методические указания - Кубанский государственный аграрный
advertisement
Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» УДК 637.146/.07 Методические указания разработаны сотрудниками кафедры технологии хранения и переработки животноводческой продукции Н.В. Тимошенко, А.М. Патиевой, О.А. Огневой, Н.С. Вороновой. Кафедра технологии хранения и переработки животноводческой продукции Под редакцией Н.В. Тимошенко. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ к лабораторно-практической работе «ПРИГОТОВЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО НАЗНАЧЕНИЯ» доктора технических наук, Методические указания включают: теоретическую часть, технику безопасности, цель работы, особенности техники выполнения работы, порядок оформления отчета о выполнении работы, контрольные вопросы и библиографический список. Методические указания рассмотрены и рекомендованы к изданию методической комиссией факультета перерабатывающих технологий Кубанского государственного аграрного университета. Протокол № 9 от 19.06.2014г. для бакалавров, обучающихся по направлению 19.03.03 «Продукты питания животного происхождения» Рецензент: доктор технических наук, профессор Л.В. Донченко (КубГАУ) Краснодар, 2014 профессора 2 В качестве закваски при заквашивании молока или сливок издавна применяли самоквасную простоквашу или сметану высокого качества. Промышленные бактериальные закваски впервые стали применять в маслоделии в конце прошлого столетия, используя в качестве закваски пахту, сквашенные сливки или кислое молоко. Такие закваски называются естественными. Они не гарантировали получения продукта высокого качества, так как часто загрязнялись случайной посторонней микрофлорой. Поэтому в Дании (1888 г), а затем и в России (1898 г) в производстве кисло-сливочного масла начали изготовлять чистые культуры специально подобранных микроорганизмов. В дальнейшем закваски на чистых культурах стали применять также для получения кисломолочных продуктов и сыров. В настоящее время в молочной промышленности всех стран используют закваски на чистых культурах микроорганизмов, которые готовят в специальных лабораториях. Под бактериальными заквасками понимают виды и штаммы молочнокислых бактерий, применяемые в производстве кисломолочных продуктов, творога, кисло-сливочного масла и сыров. Название «закваска» произошло от слов «квасить» или «сквашивать», т. е. повышать кислотность молока с целью получения сгустка. Микрофлора закваски состоит из специально отобранных видов и штаммов молочнокислых бактерий, которые вносят в молоко после его тепловой обработки, уничтожающей большую часть природной микрофлоры молока. По физиологическому состоянию микрофлоры закваски можно разделить на консервированные, в которых микрофлора находится в состоянии анабиоза, и активные. Первые вырабатывают централизованно с использованием в качестве консервирующего фактора чаще всего дегидратацию (высушивание) или замораживание. Сухие закваски имеют высокую стойкость, что позволяет их транспортировать на большие расстояния и хранить до трех и более месяцев на заводах. Вырабатывают также жидкие закваски, в которых в качестве консервирующего фактора используют 10-20%-ный раствор глицерола и высокие концентрации сухих веществ молока, но они обладают более низкой стойкостью в хранении и поэтому могут транспортироваться только на короткие расстояния. В России жидкие закваски вырабатывают редко. Консервированные закваски используют как посевной материал для приготовления активных заквасок. Бактериальные закваски, препараты и концентраты далее будут называться просто БЗ, БП и БК. Активные БЗ готовят путем реактивации и размножения до требуемого количества клеток микрофлоры консервированных заквасок. Реактивацию и размножение проводят в молоке или благоприятных для роста микрофлоры заквасок средах, которые готовят на молочной основе. Приготовление БЗ на немолочных средах, например, на средах, в которых источником энергии является не лактоза, а глюкоза, может привести к накоплению биомассы неактивных в молоке клеток молочнокислых бактерий, не сбраживающих лактозу. Активные БЗ, которые вносят в молоко, подготовленное для выработки кисломолочных продуктов или сыра, называют производственными, а те, которые по активности микрофлоры можно использовать как производственные, но биомасса которых недостаточна для переработки планируемого количества молока, – пересадочными.. По способу консервации микрофлоры БЗ и БП подразделяются на сухие, замороженные и жидкие. В России вырабатываются в основном сухие БЗ, поскольку замороженные требуют специальных дорогостоящих контейнеров для транспортировки, возврат которых предприятию резко увеличивает затраты на транспортировку заквасок. Жидкие БЗ также менее удобны для транспортировки и менее стойки в хранении по сравнению с сухими заквасками. БЗ и БП могут быть моно- и поливидовыми. Обычно для формирования органолептических показателей сыров нужно несколько видов молочнокислых бактерий. Исключением является Чеддер, который вырабатывают при участии только сливочного или молочного лактококка. При использовании моновидовых БЗ или БП для приготовления поливидовых БЗ в молоко вносят несколько моновидовых БЗ или БП, соблюдая требуемое соотношение между видами, или готовят несколько производственных БЗ и вносят их в молоко для изготовления продукта в требуемых соотношениях. По отношению к температуре БЗ делят на мезофильные (оптимальные температуры для роста микрофлоры около 30°С) и термофильные (соответственно 38-42°С). Большинство поливидовых мезофильных БЗ и БП содержит только лактококки и лейконостоки. Они бывают четырех типов: содержащие только сливочный и молочный лактококки или один из этих подвидов (0-закваски), содержащие из газообразующих лактобактерий только диацетильный лактококк (Д-закваски), содержащие из газообразующих только лейконостоки (Л-закваски) и содержащие оба типа газообразующих бактерий (ДЛ-закваски). В зарубежной литературе лейконостоки часто обозначают индексом «В» – первой буквой старого названия лейконостоков («бетакокки»), БЗ с 3 4 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ лейконостоками называются, соответственно, В и DB-заквасками (в отечественной литературе Л и ДЛ-заквасками). Закваска – основная и наиболее важная составная часть первичной микрофлоры кисломолочных продуктов. Только с ее внесением молоко обогащается живыми клетками микроорганизмов. При создании благоприятных температурных условий бактериальные клетки, внесенные с закваской, начинают интенсивно размножаться. Микрофлору кисломолочных продуктов составляют следующие виды молочнокислых бактерий и дрожжей. Молочнокислый стрептококк представляет собой клетки овальной формы. При размножении в молоке клетки располагаются в виде коротких цепочек. Стрептококки бывают двух форм: мезофильные и термофильные, оптимальная температура развития которых соответственно 30-350С и 40-450С. Предел кислотообразования молочнокислых стрептококков – 120-1300Т. Ароматобразующие бактерии входят в группу молочнокислых стрептококков и помимо молочной кислоты продуцируют повышенное количество летучих кислот и ароматических веществ. Оптимальная температура развития бактерий находится в пределах 25-300С. Болгарская палочка представляет собой относительно крупные палочки в виде отдельных образований или цепочек. Оптимум их развития при 42-450С и предел кислотообразования 3000Т. Этот вид молочнокислых бактерий образует ровный относительно плотный сгусток. Ацидофильная палочка представляет собой крупные палочки или цепочки. Различают слизистые и неслизистые расы ацидофильной палочки, оптимальная температура развития которых 40-420С. Слизистые расы – это относительно слабые кислотообразователи (предел 2000Т), при сквашивании образуют тягучий (слизистый) сгусток. Неслизистые расы – сильные кислотообразователи (предел 3000Т), при сквашивании образуют ровный сгусток. Молочные дрожжи представляют собой одноклеточные, неподвижные крупные образования. Они в 10 раз крупнее бактерий и принадлежат к группе одноклеточных грибов. Дрожжи сбраживают лактозу при оптимальной температуре развития 18-200С, хорошо развиваются в средах с кислой реакцией и при доступе воздуха Кефирные грибки – это симбиотическая закваска, содержащая молочнокислые стрептококки и палочки, дрожжи, уксуснокислые и ароматобразующие бактерии. Температура культивирования кефирных грибков лежит в пределах 18-220С. Предел их кислотообразования 951100Т. Для каждого кисломолочного продукта подбирают специальные БЗ. Подбор отдельных штаммов и БЗ для кисломолочных продуктов осуществляется по следующим показателям: соответствие микробиологической чистоты штаммов и заквасок по микроскопическому препарату (отбраковка образцов, загрязненных посторонней микрофлорой); активность штаммов и заквасок, характеризуемая продолжительностью сквашивания и органолептической оценкой (характер сгустка, вкус, запах); влагоудерживающая способность (влагоотдача); предел кислотообразования, определяемый по титруемой кислотности; устойчивость к поливалентному бактериофагу; антибиотическая и антагонистическая активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре. Состав микрофлоры БЗ подбирают таким образом, чтобы обеспечить для каждой группы продуктов необходимые вкус, запах, консистенцию. Закваска для творога, сметаны и простокваши обыкновенной состоит из мезофильных молочнокислых стрептококков. В закваску для творога вводят культуры, образующие сгустки, хорошо отделяющие сыворотку, для сметаны – культуры, образующие сгустки, хорошо удерживающие сыворотку. Закваска для Южной, Мечниковской простокваши, йогурта, «Снежка» состоит из термофильного стрептококка и болгарской палочки. Для приготовления ряженки и варенца применяют закваску термофильного стрептококка с добавлением или без добавления болгарской палочки. Закваска для ацидофильного молока и ацидофильной пасты состоит из ацидофильной палочки, для ацидофилина – из закваски ацидофильной палочки, молочнокислого стрептококка и кефирной палочки, взятых поровну. При выработке кисломолочных напитков с пониженным содержанием жира и плодово-ягодными наполнителями, а также сметаны с пониженным содержанием жира применяют закваску, состоящую из мезофильных и термофильных молочнокислых стрептококков. Кефир вырабатывают, используя закваску, полученную с помощью естественной симбиотической закваски – кефирных грибков. В настоящее время в молочной промышленности применяются в основном закваски, высушенные сублимацией. Наряду с БЗ все более широкое применение находят при производстве творога, сметаны и некоторых других кисломолочных продуктов БК. При производстве творога и сметаны используют также жидкие закваски. Срок хранения 5 6 сухих БЗ, БК и БП составляет 3-4 мес., жидких заквасок 10 сут. (в холодильнике) и не более 4-5 сут. при нерегулируемой температуре. В 1 г сухих БЗ содержатся сотни миллионов – миллиарды клеток, в 1 г сухих БК и БП – сотни миллиардов клеток. Соответственно повышается и их активность. Основные правила приготовления заквасок Закваску готовят на цельном или обезжиренном молоке хорошего качества, полученном от здоровых коров. Цельное молоко очищают на очистителе или фильтрованием. Если закваску готовят из обезжиренного молока, сепарирование проводят перед началом работы, чтобы сепаратор не был загрязнен. Молоко, предназначенное для лабораторной закваски, стерилизуют при температуре 1210С с выдержкой 15–20 мин, для производственной закваски – стерилизуют или пастеризуют при температуре 92–950С с выдержкой 20–30 мин. Особое внимание обращают на правильность проведения пастеризации. Очень важно, чтобы в процессе выдержки при температуре пастеризации молоко постоянно перемешивалось для равномерного прогревания всех слоев. Сразу после пастеризации или стерилизации молоко охлаждают до температуры заквашивания и вносят в него закваску. В случае если стерилизованное молоко не используют сразу, его можно оставлять при температуре 18–200С (не более 5 сут.) и нагревать до температуры заквашивания перед употреблением. Закваску вносят в количестве 13% в зависимости от условий производства. Сразу после сквашивания закваска должна быть использована в производстве. Если это невозможно, ее охлаждают до температуры 3100С. Общая продолжительность хранения лабораторной закваски при температуре 3-60С не должна превышать 72 ч после сквашивания, производственной – 24 ч. Для предотвращения развития бактериофага производят смену заквасок с таким расчетом, чтобы закваска с одним и тем же составом микрофлоры чередовалась в определенной последовательности. Закваску обычно готовят ежедневно в количестве, необходимом для заквашивания молока и сливок, перерабатываемых в течение одних суток. Приготовление лабораторной закваски. Лабораторной называется закваска, полученная с использованием готовых жидких или сухих заквасок на стерилизованном молоке, поставляемых специальными лабораториями. Лабораторную закваску приготовляют в микробиологической лаборатории, помещение которой должно быть сухим и светлым; в нем поддерживают строгую чистоту. Вход в 7 лабораторию разрешен только работающим здесь лицам. Лаборатория должна быть оборудована автоклавом, микроскопом, термостатами, холодильником. Для сквашивания мезофильных и термофильных заквасок должны быть отдельные термостаты. Закваски, получаемые из специальных лабораторий, применяют сразу после получения. До употребления закваски хранят в холодильнике. Срок годности закваски указан на этикетке. При необходимости пересадку лабораторной закваски производят на стерильном молоке. После каждой пересадки закваску контролируют под микроскопом. В случае обнаружения загрязнения закваски посторонней микрофлорой культивирование ее прекращают и готовят новую закваску из другой порции. Для приготовления лабораторной закваски в стерилизованное молоко при температуре заквашивания вносят сухую или жидкую закваску. Одну порцию сухих заквасок вносят на 2 л или 100 мл молока, жидких заквасок – на 2,5 л молока. Приготовление производственной закваски. Производственную закваску готовят в специальных заквасочниках или ваннах длительной пастеризации на пастеризованном молоке или в бидонах на стерилизованном молоке. Для заквашивания используют лабораторную БЗ, БК или БП. По окончании пастеризации молоко охлаждают до температуры заквашивания и вносят в него 0,5-3% лабораторной закваски. Молоко тщательно перемешивают и оставляют в покое до образования сгустка, после чего закваску употребляют в производстве. В случае необходимости ее охлаждают, пуская холодную воду в заквасочник или межстенное пространство ванны длительной пастеризации. БК или БП используют непосредственно для приготовления производственной закваски, минуя лабораторную, предварительно проведя его активизацию. Для этого одну порцию БК или БП в зависимости от вида закваски вносят в 300 мл или в 1 л стерилизованного молока, охлажденного до оптимальной температуры, и выдерживают его при этой температуре в течение 2-3 ч. Все операции по приготовлению производственной закваски – пастеризацию и охлаждение молока, заквашивание, сквашивание и охлаждение закваски – осуществляют в одной емкости. Первичную производственную закваску рекомендуется применять непосредственно для заквашивания молока или сливок при выработке кисломолочных продуктов. В сыроделии и маслоделии из первичной закваски с целью накопления в ней аромата готовят вторичную закваску. 8 Требования, предъявляемые к закваскам закваски указаны в технологических инструкциях по приготовлению каждого конкретного вида продукта. Перед выпуском в производство закваску контролируют по химическим, органолептическим и микробиологическим показателям. Химические показатели. Закваска для творога и сметаны должна иметь кислотность 85900Т, закваска термофильного стрептококка 80-900Т, закваска молочнокислых палочек не выше 100-1300С, кефирная грибковая 951000Т, а кефирная производственная – кислотность 95-1000Т. Микробиологические показатели. При просмотре микроскопических препаратов закваски должны быть видны: в закваске для сметаны – молочнокислые стрептококки, преимущественно в виде цепочек; в закваске для творога (чистой) – только молочнокислые стрептококки, преимущественно в диплококковой форме, обсемененной термоустойчивой молочнокислой палочкой – молочнокислые стрептококки и палочки, часто зернистые; в закваске для простокваши Южной, украинской, ряженки, варенца – только молочнокислые стрептококки, при добавлении болгарской палочки – небольшое количество палочек; в закваске для напитков «Любительский», «Юбилейный», «Русский» – молочнокислые стрептококки в виде мелких диплококков и более крупных цепочек; в закваске кефирной грибковой – преобладающие молочнокислые стрептококки, единичные клетки палочек и дрожжей, иногда – скопления палочек и дрожжей; в кефирной производственной – преобладающие молочнокислые стрептококки, единичные клетки палочек и дрожжей. Правила применения заквасок на производстве При использовании заквасок на производстве должны быть обеспечены их микробиологическая чистота и активное протекание молочнокислого процесса. Для сохранения микробиологической чистоты заквасок при транспортировании их приготовление должно производиться как можно ближе к емкостям, в которых производят продукт. Если закваску подают из ванн длительной пастеризации или заквасочников в емкости для производства продуктов по трубопроводам, они должны быть максимально короткими. После использования трубопроводов их тщательно промывают, перед началом работы пропаривают. Если закваску готовят в бидонах или флягах, последние подают в цех опломбированными; перед внесением закваски в емкости для заквашивания края бидонов или фляг протирают спиртом или раствором хлорной извести. Количество закваски, вносимой в молоко, должно обеспечивать активное протекание молочнокислого процесса при производстве продуктов. Длительность процесса сквашивания и процент вносимой Кисломолочные продукты получают из цельного, нормализованного или обезжиренного молока и сливок сквашиванием с применением специальных заквасок. Производство кисломолочных продуктов основано на применении микробиологических процессов. Накапливающаяся в результате молочнокислого брожения молочная кислота вызывает выпадение белков молока в виде мелких хлопьев. Молоко свертывается, при этом образуются сгустки более или менее плотной консистенции. Наиболее популярными являются такие кисломолочные продукты как творог, сметана, простокваша, кефир, ряженка, варенец и пр. В последние годы значительно увеличился выпуск кисломолочных продуктов с пониженным содержанием жира и с плодово-ягодными и другими наполнителями. Кисломолочные продукты существенно отличаются от молока как по химическому составу, так и по содержанию микрофлоры. В результате сквашивания в молоке снижается содержание лактозы, повышается количество ряда биологически ценных веществ – свободных аминокислот, ароматических соединений, углекислоты, летучих жирных кислот, антибиотических веществ. Кисломолочные продукты характеризуются легкой перевариваемостью, обусловленной кислотной коагуляцией белков молока, выпадением их в виде мелких хлопьев и частичным протеолизом их; в них значительно снижено аллергизирующее действие белков. Кисломолочные продукты содержат также большое количество живых клеток микроорганизмов – до 1 миллиарда в 1 г. Наличие молочнокислых бактерий, а также дрожжей в значительной мере определяет способность этих продуктов подавлять нежелательную микрофлору кишечника. Поэтому интерес к ним особенно повысился в связи с широким распространением дисбактериозов и других хронических кишечных заболеваний, не поддающихся лечению медикаментами. Специальным подбором микрофлоры можно повысить полезные свойства кисломолочных продуктов. Наиболее перспективные микроорганизмы, используемые в создании лечебных кисломолочных продуктов, – ацидофильные бактерии, подавляющие нежелательную микрофлору кишечника и нормализующие кишечную флору; дрожжи, антибиотически активные против микробактерий туберкулеза и кишечной палочки; болгарская палочка, нормализующая микрофлору 9 10 Микробиология кисломолочных продуктов кишечника (применяют в Болгарии); бифидобактерии, нормализующие микрофлору кишечника, особенно у грудных детей. Кисломолочные продукты широко применяют как для лечебного питания в качестве источника легкоусвояемых веществ, так и для лечения ряда заболеваний. Условия развития микроорганизмов в кисломолочных продуктах Условия развития микроорганизмов при производстве кисломолочных продуктов определяются в основном принятыми для каждого конкретного продукта температурными режимами сквашивания, созревания, охлаждения. Их обычно устанавливают с учетом особенностей микроорганизмов, подобранных для сквашивания. Выбор же микроорганизмов зависит от тех требований, которые предъявляют к готовому продукту. Так, при производстве творога, кислотность которого должна быть умеренной, применяют закваску, состоящую из молочнокислых стрептококков, обладающих сравнительно низким пределом кислотообразования. В соответствии с выбранными микроорганизмами температуру технологического процесса поддерживают в пределах от 25 до 300С. Характер развития микрофлоры и объем ее в основном подчиняются общим закономерностям, по которым происходит размножение применяемого микроорганизма в стерилизованном молоке при выбранных температурных режимах. Если в процессе производства молоко или полупродукт подвергают какой-либо дополнительной обработке (сепарирование, отделение сыворотки), условия развития микроорганизмов меняются. Например, в сливках, особенно высокожирных, они развиваются несколько медленнее, чем в молоке, и конечный объем микрофлоры в сметане соответственно ниже, чем в простокваше. С другой стороны, при производстве творога в процессе синерезиса или сепарирования сгустка в нем концентрируются микробные клетки. В результате темп накопления микроорганизмов в твороге и их конечный объем бывают соответственно выше, чем в кисломолочных продуктах, которые готовят сквашиванием молока. На развитие микроорганизмов при производстве кисломолочных продуктов влияет химический состав молока. При наличии в нем веществ, угнетающих микроорганизмы (антибиотики, остатки моющедезинфицирующих средств и пр.), тормозится развитие микробов, в первую очередь молочнокислых бактерий. Недостаток в молоке необходимых питательных веществ (витаминов, аминокислот), 11 наблюдающийся в весеннее время, также может привести к замедлению молочнокислого процесса. В производственных условиях микрофлора, вводимая с закваской, обычно развивается не в стерилизованном, а в пастеризованном молоке, в котором содержится довольно значительное количество посторонних микроорганизмов. Эта микрофлора может существенно влиять на направление микробиологических процессов при производстве кисломолочных продуктов и вызывать возникновение пороков. Источники микрофлоры кисломолочных продуктов Микрофлору кисломолочных продуктов, так же как и микрофлору молока, можно условно разделить на первичную, попадающую извне, и вторичную, развивающуюся при проведении всего технологического процесса. Первичная микрофлора кисломолочных продуктов складывается из микрофлоры, вносимой с заквасками, и микрофлоры пастеризованного молока. Количество микроорганизмов, вносимых с заквасками, составляет обычно от 50 до 500 млн. клеток в 1 мл молока (колебания зависят от количества вносимой закваски и от наличия в ней жизнеспособных клеток). Общее количество посторонних микроорганизмов в пастеризованном молоке может достигать 50500 тыс. в 1 мл, т. е. примерно в 1000 раз меньше, чем количество клеток, вносимых с заквасками. В зависимости от состава микрофлоры заквасок кисломолочные продукты делят на следующие группы: приготовляемые с использованием многокомпонентных заквасок (кефир, кумыс); вырабатываемые с применением мезофильных молочнокислых стрептококков (творог, сметана, простокваша обыкновенная); изготовляемые с использованием термофильных молочнокислых бактерий (ряженка, варенец, йогурт, простокваша Южная, Мечниковская); вырабатываемые с применением термофильных и мезофильных молочнокислых бактерий (любительская сметана, сметана с пониженным содержанием жира, напитки «Любительский», «Юбилейный», «Русский»); приготовляемые с использованием ацидофильных бактерий (ацидофильное молоко, ацидофильная паста, ацидофилин и др.). 12 Пороки заквасок В заквасках разного типа встречаются различные пороки. Наиболее распространенные из них описаны ниже. Закваски, состоящие из мезофильных молочнокислых стрептококков. Развитие термоустойчивых молочнокислых палочек – один из наиболее распространенных пороков заквасок этой группы. Он возникает в результате нарушения режимов пастеризации молока, предназначенного для приготовления заквасок: нарушения целостности емкостей (например, течь в водяной рубашке), в которых готовят закваску; несоблюдения правил обработки инвентаря, соприкасающегося с закваской и молоком; неэффективного охлаждения готовой закваски. Загрязнение заквасок термоустойчивыми молочнокислыми палочками приводит к тому, что при производстве продуктов происходит дальнейшее развитие этих микроорганизмов и возникновение порока продукции – излишняя кислотность творога, сметаны и других продуктов. Основными мерами, способствующими предупреждению этого порока в заквасках, являются тщательный контроль режима пастеризации молока и использование только первичной производственной закваски на пастеризованном или стерилизованном молоке. Иногда в закваске для сметаны, реже для творога, появляется тягучесть. Возникновение этого порока может быть связано с наличием в исходной закваске культур, обладающих излишней вязкостью, или с появлением тягучести в культурах закваски в процессе ее культивирования. Причины этого порока еще до конца не ясны. В случае его появления данную закваску заменяют закваской другой партии и тщательно следят, чтобы не снижалась температура сквашивания. Закваски, состоящие из термофильных молочнокислых стрептококков. В заквасках данного типа чаще всего наблюдается появление термоустойчивой молочнокислой палочки. Это объясняется тем, что температура сквашивания этой закваски близка к оптимальной для развития термоустойчивой палочки. Поэтому даже в случае минимального загрязнения молока или закваски извне в процессе сквашивания палочки развиваются очень интенсивно. Если закваску термофильного стрептококка не охлаждают сразу после сквашивания или немедленно не используют, то палочки в ней продолжают размножаться. Основные мероприятия по предупреждению этого порока – те же, что и для закваски мезофильных стрептококков. Учитывая, что 13 термофильную закваску обычно готовят в небольших количествах, рекомендуется приготовлять ее на стерилизованном молоке. В заквасках данного типа наблюдается также возникновение излишней тягучести. Одной из причин этого явления может быть снижение температуры культивирования. Закваски, состоящие из термофильных молочнокислых палочек. Наиболее частым пороком их является загрязнение молочнокислыми стрептококками, обусловленное прежде всего недостаточно эффективной пастеризацией молока. Проверка эффективности пастеризации молока и установление нужных режимов позволяют, как правило, избавиться от этого порока. Кроме того, целесообразно, как и при приготовлении закваски термофильного стрептококка, использовать закваски на стерилизованном молоке. Кефирная закваска. Пороки кефирной закваски, как правило, бывают обусловлены нарушением условий культивирования кефирных грибков. Одним из наиболее распространенных пороков является ослизнение кефирных грибков и появление тягучести в грибковой закваске. Этот порок возникает в результате излишнего развития в грибках и закваске уксуснокислых бактерий. Основные условия, способствующие их развитию, – большое количество грибков в молоке (соотношение между грибками и молоком менее 1:20), длительная выдержка грибков в молоке, т. е. редкая смена молока, высокая температура культивирования (выше 250С). Не менее распространен порок, выражающийся в снижении активности кефирной закваски. Он возникает в результате значительного накопления в закваске молочнокислых палочек, которые, повышая кислотность, подавляют развитие молочнокислых стрептококков – активных кислотообразователей. Условия для возникновения этого порока – те же, что и условия, приводящие к ослизнению грибков и закваски. Развитие пороков ослизнения и снижения активности можно предупредить, если при культивировании кефирных грибков точно придерживаться схемы. Наличие в кефирной закваске бактерий группы кишечной палочки наблюдается обычно при ослаблении контроля за пастеризацией молока, личной гигиеной работника, занимающегося культивированием грибков, чистотой помещения, посуды, воды. При ежедневном контроле грибковой закваски посевом на среду Кесслер порок может быть сразу обнаружен и быстро ликвидирован с помощью одноразовой выдержки закваски вместе с грибками при температуре 18-220С в течение 1 сут. 14 ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ Студенты могут быть допущены к работе в производственной лаборатории только после ознакомления их с правилами охраны труда, техники безопасности и противопожарной безопасности, знание которых проверяет руководитель лаборатории. При выполнении анализов нужно соблюдать осторожность, быть внимательным и все операции проводить аккуратно, без спешки, в рабочем халате. Категорически запрещается принимать пищу за лабораторным столом, пробовать на вкус химические вещества и оставлять какое-либо вещество в посуде без соответствующей надписи. В каждой лаборатории обязательно должны быть огнетушители, ящик с сухим песком, войлок, асбест. Средства для тушения пожара необходимо держать в полной исправности в легкодоступных местах. Правила работы со стеклянной посудой Используемая в лаборатории стеклянная посуда, приборы, стаканы, колбы требуют осторожного обращения. При перемешивании стеклянной палочкой нужно избегать ударов по стенкам посуды. Нельзя нагревать химическую посуду на огне без асбестовой сетки. Толстостенная химическая посуда не выдерживает нагревания, поэтому в нее нельзя наливать горячую жидкость без предварительного ополаскивания ею стенок и дна сосуда. Правила работы с основными реактивами Перед взятием реактива из склянки нужно осмотреть ее горло и удалить все, что может попасть в пересыпаемое вещество и загрязнить его. Просыпавшийся на стол реактив (неизбежно загрязняющийся при этом) нельзя высыпать обратно в склянку, в которой он хранился. На всех склянках с реактивами обязательно должны быть этикетки с обозначением, что в них находится, или надписи, сделанные карандашом для стекла. Огнеопасные реактивы хранят в металлических шкафах. Нельзя вместе хранить реактивы, способные при взаимодействии возгораться или выделять большое количество тепла. 15 В лаборатории не допускается хранение больших количеств огнеопасных веществ. Легковоспламеняющиеся вещества нельзя нагревать на открытых электроплитках или горелках. Если огнеопасная жидкость будет разлита, то ее засыпают песком или накрывают листом асбеста. Легковоспламеняющиеся вещества и вещества, выделяющие летучие ядовитые пары, а также неприятный запах, надо хранить только в вытяжном шкафу. При проведении работ в вытяжном шкафу работу надо выполнять так, чтобы голова и корпус тела оставались вне шкафа, а наблюдение за работой производить через стекло опущенной створки. Правила обращения с концентрированными веществами. При работе с концентрированными веществами следует помнить, что, попадая на кожу человека, они вызывают тяжелые ожоги. Поэтому работать с этими веществами необходимо только в защитных очках, резиновых фартуках и перчатках. При разбавлении или переливании концентрированных кислот или щелочей необходимо надевать противогаз или респиратор. При разведении концентрированной серной кислоты необходимо пользоваться тонкостенной посудой и вливать по стеклянной палочке кислоту в воду, а не наоборот. Разлитые кислоты и щелочи необходимо немедленно нейтрализовать, а затем тщательно смывать водой. Для нейтрализации щелочей применяют растворы борной или 8%-ной уксусной кислот, для нейтрализации кислот – 5 %-ный раствор питьевой соды. Растворы щелочей следует хранить в закрытых сосудах, так как они легко поглощают углекислый газ из воздуха и частично превращаются в углекислые соли. Точные дозы концентрированных кислот, щелочей и других агрессивных жидкостей отмеривают пипеткой с резиновой грушей или в крайнем случае пипеткой с предохранительным шариком. 16 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1. Микробиологические исследования молока для приготовления заквасок 1.1. Определение класса молока пробой на редуктазу с применением резазурина Цель работы Определение бактериальной обсемененности молока по ГОСТ 9225-84 по редуктазной пробе с использованием резазурина. В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду наряду с другими окислительновосстановительными системами анаэробные дегидразы (редуктазы). Существует прямая зависимость между количеством бактерий в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель бактериальной обсемененности сырого молока. В пробе с резазурином для определения содержания в молоке дегидраз используют свойство резазурина быстро изменять свою окраску при восстановлении окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. Оценку качества молока при пробе с резазурином получают в течение 1 ч, а молоко с особо высокой бактериальной обсемененностью может быть выявлено через 20 мин. Приборы и реактивы. Пробирки стеклянные диаметром 16 мм и высотой 150 мм, пробки резиновые, пипетки на 1 и 10 мл, штатив для пробирок, редуктазник с автоматическим регулятором температуры или баня водяная, термометры ртутные стеклянные со шкалой 0-1000С; вода дистиллированная (свежепрокипяченная), резазурин (ТУ 6-09-210-70). Ход анализа. Пробу с резазурином следует проводить не ранее, чем через 2 ч после доения. В пробирки наливают по 1 мл рабочего раствора резазурина (см. приложение 1) и по 10 мл исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками, переворачивая пробирки, медленно смешивают 3 раза. Пробирки помещают в редуктазник или в водяную баню. Вода в бане должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температура воды в редуктазнике или в водяной бане после погружения пробирки со смесью должна поддерживаться в течение всего анализа в пределах 38-400С. 17 Пробирки с молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от прямых солнечных лучей. Время погружения пробирок в баню считают началом анализа. Показания снимают через 20 мин и через 1 ч, не встряхивая и не переворачивая пробирки, отмечают изменение окраски молока. Молоко, обесцвечивающееся через 20 мин, дальнейшему исследованию не подлежит. Пробирки с таким молоком удаляют из редуктазника. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают. Оставшиеся пробирки один раз переворачивают и оставляют в редуктазнике или водяной бане до конца анализа. В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко относят к одному из четырех классов в соответствии с таблицей 1. Таблица 1 – Определение класса молока Качество Класс молока Продолжительность изменения цвета Окраска молока Количество бактерий в 1 мл молока I Хорошее Через 1 ч Сине-стальная Менее 500 тыс. II Удовлетворительное Через 1 ч Сиреневая или сине-фиолетовая От 500 тыс. до 4 млн. III Плохое Через 1 ч Розовая или белая IV Очень плохое До 20 мин. Белая От 4 млн. до 20 млн. Свыше 20 млн. 1.2. Определение антибиотиков в молоке Цель работы Изучение методики определения антибиотиков в молоке. Сущность метода заключается в том, что развивающаяся культура микроорганизмов восстанавливает резазурин. При наличии антибиотиков в молоке восстановление резазурина замедляется вследствие ингибирования развития микроорганизмов. Приборы и реактивы. Пробирки стеклянные диаметром 16 мм и высотой 150 мм, пробки резиновые, пипетки на 1 и 10 мл, штатив для пробирок, редуктазник с автоматическим регулятором температуры, баня 18 водяная, термометры ртутные стеклянные со шкалой 0-1000С; вода дистиллированная (свежепрокипяченная), резазурин (ТУ 6-09-210-70). Ход анализа. В пробирки наливают по 10 мл исследуемого молока и прогревают на водяной бане в течение 10 мин при 85-950С. После прогревания пробирки охлаждают водопроводной водой до температуры 38-400С и вносят 0,1 мл симбиотической закваски (термофильного стрептококка и болгарской палочки). Пробирки с внесенной культурой помещают в редуктазник при 38-400С и выдерживают 2 ч. Затем в пробирки добавляют по 1 мл 0,5%-ного раствора резазурина, приготовленного на прокипяченной и охлажденной дистиллированной воде, и содержимое пробирок тщательно перемешивают. После добавления резазурина пробирки ставят в редуктазник еще на 5 мин и по изменению окраски судят о содержании антибиотиков. Молоко, не содержащее антибиотиков, имеет ярко-розовый цвет. Молоко, содержащее антибиотики, имеет сине-фиолетовую окраску. Рабочий раствор резазурина готовят из основного раствора (см. приложение 1). Необходимо учитывать результаты точно через 5 мин после добавления резазурина, так как при более длительной выдержке может произойти изменение окраски в ярко-розовый цвет при наличии малых количеств антибиотиков. 1.3. Определение пригодности молока для закваски Приборы и реактивы. Пробирки стеклянные диаметром 20 мм и высотой 180 мм, пипетки на 1 и 20 мл, штатив для пробирок, редуктазник с автоматическим регулятором температуры, баня водяная, термометры ртутные стеклянные со шкалой 0-1000С; вода дистиллированная, 96%ный этиловый спирт, метиленовый синий (МРТУ 6-09-29-76). Ход анализа. 20 мл пастеризованного и охлажденного до 400С молока вносят в чистую пробирку. Добавляют в нее 1 мл раствора индикатора метиленового синего (см. приложение 2) и 3 капли закваски (молочнокислых стрептококков). Пробирки с пробой ставят в редуктазник и термостатируют при 37-З90С. Если молоко пригодно для закваски, то метиленовый синий должен полностью восстановиться примерно через 2 ч. 19 1.4. Определение эффективности пастеризации молока для закваски При неправильном проведении пастеризации в молоке могут сохраниться термоустойчивые молочнокислые стрептококки и неспоровая термоустойчивая молочнокислая палочка. Эффективность пастеризации проверяют по методу Н. С. Королевой. Приборы и реактивы. Пробирки стеклянные (стерильные) диаметром 20 мм и высотой 180 мм, ватные пробки или пергамент, штатив для пробирок, пипетки на 10-20 мл, термостат, микроскоп. Ход анализа. Сущность метода заключается в том, что молоко после пастеризации асептически отбирают (10-20 мл) в небольшую стерильную пробирку или баночку, закрытую ватной пробкой или пергаментом. Пробы выдерживают в термостате при 40-450С в течение 24-48 ч, отмечают характер сгустка и просматривают под микроскопом окрашенные препараты. Результаты оценивают следующим образом: сгусток довольно плотный; по микроскопическому препарату большое количество стрептококков – пастеризация проведена при температуре ниже 900С, т. е. нарушен температурный режим; сгусток может быть слабым; по микроскопическому препарату зернистые и незернистые палочки – пастеризация проведена при недостаточной выдержке или перемешивании; пептонизация молока; по микроскопическому препарату большое количество споровых палочек – пастеризация проведена правильно. 20 Микрофлора кефирных грибков и грибковой закваски Кефирные грибки имеют неправильную форму, сильно складчатую или бугристую поверхность, цвет белый со слегка желтоватым оттенком, консистенцию упругую, вкус кислый, специфический. Диаметр кефирных грибков может колебаться от 1-2 мм до 3-6 см и более. Активные кефирные грибки всплывают на поверхность молока. Многие исследователи считают, что кефирный грибок представляет собой сгусток белка, который удерживает в себе микроорганизмы (Г. Хорват, 1968 г, и др.). Однако еще С.А. Королев (1932 г) отмечал, что кефирные грибки являются прочными симбиотическими образованиями. Такое представление о природе кефирного грибка, несомненно, более правильно объясняет его микробиологические, морфологические и культуральные особенности. Кефирные грибки имеют всегда определенную структуру и ведут себя биологически как живой организм: растут, делятся и передают свои свойства и структуру последующим поколениям. Несмотря на многократные попытки, еще не удалось из смеси отдельных микроорганизмов, составляющих микрофлору кефирного грибка, получить новый кефирный грибок с присущими этому организму структурой и свойствами. На практике новые порции кефирных грибков получают в результате роста и размножения ранее существовавших. При микроскопировании микротомных срезов кефирного грибка обнаруживаются тесные переплетения палочковидных нитей, которые образуют строму грибка, удерживающую остальные группы микроорганизмов. В состав постоянной микрофлоры кефирного грибка входят дрожжи, молочнокислые и уксуснокислые бактерии. Дрожжи. В кефирных грибках обнаружены дрожжи как сбраживающие, так и не сбраживающие лактозу. Мезофильные молочнокислые стрептококки. Их присутствие в кефирном грибке отмечалось многими исследователями. Считалось, что эта группа, хотя и присутствует постоянно в кефирных грибках и кефире, является посторонней сопутствующей микрофлорой, неблагоприятно влияющей на качество готового продукта. С.А. Королев (1932 г) установил, что на долю этой группы микроорганизмов приходится около 60% всей микрофлоры кефира, и высказал мнение о существенной роли ее в процессе сквашивания. Мезофильные молочнокислые стрептококки кефирного грибка – не однородная группа. Она состоит из активных кислотообразователей (Str. lactis, Str. cremoris) и ароматообразующих стрептококков (Leuс. citrovorum, Leuc. dextranicum). В настоящее время Str. lactis и Str. cremoris рассматриваются как постоянная и наиболее активная часть микрофлоры кефирного грибка, обеспечивающая быстрое нарастание кислотности закваски в первые часы сквашивания (Н.С. Королева, 1966 г, Н.А. Бавина, 1971 г). Мезофильные молочнокислые палочки. Среди микроорганизмов, выделенных из кефирного грибка, С. ОрлаЙенсеном (1914 г), М.Пиком (1932 г), В.М. Богдановым (1957 г) были обнаружены мезофильные молочнокислые палочки типа Beta- и Streptobacterium. Некоторые исследователи – Л.П. Старыгина и М.Ф. Халдина (1934 г), А.К. Максимова и Э.Е. Грудзинская (1959 г), Е.П. Феофилова (1958 г), Г. Хорват (1968 г) – считают, что эти микробы влияют на аромат и консистенцию кефира. Однако то обстоятельство, что мезофильные молочнокислые палочки медленно развиваются и количество их в свежей кефирной закваске едва достигает 102-103/мл (Н.А. Бавина, 1971 г), делает маловероятным существенное влияние их на качество продукта, производство которого длится примерно 24 ч. Возможно, что эти микроорганизмы идентичны микроорганизмам стромы грибка и основная их роль сводится к поддержанию симбиоза. Термофильные молочнокислые палочки. Эта группа микроорганизмов длительное время игнорировалась исследователями микрофлоры кефирных грибков. Считалось, что, поскольку продукт 21 22 2. Приготовление кефирной закваски Кефир – кисломолочный напиток из коровьего молока смешанного (молочнокислого и спиртового) брожения. Отличительной особенностью кефира является то, что при его производстве используют естественную, сложную по микробиологическому составу симбиотическую закваску – кефирный грибок (рис. 1). Рисунок 1 – Кефирный грибок вырабатывают при сравнительно низких температурах, термофильных микроорганизмов в нем не должно быть. Однако еще С.А. Королев (1932 г) отмечал присутствие в кефирных грибках термофильных молочнокислых палочек типа Bact. casei ε. (синонимы Lbm. helveticum). Н.С. Королевой (1960 г) показано постоянное присутствие термофильных молочнокислых палочек в кефирной закваске и кефире. Количество этих микроорганизмов резко возрастает при повышении температуры культивирования. Роль термофильных молочнокислых палочек в кефирной закваске и кефире, по-видимому, достаточно существенна. Эта группа проявляет себя во всех случаях нарушения режимов культивирования грибков – повышения температуры, увеличения выдержки и т. д. Интенсивное развитие ее в закваске приводит к излишнему повышению кислотности и к подавлению мезофильных молочнокислых стрептококков. Уксуснокислые бактерии. Некоторые исследователи (А.М. Скородумова, 1963 г, X.И. Клупш, 1968 г) считают уксуснокислые бактерии посторонней микрофлорой кефирных грибков, отрицательно влияющей на качество кефира. Работы же В.М. Богданова и И.Н. Пятницыной (1959 г), А.К. Максимовой и Э.Е. Грудзинской (1959 г), Е.П. Феофиловой (1958 г) подтвердили постоянное присутствие уксуснокислых бактерий в кефирных грибках и закваске. Совместно с В.Н. Апульциной (1965 г) установлено, что в 1 мл грибковой кефирной закваски может содержаться от 200 000 до 6 000 000 этих микроорганизмов. Уксуснокислые бактерии играют, по-видимому, значительную роль в симбиозе организмов кефирного грибка. М.Е. Шульц (1946 г) отмечает влияние этих микроорганизмов на прирост грибков, сохранение активности кефирной закваски. А.К. Максимовой и Э.Е. Грудзинской (1959 г) установлено угнетающее действие уксуснокислых бактерий на дрожжи и в то же время увеличение в их присутствии антибиотической активности кефира. Ими же выявлено, что при наличии уксуснокислых бактерий в закваске кефир имеет более типичные консистенцию и вкус. Однако при излишнем развитии уксуснокислых бактерий наблюдается порок – ослизнение (А.М. Скородумова, 1955 г; А.К. Максимова и Э.Е. Грудзинская, 1959 г; Б.М. Богданов и И.Н. Пятницына, 1959 г). В молоке, сквашенном грибками с признаками ослизнения, содержание уксуснокислых бактерий достигало десятков и сотен миллионов в 1 мл (Н.С. Королева, 1966 г). Кроме постоянных микроорганизмов, в составе типичной микрофлоры кефирных грибков и закваски могут находиться посторонние микроорганизмы, попадающие при недостаточно тщательном культивировании грибков. К таким микроорганизмам относятся бактерии группы кишечной палочки, Oidium lactis и Mycoderma (H.С. Королева, 1966 г). Приборы и реактивы. Термометры ртутные стеклянные со шкалой 0-1000С, спиртовки, водяная баня, мутовки, емкости, алюминиевый дуршлаг или сито Ход работы. При изготовлении кефирных заквасок используют как живые, так и высушенные кефирные грибки. Применение высушенных грибков связано с удобством их пересылки на места и возможностью длительного хранения их в сухом состоянии. Перед употреблением высушенные грибки должны быть оживлены сначала в воде, затем в пастеризованном молоке. Однако активность грибков, оживленных из сухих, как правило, ниже, чем живых. Рост их также замедляется, а иногда и отсутствует. Поэтому желательно пользоваться живыми грибками, не подвергавшимися сушке. Грибки ежедневно помещают в свежее молоко, поддерживая в молоке и помещении определенную температуру (схема, принятая на Останкинском молочном комбинате). Основными условиями, на основании которых разработана данная схема (рис. 2), являются: предупреждение возможности попадания посторонней микрофлоры извне в грибки и грибковую закваску; поддержание определенных условий, благоприятных для развития грибков и установления постоянной микрофлоры грибковой закваски. Чтобы предотвратить попадание посторонней микрофлоры в кефирную закваску и грибки, грибки культивируют в изолированном помещении, расположенном в заквасочном отделении кефирного цеха. В нем установлены бактерицидные лампы. Молоко, применяемое для культивирования кефирных грибков и получения грибковой закваски, пастеризуют при 950С с выдержкой 1015 мин в специальных заквасочниках (в ушатах с крышками и мешалками) при непрерывном перемешивании. Все операции, связанные с культивированием кефирных грибков, проводят, соблюдая особую чистоту. Посуду и инвентарь, соприкасающиеся с грибками, тщательно протирают спиртом и обжигают. Обслуживающий персонал при работе с грибками особенно следит за выполнением правил личной гигиены (чистотой рук, халата, правильно надетой косынкой и пр.). 23 24 Часы Операции 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Выдержка грибков в молоке Перемешивание закваски с грибками Пастеризация и охлаждение молока Отделение грибков от закваски Помещение грибков в свежее молоко Выдача грибковой закваски в произодство Рисунок 2 – Примерный график работы при культивировании кефирных грибков 1 2 3 4 5 6 7