ОВЧИННИКОВА, ЛИАНА ГРИГОРЬЕВНА Новые технологии в лабораторной диагностике паразитарных заболеваний кишечника Диагностика паразитарных заболеваний необходима: с целью выявления источников заражения для определения уровня зараженности населения для оценки качества проведения комплекса противопаразитарных мероприятий для контроля эффективности лечения паразитарных заболеваний Главный государственный санитарный врач РФ ПОСТАНОВЛЕНИЕ 25.12.2007 № 94 «Об усилении мероприятий по предупреждению паразитарных заболеваний и элиминации малярии в Российской Федерации» 2.2 ……………………………………………………………………………… 2.3 Внедрить в клинико-диагностических лабораториях современные методы лабораторной диагностики гельминтозов эфир-уксусным, химико-седиментационным или эфир-формалиновым осаждением, а также метод исследования на энтеробиоз по Рабиновичу. 2.4. Потребовать от руководителей лечебно-профилактических учреждений обеспечить режим работы клинико-диагностических лабораторий, соответствующий требованиям работы с микроорганизмами 3-4 группы патогенности и гельминтами. Методики повышения выявляемости при микроскопии Осветление препаратов Метод Като и Миура Концентрирование Седиментация Флотация Метод Като и Миура Флотация Седиментация (эфир-формалиновый метод) Диагностируемые объекты Только яйца кишечных и печеночных гельминтов Эффективен для обнаружения только яиц гельминтов кишечника (нематод, цистод) Яйца, личинки гельминтов кишечника и печени, цисты, ооцисты простейших Определяемая степень инвазии высокая, средняя высокая, средняя высокая, средняя, низкая Преимущества Готовые стекла с препаратами могут сохранятся долгое время, прост в исполнении, низкая себестоимость. Отсутствие ядовитых и едких компонентов для проведения анализа Высокая чувствительность, универсален позволяет определять практически всех паразитов кишечника (круглые и плоские черви, простейшие), дает возможность работать с консервированным материалом, позволяет проводить количественную оценку. Недостатки Низкая чувствительность, требует предварительной подготовки материалов (гигроскопичный целлофан пропитывается раствором Като), избирательность Избирателен (трематоды), требует длительного процесса подготовки, трудоемок, высокие требования к флотирующим растворам и предметным стеклам практически не выявляет взрослые формы простейших, трудоемок Время проведения пробоподготовки на одного пациента Более 1 часа Более 1 часа до 10 минут Используемые едкие или ядовитые вещества и растворы Фенол Нет формалин, эфир (ледяная уксусная кислота) СЕДИМЕНТАЦИЯ КЛАССИЧЕСКАЯ (формалин-эфирный, уксусно-эфирный метод) Ход исследования Необходимые реактивы и оборудование 1. Раствор формалина 10%-ный (10 мл формалина аптечного + 90 мл дистиллированной воды). 2. Этиловый эфир медицинский. 3. Раствор Люголя 1%-ный. 4. Центрифужные градуированные пробирки 2 шт. на один образец!!! 5. Воронки стеклянные. 6. Металлическое ситечко чайное или бинт (марля). 7. Предметные и покровные стекла. 8. Деревянные и стеклянные палочки. 9. Пипетки. 10. Резиновые пробки. 11. Микроскоп. 12. Центрифуга на 3000 об./мин. -В пробирки налить 7 мл 10%-ного раствора формалина -Добавить 1 г фекалий и тщательно перемешать при помощи палочки до образования однородной смеси -Процедить через воронку с металлическим ситечком или двухслойным бинтом в другую пробирку -Добавить 2 мл эфира -закрыть пробкой и энергично встряхивать в течение 30 с -Центрифугировать при 3000 об./мин. в течение 1 мин. (или в течение 2 мин. при 1500 об./мин.) -"Каловую пробку" палочкой отделить от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью вылить, перевернув пробирку вверх дном. -Осадок, со дна пробирки, нанести на предметное стекло пипеткой или непосредственно из пробирки Система «Parasep» модернизированный формалин-эфирный метод Пробирки (концентраторы) «Parasep» для забора и подготовки образцов кала Обновленные пробирки (концентраторы) «Parasep SF» для забора и подготовки образцов кала Станция для бесконтактной микроскопии образцов FE-5 Концентраторы PARASEP Одноразовые пластиковые пробирки для взятия, фильтрации и концентрации проб кала СЕДИМЕНТАЦИЯ “PARASEP” (формалин-эфирный, уксусно-эфирный метод) Ход исследования Необходимые реактивы и оборудование 1. Раствор формалина 10%-ный (10 мл формалина аптечного + 90 мл дистиллированной воды). 2. Этиловый эфир медицинский. 3. Раствор Люголя 1%-ный. 4. Центрифужные градуированные пробирки 2 шт. на один образец!!! 5. Воронки стеклянные. 6. Металлическое ситечко чайное или бинт (марля). 7. Предметные и покровные стекла. 8. Деревянные и стеклянные палочки. 9. Пипетки. 10. Резиновые пробки. 11. Микроскоп. 12. Центрифуга на 3000 об./мин. -В пробирку с раствором формалина добавить 0,9 мл этил-ацетета -Добавить 0,5 г фекалий с помощью шпателя на конце фильтра собрать пробирку и тщательно перемешать встряхиванием -Центрифугировать при 1200 об./мин. в течение 3 минут -"Каловую пробку" наконечником пипетки отделить от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью вылить, перевернув пробирку вверх дном. -Осадок, со дна пробирки, нанести на предметное стекло пипеткой или непосредственно из пробирки Фильтрация Фильтр расположен вертикально, т.о. фильтрация происходит латерально через фильтр 425 мкм, что приводит к тому, что грубые частицы непереваренной пищи и клетчатка оседают в смесительной камере, а жидкая часть с выделившимися в неѐ паразитами, яйцами паразитов под давлением фильтруются и центрифугируются в конической пробирке Преимущества применения пробирок (концентраторов) «Parasep» Увеличивает выявляемость возбудителей Одноразовая система, исключает подготовку и повторную обработку посуды Уменьшается опасность контаминации, т.к. минимизирован контакт персонала с исследуемыми образцами Оптимизирует работу лаборанта – сокращает время проведения анализа Оценка эффективности концентраторов «Parasep» Паразитологическая лаборатория ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии Липецкой области» Заведующая лабораторией М.Л. Хропова Применяемые методики обследования Нативный мазок Нативный мазок по Като Традиционная эфирформалиновая седиментация Эфир-формалиновая седиментация с использованием пробирок «Parasep» Результаты обследования ПАРАЗИТЫ яйца аскарид яйца описторхиса яйца ланцетовидной двуустки цисты лямблий цисты непатогенных кишечных амёб СЛУЧАИ ВЫЯВЛЕНИЯ 1 1 1 2 47 Результаты обследования При применение данных методик выявлялись возбудители паразитарных заболеваний, но количество возбудителей при микроскопии препаратов резко отличалось. Если при просмотре по Методу Като, или с 1% раствором Люголя на простейшие их обнаруживались единичные экземпляры в поле зрения, а иногда в нескольких полях зрения, то при использовании Э/Ф и Parasep в поле зрения выявлялись от 5 до 15 экземпляров возбудителей. Примеры У больного лямблиозом, выявленного в 2007г, при просмотре препаратов количество цист лямблий при использовании нативного мазка с 1% раствором Люголя обнаруживались 1-2 цисты в поле зрения, а при применении Э/Ф и Parasep в поле зрения обнаруживалось от 5-10 цист Примеры При выявлении цист непатогенных амѐб, результаты исследований также отличались по количественным показателям обнаружения возбудителя, при применении нативного мазка с 1% раствором Люголя обнаруживались 2-3 цисты в поле зрения, а при применении Э/Ф и Parasep в поле зрения обнаруживалось от 8-15 цист непатогенных амѐб. Примеры При низкой инвазии у больного описторхозом, выявленного в 2008г., при просмотре по методу Като яйца описторхиса не выявлялись, при применении методов Э/Ф и Parasep обнаруживались 1-2 яиц гельминта в 10 полях зрения Преимущества PARASEP перед традиционной седиментацией Оценка специалиста используются реагенты, не требующие специфических правил хранения, и легко приобретаемые уменьшение времени анализа (более удобное исследование пробы) снижение риска заражения (нет контакта с пробой) уменьшается количество отходов, образующихся в результате проведения анализа Преимущества PARASEP перед традиционной седиментацией Оценка специалиста возможность хранения в системе Parasep материала до 24ч в случае невозможности проведения исследования сразу улучшается стандартизация метода анализа повышается выявляемость паразитов повышается достоверность анализа FE-5 Рабочая станция для микроскопии (модернизированный формалин-эфирный метод) Снижает биологическую опасность Повышает: – Выявляемость – Стандартизацию Снижает время анализа Исключает из процесса – Предметные стѐкла – Покровные стѐкла – Пипетки Улучшает визуализацию FE-5 Рабочая станция для микроскопии (модернизированный формалин-эфирный метод) Содержит два канала: Нативная проба Окрашенная проба Позволяет добавлять пробу в ходе анализа Каналы не деформируют объекты исследования Более точно выявляет морфологические детали .127 mm .178 mm FE-5 Рабочая станция для микроскопии (модернизированный формалин-эфирный метод) Установка проточной камеры на предметном столике микроскопа Преимущества системы FE-5 Закрытая система сводит к минимуму контакт оператора с потенциально инфицированными образцами Исключает из процедуры следующие бьющиеся и режущие предметы: Пробирки для образцов Предметные и покровные стекла Обновленные пробирки (концентраторы) «Parasep SF» Обновленная паразитологическая станция ParaSys СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!