МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА УСКОРЯЮТ РЕГЕНЕРАЦИЮ

52
МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА УСКОРЯЮТ РЕГЕНЕРАЦИЮ
ДЛИТЕЛЬНО НЕЗАЖИВАЮЩИХ ЯЗВ ЖЕЛУДКА
Аскаров М. Б.
4 2008
НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологии, Москва
РЕЗЮМЕ
SUMMARY
В эксперименте изучали целесообразность использования мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток (ММСК) аутологичного костного мозга (КМ) для обеспечения ускоренного
заживления длительно незаживающих язв желудка. Показано, что аутологичные ММСК КМ,
трансплантированные в зону язвенного дефекта,
способствуют более ускоренному темпу и более
качественному заживлению хронических длительно
незаживающих язв желудка. Отмечено, что ММСК
КМ реализуют свою биорегуляторную активность
в организме не одномоментно, а за счет длительного функционирования (в наших опытах не менее
30 суток) в зоне трансплантации.
Ключевые слова: хроническая язва желудка, регенерация язвы желудка, клетки костного мозга.
In this article it was examined the application of
autological multipotent mesenchymal stromal bone
marrow cells (MMSC BM) for acceleration of gastric
ulcers regeneration. Gastric ulcer in rats was induced
by exposure to acetic acid according to the method
of Okabe. It was shown, that the transplantation
of MMSCѕ BM promoted the acceleration of
gastric ulcers regeneration by reducing destructiveinflammation phase and activation of proliferativereperation phase of regeneration process. This
effect is connected with long term (up to 30 days)
realization of bioregulatory activity MMSCѕ BM,
grafted into gastric ulcer zones. It was assumed that
transplantation of MMSCѕ BM may be used as an
alternative method of cell therapy of the chronic
peptic ulcers.
Язвенная болезнь — хроническое заболевание,
которое характеризуется торможением регенерационных процессов в зоне язвенного дефекта
и сопровождается выраженными нарушениями
регуляторных функций иммунной системы (активизация системной воспалительной реакции
и торможение лимфоидного звена иммунной системы) [1, 2, 4, 5], предопределяющими хроническое
течение заболевания [4, 7, 8]. Дисрегуляция иммунной системы поддерживает деструктивно-воспалительные изменения в зоне язвенного дефекта
и ингибирует пролиферативно-репаративную фазу
регенераторного процесса, что связано с нарушением не только синтеза структурных белков,
но и синтеза молекул межклеточного взаимодействия (пептиды) [6].
В этих условиях использование клеток костного мозга — главного органа иммуногенеза, который содержит предшественники иммуноцитов
[12], обладающие высоким морфогенетическим
потенциалом за счет продукции биорегуляторных пептидов, — индукторов восстановительных
процессов в поврежденных органах (цитокинов
и ростстимулирующих факторов) [10, 11], может
стать новым перспективным направлением лече-
ния хронических длительно незаживающих язв
за счет биорезерва собственных клеток костного
мозга.
Целью настоящего исследования явилось изучение в эксперименте целесообразности использования культивированных мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток (ММСК)
аутологичного костного мозга (КМ) для обеспечения ускоренного заживления длительно незаживающих язв желудка (ДНЯЖ).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Хроническую язву желудка моделировали на 30
крысах-самцах породы Wistar массой тела 250 – 300 г
по методу S. Okabe [9] при прекращении доступа
животных к пище за 18 часов перед операцией.
Под эфирным наркозом производили лапаротомию,
извлекали желудок и к серозной оболочке передней стенки антрального отдела желудка плотно
укрепляли кольцо с внутренним d = 0,5 см. Внутрь
кольца дозатором вносили 0,05 мл ледяной уксусной
кислоты сроком на 60 секунд. Остатки уксусной
кислоты с поверхности серозной оболочки удаляли фильтровальной бумагой. Лапаротомную
Рис. 1. Динамика заживления язвы желудка: 1 — после трансплантации ММСК КМ; 2 — после введения физиологического
раствора (контроль); × — p < 0,05 по сравнению с контролем
при том же сроке исследования.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
рану послойно ушивали наглухо. Через 7 дней
образовывалась язва, морфологически сходная
с язвой желудка у человека [9]. Полученная язва
самостоятельно заживала более 7 месяцев.
Животные с ДНЯЖ были разделены на две
группы: 1) крысы с трансплантацией ММСК КМ
(15 крыс — опытная группа); 2) крысы без применения клеточной терапии, но с введением физиологического раствора (15 крыс — контрольная
группа).
Забор клеток костного мозга производили
под эфирным наркозом из бедренных костей с промыванием полости кости забуференным физиологическим раствором объемом 0,5 мл с использованием
иглы 18G. Клетки костного мозга для получения
ММСК предварительно культивировали в среде
IMDM (Gibco, USA), содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки (HyClone, USA) на чашках Петри
при 37 ºС в инкубаторе в атмосфере с 5%-ным СО2
и с 95%-ной влажностью. Для получения монослоя
ММСК требовалось 9 – 12 суток.
ММСК КМ применяли на 9-е сутки после
моделирования ДНЯЖ под эфирным наркозом.
Для этого производили релапаротомию, гастротомию и в первой группе — трансплантацию прекультивированных ММСК КМ в виде суспензии
в количестве 4 млн клеток в 0,5 мл физиологического раствора путем обкалывания язвенного дефекта
в четыре равноудаленные точки, а во второй группе
(контроль) язвенный дефект обкалывали 0,5 мл
0,9%-ного NaCl.
Животных забивали на 10, 20, 30-е сутки после
начала лечения. Эффективность терапии оценивали с помощью визуального, планиметрического
и морфологического методов на 10, 20, 30-е сутки
после трансплантации ММСК КМ. Для морфологического исследования желудок фиксировали
в 10%-ном нейтральном формалине, готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм и окрашивали
гематоксилином-эозином.
Для выявления трансплантированных клеток
в периульцерозной зоне на этапе культивирования
их генетически метили, используя вирусный шатлвектор на основе рекомбинантного аденовируса
При сравнительном исследовании динамики заживления ДНЯЖ в двух группах
опытов были выявлены достоверные различия, выражающиеся в более высоком
темпе регенерации ДНЯЖ при использовании ММСК КМ (рис. 1). Было установлено, что уже на 10-е сутки после трансплантации ММСК отмечается достоверное
уменьшение площади язвенного дефекта
по сравнению с контрольной группой, где
язвы остаются практически таких же размеров, что и до начала лечения. По-прежнему отчетливой эта разница оставалась
на 20-е и 30-е сутки после трансплантации клеток.
Так, в группе с трансплантацией ММСК КМ площадь язвенного дефекта значительно уменьшалась
(р < 0,05) по сравнению с контрольной, что указывало на важную роль трансплантированных
клеток в регуляции процессов репаративной регенерации. Процессы регенерации язвы в группе
с применением ММСК КМ шли достоверно более
высокими темпами по сравнению с группой контроля (без клеток) (р < 0,05). На 30-е сутки в группе с трансплантацией ММСК КМ практически
отмечалось заживление язвенного дефекта, тогда
как в группе контроля отмечался все еще больших
размеров язвенный дефект.
Результатам планиметрического исследования
темпа регенерации язв соответствуют результаты
их гистологического исследования на разных сроках наблюдения.
Установлено, что в контрольной группе животных на 10-е сутки лечения в дне язвы выявляется широкий лейкоцитарно-некротический слой.
В подлежащем к зоне некроза и более глубоких
слоях отмечается выраженная диффузная воспалительная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов (рис. 2 а: см. цветную вклейку). В то же
время в группе с трансплантацией ММСК КМ
отмечалось значительное уменьшение воспалительной инфильтрации и отека вокруг язвенного
дефекта. Гистологически дно язвы было представлено более узкой зоной некроза и состояло
из некротических масс, распадающихся лейкоци-
experimental gastroenterology
экспериментальная гастроэнтерология
53
пятого типа, несущего Lac-Z ген, который
кодирует β-галактозидазу E. coli. Живые
клетки в различные сроки после трансплантации выявляли иммуногистохимически в криостатных срезах добавлением
субстрата Х-Gal, дающего характерное синезеленое окрашивание [3].
Статистическую обработку результатов
планиметрии язв проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
54
тов и молодой грануляционной ткани с большим
количеством новообразованных кровеносных сосудов и коллагеновых волокон. Вблизи язвы была
отмечена значительная инфильтрация, в основном
лимфоцитами и фиброцитами и незначительным
количеством нейтрофилов. В краях язвы определяются выраженные регенераторные изменения.
Вдали от язвы слизистая оболочка дна желудка
сохраняла свою структуру с незначительными
участками гипертрофированных желез (рис. 2 б:
см. цветную вклейку).
К 20-м суткам и особенно на 30-е сутки исследования гистологическая картина заживления язв
между исследуемыми группами животных была
еще отчетливее. Так, у животных контрольной
группы язвенные дефекты сохранялись. Дно язвы
было покрыто тонким лейкоцитарно-некротическим слоем. Отмечалась частичная эпителизация
края язвы с неупорядоченным ходом коллагеновых
волокон. Клеточные элементы были представлены
макрофагами, лимфоцитами и нейтрофилами.
В строме слизистой отмечался выраженный отек
(рис. 2 в: см. цветную вклейку). В группе с трансплантацией ММСК КМ гистологически отмечается эпителизация язвенного дефекта. В слизистой
оболочке язвенных дефектов не выявлено. На месте язвенного дефекта определялись кистоподобно-расширенные железы, выстланные пролиферирующим эпителием, структурно оформленная
слизистая оболочка, грануляционная ткань с выраженным ангиогенезом и упорядоченным ходом
коллагеновых волокон с архитектоникой, близкой
к нормальной (рис. 2 г: см. цветную вклейку).
Таким образом, результаты планиметрического
и микроскопического исследования подтверждают способность культивированных аутологичных ММСК обеспечивать более высокий темп
и более качественное заживление хронических
ДНЯЖ. Доказательством того, что более высокий
и качественный темп регенерации ДНЯЖ связан
с сохранением жизнеспособности и функциональной активности ММСК, трансплантированных
в периульцерозную зону, являются результаты
иммуногистохимического выявления в ММСК генетической конструкции с β-галактозидазной активностью, введенной в структуру гена LacZ E. coli
(сине-зеленое окрашивание продуктов реакции X
Gal) (рис. 3: см. цветную вклейку). Продукты β-галактозидазной активности были выявлены на 20-е
и 30-е сутки наблюдения, и это дает основание
считать, что, сохраняя свою жизнедеятельность
и высокую функ циональную активность, ММСК
обеспечивали присущую им продукцию биорегуляторных пептидов, которые способствовали
более быстрому восстановлению местного и системного гомеостаза, а также создавали условия
для регенерации ДНЯЖ.
ВЫВОДЫ
1. Прекультивированные мультипотентные
мезенхимальные стромальные клетки КМ ускоряют процессы регенерации ДНЯЖ за счет быстрой
смены фаз язвенного процесса: сокращения сроков
и выраженности деструктивно-воспалительной
фазы и активизации пролиферативно-регенераторной фазы язвенного процесса.
2. ММСК КМ реализуют свою биорегуляторную
активность в зоне язвенного дефекта не одномоментно, а за счет их длительного функционирования
(в наших опытах не менее 30 суток), что подтверждается выявлением ММСК КМ, предварительно
меченных рекомбинантным аденовирусом с геном
LacZ E. coli.
3. ММСК КМ могут быть использованы как биологический потенциал организма для стимуляции
процессов репаративной регенерации длительно
незаживающих язв желудка.
ЛИТЕРАТУРА
4 2008
1. Алекперов, Р. Т. Репаративные процессы при язвенной болезни
в зависимости от состояния иммунной системы / Р. Т. Алекперов,
О. А. Склянская, Л. П. Мягкова и др. // Материалы 4-го Всесоюзного
съезда гастроэнтерологов. — 1990. — Т. 1. — С. 109 – 110.
2. Бабаева, А. Г. Регенерация и система иммуногенеза / А. Г. Бабаева. — М., 1985.
3. Долгих, М. С. Применение рекомбинантной аденовирусной
конструкции AdSV40 — bGal для мониторинга трансплантированных клеток / М. С. Долгих, А. Ю. Григорьева, А. Ю. Жигулин
и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2005. —
№ 3. — С. 146 – 150.
4. Маев, И. В. Иммунные нарушения при эрозивно-язвенных поражениях слизистой оболочки гастродуоденальной зоны/И. В. Маев,
М. Г. Гаджиева, И. М. Овчинникова//Клин. мед. — 2004. Т. 12. С. 4–9.
5. Онищенко, Н. А. Недостаточность функции жизненно важных
органов как проявление иммунной дисрегуляции восстановительных процессов в них / Н. А. Онищенко // Вестник трансплант.
и искусств. органов. — 1999. — Т. 4. — С. 44 – 48.
6. Потапова, В. Б. Ультраструктура слизистой оболочки желудка
и кишечника при хронических заболеваниях этих органов: дис. …
д-ра мед. наук / В. Б. Потапова. — М., 2000.
7. Циммерман, Я. С. Язвенная болезнь и иммунная система организма / Я. С. Циммерман, Е. Н. Михалева // Клин. мед. — 2000.
Т. 7. — С. 15 – 21.
8. Borody, T. Impaired host immunity contributes to Helicobacter pylori
eradication failure / T. Borody, Z. Ren, G. Pang et al. // Am. J. Gastroenterol. — 2002. — Vol. 97, № 12. — P. 3032 – 3037.
9. Okabe, S. An overview of acetic acid ulcer models — the history and
state of the of peptic ulcer research / S. Okabe, K. Amagase // Biol. Pharm.
Bull. — 2005. — Vol. 28, № 8. — P. 1321 – 1341.
10. Jorgensen, C. Engineering mesenchimal stem cells for immunotherapy / C. Jorgensen, F. Djouad, F. Apparaily et al. // Gene Therapy. —
2003. — Vol. 10. — Р. 928 – 931.
11. Zhao, R. C. Mechanisms and perspectives on the mesenchimal
stem cell in immunotherapy / R. C. Zhao, L. Liao, Q. Han // J. Lab. Clin.
Med. — 2004. — Vol. 143. — Р. 284 – 291.
12. Weimar, J. S. Hepatocyte growth factor is produced by human
bone marrow stromal cells and promotes proliferation, adhesion
and survival of human hematopoietic progenitor cells / J. S. Weimar,
N. Miranda, E. J. Muller et al. // Exp. Hematol. 1998. — Vol. 26. —
P. 885 – 894.