Неизвестные условно патогенные бактерии представители

32Tez.qxd
24.04.2013
18:20
Page 32
Результаты клинических исследований
Неизвестные условнопатогенные
бактерии представители
микрофлоры человека
как возможные
возбудители пневмонии
Г.В. Тец, Д.С. Викина, М.Ф. Вечерковская,
А.А. Доморад, В.В. Харламова, В.В. Тец
Идентификация микроорганизмов, представляющих нормальную микрофлору ротовой полости, является актуальной
проблемой пульмонологии. Некоторые представители микрофлоры ротовой полости человека являются возбудите
лями заболеваний респираторного тракта, а плохое состояние полости рта, болезни зубов и десен увеличивают риск
возникновения пневмонии. Недостаточная изученность нормальной микрофлоры связана с отсутствием методов
культивирования, обеспечивающих выделение чистых культур этих микробов. Целью работы было изучение смешан
ных микробных биопленок в нормальной микрофлоре ротовой полости, выявление и идентификация малоизученных
или неизвестных ранее аэробных условнопатогенных бактерий, способных вызывать заболевания бронхолегочной
системы, а также оценка их устойчивости к антибиотикам.
Ключевые слова: малоизученные бактерии, условнопатогенные бактерии, микробиота ротовой полости, смешан
ные биопленки.
Введение
Расширение представлений о роли бактерий в возник
новении патологических процессов различной локализа
ции потребовало детального изучения и идентификации
состава нормальной микрофлоры человека (микробиота).
Выявлено, что среди бактерий, обитающих в организме че
ловека, много условнопатогенных, способных вызывать
заболевания различной локализации, возникновение кото
рых связано с внешними воздействиями, например стома
тологическими процедурами, или снижением уровня им
мунной защиты организма [1]. Известно, что представите
ли микрофлоры ротовой полости могут вызывать пневмо
Георгий Викторович Тец – канд. мед. наук, зав. лабора
торией инновационных программ и методов исследова
ний НПЦ “Стоматология”.
Дарья Сергеевна Викина – врачординатор кафедры
микробиологии, вирусологии и иммунологии СанктПе
тербургского государственного медицинского универ
ситета (СПбГМУ) им. акад. И.П. Павлова.
Мария Федоровна Вечерковская – врачисследова
тель кафедры микробиологии, вирусологии и иммуно
логии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Анна Абрамовна Доморад – канд. биол. наук, ст. науч.
сотр кафедры микробиологии, вирусологии и иммуно
логии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Виктория Валентиновна Харламова – студентка
IV курса СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Виктор Вениаминович Тец – профессор, зав. кафед
рой микробиологии, вирусологии и иммунологии
СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
32
Атм сферA. Пульмонология и аллергология
http://atmpress.ru
1*2013
нию [2–4]. Плохое состояние полости рта, болезни зубов и
десен увеличивают риск пневмонии. Существует очевид
ная и опасная корреляция между наличием заболеваний
ротовой полости и респираторными инфекциями. Установ
лено, что заболевания пародонта связаны с развитием
различных поражений органов дыхания, таких как внеболь
ничные и внутрибольничные пневмонии, вентиляторассо
циированные пневмонии и внебольничные пневмонии в уч
реждениях закрытого типа (домах престарелых) [2, 3]. По
следний тип пневмонии распространен среди пожилых
обитателей домовинтернатов для престарелых и по кли
ническим признакам более близок к внебольничной пнев
монии, нежели к нозокомиальной.
Несмотря на значимость для медицины, микроорга
низмы, обитающие в ротовой полости человека, остаются
недостаточно изученными: считается, что мы знаем от 5 до
30% микроорганизмов нормальной микрофлоры. Труднос
ти в ее изучении связаны прежде всего с отсутствием ме
тодов культивирования. Последнее определяется органи
зацией жизни бактерий в биопленках, которая подразуме
вает гораздо б/ольшую взаимозависимость микроорганиз
мов и создает им условия, пока невоспроизводимые в
лаборатории [4, 5]. При изучении генов микробиоты выяв
лено, что в число неизученных и практически неизвестных
входят различные бактерии, археи, грибы и вирусы.
Цель исследования: выявление и идентификация в
нормальной микрофлоре ротовой полости человека мало
изученных или неизвестных ранее аэробных условнопато
32Tez.qxd
24.04.2013
18:20
Page 33
Результаты клинических исследований
генных бактерий, которые могут вызывать поражения раз
личных отделов дыхательной системы.
Материал и методы
Материалом для исследования являлась слюна людей
в возрасте от 19 до 60 лет. Слюну собирали в стерильные
пробирки и в течение 1 ч после забора материала делали
высевы.
Для выделения бактерий использовали жидкие и ага
ризованные питательные среды: бруцеллаагар, эндо
агар, кровяной агар, агаризованную среду LВ (bioMerieux,
Франция). Колонии анализировали по характеру роста,
морфологии и изменениям свойств среды.
Для изучения бактерий использовали методы окраски
по Граму и световой микроскопии (микроскоп Olympus
BX51 TF (Olympus Corp., Япония), Digital Microscope Camera
ProgRes CF), программу для компьютера Jenoptik (Герма
ния), Camera adapter (Projection lens) UTV0.63XC, Sensor
CCD, Color 2/3''. Чистые культуры идентифицировали по
биохимической активности с помощью автоматической
системы Vitec2 (BioMerieux). Чувствительность к антибио
тикам определяли с использованием панели Vitec2.
Результаты и обсуждение
Использованный метод культивирования позволил по
лучить смешанные биопленки, похожие по морфологии на
обычные колонии, образованные бактериями одного вида
(рис. 1), включающие от 2 до 8 различных бактерий (рис. 2).
Чистые бактериальные культуры в данных условиях культи
вирования в первом высеве практически не были обнару
жены.
По организации выявленные биопленки были идентич
ны смешанным микробным сообществам, полученным на
ми ранее экспериментально [6, 7].
В результате рассевов на разные среды некоторые
смешанные биопленки удалось разделить и получить из
них чистые культуры бактерий, пригодные для идентифи
кации. Вместе с тем большинство из смешанных биопле
нок разделить в имеющихся условиях не удалось. Они ока
зались устойчивыми сообществами, которые выдержива
ли многократные (более 10) пересевы на аналогичные сре
ды. Образование на питательных средах большого числа
разнообразных смешанных биопленок свидетельствует о
существовании в микробиоте тесного взаимодействия
между различными неродственными бактериями. Устойчи
вое воспроизведение смешанных бактериальных биопле
нок и невозможность получения чистых культур указывают
на выраженный мутуализм бактерий нормальной микро
флоры. При таком взаимодействии каждый вид бактерий
получает от другого вида дополнительные факторы, кото
рые не может выработать самостоятельно. Очевидно, что
эти факторы отсутствуют и в использованных нами пита
тельных средах.
Часть бактерий, изолированных из смешанных биопле
нок в виде чистых культур и идентифицированных по био
Рис. 1. Морфология смешанных биопленок. Все пред
ставленные на снимке “колонии” являются смешанными
бактериальными биопленками.
Рис. 2. Микроскопия сме
шанной биопленки. Биоплен
ка включает грамположитель
ные и грамотрицательные
бактерии. Окраска по Граму.
химическим тестам с достоверностью 98–99%, принадле
жат к известным родам и видам, представители которых
являются возбудителями заболеваний человека различной
локализации. Вместе с тем они не описаны или малоизве
стны как представители нормальной микрофлоры ротовой
полости человека.
Среди грамположительных бактерий обнаружен
Aerococcus viridans, микроорганизм, относящийся к воз
будителям оппортунистических инфекций. Известны за
болевания, которые может вызывать A. viridans: менинги
ты, инфекции мочевыделительной системы и эндокарди
ты у детей и взрослых, септические артриты и бактерие
мии. Этот микроорганизм способен распространяться в
стационарах и считается возбудителем внутриболь
ничных (нозокомиальных) инфекций [8]. Другими грам
положительными бактериями оказались различные
стафилококки, недавно обнаруженные в ротовой полости:
Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis и
Staphylococcus warneri, а также Staphylococcus pasteuri и
Атм сферA. Пульмонология и аллергология
1*2013
http://atmpress.ru
33
32Tez.qxd
24.04.2013
18:20
Page 34
Результаты клинических исследований
S. hominis subsp. novobiosepticus, которые ранее в слюне
практически не выявлялись [9]. Все эти кокки относятся к
возбудителям оппортунистических и нозокомиальных ин
фекций [10, 11]. Среди стафилококков, выделенных в сме
шанных биопленках из ротовой полости, S. hominis subsp.
novobiosepticus характеризуется выраженной устойчивос
тью к новобиоцину, налидиксовой кислоте, пенициллину,
оксациллину, канамицину и стрептомицину. Известно, что
у этого вида также часто встречаются штаммы, устойчи
вые к эритромицину, клиндамицину, хлорамфениколу,
сульфаниламидам и ципрофлоксацину [12]. Устойчивость
к азалидам (азитромицину), макролидам (эритромицину)
и клиндамицину продемонстрировал S. hominis. Другой
стафилококк, ранее не описанный в микрофлоре ротовой
полости, – Staphylococcus pasteuri был устойчив к эритро
мицину.
Из слюны были также изолированы чистые культуры
грамотрицательных аэробных бактерий. Так, была
идентифицирована Pseudomonas putida, известная как
представитель микрофлоры воды, почвы и некоторых жи
вотных [13]. Описаны случаи заболеваний людей, вызван
ные P. putida, однако в составе нормальной микрофлоры
человека эта бактерия ранее не описана. Другая выявлен
ная псевдомонада – Pseudomonas oryzihabitans обитает в
сточных водах и недавно была обнаружена на поверхности
языка человека [14, 15]. Грамотрицательная бактерия
Klebsiella oxytoca, известная как условнопатогенный мик
роорганизм, не является типичным представителем нор
мальной микрофлоры ротовой полости человека и описана
как возбудитель оппортунистических инфекций [10]. Выяв
ленные псевдомонады продемонстрировали устойчивость
к нитрофуранам (нитрофурантоину) и цефалоспоринам
(цефазолину), пенициллинам (ампициллину и амоксицил
лину/клавуланату), фосфомицину, триметоприму/сульфа
метоксазолу, хлорамфениколу и клиндамицину.
Из ротовой полости были также выделены микробы,
которые по морфологии похожи на известные бактерии, но
по биохимической активности не могли быть достоверно
отнесены к представителям идентифицированных родов и
видов (сходство не превышало 85%). Бактерии, имеющие
сходство с Micrococcus luteus, отличались от известного
вида характером роста, размером и формой клеток, пиг
34
Атм сферA. Пульмонология и аллергология
http://atmpress.ru
1*2013
ментом и другими признаками. Часть бактерий по биохи
мической активности не могли быть идентифицированы
автоматической системой Vitec2 с последней версией ба
зы данных и отнесены к категории “неидентифицирован
ный организм”.
Носительство условнопатогенных бактерий в ротовой
полости считается важным фактором в появлении различ
ных соматических заболеваний [1]. Практически все выде
ленные и идентифицированные бактерии способны вызы
вать гнойновоспалительные процессы и являются потен
циальными возбудителями различных заболеваний орга
нов дыхания, и в частности пневмонии. С наличием таких
бактерий, не растущих на стандартных лабораторных сре
дах, может быть связана часть случаев неэффективной ла
бораторной диагностики заболеваний респираторного
тракта. Обращает на себя внимание устойчивость выде
ленных штаммов к различным антибиотикам, что повыша
ет потенциальную опасность этих микроорганизмов.
Таким образом, в ходе исследования выделены сме
шанные микробные биопленки, из которых изолированы
бактерии, неизвестные ранее как представители микро
биоты ротовой полости, способные вызывать заболевания
бронхолегочной системы человека.
Список литературы
1. Тец В.В. // Стоматология. 2008. № 87(3). С. 76.
2. ElSolh A.A. et al. // Chest. 2004. V. 126. P. 1575.
3. Koeman M. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2006. V. 173.
P. 1348.
4. Lewis K., Epstein S.S. // Microbiology Monographs / Ed. by
A. Steinbuchel. Berlin; Heidelberg, 2009. P. 181–194.
5. Epstein S.S. // Microbiology Monographs / Ed. by A. Steinbuchel.
Berlin; Heidelberg, 2009. P. 131–150.
6. Tetz V.V. // Microbios. 1994. V. 80. P. 63.
7. Tetz V.V. // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 1999. V. 107.
P. 645.
8. Kerbaugh M.A., Evans J.B. // Appl. Microbiol. 1968. V. 16. P. 519.
9. OharaNemoto Y. et al. // J. Med. Microbiol. 2008. V. 57. P. 95.
10. M/enard A. et al. // J. Clin. Microbiol. 2010. V. 48. P. 3021.
11. Brennan M.T. et al. // Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol.
Endod. 2004. V. 98. P. 665.
12. Palazzo I.C.V. et al. // J. Antimicrob. Chemother. 2008. V. 62.
P. 1222.
13. Anaissie E. et al. // Am. J. Med. 1987. V. 82. P. 1191.
14. Conti S. et al. // Appl. Oral Sci. 2009. V. 17. P. 375.
15. Kodama K. et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1985. V. 35. P. 467.