Флороценоз: Обоснованно. Информативно. Разумно

ФЛОРОЦЕНОЗ
Рациональная ПЦР-диагностика
в гинекологии
Новые программы обследования
для женщин
в лаборатории CMD
Пыркина М.В., Румянцева Т.А., Гущин А.Е.
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
ИНФЕКЦИИ ОРГАНОВ РЕПРОДУКЦИИ
Возбудители
ИППП
•
•
•
•
•
•
N.gonorrhoeae
C.trachomatis
M.genitalium
T.vaginalis
T.pallidum
Вирусы (HSV1&2;
HPV)
Эндогенная
микрофлора
• Условно-патогенные
микоплазмы
U.urealyticum, U.parvum,
M.hominis
• Грибы рода Candida
• Анаэробные
микроорганизмы
G.vaginalis, A.vaginae и др.
• Аэробные
микроорганизмы
Enterobacteriaceae,
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
ЧАСТОТА ВАГИНАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
ИППП
5-10%
Вульвовагинальный
Кандидоз 20-30%
Gonzales-Pedraza, 1999; Sobel, 2000; Donders, 2003
Инфекции
передаваемые
половым путем
(ИППП)
ОСОБЕННОСТИ ИППП (NCMT)
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
1. В норме не должны
присутствовать.
2. В большинстве случаев не
имеют специфических
проявлений.
3. Высокая частота
бессимптомного течения.
4. Микст – инфекции.
5. При выявлении возбудителей
ИППП показано лечение
независимо от наличия
симптомов.
6. Различная схема лечения для
каждой инфекции.
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
ИППП (NCMT) СРЕДИ ЖЕНЩИН
Chlamydia trachomatis
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Neisseria gonorrhoeae
Микст-инфекции
А.Е. Гущин и соавторы
«КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ», №4, 2011
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ МИКСТ-ИНФЕКЦИЙ
9 разных комбинаций,
случаи инфицирования
одновременно 3
патогенными
возбудителями
Требуется коррекция
этиотропной терапии в
зависимости от спектра
возбудителей!
А.Е. Гущин и соавторы
«КЛИНИЧЕСКАЯ ДЕРМАТОЛОГИЯ И ВЕНЕРОЛОГИЯ», №4, 2011
РОССИЙСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Нозология
КР-2012
Гонорея
Микроскопия,
(N.gonorrhoeae) Культ.иссл., МБМ
Хламидиоз
(C.trachomatis )
МБМ, Культ.иссл.
М. genitalium
МБМ
Трихомониаз
(T.vaginalis)
Микроскопия, МБМ,
Культ.иссл.
РОССИЙСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
«Другие
методы
лабораторных
исследований, в том числе прямая
иммунофлюоресценция
(ПИФ),
иммуноферментный анализ (ИФА)
для
обнаружения
антител
к
C.trachomatis, микроскопический и
морфологический
методы
недопустимо
использовать
для
диагностики
хламидийной
инфекции.»
Возбудитель
Микроскопия
Бак.посев
МБМ
N.gonorrhoeae
20% (Ж)-90%(М)
60% (Ж)
95-98%
90%(М)
C.trachomatis
10-60% (ПИФ)
60-80%
90-99%
M.genitalium
-
-
90-100%
10%(М)-65%(Ж)
50%(М)
90-99%
T.vaginalis
80%(Ж)
РЕЗУЛЬТАТЫ ОБСЛЕДОВАНИЯ НА NCMT
ФЛОРОЦЕНОЗ:
ОЦЕНКА МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА
количественная оценка соотношения
условно-патогенных микроорганизмов УГТ
Микрофлора (микробиоценоз) влагалища здоровой женщины
– экосистема, представленная большим разнообразием
микроорганизмов.
ЛАКТО-
Нормальная
микрофлора
ФЛОРА
95-98%
Условнопатогенная
флора
2-5%
Дисбиоз
• Непатогенные
• Условно-патогенные
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ
ВАГИНОЗ
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ
Полимикробный
невоспалительный
синдром,
возникающий в результате полной/частичной замены
лактофлоры анаэробными микроорганизмами.
БВ – наиболее частая причина патологических выделений
из влагалища у женщин.
Методы диагностики бактериального вагиноза
Критерии
Амсель
Оценка
по Ньюдженту
ПЦР
ДИАГНОСТИКА БВ
Критерии Амсель
•
•
•
•
(предложены в 1984 году)
Наличие специфических
выделений
Увеличение ph>4.5
Положительный тест с
KOH
Наличие «ключевых
клеток» при микроскопии
3 КРИТЕРИЯ «+» → БВ
чувствительность/специфичность
37– 70%/94-99%
С запахом
Кровянистые
Гнойные
Серые
Зеленоватые
Желтоватые
Молочные
Творожистые
Слизистые
Густые
Жидкие
Умеренные
Обильные
92,9
6,3
12,7
35,8
9,7
26,3
61,1
11,9
21,9
32,0
62,0
30,0
65,0
0
20
40
60
80
100
Кира, 2012
ДИАГНОСТИКА БВ
Критерии Ньюджента (предложены в 1991 г.) – система
оценки препарата, окрашенного по Граму.
Lactobacillus
morphotypes
Gardnerella/
Bacteroides spp.
Curved Gramvariable rods
крупные
грамположительные
бактерии
небольшие
грамотрицательные или
грамвариабельные бактерии
изогнутые
грамотрицательные или
грамвариабельные
бактерии
4+
0 лактобактерий) 0
0 - 3 – 0 норма (присутствуют
только морфотипы
3+ состояние (морфотипы
1+
1+/2+
4 - 6 –1 промежуточное
Gardnerella, Mobiluncus
на
фоне лактобактерий)
2
2+
2+
3+/4+
7 - 103 – бактериальный
вагиноз (дисбиоз)
(доминируют морфотипы
1+
3+
Gardnerella,
Mobiluncus0 на фоне отсутствия
4
4+ лактобактерий, «ключевые
клетки»)
ПЦР В ДИАГНОСТИКЕ БВ
Бактериальный вагиноз – полимикробный синдром.
Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp., Leptotrichia spp.,
Fusobacterium spp., Megasphaera spp., Veillonella spp., Diliaster spp., Lachnobacterium spp., Clostridium spp.,
Mobiluncus spp., Corinebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Bacteroides spp.,
Peptococcus spp., Mycoplasma spp., BVAB-1,2,3, Peptoniphilus spp, Eggerthella spp., Peptoniphilus lacrimalis,
Arcanobacterium spp., Cryptobacterium spp., Tessaracoccus spp., Couchioplanes spp., Propioniferax spp., Hallella
spp., Kaistella spp., Fluviivola spp., Crocinitomix spp., Flectobacillus spp., Persicivirga spp., Cloacibacterium,
Papillibacter spp., Aerococcus spp., Pseudobutyribivibrio, Alloiococcus spp., Anaerococcus spp., Subdoligranulum
spp., Fastidiosipila spp., Abitrophia spp., Pediococcus spp., Bulleidia spp., Butyrivibrio spp., Lactovum spp.,
Pelospora spp., Paucisalibacillus spp., Sporobacter spp., Acidaminococcus spp., Finegoldia spp.,
Caloranaerobacter spp., Desulfonispora spp., Isobaculum spp., Anaerobacter spp., Brevibacillus spp., Atopostipes
spp., Ignavigranum spp., Staphylococcus spp., Ureibacillus spp., Cetobacterium spp., Acinetobacter spp.,
Caldilinea , Haemophilus spp.,Sphingomonas spp., Olsenella spp., Slackia spp., etc
СКОЛЬКО И КАКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ НУЖНО ВЫЯВЛЯТЬ?
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ
G.vaginalis и A. vaginae наиболее информативные маркеры БВ
БВ сопровождается образованием биопленок. Биопленка
при БВ состоит:
60-90% G.vaginalis
1-40% A.vaginae
1-15% другие бактерии
Swidsinski A., O&G, 2005
 G.vaginalis – наиболее вероятный этиологический агент
БВ (способность к адгезии и формированию биопленки).
 A.vaginae - высокоспецифичный маркер БВ, устойчивый к
метронидазолу (стандартной терапии).
ПЦР В ДИАГНОСТИКЕ БВ
НО! G.vaginalis и A.vaginae может
присутствовать у 30-60% женщин с
нормальной микрофлорой.
Качественное ПЦР исследование на
G.vaginalis и A.vaginae
не информативно!
ПЦР В ДИАГНОСТИКЕ БВ
ФлороценозБактериальный вагиноз
ДНК Bacteriaceae spp.
ДНК Lactobacillus spp.
ДНК G.vaginalis
ДНК A.vaginae
Оценивается:
 количество ДНК гарднерелл и атопобиума
 соотношение с лактобактериями
БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ
Результат сравнения с классическими
методами диагностики БВ
(критерии Амсель + критерии Ньюджента):
Амсель + Ньюджент
Флороценоз-БВ
БВ по Амсель и Ньюдженту
66
62 БВ (94,0%)
4 БВ не выявлен
Норма по Амсель и Ньюдженту
156
5 БВ
151 БВ не выявлен (96,8%)
Ivanova T., 2013
АЭРОБНЫЙ ВАГИНИТ
АЭРОБНЫЙ ВАГИНИТ
Аэробный вагинит – нарушение микрофлоры влагалища,
характеризуется доминированием аэробов на фоне
снижения лактобактерий в сочетании с развитием местной
воспалительной реакции.
Возбудители АВ:
 Enterobacteriaceae
 Staphylococcus spp.
 Streptococcus spp.




Выделения из влагалища
Симптомы воспаления
ph> 4,5
Микроскопические признаки: (преобладание
кокковой флоры, наличие парабазальных клеток,
ПМЯЛ:ЭК > 1:1)
ФЛОРОЦЕНОЗ – Аэробы
ДИАГНОСТИКА:
 микроскопическое
исследование
для
оценки
воспалительной реакции;
 оценка соотношения микроорганизмов (лактобацилл,
анаэробов и др.).
Флороценоз - оценка соотношения:
 ДНК Lactobacillus spp






ДНК Bacteriaceae
ДНК A.vaginae
ДНК. G.vaginalis
ДНК Enterobacteriaceae spp.
ДНК Staphylococcus spp.
ДНК Streptococcus spp.
ГЕНИТАЛЬНЫЕ
МИКОПЛАЗМЫ
РОЛЬ МИКОПЛАЗМ
В РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИИ
Виды
АССОЦИИРОВАННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Уретрит
Цервицит
БВ
Эндометрит
/или
ВЗОМТ
Преждевременные
роды
Бесплодие
Передача
ВИЧ
++++
+++
-
+++
+/-
+
+
-
-
++++
+/-
+/-
-
НД
+/-
-
+++
НД
+
+/-
НД
U.urealyticum
+
НД
НД
НД
НД
НД
НД
U.parvum
-
НД
НД
НД
НД
НД
НД
M.genitalium
M.hominis
Ureaplasma
spp.
НД - недостаточно данных
++++ связь доказана
+++ связь установлена в большинстве
исследований
+ связь установлена только в нескольких
исследованиях
+/- противоречивые данные
Laboratory diagnosis of sexually transmitted infections, including human immunodeficiency virus, WHO, 2013
ГЕНИТАЛЬНЫЕ МИКОПЛАЗМЫ
ФЛОРОЦЕНОЗ - оценка концентрации ДНК
 ДНК M.hominis
 ДНК U.parvum
 ДНК U.urealyticum
лечение
1 КОЕ= 10 ГЭ (104 КОЕ = 105 ГЭ)
ВУЛЬВОВАГИНАЛЬНЫЙ
КАНДИДОЗ
ВОЗБУДИТЕЛИ ВВК
Частые
С.albicans
C.tropicalis
C.parapsilosis
C.glabrata
Редкие
C.krusei
C.kefir
C.guilliermondii
C.lusitaniae
Единичные случаи
C.catenulata
и др.
C.glabrata
C.krusei
C.tropicalis
C.parapsilosis
15 - 35%
1 - 26%
5 - 27%
1 - 14%
Анкирская А. С., 2006
Мирзабалаева А.К, 2007
Прилепская В.Н.,2010
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОТДЕЛЬНЫХ
ВИДОВ Сandida К АНТИМИКОТИКАМ
Виды
Полиеновые
Азоловые
Другие
Амфотерицин
В
Флу
коназол
Итра
коназол
Кето
коназол
5фторурацил
C.albicans
S
S
S
S
S
C.glabrata
I
S-DD
S-DD
-
S
C.krusei
I
R
S-DD-R
-
I-R
C.parapsil
osis
S
S
S
S
S
C.tropicali
s
S
S
S
S
S
S-чувствительные; DD-ДЗЧ; I – недостаточно данных; R - устойчивые
Савичева А.М.,2009
ВУЛЬВОВАГИНАЛЬНЫЙ КАНДИДОЗ
Микроскопия в диагностике ВВК
• некоторые non-albicans разновидности
не формируют pseudohyphae или
hyphae и не распознаются при световой
микроскопии
• аналитическая
чувствительность
световой микроскопии – 105 – 106
МК/мл
Культуральная диагностика
• длительный срок исследования
(до 7 суток)
• сложный процесс видовой
дифференцировки
• высокая себестоимость
ВУЛЬВОВАГИНАЛЬНЫЙ КАНДИДОЗ
ПЦР
необходимо выявлять клинически
значимые виды Candida в количественном
формате!
ВУЛЬВОВАГИНАЛЬНЫЙ КАНДИДОЗ
ФЛОРОЦЕНОЗ - оценка концентрации ДНК:
 C.albicans
 C.glabrata
 C.krusei
 C.parapsilosis
/ tropicalis
Лечение
с учетом выявленного вида Candida
и чувствительности к препаратам!
ФЛОРОЦЕНОЗ
C. albicans
C. glabrata
C. krusei
C.parapsilosis|
tropicalis
Кандиды
БВассоциированные
анаэробы
G. vaginalis
A. vaginae
Lactobacillus spp.
Bacteriae (ОКБ)
Возбудители
U. parvum Микоплазмы
аэробного Enterobacteriaceae
U. urealyticum
вагинита Staphylococcus spp.
M. hominis
Streptococcus spp.
НОВЫЕ ПРОГРАММЫ ОБСЛЕДОВАНИЯ
женщин репродуктивного возраста
310001
310002
310003
310004
Флороценоз
Флороценоз и Микроскопия
Флороценоз и NCMT
Флороценоз, NCMT и Микроскопия
ПЕРВИЧНОЕ ОБРАЩЕНИЕ ПАЦИЕНТКИ
Показания к назначению исследования
Профилактическое обследование • Выделения из половых путей • Зуд, жжение, дискомфорт в области половых
органов • Планирование беременности • Беременность • Планирование инвазивных манипуляций на
органах малого таза
Флороценоз , NCMT и Микроскопия (310004)
Соотношения
концентраций ДНК
микроорганизмов
соответствуют БВ
Бактериальный
вагиноз
Преобладает
аэробная
микрофлора +
Признаки
воспаления
Аэробный вагинит
ДНК C.albicans/
C.glabrata/ C.krusei/
C.parapsilosis/tropicalis
>102ГЭ/мл
+ Признаки
воспаления
Вульвовагинальный
кандидоз
ДНК
M.hominis/U.parvum/
U.urealyticum >
105ГЭ/мл
при отсутствии других
возможных причин
развития
цервицита/вагинита
Инфекции,
ассоциированные
с U. parvum/
U. urealyticum/
M. hominis
Обнаружена ДНК
N.gonorrhoeae/
C.trachomatis/
M genitalium/
T.vaginalis
• Гонококковая
инфекция
• Урогенитальная
хламидийная
инфекция
• Трихомониаз
• Инфекция,
вызываемая
M.genitalium
ЛЕЧЕНИЕ
КОНТРОЛЬ ТЕРАПИИ НЕ РАНЕЕ ЧЕМ ЧЕРЕЗ 3-4 НЕДЕЛИ
Флороценоз и Микроскопия (310002)
N/C/M/T (ПЦР
или NASBA)
Микроскопия
Образец выдачи результатов
тестов ФЛОРОЦЕНОЗ
310004
Флороценоз, NCMT и микроскопия
ФЛОРОЦЕНОЗ
 Оптимальный тест для диагностики
основных
инфекций
урогенитального
тракта
 Автоматизированный анализ результатов
 Формулировка выдачи результатов в
соответствии
с
классификацией,
используемой в европейских руководствах
по диагностике нарушений баланса
микрофлоры влагалища
Благодарю за внимание!