ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПРИРОДНЫХ И
advertisement
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА ___________________________________________________________________ на правах рукописи Аралов Андрей Владимирович ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПРИРОДНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ РНК ФОСФОТРИЭФИРНЫМ МЕТОДОМ Специальность: 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. Научные руководители: доктор химических наук, профессор Ефимов Владимир Алексеевич доктор химических наук Чахмахчева Оксана Григорьевна Официальные оппоненты: Михайлов Сергей Николаевич доктор химических наук, руководитель лаборатории стереохимии ферментативных реакций Учреждения РАН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта. Каюшин Алексей Львович кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии Учреждения РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. Ведущая организация: Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова. Защита состоится «18» мая 2011 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН. Автореферат разослан «15» апреля 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В.А. Олейников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. За последние 40 лет синтетические фрагменты нуклеиновых кислот зарекомендовали себя как универсальные инструменты для исследований в области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Они широко применяются для диагностики генетических заболеваний и рака, для детекции патогенных вирусов и микроорганизмов, в функциональной ге- номике и нанотехнологии, а также для лечения некоторых заболеваний с помощью антисенстерапии, что связано с их способностью образовывать комплексы с комплементарными фрагмен- тами нуклеиновых кислот и регуляторными белками. Так, все большее внимание исследователей привлекают такие синтетические фрагменты РНК, как рибозимы, малые интерферирующие РНК (siRNA) и микро-РНК (miRNA). Однако использование в живых организмах природных олигонук- леотидов ограничено в основном из-за их нестабильности в биологических системах и жидкостях. Перспективным путем развития этого направления является использование для тех же целей аналогов нуклеиновых кислот, обладающих повышенной биологической стабильностью и улучшен- ным проникновением в живые клетки. Одним из способов решения этой задачи является введение в РНК химических модификаций по сахаро-фосфатному остову. В связи с постоянно возрастающей потребностью во фрагментах РНК и их аналогах с заранее за- данными свойствами, в последнее время много внимания уделяется разработке новых методов их химического синтеза. Как и в случае синтеза ДНК, в автоматическом химическом синтезе РНК для наращивания цепи олигонуклеотидов используются защищенные нуклеотидные мономеры. Однако по сравнению с ДНК, получение РНК-мономеров осложняется наличием дополнительной 2´- гидроксильной группы. Основная причина, тормозящая развитие химического синтеза фрагментов РНК, заключается в сложности подбора ортогональных защитных групп для 5´- и 2´-гидроксилов. Для решения проблемы синтеза РНК используются два подхода, один из которых заключается в разработке методов, аналогичных современным подходам к синтезу ДНК, а второй - в разработке специальных подходов к синтезу РНК. В обоих случаях возникает проблема подбора защитных групп, которые были бы совместимы с условиями синтеза, и которые можно было бы легко и количественно удалять в условиях, не приводящих к деградации целевого продукта. Кроме того, данная проблема включает не только подбор 5´- и 2´-OH защитных групп, но также защитных групп гетероциклических оснований и фосфатного остатка. В последнее время значительный прогресс был достигнут в синтезе РНК амидофосфитным мето- дом, что привело к заметному увеличению эффективности синтеза и улучшению качества целевых продуктов. Однако в силу своих химических особенностей он не может быть использован для синтеза ряда модифицированных олигонуклеотидов, в частности производных, содержащих сильные 1 электрофильные группировки, такие как азидная и N-оксидная группировки, в составе цепи, а также стереоспецифических фосфоротиоатных аналогов нуклеиновых кислот. Решение этих проблем возможно при использовании фосфотриэфирного метода, который является хорошо разработанным, альтернативным подходом к синтезу олигонуклеотидов. Цель работы. Диссертация посвящена подбору защитных и модифицирующих групп для 2´-ОН функции рибонуклеотидов, удовлетворяющих требованиям фосфотриэфирного метода и обеспечивающих высокую эффективность автоматического синтеза РНК. Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы впервые был синтезирован ряд рибонуклеотидных мономеров, содержащих различные 2´-О-защитные группы, количественно удаляемые в близких к нейтральным условиях, и продемонстрирована высокая эффективность синтеза природных олигорибонуклеотидов с их использованием. Кроме того, синтезирован ряд мономеров, содержащих 2´-О-модифицирующие группы, в том числе 2´-О-азидометильную (AZM) группу и 2´-О-метоксиметильную (MOM) группу. Исследования по ферментативному рас- щеплению 2´-О-модифицированных олигорибонуклеотидов, а также исследования термической стабильности дуплексов, образованных этими аналогами олигорибонуклеотидов с комплементар- ными НК, позволяют сделать вывод о возможности их применения для различных молекулярнобиологических исследований. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах. Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результа- тов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (158 ссылок). Работа изложена на 117 страницах, содержит 10 рисунков, 64 схемы и 4 таблицы. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез мономеров, содержащих 2´-O-азидометильную или 2´-O-(2-азидометил)- бензоильную группу. Одним из главных требований, предъявляемым к 2´-O-защитным группам, является стабильность олигорибонуклеотидов на финальной стадии их деблокирования. Установлено, что для удаления 2´-O-защитных групп наиболее подходят близкие к нейтральным условия, и примерами групп, удаляемых в данных условиях, являются азидометильная (AZM) и (2-азидометил)бензоильная 2 (AZMB) группы. Однако эти группы не нашли применения в амидофосфитном методе синтеза, что связано с низкими выходами на стадии межнуклеотидной конденсации, вероятно из-за образования иминофосфорана по реакции Штаудингера. O-Азидометильная группа относится к классу защитных групп, удаляющихся в два этапа действи- ем три-замещенного фосфина в водно-органической среде. При взаимодействии азидной группы (как в соединении 1) с три-замещенным фосфином на первом этапе образуется иминофосфоран 2, который впоследствии гидролизуется, давая формамидный гемиацеталь 3. Разложение неустойчивого гемиацеталя 3 приводит к высвобождению гидроксильной группы 4 (Схема 1). Схема 1 Поскольку в фосфотриэфирном методе синтеза фосфор со степенью окисления (V) не вступает в реакцию с азидной группой, это позволило нам получить 2´-O-AZM-защищенные мономеры 24 и проверить их пригодность в фосфотриэфирном методе синтеза природных фрагментов РНК. Для этого нами была использована предложенная ранее Завгородним и др. схема синтеза 2´-O-AZMнуклеозидов 8 (Схема 2). Схема 2 Данная схема включала получение 3´,5´-O-защищенных нуклеозидов 5, обработку их смесью DMSO, уксусного ангидрида и уксусной кислоты для получения 2´-O-метилтиометильных (MTM) производных 6 и последующее их превращение в 2´-O-AZM-защищенные соединения 8. Обработка 2´-O-MTM производных 6 сульфурилхлоридом (или Br2) должна была бы приводить к образо3 ванию высоко реакционноспособного α-хлорэфира 7 (или α-бромэфира в случае Br2), прибавление к которому раствора азида лития в N,N-диметилформамиде (DMF) должно было давать 2´-O-AZM производные 8. Следуя данной методике и используя для активации MTM группы Br2, нами было получено, после удаления 3´,5´-O-силильной защитной группы, соответствующее 2´-O-AZM ури- диновое производное 14, которое, однако, содержало практически равное количество побочного продукта, представляющего собой по данным 1H-ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии побочный продукт 15 (Схема 3). Схема 3 Действительно, ранее было показано, что обработка уридинового производного 9 избытком суль- фурилхлорида приводит к хлорированию 5 положения урацильного кольца. Однако при 0°С и использовании минимальных избытков сульфурилхлорида авторам удалось подавить данную побочную реакцию. Для решения данной проблемы мы использовали более мягкий реагент, 2- нитробензолсульфенилхлорид (NBSCl), который позволил получить чистые 2´-O-AZM нуклеозиды 18 с практически количественными выходами (Схема 4). Нами было установлено, что в отсутствии основания NBSCl избирательно взаимодействует с MTM группой, не затрагивая гидроксильных групп рибозного кольца. Это позволило нам осуществлять введение AZM группы на уровне 3´,5´-O-деблокированных производных 16, что имеет ряд преимуществ по сравнению с используемым ранее методом. Главным преимуществом данного способа является отсутствие в мо- лекуле нуклеозида объемной липофильной силильной защитной группы, что приводит к появле- нию разницы в хроматографической подвижности продуктов 18 и исходных соединений 16 на си4 ликагеле и, как результат, облегчает контроль протекания реакции с помощью ТСХ, а также вы- деление полученных продуктов 18. В случае 2´-O-MTM-защищенных пуриновых производных 16 (B = AdeBz,GuaiBu) добавление NBSCl осуществляли в присутствии трифторметансульфоновой ки- слоты (TfOH) для того, чтобы предотвратить внутримолекулярную побочную реакцию взаимодействия 2´-O-хлорметильной группировки промежуточных соединений 17 с нуклеофильным N-3 атомом пуриновых оснований, которая приводит к образованию циклонуклеозида. Обработка соединений 18 4,4´-диметокситритилхлоридом (DMTrCl) в пиридине давала 5´-О-защищенные производные 19. Схема 4 Введение остатка фосфорной кислоты, содержащей каталитическую 4-метокси-1-оксидо-2пиколильную P-защитную группу, осуществляли двумя способами. Первый вариант включал фосфорилирование 3´-гидроксильной функции 5´-O-DMTr защищенных производных 19 бис(1,2,4триазолил)(2-хлорфенил)фосфатом 20, полученным из (2-хлорфенил)дихлорфосфата по ранее предложенной методике. Последующая обработка водным раствором бикарбоната триэтиламмо- ния (TEAB) давала соответствующие нуклеозидные фосфодиэфиры 21, которые превращали в полностью защищенные нуклеозидные фосфотриэфиры 22 действием 1-оксидо-4-метокси-2пиридинметанола в присутствии 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорида (TPSCl) и 1- метилимидазола (MeIm). В качестве второго варианта нами была разработана упрощенная мето- дика, включавшая превращение 2´,5´-O-защищенных нуклеозидов 19 в фосфотриэфир 22 действием предварительно полученным фосфодиэфиром 23 в присутствии конденсирующего реагента. Последующее избирательное удаление 2-хлорфенильной P-защитной группы из соединений 22 действием 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-еном (DBU) в водном ацетонитриле приводило к образованию целевых мономеров типа 24 (Схема 5). 5 Схема 5 В свою очередь фосфодиэфир 23 получали обработкой 1-оксидо-4-метокси-2-пиридинметанола бис(2-хлорфенил)хлорфосфатом 25 в присутствии триэтиламина (TEA), с последующим избирательным удалением из фосфотриэфира 26 одной 2-хлорфенильной группы обработкой TEA в смеси ацетонитрил – вода (Схема 6). Схема 6 Второй опробованной нами для защиты 2´-OH функции нуклеотидов группой была 2- (азидометил)бензоильная (AZMB) группа. Удаление данной группы также протекает в две стадии и включает восстановление азидной группы до аминогруппы при действии три-замещенным фосфином в водно-органической среде с последующей внутримолекулярной атакой образовавшейся аминогруппы сложноэфирной функции, что сопровождается высвобождением OH функции и образованием бензолактама 29 (Схема 7). Используя подход, аналогичный описанному ранее для введения AZMB группы по 5´- и 3´-OH функциям дезоксирибонуклеозидов, мы синтезировали 2´-O-AZMB уридиновый мономер 35 (Схема 8). 6 Схема 7 Для этого 3´,5´-O-защищенное (азидометил)бензоилхлоридом уридиновое производное полученным (AZMB-Cl), из 5 обрабатывали соответствующей 22- (азидометил)бензойной кислоты кипячением с тионилхлоридом в толуоле, в присутствии MeIm. Дальнейшее десилилирование 5´- и 3´-OH функций соединения 30 обработкой 1М тетрабутиламмонийфторидом (TBAF) в тетрагидрофуране (THF) и диметокситритилирование полученного в результате 2´-O-[2-(азидометил)бензоил]уридина 31 давали 5´-O-DMTr производное 32. Схема 8 Следующим этапом было фосфорилирование соединения 32 действием фосфодиэфира 33 в при- сутствии конденсирующего реагента. Избирательное удаление метильной P-защитной группы из фосфотриэфира 34 обработкой пиперидином давало мономер 35. Предварительно, нами была проверена устойчивость AZMB группы к действию пиперидина на уровне производного 31 и было установлено, что данная группа полностью стабильна в этих условиях в течение более 24 часов, что превышает время обработки пиперидином, требуемое для избирательного удаления из соединения 34 метильной P-защитной группы. Кроме того, обработка полностью защищенного уридинового производного 30 TBAF не сопровождалась миграцией AZMB группы, что имеет место в случае других защитных групп ацильного типа. 7 Фосфодиэфир 33 получали в две стадии обработкой 1-оксидо-4-метокси-2-пиридинметанола диметилхлорфосфатом 36 в присутствии TEA, с последующим удалением одной метильной защитной группы обработкой пиперидином (Схема 9). Схема 9 2. Синтез мономеров, содержащих 2´-O-AZM и N-AZMB группы. Как один из вариантов, мы изучили эффективность автоматического твердофазного синтеза РНК фосфотриэфирным методом с применением AZMB группы для защиты экзоциклических аминофункций гетероциклических оснований нуклеотидов. N-AZMB группа была использована нами для синтеза мономеров типа 41 и 47 дезоксирибо- и рибо-ряда, соответственно. Данную группу вводили по аминофункциям гетероциклических оснований дезоксирибо- и рибо-нуклеозидов 38 действием AZMB-Cl с предварительным триметилсилилированием гидроксильных функций рибозного или дезоксирибозного кольца, в результате чего были получены N-защищенные производные типа 39 (Схема 10). Схема 10 Дальнейшее диметокситритилирование 5´-OH функции, фосфорилирование полученных 5´-O- DMTr производных 40 и обработка их DBU в водно-органической среде давали мономеры типа 41 (Схема 11). Тимидиновый мономер получали по методике, описанной ранее. В случае рибонуклеотидов для защиты 2´-OH функций использовали AZM-группу (Схема 12). Нуклеозиды, защищенные во всех случаях, кроме уридинового производного, N-AZMB группой, 8 избирательно блокировали по 3´- и 5´-OH функциям действием 1,3-дихлоро-1,1,3,3- тетраизопропилдисилоксаном (TIPDSCl2), а затем соединения 42 обрабатывали смесью DMSO, уксусного ангидрида и уксусной кислоты, получая полностью защищенные производные 43. Схема 11 После 3´,5´-O-десилилирования 2´-O-AZM группу вводили обработкой 2´-O-MTM-защищенных соединений 44 NBSCl с последующим добавлением 1М раствора азида лития в DMF. Схема 12 Превращение MTM-аденозинового и -гуанозинового производных 44 в AZM-производные 45 про- водили в присутствии трифторметансульфоновой кислоты, как описано выше. Дальнейшая защита 5´-OH функции обработкой DMTrCl, фосфорилирование 3´-OH функции и избирательное удале- ние 2-хлорфенильной P-защитной группы давали мономеры 47. 3. Синтез мономера, содержащего 2´-O-(4-нитробензилокси)метильную группу. Ранее Гофом и др. было показано, что 2´-O-(4-нитробензилокси)метильная (4-NBOM) защитная группа устойчива в условиях стандартного амидофосфитного метода синтеза и деблокирования 9 олигонуклеотидов, и количественно удаляется при обработке 1M TBAF в течение 24 ч. Мы также решили исследовать возможность использования данной защитной группы в синтезе олигорибонуклеотидов фосфотриэфирным методом. Гофом и др., а также Цислаком и др., были описаны способы введения (4-NBOM) группы в нуклеозиды обработкой 2´,3´-O-дибутилстанниленуридина хлоридом 1-(4-нитробензилоксиметил)пиридиния в присутствии бромида тетрабутиламмония или обработкой 3´,5´-O-(1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)-2´-O-метилтиометилнуклеозидов смесью N-йодсукцинимида (NIS) и TfOH в присутствии 4-нитробензилового спирта. Схема 13 Нами была предложена альтернативная методика региоселективного введения (4-NBOM) группы. На первом этапе был осуществлен синтез ацетоксиметил 4-нитробензилового эфира 52. Для этого 4-нитробензиловый спирт 48 алкилировали метиловым эфиром бромуксусной кислоты 49 в при- сутствии карбоната цезия, с последующим омылением сложноэфирной группы соединения 50 и декарбоксилированием полученного соединения 51 при обработке тетраацетатом свинца в DMF (Схема 13). Последующее алкилирование 3´,5´-O-(1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)уридина 5 аце- токсиметил 4-нитробензиловым эфиром 52 в присутствии хлорида олова (IV) давало полностью защищенное уридиновое производное 53. Для избирательного удаления 3´,5´-O-защитной группы из соединения 53 можно использовать раствор NH4F в метаноле, а мы нашли, что для этих же целей подходит раствор фторида калия в метаноле. Дальнейшее введение DMTr-группы по 5´-OH функции, фосфорилирование и избирательное удаление с фосфатного остатка 2-хлорфенильной группы давали уридиновый мономер 56 (Схема 14). 4. Синтез мономеров, содержащих модифицирующую 2´-O-метоксиметильную группу. В настоящее время предложено большое количество 2´-O-защитных групп ацетального типа, удаление которых осуществляется кислотным гидролизом. Данные группы обладают рядом преиму- ществ, так они неспособны мигрировать, устойчивы в основных условиях, требуемых для дебло- кирования гетероциклических оснований, межнуклеотидных остатков и отщепления с носителя, и позволяют осуществлять очистку 2´-O-защищенных РНК последовательностей в нейтральных или основных условиях, а также не опасаться расщепления эндонуклеазами. 10 Схема 14 Метоксиметильная (MOM) группа нашла широкое применение в органическом синтезе для блокирования гидроксильных функций, благодаря своему малому размеру, легкости введения и устой- чивости в основных и слабокислых условиях, а также в условиях, используемых для удаления силильных, алкоксиацетильных и бензильных групп. Кроме того, она была использована в качестве 2´-O-модифицирующей группы для олигонуклеотидов, полученных H-фосфонатным методом. Однако удаление MOM группы обычно предполагает обработку сильными кислотами, которые катализируют расщепление и изомеризацию межнуклеотидных связей олигорибонуклеотидов. На первом этапе нами было синтезировано модельное соединение 58 (R = CH3) с целью подбора условий деблокирования 3´-гидроксильной функции, которые не приводили бы к миграции и расщеплению межнуклеотидных связей олигорибонуклетидов. Для этого 5´-O-(трет- бутилдифенилсилил)тимидин 57 обработали диметоксиметаном в присутствии эфирата трехфтористого бора и получили производное 58 (R = CH3) (Схема 15). Схема 15 Оказалось, что обработка соединения 58 1М раствором LiI в ацетонитриле в присутствии 0.01М HCl в течение 30 минут приводило к количественному удалению 3´-O-MOM группы, причем до- бавление воды вплоть до 10 % не влияло на скорость реакции ее удаления. С другой стороны известно, что уридилил-(3´→5´)-уридин подвергается расщеплению по межнуклеотидной связи и 11 изомеризации с образованием уридилил-(2´→5´)-уридина в 0.1М HCl (pH 1.0) при 25°С, но в тех же условиях при использовании 0.01М HCl (pH 2.0) обе эти реакции протекают с ничтожно низкой скоростью. Следовательно, можно было ожидать, что обработка 2´-O-MOM олигорибонуклеотидов 0.01М HCl не будет приводить к их деградации и изомеризации межнуклеотидных связей. Далее, нами были синтезированы еще два 5´,3´-O-защищенных тимидиновых производных, со- держащих в 3-положении аналоги MOM группы, этоксиметильную (EOM) 58 (R = C2H5) и бензи- локсиметильную (BzOM) 62 группу. Введение EOM группы осуществляли по той же методике, как и введение MOM группы, но с использованием диэтоксиметана (Схема 15). Для введения BzOM группы на первом этапе был получен соответствующий ацетоксиметилбензиловый эфир 61. Бензиловый спирт 59 обрабатывали параформом и триметилхлорсиланом в CCl4 в течение 2 часов, с последующим кипячением полученного α-хлорэфира 60 с ацетатом калия в ацетонитриле. Затем, 5´-O-(трет-бутилдифенилсилил)тимидин 57 конденсировали с соединением 61 в присутствии эфирата трехфтористого бора, в результате чего было получено 5´,3´-O-защищенное тимидиновое производное 62 (Схема 16). Схема 16 Все три группы количественно удалялись при обработке LiI в присутствии 0.01 HCl, причем скорость удаления EOM была равной, а BzOM несколько меньшей, чем скорость удаления MOM группы. Т.к. MOM и EOM группы удаляются с одинаковой скоростью, но первая имеет меньшие размеры, что должно оказывать благоприятный эффект на выходы реакции межнуклеотидной конденсации, MOM группа была выбрана нами для синтеза рибонуклеотидных мономеров типа 66, впоследствии используемых в фосфотриэфирном методе синтеза с O-нуклеофильным внутри- молекулярным катализом. Производные уридина, цитидина и аденозина 5, содержащие блокированные 3´- и 5´-гидроксилы, а в случае С и А нуклеозидов также блокированные экзоциклические аминофункции гетероциклических оснований, обрабатывали избытком диметоксиметана в присутствии эфирата трехфтористого бора в 1,2-дихлорэтане при комнатной температуре в течение 2 ч. После выделения полно12 стью блокированных нуклеозидов 64, проводили удаление TIPDS-группы действием 1М раствора TBAF в THF в течение 1 ч. Полученные МОМ-производные диметокситритилировали, а затем в полученные таким образом соединения 65 по 3´-гидроксилу вводили остаток фосфорной кислоты, содержащий 4-метокси-1-оксид-2-пиколильную Р-защитную группу последовательной обработкой (4-хлорфенил)-(1-оксидо-4-метокси-2-пиколил)фосфатом 32 в присутствии TPSCl, а затем DBU в водном ацетонитриле. В случае производных гуанозина обработка соответствующего 3´,5´-O- защищенного нуклеозида диметоксиметаном в присутствии эфирата трехфтористого бора приводила к образованию большого количества флуоресцирующего побочного продукта, поэтому в этом случае синтез 2´-О-МОМ-производного 64 осуществляли, исходя из метилтиометильного производного 63, обработкой при -40ºС трифторметансульфоновой кислотой и NIS в смеси THF – метанол (25:1) в течение 20 мин (Схема 17). Схема 17 5. Синтез, деблокирование и очистка олигонуклеотидов. Синтез олигонуклеотидов осуществляли фосфотриэфирным методом на синтезаторе Applied Bio- systems Synthesizer 381A, используя в случае мономеров 24 и 35 CPG-носитель, функционализиро- ванный уридиновыми производными 18 или 31, соответственно, а в случае мономеров 41, 47, 56 и 66, универсальный CPG носитель (Glen Research). Оценка эффективности прохождения этапов на- ращивания цепи олигонуклеотидов проводилась спектрофотометрическим измерением концентрации образующегося на стадии детритилирования карбокатиона при 478 и 498 нм. Типичный цикл элонгации цепи олигонуклеотида представлен в табл. 1, а в табл. 2 представлены выходы некоторых из полученных олигонуклеотидов. 13 Таблица 1. Цикл элонгации цепи олигонуклеотида при автоматическом синтезе. Стадия 1. Детритилирование 2. Промывка 3. Промывка 4. Конденсация 5. Промывка 6. Кэппирование 7. Промывка Растворители и реагенты 3% дихлоруксусная кислота в дихлорметане ацетонитрил Ацетонитрил-пиридин (3:1, об/об) 0.05М мономерный синтон; 0.15М TPSCl в смеси ацетонитрилпиридин (3:1, об/об) Ацетонитрил-пиридин (3:1, об/об) Уксусный ангидрид – 1-метилимидазол – ацетонитрил (1:1:8, об/об) ацетонитрил Время, мин 1.0 1.0 0.5 3.0* 0.5 0.5 1.0 * - время реакции межнуклеотидной конденсации для мономеров типа 41 составляло 0.5 мин, для мономера типа 24 – 2 мин, для мономеров типа 47, 56 и 66 – 3 мин и для мономера 35 – 5 мин. После завершения наращивания цепи, с олигонуклеотидов удаляли Р-защитную 1-оксидо-4метокси-2-пиколильную группу. Ранее для этих целей обычно использовался пиперидин (10 часов, 20°С) или смесь тиофенол-диоксан-триэтиламин (1:2:2, об/об, 3-5 часов, 20°С). Позже мы обнару- жили, что удобным и эффективным реагентом для деблокирования фосфатных остатков является 1М раствор LiI в ацетонитриле (3 часа, 20°С). Отщепление олигонуклеотидов с носителя и дебло- кирование стандартных ацильных защитных групп с экзоциклических аминофункций гетероциклических оснований осуществляли действием смеси 28% раствора водного аммиака и этанола (3:1, об/об) при 55ºС в течение 3-5 часов. N-AZMB-группы с гетероциклических оснований удаляли как описано в разделе 5.1. Полученные олигонуклеотиды выделяли гель-фильтрацией на сефадексе, и их гомогенность проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и обращенофазовой ВЭЖХ. Затем проводили удаление 2´-О-защитных групп с олигорибонуклеотидов (см. ниже). Целевые, полностью деблокированные олигонуклеотиды выделяли гель-фильтрацией. Для сравнения те же олигонуклеотиды были получены амидофосфитным методом с использованием коммерчески доступных мономеров и стандартного протокола синтеза. 5.1. Удаление 2´-О-защитных групп. Устойчивость 2´-О-AZM и 2´-О-AZMB групп к действию смеси 28% водного аммиака и этанола (3:1, об/об) проверяли на соответствующих нуклеозидных мономерах 18 и 31. Было установлено, что обе группы полностью устойчивы в этих условиях в течение 3 суток при комнатной темпера- туре или в течение 3 ч при 55ºС. Затем проверяли эффективность удаления 2´-О-AZM и 2´-О- AZMB групп обработкой мономеров типа 24 и 35 0.1М трифенилфосфином в смеси ацетонитрил- вода (9:1, об/об) или 0.1М метилдифенилфосфином в смеси диоксан-вода (4:1, об/об). 14 Таблица 2. Последовательности и выходы некоторых из синтезированных РНК. №* Последовательность олигонуклеотида Средний выход на стадии Суммарный конденсации, % выход, % I r(UUUUUUUUUUUUUUU) 99.2 56 II r(AUGGUGACCGACGCCA) 98.5 51 III r(CGCUCUCGUCGCUCUCCAUGU) 97.4 47 IV r(AAGAAGAGCCUGGAGCCCAUCU) 98.1 50 V r (AGAUGGGCUCCAGGCUCUUCUU) 97.6 48 VI r(GCUCUCGUCGCUCUCCAUG)dTT 98.3 49 VII r(CAUGGAGAGCGACGAGAGC)dTT 97.7 55 VIII r (CAGACAAAAGAAAGCGCA) 99.1 60 IX r (UCUCCUGUGUACAAGUGAGUGC) 98.9 57 X d(CGCACTCGTCGCTCACCATGT) 99.3 63 XI r(CGCACUCGUCGCUCACCAUGU) 98.2 50 XII r(CGAUCUCAUCACCUCUCCAU) 98.4 52 XIII r(UUUUUUUUUUUUUUU) 99.1 59 XIV r( CGAUCUCAUCACCUCUCCAU ) 98.9 57 * - олигонуклеотиды I-IX синтезированы, исходя из мономеров 24; олигонуклеотиды X – из мономеров 41; XI-XII - из 47 и XIII-XIV - из 66. Мы нашли, что для полного удаления 2´-О-AZM группы с мономеров 24 требуется 5-10 мин, тогда как удаление 2´-О-AZMB группы достигается в течение 30 мин. Затем, 2´-О-AZM- и 2´-О-AZMBзащищенные пентадекамерные полиуридиловые олигонуклеотиды подвергали обработке теми же реагентами в течение 1, 2, 3 и 5 часов, с последующим анализом продуктов с помощью электро- фореза в ПААГ. Было найдено, что удаление 2´-О-AZM групп с олигорибонуклеотида обработкой 0.1М трифенилфосфином полностью протекало в течение 2-3 ч при комнатной температуре, а 0.1М метилдифенилфосфином - 30 мин. В то же время удаление 2´-О-AZMB групп с олигорибо- нуклеотида требовало большего времени (1 ч с метилдифенилфосфином и 3-5 ч с трифенилфос- фином) и сопровождалось частичным его расщеплением. На основании полученных данных был сделан вывод о предпочтительности использования 2´-О-AZM-защитной группы в синтезе фраг- ментов РНК. Олигорибонуклеотиды со смешанной последовательностью оснований и 2´-О-AZMзащитной группой также полностью деблокировались в вышеописанных условиях (рис. 1). Отдельно исследовалась устойчивость N-AZMB-защитной группы к действию смеси этилового спирта и концентрированного аммиака. Как показали эксперименты на защищенных мономерах 41 и 47, а также на олигодезоксирибонуклеотиде d(CGCACTCGTCGCTCACCATGT), данная группа полностью устойчива в этих условиях в течение времени, требуемого для отщепления олигонук- леотидов с носителя и полностью удаляется за несколько часов при действии 0.1М трифенил- или метилдифенилфосфином. 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 XC BPB Рис. 1. Анализ олигорибонуклеотидов 5´CGCUCUCGUCGCUCUCCAUGU CGCUCUCGUCGCUCUCCAUGU III (дорожки 1-3), U15 I (дорожки 4-6) и 5´UCUCCUGUGUACAAGUGAGUGC UCUCCUGUGUACAAGUGAGUGC IX (дорожки 7-9) после удаления защитных групп электрофорезом в 15% денатурирующем ПААГ. 1,4,9 – олигонуклеотиды-свидетели, олигонуклеотиды полученные амидофосфитным методом; 2,5,8 – полностью деблокированные олигонуклеотиды, полученные фосфотриэфирным методом; 3,6,7 – олигонуклеотиды до удаления 2´-ОAZM защитных групп. групп Фотография в отраженном УФ-свете свете при 254 нм нм. (XC – ксиленцианол FF, BPB – бромфеноловый голубой голубой) Затем, мы синтезировали олигорибонуклеотид r(CGCACUCGUCGCUCACCAUGU Затем CGCACUCGUCGCUCACCAUGU) XI и провели его деблокирование деблокирование. После деблокирования фосфатного остатка и отщепления олигонуклеотида с носителя, азидосодержащие держащие защитные группы с аминофункций гетероциклических оснований и 2´-гидроксилов гидроксилов удаляли действием 0.1М М раствора трифенилфосфина в смеси ацетонитрил ацетонитрил-вода (9:1, 20°C, 5 чч) или метилдифенилфосфина в смеси диоксан диоксан-вода (8:1, 20°C C, 2 ч). Полученные олигонуклеотиды выделяли гель-фильтрацией фильтрацией, и их гомогенность проверяли электрофорезом в ПААГ фильтрацией (рис. 2) и обращено-фазовой фазовой ВЭЖХ. ВЭЖХ Рис. 2. Анализ олигонуклеотидов r(CGCACUCGUCGCUCACCAUGU CGCACUCGUCGCUCACCAUGU) XI (дорожки 1-3) и d(CGCACTCGTCGCTCACCATGT CGCACTCGTCGCTCACCATGT) X (дорожки 46) после удаления защитных групп электрофорезом в 15% денатур денатурирующем ПААГ. (3, 6) - олигонуклеотиды-свидетели свидетели, полученные амидофосфитным методом; (2, 5) – полностью деблокированные олиг олигонуклеотиды, полученные фосфотриэфирным методом c азидосодернуклеотиды жащими защитными группами; (1, 4) - олигонуклеотиды олигонуклеотид до удаления 2´-О-AZM и N-AZMB защитных групп групп. Фотография в отраженном УФ-свете при 254 нм. Используя уридиновый мономер 56, содержащий 2´-O-(4-NBOM)-защитную защитную группу группу, был синтез синтези- рован олигонуклеотид U15 с выходами на отдельных стадиях наращивания цепи цепи, превышающими 99%. После деблокирования фосфатного остатка и отщепления олигонуклеотида с носителя 4NBOM-группу удаляли с 2´-гидроксилов гидроксилов действием 1М М раствора TBAF в THF в течение 2 часов при комнатной температуре температуре. Затем, Затем олигонуклеотид выделяли гель гель-фильтрацией фильтрацией на колонке с ссефадексом и проверяли его гомогенность с помощью электрофореза в ПААГ (рис. 3) и обращенофазовой ВЭЖХ. Также нами исследовалась возможность удаления 2´-О-MOM группы с синтезированных олиг олигонуклеотидов на примере олигорибонуклеотидов r(U15) и r(CGAUCUCAUCACCUCUCCAU CGAUCUCAUCACCUCUCCAU) , по- лученных исходя из мономеров 66. 66 После деблокирования фосфатного остатка, остатка аминофункций ггетероциклических оснований и отщепления олигорибонуклеот олигорибонуклеотидов идов с носителя 2´-О-защищенные олигорибонуклеотиды подвергали действию реагентами реагентами, обычно используемыми для удаления MOM защитной группы: группы 30% трифторуксусной кислотой или ZnBr2 в присутствии меркаптана меркаптана. 16 Однако в этих условиях в значительной степени протекала деградации цепи олигонуклеотидов. При действии более мягкого реагента -1M LiI в ацетонитриле, содержащем 5-10% воды, в присут- ствии 0.01М HCl наблюдалось только частичное удаление MOM группы, которое также сопровождалось частичной деградацией цепи олигомеров (рис. 4). 1 2 3 Рис. 4. Электрофореграмма в 15% денатурирующем ПААГ олигонуклеотидов U15 XIII (1, 2) и 5’- CGAUCUCAUCACCUCUCCAU XIV (3, 4), полученных с использованием 2´-О-МОМ группы, до (1, 3) и после (2, 4) их обработки 1 М LiI в смеси ацетонитрил – вода (20:1) в присутствии 0.01 М соляной кислоты. Фотография в отраженном УФ-свете при 254 нм. (ХС – ксиленцианол FF, ВРВ – бромфеноловый голубой). Рис. 3. Электрофореграмма в 15% денатурирующем ПААГ олигонуклеотида U15, полученного с использованием 2´-О-(4-NBOM) защитной группы до (1) и после (2) ее удаления, (3) - тот же полностью деблокированный олигонуклеотид, полученный амидофосфитным методом. 5.2. Ферментативное расщепление 2´-О-защищенных и полностью деблокированных олиго- рибонуклеотидов. Исследования синтетических фрагментов РНК, полученных фосфотриэфирным методом с использованием мономеров 24, 35, 47 и 56 показали, что они обладают теми же свойствами, как олигорибонуклеотиды, полученные амидофосфитным методом, и дают аналогичную картину при расщеплении нуклеазами. Результаты, полученные при анализе расщепления РНКазой H, позволяют сде- лать вывод о том, что олигорибонуклеотиды, синтезированные нами фосфотриэфирным методом, достаточно чисты для использования в биологических исследованиях (рис. 5). В то же время, олигорибонуклеотиды, содержащие 2´-О-AZM и 2´-О-MOM группы, более устойчивы к действию нуклеаз, чем полностью деблокированные олигонуклеотиды. Исследовалась также стабильность 2´-О-AZM- и 2´-О-MOM-модифицированных олигонуклеотидов к действию РНК-специфических нуклеаз, в частности РНказы A и PHказы T1. Мы обнаружи- ли, что они стабильны к действию данных ферментов при концентрациях, которые приводят к полному расщеплению природных олигорибонуклеотидов. Более того, S1 нуклеаза, нуклеаза золо- тистой фасоли и экзонуклеаза III также были неспособны расщеплять 2´-О-AZM и 2´-О-MOM олигорибонуклеотиды. Наряду с этим, фосфодиэстераза змеиного яда (VPDE) и фосфодиэстераза се- лезенки рогатого скота (SPDE) расщепляли 2´-О-модифицированные олигорибонуклеотиды, но их 17 устойчивость к действию данных ферментов была выше устойчивости природных олигорибону олигорибонуклеотидов (рис. 6). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рис. 5. Электрофоретический анализ в 15% денатурирующем ПААГ при расщеплении РНКазой H 32Pмеченных олигорибонуклеотидов r((CAUGGAGAGCGACGAGAGC)dTT (а) и CGCUCUCGUCGCUCUCCGCUCUCGUCGCUCU CAUGU (б). Полосы 1-6 показывают расщепление олигорибонуклеотида (а) через 2, 5, 10, 30 и 60 минут выдерживания с ферментом и до обработки обработки, соответственно соответственно. Полосы 7 и 8 показывают олигорибонукле олигорибонуклеотид (б), синтезированный фосфотриэфирным и амидофосфитным методом методом, соответственно соответственно, а полосы 9 и 10 тот же самый олигорибонуклеотид (б) ( после выдерживания с ферментом в течение 2 часов. Визуализацию осуществляли радиоавтографией. исходное соединение (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Рис. 6. Стабильность 2´-О-AZM олигоуридилата к действию нуклеазами. нуклеазами Динамика расщепления 2´-О-AZM гомо-U15 и полностью деблокированного гомо-U15 фосфодиэстеразой селезенки рогатого скота (SPDE SPDE) (кривые 1 и 3) и фосфодиэстеразой змеиного яда (VPDE) (кривые кривые 2 и 4). 1 2 3 300 270 240 210 180 150 120 90 60 30 0 4 время (мин) 5.3. Термическая стабильность дуплексов дуплексов, образованных 2´-О-AZM AZM- и 2´-О-MOMмодифицированными олигорибонуклеотидами с комплементарными НК НК. При сравнении температур плавления (Tпл) дуплексов дуплексов, образованных полностью деблокирова деблокированными или 2´-О-AZM-защищенными защищенными олиогорибонуклеотидами с комплементарными мишенями мишенями, было установлено, что Tпл обоих типов д дуплексов очень близки (рис. 7). Установлено, Установлено что присутствие 2´-О-AZM групп в олигонуклеотидах оказывает незначительное влияние на стабильность дуплексов, хотя и приводит к небольшой их дестабилизации (~0.25°С дуплексов С на пару оснований оснований) (табл. табл 3). В свою очередь очередь, проверка гибридизационного взаимодействия 2´-О-МОМ МОМ-модифицированных 18 РНК НК с комплементарными фрагментами НК показала показала, что наличие этих группировок не оказывает значительного влияния на специфичность связывания олигонуклеотидов (рис. (рис рис 8). Так, стабильность образованных ими дуплексов с комплементарными фрагментами РНК была неско несколько вы- ше, и это повышение Тпл составило в среднем около 0.2ºС на одно звено по сравнению с приро природными дуплексами. дуплексами Однако комплексы 2´-О-МОМ-модифицированных модифицированных олигонуклеотидов с ДНК ДНКмишенями имели Тпл несколько меньшую меньшую, чем комплексы комплексы, образованные с олигори олигорибонуклеотида- ми природного типа с той же последовательностью оснований (дестабилизация дестабилизация составила ~0.3ºС на одно звено) (табл. 3). Введение единичных замен нуклеотидов в последовательности ДНК и РНК матриц приводило к снижению температуры плавления соответст соответствующих вующих дуплексов на 1015ºС С в зависимости от положения мутации. мутации температура (ºС) температура (ºС) Рис. 7. Кривые плавления дуплексов, дуплексов образованных олигонуклеотидами 5'CGCUCUCGUCGCUCUCCAUGU (а) ( и U15 (б) до и после удаления 2´-О-азидометильной азидометильной группы. группы Ра Растворы олигорибонуклеотидов (1 мкМ мкМ) отжигали с такими же объемами растворов комплементарных фрагментов нуклеиновых кислот (1 мкМ мкМ) в 0.01 М Трис-HCl Трис (pH 7.5)/0.01 М MgCl2/0.1 M NaCl при 90°С в течение 2 минут, медленно охлаждали до 20°С, С а затем нагревали со скоростью 0.5°С/мин. С мин Показаны кривые плавления дуплексов, дуплексов образованных с ДНК ДНК-матрицами – полностью деблокированными олиг олигонуклеотидами (кривые кривые 1); олигонуклеотидами с 2´-О-азидометильными азидометильными группами (кривые кривые 2) и с РНКРНК матрицей полностью деблокированным U15 (кривая 3). 1,1 1 1 0,9 A260 0,8 2 0,7 0,6 0,5 3 4 0,4 0,3 0,2 0,1 Рис. 8. Кривые плавления дуплексов дуплексов, образованных 2´-O-МОМ-модифицированными модифицированными олигонуклеотиолигонуклеот дами U15 (1,2) 2) и 5’r(CGAUCUCAUCACCUCUCCAU CGAUCUCAUCACCUCUCCAU) (3,4) с комплементарными олигодезоксирибонуклеотидами (1,3) и олигорибонуклеотидами (2,4). Растворы олигорибонуклеотидов (1 мкМ мкМ) отжигали с такими же объоб емами растворов комплементарных фрагментов нуклеиновых кислот (1 мкМ) мкМ в 0.01 М Трис-HCl Трис (pH 7.5)/0.01 М MgCl2/0.1 M NaCl при 90°С в течение 2 минут, минут медленно охлажда охлаждали до 20°С, а затем нагревали со скоростью 0.5°С/мин. 0.5°С мин 0 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 температура (ºС) 19 Таблица 3. Термическая устойчивость дуплексов, образованных 2´-О-модифицированными олигорибонуклеотидами с комплементарными мишенями. Модифицируюшая группа 2´-О-AZM Последовательность фрагмента РНК Комплементарный олигонуклеотид Tm,˚C а UUUUUUUUUUUUUUU r(AAAAAAAAAAAAAAA) 35 (-2) 2´-О-MOM UUUUUUUUUUUUUUU r(AAAAAAAAAAAAAAA) 39(+3) 2´-О-AZM UUUUUUUUUUUUUUU d(AAAAAAAAAAAAAAA) 34(-4) 2´-О-MOM UUUUUUUUUUUUUUU d(AAAAAAAAAAAAAAA) 32(-5) 2´-О-AZM AUGGUCACCGACGCCA d(TGGCGTCGGTGACCAT) 52 (-4) 2´-О-AZM CGCUCUCGUCGCUCUCCAUGU d(ACATGGAGAGCGACGAGAGCG) 67(-5) 2´-О-AZM AAGAAGAGCCUGGAGCCCAUCU d(AGATGGGCTCCAGGCTCTTCTT) 65(-6) 2´-О-AZM AGAUGGGCUCCAGGCUCUUCUU d(AAGAAGAGCCTGGAGCCCATCT) 64 (-5) 2´-О-AZM r(GCUCUCGUCGCUCUCCAUG)dTT d(CATGGAGAGCGACGAGAGC) 65 (-5) 2´-О-AZM r(CAUGGAGAGCGACGAGAGC)dTT d(GCTCTCGTCGCTCTCCATG) 64 (-4) 2´-О-AZM CAGACAAAAGAAAGCGCA d(TGCGCTTTCTTTTGTCTG) 60 (-4) 2´-О-AZM 2´-О-MOM UCUCCUGUGUACAAGUGAGUGC CGAUCUCAUCACCUCUCCAU d(GCTCTCACTTGTACTCAGGAGA) d(ATGGAGAGGTGATGAGATCG) 66 (-6) 53(-7) 2´-О-MOM CGAUCUCAUCACCUCUCCAU r(AUGGAGAGGUGAUGAGAUCG) 54(+3) – Значения в скобках показывают разницу в температурах плавления дуплексов, образованных природным и 2´-О-модифицированным олигорибонуклеотидом. а Таким образом, впервые была показана возможность проведения эффективного твердофазного синтеза олигорибонуклеотидов фосфотриэфирным методом с использованием О-нуклеофильного внутримолекулярного катализа и удаляющихся в нейтральных условиях азидосодержащих и 4NBOM-защитных групп. Разработанный метод также позволяет синтезировать 2´-O- модифицированные AZM- или МОМ-группами олигонуклеотиды и открывает перспективу для применения этих соединений и их фосфоротиоатных аналогов для различных молекулярнобиологических исследований. 20 ВЫВОДЫ 1. Разработана методика введения 2´-O-азидометильной группы в нуклеозиды, позволяющая из- бежать побочной реакции галогенирования гетероциклических оснований. 2. Разработаны схемы синтеза мономеров, содержащих 2´-O-азидометильную, 2´-O-(2- азидометил)бензоильную и N-(2-азидометил)бензоильную группы, для фосфотриэфирного метода синтеза олигорибонуклеотидов на основе O-нуклеофильного внутримолекулярного катализа. Показано, что использование мономеров, содержащих 2´-O-азидометильную азидометил)бензоильную группы, позволяет эффективно синтезировать фрагменты РНК. и N-(2- 3. Предложены новые фосфорилирующие реагенты, содержащие в своем составе O- нуклеофильную каталитическую 4-метокси-1-оксидо-2-пиколильную P-защитную группу, использование которых позволяет повысить суммарные выходы мономеров и сократить время их синтеза. 4. Предложен способ введения (4-нитробензилокси)метильной группы в состав рибонуклеозидов, получен 2´-О-(4-NBOM) уридиновый мономер для фосфотриэфирного метода и показана эффективность его использования в синтезе фрагментов РНК. 5. Разработаны схемы синтеза мономеров, содержащих модифицирующую 2´-O- метоксиметиль- ную группу, использование которых модифицированных олигорибонуклеотидов. 6. Исследования по обеспечивает ферментативному высокоэффективный расщеплению синтез олигорибонуклеотидов, 2´-O- 2´-О- модифицированных азидометильной или метоксиметильной группами, а также исследования термической стабильности дуплексов, образованных этими аналогами олигорибонуклеотидов с комплементарными НК, позволяют сделать вывод о возможности их применения для различных молекулярно-биологических исследований. 21 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи: 1. Ефимов В. А., Аралов А. В., Федюнин С. В., Клыков В. Н., Чахмахчева О. Г. Азидометильная защитная группа в синтезе олигорибонуклеотидов фосфотриэфирным методом. Биоорг. химия 2009, 35, 279-273 (Efimov V. A., Aralov A. V., Fedunin S. V., Klykov V. N., Chakhmakhcheva O. G. An azidomethyl protective group in the synthesis of oligoribonucleotides by the phosphotriester method. Russ. J. Bioorg. Chem. 2009, 35, 250–253). 2. Efimov, V.A.; Aralov, A.V.; Klykov, V.N.; Chakhmakhcheva, O.G. Synthesis of RNA by the rapid phosphotriester method using azido-based 2´-O-protecting group. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2009, 28, 846–865. 3. Ефимов В. А., Аралов А. В., Грачев С. А., Чахмахчева О. Г. N-Азидометил-бензоильная за- щитная группа в синтезе олигонуклеотидов фосфотриэфирным методом Биоорг. химия 2010, 36, 681-687 (Efimov V. A.; Aralov A. V.; Grachev S. A.; Chakhmakhcheva O. G. Nazidomethylbenzoyl blocking group in the phosphotriester synthesis of oligoribonucleotides. Russ. J. Bioorg. Chem. 2010, 36, 628–633). 4. Ефимов В.А., Аралов А.В., Чахмахчева О.Г. Метоксиметильная и (п- нитробензилокси)метильная группы в синтезе олигорибонуклеотидов фосфотриэфирным методом. Биоорг. химия. 2011, 37, 284-288 (Efimov, V.A.; Aralov, A.V.; Chakhmakhcheva, O.G. Me- thoxymethyl and (p-Nitrobenzyloxy)methyl Groups in Synthesis of Oligoribunucleotides by the Phosphotriester Method. Russ. J. Bioorg. Chem. 2011, 37, 254–258). Тезисы докладов на конференциях: 1. Аралов А.В., Чахмахчева О. Г., Ефимов В.А. Химический синтез природных и модифицированных РНК фосфотриэфирным методом. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2011, 63. 22
