Методические рекомендации АмплиСенс® Pseudomonas

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
по применению набора реагентов
для выявления и количественного определения ДНК
Pseudomonas aeruginosa в клиническом материале
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс Pseudomonas
aeruginosa-скрин-титр-FL»
Формат FRT
АмплиСенс
Федеральное бюджетное учреждение науки
«Центральный научно-исследовательский
институт эпидемиологии»,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а
ОГЛАВЛЕНИЕ
НАЗНАЧЕНИЕ .................................................................................................................... 3
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ....................................................................................... 3
ПОРЯДОК РАБОТЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ АВТОМАТИЧЕСКОЙ СТАНЦИИ ДЛЯ
ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ NucliSENS easyMAG, (bioMérieux,
Франция)............................................................................................................................. 3
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ
ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия) и RotorGene Q (Qiagen, Германия) ............................................................................................... 8
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ
ПОМОЩИ ПРИБОРОВ iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США) ................................................ 12
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 2 из 14
НАЗНАЧЕНИЕ
Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании
набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК Pseudomonas
aeruginosa в клиническом материале (кровь, плазма крови, мазок из ротоглотки,
бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), мокрота, эндотрахеальный аспират, моча, секрет
простаты, спинномозговая жидкость (СМЖ), пунктаты из очагов поражения органов и
тканей) методом
полимеразной
цепной
реакции
(ПЦР)
с
гибридизационно-
флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Pseudomonas aeruginosa-скрин-титр-FL»
совместно с приборами для ПЦР в режиме «реального времени»:
-
Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия),
-
Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия),
-
iCycler iQ, iQ5 (Bio-Rad, США).
Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции
Канал для флуорофора
Название канала детекции для разных
моделей приборов1
канал для флуорофора FAM
FAM/Green
канал для флуорофора JOE
JOE/HEX/R6G/Yellow/Cy3
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
ВНИМАНИЕ! В соответствии с Директивой Европейского Союза 1999/45/ЕС и
Регламентом (ЕС) 1272/2008 следующие реагенты подлежат маркировке как
содержащие опасные вещества:
1
Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе
методических рекомендаций к набору реагентов.
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 3 из 14
Гуанидин
тиоцианат
Wng
-
Р501
Тритон
Х-100
Xi
H225,
H319,
H336
Dgr
Р210,
Р233,
Р240,
Р241,
Р242,
Р243,
Р261,
Р264,
Р271,
Р280
Р403+
Р233,
Р403+
Р235,
Р405
Р501
автоматический
контроль над
содержанием
вещества в воздухе
рабочей зоны
класс опасности
основная опасность
ПДК макс разовая /
среднесменная, мг/м3
H225
H319
H336
R11
R36
R67
Изопропанол
Dgr
Р403+
Р233,
Р403+
Р235,
Р405
Р501
H225,
H319,
H336,
R11,
R36,
R67
Изопропанол
Dgr
Расшифровка обозначений:
F: Легковоспламеняющийся
Xn: Вредный для здоровья
Xi: Вызывающий раздражение.
2
Не требуется
Не требуется
F
R11,
R36,
R67,
S7,
S16,
S24/25,
S26
Dgr
Не требуется
Dgr
Xi
Раствор для
отмывки 4
H225,
H319,
H336
Р210,
Р233,
Р240,
Р241,
Р242,
Р243,
Р261,
Р264,
Р271,
Р280
Изопропанол
Класс опасности 3
F
R10,
R36,
R67,
S7,
S16,
S24/25,
S26
Р501
H225,
H319,
H336,
R11,
R36,
R67
Класс опасности 3
Раствор для
отмывки 3
Dgr
Р403+
Р233,
Р403+
Р235,
Р405
Пары
Xi
Нет данных
Пары
F
H225,
H319,
H336
H302,
H311,
H315,
H319,
H335,
R21/22,
R36/37/38
Пары
Раствор для
преципитации
R11,
R36,
R67,
S7,
S16,
S24/25,
S26
Нет данных
Класс опасности 3
Dgr
Р303+
Р361+
Р353,
Р304+
Р340,
Р305+
Р351+
Р338,
Р337+
Р313,
Р312,
Р370+
Р378
Р303+
Р361+
Р353,
Р304+
Р340,
Р305+
Р351+
Р338,
Р337+
Р313,
Р312,
Р370+
Р378
Р303+
Р361+
Р353,
Р304+
Р340,
Р305+
Р351+
Р338,
Р337+
Р313,
Р312,
Р370+
Р378
H302,
H319,
H411,
R22,
R41,
R51/53
Wng
1-Тиоглицерол
Р210,
Р233,
Р240,
Р241,
Р242,
Р243,
Р261,
Р264,
Р271,
Р280
Нет данных
50/10
Wng
Р260,
Р264,
Р270,
Р271,
Р273,
Р280
H302,
H312,
H332,
H412,
EUH032,
R20/21/22,
R32,
R34,
R52/53
2
50/10
Xn
H302,
H312,
H332,
H412,
EUH032
по ГН 2.2.5.1313-03
50/10
Раствор для
лизиса
R20/21/22,
R32,
R34,
R52/53,
S13,
S26,
S36/37/39,
S45,
S61
Р301+
Р312,
Р302+
Р352,
Р304+
Р340,
Р312,
Р322,
Р330,
Р363
Заявление об опасности,
дополнительная
информация, факторы
риска (R фразы)
Символы опасности и
сигнальное слово вещества
согласно Регламенту (ЕС)
1272/2008
Наименование опасного
вещества в составе
реагента
Утилизация
Хранение
Реакция
Предупреждение
Заявление об опасности,
дополнительная
информация
Символы опасности,
сигнальное слово согласно
Регламенту (ЕС) 1272/2008
Факторы риска
и безопасности реагента
(R- и S-фразы)
Символы и обозначения
опасности согласно
Директиве 1999/45/ЕС
Наименование
реагента
Меры предосторожности
Данные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе
рабочей зоны». Класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76 «Система стандартов безопасности труда.
«Вредные вещества. Классификация. Общие требования безопасности».
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 4 из 14
Dgr: Опасно.
Wng: Предупреждение.
Н225:Высокогорючая жидкость и пар.
H302: Вредно при проглатывании.
H311: Токсично при контакте с кожей.
H312: Вредно при контакте с кожей.
H315: Вызывает раздражение кожи.
H319: Вызывает серьезное раздражение глаз.
H332: Вредно при вдыхании.
H335: Может вызывать раздражение дыхательных путей.
Н336: Может вызвать вялость или сонливость.
H411: Токсичен для водных организмов с долгосрочными последствиями.
H412: Вредно для водных организмов с долгосрочными последствиями.
R10: Огнеопасно.
R11: Очень огнеопасно.
R20/21/22: Опасно при вдыхании, попадании на кожу и проглатывании.
R21/22: Опасно при попадании на кожу и проглатывании.
R22: Опасно при проглатывании.
R32: При контакте с кислотами выделяет очень токсичный газ.
R34: Вызывает ожоги.
R36: Вызывает раздражение глаз.
R36/37/38: Вызывает раздражение глаз, органов дыхания и кожи.
R41: Риск серьёзного повреждения глаз.
R51/53: Токсично для водных организмов, может вызывать продолжительные неблагоприятные изменения в
водной среде.
R52/53: Опасно для водных организмов, может вызывать продолжительные неблагоприятные изменения в
водной среде.
R67: Пары могут вызвать сонливость и головокружение.
S7: Хранить плотно закрытым.
S13: Хранить вдали от продуктов питания, напитков и корма для животных.
S16: Хранить вдали от источников воспламенения. Не курить.
S24/25: Избегать попадания на кожу и в глаза.
S26: В случае попадания в глаза немедленно промыть глаза большим количеством воды и обратиться за
медицинской помощью.
S36/37/39: Надеть соответствующую защитную одежду, перчатки и средства защиты глаз/лица.
S45: В случае аварии или при плохом самочувствии немедленно обратиться за медицинской помощью (по
возможности предъявить этикетку материала).
S61: Не допускать попадания в окружающую среду. Смотрите специальные инструкции/паспорт безопасности
материала.
P210: Хранить вдали от источников тепла, горячих поверхностей, искр, открытого пламени и других источников
воспламенения. Не курить.
P233: Хранить в плотно закрытой таре.
P240: Заземлить / соединить контейнер и приемное оборудование.
P241: Использовать взрывобезопасное электрическое оборудование.
P242: Используйте только неискрящие инструменты.
P243: Принять меры предосторожности против статического разряда.
P260: Не вдыхать пары.
Р261: Избегать вдыхания паров.
P264: Вымойте руки после работы тщательно.
P270: Не ешьте, не пейте и не курить в процессе использования этого продукта.
P271: Используйте только на открытом воздухе или в хорошо проветриваемом помещении.
P273: Избегать попадания в окружающую среду.
P280: Пользоваться защитными перчатками/ средствами защиты глаз.
P301 + P 312: При проглатывании: обратиться к врачу при плохом самочувствии.
P302 + P 352: ЕСЛИ НА КОЖУ: Промыть большим количеством воды.
P303 + Р361 + Р353: ПРИ ПОПАДАНИИ НА КОЖУ (или волосы): Немедленно снять всю загрязненную одежду.
Промыть кожу водой.
P304 + Р340: При вдыхании: Вынести пострадавшего на свежий воздух и обеспечить удобство дыхания.
P305 + P 351 + P 338: ПРИ ПОПАДАНИИ В ГЛАЗА: Осторожно промыть глаза водой в течение нескольких минут.
При наличии контактных линз, снять их и продолжить промывание водой.
P312: Обратиться к врачу при плохом самочувствии.
Р322: Специальные меры.
P330: Прополоскать рот.
P337 + P 313: Если раздражение глаз не проходит обратиться за медицинской консультацией.
P363: Постирать загрязнённую одежду перед последующим использованием.
P370 + Р378: В случае пожара: Использовать огнетушитель для тушения.
P403 + Р233: Хранить в хорошо проветривающемся месте. Держать контейнер плотно закрытым.
P403 + Р235: Хранить в хорошо проветривающемся месте. Хранить в прохладном месте.
P405: Хранить под замком.
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 5 из 14
P501: Утилизировать содержимое в соответствии с национальными правилами САНПИН 2.1.7.2790-10
"САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ОБРАЩЕНИЮ С МЕДИЦИНСКИМИ ОТХОДАМИ".
EUH032: При контакте с кислотами освобождаются очень токсичные газы.
ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать
правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от
30.08.91.
ПОРЯДОК РАБОТЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ АВТОМАТИЧЕСКОЙ СТАНЦИИ ДЛЯ
ЭКСТРАКЦИИ
НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ
NucliSENS
easyMAG,
(bioMérieux,
Франция)
Вариант 1. Экстракция ДНК с лизисом образца вне прибора.
Данный метод экстракции позволяет снизить расход буфера для лизиса NucliSens
и предпочтительнее при работе с образцами клинического материала, содержащего
сгустки.
1. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции РНК/ДНК,
следуя инструкции к прибору.
2. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие
параметры: название образца, материал (Matrix) для экстракции ДНК (Plasma),
объем образца (Volume) – 0,1 ml, объем элюции (Eluate) – 55 mkl, тип образца
(Type) – Lysed, очередность экстракции ДНК в образцах (Priority) – Normal.
3. Создать новый протокол экстракции ДНК и сохранить его. В протоколе указать,
что лизис и инкубация образцов происходит вне прибора: On-board Lysis Buffer
Dispensing-No, On-board Lysis Incubation-No.
4. Перенести таблицу образцов в созданный протокол.
5. Отобрать необходимое количество специализированных одноразовых пробирок,
предназначенных для экстракции ДНК в приборе NucliSENS easyMAG (включая
отрицательный и положительный контроли экстракции). Внести в каждую
пробирку на внутренние стенки по 10 мкл ВКО STI-87. Добавить в пробирки по
550 мкл буфера для лизиса NucliSens.
ВНИМАНИЕ! При работе с материалом, содержащем сгустки, лизис рекомендуется
проводить в пробирках объёмом 1,5 мл. После окончания инкубации (пункт 8)
следует провести центрифугирование пробирок при 10 тыс об/мин в течение 1 мин
на микроцентрифуге и перенести надосадочную жидкость в специализированные
пробирки, предназначенные для экстракции ДНК в приборе NucliSENS easyMAG.
6. В пробирки с буфером для лизиса NucliSens и ВКО STI-87, внести по 100 мкл
подготовленных
проб,
используя
наконечники
с
фильтром
и
тщательно
перемешать пипетированием. Следует избегать попадания в пробирку сгустков
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 6 из 14
слизи и крупных частиц.
8. В пробирку отрицательного контроля экстракции (В–) внести 100 мкл ОКО. В
пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и
10 мкл ПКО ДНК Ps.aerug.
9. Инкубировать пробирки в течение 10 мин при комнатной температуре.
10.Ресуспендировать пробирку с магнитной силикой NucliSens, интенсивно
перемешав на вортексе. Внести в каждую пробирку отдельным наконечником с
фильтром
по
10
мкл
магнитной
силики
и
тщательно
перемешать
пипетированием. Магнитная силика должна быть равномерно распределена по
всему объему пробирки.
11.Загрузить пробирки с образцами в прибор, установить наконечники, запустить
программу экстракции ДНК с лизисом образцов вне прибора (Off board).
12.После окончания экстракции ДНК извлечь пробирки из прибора. Пробирки с ДНКпробами перенести в зону проведения ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной
детекции продуктов амплификации.
Вариант 2. Экстракция ДНК с лизисом образца в приборе.
1. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции ДНК,
следуя инструкции к прибору.
2. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие
параметры: название образца, материал (Matrix) для экстракции ДНК – плазма
(Plasma), объем образца (Volume) – 0,1-1 ml, объем элюции (Eluate) – 55 mkl,
тип образца (Type) – Primary, очередность экстракции ДНК в образцах (Priority) –
Normal.
3. Создать новый протокол экстракции ДНК и сохранить его. В протоколе указать,
что лизис и инкубация образцов происходит автоматически в приборе: On-board
Lysis Buffer Dispensing-Yes, On-board Lysis Incubation-Yes.
4. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.
5. В каждую пробирку, предназначенную для экстракции ДНК в приборе NucliSENS
easyMAG, необходимо добавить 100 мкл подготовленных проб отдельным
наконечником с фильтром.
6. Для отрицательного контроля (В–) в пробирку, предназначенную для экстракции
ДНК в приборе NucliSENS easyMAG, необходимо добавить 100 мкл ОКО. В
пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и 10 мкл
ПКО ДНК P.aeruginosa.
7. В отдельной стерильной пробирке на 2 мл смешать магнитную силику
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 7 из 14
NucliSens и ВКО STI-87 стерильными наконечниками с фильтром в следующем
соотношении:
Количество образцов
для экстракции ДНК
1
24
(полная загрузка прибора)
8. Содержимое
пробирки
Количество магнитной
силики NucliSens, мкл
10
250
(с запасом на 1 пробу)
тщательно
перемешать.
Количество
ВКО STI-87, мкл
10
250
Смесь
магнитной
силики
NucliSens с ВКО STI-87 может храниться не более 30 мин.
9. Загрузить пробирки с образцами в прибор, установить наконечники, запустить
программу экстракции ДНК с лизисом образцов в приборе (Оn board).
10.Дождаться, пока прибор NucliSENS easyMAG не остановит работу в положении
Instrument State – Idle (примерно 15 мин).
11.Тщательно перемешать пробирку с приготовленной смесью магнитной силики
NucliSens и ВКО STI-87 на вортексе до однородного состояния.
12.Открыть крышку прибора и добавить в каждую пробирку отдельным наконечником
по 20 мкл приготовленной смеси. Каждую пробирку тщательно перемешать
пипетированием
с
помощью
многоканального
дозатора
отдельными
наконечниками с фильтром на 200 мкл.
12.Запустить на приборе программу продолжения экстракции ДНК.
13.После окончания экстракции ДНК извлечь пробирки из прибора. Пробирки с
пробами
ДНК
перенести
в
зону
проведения
ПЦР
и
гибридизационно-
флуоресцентной детекции продуктов амплификации.
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ
ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия) и
Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия)
Для работы с прибором Rotor-Gene 3000 следует использовать программу RotorGene версии 6, с прибором Rotor-Gene 6000 – программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7
(build 67) или выше.
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и
программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора RotorGene 3000 / для англоязычной версии программы Rotor-Gene 6000 / для
русскоязычной версии программы Rotor-Gene 6000.
Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно
инструкции к набору реагентов. При работе с прибором Rotor-Gene 3000 и Rotor-
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 8 из 14
Gene 6000 рекомендуется использование прозрачных ПЦР-пробирок на 0,2 мл с
плоской крышкой (детекция через дно пробирки) или пробирок на 0,1 мл.
Поместить пробирки в ротор амплификатора Rotor-Gene 3000/6000/Q так, что бы
первая пробирка попала в лунку 1; установить ротор в прибор, закрыть крышку
(ячейки ротора пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для
программирования положения проб в амплификаторе).
ВНИМАНИЕ! Если вы не полностью заполняете ротор прибора, то ее следует
уравновесить. Для этого заполните незанятые места пустыми пробирками (не
используйте пробирки от предыдущих экспериментов). Лунка 1 обязательно
должна быть заполнена какой-либо исследуемой пробиркой (не пустой).
Программирование амплификатора:
1. Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.
2. В
открывшемся
окне
выбрать
шаблон
запуска
эксперимента
Advanced/Детальный мастер и выделить Dual Labeled Probe/Hydrolysis
probes/Флуоресцентные зонды (TaqMan). Нажать кнопку New/Новый.
3. В открывшемся окне выбрать ротор на 36 лунок 36-Well Rotor/36-луночный
ротор (или на 72 лунки 72-Well Rotor/72-луночный ротор), и отметить, что вы
не используете пробирки с круглыми крышками (Rotor-Gene 3000)/закреплено
фиксирующее кольцо (Rotor-Gene 6000). Нажать кнопку Next/Далее.
4. В открывшемся окне задать оператора и выбрать объем реакционной смеси:
Reaction volume/Объем реакции – 25 мкл. Установить галочку напротив
функции 15 µl oil layer volume/15 μL объем масла/воска. Нажать кнопку
Next/Далее.
5. В открывшемся окне необходимо задать температурный профиль эксперимента.
Для
этого
нажать
кнопку
Edit
profile/Редактор
профиля
и
задать
соответствующие параметры.
Программа «АмплиСенс-1» для приборов роторного типа3
3
Цикл
Температура, °С
Время
1
2
95
95
60
72
95
15 мин
5с
20 с
15 с
5с
3
60
20 с
72
15 с
Измерение
флуоресценции
–
–
–
–
–
FAM/Green,
JOE/Yellow
–
Кол-во
циклов
1
5
40
Например, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (Qiagen,
Германия) или аналогичные.
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 9 из 14
6. После того как выбран температурный профиль эксперимента, нажать кнопку
OK/Да.
7. В окне New Run Wizard/Мастер Нового Теста нажать кнопку Calibrate/Gain
Optimisation…/Опт.уровня сигн..
а) осуществлять калибровку по каналам FAM/Green и JOE/Yellow (нажать кнопку
Calibrate Acquiring/Optimise Acquiring/Опт. Детек-мых);
б) для установки калибровки всех каналов нужно указать в графе Min
Reading/Миним. Сигнал – 5, Max Reading/Максим. Сигнал – 10. Отметить
галочкой Perform Calibration Before 1st Acquisition/Perform Optimisation
Before 1st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции.
Нажать кнопку Close/Закрыть.
8. Нажать кнопку Next/Далее, запустить амплификацию кнопкой Start run/Старт.
9. Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
10. Внести данные в таблицу образцов (открывается автоматически после
запуска
амплификации).
В
колонке
Name/Имя
указать
названия/номера
исследуемых клинических образцов. Отрицательный контроль ПЦР обозначить как
К–, положительный контроль экстракции – ПК. Напротив всех исследуемых
клинических образцов установить тип Unknown/Образец, напротив положительного
контроля экстракции – тип Positive control/Положительный контроль, напротив
отрицательного
контроля
ПЦР
–
тип
NTC.
Для
калибраторов
–
тип
Standard/Стандарт и указать их концентрации в столбце Given Conc. Значения
концентраций калибраторов указаны во вкладыше к набору реагентов. Для ячеек,
соответствующих пустым пробиркам, установить тип None/Пусто.
ВНИМАНИЕ! При установке типа None/Пусто данные образца анализироваться
не будут!
Анализ результатов
Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум
каналам – анализируются с помощью программного обеспечения используемого
прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени».
Анализ результатов амплификации BKO STI-87 (канал FAM/Green):
1. Проверьте, чтобы в таблице образцов были обозначены калибраторы и заданы
их концентрации.
2. Активировать нажатием в меню кнопки Analysis/Анализ, выбрать режим анализа
Quantitation/Количественный, активировать кнопку Cycling A. FAM/Cycling A.
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 10 из 14
Green, Show/Показать.
3. Отменить автоматический выбор уровня пороговой линии Threshold/Порог.
4. В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ)
должны
быть
активированы
кнопки
Dynamic
tube/Динамич.фон,
Slope
Correct/Коррект.уклона.
5. В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить уровень
пороговой линии Threshold/Порог = 0.03.
6. Выбрать параметр More settings/Outlier Removal/Устранение выбросов и
установить значение порога отрицательных проб (NTC Threshold/Порог Фона –
ПФ (NTC)) равным 10 %.
7. В отрицательном контроле ПЦР (К–) – ДНК-буфер – не должно быть каких-либо
значений Ct.
8. В ДНК-калибраторах должны появиться значения Ct и значения концентраций
(Calc Conc (copies/reaction)).
Анализ результатов реакции амплификации ДНК Pseudomonas aeruginosa
(канал JOE/Yellow):
1. Проверьте, чтобы в таблице образцов были обозначены калибраторы и заданы
их концентрации.
2. Активировать нажатием в меню кнопки Analysis/Анализ, выбрать режим анализа
Quantitation/Количественный, активировать кнопку Cycling A. JOE/Cycling A.
Yellow, Show/Показать.
3. Отменить автоматический выбор уровня пороговой линии Threshold/Порог.
4. В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ)
должны
быть
активированы
кнопки
Dynamic
tube/Динамич.фон,
Slope
Correct/Коррект.уклона.
5. В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить уровень
пороговой линии Threshold/Порог = 0.03.
6. Выбрать параметр More settings/Outlier Removal/Устранение выбросов и
установить значение порога отрицательных проб (NTC Threshold/Порог Фона –
ПФ (NTC)) равным 10 %.
7. В отрицательном контроле экстракции (В–) – ОКО – значение должно быть не
более 5 копий ДНК/проба.
8. В отрицательном контроле ПЦР (К–) – ДНК-буфер – значение должно быть не
более 5 копий ДНК/проба.
9. В ДНК-калибраторах должны появиться значения Ct и значения концентраций
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 11 из 14
(Calc Conc (copies/reaction)).
10. В положительном контроле экстракции (ПК) – ПКО ДНК P.aeruginosa – должно
появиться значение Ct и значение концентрации.
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ
ПОМОЩИ ПРИБОРОВ iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США)
1. Включить прибор, открыть программу iCycler/iQ5.
2. ВНИМАНИЕ! Лампа должна быть прогрета до запуска эксперимента не менее
15 мин.
3. Поместить микропробирки или стрипы в реакционный модуль амплификатора и
запрограммировать прибор.
ВНИМАНИЕ! Следить за тем, чтобы на стенках микропробирок не оставалось
капель, так как падение капли в процессе амплификации может привести к
сбою сигнала и усложнить анализ результатов. Не переворачивать стрипы при
установке в прибор.
Программирование амплификатора (осуществлять согласно инструкции
производителя прибора):
1. Войти в режим создания нового протокола амплификации, нажав кнопку Create
new, в модуле Workshop.
2. В открывшемся окне задать соответствующие параметры амплификации.
Программа «АмплиСенс-1» для приборов планшетного типа4
Цикл
Температура, °С
Время
1
95
95
60
72
95
60
72
15 мин
5с
20 с
15 с
5с
30 с
15 с
2
3
Измерение
флуоресценции
–
–
–
–
–
FAM, JOE/HEX
–
Кол-во
циклов
1
5
40
3. Дать название новому протоколу и сохранить его.
4. Создать новую плашку образцов (Plate Setup). Задать схему расположения
пробирок в планшете.
5. В открывшемся окне все клинические образцы обозначить как Unknown,
положительные контроли как «+», отрицательные контроли как «–». Калибраторы
по каналу JOE/HEX и FAM задать как Standard и указать концентрацию из
вкладыша к набору реагентов. При задании калибраторов кнопка Whole Plate
4
Например, iCycler iQ, iQ5 (Bio-Rad, США) или аналогичные.
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 12 из 14
Loading должна быть не активирована. Для всех образцов и калибраторов задать
измерение флюоресценции по двум каналам JOE/HEX и FAM.
6. Дать название схеме расположения пробирок и сохранить ее.
7. Нажать кнопку Run. В открывшемся окне отметить Use Persistant Well Factors,
нажать кнопку Begin Run и сохранить эксперимент.
Обработка данных
1. Запустить программу и открыть сохраненный файл. Для этого в модуле Workshop
нажать Data file и выбрать файл данных. Перейти в режим Data Analysis.
2. Просматривать данные отдельно по каждому каналу.
3. Для каждого канала проверить правильность автоматического выбора пороговой
линии. В норме пороговая линия должна пересекать только сигмообразные
кривые накопления сигнала положительных образцов и контролей и не
пересекать базовую линию. В случае, если это не так, повысить уровень порога,
нажав кнопку Log View и установив уровень пороговых линий (левой кнопкой
мыши) на таком уровне, где кривые флюоресценции носят линейный характер и
не пересекают кривых отрицательных образцов. В таблице результатов (окно
Quant. Results) появятся значения Ct для анализируемого канала.
4. Для анализа результатов нажать кнопку PCR Quant (iCycler iQ) или активировать
кнопку Results (расположена под кнопками с названиями флуорофоров) (iQ5).
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 13 из 14
Лист вносимых изменений
Редакция
Место внесения
изменений
27.12.10
RT
Название инструкции,
по тексту
18.08.11
VV
27.09.11
LA
Титульная страница
Нижний колонтитул
Титульная страница
Меры
предосторожности
28.05.12
IvI
Титульная страница
По тексту
29.05.12
IvI
По тексту
28.06.12
LA
Назначение
12.11.12
IvI
Титульная страница
Назначение
01.07.13
FN
22.07.14
ME
21.04.15
ChA
20.11.15
ME
По тексту
Проведение реакции
амплификации,
анализ и учет
результатов при
помощи приборов
Rotor-Gene 3000/6000
(Corbett Research,
Австралия) и RotorGene Q (QIAGEN,
Германия)
Меры
предосторожности
Меры
предосторожности
Суть вносимых изменений
Название набора «АмплиСенс Pseudomonas
aeruginosa-FL» изменено на «АмплиСенс
Pseudomonas aeruginosa-скрин-титр-FL»
Добавлен символ, обозначающий «изделие для in
vitro диагностики»
«Кат. №» и «дата изменения» заменены на
соответствующие символы
Добавлены символ, наименование и адрес
производителя
Символ «Изделие для in vitro диагностики»
перемещен в правый нижний угол страницы
Удалена информация из нижнего колонтитула
Добавлена таблица реагентов, подлежащих
маркировке, как содержащие опасные вещества
Замена значка «Изделие для in vitro диагностики»
на значок «Только для исследовательских целей»
Отрицательный контроль экстракции ОК заменен
на В–
«Выделение» заменено на «экстракцию»
Добавлен следующий клинический материал: кровь,
эндотрахеальный аспират, СМЖ и пунктаты из
очагов поражения органов и тканей
Символ RUO заменен на IVD
Добавлены подпись и печать директора ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии В.И. Покровского
Добавлена таблица «Соответствие названий
флуорофоров и каналов детекции»
Названия каналов детекции для каждого из
приборов приведены в соответствие с протоколом
№ 20 от 26.02.13
В анализе результатов по каналу JOE/Yellow в п. 8
для образцов «К-» изменен учет результата
Откорректирована таблица с опасными
реагентами
Раздел актуализирован в соответствии с шаблоном
Формат FRT Форма 2: REF R-B76-50-FT(RG,iQ) / VER 20.11.15 / стр. 14 из 14