ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ ИМЕНИ В.В. ЗАКУСОВА»
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ ИМЕНИ В.В. ЗАКУСОВА» На правах рукописи КУДРЯШОВ НИКИТА ВИКТОРОВИЧ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПСИХОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРАЗОЛО[C]ПИРИДИНА ГИЖ-72 И ПИРОЛЛОДИАЗЕПИНА ГМАЛ-24 В УСЛОВИЯХ НЕПРЕДСКАЗУЕМОГО ХРОНИЧЕСКОГО УМЕРЕННОГО СТРЕССА 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Калинина Татьяна Сергеевна Москва – 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ....................................................................................................................................6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................................15 1.1. Патогенез депрессивных расстройств ............................................................................15 1.1.1. Роль дендритного ремоделирования в патогенезе депрессии ...............................16 1.1.2. Роль системы эндогенных нейростероидов в патогенезе депрессии ....................19 1.1.3. Роль гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси в патогенезе депрессии ..22 1.2. Антидепрессанты: молекулярные мишени и особенности применения .....................25 1.3. Экспериментальное моделирование тревоги и депрессии: проблемы релевантности и их возможное решение .........................................................................................................36 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ...................................................46 2.1. Экспериментальные животные........................................................................................46 2.2. Изученные вещества .........................................................................................................46 2.3. Моделирование хронического стресса ...........................................................................47 2.3.1. Непредсказуемый хронический умеренный стресс ................................................47 2.4. Оценка антидепрессивной активности ...........................................................................48 2.4.1. Тест вынужденного плавания ...................................................................................48 2.5. Оценка когнитивной функции .........................................................................................48 2.5.1. Водный лабиринт Морриса .......................................................................................48 2.6. Оценка уровня тревоги .....................................................................................................49 2.6.1. Открытое поле ............................................................................................................49 2.6.2. Тест закапывания шариков........................................................................................50 2.6.3. Черно-белая камера ....................................................................................................50 2.6.4. Гипофагия ...................................................................................................................51 2.7. Оценка нейролептической активности ...........................................................................51 2.7.1. Апоморфиновая вертикализация ..............................................................................51 2.8. Изучение интероцептивных свойств ..............................................................................52 3 2.8.1. Лекарственная дифференцировка.............................................................................52 2.9. Нейрохимический анализ .................................................................................................53 2.9.1. Определение уровня моноаминов и их метаболитов .............................................53 2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных ............................................54 ГЛАВА 3. ОЦЕНКА АНТИДЕПРЕССИВНОЙ АКТИВНОСТИ ИЗУЧАЕМЫХ ВЕЩЕСТВ .......................................................................................................................................................56 3.1. Влияние продолжительности предварительного плавания на эффекты флуоксетина в тесте вынужденного плавания .............................................................................................56 3.2. Особенности антидепрессивных эффектов флуоксетина и амитриптилина в модификации теста вынужденного плавания .......................................................................59 3.3. Особенности антидепрессивной активности амитриптилина и флуоксетина при различных режимах введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса .......................................................................................................................................60 3.4. Изучение антидепрессивной активности производного пиразоло[C]пиридина ГИЖ72 при отсутствии стресса. ......................................................................................................65 3.5. Изучение антидепрессивной активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 после субхронического введения в условиях непредсказуемого умеренного хронического стресса .......................................................................................................................................69 3.6. Особенности антидепрессивной активности ГИЖ-72 после хронического перорального введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса ...................................................................................................................................................73 3.7. Изучение эффектов ГИЖ-72 в водном лабиринте Морриса после хронического введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса......................77 ГЛАВА 4. ОЦЕНКА АНКСИОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИЗУЧАЕМЫХ ВЕЩЕСТВ .......................................................................................................................................................79 4.1. Особенности анксиолитической активности изучаемых веществ при однократном введени в отсутствии стресса .................................................................................................79 4.1.1. Влияние изучаемых веществ на ориентировочно-исследовательскую реакцию 79 4.1.2. Влияние изучаемых веществ на компульсивное поведение мышей .....................81 4.1.3. Влияние ГИЖ-72 на апоморфиновую вертикализацию .........................................85 4.1.4. Влияние изучаемых веществ на тревожные реакции в «черно-белой камере» ...87 4 4.2. Особенности анксиолитической активности изучаемых веществ в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса..........................................................88 4.2.1. Влияние изучаемых веществ на ориентировочно-исследовательскую реакцию 89 4.2.2. Влияние изучаемых веществ на компульсивное поведение мышей .....................94 4.2.3. Влияние изучаемых веществ на тревожные реакции мышей в «черно-белой камере» ..................................................................................................................................96 4.2.4. Особенности анксиолитической активности ГИЖ-72 в тесте «гипофагия» после хронического перорального введения ................................................................................99 ГЛАВА 5. НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ И ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ АНТИДЕПРЕССАНТОВ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА .....................................101 5.1. Влияние непредсказуемого умеренного хронического стресса на эффекты антидепрессантов в тесте вынужденного плавания ...........................................................102 5.2. Нейрохимические изменения ........................................................................................104 ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СИСТЕМЫ ЭНДОГЕННЫХ НЕЙРОСТЕРОИДОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ПСИХОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ ГИЖ-72 И ПРЕПАРАТОВ СРАВНЕНИЯ .............................................................................................................................109 6.1. Нейростероидогенез и тревожные реакции у мышей .................................................111 6.2. Влияние нарушения нейростероидогенеза на эффекты ГИЖ-72 и флувоксамина в тесте «открытое поле» ...........................................................................................................113 6.3. Нейростероидогенез и компульсивное поведение у мышей ......................................116 6.4. Влияние нарушения нейростероидогенеза на антикомпульсивную активность ГИЖ72 и препаратов сравнения....................................................................................................118 6.5. Влияние нарушения нейростероидогенеза на антидепрессивную активность ГИЖ-72 и флуоксетина ........................................................................................................................121 ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ГАМКА-РЕЦЕПТОРА В РЕАЛИЗАЦИИ ПСИХОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ ГИЖ-72 .............................................................................123 7.1. Лекарственная дифференцировка «коразол – физиологический раствор» ...............123 ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ..........................................................................126 ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................................154 ВЫВОДЫ ...................................................................................................................................159 5 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ...................................................................................161 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .......................................................................................................162 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .........................................................................................................163 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы. тревожно-депрессивными Стремительный рост заболеваемости и негативный расстройствами эпидемиологический прогноз [Kessler and Bromet, 2013] обуславливают актуальность поиска новых средств фармакологической коррекции указанных психопатологий, которые будут обладать широким спектром терапевтического действия и достаточным профилем безопасности. Среди тревожных расстройств особое место занимает обсессивнокомпульсивное появлением расстройство навязчивых и – тревожное заболевание, тревожных мыслей связанное с (обсессии), которые сопровождаются навязчивым поведением (компульсии), направленным на снижение тревоги [Veale and Roberts, 2014]. Основу фармакотерапии обсессивно-компульсивного расстройства составляют антидепрессанты, а также анксиолитики бензодиазепинового ряда и низкие дозы нейролептиков [Decloedt and Stein, 2010; Marazziti et al., 2012; Veale and Roberts, 2014]. На сегодняшний день существует проблема резистентности к терапии селективными ингибиторами обратного захвата серотонина (СИОЗС) и трициклическим антидепрессантом (ТЦА) кломипрамином, преодоление которой, в некоторых случаях, удается достичь путем наращивания дозы, либо комбинированием антидепрессантов с антипсихотическими препаратами [Decloedt and Stein, 2010], что может увеличить риск развития нежелательных лекарственных реакций и ставит под сомнение безопасность терапии. Вышеизложенное обуславливает задачу разработки новых эффективных лекарственных средств терапии обсессивно-компульсивного расстройства, в том числе изучения антикомпульсивной активности среди новых фармакологических веществ. Развитие концепции стресса, основа которой была заложена Гансом Селье [Selye, 1956], привело к формированию представления об основополагающей роли стрессового фактора, как триггерного механизма в 7 патогенезе многих психопатологий, в т.ч. и аффективных расстройств. Непредсказуемый хронический умеренный стресс (НХУС) – экспериментальная парадигма, различные модификации которой в последнее время приобретают все большую популярность для моделирования взаимосвязи между аффективными расстройствами и воздействием на организм непредвиденных стрессовых событий [Darwish et al., 2013; Gronli, 2006; Hill et al., 2012; Javelot et al., 2014]. Использование модели НХУС позволяет, с одной стороны, сделать экспериментальные модели тревоги и депрессии более чувствительными, с другой – оценить динамику активности фармакологических веществ, в том числе и новых оригинальных соединений, в условиях длительной стрессовой экспозиции. Экспериментальные и клинические данные указывают на возможную роль стресс-зависимых систем, таких как гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковая ось [Heinzmann et al., 2011; Hernandez et al., 2013; Wang et al., 2014; Young et al., 2004] и система эндогенных нейростероидов, в реализации психотропных эффектов антидепрессантов из группы селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС) [Fry et al., 2014; Griffin and Mellon, 1999; Maurice and Su, 2009; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006]. Современные представления о нейробиологических аспектах стресса рассматривают нейростероидогенез как основу физиологической реакции на стресс [Sarkar et al., 2011]. В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» был синтезирован ряд производных пиразоло[C]пиридина и пирролодиазепинов, среди которых были отобраны соединения ГИЖ-72 (4,6-диметил-2-(4хлорфенил)-2,3-дигидро-1Н-пиразоло[4,3-C]пиридин-3-он, хлоралгидрат) и ГМАЛ-24 (2-(2-гидроксиэтил)-1,2,4,5-тетрагидро-3Н-пирроло диазепин-3-он), обладающие антидепрессивным и [1,2а][1,4] анксиолитическим эффектами, а также низкой токсичностью [Мелетова, 2007; Середенин и др., 2013]. 8 Вышеизложенное делает актуальным экспериментальное изучение антикомпульсивного эффекта соединений ГИЖ-72 и ГМАЛ-24, особенностей их анксиолитических и антидепрессивных свойств в условиях длительной стрессовой экспозиции, а также роли системы эндогенных нейростероидов в механизме действия антикомпульсивной активности психотропных препаратов. Степень разработанности проблемы. Психотропные эффекты синтезированных в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» оригинальных гетероциклических соединений ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 были обнаружены при скрининге анксиолитической и антидепрессивной активности [Мелетова, 2007; Середенин и др., 2013], что послужило основой для расширенного изучения их активности в условиях моделирования патологии при длительном применении. На сегодняшний день изучены многие нейробиологические аспекты НХУС [Bekris et al., 2005; Farhan et al., 2014; Häidkind et al., 2003; Hill et al., 2012], а также поведенческие и нейрохимические эффекты отдельных препаратов в условиях данной модели [Azpiroz et al., 1999; Darwish et al., 2013; Ducottet et al., 2003; Farhan and Haleem, 2015; Pitychoutisa et al., 2012; Rong et al., 2010; Wang et al., 2014]. Однако многие вопросы, связанные с механизмами действия фармакологических агентов в условиях длительной стрессовой экспозиции, которые могут отличаться от таковых при отсутствии стресса остаются открытыми. Благодаря целому ряду экспериментальных и клинических работ, к настоящему времени начинают формироваться представления о значительной роли системы эндогенных нейростероидов в патогенезе аффективных расстройств [Bäckström et al., 2014; Bali and Jaggi, 2014; Frye et al., 2006], а также в реализации психотропных эффектов некоторых классов антидепрессантов, в частности СИОЗС [Fry et al., 2014; Griffin and Mellon, 1999; Maurice and Su, 2009; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006]. 9 Цель исследования – экспериментальное изучение психотропной активности оригинальных гетероциклических соединений ГИЖ-72 и ГМАЛ24 при длительном введении и в условиях НХУС в сравнении с типичными антидепрессантами. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Изучить влияние НХУС на эффекты амитриптилина, флуоксетина, ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в тесте вынужденного плавания при однократном и длительном введении. 2. Изучить влияние НХУС на содержание моноаминов и их метаболитов в головном мозге мышей после однократного и хронического введения амитриптилина и флуоксетина 3. Изучить анксиолитическую активность ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 после однократного введения при отсутствии стресса и после длительного введения в условиях НХУС. 4. Изучить антикомпульсивную активность ГИЖ-72 при однократном и длительном введении в условиях НХУС в тесте закапывания шариков для мышей в сравнении с флувоксамином. 5. Изучить влияние подавления активности 5α-редуктазы и 3α- гидроксистероид дегидрогеназы на компульсивное поведение и ориентировочно-исследовательскую реакцию мышей линий BALB/C и С57BL/6. 6. Оценить влияние селективной блокады митохондриального транслокационного белка 18 кДа (TSPO) на антидепрессивную и антикомпульсивную активность ГИЖ-72 и флуоксетина. 7. Изучить роль ГАМКА-рецептора в реализации эффектов ГИЖ-72 на модели оперантного метода лекарственной дифференцировки. Научная новизна работы. Впервые показано, что антидепрессивный эффект флуоксетина в тесте вынужденного плавания, в отличие от 10 амитриптилина, находится в зависимости от кратности введения и продолжительности действия НХУС – претерпевает инверсию при субхроническом и отсутствует при однократном введении в условии НХУС. В ходе комплексного изучения анксиолитической активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 впервые установлено, что: ГИЖ-72 обладает анксиолитическим эффектом у мышей линии BALB/C при однократном и длительном введении, а также сохраняет противотревожные свойства через 24 ч после отмены хронического введения в условиях НХУС. ГИЖ-72 демонстрирует антикомпульсивную активность у мышей линий BALB/C и С57BL/6, которая не только сохраняется, но и усиливается при длительном введении в условиях НХУС, а также не исчезает через 24 ч после отмены курсового введения. ГМАЛ-24 после длительного введения в условиях НХУС ослабляет тревожные реакции мышей линии BALB/C в тестах «открытое поле» и «закапывание шариков». При фармакологической блокаде основных ферментов метаболизма прогестерона в ЦНС впервые установлено, что компульсивное поведение мышей линий BALB/C и С57BL/6, в отличие от ориентировочноисследовательской реакции, подавляется только при селективном ингибировании 5α-редуктазы. Впервые показано, что селективная блокада TSPO при применении РК11195 устраняет антидепрессивный эффект флуоксетина и приводит к продепрессивному действию ГИЖ-72 в тесте вынужденного плавания у мышей. Антикомпульсивная активность ГИЖ-72 и флуоксетина не зависит от функциональной активности TSPO. При проведении комплексного поведенческого и нейрохимического анализа антидепрессивной активности амитриптилина и флуоксетина в условиях НХУС, установлена корреляция между антидепрессивными 11 свойствами изучаемых препаратов и изменениями в моноаминергической системе головного мозга мышей на фоне длительной стрессовой экспозиции. Впервые показано, что лиганды сигма-1-рецепторов, в частности флувоксамин, потенцируют эффекты ингибиторов 5α-редуктазы. В условиях оперантной модели лекарственной дифференцировки было впервые установлено, что интероцептивные эффекты коразола не ингибируются введением ГИЖ-72, что указывает на отсутствие у ГИЖ-72 свойств лиганда положительных модуляторных сайтов ГАМКА-рецептора. Впервые показано, что антидепрессивный эффект флуоксетина в тесте вынужденного плавания у мышей находится в зависимости от наличия процедуры предварительного плавания и ее продолжительности. Научно-практическая значимость. Отсутствие антидепрессивного эффекта флуоксетина при однократном введении и его продепрессивное действие при субхроническом введении в условиях НХУС позволяет рассматривать проблемы резистентности и усугубления депрессивной симптоматики на фоне терапии СИОЗС с позиции зависимости эффектов флуоксетина от определѐнной стадии стресса. Особенности анксиолитической активности ГИЖ-72 в условиях трансляционной модели обсессивно-компульсивного расстройства (в тесте закапывания шариков) при НХУС позволяют рассматривать ГИЖ-72 в качестве перспективного средства для будущих клинических исследований. Сохранение анксиолитической активности ГИЖ-72 через 24 ч после прекращения курса хронического введения в условиях стресса свидетельствует об отсутствии синдрома отмены у изучаемого соединения, что обуславливает его преимущество по сравнению с другими анксиолитическими средствами. Выявленная зависимость антидепрессивного эффекта флуоксетина, в тесте вынужденного плавания у мышей, от предварительной посадки и ее продолжительности свидетельствует о необходимости процедуры предварительного плавания продолжительностью 5 мин за 24 ч до теста, 12 которая позволит сделать модель более чувствительной при скрининге антидепрессивной активности в рядах новых соединений. Методология и методы исследования. Эксперименты проведены с использованием целостного организма (поведенческий анализ) и на уровне систем (нейрохимический применены методы анализ). В представленной фармакологического анализа работе были (использование фармакологических анализаторов и референтых препаратов), генетического анализа поведения (использование инбредных линий животных) и метод лекарственной дифференцировки. С целью моделирования взаимосвязи тревожно-депрессивных расстройств и стрессовых событий в работе была использована модель НХУС различной продолжительности. Для оценки степени проявления депрессивных реакций и уровня тревожности были использованы следующие экспериментальные методы: тест вынужденного плавания в собственной модификации, водный лабиринт Морриса, тест «открытое поле», тест «черно-белая камера», тест «гипофагия», тест закапывания шариков. Для моделирования нарушений различных звеньев процесса нейростероидогенеза были использованы фармакологические анализаторы, блокирующие принципиальные этапы метаболизма прогестерона в ЦНС. Измерение содержания моноаминов и их метаболитов в головном мозге мышей проводили с помощью метода ВЭЖХ. Роль ГАМКАрецептора в реализации психотропных эффектов ГИЖ-72 оценивали при помощи метода лекарственной дифференцировки. Связь темы диссертации с планом научных работ учреждения. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексного научного исследования ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» (Рег. № 01201169192), а также в рамках гранта РФФИ №13-04-01596. 13 Положения, выносимые на защиту: 1. Антидепрессивный эффект флуоксетина, в отличие от амитриптилина, зависит от кратности введения и продолжительности стрессовой экспозиции. Антидепрессивный эффект амитриптилина и флуоксетина в тесте вынужденного плавания сопровождается уменьшением оборота серотонина в гиппокампе и повышением уровня норадреналина в гипоталамусе при длительном введении в условиях НХУС. 2. ГИЖ-72 обладает анксиолитическим эффектом после однократного и длительного введения, а также его отмены в условиях НХУС, в то время как ГМАЛ-24 только после длительного введения. 3. Антикомпульсивный эффект ГИЖ-72 проявляется после однократного и длительного введения в условиях НХУС, ГМАЛ-24 – только после длительного; введение флувоксамина в стрессовых условиях приводит к усилению компульсивного поведения. 4. Тревожное поведение мышей инбредных линий BALB/c и С57BL/6 в тесте закапывания шариков подавляется только при селективной блокаде 5αредуктазы, в то время как в тесте «открытое поле» уровень тревоги усиливается при блокаде 5α-редуктазы и TSPO. 5. Селективная блокада TSPO изменяет антидепрессивную, но не антикомпульсивную активность ГИЖ-72 и флуоксетина. ГИЖ-72 не влияет на интероцептивные эффекты коразола на оперантной модели лекарственной дифференцировки, что свидетельствует об отсутствии у ГИЖ-72 свойств позитивного модулятора ГАМКА-рецептора. Личный вклад автора. Автором был проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, а также полностью выполнена вся экспериментальная часть, касающаяся поведенческих исследований. Модификация теста вынужденного плавания, включающая процедуру предварительного плавания продолжительностью 5 мин, является личной разработкой автора. При активном участии автора проведен 14 нейрохимический анализ содержания уровней моноаминов и их метаболитов в различных структурах головного мозга мышей. Основные публикации по теме диссертации были подготовлены при активном участии автора. Степень достоверности. Должный уровень достоверности полученных результатов подтверждается статистических экспериментальной выборок, оценки использованием достаточного выбором общепризнанных изучаемых эффектов, объема методов использованием референтных препаратов и методов статистической обработки. Апробация работы. Результаты настоящего исследования были представлены на 27 конгрессе European College of Neuropsychopharmacology (Берлин, 2014), всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Медицинская весна 2015» (Москва, 2015), на 6-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2015). Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, реферируемых ВАК при Минобрнауки РФ, и 3 тезисов докладов. Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 198 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Работа сопровождается 22 рисунками и 22 таблицами. Список литературы включает 301 источник, из которых 10 отечественных. 15 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Патогенез депрессивных расстройств Исторически первой теорией, описывающей патогенез депрессивных расстройств, была моноаминовая теория депрессии. Согласно которой ключевым звеном патогенеза является дефицит моноаминов, таких как серотонин и норадреналин в ЦНС [Hirschfeld, 2000]. Моноаминовая гипотеза долгое время пользовалась поддержкой, поскольку объясняла клиническую эффективность антидепрессантов. Стоит отметить, что все антидепрессанты, представленные на современном фармацевтическом рынке, были разработаны в соответствии с моноаминовой концепцией, а механизм действия этой группы психотропных средств, в той или иной степени, связан с изменением активности моноаминергической системы головного мозга [Feighner, 1999; Frecska, 2010; Gahr, 2014; Khan, 2009]. Экспериментальные и клинические исследования последних лет свидетельствуют о возможной роли других систем в развитии депрессивных расстройств. Формирующиеся в настоящее время новые представления об этиологии и патогенезе депрессивных расстройств связывают их развитие с нарушением процессов нейрогенеза зрелого головного мозга [Gorman and Docherty, 2010; Mendez-David et al., 2013; Sahay and Hen, 2007; Zhou et al., 2004]. Известно, что способность почти всех известных антидепрессантов в несколько раз увеличивать число митозов стволовых клеток в субгранулярной зоне зубчатой фасции гиппокампа, составляют характерную особенность данной группы психотропных лекарственных средств, что выделяет их среди прочих [Malberg et al., 2000; Mendez-David et al., 2013; Warner-Schmidt and Duman, 2006]. В эксперименте нарушения нормального процесса нейрогенеза взрослого мозга регистрируют при хроническом стрессе, который также рассматривают в качестве фактора нейродегенеративных изменений на фоне депрессивных расстройств и срыва 16 адаптивной функции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси [Andreatini, 2012; Vreeburg et al., 2009]. На сегодняшний день нет полной ясности в вопросе, что же является пусковым стимулом для реализации нейропротективных эффектов антидепрессантов: специфическое и/или неспецифическое воздействие на моноаминергическую систему мозга, взаимодействие с гипатоламо- гипофизарно надпочечниковой осью [Weber et al., 2006; Heinzmann et al., 2011], изменения в системе эндогенных нейростероидов [Griffin and Mellon, 1999; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006] геномные эффекты некоторых антидепрессантов [Watanabe et al., 2010] или совокупность этих факторов? 1.1.1. Роль дендритного ремоделирования в патогенезе депрессии В настоящее время накоплено большое количество экспериментальных работ, свидетельствующих в пользу нейродегенеративной теории депрессии, среди которых можно выделить следующие факты: 1. У пациентов с большим депрессивным расстройством было отмечено снижение экспрессии мозгового нейротрофического фактора (Brainderived neurotrophic factor – BDNF) [Duman and Monteggia, 2006; Gorman and Docherty, 2010; Molendijk et al., 2014], а также рецепторов TrkB к нейтрофинам в головном мозге [Autry and Monteggia, 2012; Castrén and Rantamäki, 2010]; 2. В большинстве депрессивным случаев, у расстройством, больных, отмечают страдающих уменьшение большим объема гиппокампа [Bremner et al., 2000; Videbech and Ravnkilde, 2004], которое является обратимым при применении антидепрессантов. Полагают, что уменьшение объема этой структуры головного мозга связано с активными процессами нейродегенерации [Castrén and Rantamäki, 2010]. 17 3. Антидепрессанты при хроническом введении способны оказывать стимулирующее воздействие на процессы нейрогенеза в гиппокампе, и этот эффект не связан ни с химической структурой, ни с каким-либо из общепринятых механизмов действия психотропных препаратов данной группы [Malberg et al., 2000; Mendez-David et al., 2013]. Тем не менее, нейродегенеративная гипотеза не может в полной мере объяснить все аспекты развития тревожно-депрессивных расстройств. Известно, что морфологические и функциональные изменения на фоне депрессии наблюдаются не только в гиппокампе, но также затрагивают и другие структуры – префронтальную кору [Koenigs and Grafman, 2009] и миндалевидное тело [Yang et al., 2010], в то время как процессы нейрогенеза наиболее характерны для гиппокампа и обонятельной луковицы [Au and Fishell, 2006; Ming and Song, 2011]. В связи с этим следует рассмотреть и другие нейрональные факторы, которые могут лежать в основе патогенеза депрессивных расстройств. Таким дополняющим фактором для нейродегенеративной концепции депрессии может служить явление дендритного ремоделирования, которое заключается в том, что дендриты нейронов головного мозга находятся в динамическом состоянии и способны изменять свою длину [Gorman and Docherty, 2010]. В свою очередь, на поверхности дендритов расположены особые выросты – дендритные шипики, способные появляться и исчезать. Как полагают, дендритные шипики могут играть важную роль в синаптической передачи, поскольку несут на своей поверхности рецепторы к большинству нейротрансмиттеров ЦНС и нейротрофинам [Hung et al., 2008; Nimchinsky and Sabatini, 2002; Sala and Segal, 2014]. Известно, что хронический стресс вызывает атрофию дендритных шипиков в области гиппокампа и префронтальной коры, что сопровождается дефицитом синаптической пластичности и нарушением памяти [Chen et al., 2008; Radley et al., 2006, Zhou et al., 2004]. Длительный стресс вызывает ретракцию дендритов и потерю дендритных шипиков, предположительным 18 механизмом этого явления считают стресс-индуцированное усиление глутаматергической нейротрансмиссии в ЦНС, которое приводит к переактивации NMDA-рецепторов, расположенных, в том числе, и на дендритных шипиках [Christian et al., 2011; Conrad, 2006]. Роль возбуждающих аминокислот, в том числе и глумата, в формировании расстройств эмоциональной сферы обсуждается достаточно длительное время [Paul et al., 2003]. В настоящий момент накоплено большое количество экспериментальных и клинических данных, свидетельствующих об усилении глутаматергической нейротрансмисии у больных, страдающих депрессивными расстройствами. Кроме того, было показано, что на внешние факторы, к числу которых относится и стресс, организм реагирует усилением глутаматергической нейротрансмиссии в ЦНС [Sanacora et al., 2012]. В состоянии физиологической нормы глутамат наряду с BDNF играет важную роль в формировании, регуляции размеров и плотности дендритных шипиков [Gorman and Docherty, 2010; Sala and Segal, 2014], но чрезмерная активность глуматергической нейротрансмиссии ведет к прямо противоположному эффекту – атрофии дендритных шипиков [Gorman and Docherty, 2010]. Уменьшение плотности последних может быть как следствием избыточного действия глутамата, так и выступать в качестве компенсаторно-защитной реакции нейронов от чрезмерной стимуляции глутаматом. Стоит отметить, что атрофия дендритных шипиков опосредована активацией быстрых ионотропных глутаматных рецепторов – NMDA, в то время как стимуляция метаботропных GluN1, GluN2A и GluN2B сопровождается ростом шипиков [Sala and Segal, 2014]. Феномен дендритного ремоделирования, с одной стороны, позволяет сохранить концепцию об основополагающей роли стресса в развитии расстройств эмоциональной сферы, с другой, частично обосновать симптоматику депрессивных расстройств. Если принять во внимание, что сокращение дендритных шипиков приводит к уменьшению количества синаптических связей и, как следствие, к нарушению нормальной 19 синаптической передачи, то можно предположить, что нарушается нормальное взаимодействие между ключевыми структурами головного мозга – префронтальной корой, миндалевидным телом и гиппокампом [Gorman and Docherty, 2010]. В частности, префронтальная кора может потерять свое тормозное влияние на миндалевидное тело [Quirk et al., 2003; Zink et al., 2010], и такое нарушение взаимосвязи между структурами может способствовать развитию неконтролируемой тревоги [Gorman and Docherty, 2010] – одного из частых коморбидных состояний депрессии. Другим важным аспектом является роль дендритных шипиков в процессах памяти и обучения [Hung et al., 2008], поскольку потеря шипиков или уменьшение их плотности может играть важную роль в нарушении обработки положительных воспоминаний (положительного опыта), находящихся в гиппокампе, префронтальной корой, формируя мрачное и бесперспективное видение будущего, т.е. речь идет о невозможности использования предыдущего позитивного опыта. Феномен дендритного ремоделирования не может в полной мере являться обоснованием патогенеза депрессивных расстройств, но может служить дополняющим элементом для нейродегенеративной концепции депрессии, укрепляя основополагающую роль стресса в формировании расстройств эмоциональной сферы. 1.1.2. Роль системы эндогенных нейростероидов в патогенезе депрессии На сегодняшний день сформировалось понимание фундаментальной роли эндогенных нейростероидов в формировании аффективных расстройств [Bäckström et al., 2014; Bali and Jaggi, 2014; Frye et al., 2006]. Биосинтез нейростероидов в головном мозге является консервативным свойством позвоночных и обнаружен у рыб, амфибий, птиц, млекопитающих. Как установлено, к индукции центрального (преимущественно в гиппокампе, миндалевидном комплексе и гипоталамусе) биосинтеза нейростероидов 20 приводит активация митохондриального транслокационного белка 18 кДа (который ранее называли периферическим бензодиазепиновым рецептором или бензодиазепиновым митохондриальным рецептором) [Gavish et al., 1999]. В результате нейростероидогенеза в ЦНС образуется аллопрегнанолон, который является позитивным модулятором нейростероидного сайта ГАМКА рецепторов [Reddy, 2010]. В ряде клинических работ было показано, что большое депрессивное расстройство, предменструальное дисфорическое расстройство, депрессия на поздних сроках беременности, тревожные расстройства и другие нарушения эмоциональной сферы сопровождаются снижением уровня аллопрегнанолона в крови и ликворе больных [Hellgren et al., 2014; Schüle et al., 2014], в то время как антидепрессанты, в частности селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, способны повышать его концентрацию [Griffin and Mellon, 1999; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006]. Система эндогенных нейростероидов также вовлечена в регуляцию ответа организма на стресс [Torres et al., 2001] и имеет свою определенную специфику на фоне острого и хронического стрессового воздействия [Bali and Jaggi, 2014]. Было показано, что острый плавательный стресс длительностью 10 мин приводит к повышению уровня аллопрегнанолона в коре, гипоталамусе и плазме крыс [Purdy et al., 1991]. Основная роль аллопрегнанолона при стрессе, по-видимому, заключается в регуляции функциональной активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси гиперактивации Аллопрегнанолон [Wirth et al., 2007]. – устранении ее подавляет транскрипцию генов АКТГ и кортикотропин-рилинзг гормона, оказывая анксиолитическое и антистрессорное действие [Bali and Jaggi, 2014]. Кроме того, аллопрегнанолон может снижать активность гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой оси за счет позитивной модуляции ГАМКА-рецепторов паравентрикулярного ядра гипоталамуса [Gunn et al., 2011]. Повышение 21 уровня аллопрегнанолона отмечается также и у людей после острого стресса [Droogleever Fortuyn et al., 2004]. Хронический стресс, сопровождающийся сильным повышением уровней кортикостерона, приводит к снижению уровня аллопрегнанолона и экспрессии мРНК 5α-редуктазы I типа. Важно отметить, что почти все эксперименты, посвященные изучению взаимодействия аллопрегеналона и хронического стресса, были проведены на моделях социальной изоляции [Bali and Jaggi, 2014]. Снижение концентрации аллопрегнанолона на фоне хронического стресса может быть следствием развития толерантности ГАМКА-рецептора к модулирующему действию аллопрегненалона [Turkmen et al., 2011]. Аффективные расстройства, сопровождающиеся снижением содержания аллопрегнанолона, могут быть не просто следствием дефицита нейростероидов в ЦНС, а результатом действия низких доз аллопрегнанолона. Как было показано в экспериментах, низкие дозы аллопрегнанолона приводят к развитию анксиогенных реакций у животных [Beauchamp et al., 2000; Fish et al., 2005; Miczek et al., 2003; Pinna et al., 2003; 2005]. Эндогенные нейростероиды могут обладать бимодальными свойствами в отношении ЦНС, т.е. низкие дозы отвечают за развитие депрессии и тревоги, а высокие – обладают противоположным действием. Система эндогенных нейростероидов играет важную роль в защитноадаптивных механизмах организма и может выступать в качестве одного из основных звеньев патогенеза депрессии и ряда других аффективных расстройств. Как и в случае с концепцией дендритного ремоделирования, рассмотрение эндогенных нейростероидов в качестве одного из элементов патогенеза депрессивных расстройств позволяет сохранить основополагающую роль стрессового фактора, как пускового стимула депрессии. С другой стороны, прослеживается связь нейростероидов с процессами нейродегенерации и нейрогенеза, что также подкрепляет положение о вовлеченности этой системы в патогенез депрессивных 22 расстройств. Во-первых, аллопрегнанолон модулятором ГАМКА-рецепторов и является обладает положительным способностью угнетать глутаматергическую нейротрансмиссию в ЦНС [Bali and Jaggi, 2014], которая, как говорилось ранее, является основной причиной уменьшения количества дендритных шипиков и ретракции дендритов, что в свою очередь приводит к нарушению нейрональной пластичности. Во-вторых, сам аллопрегненалон способен стимулировать процессы нейрогенеза, что было продемонстрировано на модели болезни Альцгеймера [Irwin and Brinton, 2014]. 1.1.3. Роль гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси в патогенезе депрессии На протяжении многих лет хорошо установленным фактом считается дисфункция гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси на фоне большого депрессивного расстройства [Femina et al., 2001; Pariante and Lightman, 2008; Varghese and Brown, 2001; Zunszain et al., 2011]. Глюкокортикостероиды выступают в качестве регуляторных факторов многих процессов в организме: обмена веществ, иммунной защиты и воспалительного ответа. глюкокортикостероидов Такое делает широкое их биологическое важнейшим действие компонентом гомеостатической системы, а уровни этих гормонов в средах и тканях организма должны поддерживаться в рамках определенного диапазона, который обеспечивает их физиологическую гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси функцию. на фоне Дисфункция депрессии проявляется гиперактивацией и повышением уровня кортизола. Измененное функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси у больных депрессивными расстройствами можно определить по нарушению отрицательной обратной связи в дексаметазоновом тесте [Carpenter et al., 2009]. Кроме того, у пациентов с депрессией можно обнаружить высокие 23 уровни провоспалительных цитокинов, белков острой фазы, хемокинов и молекул клеточной адгезии [Zunszain et al., 2011]. Появление маркеров воспалительного процесса не случайно и, повидимому, оно находится в тесной взаимосвязи с функциональной активностью гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси. Однако до сих пор остается нерешенным вопрос о том, что первично: гиперактивация оси или повышение уровня провоспалительных цитокинов? Попытаемся обобщить литературные данные и выстроить их в логическую цепочку. Если придерживаться ранее выбранной концепции о роли стресса как триггерного механизма в патогенезе депрессии, то одной из первых в ответ организма на стресс вовлекается гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось. Вследствие гиперактивации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси в организме происходит повышение уровня кортизола, который, как известно, обладает способностью нарушать процесс нейрогенеза в зрелой ЦНС [Anacker et al., 2013a; 2013b]. И здесь стоит вспомнить про повышение уровня провоспалительных цитокинов, которые, в числе прочего, принимают активное участие в пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток, модулируя процессы нейрогенеза [Borsini et al., 2015; Breton and MaoDraayer, 2011; Fuster-Matanzo et al., 2013]. Таким образом, получается, что повышение провоспалительных цитокинов на фоне депрессии, по-видимому, не случайно, и оно действительно может быть связано с гиперактивацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси. Возникает вопрос: гипотетически это явление можно было бы отнести к ранним маркерам нейрогенеза? Для убедительного ответа на этот вопрос имеющихся на сегодняшний день литературных данных недостаточно. С другой стороны, известно, что примерно половина пациентов, получающих терапию интерфероном альфа, испытывают депрессивную симптоматику, которая является одним из поздних побочных эффектов этого цитокина [Bull et al., 2009; Lotrich et al., 2007; Witches et al., 2005]. Очевидно, что в данном случае вряд ли речь идет о каком-то массивном нейродегенеративном процессе, 24 однако если принять во внимание предположение о том, что цитокины могут сигнализировать об инициации нейрогенеза, то можно предположить, что повышение определенных цитокинов может служить для организма сигналом для перехода в режим «жесткой экономии» ресурсов, прежде всего ЦНС, и это может быть причиной развития депрессивной симптоматики. Подобные изменения могут быть необходимы для подготовки организма к грядущему обновлению нейронов ЦНС в условиях внешнего неблагополучия, и, по-видимому, являются важным компонентом защитноадаптивных механизмов. Тем не менее, убедительных экспериментальных или клинических доказательств этих предположений на сегодняшний день просто не существует, что делает достаточно актуальным задачу по изучению изложенных выше теоретических аспектов. Таким образом, рассмотрение гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой оси в качестве одного из компонентов патогенеза депрессии не только не противоречит двум другим аспектам, описанным выше, но и согласуется с ними. Так, атрофия дендритных шипиков и ретракция дендритов с одной стороны может расцениваться как начало нейродегенеративного процесса, а с другой – как вынужденная экономия ресурсов ЦНС о которой говорилось выше. В тесном взаимодействии с гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой осью находится и система эндогенных нейростероидов. Было показано, что острый стресс приводит к повышению уровня не только кортизола, но и аллопрегнанолона [Droogleever Fortuyn et al., 2004; Purdy et al., 1991], который, в свою очередь, способен подавлять активность самой оси [Wirth et al., 2007] и, по-видимому, препятствовать гиперактивности кортизола в отношении ЦНС. Обобщая вышесказанное, можно сделать вывод, что рассматривать какой-либо один аспект в качестве возможного патогенеза депрессии было бы не совсем корректно, а сама проблема требует системного подхода с представлением комплексного механизма, лежащего в основе не только депрессивного, но и других аффективных расстройств. 25 1.2. Антидепрессанты: молекулярные мишени и особенности применения Антидепрессанты – группа психотропных лекарственных средств, основное применение которых связано с фармакотерапией депрессивных расстройств. Выделяют 8 основных классов антидепрессантов [Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Stahl, 1998]: Трициклические антидепрессанты (ТЦА) амитриптилин, имипрамин (мелимипрамин), кломипрамин (анафранил) Селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС) флуоксетин (прозак), флувоксамин (феварин), сертралин (золофт), циталопрам (ципрамил, опра), эсциталопрам (ципралекс), пароксетин (паксил) Ингибиторы МАО (иМАО) моклобемид (аурорикс) Ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина (ИОЗСН) венлафаксин (велаксин, велафакс), дулоксетин (симбалта), дезвенлафаксин (Pristiq), левомилнаципран (Fetzima) Ингибиторы обратного захвата норадреналина и дофамина (ИОЗНД) бупропион (веллбутрин) Селективные ингибиторы обратного захвата норадреналина (СИОЗН) ребоксетин (Edronax) Норадренергические и специфические серотонинергические антидепрессанты (НАССА) миртазапин (ремерон), миансерин (леривон) Антагонисты серотониновых 5-НТ2А-рецепторов / ингибиторы обратного захвата серотонина тразодон (триттико), нефазодон (Dutonin, Nefadar) Неклассифицированные антидепрессанты агомелатин (вальдоксан), вилазодон (Viibryd) 26 Помимо приведенной выше классификации, все антидепрессанты принято разделять на две большие группы: типичные и атипичные. К первой группе относятся трициклические антидепрессанты (ТЦА), селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС) и ингибиторы МАО (иМАО), ко второй – все остальные [Mason and Angel, 1984; Tartara et al., 1985]. ТЦА обладают комплексным механизмом действия: нарушают обратный нейрональный захват НА и 5-НТ за счет блокады синаптических переносчиков этих моноаминов, а также обладают широким спектром рецепторной активности, которая включает в себя блокаду центральных гистаминовых Н1-рецепторов, мускариновых холинорецепторов, α 1- адренорецепторов и серотониновых 5-НТ2А-рецепторов. Кроме того, в высоких дозах ТЦА способны блокировать вольтажзависимые натриевые каналы [Gillman, 2007; Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Stahl, 1998]. Активность в отношении перечисленных мишеней неоднородна и варьирует внутри группы. Так, кломипрамин в значительно большей степени нарушает обратный захват 5-НТ по сравнению с имипрамином и амитриптилином [Gillman, 2007; Hilal-Dandan and Brunton, 2014], а последний обладает наибольшим сродством к гистаминовым Н1-рецепторами и серотониновым 5НТ2А-рецепторам [Gillman, 2007]. Согласно экспериментальным данным, ТЦА способны проявлять свойства агонистов δ- и κ-опиоидных рецепторов [Onali et al., 2010], что также может быть частью механизма их антидепрессивной и антиноцицептивной активности. Любопытным является и тот факт, что амитриптилин ингибирует гистоновые деацетилазы, активируя тем самым апоптоз миеломных клеток [Mao et al., 2011]. Подобная активность амитриптилина, которая реализуется на уровне регуляции экспрессии генов, может также обуславливать положительное влияние препарата на процессы нейрогенеза [Chadwick et al., 2011], активируя экспрессию генов нейротрофических факторов за счет подавления процессов деацетилирования гистонов. Основные побочные эффекты ТЦА обусловлены 27 их фармакодинамическими свойствами: седация, сонливость (блокада центральных H1-, α1- и мускариновых рецепторов), увеличение массы тела (блокада гистаминовых H1-рецепторов), головокружение, снижение АД (блокада сосудистых аккомодации, сухость α1-адренорецепторов), во рту (блокада констипация, нарушение мускариновых рецепторов), проаритмогенное действие, судороги (блокада натриевых каналов), усиление суицидальных мыслей, нарушение со стороны пищеварительного тракта (усиление серотонинергической нейротрансмиссии), а также риск серотонинового синдрома при одновременном применении с иМАО или другими антидепрессантами, усиливающими серотонинергическую нейротрансмиссию. ТЦА показаны при депрессивных расстройствах как средства второй линии, нейропатических болях, недержании мочи у детей [Hilal-Dandan and Brunton, 2014]. Кломипрамин, как препарат с преимущественным серотонинергическим действием, применяют в терапии обсессивно-компульсивного расстройства [Marazziti et al., 2012]. Долгое время считалось, что в основе антидепрессивного действия СИОЗС лежит их способность нарушать обратный захват 5-НТ за счет блокады серотонинового транспортера [Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Stahl, 1998], однако экспериментальные и клинические исследования последних лет указывают на возможное участие других систем в механизме действия этого класса антидепрессантов. Известно, что флуоксетин способен повышать уровень эндогенного аллопрегнанолона у больных, страдающих большим депрессивным расстройством, что коррелирует с терапевтической эффективностью препарата. В основе этого эффекта лежит способность флуоксетина регулировать активность фермента 3α-гидроксистероид дегидрогеназы и тем самым нарушать процесс окисления аллопрегнанолона до 5α-дигидропрогестерона [Fry et al., 2014; Griffin and Mellon, 1999; Maurice and Su, 2009; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006]. Антидепрессанты из группы СИОЗС обладают разной степенью аффиности по отношению к сигма-1рецепторам. По показателю сродства к рецептору СИОЗС можно выстроить в 28 следующем порядке: флувоксамин > сертралин > флуоксетин > эсциталопрам > циталопрам > пароксетин [Hasimoto, 2009; 2015]. Флувоксамин, обладающий наибольшим аффинитетом, вступает во взаимодействие с сигма-1-рецепторами по типу агониста, и в условиях эксперимента было показано, что его антидепрессивный эффект находится в зависимости от функциональной активности сигма-1-рецепторов [Sugimoto et al., 2012]. Возможно, что именно активность в отношении сигма-1-рецептора обуславливает высокую эффективность флувоксамина и его широкое применение при различных тревожных расстройствах [Hilal-Dandan and Brunton, 2014]. Кроме того, СИОЗС способны регулировать активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси [Heinzmann et al., 2011; Hernandez et al., 2013; Wang et al., 2014; Young et al., 2004] и увеличивать экспрессию генов BDNF [Martinowich and Lu, 2008; Watanabe et al., 2010]. К наиболее серьезным побочным эффектам СИОЗС относится увеличение риска совершения суицида на фоне терапии, особенно среди подростков и пожилых лиц [Bridge et al., 2007; Gunnell and Ashby, 2005; Olfson et al., 2006]. СИОЗС также вызывают целый ряд нежелательных эффектов, обусловленных усилением серотонинергической нейротрансмиссии, часть из которых устраняется путем коррекции дозы: тошнота, нарушения со стороны пищеварительного тракта, тревога, инсомния, сексуальная дисфункция, синдром отмены одновременном и риск приеме развития с серотонинового другими синдрома при антидепрессантами с серотонинергическим действием [Ferguson, 2001; Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Stahl, 1998]. Применяют СИОЗС в терапии депрессивных расстройств, как средство первой линии, панических атак, обсессивно-компульсивного расстройства, посттравматического синдрома, предменструального дисфорического синдрома, булимии и некоторых других заболеваний [HilalDandan and Brunton, 2014; Marazziti et al., 2012]. Первые препараты из группы иМАО, такие как ниаламид и транилципромин, не обладали селективностью в отношении различных 29 изоформ МАО, необратимо ингибируя МАО-А и МАО-В [Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Stahl, 1998; Yamada and Yasuhara, 2004]. Подобная активность неселективных иМАО сопровождалась не только терапевтической эффективностью, но и большой частотой развития тяжелых побочных эффектов (гепатотоксичность, ортостатическая гипотензия, гипертонический криз), а их прием требовал от пациентов строжайшего соблюдения диеты, поскольку обе изоформы МАО принимают участие в инактивации экзогенного тирамина, который в большом количестве содержится в сырах, какао бобах и других продуктах [Fulton and Benfield, 1996; Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Norman and Burrows, 1995; Stahl, 1998; Yamada and Yasuhara, 2004]. Перечисленные выше факты послужили предпосылками для создания и применения селективных и обратимых ингибиторов МАО-А, к которым относится препарат моклобемид. За счет селективности в отношении изоформы МАО-А препарат обладает более широким профилем безопасности, сохраняя при этом терапевтический потенциал иМАО [Fulton and Benfield, 1996; Norman and Burrows, 1995; Yamada and Yasuhara, 2004]. К основным побочным эффектам моклобемида можно отнести нарушения сна, беспокойство, тревогу, головную боль и риск развития серотонинового синдрома при совместном применении с СИОЗС [Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Yamada and Yasuhara, 2004]. Препараты из группы иМАО считаются средствами второй линии и применяются в терапии депрессивных и тревожных расстройств, в частности иМАО продемонстрировали эффективность в лечении социальной фобии, панических атак, обсессивнокомпульсивного расстройства и постравматического синдрома, причем в последнем случае иМАО по эффективности могут превосходить ТЦА [Yamada and Yasuhara, 2004]. В основе механизма действия ИОЗСН лежит их способность тормозить обратный нейрональный захват двух моноаминов – 5-НТ и НА [Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Stahl, 1998]. Венлафаксин, дезвенлафаксин и дулоксетин имеют более высокое сродство к серотониновому транспортеру, чем к 30 норадреналиновому, причем в случае венлафаксина и дулоксетина обратный нейрональный захват нарушается последовательно – первоначально 5-НТ, а затем НА. Дисбаланс в отношении синаптических переносчиков моноаминов устраняется при увеличении дозы препаратов и/или длительном применении. Все три препарата также обладают слабой активностью в отношении обратного захвата ДА [Montgomery, 2008; Sansone and Sansone, 2014]. В условиях эксперимента было показано, что антиноцицептивный эффект венлафаксина находится в зависимости от функциональной активности µ-, κ-, и δ-опиоидных, а также от α2-адренорецепторов [Schreiber et al., 2002]. Милнаципран обладает сбалансированным действием в отношении обратного захвата 5-НТ и НА [Delini-Stula, 2000], нарушение которого происходит одновременно для 5-НТ и НА [Sansone and Sansone, 2014]. Левомилнаципран уникален тем, что в 2 раза более активен в отношении обратного захвата НА, чем 5-НТ [Auclair et al., 2013]. Оба препарата не обладают активностью в отношении дофаминергической нейротрансмиссии [Sansone and Sansone, 2014]. Все перечисленные ИОЗСН показаны для терапии депрессивных расстройств [Hilal-Dandan and Brunton, 2014]. Лекарственная форма венлафаксина с замедленным высвобождением применяется при генерализованном тревожном расстройстве, социальной фобии, паническом расстройстве и обсессивно-компульсивном расстройстве [Thase, 2006]. Дулоксетин также показан при нейропатическом болевом синдроме [Lunn et al., 2014]. Побочные эффекты ИОЗСН связаны, главным образом, с влиянием на серотонинергическую (головная боль, тошнота, усталость, половая дисфункция, тревога) и норадренергическую нейротрансмиссию (тремор, сухость во рту, потливость) [Hilal-Dandan and Brunton, 2014; Sansone and Sansone, 2014]. К группе ИОЗНД относится препарат бупропион, который нарушает обратный захват НА и ДА, блокируя соответствующие синаптические переносчики [Stahl et al., 2004]. Бупропион обладает немного большей активностью в отношении дофаминового транспортера, чем 31 норадреналинового [Foley et al., 2006]. Препарат не имеет такого широкого рецепторного профиля как ТЦА [Foley et al., 2006; Stahl et al., 2004] и является только антагонистом никотиновых холинорецепторов [Mansvelder et al., 2007; Slemmer et al., 2000]. К наиболее частым осложнениям терапии бупропионом можно отнести сухость во рту, констипацию, головную боль, тошноту, ажитацию, бессонницу, потерю веса, для препарата характерен синдром отмены [Foley et al., 2006]. Бупропион показан для лечения депрессивных расстройств и никотиновой зависимости [Foley et al., 2006; Mansvelder et al., 2007; Slemmer et al., 2000]. Ребоксетин селективно нарушает обратный захват НА [Szabadi et al., 1998], проявляет свойства неконкурентного антагониста NN- и NMхолинорецепторов [Arias et al., 2013a; 2013b; Rauhut et al., 2002], при повторном введении вызывает гиперсенсибилизацию центральных α 1адренорецепторов [Rogoz et al., 2002], а также способен к взаимодействию с дофаминовыми D1/5-рецепторами [De Bundel et al., 2013]. Кроме того, ребоксетин повышает релиз ДА в гиппокампе и префронтальной коре [De Bundel et al., 2013]. О наличии в механизме действия ребоксетина дофаминергического компонента свидетельствуют и экспериментальные данные о структуре антидепрессивного эффекта препарата в тесте вынужденного плавания [Page, 2003], который характеризуется уменьшением иммобилизации с одновременным увеличением клайминга, что характерно для усиления дофаминергической нейротрансмиссии [Perona et al., 2008]. В экспериментальных исследованиях также было показано, что антидепрессивный эффект ребоксетина может быть связан с функциональной активностью AMPA-рецепторов [Wolak et al., 2013]. Ребоксетин находит применение в лекарственной терапии депрессий [Cipriani et al., 2009], панического расстройства [Dannon et al., 2002], синдрома дефицита внимания и гиперактивности [Golubchik et al., 2013; Hashemian et al., 2011]. В ряде клинических исследований было показано, что препарат может быть также эффективен при нервной булимии [El-Giamal et al., 2000], ночном энурезе 32 [Neveus, 2006], нарколепсии [Larrosa et al., 2001] и при одновременном применении с оланзапином, для уменьшения побочных реакций последнего [Poyurovsky et al., 2003]. Осложнения, возникающие на фоне приема ребоксетина, как правило, связаны с усилением норадренергической нейротрансмисии: бессонница, тошнота, потливость, сухость во рту и констипация [Cipriani et al., 2009; Szabadi et al., 1998]. Препараты из группы НАССА характеризуются рецепторным механизмом действия: миртазапин является антагонистом пресинаптических α2-адренорецепторов, а также постсинаптических серотониновых 5-НТ2- и 5НТ3-рецепторов [Betry et al., 2011; de Boer, 1995; Marek et al., 2003], гистаминовых Н1-рецепторов [Sato et al., 2013]; минасерин не действует на 5НТ3-рецепторы [Hilal-Dandan and Brunton, 2014]. Оба препарата, согласно экспериментальным данным, обладают κ-опиоидной активностью [Olianas et al., 2012; Schreiber et al., 2002a; 2002b]. Миртазапин увеличивает релиз ДА, увеличивает его оборот и повышает экспрессию генов ДА транспортера в кортикальных нейронах [Kadoguchi et al., 2014; Nakayama et al., 2004; Rogoz et al., 2002], и этот эффект не связан с прямым воздействием на дофаминовые рецепторы [Rogoz et al., 2002], а, по-видимому, опосредован модуляцией серотониновых 5-НТ1А-ауторецепторов [Nakayama et al., 2004]. Дофаминергическая активность миртазапина может быть полезна в терапии болезни Паркинсона, что подтверждают и экспериментальные данные об антагонизме миртазапина и нейротоксина МФТП [Kadoguchi et al., 2014]. Миртазапин также вступает во взаимодействия с системой эндогенных нейростероидов, ингибируя фермент 3α-гидроксистероид дегидрогеназу, и подобно СИОЗС нарушает процесс окисления аллопрегнанолона до 5αдигидропрогестерона [Serra et al., 2002; Schüle et al., 2006]. Однако при длительном введении миртазапин снижает или полностью предупреждает стресс-индуцированное увеличение концентрации нейростероидов в плазме крови и коре головного мозга у грызунов, что принципиально отличает его от действия флуоксетина в отношении этой системы [Serra et al., 2002]. 33 Миртазапин показан для терапии депрессии [Anttila et al., 2001; Croom et al., 2009], тревожного генерализованного расстройства, социальной фобии, обсессивно-компульсивного расстройства, панического расстройства, посттравматического синдрома [Croom et al., 2009], пониженного аппетита [Chinuck et al., 2007], бессонницы [Jindal, 2009], тошноты и рвоты [Li et al., 2011], зуда [Greaves, 2005], головных болей и мигрени [Li et al., 2011]. Минасерин показан при депрессивных расстройствах [Ferreri et al., 2001], кроме того, препарат может быть эффективен в комплексной терапии резистентных форм шизофрении с целью устранения негативной симптоматики [Poyurovsky et al., 2003; Shiloh et al., 2002] и для уменьшения галлюциногенных побочных эффектов антипаркинсонических средств [Ikeguchi and Kuroda, 1995]. К наиболее частым побочным эффектам препаратов группы НАССА можно отнести констипацию, сухость во рту, сонливость, седацию, увеличение массы тела [Hilal-Dandan and Brunton, 2014]. В основе механизма действия тразодона лежит его способность блокировать серотониновые 5-НТ2А\2С-рецепторы, а также нарушать обратный захват 5-НТ [Odagaki et al., 2005]. Кроме того, тразодон является антагонистом гистаминовых Н1-рецепторов, α1-адренорецепторов и проявляет слабую антимускариновую активность [Betti et al., 2002; Fagiolini et al., 2012; Stahl, 2009]. Некоторые авторы указывают на наличие у тразодона свойств агониста 5-НТ1А-рецептора [Ghanbari et al., 2010; Odagaki et al., 2005] и дозозависимые взаимодействия с постсинаптическими дофаминовыми D2-рецепторами по типу антагониста [Balsara et al., 2005]. Нефазодон по своей фармакологической характеристики близок к тразодону. По некоторым данным, антиноцицептивный эффект тразодона в эксперименте может зависеть от функциональной активности µ1- и µ2опиоидных рецепторов [Schreiber et al., 2000]. Похожей активностью может обладать и нефазодон [Ortega-Alvaro et al., 2004]. Препараты этой группы применяются в терапии депрессивных расстройств в качестве средств второй 34 линии [Fagiolini et al., 2012], а также для коррекции бессонницы [Kaynak et al., 2004]. Наиболее частыми побочными эффектами являются сонливость, седация, сухость во рту, головная боль, головокружение, значительно реже могут отмечаться ортостатическая гипотензия и аритмии [Fagiolini et al., 2012]. Вилазодон является представителем нового класса антидепрессантов, который был одобрен FDA для терапии большого депрессивного расстройства на территории США в 2011 году [Singh and Schwartz, 2012; Wang et al., 2015]. Препарат обладает двойным серотонинергическим механизмом действия: селективно нарушает обратный нейрональный захват 5-НТ и является парциальным агонистом 5-НТ1А-рецепторов [Khan, 2009]. Помимо непосредственной блокады серотонинового переносчика, вилазодон, согласно экспериментальным данным, повышает содержание серотонина в нейронах головного мозга за счет десенситизации 5-НТ1А-ауторецепторов [van Amsterdam and Seyfried, 2014; Wang et al., 2015]. Наиболее распространенными побочными эффектами являются диарея, тошнота, рвота, головная боль, головокружение, бессонница [Wang et al., 2015]. Агомелатин по механизму действия также отличается от других классов антидепрессантов – препарат является агонистом мелатониновых МТ1- и МТ2-рецепторов, антагонистом серотониновых 5-НТ2С-рецепторов [Srinivasan et al., 2012]. В ряде экспериментальных работ было показано, что хроническое введение агомелатина повышает экспрессию генов BDNF [Gumuslu et al., 2014], восстанавливает активность нейронов и повышает пролиферацию клеток гиппокампа у животных на фоне хронической стрессовой экспозиции, и этот эффект не связан с регуляцией активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси [Banasr et al., 2006; Dagyte et al., 2010]. Основное применение препарата связано с фармакотерапией депрессивных расстройств [Taylor et al., 2014]. Кроме того, проводятся исследования, посвященные эффективности агомелатина при обсессивно- 35 компульсивном расстройстве [Bhutada et al., 2013; De Berardis et al., 2012], тревожных расстройствах [Crippa et al., 2010; De Berardis et al., 2013]. Проведенный анализ литературы демонстрирует, что, с одной стороны, в основе механизма всех антидепрессантов лежит влияние на моноаминергическую систему головного мозга, а с другой, этот класс психотропных средств имеет большое количество других молекулярных мишеней, которые наиболее близки к стрессовой концепции этиологии депрессий. Речь идет, в первую очередь, о таких стресс-зависимых системах, как система эндогенных нейростероидов и гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковая ось. Кроме того, большинство антидепрессантов способны стимулировать процесс нейрогенеза в гиппокампе, что также является особенностью препаратов этой группы. Если одни препараты могут напрямую регулировать процесс нейростероидогенеза за счет взаимодействия с энзимами и сигма-1-рецепторами, как например СИОЗС и НАССА, то другие препараты могут вмешиваться в этот процесс опосредовано за счет протективной активности в отношении митохондрии (где протекают первые стадии биосинтеза нейростероидов), которой обладают венлафаксин, имипрамин и тразодон [Kumar et al., 2010]. Первую линию в терапии депрессий и некоторых тревожных расстройств занимают препараты из группы СИОЗС, вторыми по частоте назначения остаются ТЦА [Cuijpers et al., 2013]. Вместе с этим, хорошо известна проблема резистентности к фармакотерапии СИОЗС (Decloedt and Stein, 2010; Leykin et al., 2007), которая может быть связана с механизмом действия этих антидепрессантов. В частности, это может быть следствием сложных взаимоотношений между СИОЗС и стресс-зависимыми системами, таким как гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось и система эндогенных нейростероидов. Исходя из этого, терапевтический ответ на прием СИОЗС может жестко коррелировать с такими факторами, как кратность приема и продолжительность стрессовой экспозиции. Так, одно из пилотных клинических исследований продемонстрировало, что флуоксетин может быть 36 неэффективен, если применяется у пациентов с гиперактивированной до начала лечения гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой осью [Young et al., 2004]. Кроме того, в ряде экспериментальных работ было показано, что препараты из группы СИОЗС в условиях хронического умеренного стресса способны ослаблять тревожные реакции у грызунов в тех моделях, в которых при обычных условиях обладают анксиогенным эффектом [Borsini et al., 2002; Farhan and Haleem, 2015; Wang et al., 2014]. Подобная динамика активности СИОЗС в условиях стрессовой экспозиции вызывает определенный интерес, поскольку если возможна инверсия эффекта с отрицательного (в рамках конкретной животной модели) на положительный, то велика вероятность изменения в обратном направлении. В тоже время, для препаратов резерва, например ТЦА, подобные взаимодействия не описаны, что может отражать меньшую вовлеченность упомянутых выше систем в механизме их психотропной активности. Дальнейшее изучение взаимодействия антидепрессантов, в первую очередь из группы СИОЗС и ТЦА – наиболее часто применяемых как в клинической практике, так и в качестве референтных препаратов на этапе доклинических исследований, со стресс-зависимыми системами, а также оценка их активности в различных условиях и при различной кратности введения представляется актуальной задачей, поскольку способствует созданию прогностических критериев эффективной и безопасной фармакотерапии. 1.3. Экспериментальное моделирование тревоги и депрессии: проблемы релевантности и их возможное решение В настоящее время существует большое многообразие животных моделей, которые депрессивного позволяют расстройства: имитировать тест отдельные вынужденного симптомы плавания, тест подвешивания за хвост – моделирование дисфорического компонента 37 депрессии; тест потребления сахарозы и гипонеофагия, имитирующие поведение, ассоциированное с ангедонией; водный лабиринт Морриса и лабиринт Барнса, позволяющие оценить изменение когнитивных функций и т.д. Модели тревоги также не уступают по своему разнообразию, здесь можно обнаружить тесты, позволяющие оценить ситуационную тревогу, такие как открытое поле, черно-белая камера, приподнятый крестообразный лабиринт, гипофагия, а также модели генетически детерминированной тревоги – тест закапывания шариков, который помимо этого является и трансляционной моделью обсессивно-компульсивного расстройства. Экспериментальное моделирование расстройств эмоциональной сферы сопряжено с рядом проблем, которые условно можно разделить на проблемы общие, связанные с релевантностью экспериментальных процедур и клинического применения психотропных препаратов, и частные, затрагивающие методологические аспекты конкретного теста. Первая группа охватывает проблемы связанные не с конкретной животной моделью, а с условиями постановки эксперимента в целом. Хорошо известно, что антидепрессанты или анксиолитики, в случае если их использование направлено не на купирование какого-либо симптома, а на достижение стойкой ремиссии аффективного расстройства, требуют, в среднем, 4-8 недельного применения [Ciraulo and Shader, 2011; Hilal-Dandan and Brunton, 2014]. Не смотря на это, в большинстве случаев протоколы скрининга антидепрессивной и анксиолитической активности среди новых оригинальных соединений предполагают оценку эффекта при однократном введении у здоровых животных при стандартном содержании, как правило, с минимальным воздействием стрессовых факторов перед поведенческими экспериментами [Castagne et al., 2006; Petit-Demouliere et al., 2005]. Вопервых, целесообразным представляется изучение стойкости эффекта, как оригинальных соединений, так и референтных препаратов при различных режимах введения. Во-вторых, изучение фармакологической активности оригинальных соединений на интактных животных с целью оценки их 38 возможной клинической эффективности у людей с психическими патологиями выглядит не совсем корректно, поскольку в таком случае мы получаем диссонанс между целью и способом еѐ достижения. С одной стороны, будущий психотропный препарат должен быть эффективен в условиях конкретной патологии или группы заболеваний, с другой – решение об эффективности принимают на основании того, что препарат изменяет нормальное (в условиях модели) поведение или какой-либо параметр у здорового животного. Для того чтобы модель была релевантной необходимо создать условия, благоприятные для формирования аффективных расстройств. Для моделирования взаимосвязи между стрессом и аффективными расстройствами в последнее время популярность приобретают модификации непредсказуемого хронического умеренного стресса (НХУС, unpredictable chronic mild stress), при котором животные подвергаются воздействию различных непредсказуемых стрессовых факторов средней силы, социального или физиологического характера, в течение нескольких недель [Darwish et al., 2013;Gronli, 2006; Hill et al., 2012; Javelot et al., 2014]. В условиях эксперимента процедура НХУС приводит к: ангедонии, снижению массы тела, нарушению сна, снижению исследовательской активности и полового влечения [Vollmayr and Henn, 2003], увеличению времени иммобилизации грызунов в тесте вынужденного плавания, изменению уровня тревожности и исследовательской активности [Darwish et al., 2013; Hill et al., 2012; Willner, 2005]. Известно также, что НХУС сопровождается нарушениями процесса нейрогенеза в гиппокампе зрелого мозга [de Andrade et al., 2013], что позволяет характеризовать эту модель весьма актуальной, так как современные представления о патогенезе аффективных расстройств рассматривают депрессию как нейродегенеративное заболевание [Zhou et al., 2004; Sahay and Hen, 2007]. Использование процедуры НХУС позволяет не только увеличить чувствительность животных моделей к действию антидепрессантов или 39 анксиолитиков, но сделать условия эксперимента более релевантными (таблицы 1.3.1 и 1.3.2). Таблица 1.3.1. Влияние непредсказуемого хронического умеренного стресса на уровень тревожности грызунов Модель Животные Продолжительность Эффект Ссылка стресса Открытое поле C57BL/6 4 недели ↑ C57BL/6 4 недели ↑ 6 недель ↑ 6 недель ↑ 4 недели ↔ 4 недели ↔ Приподнятый крестообразный лабиринт Открытое поле Swiss albino mice Приподнятый крестообразный лабиринт Swiss albino mice Приподнятый C57BL/6 крестообразный BALB/C лабиринт DBA/2J Открытое поле C57BL/6 BALB/C DBA/2J Черно-белая C57BL/6 камера BALB/C ↔ 4 недели ↑ DBA/2J Открытое поле IRC C57BL/6 Черно-белая BALB/C 3 недели ↑ 9 недель ↓ Zhu et al., 2014 Zhu et al., 2014 Wang et al., 2014 Wang et al., 2014 Mineur et al., 2006 Mineur et al., 2006 Mineur et al., 2006 Jung et al., 2014 Ducottet et 40 камера al., 2003 Приподнятый крысы крестообразный стока лабиринт Wistar 9 недель ↓ D’Aquila et al., 1994 Примечание: ↑ - усиление тревожных реакций, ↓ - ослабление тревожных реакций, ↔ - поведение не изменялось Таблица 1.3.2. Влияние непредсказуемого хронического умеренного стресса на депрессивное поведение грызунов. Модель Животные Продолжительность Эффект Ссылка стресса Тест вынужденного C57BL/6 4 недели ↑ C57BL/6 4 недели ↑ 4 недели ↔ 4 недели ↑ 4 недели ↔ 3 недели ↑ 3 недели ↑ плавания Тест вынужденного плавания BALB/C DBA/2J Тест BALB/C подвешивания C57BL/6 за хвост Тест потребления сахарозы Тест потребления сахарозы DBA/2J SpragueDawley rats IRC C57BL/6 Zhu et al., 2014 Mineur et al., 2006 Mineur et al., 2006 Mineur et al., 2006 Mineur et al., 2006 Rong et al., 2010 Jung et al., 2014 Примечание: ↑ - усиление депрессивных реакций, ↔ - поведение не изменялось 41 Использование процедуры НХУС связано с еще одной интересной особенностью – инверсией эффекта некоторых препаратов. Так, согласно экспериментальным данным, классический представитель СИОЗС флуоксетин, обладающий в обычных условиях анксиогенной активностью в большинстве моделей тревоги у грызунов [Borsini et al., 2002], в условиях НХУС обнаруживает анксиолитический эффект [Farhan and Haleem, 2015; Wang et al., 2014]. бензодиазепинового В ряда тоже время, демонстрирует диазепам – анксиолитик анксиолитический эффект независимо от факта наличия/отсутствия НХУС и кратности введения [Nirmal et al., 2008; Wang et al., 2014]. В случае СИОЗС, различия в эффектах у интактных и стрессированных животных, по-видимому, можно объяснить участием в механизме действия стресс-зависимых систем – системы эндогенных нейростероидов и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, что более подробно описывалось ранее. Флуоксетин демонстрирует пример с инверсией эффекта в сторону положительного результата (анксиолитики), но нельзя исключать инверсии эффекта в обратном направлении или же вообще его отсутствие в условиях НХУС. Подобная динамика активности флуоксетина еще раз подчеркивает проблему условий и релевантности экспериментальной модели и делает актуальным задачу по изучению психотропной активности, как новых соединений, так и уже применяемых в клинической практике препаратов в условиях НХУС. Результаты, полученные в ходе таких экспериментов, могут иметь ценное практическое значение, поскольку способны выявить проблемы безопасности или неэффективности некоторых психотропных препаратов, которые зависят от внешних условий и состояния организма. Кроме того, на основании экспериментальных данных могут быть выработаны прогностические критерии резистентности к терапии определенным классом психотропного средства/препаратом или критерии безопасной фармакотерапии. 42 Ко второй группе, как уже говорилось ранее, относятся проблемы, связанные с методологическими аспектами конкретной модели. Наиболее ярким примером может служить тест вынужденного плавания. Тест вынужденного плавания (Forced swim test) – животная модель депрессии, которая широко применяется для доклинической оценки антидепрессивной активности. Впервые протокол процедуры вынужденного плавания был описан Роджером Порсолтом для крыс [Porsolt et al., 1977], позже тест был адаптирован для других видов, включая мышей [Porsolt et al., 1978; Cryan and Holmes, 2005; Slattery and Cryan, 2012]. Протокол теста вынужденного плавания для крыс описывает двухдневную процедуру: в первый день предполагается выполнять сеанс предварительного плавания продолжительностью 15 мин, а во второй – сам тест. Такая последовательность не случайна – Borsini и соавторами было показано, что сеанс предварительного продолжительности плавания иммобилизации может и, играть как важную следствие, роль для повышать чувствительность модели к действию антидепрессантов [Borsini et al., 1989]. Не смотря на это, на сегодняшний день существует большое количество разнообразных модификаций теста вынужденного плавания для мышей: однодневная процедура без предварительного плавания [Castagne et al, 2006; Costa et al., 2013], а также тесты с 6 и 15 минутной предварительной посадкой [Dulawa et al., 2004; Llorens-Martin et al., 2011]. Тем не менее, игнорирование процедуры предварительного плавания или свободное варьирование его продолжительности может привести к получению ложных результатов. В качестве примера можно привести зависимость эффекта СИОЗС флуоксетина от наличия и продолжительности предварительной посадки. Так, в эксперименте без предварительного плавания, где данная процедура заменена первыми двумя минутами единственной посадки, которые не входят в общее время регистрации, флуоксетин обнаруживает антидепрессивную активность после однократного введения [Castagne et al, 2006]. В тоже время, в тесте с предварительной посадкой длительностью 15 43 мин эффект препарата отсутствует после однократного введения и появляется лишь после хронического введения [Dulawa et al., 2004]. Обобщая вышеизложенные факты, можно сделать следующие выводы: во-первых, наличие процедуры предварительного плавания – важный фактор, который напрямую может повлиять на результаты эксперимента, во-вторых, если данная процедура используется экспериментатором, то необходимо подобрать оптимальную продолжительность предварительной посадки. К сожалению, протокол вынужденного плавания хоть и был адаптирован для мышей, но вопрос с необходимостью использования процедуры предварительного плавания так и не был проработан, что делает эту задачу актуальной. Второй методологической проблемой теста вынужденного плавания является выбор регистрируемых параметров. Классический вариант теста предполагает регистрацию иммобилизации, одного уменьшение параметра которого – продолжительности считают коррелятом антидепрессивной активности [Porsolt et al., 1977]. Однако зачастую антидепрессанты способны вызывать дополнительные фармакологические эффекты, например, психостимулирующий или седативный, которые могут влиять на длительность иммобилизации в данном тесте [Van der MeerschMougeot et al., 1993]. Для решения этой проблемы ряд исследователей предлагает фиксировать несколько параметров: время иммобилизации, плавания и клайминга. Во-первых, это может способствовать выделению собственно антидепрессивного эффекта, а во-вторых, имеются экспериментальные данные о неодинаковом воздействии различных классов антидепрессантов на эти параметры, что также может быть информативным для формирования представлении о преобладающей роли того или иного компонента в механизме действия экспериментальном этапе (таблица 1.3.3). изучаемого вещества на 44 Таблица 1.3.3. Влияние антидепрессантов различных групп на изменение регистрируемых параметров в тесте вынужденного плавания у грызунов Препарат Животные Клайминг Плавание Иммоби- Ссылка лизация Флуоксетин, BALB/C ↔ ↑ ↓ 20 мг/кг Флуоксетин, 20 мг/кг Флуоксетин, 15 мг/кг Флуоксетин, 20 мг/кг Dulawa et al., 2004 Sprague- ↔ ↑ ↓ Dawley rats Sprague- 1999 ↔ ↑ ↓ Dawley rats Sprague- Page et al., Cyan et al., 2005 ↔ ↑ ↓ Dawley rats Kirby and Lucki, 1997 Дезипрамин, 20 мг/кг Ребоксетин, 60 мг/кг Моклобемид, 15 мг/кг - Sprague- ↑ ↔ ↓ Dawley rats Sprague- 1999 ↑ ↔ ↓ Dawley rats Sprague- Cyan et al., 2005 ↑ ↑ ↓ Dawley rats Мыши с Page et al., Cyan et al., 2005 ↑ ↓ ↓ нокаутом Perona et al., 2008 переносчика ДА - Мыши с ↔ ↔ ↓ нокаутом Perona et al., 2008 переносчика НА - Мыши с ↔ ↔ ↔ Perona et 45 нокаутом al., 2008 переносчика 5-НТ Примечание: ↓ - уменьшение параметра, ↑ - увеличение параметра, ↔ регистрируемый параметр не изменялся Экспериментатор при изучении психотропной активности того или иного вещества сталкивается с рядом проблем. Наиболее масштабной является проблема релевантности условий эксперимента и будущего клинического применения изучаемого вещества. Одним из возможных решений данной проблемы может служить использование процедуры НХУС, которая позволяет имитировать взаимосвязь стресса и аффективных расстройств в условиях эксперимента, а также корректировать поведение животных или какой-либо параметр, отличающихся от нормальных. Кроме того, некоторые животные модели перед постановкой эксперимента требуют решения некоторых методологических проблем. В частности, при оценке антидепрессивной активности в тесте вынужденного плавания необходимо предусмотреть процедуру предварительной посадки и определить ее оптимальную продолжительность. 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Экспериментальные животные Исследования проведены на 467 самцах беспородных мышей массой 23-30 г, 851 самце мышей линии BALB/c массой 20-25 г, 262 самцах мышей линии С57BL/6 массой 20-25 г и 12 самцах крыс стока Wistar массой 250-300 г (Питомник моделирования «Столбовая» РАМН). непредсказуемого Животных, умеренного за исключением хронического стресса, содержали в стандартных условиях вивария при естественной суточной смене день/ночь. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики и Приказу МЗ и СР РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». При проведении экспериментов были приняты меры, исключающие излишние физические страдания или повреждения животных. 2.2. Изученные вещества Производное пиразоло[C]пиридина ГИЖ-72 хлорфенил)-2,3-дигидро-1Н-пиразоло[4,3-C]пиридин-3-он, (4,6-диметил-2-(4хлоралгидрат) (0,02; 0,2; 2; 20; 30; 40 мг/кг, ФГБНУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова), производное пирроло[1,2а][1,4]диазепина ГМАЛ-24 (2-(2- гидроксиэтил)-1,2,4,5-тетрагидро-3Н-пирроло[1,2а][1,4] диазепин-3-он) (10 мг/кг, ФГБНУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова), флуоксетин (20 и 40 мг/кг, субстанция Sigma Aldrich), флувоксамин (25 мг/кг, «Феварин», таблетки, Abbott), амитриптилин (10 мг/кг, раствор для внутримышечного и внутривенного введения, Московский эндокринный завод), диазепам (1 мг/кг) и феназепам (2 мг/кг), афобазол (1; 5 и 10 мг/кг, ФГБНУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова), апоморфин (5 мг/кг, субстанция Sigma Aldrich), галоперидол (0,5 мг/кг, субстанция Sigma Aldrich), РК11195 (3 и 5 47 мг/кг, субстанция Sigma Aldrich), финастерид (5 и 15 мг/кг, субстанция Sigma Aldrich), индометацин (10 мг/кг, субстанция Sigma Aldrich), прегненолон (20 мг/кг, субстанция Sigma Aldrich). Изучаемые вещества вводили внутрибрюшинно (за исключением апоморфина, который вводился подкожно) в виде раствора или эмульсии с Tween-80 (Sigma Aldrich), если вещество было нерастворимо в воде. Флувоксамин использовали в виде суспензии. При изучении хронических эффектов на беспородных мышах ГИЖ-72 (30 мг/кг) вводили перорально в виде раствора в 0,01% ДМСО вместо питьевой воды («Димексид», концентрат для приготовления раствора, Татхимфармпрепараты). ДМСО был выбран как универсальный растворитель, применяемый при исследовании новых соединений [Balakin et al., 2006]. Вещества вводили за 15, 30, 40, 60 мин и 24 ч до поведенческих процедур; введение веществ-анализаторов осуществлялось за 30 мин до изучаемых соединений. 2.3. Моделирование хронического стресса 2.3.1. Непредсказуемый хронический умеренный стресс В настоящей работе применялась модель непредсказуемого умеренного хронического стресса (unpredictable chronic mild stress) [Gronli, 2006; Willner, 2005] Во время содержания в условиях вивария животных подвергали воздействию различных стрессовых факторов: мокрая подстилка, нерегулярная чистка клеток (не чаще 1 раза в 7 дней), ограничение доступа к воде, демонстрация трупов особей того же стока, что и экспериментальные животные, нарушение светового режима (сокращение продолжительности светлого времени). Перечисленные стрессовые факторы вводились в случайной последовательности и на различные по длительности интервалы 48 времени. Общая продолжительность воздействия умеренного хронического стресса составляла 14 и 28 дней. 2.4. Оценка антидепрессивной активности 2.4.1. Тест вынужденного плавания Для оценки антидепрессивного эффекта использовали модифицированный вариант теста для мышей [Perona et al., 2008]. Экспериментальная установка представляла собой набор из 5 пластиковых цилиндров высотой 30 см и диаметром 10 см, которые заполняли водой температурой 25±1оС до отметки 20 см. Смена воды осуществлялась после каждой группы животных. За 24 ч до теста проводили сеанс предварительного плавания длительностью 5 мин. Общее время проведение теста для одной группы животных составляло 5 мин, в рамках которого выделяли периоды клайминга, плавания и иммобилизации. Плавание активное использование животным передних лап (без подъема над поверхностью воды) для передвижения вперед, в центр или вдоль стенок цилиндра. Иммобилизация - отсутствие активности, кроме той, что была необходима для поддержания головы над поверхностью воды: движения хвостом или ограниченные движения конечностями. Клайминг – направленные вверх движения передних лап вдоль стенок цилиндра. 2.5. Оценка когнитивной функции 2.5.1. Водный лабиринт Морриса Для оценки когнитивных функций был использован водный лабиринт Морриса [Vorhees and Williams, 2006]. Экспериментальная установка представляла собой бассейн с диаметром арены 150 см, высотой стенок 60 см и платформой с диаметром 10 см. Бассейн заполняли водой температурой 49 25±1оС до отметки 30 см, в которую добавляли сухое молоко для замутнения. Тестовая процедура была рассчитана на 3 дня: в 1 и 2 день животные обучались находить платформу, которая располагалась на высоте 2 см над уровнем воды, на 3 день оценивали воспроизведение полученного навыка по нахождению платформы, находящейся на глубине 1 см под водой. При обучении животному отводили 2 мин на поиски, после чего мышь помещали на платформу принудительно (в случае, если за отведенное время платформа не была найдена). Максимальное количество попыток составляло 3. В самом тесте оценивали время (но не более 2 мин), затраченное на поиск платформы, погруженной под воду. 2.6. Оценка уровня тревоги 2.6.1. Открытое поле Исследование проводили на мышах линии BALB/C в соответствии с методикой «открытое поле» [Воронина и др., 2012; Шимширт и др., 2012]. Уровень тревожности оценивали в экспериментальной установке квадратной формы 40 на 40 см со стенками высотой 22 см. Площадка открытого поля была разделена на 25 квадратов, в 9 центральных квадратах располагалось 16 отверстий диаметром 2 см. Освещенность площадки составляла 300 лк. В течение 2 мин регистрировали: периферическую и центральную горизонтальную активность, число обследований отверстий и вертикальных стоек. На основе полученных данных определяли коэффициент ориентировочной исследовательской реакции (КОИР) по сумме параметров и индекс тревожности (ИТ) по соотношению активности в центральной части установки к сумме активностей в центре и на периферии. Увеличение ИТ являлось коррелятом ослабления тревожных реакций. 50 2.6.2. Тест закапывания шариков Эксперимент проводили по оригинальной методике marble burying test для мышей [Witki, 2008]. Использовали мышей инбредных линий BALB/C и С57BL/6.В качестве экспериментальной установки использовали индивидуальные поликарбонатные боксы для грызунов (31,5х23х15,7 см), которые на 5 см заполняли плотно утрамбованными опилками. В экспериментальной комнате поддерживали минимальный уровень шума и освещение в 100 лк. Предварительно животных помещали в индивидуальные боксы с подстилкой на 30 мин с целью ознакомления. После предварительной посадки опилки вновь утрамбовывали и помещали на них 9 стеклянных шариков диаметром 1,5 см (по схеме 3 на 3). Мышей помещали в индивидуальные боксы с шариками на 30 мин по истечению которых подсчитывали количество зарытых шариков (зарытыми считались шарики, погруженные в подстилку на 2/3). 2.6.3. Черно-белая камера Черно-белая камера представляла собой бокс 16х27х30 см, разделенный на два отсека. Одна половина камеры была ярко освещена светодиодной лампой (390 лк), вторая оставалась затемненной (2 лк). В ходе эксперимента мышь помещали на светлую сторону и в течение 5 мин регистрировали: латентный период (время, прошедшее от момента посадки животного на светлую сторону до первого перехода в темный отсек установки), количество переходов между отсеками и вертикальную активность на светлой стороне, «стрейчи» (максимально возможное 51 вытягивания тела при исследовании пространства с одновременной фиксацией задних конечностей) [Bourin and Hascoët, 2003]. 2.6.4. Гипофагия Гипофагия – экспериментальная модель тревожного поведения, основанная на том, что грызуны, которых поместили в новую обстановку, будут потреблять пишу в значительно меньших количествах и после длительного обследования окружающего пространства [Buccafusco, 2009]. В качестве экспериментальной установки использовали пластиковый прозрачный цилиндр высотой 50 см и диаметром 30 см с освещением 390 лк. В центр установки помещали 1 брикет сухого корма для мышей, после чего – само животное, которое предварительно было подвергнуто 24 ч пищевой депривации. Оценивали время (латентный период) до момента первой попытки взять пищу. Уменьшение латентного времени рассматривали как коррелят снижения тревожности. 2.7. Оценка нейролептической активности 2.7.1. Апоморфиновая вертикализация Нейролептическую активность оценивали по методике апоморфинового клайминга [Островская и др., 2012]. В ходе эксперимента оценивали интенсивность вертикализации мышей С57BL/6 путем подсчета количества лап на прутьях в момент регистрации (каждые 2 мин). После статистической обработки данный параметр был представлен в качестве единиц вертикальной активности. Дополнительно фиксировалась активность животных в баллах: 1 балл соответствовал обнюхиванию прутьев, 2 балла – покусыванию прутьев или жевательным продолжительность теста составляла 60 мин. движениям. Общая 52 2.8. Изучение интероцептивных свойств 2.8.1. Лекарственная дифференцировка Оперантные рефлексы вырабатывали одновременно у 6-ти крыс в 6-ти камерах Скиннера (фирмы Lafayette Instrument Со, США). Каждый из 6-ти оперантных боксов соединялся через интерфейс Lafayette Instrument Со с компьютером и принтером и контролировался программой ABЕTII (США). Рефлексы у животных начинали вырабатывать после 24-часовой водной депривации, в качестве безусловного раздражителя использовали питьевое подкрепление: 1 капля воды объемом 0,125 мл при осуществлении адекватной реакции. Выработку лекарственной дифференцировки осуществляли в соответствии со стандартным протоколом [Калинина и др., 2008; Buccafusco, 2009]. Первый этап обучения состоял в предварительной выработке базового оперантного поведения в режиме фиксированного отношения FR10, при котором каждое 10-е нажатие на любой из двух рычагов подкрепляли 1 каплей воды объемом 0,125 мл. Затем переходили к обучению крыс реакции альтернативного выбора рычагов в зависимости от инъекции контрольного раствора или психотропного вещества, включая первые два сеанса на фоне действия контрольного раствора в общую последовательность чередования дифференцируемых стимулов. Обучение животных лекарственной дифференцировке коразола и физиологического раствора осуществляли в течение 10 мин, длительность тренировки при использовании в качестве дифференцируемых стимулов коразола и контрольного раствора составляла 15 мин. По достижении стабилизации текущего процесса обучения ЛкД и воспроизведения ЛкД осуществляли заместительное тестирование или блокаду интероцептивных эффектов коразола. В тесте на антагонизм ГИЖ-72 53 и феназепам вводили за 30 мин до коразола. Коразол вводили за 15 мин до тестирования. При заместительном тестировании ГИЖ-72 и феназепам вводили за 40 мин до теста. Время теста составляло от 2 до 5 мин, тестовые сессии независимо от реакции животных подкрепляли и не подкрепляли случайным образом. Параметрами оценки воспроизведения интероцептивных эффектов тренировочных и тестовых комбинаций являлись:1) средний по группе % выборов рычага, соотнесенного в процессе обучения с инъекцией тренировочного препарата; 2) % крыс, осуществляющих выбор рычагов, ассоциируемых с каждым из дифференцируемых стимулов. 2.9. Нейрохимический анализ 2.9.1. Определение уровня моноаминов и их метаболитов Уровни моноаминов и их метаболитов определяли в следующих структурах: фронтальная кора, стриатум, Изучаемые структуры головного мозга гипоталамус, гиппокамп. мышей выделяли на холоду, взвешивали и хранили в жидком азоте до эксперимента. Для последующего определения уровней моноаминов и их метаболитов структуры измельчали в гомогенизаторе при +4оС «стекло-тефлон» (0,2 мм) при скорости вращения пестика 3000 об/мин. В качестве среды выделения использовали 20 объемов 0,1Н НСlО4 с диоксибензиламина, добавлением вещества внутреннего стандарта катехоламиновой ДОБА природы, но (3,4не встречающегося в нативной ткани) в концентрации - 0,25 нмоль/мл. Пробы центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Супернатант использовался в дальнейшем для определения моноаминов и их метаболитов. Содержание моноаминов и их метаболитов определялось с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ионпарная хроматография) с электрохимической детекцией на хроматографе LC-304T 54 (BAS, West Lafayette, США) с инжектором Rheodyne 7125, петля для нанесения образцов 20 мкл. Изучаемые вещества разделяли на обращѐннофазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4х100 мм, 3 мкм (Dr.Majsch GMBH, «Элсико», Москва). Насос PM-80 (BAS, США), скорость элюции подвижной фазы 1,0 мл/мин, при давлении 200 атм. Мобильная фаза: 0.1 M цитратнофосфатный буфер, содержащий 1.1 mM октансульфоновой кислоты, 0.1 mM ЭДТА и 9% ацетонитрила (pH 3.0). Измерение проводили с помощью электрохимического детектора LC-4B (BAS США) на стеклоугольном электроде (+0.85 V) против электрода сравнения Ag/AgCl. Регистрация образцов проводилась с применением аппаратно-програмного комплекса МУЛЬТИХРОМ 1,5 (АМПЕРСЕНД). Все использовавшиеся для анализа реактивы были высокой степени чистоты: о.с.ч., х.ч. или analytical grade. Для калибровки хроматографа определяемых веществ использовались в концентрации смеси 500 рабочих стандартов пмоль/мл. Величины концентрации моноаминов в опытных образцах рассчитывали методом «внутреннего стандарта», исходя из отношений площади пиков в стандартной смеси и в образце [Кудрин и др., 2010]. 2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного обеспечения BioStat 2009 (professional version 5.8.4.3, AnalystSoft Inc.). Проверка результатов на нормальность распределения осуществлялась по критерию Шапиро-Уилка, после чего данные были представлены в виде средних значений по группе с указанием стандартной ошибки среднего. Достоверность различий между группами определяли по методу однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и многофакторного дисперсионного анализа, где в качестве факторов рассматривали наличие или отсутствие стресса и введение препаратов. В 55 случае если распределение отличалось от нормального, использовали непараметрические методы статистического анализа – критерий МаннаУитни. Данные, представленные в %, обрабатывали в соответствии с критерием Фишера для оценки выборочных долей вариант. 56 ГЛАВА 3. ОЦЕНКА АНТИДЕПРЕССИВНОЙ АКТИВНОСТИ ИЗУЧАЕМЫХ ВЕЩЕСТВ 3.1. Влияние продолжительности предварительного плавания на эффекты флуоксетина в тесте вынужденного плавания Первоначально протокол вынужденного плавания был описан Роджером Порсолтом и соавторами для крыс [Porsolt et al., 1977]. Позже сама процедура была адаптирована для других видов, включая мышей [Porsolt et al., 1978; Cryan and Holmes, 2005; Slattery and Cryan, 2012]. Тест вынужденного плавания для крыс включает в себя предварительную посадку продолжительностью 15 мин, которую проводят за 24 ч до эксперимента. На сегодняшний день существует большое количество разнообразных модификаций теста вынужденного плавания для мышей: однодневная процедура без предварительного плавания [Castagne et al, 2006; Costa et al., 2013], а также тесты с 6 и 15 минутной предварительной посадкой [Dulawa et al., 2004; Llorens-Martin et al., 2011]. В то же время, Borsini и соавторами было показано, что процедура предварительной посадки за 24 ч до теста может играть важную роль в увеличении чувствительности теста для обнаружения антидепрессивной активности [Borsini et al., 1989]. С учетом того, что тест Порсолта широко используется для скрининга новых фармакологических несоблюдение агентов, может игнорирование привести к условий теста ложноотрицательным или их результатам. Примером зависимости эффекта вещества от условий теста может служить селективный ингибитор обратного захвата серотонина – флуоксетин, который демонстрирует антидепрессивный эффект в широком диапазоне доз в тесте вынужденного плавания без предварительной посадки [Castagne et al, 2006], а в модификации с 15 минутным предварительным плаванием обнаруживает активность только после хронического введения [Dulawa et al., 2004]. 57 Для определения оптимальных условий проведения теста вынужденного плавания у мышей были проведены исследования по изучению влияния продолжительности предварительного плавания на эффекты флуоксетина в тесте Порсолта. В ходе проведения эксперимента животные были разделены на 3 группы по 20 мышей (таблица 3.1.1). Таблица 3.1.1. Схема эксперимента по изучению влияния предварительного плавания на эффекты флуоксетина Группы Группа 1 Группа 2 Группа 3 Количество животных в группе Вещество Физ. р-р, 0,1 мл на 10 г веса Флуоксетин, 20 мг/кг Физ. р-р, 0,1 мл на 10 г веса Флуоксетин, 20 мг/кг Физ. р-р, 0,1 мл на 10 г веса Флуоксетин, 20 10 10 10 10 10 10 мг/кг Предварительная посадка за 24 ч до теста Без предварительной посадки Предварительная посадка продолжительностью 5 мин Предварительная посадка продолжительностью 20 мин В группе с 5 минутным предварительным плаванием наблюдалось усиление депрессивно-подобных реакций в сравнении с группой без предварительной посадки (Рис. 3.1.1): время иммобилизации увеличивалось на 81,5 с (p<0,05), в то время как продолжительность плавания сокращалась на 17,8 с (p<0,05). В группе 3 была отмечена тенденция к усилению депрессивного поведения. Флуоксетин (20 мг/кг, внутрибрюшинно) обнаруживал антидепрессивный эффект в группе 2, который сопровождался уменьшением времени иммобилизации на 74,9 с (р<0,01) и увеличением 58 продолжительности плавания на 66,2 с (p<0,01). В группах 1 и 3 флуоксетин не вызывал каких-либо изменений регистрируемых параметров. Рисунок 3.1.1. Влияние продолжительности предварительного плавания на эффекты флуоксетина в тесте Порсолта у мышей. 300 250 # ** Время, с 200 150 ** # 100 50 # 0 Контроль Флуоксетин (20 мг/кг) Без предварительного плавания Клайминг Контроль Флуоксетин (20 мг/кг) 5-мин предварительное плавание Плавание Контроль Флуоксетин (20 мг/кг) 20-мин предварительное плавание Иммобилизация Примечание: * - р<0,05, ** - p<0,01 в сравнении с контролем внутри группы; # - р<0,05 в сравнении с группой без предварительного плавания. Таким образом, установлено, что наличие процедуры предварительного плавания и ее продолжительность являются важным условием для обнаружения антидепрессивного эффекта флуоксетина в тесте вынужденного плавания у мышей. Полученные результаты обуславливают дальнейшее использование модификации теста с 5-мин предварительной посадкой для изучения антидепрессивных свойств флуоксетина, амитриптилина, ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 при различных режимах введения. 59 3.2. Особенности антидепрессивных эффектов флуоксетина и амитриптилина в модификации теста вынужденного плавания Классический вариант теста вынужденного плавания предполагает регистрацию одного основного параметра – времени иммобилизации, уменьшение которого рассматривают как коррелят антидепрессивной активности изучаемого вещества [Porsolt et al., 1977]. Однако, некоторые авторы [Page et al., 1999; Perona et al., 2008] указывают на необходимость регистрации нескольких параметров: клайминга, плавания и иммобилизации, поскольку экспериментально установлено, что различные классы антидеперессантов неодинаково изменяют эти параметры [Page et al., 1999; Perona et al., 2008]. Это может быть информативным для формирования представления о преобладающей роли того или иного компонента в механизме действия изучаемого вещества на экспериментальном этапе. Поскольку в модификации представленной теста работе вынужденного предполагается использование плавания, представляется целесообразным первоначально исследовать антидепрессивные свойства препаратов сравнения – флуоксетина и амитриптилина. Амитриптилин (10 мг/кг, внутрибрюшинно) после однократного введения демонстрировал антидепрессивный эффект (таблица 3.2.1) с изменением соотношения регистрируемых параметров, характерным для трициклических антидепрессантов: клайминг увеличивался на 52,7 с (р<0,01), плавание на 101,3 с (р<0,01), время иммобилизации сокращалось на 157,3 с (p<0,01). В тоже время, флуоксетин обнаруживал активность, характерную для селективных ингибиторов обратного захвата серотонина – уменьшал время иммобилизации на 57,8 с (р<0,05) с одновременным увеличением продолжительности плавания на 51,5 с (р<0,05). Амитриптилин и флуоксетин обладают антидепрессивным эффектом в модификации теста вынужденного плавания для мышей, что свидетельствует о возможности использования данной модификации для дальнейших 60 исследований антидепрессивной активности препаратов сравнения, а также соединений ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 Таблица 3.2.1. Эффекты флуоксетина и амитриптилина в модификации теста вынужденного плавания у мышей Вещество Доза Физ. р-р, 0,1 мл на N=10 10 г веса Амитриптилин, N=10 Флуоксетин, N=10 Клайминг, с Плавание, с Иммобилизация, с 15,5 ± 7,8 120,0 ± 22,2 172,7 ± 21,1 10 мг/кг 68,2 ± 13,1 ** 221,3 ± 14,8 ** 15,4 ± 8,3 ** 20 мг/кг 13,4 ± 4,0 171,5 ± 20,2 * 114,9 ± 21,3 * Примечание: * - p<0,05; ** - р<0,01 в сравнении с контролем 3.3. Особенности антидепрессивной активности амитриптилина и флуоксетина при различных режимах введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса В большинстве случаев протоколы скрининга антидепрессивной активности среди новых оригинальных соединений предполагают оценку эффекта при однократном введении у здоровых животных при стандартном содержании, как правило, с минимальным воздействием стрессовых факторов перед поведенческими экспериментами [Castagne et al., 2006; PetitDemouliere et al., 2005; Porsolt et al., 1977]. Проблема релевантности экспериментальных условий исследования антидепрессивной и противотревожной активности была обозначена в работах Франко Борсини [Borsini et al., 2002; Borsini, 2012], согласно которым прогностическую ценность имеют результаты, полученные в условиях моделирования патологии при длительном введении, при этом отсутствие эффектов у 61 здоровых животных следует считать положительным признаком. В связи с этим, определенный непредсказуемого интерес хронического представляет умеренного изучение стресса на влияния эффекты антидепрессантов в тесте вынужденного плавания при различной кратности введения. Схема эксперимента представлена в таблице 3.3.1. А) Острое введение без воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса. Однократное введение амитриптилина сопровождалось уменьшением времени иммобилизации в 11,2 раза (р<0,01), увеличением клайминга в 4,4 раза и плавания в 1,8 (р<0,01) по сравнению с контрольной группой. При остром введении флуоксетина отмечалось снижение времени иммобилизации в 1,5 раза (p<0,05) и увеличение времени плавания в 1,4 раза (p<0,05) без изменения клайминга (рис 3.3.1). Б) Субхроническое введение и 14-дневный непредсказуемый умеренный хронический стресс. Флуоксетин при однократном введении (замене субхронических инъекций физиологического раствора на острое введение флуоксетина в тесте вынужденного плавания) не вызывал достоверных изменений какого-либо из регистрируемых параметров в сравнении с контролем; субхроническое введение приводило к увеличению времени иммобилизации в 1,5 раза (р<0,01) и уменьшению плавания в 2,9 раза (р<0,01), клайминг отсутствовал. Амитриптилин при остром введении уменьшал время иммобилизации в 2,7 раза (p<0,01), увеличивая одновременно плавание и клайминг в 1,5 и 6,5 раз соответственно (p<0,01). На фоне субхронического введения амитриптилина время иммобилизации сокращалось в 2,5 раза (р<0,01), также было отмечено увеличение продолжительности клайминга в 6,9 раз и плавания в 1,4 раза (p<0,05). По сравнению с острым введением без воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса, амитриптилин демонстрировал менее выраженный антидепрессивный эффект – примерно в 4 раза слабее влиял на сокращение времени иммобилизации (p<0,05) и 1,4 раза на период плавания (p<0,05), в то время как клайминг сохранялся на том же уровне. 62 В) Хроническое введение и 28-дневный непредсказуемый умеренный хронический стресс. Однократное и хроническое введение флуоксетина приводило к уменьшению иммобилизации и увеличению плавания. Иммобилизация при однократном введении уменьшалась в 1,7 раза (p<0,01), при хроническом – в 4,7 раза (p<0,01); плавание увеличивалось в 4,7 и 4,8 раза (p<0,01) при остром и хроническом введении соответственно. Амитриптилин как при остром, так и при хроническом введении уменьшал время иммобилизации в 2,8 и 4,7 раза (p<0,01) соответственно; время плавания увеличивалось в 4,7 раза (p<0,01); на фоне введения амитриптилина регистрировался клайминг (p<0,01), который отсутствовал у контрольной группы. Антидепрессивный эффект амитриптилина также был менее выражен по сравнению с острым введением препарата без воздействия непредсказуемого хронического умеренного стресса (p<0,05). Достоверных отличий между эффектами амитриптилина при остром и хроническом введении на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса не было, но имелась тенденция антииммобилизационного эффекта к усилению при клайминга и хроническом введении о эффекты амитриптилина. Полученные данные свидетельствуют том, что амитриптилина и флуоксетина в тесте вынужденного плавания находятся в зависимости от непредсказуемого хронического умеренного стресса. Так, антидепрессивный эффект амитриптилина сохраняется на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса, но уменьшается его выраженность – снижается антииммобилизационный эффект и влияние препарата на продолжительность плавания, в то время как клайминг не зависит от воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса. Флуоксетин же, напротив, демонстрирует зависимость активности от воздействия непредсказуемого хронического умеренного стресса, более того, субхроническое введение антидепрессивного эффекта. флуоксетина сопровождалось инверсией 63 Таблица 3.3.1. Схема эксперимента по изучению влияния НХУС на эффекты амитриптилина и флуоксетина в тесе вынужденного плавания при различной кратности введения Режим введения Непредсказуемый хронический умеренный стресс Без стресса Однократное Субхроническое Хроническое Группа Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа 6 Группа 7 Группа 8 Группа 9 Группа 10 Группа 11 Группа 12 Группа 13 Предварительное введение Вещество Доза Длительность - Введение в день теста Вещество Доза Физ р-р Амитриптилин 10 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг Физ р-р Физ р-р Амитриптилин 10 мг/кг 13 дней Флуоксетин 20 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг Общая продолжительность 14 дней Физ р-р Физ р-р Амитриптилин 10 мг/кг 27 дней Флуоксетин 20 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг Общая продолжительность 28 дней 64 Рисунок 3.3.1. Влияние продолжительности умеренного хронического стресса на эффекты антидепрессантов тесте вынужденного плавания 300 ^^ ## ** 250 $ # ** ** 200 Время, с ## # ** * 150 # ** # ** # # * 100 # ** ** ** ** # ** ^^ ## ** ^^ ## ** 0 3 При отсутствии стресса 1 2 4 3 5 плавание ## # ** ** $$ ## 1 2 6 3 7 28 дневный стресс 14 дневный стресс клайминг ** $ ** ** ** 2 ** # ** 50 1 # ** иммобилизация 1 – контроль, 2 – амитриптилин (острое введение), 3 – флуоксетин (острое введение), 4 – амитриптилин (субхроническое введение), 5 – флуоксетин (субхроническое введение), 6 – амитриптилин (хроническое введение), 7 – флуоксетин (хроническое введение), ** - p<0.01; * - p<0.05 (отличие от контрольной группы); ## - p<0.01; # p<0.05 (отличие от острого введения того же вещества при отсутствии стресса); ^^ - p<0.01; ^ - p<0.05 (отличие от острого введения внутри одной стресс-группы); $$ p<0.01; $ - p<0.05 (отличие хронического введения от субхронического). 65 3.4. Изучение антидепрессивной активности производного пиразоло[C]пиридина ГИЖ-72 при отсутствии стресса. Антидепрессивная активность ГИЖ-72 была изучена в тесте вынужденного плавания для крыс, который включал в себя однодневную процедуру с регистрацией одного основного параметра иммобилизации, уменьшение рассматривали как – времени коррелят наличия антидепрессивного эффекта [Мелетова, 2007]. Изучение ГИЖ-72 в модифицированном варианте теста может быть информативным для формирования представлений о преобладающей роли того или иного компонента в механизме действия изучаемого соединения. ГИЖ-72 в дозе 2 мг/кг не вызывал изменений регистрируемых параметров, в то время, как в дозах 0,02 и 0,2 мг/кг была отмечена тенденция к уменьшению времени иммобилизации (Рис 3.4.1). Флуоксетин (20 мг/кг) оказывал антидепрессивное действие за счет уменьшения времени иммобилизации в 1,3 раза (p<0,05) с одновременным увеличением продолжительности плавания в 1,9 раза (р<0,05). ГИЖ-72 в дозах 20 мг/кг и 30 мг/кг не вызывали каких-либо достоверных изменений поведенческих реакций, однако во втором случае наблюдалась тенденция к увеличению времени иммобилизации, а также сокращению продолжительности плавания и клайминга (Рис 3.4.2). При увеличении дозы ГИЖ-72 до 40 мг/кг у животных развивались депрессивноподобные реакции, которые сопровождались увеличением иммобилизации в 1,3 раза (р<0,05) и редукцией клайминга (р<0,01). Похожие изменения были выявлены после введения флуоксетина в дозе 40 мг/кг – увеличивалось время иммобилизации в 1,3 раза (р<0,05), а вместо клайминга уменьшалась продолжительность плавания в 2,1 раза (р<0,05). ГИЖ-72 через 24 ч после введения в дозе 20 мг/кг не оказывал какоголибо действия на поведенческие реакции, а в дозе 40 мг/кг – вызывал редукцию клайминга (р<0,01). Кроме того, в дозе 40 мг/кг была выявлена 66 тенденция к уменьшению иммобилизации и увеличению продолжительности клайминга (Рис 3.4.3). Рисунок 3.4.1. Эффекты малых доз ГИЖ-72 в тесте вынужденного плавания 300 250 * Время, с 200 150 * 100 50 0 Контроль ГИЖ-72 (0,02 мг/кг) Клайминг ГИЖ-72 (0,2 мг/кг) Плавание Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,05 ГИЖ-72 (2 мг/кг) Иммобилизация Флуоксетин (20 мг/кг) 67 300 300 250 250 200 ** 150 ** 100 Время, с Время, с Рисунок 3.4.2. Эффекты ГИЖ-72 и флуоксетина в тесте вынужденного плавания 50 100 0 Контроль Клайминг Плавание Флуоксетин, 20 мг/кг Контроль Клайминг Иммобилизация ГИЖ 72, 20 мг/кг Плавание Иммобилизация 300 300 250 250 * 200 Время, с Время, с 150 50 0 150 100 * 50 200 150 100 50 0 Контроль Клайминг Плавание Флуоксетин, 40 мг/кг Иммобилизация 300 250 Время, с 200 * 200 150 100 50 ** 0 Контроль Клайминг Плавание ГИЖ-72, 40 мг/кг Иммобилизация Примечание: * - p<0,05, ** - р<0,01 0 Контроль Клайминг Плавание ГИЖ-72, 30 мг/кг Иммобилизация 68 Рисунок 3.4.3. Эффекты ГИЖ-72 через 24 ч после введения в тесте в вынужденного плавания. 300 250 Время, с 200 150 Клайминг Плавание 100 Иммобилизация 50 ** 0 Контроль ГИЖ-72 (20 мг/кг) ГИЖ-72 (40 мг/кг) Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01 в сравнении с контролем Таким образом, установлено, что ГИЖ-72 (40 мг/кг), как и флуоксетин (40 мг/кг), обладает дозозависимым депрессивно-подобным эффектом в тесте вынужденного плавания. Однако эффекты ГИЖ-72 и флуоксетина отличаются по изменению соотношения регистрируемых параметров: если ГИЖ-72 вызывает увеличением времени иммобилизации с одновременной редукцией клайминга, то флуоксетин – с одновременным сокращением продолжительности плавания. 69 3.5. Изучение антидепрессивной активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 после субхронического введения в условиях непредсказуемого умеренного хронического стресса Схема эксперимента представлена в таблице 3.5.1. А) Острое введение без воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса. ГИЖ-72 (20 мг/кг) и ГМАЛ-24 (10 мг/кг) после однократного введения не вызывали изменений в тесте вынужденного плавания (Рис 3.5.1). Амитриптилин (10 мг/кг) увеличивал клайминг в 6,2 раза (р<0,01), продолжительность плавания – в 1,9 раза (р<0,01) и одновременно сокращал время иммобилизации в 11,3 раза (р<0,01). Флуоксетин (20 мг/кг) антидепрессивным после эффектом, однократного который введения сопровождался обладал уменьшением времени иммобилизации в 1,4 раза (р<0,05) c одновременным увеличением плавания в 1,5 раза (р<0,05). Б) Субхроническое введение и 14-дневный непредсказуемый умеренный хронический стресс. ГИЖ-72 (20 мг/кг) и ГМАЛ-24 (10 мг/кг) после однократного введения на фоне НХУС не демонстрировали какой-либо фармакологической активности. После субхронического введения изучаемых соединений также регистрируемых не было параметров. выявлено Однако, была достоверных отмечена изменений тенденция к увеличению времени иммобилизации и сокращению продолжительности плавания после субхронического инъекционного курса ГМАЛ-24. Амитриптилин (10 мг/кг) после однократного введения уменьшал время иммобилизации в 4 раза (р<0,05), увеличивал продолжительность плавания и клайминга в 1,6 и в 11,5 раза (p<0,05) соответственно. Следует отметить, что глубина антидепрессивного эффекта амитриптилина по сравнению с однократным введением уменьшилась – продолжительность иммобилизации была в 3 раза выше (р<0,05), а плавания в 1,3 раза (р<0,05) меньше по сравнению с однократным введением при отсутствии стресса. 70 Однократное введение флуоксетина (20 мг/кг) не изменяло поведенческих реакций. Субхроническое введение амитриптилина (20 мг/кг) приводило к сокращению времени иммобилизации в 3 раза (р<0,05), увеличению продолжительности плавания в 1,5 раза (р<0,05), а клайминга в 10,5 раза (р<0,05). Антидепрессивный эффект амитриптилина после субхронического введения также характеризовался меньшей глубиной по сравнению с однократным введением в отсутствии НХУС. Флуоксетин (20 мг/кг) после субхронического введения демонстрировал усиление депрессивно-подобных реакций, которые характеризовались увеличением продолжительности иммобилизации в 1,4 раза (р<0,01), уменьшением плавания в 3,5 раза (р<0,01) и редукцией клайминга (р<0,01). Таким образом, ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 демонстрируют отсутствие активности в тесте вынужденного плавания после субхронического введения в условиях модели НХУС. Амитриптилин же напротив демонстрировал антидепрессивный эффект, который сохранялся в условиях НХУС. Субхроническое введение флуоксетина в условиях НХУС приводило к инверсии антидепрессивного эффекта. 71 Таблица 3.5.1. Схема эксперимента по изучению антидепрессивных свойств ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 при субхроническом введении в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса Без стресса Однократное Непредсказуемый хронический умеренный стресс Режим введения Субхроническое Группа Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа 6 Группа 7 Группа 8 Группа 9 Группа 10 Группа 11 Группа 12 Группа 13 Группа 14 Предварительное введение Вещество Доза Длительность - Введение в день теста Вещество Доза Физ р-р ГИЖ-72 20 мг/кг ГМАЛ-24 10 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг Физ р-р ГИЖ-72 20 мг/кг Физ р-р ГМАЛ-24 10 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг 13 дней Флуоксетин 20 мг/кг ГИЖ-72 20 мг/кг ГИЖ-72 20 мг/кг ГМАЛ-24 10 мг/кг ГМАЛ-24 10 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг Общая продолжительность 14 дней 72 Рисунок 3.5.1. Влияние непредсказуемого умеренного хронического стресса на эффекты ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в тесте вынужденного плавания ^^ ## ** 300 250 ** Время, с 200 # * * 150 # * 100 # * # ** # * * * # * 50 ** 0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 ^^ ## ** ^^ ## ** 9 14 дневный стресс При отсутствии стресса клайминг плавание иммобилизация 1 – контроль, 2 – ГИЖ-72 (20 мг/кг) после однократного введения, 3 – ГМАЛ-24 (10 мг/кг) после однократного введения, 4 – амитриптилин (10 мг/кг) после однократного введения, 5 – флуоксетин (20 мг/кг) после однократного введения, 6 – ГИЖ-72 (20 мг/кг) после субхронического введения, 7 – ГМАЛ-24 (10 мг/кг) после субхронического введения, 8 – амитриптилин (10 мг/кг) после субхронического введения, 9 – флуоксетин (20 мг/кг) после субхронического введения. ** - p<0.01; * p<0.05 (отличие от контрольной группы); ## - p<0.01; # - p<0.05 (отличие от острого введения того же вещества при отсутствии стресса); ^^ - p<0.01; ^ - p<0.05 (отличие от острого введения внутри одной стресс-группы). 73 3.6. Особенности антидепрессивной активности ГИЖ-72 после хронического перорального введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса Результаты, полученные при изучении эффектов флуоксетина после длительного введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса, показали, что эффекты антидепрессантов в тесте вынужденного плавания могут зависеть от кратности введения препарата, а также продолжительности стрессовой экспозиции. Принимая во внимание динамику эффектов флуоксетина на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса и данных о наличии у ГИЖ-72 антидепрессивного эффекта [Мелетова, 2007], важным аспектом изучения психотропной активности ГИЖ-72 являлась оценка его эффектов в тесте вынужденного плавания после хронического введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса. Кроме того, особое внимание следует уделить вопросу эффективности нового соединения при пероральном введении, поскольку, с одной стороны, возможность создания пероральной лекарственной формы будущего препарата может обеспечить простоту приема и повысить комплаентность, с другой, в условиях эксперимента, позволяет избавиться от каждодневных стрессовых манипуляций, ассоциированных с инъекционным введением вещества. Принимая во внимание тот факт, что соединение ГИЖ-72 не растворимо в воде и некоторых органических растворителях, для получения водных раствроров был использован ДМСО в коцентрации 0,01%, как универсальный растворитель, широко используемый в экспериментальной медико-биологической практике [Balakin et al., 2006]. В ходе эксперимента животные были разделены на 3 группы по 10 мышей в каждой: 1) контрольная группа; 2) группа, получавшая 0,01% раствор ДМСО перорально с питьевой водой в течение 28 дней; 3) группа, 74 получавшая ГИЖ-72 (30 мг/кг), растворенный в питьевой воде с добавлением ДМСО (до 0,01%), в течение 28 дней. В группе животных, получавших 0,01% раствор ДМСО, регистрировали уменьшение времени иммобилизации в 2,4 раза (р<0,01), а также увеличение продолжительности клайминга и плавания в 4,2 и 1,6 раза (р<0,05) соответственно (таблица 3.6.1). ГИЖ-72 после хронического перорального введения достоверно не изменял регистрируемых параметров, однако, была отмечена тенденция к уменьшению времени иммобилизации и увеличению продолжительности плавания. Помимо регистрации поведенческих параметров была проведена оценка внешнего вида животных (таблица 3.6.2). По результатам внешнего осмотра было установлено, что животных, получавшие 0,01% раствор ДМСО в течение 28 дней, были покрыты множественными язвами, а волосяной покров у них был разрежен. Контрольная группа и группа, получавшая комбинацию из 0,01% раствора ДМСО и ГИЖ-72, не были подвержены внешним изменениям – язвы отсутствовали, а волосяной покров находился в состоянии нормы. Таблица 3.6.1. Эффекты ДМСО и ГИЖ-72 в тесте вынужденного плавания при совместном хроническом введении в условиях НХУС Вещество Контроль, n=8 ДМСО, n=10 ДМСО + ГИЖ-72, n=10 Доза Клайминг, с Плавание, с Иммобилизация, с - 10,5 ± 1,8 111,9 ± 19,0 177,6 ± 19,6 0,01% 44,1 ± 12,0 * 182,6 ± 20,3 * 73,2 ± 28,9 ** 11,8 ± 1,8 158,9 ± 20,9 129,3 ± 21,3 0,01% + 30 мг/кг Данные представлены как M ± S.E.M., n – количество животных в группе * - p<0,05; ** - p<0,01 – в сравнении с контролем 75 При сопоставлении данных, полученных при регистрации поведенческих параметров и оценки внешнего вида животных, можно сделать вывод, что пероральное применение 0,01% раствора ДМСО в течение 28 дней в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса приводит к его потенцированию. Антидепрессивная активность после хронического введения 0,01% ДМСО может быть отражением усугубления нейродегенеративных процессов, опосредованных стрессовой экспозицией и должна рассматриваться в качестве ложноположительного антидепрессивного эффекта, который также может наблюдаться при частичной денервации голубого пятна у крыс [Häidkind et al., 2003]. В противоположность этому, отсутствие эффектов при одновременном пероральном введении 0,01% ДМСО и ГИЖ-72 (30 мг/кг) можно расценивать как наличие стресс-протекторной активности у ГИЖ-72, которая требует дальнейшего изучения. Таблица 3.6.2. Протокол внешнего осмотра животных после 28дневного непредсказуемого хронического стресса № Контроль п/п 1 Масса 26 г; кожный и волосяной покровы в норме 2 Масса 34 г; кожный и волосяной покровы в норме 3 Масса 35 г; ДМСО 0,01% Масса 41 г; на задней части спины 4 язвы, 1 язва на боковой части тела, множественные язвы на хвосте, разреженный волосяной покров Масса 26 г; большая язва на задней части спины над хвостом, множественные язвы на хвосте, разреженный волосяной покров Масса 35 г; ДМСО 0,01% + ГИЖ-72 30 мг/кг Масса 27 г; волосяной покров в норме, 1 язва на левой задней лапе Масса 39 г; кожный и волосяной покровы в норме Масса 35 г; 76 кожный и волосяной покровы в норме 4 Масса 33 г; кожный и волосяной покровы в норме 5 Масса 29 г; кожный и волосяной покровы в норме 6 Масса 31 г; кожный и волосяной покровы в норме 7 Масса 34 г; кожный и волосяной покровы в норме 8 - 9 - 10 - 1 язва на задней части спины, волосяной покров в норме, отсутствует кончик хвоста, на хвосте единичные язвы Масса 29 г; 5 язв на задней части спины, волосяной покров разреженный, кончик хвоста отсутствует, множественные язвы на хвосте Масса 37 г; 2 язвы на передних лапах, волосяной покров разреженный Масса 41 г; волосяной покров разреженный, множественные язвы на хвосте Масса 35 г; волосяной покров в норме, множественные язвы на хвосте, кончик хвоста отсутствует Масса 39 г; волосяной покров в норме, единичные язвы на хвосте, кончик хвоста отсутствует Масса 31 г; 1 язва около основания хвоста, волосяной покров в норме, единичные язвы на хвосте, кончик хвоста поврежден Масса 31 г; 3 язвы на задней части спины, волосяной покров разреженный кожный и волосяной покровы в норме Масса 30 г; кожный и волосяной покровы в норме Масса 34 г; кожный и волосяной покровы в норме Масса 28 г; кожный и волосяной покровы в норме Масса 31 г; кожный и волосяной покровы в норме Масса 39 г; волосяной покров слегка разреженный, язвы отсутствуют Масса 36 г; кожный и волосяной покровы в норме Масса 33 г; кожный и волосяной покровы в норме 77 3.7. Изучение эффектов ГИЖ-72 в водном лабиринте Морриса после хронического введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса Одним из симптомов большого депрессивного расстройства или собственно клинической депрессии являются нарушения со стороны когнитивных функций [Harvey, 2007], которые входят в так называемую депрессивную триаду. В тесте вынужденного плавания оценивается дисфорический компонент депрессии, а для изучения влияния фармакологического агента на когнитивные функции используют целый ряд поведенческих моделей, одной из которых является водный лабиринт Морриса – модель пространственного обучения у грызунов [Vorhees and Williams, 2006]. Для изучения эффектов ГИЖ-72 в водном лабиринте Мориса животные были разделены на две экспериментальный группы: 1) группа, которая получала 0,01% раствор ДМСО перорально в течение 28 дней и 2) группа, получавшая ГИЖ-72 в дозе 30 мг/кг, разведенный в питьевой воде с добавлением ДМСО (до 0,01%). Обе группы животных были подвержены воздействию непредсказуемого хронического умеренного стресса продолжительностью 28 дней. В 1 день обучения животные, получавшие ГИЖ-72 в дозе 30 мг/кг, во время третьей посадки находили платформу в 1,6 раза быстрее (p<0,05) по сравнению с группой ДМСО (Рис 3.7.1). Во второй день обучения группа, которая получала 0,01% ДМСО во время первой и третьей посадки тратила меньше времени на поиск платформы в 1,4 и 2,0 раза соответственно (p<0,05). При воспроизведении полученного навыка между ДМСО и ГИЖ-72 не было зарегистрировано достоверных отличий. Кроме того, на фоне хронического введения ДМСО была отмечена характерная траектория движения животных с преимущественной активностью вблизи стенок – 78 тигмотаксисом (90% животных), в то время как после хронического введения ГИЖ-72 тигмотаксис отсутствовал. Таким образом, хроническое введение ГИЖ-72 в дозе 30 мг/кг улучшает процесс обучения животных в первый день теста, что может быть связано со снижением уровня тревожности, т.к. ГИЖ-72 устранял тигмотаксис, характерный для группы контроля. Рисунок 3.7.1. Влияние перорального введения ГИЖ-72 и ДМСО на обучение и воспроизведение навыка в водном лабиринте Морриса у мышей. Обучение Воспроизведение 160 140 Время, с 120 * 100 # 80 # 60 40 20 0 ДМСО 0,01% ДМСО 0,01 % + ГИЖ-72 30 мг/кг 1 день Посадка 1 ДМСО 0,01% ДМСО 0,01 % + ГИЖ-72 30 мг/кг ДМСО 0,01% 2 день Посадка 2 ДМСО 0,01% + ГИЖ-72 30 мг/кг 3 день Посадка 3 Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем того же дня, # - р<0,05 в сравнении с первым днем обучения. 79 ГЛАВА 4. ОЦЕНКА АНКСИОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИЗУЧАЕМЫХ ВЕЩЕСТВ Как известно, в клинической практике большое депрессивное расстройство или собственно депрессия зачастую сочетается с тревожными расстройствами, поэтому особую актуальность приобретает задача поиска новых фармакологических агентов, обладающих как антидепрессивными, так и анксиолитическими свойствами. Кроме того, многие антидепрессанты, в частности селективные ингибиторы обратного захвата серотонина и некоторые представители группы трициклических антидепрессантов применяются в терапии самостоятельных тревожных расстройств, таких как панические атаки и обсессивно-компульсивное расстройство [Marazziti et al., 2012]. В связи с этим, важной задачей является изучение активности новых соединений на основных моделях тревоги – тестах «открытое поле», «закапывание шариков», «приподнятый крестообразный лабиринт», «чернобелая камера» при длительном введении в условиях стресса. 4.1. Особенности анксиолитической активности изучаемых веществ при однократном введени в отсутствии стресса 4.1.1. Влияние изучаемых веществ на ориентировочноисследовательскую реакцию Ранее было показано, что ГИЖ-72 обладает анксиолитическими свойствами в тесте «открытое поле» после однократного и хронического введения у крыс [Мелетова, 2007]. Тем не менее, отдельную задачу представляет изучение психотропных эффектов ГИЖ-72 на мышах. Исследования на мышах инбредной линии BALB/C, которые обладают повышенным уровнем тревожности, представляет собой более релевантную модель для соединения с анксиолитической активностью. Кроме того, 80 определенный интерес представляет сопоставление структуры анксиолитического эффекта ГИЖ-72 в тесте открытое поле не только с анксиолитиками бензодиазепинового ряда, но и с препаратами других фармакологических групп, в частности с современным «дневным» анксиолитиком афобазолом, а также трициклическими антидепрессантами и селективными ингибиторами обратного захвата серотонина. Известно, что флуоксетин обладает анксиогенными свойствами на основных моделях тревоги, таких как открытое поле, черно-белая камера, приподнятый крестообразный лабиринт [Artaiz et al., 1998; Borsini et al., 2002; Huang et al., 2008], в то время как флувоксамин обладает анксиолитическими свойствами [Borsini et al., 2002], а амитриптилин не изменяет поведение в большинстве тестов по оценке уровня тревожности [Borsini et al., 2002]. ГИЖ-72 (20 мг/кг) при однократном введении, не изменяя КОИР, избирательно увеличивал индекс тревожности в 1,9 раза (p<0,01) по сравнению с контрольной группой животных (таблица 4.1.1.1), что свидетельствует о наличии анксиолитической активности у изучаемого соединения, которая сохранялась через 24 ч после введения. Однако, эффекты ГИЖ-72 через 30 мин и через 24 ч после введения имели некоторые различия: если в первом случае была отмечена тенденция к усилению центральной горизонтальной активности, то во втором – к уменьшению периферической горизонтальной активности. Амитриптилин (10 мг/кг) уменьшал периферическую горизонтальную активность в 1,3 раза (р<0,05) и вертикальные стойки в 2,3 (р<0,05). Флуоксетин в дозе 20 мг/кг вызывал усиление тревожных реакций: уменьшал периферическую горизонтальную активность в 1,6 раза (р<0,05), центральную – в 3 раза (р<0,05), индекс тревожности – в 1,8 раза (р<0,01), устранял вертикальные стойки и снижал КОИР в 1,7 раза (р<0,05). Диазепам (1 мг/кг) в 2 раза увеличивал периферическую горизонтальную активность (р<0,05), вертикальную активность и КОИР (р<0,01), в 1,8 раз – центральную активность (р<0,01), в 1,5 раза – число обследований отверстий (р<0,01). 81 Афобазол также демонстрировал анксиолитический эффект, который сопровождался увеличением периферической горизонтальной активности, центральной активности, числа обследований отверстий и КОИР в 1,5 раза (р<0,01). Установлено, что ГИЖ-72 в дозе 20 мг/кг обладает анксиолитическим эффектом в тесте «открытое поле», который сохраняется через 24 ч после введения вещества и отличается от флуоксетина по направленности действия, а от диазепама и афобазола – по структуре поведенческих эффектов. 4.1.2. Влияние изучаемых веществ на компульсивное поведение мышей В клинике некоторые антидепрессанты, в частности селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, применяют для лечения тревожных расстройств, таких как панические атаки и обсессивнокомпульсивное расстройство [Marazziti et al., 2012; Pull1 and Damsa, 2008]. Установлено, что флуоксетин обладает анксиогенными свойствами на основных моделях тревоги у грызунов – тесте «приподнятый крестообразный лабиринт», «конфликтная ситуация», «черно-белая камера» и т.д. [Artaiz et al., 1998; Borsini et al., 2002; Huang et al., 2008], кроме теста «закапывания шариков», где препарат демонстрирует ослабление тревожных реакций [Witkin, 2008]. Для прогнозирования возможной эффективности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в фармакотерапии обсессивно-компульсивного расстройства представляется целесообразным изучение эффективности ГИЖ-72 и ГМАЛ24 на экспериментальной модели данной патологии – тесте закапывания шариков (marble burying test) [Witkin, 2008]. ГИЖ-72 в дозе 20 мг/кг уменьшал количество зарытых шариков на 27,5% (р<0,05) у мышей линии С57BL/6 и на 21,0% (p<0,05) у мышей линии BALB/C (Рис 4.1.2.1 и 4.1.2.3). Афобазол в дозе 5 мг/кг уменьшал количество зарытых шариков на 33,7% (р<0,05) у мышей С57BL/6, а в дозах 1 мг/кг и 5 82 мг/кг на 23,9% и 15,2% соответственно у мышей линии BALB/C (Рис 4.1.2.2). Флуоксетин в дозе 20 мг/кг уменьшал число зарытых шариков у мышей линии C57BL/6 и BALB/C на 45,7% (р<0,05) и 39,0% (р<0,05) соответственно. Флувоксамин (20 мг/кг) – на 39% у мышей линии BALB/C. Полученные данные свидетельствуют о наличии у ГИЖ-72 (20 мг/кг) анксиолитического эффекта в тесте закапывания шариков у мышей линий C57BL/6 и BALB/C, наличие которого может служить прогностическим признаком эффективности ГИЖ-72 в терапии обсессивно-компульсивного расстройства. Афобазол также ингибирует закапывание шариков в дозе 5 мг/кг у мышей линии C57BL/6, в дозах 1 мг/кг и 5 мг/кг – у мышей BALB/C. 83 Таблица 4.1.1.1. Анксиолитическая активность ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в тесте «открытое поле» у мышей линии BALB/C Вещество Доза Горизонтальная активность Периферическая Центральная Контроль, 39,2 ± 2,3 7,8 ± 1,9 N=10 Флуоксетин, 20 мг/кг 24,4 ± 4,2 * 2,5 ± 0,9 * N=10 Амитриптилин, 10 мг/кг 29,8 ± 3,4 * 6 ± 1,6 N=10 Контроль, 23,5 ± 7,8 1,0 ± 0,5 N=10 Флувоксамин, 25 мг/кг 25,2 ± 6,0 0,9 ± 0,4 N=10 Контроль, N=15 15,2 ± 1,4 4,1 ± 0,8 Диазепам, 30,0 ± 2,8 7,5 ± 0,8 1 мг/кг N=10 * ** Афобазол, 23,1 ± 2,8 6,1 ± 1,2 1 мг/кг N=10 * ** Контроль, N=10 26,0±3,2 2,7±1,0 ГИЖ-72, 20 мг/кг 22,6±2,8 4,8±1,7 N=10 ГМАЛ-24, 10 мг/кг 21,6 ± 4,3 2,5 ± 0,7 N=10 Контроль 12,2±3,3 2,4±0,7 за 24 ч, N=10 ГИЖ-72 6,3±0,9 2,7±1,0 20 мг/кг за 24 ч, N=10 * - p<0,05; ** - p<0,01 – в сравнении с контролем внутри каждой группы Индекс тревожности Обследований отверстий Вертикальная активность КОИР 16,6 % 8,3 ± 0,8 2,7 ± 0,4 58 ± 3,1 9,3 %** 7,6 ± 0,8 0,4 ± 0,2 * 34,9 ± 4,9 * 14,0 % 9,9± 1,1 1,2 ± 0,6 * 46,9 ± 5,5 4,1% 3,1 ± 1,3 2,9 ± 0,5 30,5 ± 9,5 3,4% 1,1 ± 0,4 2,9 ± 0,4 30,1 ± 6,6 21 % 22 % 1,5 ± 0,3 3,0 ± 0,4 ** 1,9 ± 0,5 23,2 ± 1,8 43,5 ± 3,8 ** 34,1 ± 2,6 ** 36,7±4,5 9,4 % 17,5 % ** 2,7±1,1 1,7 ± 0,3 2,5 ± 0,4 ** 2,5 ± 0,3 ** 5,3±0,7 2,0±0,8 6,4±0,7 35,8±4,6 9,8 % 4,9 ± 0,9 3,1 ± 0,7 34,8 ± 3,1 16,4 % 0 5,7±0,7 20,9±3,4 30,0 % ** 0 5,0±0,9 14,0±1,4 21 % 84 Рисунок 4.1.2.1. Антикомпульсивная активность ГИЖ-72, флуоксетина и афобазола в тесте закапывания шариков у мышей линии C57BL/6 100% % зарытых шариков 90% 80% 70% 60% 50% * * 40% * 30% 20% 10% 0% Контроль Флуоксетин (20 мг/кг) Афобазол (1 мг/кг) Афобазол (5 мг/кг) ГИЖ-72 (20 мг/кг) * - р<0,05 в сравнении с контролем Рисунок 4.1.2.2. Антикомпульсивная активность афобазола в тесте закапывания шариков у мышей линии BALB/C 100% % зарытых шариков 90% * 80% * 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Контроль Афобазол (1 мг/кг) Афобазол (5 мг/кг) Афобазол (10 мг/кг) * - р<0,05 в сравнении с контролем 85 Рисунок 4.1.2.3. Изучение анксиолитических эффектов ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в тесте закапывания шариков у мышей линии BALB/C 100% 90% % зарытых шариков 80% 70% 60% 50% * 40% * 30% * 20% 10% 0% Контроль Флуоксетин (20 Флувоксамин мг/кг) (25 мг/кг) ГИЖ-72 (20 мг/кг) ГМАЛ-24 (10 мг/кг) * - р<0,05 в сравнении с контролем 4.1.3. Влияние ГИЖ-72 на апоморфиновую вертикализацию Активность шариков» фармакологического позволяет дать агента в прогностическую тесте оценку «закапывание эффективности изучаемого соединения в фармакотерапии обсессивно-компульсивного расстройства, однако, по данному определенную характеристику тесту полученному невозможно эффекту. присвоить Известно, что поведение в тесте «закапывание шариков», помимо антидепрессантов с серотонинергическим механизмом действия, ингибируют также анксиолитики бензодиазепинового ряда и нейролептики – препараты, пременяемые в терапии второй линии обсессивно-компульсивного расстройства [Bruins Slot et al., 2008; Decloedt and Stein, 2010; Marazziti et al., 2012]. В связи с положительными эффектами, полученными в тесте «закапывание шариков», становится актуальной задача по изучению 86 нейролептической активности нового соединения. Для решения этой проблемы была выбрана модель апоморфинового клайминга как одна из классических методик скрининга нейролептической активности [Миронов, 2012]. В тесте вертикализации апоморфин (5 мг/кг) увеличивал активность животных в 29 раз (р<0,01) и на 27 баллов (p<0,01) по сравнению с физиологическим раствором. ГИЖ-72 в дозах 20 и 40 мг/кг не оказывал влияния на интенсивность апоморфиновой вертикализации (таблица 4.1.3.1). Таким образом, ГИЖ-72 не проявлял нейролептической активности в тесте апоморфиновой вертикализации. Препарат сравнения галоперидол (0,5 мг/кг) оказывал в этом тесте выраженное нейролептическое действие, что выражалось в достоверном снижении показателей апоморфиновой вертикализации Результаты, полученные на модели апоморфинового клайминга, свидетельствуют об отсутствии нейролептической активности у ГИЖ-72. Таблица 4.1.3.1. Изучение нейролептической активности ГИЖ-72 на модели апоморфинового клайминга у мышей линии C57BL/6. Интенсивность вертикализации Вещество Доза Единицы Баллы активности Контроль, n=9 Апоморфин, n=9 Галоперидол + Апоморфин, n=9 ГИЖ-72 + Апоморфин, n=9 ГИЖ-72 + Апоморфин, n=9 - 3,0 ± 1,0 ## 5,9 ± 0,7 ## 5 мг/кг 86,0 ± 7,0 ** 32,9 ± 1,2 ** 3,0 ± 1,0 ## 8,1 ±0,7 *, ## 83,0 ± 7,0 ** 29,1 ± 0,5 ** 77,0 ± 8,0 ** 29,2 ± 0,5 ** 0,5 мг/кг + 5 мг/кг 20 мг/кг + 5 мг/кг 40 мг/кг + 5 мг/кг Данные представлены как M ± S.E.M., n – количество мышей в группе. * - p<0,05; ** р<0,01 в сравнении с контролем, ## - p<0,01 в сравнении с апоморфином. 87 4.1.4. Влияние изучаемых веществ на тревожные реакции в «чернобелой камере» Антидепрессанты демонстрируют разнонаправленные эффекты в тесте «черно-белая камера», причем эффекты варьируют даже внутри одного класса и находятся в зависимости от кратности введения, дозы и вида животных [Borsini et al., 2002]. Таблица 4.1.4.1. Влияние ГИЖ-72 и флувоксамина на тревожные реакции мышей линии BALB/C в тесте «черно-белая камера» Вещество Доза ЛП, с Время, проведенное на светлой стороне, с 45,1 ± 21,7 Число переходов между отсеками 5,5 ± 2,1 Стрейчи Контроль, N=10 - 15,6 ± 1,8 Флувоксамин, N=10 25 мг/кг 35,9 ± 7,4 ** 66,9 ± 27,3 7,6 ± 2,3 100% * ГИЖ-72, N=8 20 мг/кг 18,0 ± 3,6 100,8 ± 36,8 * 9,0 ± 2,5 50% 60% * - p<0,05; ** - p<0,01 в сравнении с контролем ГИЖ-72 в дозе 20 мг/кг увеличивал время пребывания на свету в 2,2 раза (р<0,05). Флувоксамин (25 мг/кг) увеличивал продолжительность латентного периода на светлой стороне в 2,3 раза (p<0,01) и количество регистрируемых стрейчей (p<0,05). Таким образом, установлено, что ГИЖ-72 в дозе 20 мг/кг обладает анксиолитическим эффектом в тесте «черно-белая камера» в отличие от флувоксамина (25 мг/кг), который демонстрировал усиление тревожных реакций. 88 4.2. Особенности анксиолитической активности изучаемых веществ в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса Непредсказуемый хронический умеренный стресс – экспериментальная парадигма, позволяющая моделировать взаимосвязь хронического стресса и аффективных расстройств. Известно, что в эксперименте непредсказуемый хронический умеренный стресс приводит к усилению депрессивных реакций, изменению исследовательской активности и тревожности у грызунов [Hill et al., 2012; Mineur et al., 2006]. Ранее было антидепрессантов непредсказуемого из показано, что группы СИОЗС хронического классический стресса – представитель флуоксетин демонстрирует в условиях инверсию антидепрессивного эффекта после субхронического введения (см. главу 1.3). Кроме того, по данным литературы известно, что флуоксетин, который в обычных условиях обладает анксиогенными свойствами в большинстве моделей тревоги у грызунов [Borsini et al., 2002], на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса может изменять вектор своего действия на анксиолитический [Farhan and Haleem, 2015]. При оценке анксиолитической активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в условиях физиологической нормы (при отсутствии стрессовых манипуляций) установлено, что ГИЖ-72 обладает анксиолитическими свойствами в тестах: «открытое поле», «черно-белая камера», «закапывание шариков» (marble burying test). ГМАЛ-24 напротив не обнаруживал какой-либо активности в перечисленных моделях, хотя на этапе скрининга у соединения была выявлена анксиолитическая активность [Середенин и др., 2013]. Учитывая вышеперечисленные факты, важным аспектом исследования психотропной активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 является оценка анксиолитических свойств этих соединений в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса на основных моделях тревоги для грызунов. 89 4.2.1. Влияние изучаемых веществ на ориентировочноисследовательскую реакцию Известно, что непредсказуемый хронический умеренный стресс может оказывать разнонаправленное действие на уровень тревоги у мышей: повышать тревожность, вызывать анксиолизис или сохранять активность на уровне интактных животных. Такие разнообразные результаты объясняются использованием различных наборов стрессовых факторов, продолжительностью стрессовой экспозиции, различных линий животных и их гендерными особенностями [Farhan and Haleem, 2015; Jung et al., 2014; Mineur et al., 2006; Wang et al., 2014; Zhu et al., 2014]. Классический анксиолитик бензодиазепинового ряда – диазепам уменьшает уровень тревожности в тесте «открытое поле», независимо от факта наличия/отсутствия непредсказуемого хронического умеренного стресса, вида животных и кратности введения [Nirmal et al., 2008; Wang et al., 2014]. Представитель антидепрессантов из класса СИОЗС – флуоксетин демонстрирует взаимоотношения с процедурой непредсказуемого хронического умеренного стресса совершенно иного рода. Так, обладающий анксиогенным эффектом в большинстве моделей тревоги у грызунов [Borsini et al., 2002], в т.ч. в тесте «открытое поле» (см. главу 4.1), флуоксетин на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса обнаруживает анксиолитический эффект [Farhan and Haleem, 2015; Wang et al., 2014]. Ввиду различной активности бензодиазепиновых анксиолитиков и СИОЗС, которые обычно используются в качестве референтных препаратов в моделях тревоги и депрессии, возникает несколько закономерных вопросов: 1) сохранится ли анксиолитическая активность ГИЖ-72 в условиях длительной стрессовой экспозиции? 2) возможно ли выявление анксиолитического эффекта ГМАЛ-24 при использовании процедуры непредсказуемого хронического умеренного стресса? 3) будет ли характерен 90 для ГИЖ-72 синдром отмены, отсутствующий в условиях физиологической нормы [Мелетова, 2007], на фоне длительного стресса? В соответствии с обозначенными проблемами был разработан адекватный дизайн исследования анксиолитической активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в условиях модели непредсказуемого хронического умеренного стресса (таблица 4.2.1.2). Анксиолитический эффект после однократного введения при отсутствии стресса был характерен только для ГИЖ-72, который в дозе 20 мг/кг селективно увеличивал активность в центральной части в 4,8 раза (р<0,05) по сравнению с контрольной группой. Увеличение горизонтальной активности в центре обуславливало рост индекса тревожности в 4,3 раза (p<0,01) в сравнении с контролем. Для ГМАЛ-24 была отмечена тенденция к увеличению центральной активности и индекса тревожности. Непредсказуемый хронический умеренный стресс продолжительностью 14 дней не изменял уровень тревожности животных по сравнению с интактной группой (таблица 4.2.1.3). Анксиолитическая активность после однократного введения в условиях 14-дневного стресса была отмечена только у флувоксамина в дозе 25 мг/кг, которая сопровождалась тенденцией к увеличению активностив центральной части установки и повышением индекса тревожности в 2,7 раза (p<0,05). ГИЖ-72 после субхронического введения в условиях стрессовой экспозиции демонстрировал подавление активности в центре и падение индекса тревожности до 0 (p<0,05), что может быть рассмотрено в качестве анксиогенного эффекта. Субхроническое введение ГМАЛ-24 (10 мг/кг) в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса приводило к повышению индекса тревожности в 2 раза (p<0,05), также была отмечена тенденция к усилению активности в центральной части установки. Уровень тревожности контрольной группы животных после 28дневного непредсказуемого хронического стресса не претерпевал достоверных изменений, однако была отмечена тенденция к увеличению 91 тигмотаксиса по сравнению с группой нестрессированных животных. Хроническое введение ГИЖ-72 в дозе 20 мг/кг в условиях хронического стресса приводило к селективному повышению индекса тревожности в 2,3 раза (p<0,05) с тенденцией к увеличению активности в центре. Флувоксамин, напротив, подавлял активность в центральной части установки, что опосредовало уменьшение индекса тревожности до 0 (p<0,05). Через 24 ч после отмены хронического введения ГИЖ-72 увеличивал периферическую активность в 1,7 раза (p<0,05), центральную – в 4,4 раза (p<0,05), при этом было отмечено повышение индекса тревожности в 2,9 раза (p<0,05), что убедительно говорит не только об отсутствии у ГИЖ-72 синдрома отмены, но и сохранении анксиолитического эффекта через 24 ч после отмены хронического инъекционного курса (таблица 4.2.1.1). Таблица 4.2.1.1. Анксиолитическая активность ГИЖ-72 после отмены хронического введения в условиях НХУС. Горизонтальная активность Вещество ИТ ОО ВА КОИР П Ц Контроль, 17,0 ± 2,0 0,7 ± 0,4 3,4% 4,4 ± 0,7 1,0 ± 0,4 23,0 ± 2,2 N=10 ГИЖ-72 28,2 ± 2,0 3,1 ± 1,2 9,8% 20 мг/кг, 6,2 ± 0,8 2,2 ± 0,7 40,2 ± 3,1 * * * N=10 Примечание: П – периферическая, Ц – центральная, ИТ – индекс тревожности, ОО – обследований отверстий, ВА – вертикальная активность, данные представлены как M ± S.E.M., N – количество мышей в группе, * p<0,05 в сравнении с контрольной группой 92 Таблица 4.2.1.2. Схема эксперимента по изучению влияния НХУС на эффекты ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в тесте «открытое поле» у мышей линии BALB/C Режим введения Непредсказуемый хронический умеренный стресс Без стресса Однократное Субхроническое Хроническое Группа Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 Группа 6 Группа 7 Группа 8 Группа 9 Группа 10 Группа 11 Группа 12 Группа 13 Группа 14 Предварительное введение Вещество Доза Длительность - Физ р-р 13 дней Введение в день теста Вещество Доза Физ р-р ГИЖ-72 20 мг/кг ГМАЛ-24 10 мг/кг Флувоксамин 25 мг/кг Физ р-р ГИЖ-72 20 мг/кг ГМАЛ-24 10 мг/кг ГИЖ-72 20 мг/кг ГМАЛ-24 10 мг/кг Флувоксамин 25 мг/кг ГИЖ-72 20 мг/кг ГМАЛ-24 10 мг/кг Флувоксамин 25 мг/кг Общая продолжительность 14 дней Физ р-р Физ р-р ГИЖ-72 20 мг/кг ГИЖ-72 20 мг/кг Флувоксамин 25 мг/кг 27 дней Флувоксамин 25 мг/кг Физ р-р отмена препарата ГИЖ-72 20 мг/кг Общая продолжительность 28 дней 93 Таблица 4.2.1.3. Влияние НХУС на эффекты ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в тесте «открытое поле» у мышей линии BALB/C Вещество Доза Горизонтальная активность Периферическая Центральная Индекс Обследований тревожности отверстий Вертикальная активность КОИР Хроническое введение Субхроническое введение Однократное введение Контроль, 23,5 ± 7,8 1,0 ± 0,5 4,1% 3,1 ± 1,3 2,9 ± 0,5 30,5 ± 9,5 N=10 Флувоксамин, 25 25,2 ± 6,0 0,9 ± 0,4 3,4% 1,1 ± 0,4 2,9 ± 0,4 30,1 ± 6,6 N=10 мг/кг ГИЖ-72, 20 22,6±2,8 4,8±1,7 * 17,5% ** 2,0±0,8 6,4±0,7 35,8±4,6 N=10 мг/кг ГМАЛ-24, 10 21,6 ± 4,3 2,5 ± 0,7 9,8% 4,9 ± 0,9 3,1 ± 0,7 34,8 ± 3,1 N=9 мг/кг Контроль, 26,4 ± 3,1 1,3 ± 0,4 4,6% 3,3 ± 0,5 2,9 ± 0,6 33,9 ± 3,9 N=18 ГИЖ-72, N=9 20 30,4 ± 5,0 2,4 ± 0,9 7,7% 4,4 ± 0,5 3,1 ± 1,0 40,3 ± 6,0 однократно мг/кг ГИЖ-72, N=10 20 29,2 ± 5,3 0* 0%* 4,1 ± 0,6 1,9 ± 0,7 35,2 ± 6,0 субхрон мг/кг ГМАЛ-24, N=9 10 16,1 ± 4,1 1,3 ± 0,7 9,0% 3,4 ± 0,7 3,5 ± 0,9 24,3 ± 4,8 однократно мг/кг ГМАЛ-24, N=9 10 30,8 ± 4,3 3,2 ± 1,3 9,4% * 4,6 ± 0,4 3,4 ± 1,5 43,1 ± 6,1 субхрон мг/кг Флувоксамин, 25 18,5 ± 5,2 2,6 ± 1,3 12,3% * 3,4 ± 0,5 2,5 ± 0,9 27,0 ± 6,8 N=10 мг/кг Контроль, 31,5 ± 3,9 1,4 ± 0,3 4,3% 3,4 ± 0,3 2,5 ± 0,4 38,4 ± 4,9 N=13 ГИЖ-72, N=10 20 27,1 ± 2,0 2,8 ± 1,2 10,0%* 5,2 ± 0,8 2,4 ± 0,7 39,5 ± 3,1 хронич мг/кг Флувоксамин, 25 30,1 ± 3,9 0 0% * 2,4 ± 0,4 0,4 ± 0,2 33,2 ± 4,2 N=10 хронич мг/кг Данные представлены как M ± S.E.M., N – количество мышей в группе, * - р<0,05; ** - p<0,01 – в сравнении с контролем внутри одной стресс-группы; 94 4.2.2. Влияние изучаемых веществ на компульсивное поведение мышей Стрессовые события играют важную роль в течении обсессивнокомпульсивных расстройств, хотя сам стресс не является основой патогенеза этого заболевания. Различные стрессовые ситуации, возникающие в повседневной жизни, могут выступать в качестве триггерных механизмов при обострении симптоматики обсессивно-компульсивного расстройства [Boileau, 2011; Rosso et al., 2012]. Непредсказуемый хронический умеренный стресс – взаимосвязь экспериментальная стресса и парадигма, аффективных позволяющая расстройств. моделировать Известно, что в эксперименте непредсказуемый хронический умеренный стресс приводит к усилению депрессивных реакций, изменению исследовательской активности и тревожности у грызунов [Hill et al., 2012]. Изучение антикомпульсивной активности ГИЖ-72, ГМАЛ-24 и флувоксамина в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса представляется актуальным, поскольку введение стрессового фактора позволяет сделать модель более приближенной к условиям реальной фармакотерапии обсессивно-компульсивного расстройства. Животные интактной контрольной группы закапывали 59,7% шариков, после 14-дневного НХУС этот показатель повышался до 73% (p<0,05), а после 28 дней НХУС был равен 60% (таблица 4.2.2.1). ГИЖ-72 (20 мг/кг) после однократного введения уменьшал количество зарытых шариков на 21,0% (р<0,05) в сравнении с контролем у мышей линий BALB/C (таблица 10), а флувоксамин (25 мг/кг) – на 40,4% (p<0,05). Субхроническое введение ГИЖ-72 (20 мг/кг) в условиях НХУС приводило к усилению эффекта – снижения числа зарытых шариков на 65% (р<0,05), ГМАЛ-24 после субхронического введения уменьшал этот показатель на 32% (p<0,05), в то время, как флувоксамин (25 мг/кг) увеличивал их количество на 18% (р<0,05). ГИЖ-72 (20 мг/кг) после хронического введения уменьшал 95 количество зарытых шариков на 40,5% (р<0,05), в то время как флувоксамин (25 мг/кг) увеличивал на 37% (р<0,05). Таблица 4.2.2.1. Антикомпульсивная активность ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в условиях НХУС у мышей линии BALB/C Вещество Доза Режим введения Наличие Количество НХУС зарытых шариков, % Контроль - ГИЖ-72 20 мг/кг Однократное ГМАЛ-24 10 мг/кг введение Флувоксамин 25 мг/кг Контроль ГИЖ-72 ГИЖ-72 ГМАЛ-24 ГМАЛ-24 Флувоксамин Контроль ГИЖ-72 ГИЖ-72 Флувоксамин Контроль ГИЖ-72 20 мг/кг 10 мг/кг 59,7 нет 43,0 * 59,0 23,6 * Субхроническое 73,0 # Однократное 14 дней 43,5 * Субхроническое (одновременно 8,0 *; # Однократное с введением 75,0 Субхроническое веществ) 41,0 *; # 25 мг/кг Субхроническое - Хроническое 28 дней 60,0 Однократное (одновременно 7,0 *; # Хроническое с введением 19,5 *; # Хроническое веществ) 97,0 *; # 28 дней 70,0 20 мг/кг 25 мг/кг 20 мг/кг 24 ч отмена хронического 91,0 *; # (одновременно введения с введением 21,0 ^; # веществ) * - p<0,05 в сравнении с контролем внутри одной стресс-группы; # - p<0,05 в сравнении с однократным введением того же вещества при отсутствии стресса; ^ - p<0,05 в сравнении с контролем после 24 ч отмены хронического введения 96 Таким образом, ГИЖ-72 обладает анксиолитическим эффектом в тесте закапывания шариков, который усиливается при субхроническом и хроническом введении в условиях НХУС в отличие от флувоксамина, для которого была отмечена инверсия эффекта. Кроме того, после отмены хронического введения ГИЖ-72 сохраняет анксиолитический эффект. ГМАЛ-24 обнаруживает анксиолитический эффект в тесте только при субхроническом введении в условиях НХУС. Полученные данные могут свидетельствовать о возможной эффективности ГИЖ-72 в фармакотерапии обсессивно-компульсивного расстройства. 4.2.3. Влияние изучаемых веществ на тревожные реакции мышей в «черно-белой камере» В рамках задачи по изучению анксиолитических эффектов ГИЖ-72 в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса актуальным остается вопрос активности соединения и референтного препарата флувоксамина в тесте «черно-белая камера». При оценке анксиолитической активности ГИЖ-72 и флувоксамина после однократного введения в чернобелой камере при отсутствии стресса было показано, что ГИЖ-72 обладает анксиолитической активностью в отличие от флувоксамина, для которого было характерно усиление тревожных реакций (см. главу 4.1.4). Учитывая сложные взаимодействия препаратов из группы СИОЗС со стрессом, которые в отдельных случаях заканчивались инверсией эффекта (см. главу 4.3 и главу 4.2.1) [Farhan and Haleem, 2015; Wang et al., 2014], важным моментом остается проблема сохранения, потери или инверсии эффекта изучаемого вещества в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса. Для изучения анксиолитических свойств ГИЖ-72 и флувоксамина в тесте «черно-белая камера» после субхронического введения в условиях непредсказуемого хронического стресса животные были разделены на 4 97 экспериментальные группы: 1) контрольная группа, которая содержалась в условиях с отсутствием стрессовых воздействий; 2) контрольная группа, подверженная 14-дневному непредсказуемому хроническому стрессу; 3) животные, получавшие флувоксамин (25 мг/кг) в течение 14 дней в сочетании с процедурой непредсказуемого хронического умеренного стресса; 4) животные, получавшие ГИЖ-72 (20 мг/кг) в течение 14 дней в сочетании с процедурой непредсказуемого хронического умеренного стресса. Контрольная экспозиции группа демонстрировала животных усиление после 14-дневной тревожных стрессовой реакций, которое заключалось в увеличении латентного времени на светлой стороне в 2,9 раза (p<0,05) и сокращении пребывания животных на свету в 2,8 раза (р<0,05) по сравнению с интактным контролем (таблица 4.2.3.1), такая активность соответствует хроническому введению кортикостерона [Ardayfio and Kim, 2006] и является следствием стрессовой экспозиции. ГИЖ-72 после субхронического введения в дозе 20 мг/кг ослаблял тревожные реакции. На фоне ГИЖ-72 регистрировали увеличение времени, проведенного животными на светлой стороне установки, в 4,5 раза (p<0,01), числа переходов между отсеками в 2,5 раза (p<0,05) и редукцию стрейчей в момент посадки (p<0,05). Кроме того, была отмечена тенденция к уменьшению продолжительности латентного периода. Субхроническое введение флувоксамина в дозе 25 мг/кг сопровождалось снижением латентного периода в 2,5 раза (p<0,05), сокращением стрейчей в 2 раза (p<0,05) и тенденцией к увеличению продолжительности времени, проведенному в светлом отсеке. Поведенческие изменения, происходящие под действием флувоксамина, также говорят о наличии анксиолитической активности у последнего в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса, что согласуется с данными литературы о нивелировании последствий непредсказуемого хронического умеренного стресса некоторыми представителями группы 98 СИОЗС на моделях тревоги у грызунов [Farhan and Haleem, 2015; Wang et al., 2014]. Полученные данные свидетельствуют, что ГИЖ-72 в дозе 20 мг/кг сохраняет анксиолитическую активность в тесте «черно-белая камера» после субхронического введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса, а флувоксамин в аналогичных условиях изменяет вектор своего эффекта на анксиолитический. Таблица 4.2.3.1. Влияние ГИЖ-72 и флувоксамина на тревожные реакции мышей BALB/C в тесте «черно-белая камера» после субхронического введения в условиях НХУС Вещество Доза ЛП, с Время, проведенное на светлой стороне, с 45,1 ± 21,7 Контроль при 15,6 ± 1,8 отсутствии стресса, N=10 Контроль, 44,9 ± 9,3 16,1 ± 5,2 # N=17 # Флувоксамин, N=10 25 18,0 ± 3,2 24,5 ± 5,9 субхроническое мг/кг * введение ГИЖ-72, N=10 20 34,5 ± 5,7 72,6 ± 8,0 ** субхроническое мг/кг введение * - p<0,05; ** - p<0,01 в сравнении с контролем; Число переходов между отсеками 5,5 ± 2,1 Стрейчи 3,3 ± 0,8 100% 3,1 ± 1,1 30% *; # 8,1 ± 1,0 * 0% *; # # - p<0,05 в сравнении с контролем при отсутствии стресса 60% 99 4.2.4. Особенности анксиолитической активности ГИЖ-72 в тесте «гипофагия» после хронического перорального введения Грызуны, помещенные в незнакомую обстановку и столкнувшиеся в этих условиях с едой, будут потреблять пищу в значительно ограниченных количествах после длительного обследования окружающего пространства. Такое поведение принято называть гипофагией, обусловленной изменением внешних условий, причем выявляется задержка как при потреблении так называемой привлекательной пищи (приманки), так и привычной еды после пищевой депривации. Многие анксиолитики и антидепрессанты известны своей способностью снижать временную задержку и увеличивать количество потребляемой пищи в новых условиях. Ввиду этого, модель гипофагии используют для оценки уровня тревожности у грызунов [Buccafusco, 2009]. ГИЖ-72 продемонстрировал наличие анксиолитической активности в тестах «открытое поле», «черно-белая камера», «закапывание шариков» на мышах линий BALB/C и C57BL/6 как в условиях физиологической нормы, так и после длительной стрессовой экспозиции. Подобный спектр активности дает основания для изучения анксиолитических свойств ГИЖ-72 в еще одном тесте для оценки тревожности – гипонеофагии. В ходе проведения исследований животные были разделены на 3 группы: 1) контрольная группа; 2) группа мышей, которая получала перорально раствор ГИЖ-72 в дозе 30 мг/кг; 3) группа мышей, получавшая перорально 0,01% раствор ДМСО, который использовался для сорастворения субстанции ГИЖ-72 в воде. Животные всех 3 групп были подвержены процедуре непредсказуемого хронического умеренного стресса продолжительностью 28 дней, которую начинали одновременно с курсом хронического введения изучаемых веществ. 100 Задержка начала потребления пищи (латентный период) для животных контрольной группы составляла 120 с (Рис. 4.2.4.1). Хроническое введение ГИЖ-72 в дозе 30 мг/кг приводило к сокращению латентного время потребления пищи до 85,8 с (p<0,05), что можно расценивать как наличие анксиолитической активности в данном тесте. Таким образом, установлено, что ГИЖ-72 в дозе 30 мг/кг после хронического введения в условиях непредсказуемого умеренного хронического стресса обладает анксиолитической активностью в тесте «гипофагия» у мышей. Рисунок 4.2.4.1. Влияние хронического перорального введения ГИЖ72 в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса на задержку начала потребления пищи в тесте «гипофагия» у мышей. 140 Латентный период, с 120 * 100 80 60 40 20 0 Контроль ДМСО 0,01% ДМСО 0,01% + ГИЖ-72 30 мг/кг Примечание: * - p<0,05 в сравнении с контрольной группой 101 ГЛАВА 5. НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ И ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ АНТИДЕПРЕССАНТОВ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА В настоящее время формируется представление о том, что именно непредсказуемые ежедневные стрессовые ситуации в течение длительного периода времени являются этиологическим фактором многих нейродегенеративных заболеваний и психических патологий, в том числе и депрессий [Gronli, 2006; Hill et al., 2012]. С целью моделирования взаимосвязи между стрессом и депрессией, в условиях эксперимента на животных, наиболее часто применяют различные модификации непредсказуемого умеренного хронического стресса (unpredictable сhronic mild stress, НХУС) [Gronli, 2006; Hill et al., 2012; Willner, 2005]. Известно также, что НУХС сопровождается нарушениями процесса нейрогенеза в гиппокампе зрелого мозга [de Andrade et al., 2013], что позволяет характеризовать эту модель весьма актуальной, так как современные представления о патогенезе аффективных расстройств рассматривают депрессию как нейродегенеративное заболевание [Zhou et al., 2004; Sahay and Hen, 2007]. В то же время установлено, что большинство известных антидепрессантов обладает способностью стимулировать гиппокампальный нейрогенез во взрослом мозге [Malberg et al., 2000; Wang et al., 2008; Mendez-David et al., 2013], что является основанием для гипотезы, рассматривающей нейрогенез зрелой ЦНС в качестве нейробиологического субстрата антидепрессивной активности фармакологических веществ, в том числе и при их длительном применении. На сегодняшний день нет полной ясности в вопросе, что же является пусковым стимулом для реализации нейропротективных эффектов антидепрессантов: специфическое и/или неспецифическое воздействие на моноаминергическую систему мозга, взаимодействие с гипатоламо-гипофизарно надпочечниковой осью (ГГНО) [Weber et al., 2006; Heinzmann et al., 2011], изменения в системе эндогенных 102 нейростероидов [Griffin and Mellon, 1999; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006] геномные эффекты некоторых антидепрессантов [Watanabe et al., 2010] или совокупность этих факторов? Изучение влияния острого и хронического введения антидепрессантов в условиях НУХС на эффекты антидепрессантов и нейрохимические изменения в различных структурах головного мозга грызунов представляется актуальной задачей, поскольку могут возникать значительные отличия от результатов, полученных на интактных животных. Кроме того, клиническое применение этой группы психотропных препаратов подразумевает наступление терапевтического эффекта при длительном применении в условиях психической патологии (Таблица 5.1). Таблица 5.1. Схема исследования по изучению влияния НХУС на эффекты антидепрессантов и уровень моноаминов и их метаболитов в головном мозге мышей. Группы НХУС № группы Предварительное Введение веществ в день введение (27 дней) теста (28-й день) Вещество Доза Вещество Доза - Группа 1 Физ. р-р - Физ. р-р - + Группа 2 Физ. р-р - Физ. р-р - + Группа 3 Физ. р-р - Амитриптилин 10 мг/кг + Группа 4 Физ. р-р - Флуоксетин 20 мг/кг + Группа 5 Амитриптилин 10 мг/кг Амитриптилин 10 мг/кг + Группа 6 Флуоксетин 20 мг/кг Флуоксетин 20 мг/кг 5.1. Влияние непредсказуемого умеренного хронического стресса на эффекты антидепрессантов в тесте вынужденного плавания Группа животных, подверженных процедуре НХУС, демонстрировала усиление депрессивно-подобных реакций: редукция клайминга, уменьшение 103 времени плавания в 3,5 раза и увеличение иммобилизации в 1,5 раза (p<0,05) в сравнении с контролем (Рис 5.1.1). Острое и хроническое введение амитриптилина сопровождалось появлением клайминга, увеличением фазы плавания в 4,8 раз, уменьшением времени иммобилизации в 2,8 и 4,7 раза соответственно (p<0,05). В случае хронического введения амитриптилина была отмечена тенденция к усилению антидепрессивного эффекта препарата по сравнению с острым введением – увеличение клайминга и сокращению времени иммобилизации. Флуоксетин после острого и хронического введения обнаруживал антидепрессивный эффект, сопровождающийся увеличением плавания в 4,1. и 3,4 раза (p<0,05) с одновременным сокращением времени соответственно. При иммобилизации сравнении в острых 1,7 и и 1,4 раза хронических (p<0,05) эффектов флуоксетина в тесте вынужденного плавания наблюдалась тенденция к «угасанию» антидепрессивного эффекта флуоксетина при длительном применении. Рисунок 5.1.1. Влияние НХУС на активность амитриптилина (10 мг/кг) и флуоксетина (20 мг/кг) в тесте вынужденного плавания. 300 28 дней НХУС Без НХУС # 250 * Время, с 200 * * * * 150 # * 100 # 50 # * * # * # * # 0 Контроль Контроль АМТ (однокр) ФЛК (однокр) АМТ (хр) ФЛК (хр) 104 * - p<0,05 в сравнении с контролем в условиях НХУС, # - p<0,05 в сравнении с контролем при отсутствии стресса; АМТ – амитриптилин, ФЛК – флуоксетин, однокр – однократное введение, хр – хроническое введение, НХУС – непредсказуемый хронический умеренный стресс 5.2. Нейрохимические изменения Непредсказуемый хронический умеренный стресс. У мышей при воздействии стресса содержание 5-HТ в гиппокампе снижалось в 1,5 раза (p<0,05), 5-ОИУК в 4,2 раза (p<0,01), в 3 раза уменьшался оборот 5-HТ (соотношение 5-ОИУК/5-HT) по сравнению с контрольной группой, в которой отсутствовал НХУС (таблица 5.2.1 и 5.2.2). Во фронтальной коре, стриатуме и гипоталамусе был отмечен обратный эффект – повышение содержания 5-HТ в 3 раза (p<0,01), при этом в стриатуме оборот 5-HТ был снижен в 1,7 раза (p<0,05). Во всех структурах кроме гиппокампа в 1,4-2,0 раза был повышен ДА (p<0,01). Содержание ДОФУК в стриатуме увеличивалось в 1,5 раза (p<0,05) и в 1,3 раза уменьшалось в гиппокампе (p<0,05). Соотношение ДОФУК/ДА во фронтальной коре и гиппокампе уменьшалось в 1,5 раза (p<0,05), а в гипоталамусе увеличивалось в 4,4 раза (p<0.01). Повышение уровня ГВК в 1,4 (p<0,05) и уменьшение соотношения ГВК/ДА в 1,2 раза (p<0,05) было отмечено в гипоталамусе. В гипоталамусе и гиппокампе фиксировалось повышение НА в 1,3 (p<0,01) и 1,7 (p<0,05) раза соответственно. Таким образом, гиппокамп выделялся среди остальных изученных структур нейротрансмиссии, абсолютным которое уменьшением сопровождалось серотонинергической депрессивно-подобным поведением животных в тесте вынужденного плавания. Однократное введение амитриптилина. Повышение уровня 5-HТ наблюдалось в гипоталамусе в 1,2 раза (р<0,01), во фронтальной коре и гиппокампе отмечалась тенденция к повышению 5-НТ по сравнению с контрольной группой, которая также была подвержена стрессовой экспозиции. Снижение метаболита 5-HТ – 5-ОИУК в 1,2 раза (р<0,05) было 105 обнаружено в стриатуме и гипоталамусе и, как тенденция во фронтальной коре. Во всех исследованных структурах оборот 5-HТ снижался в 1,2-1,4 раза (р<0,01, p<0,05). ДА был повышен в стриатуме и гипоталамусе в 1,2 (p<0,01) и 1,3 (p<0,05) раза соответственно, в этих же структурах происходило повышение и ДОФУК в 1,5 раза (р<0,01). В гипоталамусе также были повышены соотношение ДОФУК/ДА в 1,2 раза (p<0,05) и уровень ГВК в 1,5 (p<0,01). Амитриптилин вызывал повышение содержания 5-НТ в гиппокампе, которое по направленности было противоположно изменениям, вызванным НХУС, и сопровождалось уменьшением депрессивного поведения мышей в тесте вынужденного плавания. Хроническое введение амитриптилина. Содержание 5-HТ было повышено только в гипоталамусе в 1,2 раза (p<0,05) в сравнении с контрольной группой, содержащейся в условиях НХУС. Уровень 5-ОИУК был снижен в стриатуме в 1,2 раза (p<0,05) и в гиппокампе в 1,3 (p<0,05). Оборот 5-HТ снижался во всех структурах, кроме фронтальной коры, в 1,21,5 раза (p<0,05). Увеличение уровня ДА в 1,3 (p<0,01) отмечалось в гипоталамусе. Кроме того, в гипоталамусе было зафиксировано увеличение НА в 1,4 раз (p<0,01), которое отсутствовало на фоне острого введения препарата. Как и при однократном введении, амитриптилин уменьшал содержание 5-ОИУК в гиппокампе, однако повышал уровень НА в гипоталамусе, что может являться особенностью механизма действия этого антидепрессанта в условиях длительной стрессовой экспозиции. Однократное введение флуоксетина. Уровень 5-HТ был повышен только в гипоталамусе в 1,1 раза (p<0.05). Во всех структурах было понижено содержание 5-ОИУК, и был уменьшен оборот 5-НТ в 1,5-1,8 раз (p<0.01, p<0,05). Кроме того, отмечалось снижение ДА в стриатуме в 1,2 раза (p<0,05), снижение 3-МТ в гипоталамусе в 1,8 (p<0,05), увеличение в 1,6 раз уровня НА в стриатуме (p<0,05) и его уменьшение в гиппокампе в 1,3 (p<0,05) по сравнению с контрольной группой, подвергавшейся воздействию НХУС. 106 Хроническое введение флуоксетина. Уменьшение 5-HТ в 1,2 раза (p<0,05) было обнаружено в гипоталамусе и стриатуме по сравнению с контрольной группой, находившейся в условиях НХУС. Уровень 5-ОИУК во всех структурах, кроме фронтальной коры, уменьшался в 1,3-1,5 раз (p<0,01, p<0,05), а оборот 5-HТ – во всех, кроме стриатума, в 1,3 раза (p<0,01, p<0,05). В стриатуме и гипоталамусе наблюдалось увеличение ДА в 1,1 и 1,2 раз соответственно (p<0,05), в гиппокампе наоборот фиксировали его уменьшение в 1,9 раз (p<0,05). Уровень ДОФУК в 2,7 раз повышался во фронтальной коре (p<0,05), соотношение ДОФУК/ДА увеличивалось во фронтальной коре в 2,5 раза (p<0,01) и в гиппокампе в 1,6 раз (p<0,05). Как и в случае хронического введения амитриптилина, было отмечено повышение НА в гипоталамусе в 1,4 раза (p<0,01), а также во фронтальной коре в 1,5 (p<0,01). Амитриптилин и флуоксетин сохраняли антидепрессивную активность при хроническом введении в условиях НХУС, причем амитриптилин демонстрировал тенденцию к усилению антидепрессивного эффекта при хроническом введении, а флуоксетин напротив – к ослаблению. Антииммобилизационный эффект изучаемых антидепрессантов совпадал с уменьшением метаболизма 5-HТ в гиппокампе и, по-видимому, связан с усилением серотонинергической нейротрансмиссии. Хроническое введение амитриптилина и флуоксетина в условиях НХУС сопровождалось увеличением содержания НА в гипоталамусе и по направленности действия соответствовало с НХУС. Возможно, что механизмы действия амитриптилина и флуоксетина при длительном введении в условиях НХУС связаны с преодолением толерантности к воздействию стрессового фактора и активацией естественных защитно-адаптивных механизмов организма. 107 Таблица 5.2.1. Влияние хронического введения антидепрессантов (в условиях непредсказуемого умеренного хронического стресса) на уровни моноаминов и их метаболитов во фронтальной коре и стриатуме (нмоль/1г ткани). Контроль Контроль + НХУС НА 5-HТ 5-ОИУК 5-ОИУК /5-HT ДА ДОФУК ДОФУК/ДА 1.01 ± 0.09 3.62 ± 0.11 1.49 ± 0.15 0.42 ± 0.05 0.47 ± 0.07 0.31 ± 0.02 0.71 ± 0.10 1.27 ± 0.12 11.43 ± 0.59 ## 1.55 ± 0.17 0.53 ± 0.05 0.90 ± 0.08 ## 0.39 ± 0.07 0.48 ± 0.07 # НА 5-HТ 5-ОИУК 5-ОИУК /5-HT ДА ДОФУК ДОФУК/ДА ГВК ГВК/ДА 3-MT 0.41 ± 0.03 2.93 ± 0.06 2.61 ± 0.22 0.89 ± 0.09 43.84 ± 1.95 2.51 ± 0.21 0.06 ± 0.00 4.68 ± 0.31 0.11 ± 0.01 0.53 ± 0.03 0.33 ± 0.05 11.05 ± 0.62 ## 3.14 ± 0.18 0.51 ± 0.04 ## 62.47 ± 3.27 ## 3.85 ± 0.42 # 0.06 ± 0.00 5.02 ± 0.41 0.10 ± 0.01 0.61 ± 0.08 Амитриптилин Амитриптилин (однократно) + (хронически) + НХУС НХУС Фронтальная кора 1.08 ± 0.09 1.51 ± 0.20 12.56 ± 0.40 10.97 ± 1.19 1.22 ± 0.05 1.30 ± 0.13 0.38 ± 0.02 * 0.50 ± 0.08 1.08 ± 0.10 0.97 ± 0.18 0.35 ± 0.03 0.41 ± 0.05 0.41 ± 0.06 0.60 ± 0.13 Стриатум 0.44 ± 0.06 0.43 ± 0.14 11.00 ± 0.74 9.87 ± 0.66 2.68 ± 0.18 * 2.56 ± 0.20 * 0.44 ± 0.02 * 0.46 ± 0.02 76.44 ± 3.09 ** 61.34 ± 5.15 5.64 ± 0.38 ** 4.07 ± 0.37 0.07 ± 0.00 * 0.06 ± 0.00 7.32 ± 0.39 ** 4.71 ± 0.32 0.12 ± 0.01 0.09 ± 0.01 0.71 ± 0.12 0.76 ± 0.12 Флуоксетин (однокртано) + НХУС Флуоксетин (хронически) + НХУС 1.22 ± 0.12 11.43 ± 1.15 0.95 ± 0.11 * 0.33 ± 0.02 ** 1.11 ± 0.11 0.38 ± 0.04 0.41 ± 0.06 1.87 ± 0.16 ** 14.8 ± 1.87 1.38 ± 0.28 0.41 ±0.01 * 0.97 ± 0.14 1.05 ± 0.28 * 1.22 ± 0.21 ** 0.52 ± 0.07 * 9.91 ± 1.04 1.78 ± 0.18 ** 0.33 ± 0.02 ** 54.13 ± 0.08 * 3.60 ± 0.47 0.06 ± 0.01 4.87 ± 0.30 0.11 ± 0.01 0.58 ± 0.07 0.31 ± 0.03 9.21 ± 0.25 * 2.41 ± 0.12 ** 0.47 ± 0.02 69.45 ± 1.68 * 4.46 ± 0.25 0.06 ± 0.00 5.42 ± 0.46 0.09 ± 0.01 0.70 ± 0.09 Данные представлены как M ± S.E.M.; # - P<0.05, ## - P<0.01 – в сравнении с контролем, * - P<0.05, ** - P<0.01 – в сравнении с контролем + стресс 108 Таблица 5.2.2. Влияние хронического введения антидепрессантов (в условиях непредсказуемого умеренного хронического стресса) на уровни моноаминов и их метаболитов в гипоталамусе и гиппокампе (нмоль/1г ткани). Контроль Контроль + НХУС НА 5-HТ 5-ОИУК 5-ОИУК /5-ОT ДА ДОФУК ДОФУК/ДА ГВК ГВК/ДА 3-MT 3.59 ± 0.13 4.12 ± 0.23 2.96 ± 0.21 0.72 ± 0.03 1.57 ± 0.17 0.28 ± 0.06 0.18 ± 0.02 0.72 ± 0.08 0.46 ± 0.03 0.10 ± 0.03 4.80 ± 0.24 ## 12.04 ± 0.48 ## 2.76 ± 0.14 0.65 ± 0.03 2.81 ± 0.14 ## 0.45 ± 0.07 0.79 ± 0.10 ## 1.03 ± 0.08 # 0.38 ± 0.03 # 0.21 ± 0.03 # НА 5-HТ 5-ОИУК 5-ОИУК /5-ОT ДА ДОФУК ДОФУК/ДА 0.87 ± 0.07 2.99 ± 0.33 3.09 ± 0.16 1.09 ± 0.11 0.44 ± 0.15 0.30 ± 0.05 0.91 ± 0.18 1.52 ± 0.14 # 2.05 ± 0.20 # 0.73 ± 0.07 ## 0.35 ± 0.04 ## 0.58 ± 0.12 0.23 ± 0.07 # 0.61 ± 0.08 # Амитриптилин (однократно) + НХУС Гипоталамус 5.06 ± 0.14 13.89 ± 0.40 ** 2.30 ± 0.08 * 0.47 ± 0.01 ** 3.56 ± 0.23 * 0.69 ± 0.07 * 1.02 ± 0.19 1.17 ± 0.11 0.35 ± 0.03 0.20 ± 0.03 Гиппокамп 1.49 ± 0.08 2.48 ± 0.17 0.63 ± 0.04 0.25 ± 0.01 ** 0.44 ± 0.06 0.19 ± 0.02 0.81 ± 0.21 Амитриптилин (хронически) + НХУС Флуоксетин (однократно) + НХУС Флуоксетин (хронически) + с НХУС 6.66 ± 0.27 ** 14.33 ± 0.71 * 2.69 ± 0.20 0.53 ± 0.03 * 3.53 ± 0.18 ** 0.55 ± 0.04 0.80 ± 0.02 1.30 ± 0.14 0.39 ± 0.04 0.15 ± 0.02 4.67 ± 0.33 13.15 ± 1.18 * 1.72 ± 0.15 ** 0.38 ± 0.01 ** 3.20 ± 0.43 0.56 ± 0.05 0.94 ± 0.07 1.07 ± 0.08 0.37 ± 0.03 0.12 ± 0.02 * 6.73 ± 0.30 ** 10.32 ± 0.44 * 1.82 ± 0.12 ** 0.50 ± 0.03 ** 3.34 ± 0.26 * 0.70 ± 0.11 1.08 ± 0.14 1.04 ± 0.07 0.34 ± 0.04 0.19 ± 0.02 1.35 ± 0.16 2.36 ± 0.19 0.57 ± 0.06 * 0.24 ±0.03 * 0.48 ± 0.12 0.20 ± 0.06 1.09 ± 0.39 1.20 ± 0.10 * 2.10 ± 0.19 0.44 ± 0.04 ** 0.20 ± 0.02 ** 0.37 ± 0.04 0.22 ± 0.05 0.86 ± 0.12 1.71 ± 0.20 1.75 ± 0.10 0.49 ± 0.03 * 0.28 ± 0.02 * 0.31 ± 0.05 * 0.17 ± 0.02 0.98 ± 0.18 * Данные представлены как M ± S.E.M.; # - P<0.05, ## - P<0.01 – в сравнении с контролем, * - P<0.05, ** - P<0.01 – в сравнении с контролем + стресс ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СИСТЕМЫ ЭНДОГЕННЫХ НЕЙРОСТЕРОИДОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ПСИХОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ ГИЖ-72 И ПРЕПАРАТОВ СРАВНЕНИЯ Система эндогенных нейростероидов занимает одно из центральных мест в патогенезе аффективных расстройств [Bäckström et al., 2014; Bali and Jaggi, 2014; Frye et al., 2006]. Инициацией процесса центрального биосинтеза эндогенных нейройстероидов является активация митохондриального транслокационного белка 18 кДа. В результате нейростероидогенеза в ЦНС образуется 3α,5α-тетрагидропрогестерон (аллопрегнанолон) – позитивный модулятор ГАМКА-рецептора [Reddy, 2010], дигидроэпиандростерон и прегненолона сульфат (Рис 6.1). Прегненолона сульфат и дигидроэпиандростерон являются антагонистами ГАМКА-рецептора, а также могут приводить к активации глутаматных NMDA-рецепторов [MacKenzie and Maguire, 2013]. В ряде клинических исследований было показано, что зачастую расстройства эмоциональной сферы сопровождаются снижением уровня аллопрегнанолона в крови и ликворе больных [Hellgren et al., 2014; Schüle et al., 2014]. Известно, что фармакологические агенты, способные нарушать нейростероидогенез провоцировать развитие на различных тревожно-депрессивных его стадиях, расстройств могут [Rahimi- Ardabili et al., 2006; Schwartz and Moura, 1983]. В частности, к таким препаратам относятся антиандрогенное средство финастерид, применяемый при доброкачественной гиперплазии предстательной железы, и индометацин – нестероидное противовоспалительное средство из группы производных индолуксусной кислоты, которое находит широкое применение в акушерской и гинекологической практике. В основе механизма действия финастерида лежит его способность ингибировать фермент 5α-редуктазу, ответственный за превращение тестостерона в более активный 5α-дегидротестостерон, а также катализирующий целый ряд других биохимических реакций, в числе которых превращение прогестерона в 5α-дегидропрогестерон (Рис 6.1) 110 [Belelli and Lambert, 2005; Finn et al., 2006]. Индометацин – ингибитор циклооксигеназы и катализирующего 3α-гидроксистероид превращение дегидрогеназы 5α-дегидропрогестерона – фермента, в 3α,5α- тетрагидропрогестерон (аллопрегнанолон). Рисунок 6.1. Схема биосинтеза нейростероидов в ЦНС (модификация Finn et al., 2006). Финастерид и индометацин фармакологических могут анализаторов для быть использованы изучения системы в качестве эндогенных нейростроидов и степени ее вовлеченности в отдельные процессы. С целью нарушения начальных путей нейростероидогенеза применяют РК11195 – селективный блокатор митохондриального транслокационного белка 18 кДа [Belelli and Lambert, 2005]. 111 6.1. Нейростероидогенез и тревожные реакции у мышей Вопрос о том, в какой степени блокада того или иного этапа биосинтеза нейростероидов в ЦНС влияет на уровень тревожности мышей различных линий в современной литературе освещен слабо. Известно, что эффективность анксиолитиков зависит от генетически контролируемого типа поведения при стрессовом воздействии [Середенин и др., 2001]. В связи с этим актуальность приобретает вопрос о специфике поведенческих ответов на блокаду нейростероидогенеза у инбредных мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовых реакций. С этой целью было проведено сравнительное изучение влияния веществ, селективно ингибирующих основные этапы биосинтеза нейростероидов ЦНС, на уровень исследовательской активности мышей линий BALB/C и С57BL/6. Таблица 6.1.1. Влияние веществ, нарушающих биосинтез нейростероидов, на ориентировочно-исследовательскую реакцию мышей в тесте «открытое поле». Вещество Доза, мг/кг Горизонтальная активность Ц Ц+П ИТ, % ВА ОО КОИР Мыши BALB/C Контроль, n=65 - 4,1 ± 0,8 19,8 ± 1,4 21 1,5 ± 0,3 1,7 ± 0,3 23,2 ± 1,8 PK11195, n=20 5 1,1 ± 0,3 ** 0,6 ± 0,1 ** 1,2 ± 0,2 ** 15 Индометацин, n=8 10 1,4 ± 0,1 3,4 ± 0,5 ** 9,6 ± 1,4 **, # 7,9 ± 1,9 **, # 6 ** Финастерид, n=20 0,2 ± 0,1 ** 2,1 ± 0,5 **,# 18 1,6 ± 0,8 1,4 ± 0,4 Прегненолон, n=10 20 5,9 ± 2,6 31,6 ± 7,9 19 2,0 ± 1,1 1,4 ± 0,5 5,6 ± 0,7 ** 11,6 ± 1,4 **, # 10,9 ± 2,3 **, # 35,1 ± 8,0 ** 15 + 20 0,3 ± 0,2 **, ## 1,9 ± 0,7 **, ## 16 0,3 ± 0,1 **, ## 1,3 ± 0,3 **, ## 3,7 ± 0,9 **, ## 18 8,8 ± 1,6 х 7,7 ± 0,9 х 17 6,8 ± 1,5 9,1 ± 1,3 66,9 ± 5,6 х 44,1 ± 6,2 * Финастерид + прегненолон, n=10 22 1,5 ± 0,3 Мыши C57BL/6 Контроль, n=37 - 9,7 ± 1,5 х PK11195, n=10 5 6,6 ± 1,4 53,8 ± 4,8 х 31,8 ± 3,8 * 112 Финастерид, n=20 1,5 ± 0,1 26,0 ± 5,1 8 4,1 ± 0,8 1,3 ± 0,3 31,6 ± 5,9 ** ** ** ** * ** Индометацин, n=10 5,8 ± 1,1 35,3 ± 1,3 2,6 ± 0,5 44,0 ± 1,7 10 17 6,2 ± 0,9 * ** ** ** Примечание. Данные представлены как M ± S.E.M., n – количество мышей в группе, Ц – центральная активность, П – периферическая активность, ИТ – индекс тревожности, ОО – обследований отверстий, ВА – вертикальная активность, *, ** - отличие от контроля при p<0,05; 0,01; х – отличие от контрольной группы BALB/C при p<0,05; #, ## - отличие от PK11195 при p<0,05; 0,01 15 Мыши инбредных линий BALB/C и С57BL/6 различались по своей исследовательской активности (таблица 6.1.1): КОИР для первых составил 23,2 ± 1,8, для вторых – 66,9 ± 5,6 (р<0,05), что согласуется с данными литературы [Середенин и др., 2001]. Селективный блокатор TSPO РК11195 (5 мг/кг) у мышей линии BALB/C вызывал снижение всех регистрируемых параметров ОИР, по сравнению с показателями в группе контрольных животных. Финастерид (15 мг/кг) уменьшал горизонтальную и вертикальную активность и не оказывал влияния на число обследованных отверстий и индекс тревожности. Индометацин (10 мг/кг) оказывал ингибирующее действие лишь в отношении горизонтальной активности животных, тем не менее все же снижал КОИР в 2 раза, по сравнению с контролем подобно финастериду. Селективное ингибирование активности TSPO у мышей С57BL/6 вызывало уменьшение горизонтальной активности и КОИР. Финастерид снижал все регистрируемые параметры поведения в тесте «открытое поле», оказывая наиболее значительные изменения в отношении центральной активности. Индометацин уменьшал горизонтальную активность и число обследований отверстий, не оказывая влияния на вертикальную активность мышей С57BL/6. Депримирующее действие финастерида сочеталось с уменьшением индекса тревожности. Ослабление исследовательского поведения, вызванное применением РК11195 или индометацина, не сопровождалось уменьшением активности в центральной части установки. Селективная блокада митохондриального транслокационного белка 18 кДа путем системного введения РК11195 (5 мг/кг) снижает коэффициент 113 ориентировочно-исследовательской реакции на 76% у самцов мышей BALB/C и на 19% - у самцов мышей С57BL/6, по сравнению с контрольными группами животных. РК11195 в 3-4 раза снижает активность мышей BALB/C в центральной части экспериментальной установки, что свидетельствует об усилении тревожности животных. Финастерид (15 мг/кг) и индометацин (10 мг/кг) вызывают снижение коэффициента ориентировочно-исследовательской реакции у мышей независимо от типа эмоционально-стрессовой реакции на 34-53%. Прегненолон (20 мг/кг) обладает активирующим действием в тесте «открытое поле» у мышей BALB/C, ориентировочно-исследовательской реакции увеличивая животных коэффициент на 51%, по сравнению с контрольной группой мышей, но при этом на 68% усиливает депримирующий эффект финастерида. 6.2. Влияние нарушения нейростероидогенеза на эффекты ГИЖ-72 и флувоксамина в тесте «открытое поле» Учитывая широкое применение СИОЗС в фармакотерапии тревожных расстройств, включая обсессивно-компульсивное расстройство, панические атаки и посттравматический синдром [Decloedt and Stein, 2010; Marazziti et al., 2012], определенный интерес вызывает вопрос: какое место отводится системе эндогенных нейростероидов в противотревожном или напротив анксиогенном действии препаратов этой группы? Вторым важным моментом являются условия проведения самого эксперимента. Стоит отметить, что стрессовые события зачастую могут выступать в роли триггерного механизма при обострении симптоматики или ухудшении течения перечисленных расстройств [Boileau, 2011; Rosso et al., 2012]. Кроме того, данные литературы [Farhan and Haleem, 2015; Wang et al., 2014] и собственных экспериментов прямо указывают на возможную 114 инверсию эффектов СИОЗС в отношении тревожных реакций. В связи с этим, изучение вовлеченности системы эндогенных (которая сама по себе является стресс-зависимой системой) в механизм противотревожного/ анксиогенного эффекта СИОЗС должно проводиться в условиях длительной стрессовой экспозиции. Для этих целей подходит процедура непредсказуемого хронического умеренного стресса, поскольку именно она призвана имитировать те стрессовые события, с которыми сталкивается среднестатистический человек в повседневной жизни [Gronli, 2006; Hill et al., 2012]. В дополнение к вышесказанному нужно отметить, что ГИЖ-72 – новое и оригинальное соединение с неустановленным механизмом действия, поэтому изучение роли системы эндогенных нейростероидов в реализации анксиолитического эффекта последнего может быть выполнено в рамках задачи по изучению механизма действия данного соединения. В качестве вещества, селективно нарушающего нейростероидогенез, был выбран финастерид, поскольку наиболее выраженное депримирующее действие в отношении ориентировочно-исследовательских реакций у мышей в тесте «открытое поле» было выявлено именно после введения финастерида, которое также не зависело от фенотипа эмоционально-стрессовой реакции (см. главу 6.1). Перед началом эксперимента все животные были подвергнуты процедуре непредсказуемого хронического умеренного стресса продолжительностью 21 день. Контрольная группа животных, которые были подвержены длительной стрессовой экспозиции, демонстрировали подавление центральной активности по сравнению с животными интактной группы (таблица 6.2.1). Введение финастерида (15 мг/кг) сопровождалось усилением центральной активности, повышением индекса тревожности и увеличением КОИР в 1,9 раза (p<0,05), что свидетельствует об активирующим действии селективного ингибитора 5α-редуктазы в условиях непредсказуемого 115 хронического умеренного стресса. ГИЖ-72 (20 мг/кг) и флувоксамин (25 мг/кг) уменьшали интенсивность вертикализации в 4,5 и 9,0 раза (p<0,05) соответственно. Совместное введение финастерида (15 мг/кг) и ГИЖ-72 (20 мг/кг) приводило к увеличению вертикальной активности в 3,4 раза (p<0,05) и уменьшению обследований отверстий в 2 раза (p<0,05) по сравнению с введением финастерида (15 мг/кг). При комбинированном введении финастерида (15 мг/кг) и флувоксамина (25 мг/кг) было отмечено усиление активирующего действия финастерида: увеличение центральной активности в 6 раз (p<0,05), индекса тревожности в 4,2 раза (р<0,05) и КОИР в 2,5 раза (p<0,05) по сравнению с введением одного финастерида. Таблица 6.2.1. Влияние селективного ингибирования 5α-редуктазы на эффекты ГИЖ-72 и флувоксамина в тесте «открытое поле» у мышей BALB/C после длительной стрессовой экспозиции Вещество Доза, мг/кг Горизонтальная активность П Ц ИТ, % ВА ОО КОИР Контроль без 15,7 ± 1,4 4,1 ± 0,8 21 1,5 ± 0,3 1,7 ± 0,3 23,2 ± 1,8 стресса, n=65 Контроль, 11,9 ± 2,7 0 0 1,8 ± 0,4 2,1 ± 0,3 15,9 ± 2,8 n=10 $$ $$ Финастерид, 25,0 ± 3,7 0,9 ± 0,5 3,5 0,5 ± 0,2 3,1 ± 0,4 29,5 ± 3,4 15 n=10 * * * ГИЖ-72, 7,3 ± 1,7 0 0 0,4 ± 0,2 1,8 ± 0,5 9,5 ± 1,9 20 n=10 * Флувоксамин, 13,5 ± 3,6 0 0 0,2 ± 0,1 1,8 ± 0,5 15,5 ± 3,7 25 n=10 * Контроль, 16,1 ± 4,7 0 0 0,4 ± 0,2 1,7 ± 0,4 18,5 ± 5,1 n=10 Финастерид + 15 + 27,5 ± 6,4 1,8 ± 1,0 6,1 1,7 ± 0,5 1,5 ± 0,3 32,5 ± 7,7 ГИЖ-72, n=10 20 * *, # ## Финастерид + 37,4 ± 5,6 6,4 ± 2,3 14,7 1,0 ± 0,5 2,0 ± 0,6 46,9 ± 7,6 15 + флувоксамин, ** *; # *; # **; # 25 n=10 Примечание. Данные представлены как M ± S.E.M., n – количество мышей в группе, *, ** отличие от контроля при р<0,05;0,01; #, ## - отличие от финастерида при р<0,05;0,01; $, $$ отличие от интактного контроля при р<0,05;0,01 116 Установлено, что финастерид (15 мг/кг) в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса обладает активирующим действием в тесте «открытое поле». Совместное введение финастерида (15 мг/кг) и флувоксамина (25 мг/кг) потенцирует анксиолитическую активность финастерида в тесте открытое поле у мышей BALB/C. 6.3. Нейростероидогенез и компульсивное поведение у мышей В качестве одной из возможных теорий патогенеза обсессивнокомпульсивного расстройства некоторые авторы [Albelda and Joel, 2012; Fava et al., 2014; Umathe et al., 2009] рассматривают дисрегуляцию в системе эндогенных нейростероидов. Данное предположение подкреплено экспериментальными исследованиями, в которых было показано, что аллопрегненалон, один из конечных метаболитов прогестерона, дозозависимо подавляет закапывание шариков в тесте закапывания шариков, в то время как анксиогенный нейростероид дигидроэпиандростерон, напротив, усиливает компульсивное поведение у мышей [Umathe et al., 2009]. Тем не менее, влияние блокады различных этапов биосинтеза нейростероидов на компульсивное поведение у мышей с различным эмоционально-стрессовым фенотипом изучено не было. В связи с этим, было проведено сравнительное изучение влияния селективной блокады различных этапов метаболизма прогестерона на компульсивное поведение мышей линий BALB/C и С57BL/6 в тесте закапывания шариков. Количество зарытых шариков в контрольных группах обеих линий было примерно на одном уровне и составило 69,4% для мышей BALB/C и 71,0% для С57BL/6. Введение финастерида за 60 мин до теста (5 мг/кг) уменьшало число зарытых шариков на 44,7% (p<0,05, а введение за 24 ч – на 117 32,3% (p<0,05) у мышей линии BALB/C. Мыши линии С57BL/6 оказались менее чувствительны к финастериду – данный показатель под действием препарата уменьшался лишь на 18,8% (p<0,05), что в 2,4 раза меньше (p<0,05), чем для мышей BALB/C. Установлено, что финастерид в дозе 5 мг/кг подавляет закапывание шариков у мышей линий BALB/C и С57BL/6 в тесте закапывания шариков, причем мыши линии BALB/C более чувствительны к действию препарата, чем С57BL/6. Селективный блокатор TSPO РК11195 (5 мг/кг) не оказывает влияния на компульсивное поведение у мышей обеих линий. Рисунок 6.3.1. Влияние блокады метаболизма прогестерона в ЦНС на компульсивное поведение у мышей в тесте закапывания шариков. Количество зарытых шариков в % 100% 90% 80% 70% # 60% * 50% Контроль РК11195 (5 мг/кг) 40% Финастерид (5 мг/кг) 30% * 20% 10% 0% BALB/C C57BL/6 Примечание. * - отличие от контроля внутри одной линии при р<0,05; # - отличие от линии BALB/C при p<0,05 118 Рисунок 6.3.2. Влияние блокады метаболизма прогестерона в ЦНС на компульсивное поведение мышей линии BALB/C при различных режимах Количество зарытых шариков в % введения 100% 90% 80% 70% 60% # 50% Контроль * 40% РК11195 (5 мг/кг) Финастерид (5 мг/кг) 30% * 20% 10% 0% Через 60 мин после введения Через 24 ч после введения Примечание. * - отличие от контроля внутри одной группы при р<0,05; # - отличие от введения за 60 мин при p<0,05 6.4. Влияние нарушения нейростероидогенеза на антикомпульсивную активность ГИЖ-72 и препаратов сравнения Как уже говорилось ранее, антидепрессанты из группы СИОЗС являются средствами первой линии в фармакотерапии обсессивно- компульсивного расстройства [Boileau, 2011; Decloedt and Stein, 2010; Marazziti et al., 2012]. Согласно литературным данным последних лет, значительную роль в механизме психотропных эффектов СИОЗС может играть система эндогенных нейростероидов [Fry et al., 2014; Maurice and Su, 2009; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006]. В тоже время, остается открытым вопрос об участии данной системы в отдельных эффектах СИОЗС, в частности, насколько вовлечена система эндогенных нейростероидов в реализацию антикомпульсивного эффекта препаратов этого класса. 119 С другой стороны, новое производное пиразоло[C]пиридина ГИЖ-72 продемонстрировал антикомпульсивный эффект, который не зависит от кратности введения вещества, а также факта отсутствия/наличия стресса, что дает соединению преимущество перед референтными препаратами из группы СИОЗС, для которых была отмечена инверсия эффекта на фоне длительной стрессовой экспозиции. Изучение задействованности системы эндогенных нейростероидов в механизм антикомпульсивного действия СИОЗС и ГИЖ-72 является важной задачей, поскольку позволит дать ответ на вопрос, связан ли стабильный антикомпульсивный эффект ГИЖ-72 с системой эндогенных нейростероидов или же она ответственна за изменчивый фармакологический ответ антидепрессантов группы СИОЗС? Рисунок 6.4.1. Влияние селективной блокады TSPO Количество зарытых шариков в % антикомпульсивную активность ГИЖ-72 и флуоксетина у мышей C57BL/6 100% 90% 80% 70% 60% * 50% * 40% 30% * * 20% 10% 0% Контроль Флуоксетин ГИЖ-72 (20 РК11195 (5 (20 мг/кг) мг/кг) мг/кг) Примечание. * - отличие от контроля при р<0,05 РК11195 (5 РК11195 (5 мг/кг) + мг/кг) + флуоксетин ГИЖ-72 (20 (20 мг/кг) мг/кг) на 120 Рисунок 6.4.2. Влияние селективной блокады TSPO на Количество зарытых шариков в % антикомпульсивную активность флувоксамина у мышей BALB/C 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% * 30% * 20% 10% 0% Контроль Флувоксамин (25 мг/кг) РК11195 (5 мг/кг) РК11195 (5 мг/кг) + флувоксамин (25 мг/кг) Примечание. * - отличие от контроля при р<0,05 В контрольной группе мышей С57BL/6 количество зарытых шариков составило 65,7%. Флуоксетин (20 мг/кг) уменьшал количество зарытых шариков на 40,7% (p<0,05), ГИЖ-72 (20 мг/кг) – на 21,2% (p<0,05), в то время как РК11195 данный показатель не изменял (рис 4.4.1). Совместное введение РК11195 (5 мг/кг) с флуоксетином (20 мг/кг) и ГИЖ-72 (20 мг/кг) не изменяло антикомпульсивную активность изучаемых веществ у мышей C57BL/6. В контрольной группе мышей BALB/C количество зарытых шариков составило 65,4%. Флувоксамин (25 мг/кг) уменьшал этот показатель на 41,8% (р<0,05), а РК11195 (5 мг/кг) не вызывал каких-либо изменений. Совместное введение РК11195 (5 мг/кг) с флувоксамином (25 мг/кг) не оказывало никакого влияния на антикомпульсивный эффект последнего. Полученные данные свидетельствуют о том, что селективная блокада TSPO не влияет на антикомпульсивную активность ГИЖ-72, флуоксетина и флувоксамина у мышей в тесте закапывания шариков. 121 6.5. Влияние нарушения нейростероидогенеза на антидепрессивную активность ГИЖ-72 и флуоксетина Ранее в настоящей работе было показано, что антикомпульсивная активность флуоксетина и ГИЖ-72 не зависит от функциональной блокады TSPO, однако это вовсе не означает, что антидепрессивный эффект этих веществ в эксперименте не зависит от системы эндогенных нейростероидов, поскольку перечисленные эффекты могут иметь принципиально разные механизмы. Согласно данным литературы, селективный блокатор TSPO РК11195 сам по себе не изменяет регистрируемые параметры в тесте вынужденного плавания, однако способен оказывать влияние на эффекты соединений, в основе антидепрессивного эффекта которых лежит взаимодействие с системой эндогенных нейростероидов [Gavioli et al., 2003; Raghavendra et al., 2000]. С целью дифференцированного анализа анксиолитического и антидепрессивного эффекта ГИЖ-72 и флуоксетина было проведено изучение влияния функциональной блокады TSPO на эффекты ГИЖ-72 и флуоксетина в тесте вынужденного плавания. Флуоксетин в дозе 20 мг/кг сокращал время иммобилизации в 2 раза (p<0,05), а также увеличивал продолжительность плавания в 1,5 раза (p<0,01) по сравнению с контрольной группой животных, что говорит о наличии антидепрессивного эффекта (Рис 6.5.1). ГИЖ-72 (30 мг/кг) не обнаруживал какой-либо активности в тесте вынужденного плавания. Предварительное введение РК11195 (3 мг/кг) полностью устраняло антидепрессивный эффект флуоксетина (20 мг/кг), а при совместном введении РК11195 (3 мг/кг) и ГИЖ-72 (30 мг/мг) было отмечено усиление депрессивных реакций: увеличение иммобилизации в 1,7 раза (p<0,01) и уменьшение продолжительности плавания на ту же величину (p<0,05). Установлено, что предварительное введение селективного блокатора TSPO РК11195 (3 мг/кг) препятствует развитию антидепрессивного эффекта 122 флуоксетина (20 мг/кг). Совместное введение РК11195 (3 мг/кг) и ГИЖ-72 (30 мг/кг) приводит к усилению депрессивно-подобного поведения. Рисунок 6.5.1. Влияние селективной блокады TSPO на эффекты ГИЖ-72 и флуоксетина в тесте вынужденного плавания у мышей 300 ** 250 ** Время, с 200 150 * 100 * 50 0 Контроль Флуоксетин (20 мг/кг) Клайминг ГИЖ-72 (30 мг/кг) Плавание РК11195 (3 РК11195 (3 мг/кг) + мг/кг) + ГИЖ-72 флуоксетин (20 (30 мг/кг) мг/кг) Иммобилизация Примечание. *,** - отличие от контроля при р<0,05; 0,01 123 ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ГАМКА-РЕЦЕПТОРА В РЕАЛИЗАЦИИ ПСИХОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ ГИЖ-72 Более ранние экспериментальные исследования анксиолитических свойств ГИЖ-72 дали основу для предположения о возможной роли ГАМК Арецептора в реализации психотропных эффектов соединения [Мелетова, 2007]. В настоящее время ряд экспериментальных и клинических данных указывает на вовлечение ГАМКергической системы в патогенез не только тревожных расстройств, но и депрессии, а ГАМКА-рецептор рассматривают в качестве гипотетической мишени для антидепрессантов [Sanacora and Saricicek, 2007; Vollenweider et al., 2011]. В связи с этим, особую актуальность приобретает задача изучения возможной роли ГАМКАрецепторов в реализации психотропных эффектов ГИЖ-72 in vivo. 7.1. Лекарственная дифференцировка «коразол – физиологический раствор» Неконкурентный антагонист ГАМКА-рецептора коразол известен способностью в субсудорожных дозах вызывать у людей состояние тревоги, а в конвульсивных – провоцировать панические атаки [Jung, 2002]. В условиях эксперимента на животных анксиогенные эффекты коразола нашли применение для моделирования тревожных состояний [Королев и др., 2014; Jung, 2002]. Кроме того, установлено наличие у коразола интероцептивных дифференцировочных стимульных свойств [Buccafusco, 2009], которые позволяют использовать его в различных модификациях лекарственной дифференцировки (ЛкД). Метод ЛкД позволяет провести сравнительный анализ анксиолитических обусловленной блокадой эффектов веществ на модели тревоги, ГАМКА-рецептора, а также оценить 124 задействованность ГАМКА-рецептора в механизме анксиолитического эффекта ГИЖ-72. Рисунок 7.1.1. Влияние веществ на интероцептивные эффекты коразола (20 мг/кг, в/б) у крыс, обученных лекарственной дифференцировке «коразол-физ. р-р» в оперантном режиме FR10. А. Влияние веществ на среднюю по группе долю (%) выборов рычагов, ассоциируемых с инъекцией коразола (20 мг/кг, в/б); параметр представлен по оси Y 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ** Физ. р-р ** ** ** Коразол (20 Феназепам (2 Коразол (20 ГИЖ-72 (20 Коразол (20 мг/кг) мг/кг) мг/кг) + мг/кг) мг/кг) + феназепам (2 ГИЖ-72 (20 мг/кг) мг/кг) 125 Б. Влияние веществ на долю (%) крыс, выбирающих рычаг, адекватный коразолу; параметр представлен по оси Y 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ** Физ. р-р ** ** ** Коразол (20 Феназепам (2 Коразол (20 ГИЖ-72 (20 Коразол (20 мг/кг) мг/кг) мг/кг) + мг/кг) мг/кг) + феназепам (2 ГИЖ-72 (20 мг/кг) мг/кг) Примечание. ** - отличие от коразола при р<0,01 При предварительном введении феназепама (2 мг/кг, в/б) наблюдали полный антагонизм с интероцептивными эффектами коразола по всем регистрируемым параметрам. Предварительное введение ГИЖ-72 в дозе 20 мг/кг не вызывало изменений интероцептивных эффектов коразола. В заместительном ассоциированное тестировании с введением условнорефлекторное ГИЖ-72, соответствовало поведение, инъекции физиологического раствора. ГИЖ-72 не ингибирует интероцептивные эффекты коразола у крыс Вистар, что свидетельствует об отсутствии у ГИЖ-72 свойств лиганда ГАМКА-рецептора. 126 ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В тесте вынужденного плавания было показано, что в контрольной группе мышей, которые подвергались предварительной экспозиции 5-мин острым плавательным стрессом, происходило усиление депрессивных реакций по сравнению с группой, в которой подобная процедура отсутствовала, а так же с группой, где еѐ продолжительность составляла 20 мин. Активность флуоксетина также была выявлена только в группе с 5-мин предварительной посадкой. По-видимому, подобная динамика указывает на вовлечение в процесс системы эндогенных нейростеройдов. В пользу этой точки зрения говорит как минимум два факта. Во-первых, острый плавательный стресс продолжительностью не более 10 минут приводит к повышению уровня эндогенного аллопрегнанолона in situ и увеличению плотности TSPO спустя 24 ч после [Gavish et al., 1999; Vallee et al., 2000; Gunn et al., 2015]. Во-вторых, собственные данные, полученные при совместном введении селективного блокатора TSPO РК11195 и флуоксетина, которые свидетельствуют о зависимости антидепрессивного эффекта последнего от функциональной активности TSPO. Полученные результаты согласуется с данными литературы о взаимодействии СИОЗС с системой эндогенных нейростероидов. Известно, что флуоксетин способен повышать уровень эндогенного аллопрегнанолона у больных, страдающих большим депрессивным расстройством. В основе этого эффекта лежит способность флуоксетина дегидрогеназы, регулировать активность катализирующего фермента реакцию 3α-гидроксистероид восстановления 5α- дигидропрогестерона до аллопрегнанолона, если ко-ферментом выступает альдо-кето редуктаза, или напротив – реакцию окисления аллопрегнанолона до 5α-дигидропрогестерона при участии ко-фермента ретинол дегидрогеназы. Флуоксетин ингибирует активность второго ко-фермента (Рис 8.1) и подавляет процесс окисления аллопрегнанолона [Fry et al., 2014; 127 Griffin and Mellon, 1999; Maurice and Su, 2009; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006]. Рисунок 8.1. Взаимодействие флуоксетина с ферментами de nova биосинтеза нейростероидов в ЦНС. При селективной блокаде TSPO нарушается начальный этап биосинтеза аллопрегнанолона в ЦНС (Рис 4.1) и флуоксетин, по-видимому, не способен реализовать антидепрессивный эффект ввиду отсутствия достаточного количества аллопрегнанолона. ГИЖ-72 в диапазоне доз от 0,02 до 30 мг/кг не обнаруживал антидепрессивной активности, а при повышении дозы до 40 мг/кг приводило к усилению депрессивных реакций в тесте вынужденного плавания у мышей. Референтный препарат флуоксетин в дозе 20 мг/кг демонстрировал антидепрессивную активность, увеличение дозы до 40 мг/кг также приводило к усилению депрессивного поведения. Полученные данные не согласуются с результатами более ранних исследований антидепрессивной активности ГИЖ-72 [Мелетова, 2007], однако следует отметить, что антидепрессивный эффект изучаемого соединения был выявлен на крысах в условиях модифицированного варианта теста вынужденного плавания – без сеанса предварительного плавания за 24 ч до самого теста. В то же время, Borsini и соавторами было показано, что процедура предварительной посадки за 24 ч до теста может играть важную роль в увеличении чувствительности теста для обнаружения антидепрессивной активности [Borsini et al., 1989]. Увеличение дозы как флуоксетина, так и ГИЖ-72 до 40 мг/кг приводило к однонаправленному эффекту – усилению депрессивно- 128 подобных реакций, но структура этого эффекта у ГИЖ-72 и флуоксетина имела принципиальные различия. Так, в случае флуоксетина усиление иммобилизации происходило за счет сокращения времени плавания, ГИЖ-72 же вызывал полную редукцию клайминга. В дозе 30 мг/кг ГИЖ-72 не вызывал достоверных уменьшению изменений, клайминга и но была увеличению отмечена времени тенденция к иммобилизации. Депрессивно-подобное действие ГИЖ-72 объяснить достаточно сложно, поскольку механизмы его психотропных эффектов на данный момент не изучены. Однако можно предположить, что подобная активность связана с несколькими факторами: активностью в отношении серотонинергической и дофаминергической нейротрансмиссии, а также взаимодействием с энзимами de nova биосинтеза нейростероидов. Первое активности предположение подкреплено серотонинергического данными анксиолитика литературы буспирона в об тесте вынужденного плавания. Буспирон, как и ГИЖ-72, дозозависимо усиливает депрессивные реакции в тесте Порсолта у мышей [Kitamura and Nagatani, 1996], что может косвенно указывать на наличие общих точек приложения для действия этих веществ. Кроме того, флуоксетин, имеющий серотонинергический компонент в механизме действия, обладает схожим эффектом при увеличении дозы. Динамика поведенческих изменений при увеличении дозы ГИЖ-72 может указывать на возможную активность ГИЖ-72 в отношении дофаминергической нейротрансмиссии, т.к. ранее было показано, что мыши с нокаутом генов дофаминового транспортера демонстрируют прямо противоположные эффекты в тесте вынужденного плавания – увеличение клайминга и сокращение времени иммобилизации [Perona et al., 2008]. Также известно, что типичный нейролептик галоперидол обладает способность к увеличению времени иммобилизации в тесте вынужденного плавания [Chatterjee et al., 2012; Corbett et al., 1999; Weiner et al., 2003], что может 129 служить дополнительным аргументов в пользу наличия дофаминергического компонента в механизме действия ГИЖ-72. На возможное взаимодействие ГИЖ-72 и системы эндогенных нейростероидов указывает тот факт, что совместное введение селективного блокатора TSPO РК11195 (3 мг/кг) и ГИЖ-72 (30 мг/кг) вызывает тот же эффект, что и ГИЖ-72 в дозе 40 мг/кг. Можно предположить, что ГИЖ-72, как и РК11195 является лигандом TSPO, однако его связывающая способность, скорее всего, в разы уступает РК11195. С одной стороны, это предположение можно подкрепить тем, что РК11195 в дозе 3 мг/кг и ГИЖ-72 30 мг/кг не обладают активностью в тесте вынужденного плавания, а при совместном введении усиливают депрессивное поведение. Недостатком этого аргумента является отсутствие каких-либо данных о влиянии высоких доз РК11195 на продолжительность иммобилизации в тесте Порсолта. Тем не менее, вектор активности, направленный в сторону усугубления депрессивного поведения, представляется наиболее логичным для РК11195, поскольку он согласуется с концепцией о корреляции понижения эндогенного аллопрегнанолона и симптоматикой большого депрессивного расстройства у людей [Bäckström et al., 2014; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006], а также усилением тревожных реакций и депрессивного поведения у экспериментальных животных [Beauchamp et al., 2000; Fish et al., 2005; Pinna et al., 2003; 2005]. Рисунок 8.2. Химические структуры ГИЖ-72 (а) и РК11195 (б). (а) (б) 130 С другой стороны, если сравнить химическую структуру ГИЖ-72 с таковой у РК11195 можно найти определенные сходства (Рис. 8.2), которые, по-видимому, и отвечают за сродство к одной мишени. Безусловно, по нескольким поведенческим экспериментам нельзя с уверенностью сделать вывод о механизме данного эффекта у ГИЖ-72, и данный вопрос требует более тщательного изучения с определением показателей связывания и константы диссоциации. Следующим этапом непредсказуемого работы хронического являлось умеренного изучение стресса на влияния эффекты классических антидепрессантов и ГИЖ-72 в тесте вынужденного плавания. Контрольная группа животных демонстрировала усиление депрессивно-подобного поведения после 28 дневного непредсказуемого хронического умеренного стресса, что согласуется с данными литературы о влиянии непредсказуемого хронического умеренного стресса на изменение регистрируемых параметров в тесте вынужденного плавания [Willner, 2005] и по направленности действия соответствует введению кортикостерона [Johnson et al., 2006]. Амитриптилин обнаруживал антидепрессивный эффект во всех изученных моделях регистрируемых и демонстрировал параметров независимо характерные от кратности соотношения введения и воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса. Однако, антидепрессивный эффект амитриптилина на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса был менее выражен, чем при его отсутствии – антииммобилизационный эффект и влияние амитриптилина на продолжительность плавания имели меньшую глубину, в то время как клайминг не изменялся. Можно предположить, что эффекты амитриптилина в тесте вынужденного плавания в какой-то мере могут зависеть от функциональной активности TSPO, плотность которых согласно литературным данным уменьшается при повторном стрессе [Gavish et al., 1999]. 131 Флуоксетин был активен при остром введении как на фоне 28 дневного непредсказуемого хронического умеренного стресса, так и при его отсутствии, а также при хроническом введении на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса. Острое введение флуоксетина животным, которые подвергались воздействию непредсказуемого хронического умеренного стресса на протяжении 14 дней, не вызывало поведенческих изменений по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор, в то время как при субхроническом введении на фоне непредсказуемого хронического действие животных умеренного стресса наблюдалось депрессивно-подобное флуоксетина – достоверное увеличение времени иммоблизации в сравнении с контрольной группой. Отсутствие антидепрессивного эффекта и его инверсия на фоне 14 дневного непредсказуемого хронического умеренного стресса, по-видимому, связаны с взаимодействиями флуоксетина и гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой оси. Отсутствие активности флуоксетина после острого введения на фоне 14 дневного непредсказуемого умеренного хронического стресса, скорее всего, является следствием активации гипоталамо- гипофизарно-надпочечниковой оси в этот временной промежуток. Данное предположение согласуется с клиническими данными о том, что фармакотерапия флуоксетином неэффективна у больных с активированной до начала лечения гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой осью [Young et al., 2004]. Возможным объяснением инверсии эффекта флуоксетина, при субхроническом введении на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса, может являться однонаправленный вектор воздействия на организм флуоксетина и непредсказуемого умеренного хронического стресса, т.е. флуоксетин может способствовать гиперактивации гипоталамогипофизарно-надпочечниковой оси именно в 14-дневный период введения. Гипотетическим механизмом этого инверсного эффекта может являться дополнительное стимулирующее воздействие серотонина на гипоталамогипофизарно-надпочечниковую ось через 5-НТ2С-рецепторы 132 паравентрикулярного ядра гипоталамуса [Heisler et al., 2007], и можно предположить, что функциональная активность этого подтипа серотониновых рецепторов может увеличиваться в условиях нарушения обратного захвата флуоксетина. серотонина Кроме того, в ЦНС, известно, опосредованного что флуоксетин введением способен к взаимодействию с системой эндогенных нейростероидов, регулируя уровень позитивного ГАМК-модулятора аллопрегненалона в ЦНС [Griffin and Mellon, 1999; Pinna et al., 2004; Uzunova et al., 1998], который, в свою очередь, также имеет точку приложения в паравентрикулярном ядре гипоталамуса и способен модулировать активность гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой оси [Gunn et al., 2011]. Возможное взаимодействие этих систем при одновременном воздействии непредсказуемого хронического умеренного стресса и субхроническом введении флуоксетина привело к возникновению депрессивно-подобного поведения в тесте вынужденного плавания. Кажущееся на первый взгляд одинаковым, действие флуоксетина при остром и хроническом введении может иметь принципиально разные механизмы и требует дифференцированного подхода к дальнейшему изучению. Так, в случае острого введения эффект флуоксетина может зависеть от плотности TSPO, взаимодействие с которым может быть регуляторным механизмом для биосинтеза нейростероидов в ЦНС, данное предположение флуоксетина требует на фоне экспериментального введения изучения анализаторов, активности нарушающих нейростероидогенез в ЦНС на разных стадиях. Хронический эффект флукосетина может быть связан с его способностью угнетать активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси при длительном введении [Heinzmann et al., 2011], но и не исключает также вовлечения TSPO, взаимодействия флуоксетина с энзимами de nova биосинтеза нейростероидов и других механизмов. Кроме того, динамика эффектов флуоксетина при остром, субхроническом и хроническом введении позволяет сделать 133 предположение, что флуоксетин за счет потенцирования стресса способствует активации естественных защитно-адаптивных функций ЦНС и подтверждением, косвенно говорящим в пользу этой гипотезы, может выступать тот факт, что хроническое введение флуоксетина стимулирует нейрогенез в гиппокампе [Malberg et al., 2000; Wang et al., 2008], т.е. индуцирует процесс, направленный на устранение нейродегенеративных последствий гиперсекреции кортизола. Полученные данные свидетельствуют о том, что фармакологические эффекты амитриптилина и флуоксетина в тесте вынужденного плавания находятся в зависимости от непредсказуемого хронического умеренного стресса. Так, антидепрессивный эффект амитриптилина сохраняется на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса, но уменьшается его выраженность – снижается антииммобилизационный эффект и влияние препарата на продолжительность плавания, в то время как клайминг не зависит от воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса. Флуоксетин же, напротив, демонстрирует зависимость активности от воздействия непредсказуемого хронического умеренного стресса, более того, субхроническое введение флуоксетина сопровождалось инверсией антидепрессивного эффекта. Обобщая результаты, полученные в ходе эксперимента, можно предположить, что механизм антидепрессивного эффекта флуоксетина реализуется через гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковую ось или сопряженную с ней систему. Таким образом, кратность введения изучаемых препаратов и длительность воздействия непредсказуемого хронического умеренного стресса являются важными параметрами, определяющими эффективность антидепрессантов в тесте вынужденного плавания, что необходимо учитывать как при скрининге антидепрессивной активности среди новых оригинальных фармакологических веществ, так и при формировании представлений о патогенезе депрессивных расстройств. Выявленная зависимость подтверждает обоснованность поиска мишеней антидепрессантного эффекта, 134 задействованных в реализации адаптивной реакции организма на стрессовые воздействия умеренной или слабой интенсивности. Изучение антидепрессивной активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 после субхронического введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса результатов не принесло. Интересные результаты были получены при изучении активности ГИЖ-72 в тесте Порсолта после хронического введения в условиях стрессовой экспозиции. ГИЖ-72 антидепрессивным эффектом не обладал, однако такая активность была отмечена у ДМСО, который вводили перорально животным в течение 28 дней в качестве дополнительного контроля. Однако антидепрессивную активность ДМСО скорее следует отнести к ложноположительному результату, поскольку при оценке внешнего вида было установлено, что мыши, получавшие 0,01% раствор ДМСО, имели разреженный волосяной покров и множественные язвы различного размера и локализации. Внешнее состояние животных, повидимому, является следствием длительной стрессовой экспозиции. В тоже время, у контрольной группы и группы животных, получавших ГИЖ-72 совместно с ДМСО, таких изменений отмечено не было, хотя условия содержания и стрессовые манипуляции не отличались от группы ДМСО. Наиболее вероятной причиной такого результата можно назвать потенцирование непредсказуемого хронического стресса введением ДМСО. Используемый в качестве криопротектора при пересадке костного мозга ДМСО, в числе прочих побочных эффектов, обладает нейротоксическим действием: описаны случаи развития амнезии, судорог и паралича у реципиентов [Bauwens et al., 2005; Abdelkefi et al., 2009; Hequet et al., 2002; Hoyt et al., 2000; Júnior et al., 2008; Otrock et al., 2008; Windrum and Morris, 2003]. Установлено, что ДМСО в малых концентрациях может оказывать возбуждающее действие на NMDA-рецепторы [Tsvyetlynska et al., 2005], а в более высоких – способен блокировать эти же рецепторы, а также подавлять ионные токи, сопряженные с ними [Lu and Mattson, 2001]. Как известно, 135 процедура непредсказуемого хронического умеренного стресса может приводить к нарушению процессов гиппокампального нейрогенеза [de Andrade et al., 2013]. Нейродегенеративные изменения, происходящие на фоне стрессовой экспозиции, могут быть опосредованы чрезмерной активацией глуматергической системы, которая инициирует процессы атрофии и ретракции дендритных шипиков [Christian et al., 2011; Conrad, 2006; Gorman and Docherty, 2010]. Если брать во внимание достаточно агрессивное действие глутамата на нейроны ЦНС, триггером которого может выступать длительная стрессовая экспозиция [Sanacora et al., 2012], и тот факт, что низкие дозы ДМСО могут стимулировать NMDA-рецепторы [Tsvyetlynska et al., 2005], то можно предположить однонаправленное действие на ЦНС непредсказуемого хронического умеренного стресса и ДМСО. О возможных структурных нарушениях в ЦНС может свидетельствовать также активность ДМСО в тесте вынужденного плавания, поскольку частичная денервации голубого пятна в эксперименте, проводимая за неделю до начала процедуры непредсказуемого хронического умеренного стресса, приводила к аналогичному результату – антидепрессивной активности [Häidkind et al., 2003]. Не менее важным является отсутствие эффектов у ГИЖ-72 в тесте вынужденного плавания при совместном введении с ДМСО, что в совокупности с внешне благополучными животными может говорить об антагонизме этих веществ. Обобщая вышеизложенные факты, можно предположить, что в основе механизма нейропротективного действия ГИЖ-72 лежит взаимодействие с глутаматергической системой. Стоит отметить, что атрофия дендритных шипиков опосредована активацией быстрых ионотропных глутаматных рецепторов – NMDA, в то время как стимуляция метаботропных GluN1, GluN2A и GluN2B сопровождается ростом шипиков [Sala and Segal, 2014]. ГИЖ-72 может проявлять свойства агониста метаботропных глутаматных рецепторов, что требует более детального изучения активности ГИЖ-72 в комбинации с блокаторами этих рецепторов. 136 В пользу предположения о наличии нейропротективных свойств у ГИЖ-72 говорят результаты, полученные в водном лабиринте Морриса. В первый день обучения, мыши, получавшие ГИЖ-72, растворенный в 0,01% растворе ДМСО, быстрее находили платформу за отведенное время в сравнении с чистым введением 0,01% ДМСО. Однако это может быть связано не только с влиянием ГИЖ-72 на когнитивные функции, но и отражать анксиолитическую активность соединения, поскольку на фоне введения ГИЖ-72 не было отмечено тигмотаксиса, характерного для группы ДМСО. Таким образом, полученные при изучении активности ГИЖ-72 совместно с ДМСО результаты могут свидетельствовать о наличии у соединения нейропротективных свойств, а также предполагают взаимодействие ГИЖ-72 с метаботропными глутаматными рецепторами по типу агониста. В тесте «открытое поле» ГИЖ-72 (20 мг/кг) обладал анксиолитическим эффектом с избирательным увеличением индекса тревожности, который сохранялся через 24 ч после однократного введения. Противотревожное действие ГИЖ-72 в тесте «открытое поле», по своей структуре, значительно отличается от такового у препаратов сравнения – диазепама и афобазола, что может быть следствием различий в механизмах анксиолитического эффекта этих соединений. При сравнении эффектов ГИЖ-72 через 30 мин и 24 ч после введения мы можем отметить интересную особенность – во втором случае анксиолитический эффект ГИЖ-72 сопровождается тенденцией к уменьшению тигмотаксиса. Похожей активностью (уменьшением тигмотаксиса) в тесте «открытое поле» обладает буспирон – анксиолитик с серотонинергическим механизмом действия [Siemiatkowski et al., 2000], что может косвенно указывать на сходство с ГИЖ-72. По результатам теста «открытое поле» можно сделать вывод, что ГИЖ-72 по направленности эффекта и его структуре отличается от всех трех препаратов сравнения: флуоксетина, диазепама и афобазола. 137 ГИЖ-72 в дозе 20 мг/кг обнаруживал активность в тесте «закапывание шариков» на двух линиях мышей – BALB/C и С57BL/6, которая была сопоставима с флуоксетином. Наличие эффекта в тесте «закапывания шариков», с одной стороны, является одним из прогностических признаков возможной эффективности ГИЖ-72 в фармакотерапии обсессивно- компульсивного расстройства [Bruins Slot et al., 2008; Witki, 2008], с другой – говорит в пользу наличия у ГИЖ-72 серотонинергичекого компонента, поскольку большинство антидепрессантов, ослабляющих тревожные реакций в тесте «закапывание шариков» обладают активностью в отношении серотонинергической нейротрансмиссии [Marazziti et al., 2012]. Кроме того, ранее полученные данные нейрохимического анализа показали однонаправленное воздействие ГИЖ-72 и флуоксетина на содержание серотонина в прилежащем ядре и гипоталамусе [Мелетова, 2007], что также позволяет предположить наличие серотонинергического компонента в механизме действия ГИЖ-72. Анксиолитики бензодиазепинового ряда и нейролептики [Bruins Slot et al., 2008; Nicolas et al., 2006] также подавляют закапывание шариков, что требует дифференцированного подхода к анализу активности ГИЖ-72 в данном тесте. Нейролептическая активность ГИЖ-72 была изучена на модели апоморфинового клайминга. Установлено, что ГИЖ-72 в дозах 20 и 40 мг/кг не устраняет вертикализацию и другие поведенческие реакции, вызванные введением апоморфина. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что эффективность ГИЖ-72 в тесте закапывания шариков не связана с нейролептической активностью, а является отражением анксиолитических свойств. На фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса была отмечена инверсия анксиолитического эффекта ГИЖ-72 при 14-дневном введении в тесте «открытое поле», в то время как после 28 дней вновь был зарегистрирован анксиолитический эффект, присущий соединению в состоянии физиологической нормы. Активность ГИЖ-72 в условиях 138 непредсказуемого хронического умеренного стресса, по своей динамике, повторяет таковую у флуоксетина, с той лишь разницей, что во втором случае был антидепрессивный эффект. Тем не менее, и в той, и в другой ситуации точкой инверсии служил 14 день введения препарата в условиях стрессовой экспозиции, а однократное введение веществ в таких условиях не приводило к каким-либо результатам. С целью возможного объяснения изменчивости эффекта, обратимся к референтному препарату флувоксамину. Флувоксамин, представляющий группу СИОЗС и проявляющий свойства агониста сигма-1-рецепторов [Hindmarch and Hashimoto, 2010; Maurice and Su, 2009], при субхроническом введении в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса демонстрировал ослабление тревожных реакций в тесте «открытое поле», а при хронизации процесса знак эффекта менялся на противоположный. По-видимому, инверсия эффекта, в случае флувоксамина, может быть объяснена изменениями, которые претерпевает серотонинергическая система в условиях длительной стрессовой экспозиции. Согласно данным литературы, непредсказуемый хронический умеренный стресс приводит к снижению связывающей способности и десенситизации 5НТ1А-рецепторов, а также увеличению функциональной активности анксиогенных 5-НТ2-рецепторов [Hill et al., 2012; Pitychoutisa et al., 2012]. Логичным выглядит вариант развития событий, при котором флувоксамин нарушает обратный функциональной захват активности серотонина его в рецепторов, условиях что в изменѐнной свою очередь обуславливает чрезмерную активацию 2 подтипа серотониновых рецепторов и усиление уровня тревожности. В дополнение к этому, флувоксамин агонист сигма-1-рецепторов, которые также принимают активное участие в модуляции серотонинергической нейротрансмиссии [Bermack and Debonnel, 2001, 2005; Fishback et al., 2010]. Обобщая изложенные выше аргументы, можно предположить, что инверсия анксиолитического эффекта флувоксамина в тесте «открытое поле» обусловлена изменениями в 139 серотонинергической нейротрансмиссии в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса. Значительно более сложной представляется задача объяснения инверсии эффекта ГИЖ-72, поскольку механизм действия этого соединения к настоящему времени не изучен, и выстраивать гипотетические аспекты действия ГИЖ-72 можно только на основании результатов поведенческих тестов. Первое на что следует обратить внимание – идентичность динамики активности ГИЖ-72 и флуоксетина в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса, не смотря на то, что речь идет о принципиально разных фармакологических эффектах. ГИЖ-72 и флуоксетин может объединять взаимодействие с системой эндогенных нейростероидов, однако точки приложения в этой системе у веществ, скорее всего, разные. Как уже упоминалось ранее, флуоксетин ингибирует ко-фермент ретинол дегидрогеназу, нарушая тем самым реакцию окисления аллопрегнанолона до 5α-дигидропрогестерона [Fry et al., 2014]. Можно предположить, что при субхроническом введении в условиях непредсказуемого хронического стресса и при увеличении вводимой в состоянии физиологической нормы дозы препарат теряет селективность в отношении направления реакции и подавляет также процесс восстановления 5α-дигидропрогестерона до аллопрегнанолона, и дефицит последнего приводит к усилению депрессивных реакций. ГИЖ-72, как уже было отмечено, по своей химической структуре имеет некоторую схожесть с селективным блокатором TSPO – РК11195. Кроме того, совместное введение этих веществ в субэффективных дозах приводит к усилению депрессивного поведения в тесте вынужденного плавания. Исходя из этого, можно сделать предположение, что ГИЖ-72 также является лигандом TSPO, но обладает значительно меньшим аффинитетом, чем РК11195 и отсутствием высокой селективности в отношении данной мишени. Известно, что плотность TSPO находится в тесной зависимости от воздействия стрессового фактора, так острый стресс приводит к повышению плотности TSPO через 24 ч, а 140 повторный наоборот – уменьшает плотность этих белков [Gavish et al., 1999]. По-видимому, 14-дневный непредсказуемый хронический стресс может приводить к уменьшению плотности TSPO, и в таких условиях ГИЖ-72 более отчетливо демонстрирует свойства лиганда TSPO, что и обуславливает анксиогенную активность этого соединения. Это предположение также согласуется с данными о влиянии РК11195 на уровень тревожности мышей в тесте «открытое поле» (таблица 4.1.1). В тесте закапывания шариков флувоксамин также демонстрировал инверсию эффекта, и, по-видимому, в основе инверсии лежит тот же механизм, что и в случае с «открытом полем». Дополнительным подтверждением зависимости этого тезиса антикомпульсивной служат экспериментальные активности флувоксамина данные в о тесте закапывания шариков от функциональной активности 5-НТ1А-рецепторов [Ichimaru et al., 1995]. При субхроническом и хроническом введении ГИЖ-72 в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса было отмечено усиление антикомпульсивного эффекта в тесте закапывания шариков. Полученные данные не противоречат предположению о возможных рецептор-лигандных взаимодействиях ГИЖ-72 и TSPO, поскольку компульсивное поведение мышей линий BALB/C и С57BL/6 не зависит от функциональной активности TSPO (Рис. 4.3.1, Рис. 4.4.1). В тесте «открытое поле» и тесте закапывания шариков ГИЖ-72 сохранял анксиолитическую и антикомпульсивную активность через 24 ч после отмены хронического инъекционного курса введения, что говорит об отсутствии у ГИЖ-72 синдрома отмены, характерного для анксиолитиков бензодиазепинового ряда [Divljaković et al., 2013]. ГИЖ-72 обнаруживал анксиолитическую активность в тесте «чернобелая камера», в то время как референтный препарат флувоксамин увеличивал латентный период и число стрейчей. Изменение поведенческих реакций под действием флувоксамина следует трактовать как анксиогенный 141 эффект. Согласно экспериментальным данным, хроническое введение кортикостерона вызывает увеличение латентного времени у мышей при начальной позиции на светлой стороне [Ardayfio and Kim, 2006]. Похожая модель поведения была зафиксирована и в нашей работе – животные после флувоксамина демонстрировали задержку на светлой стороне, которая сопровождалась стрейчами, т.е. имеет место извращение норкового рефлекса под действием препарата. Кроме того, полученные результаты согласуются с данными литературы об анксиогенных свойствах некоторых представителей СИОЗС в тесте «черно-белая камера» [Borsini et al., 2002]. Непредсказуемый хронический умеренный стресс продолжительностью 14 дней увеличивал латентное время и количество стрейчей, а также сокращал время пребывания животных в светлом отсеке, что согласуется с данными литературы о влиянии непредсказуемого хронического умеренного стресса на уровень тревожности у мышей в тесте «черно-белая камера» [Wang et al., 2014]. ГИЖ-72 после субхронического введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса увеличивал время, проведенное животными в светлом отсеке, а также устранял стрейчи, что свидетельствует о сохранении анксиолитической активности. Препарат сравнения флувоксамин уменьшал латентный период и сокращал число стрейчей, также была отмечена тенденция к увеличению времени, проведенному животными на светлой стороне установки. Чернобелая камера – единственный тест в настоящей работе, где флувоксамин демонстрирует инверсию эффекта в сторону анксиолитики, тем самым повторяя результаты, полученные при изучении анксиолитических свойств другого СИОЗС – флуоксетина [Farhan and Haleem, 2015; Wang et al., 2014]. По-видимому, инверсия эффектов в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса является характерной чертой антидепрессантов из группы СИОЗС. В то время как ГИЖ-72 менял знак эффекта только в одном тесте – в «открытом поле», что может служить 142 прогностическим признаком более широкого профиля безопасности будущей фармакотерапии этим соединением. Следующим шагом в рамках задачи по изучению влияния непредсказуемого хронического стресса на эффекты антидепрессантов была оценка поведенческих и нейрохимических аспектов хронического введения амитриптилина и флуоксетина в условиях 28-дневной стрессовой подвержена процедуре экспозиции. Группа животных, непредсказуемого которая хронического была умеренного стресса, демонстрировала усиление депрессивно-подобных реакций в тесте вынужденного плавания по сравнению с контролем, что согласуется с данными литературы о влиянии непредсказуемого хронического умеренного стресса на продолжительность времени иммобилизации в тесте вынужденного плавания [Willner, 2005; Darwish et al., 2013], и по направленности действия соответствует введению кортикостерона [Johnson et al., 2006]. Усиление депрессивно-подобного поведения может быть связано с уменьшением содержания 5-ОИУК, 5-ОТ и одновременным уменьшением его оборота в гиппокампе, поскольку все изученные антидепрессанты, независимо от кратности введения, проявляли антииммобилизационный эффект, который сопровождался усилением серотонинергической нейротрансмиссии в гиппокампе. Нейрохимические изменения, произошедшие под влиянием непредсказуемого хронического умеренного стресса, включали также повышение уровня всех моноаминов в гипоталамусе, и это, по-видимому, является последствием активации естественных защитно-адаптивных механизмов в ответ на хроническое воздействие стрессового фактора. Экспериментально показано, что острый стресс приводит к уменьшению содержания НА и увеличению его оборота [Reinstein et al., 1984; Hu et al., 2014], повышению уровня ДА, ДОФУК и 5-ОИУК в гипоталамусе у крыс [Hu et al., 2014]. Кроме того, известно, что в случае процедуры вынужденного плавания у интактных животных отмечается уменьшение содержания 5-HT и 143 НА в гипоталамусе, которое совпадает во времени с активацией гипоталамогипофизарно-надпочечниковой оси [Connor et al., 1997]. В нашей работе был получен частично обратный результат – увеличение уровня НА и уменьшение оборота 5-ОТ в гипоталамусе. Изменения, вызванные непредсказуемым хроническим умеренным стрессом, могут иметь важное значение в адаптационных механизмах, способствуя развитию толерантности к стрессовому фактору, а чрезмерно длительное воздействие стресса на организм может привести к срыву защитных систем и создать условия для формирования патологических состояний, таких как, например, депрессия, в условиях которой гипоталамогипофизарно-надпочечниковая ось патологически активирована [Femina et al., 2001; Vreeburg et al., 2009; Andreatini, 2012]. Одним из подтверждений этого предположения может служить тот факт, что частичная денервация голубого пятна за неделю до начала процедуры непредсказуемого хронического умеренного стресса приводит к усилению тревожного поведения у крыс в открытом поле [Häidkind et al., 2003]. 5-ОT также играет значимую роль в ответной реакции организма на стресс, оказывая стимулирующее воздействие на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось через 5-НТ1А- и 5-НТ2С-рецепторы, которые локализованы, в том числе, и в зонах головного мозга, задействованных в защитно-адаптационных механизмах, таких как миндалевидное тело, паравентрикулярное ядро гипоталамуса и гиппокамп [Heisler et al., 2007; Lanfumey et al., 2008]. По имеющимся экспериментальным данным, непредсказуемый хронический умеренный стресс оказывает существенное влияние на серотонинергическую нейротрансмиссию: уменьшает связывание 5-НТ1А- и вызывает гиперсенсибилизацию 5-НТ2С-рецепторов [Hill et al., 2012; Pitychoutisa et al., 2012], уменьшает уровень гиппокампального 5-ОТ [Li et al., 2003; Bekris et al., 2004; Kang et al., 2005; Gronli 2006], и это, по-видимому, объясняет повышение уровня серотонина во всех структурах, кроме гиппокампа, где был отмечен обратный эффект. Гиппокамп не случайно 144 выделяется среди изученных структур альтернативной направленностью содержания 5-ОТ, а именно его уменьшением. Можно предположить, что снижение уровня 5-ОТ сопряжено с процессом гиппокампального нейрогенеза, что фиксируют и при депрессии, и при хроническом стрессе, в т.ч. и непредсказуемом хроническом умеренном стрессе [Zhou et al., 2004; Gronli, 2006; Sahay and Hen, 2007; de Andrade et al., 2013; Mendez-David et al., 2013]. Вопрос о том, является ли это снижение нейрохимическим коррелятом компенсаторной активации процессов гиппокампального нейрогенеза или отражением нарушений этого процесса – предмет дальнейших исследований. Повышение содержания ДА во фронтальной коре и стриатуме на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса также находит подтверждение в литературе [Bekris et al., 2004]. В целом, происходящих умеренного выявленный под стресса, паттерн воздействием не повторяет нейрохимических непредсказуемого полностью ни одну изменений, хронического из раннее опубликованных экспериментальных работ, и это объясняется наличием большого количества разнообразных факторов: различиями в условиях содержания животных до начала процедуры непредсказуемого хронического умеренного стреса; различным набором, интенсивностью и последовательностью применения стрессовых факторов; использованием животных различных видов, линий и их гендерными особенностями [Azpiroz et al., 1999; Li et al., 2003; Westenbroek et al., 2003; Bekris et al., 2004; Hill et al., 2012; Darwish et al., 2013; Farhan et al., 2014; Javelot et al., 2014]. Острое введение флуоксетина приводило к повышению НА в стриатуме и уменьшению уровней 5-ОИУК и оборота 5-НТ во всех изученных структурах мозга, а также была отмечена тенденция к повышению 5-НТ в гипоталамусе, что согласуется с результатами, полученными при остром введении флуоксетина интактным животным [Kudrin et al., 2010; Wang et al., 2012]. Aмитриптилин после острого введения повышал уровень ДА в гиппокампе и стриатуме, 5-НТ в гипоталамусе, в то время как во 145 фронтальной коре и гиппокампе наблюдалась тенденция к повышению 5-НТ. Как и флуоксетин, амитриптилин уменьшал содержание 5-ОИУК во фронтальной коре, гипоталамусе и стриатуме, а также уменьшал оборот 5-НТ во всех структурах. Подобная активность в отношении серотонинергической нейротрансмиссии может быть объяснена способностью изучаемых препаратов ингибировать МАО-А [Fisar et al., 2010] или возможной «экономией» нейротрансмиттера в условиях нарушенного обратного захвата, но наиболее вероятной причиной таких изменений, скорее всего, является совокупность этих факторов. Изучаемые препараты, после острого введения, демонстрировали антидепрессивную активность в тесте вынужденного плавания, которая сопровождалась изменениями регистрируемых параметров, характерными для группы трициклических антидепрессантов и селективных ингибиторов обратного захвата серотонина [Page et al., 1999; Perona et al., 2008]. На фоне хронического введения изучаемых препаратов была отмечена интересная особенность – повышение уровня НА в гипоталамусе, которая отсутствовала при остром введении и наблюдалась после процедуры непредсказуемого хронического умеренного стресса у контрольной группы животных. Эти результаты согласуются с экспериментальными данными об индуцировании системы голубое пятно-норадреналин при стрессе после хронического, но не острого введения флуоксетина [Page et al., 1997]. Повидимому, в случае хронического введения имеет место феномен однонаправленного воздействия на организм непредсказуемого хронического умеренного стресса и изучаемых антидепрессантов, т.е. усиление активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси. Как известно, большинство антидепрессантов при хроническом введении усиливают процесс нейрогенеза в гиппокампе и эффект этот не обусловлен ни конкретной химической структурой, ни механизмом действия [Malberg et al., 2000; Wang et al., 2008]. Возможно, что хроническое введение амитриптилина и флуоксетина мягко потенцирует стресс-индуцированную нейродегенерацию, 146 активируя тем самым естественные защитно-адапативные механизмы, которые направлены на устранение последствий хронического стресса. По сути, речь идет о преодолении толерантности к воздействию непредсказуемого хронического умеренного стресса на организм, и такое действие антидепрессантов на ЦНС можно сравнить с процессом активной иммунизации, когда для успешного лечения или профилактики в организм искусственно вводят антигены с целью сенсибилизации иммунной системы. Активность амитриптилина и флуоксетина в отношении ДА нейротрансмиссии можно объяснить реципрокными взаимодействиями между нейромедиаторными системами [El Mansari et al., 2010] в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса. Следует учитывать и тот факт, что серотониновый переносчик может принимать активное участие в «поглощении» ДА в естественных условиях [Larsen et al., 2011], а НА транспортер – брать на себя функцию обратного захвата ДА в областях мозга, где отмечается пониженная плотность ДА транспортера [Moron et al., 2002]. По-видимому, в условиях нарушенного обратного захвата транспортеры моноаминов также могут участвовать в переносе не родственных им нейротрансмиттеров в область синапсов. Особого внимания заслуживает изменение оборота ДА по ДОФУК во фронтальной коре и гиппокампе. Под воздействием непредсказуемого хронического умеренного стресса наблюдалось уменьшение соотношения ДОФУК/ДА, а при хроническом введении антидепрессантов был отмечен обратный эффект – увеличение ДОФУК/ДА в изучаемых структурах после хронического введения ФЛК и тенденция в случае АМТ. Подобная динамика изменений в обороте ДА может быть отражением нейродегенеративных процессов, вызванных процедурой непредсказуемого хронического умеренного стресса, и последующей активации нейрогенеза под воздействием хронического введения флуоксетина и амитриптилина. Это предположение основано на экспериментальных данных о нейрохимических изменениях, вызываемых нейротоксином 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином у мышей. 147 Однократное введение этого вещества сопровождалось увеличением соотношения ДОФУК/ДА в гиппокампе [Капица и др., 2008], которое, повидимому, может свидетельствовать об увеличении числа митозов стволовых клеток в обозначенной структуре, которое является ответом на введение 1метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина. Амитриптилин и флуоксетин, при хроническом введении, сохраняли свою активность и соотношение регистрируемых параметров в тесте вынужденного плавания, но была отмечена тенденция к усилению антидепрессивного эффекта амитриптилина и его ослабление у флуоксетина после хронического введения. Тенденция к «угасанию» эффекта флуоксетина при длительном введении может быть связана с уменьшением уровня 5-НТ в гипоталамусе, т.к. во всех остальных случаях отмечалось его стойкое увеличение. Вероятно, 5-НТ в гипоталамусе играет важную роль в модуляции активности системы эндогенных нейростероидов, которые имеют точку приложения в паравентрикулярном ядре гипоталамуса и способны, в свою очередь, модулировать активность гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой оси [Gunn et al., 2011]. Известно, что флуоксетин может регулировать уровень позитивного ГАМК-модулятора аллопрегненалона в ЦНС [Griffin and Mellon, 1999; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006], который собственно и способен к взаимодействию с гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой осью в гипоталамусе [Gunn et al., 2011]. Связующим звеном между 5-НТ и системой эндогенных нейростероидов могут являться 5-НТ2С-рецепторы или другие подтипы 5-НТ2-рецепторов, которые задействованы в стимулирующем эффекте 5-ОТ на гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковую ось [Heisler et al., 2007] и, скорее всего, взаимодействие 5НТ на эти рецепторы не ограничивается стимулированием гипоталамогипофизарно-надпочечниковой оси, в динамике оно может принимать модулирующий характер. Данное предположение требует дальнейшего более прицельного изучения роли 5-НТ и его рецепторов в регуляции биосинтеза эндогенных нейростероидов. 148 Полученные результаты позволяют сделать вывод о сохранении активности амитриптилина и флуоксетина при длительном введении в сочетании с процедурой непредсказуемого хронического умеренного стресса. Антидепрессивный эффект изучаемых препаратов в тесте вынужденного плавания был сопряжен с усилением серотонинергической нейротрансмиссии, а именно с уменьшением метаболизма 5-НТ. В тоже время, можно предположить, что механизмы антидепрессивного эффекта изучаемых препаратов при остром и хроническом введении на фоне непредсказуемого хронического принципиальные отличия, умеренного которые стресса связаны могут с иметь взаимодействием антидепрессантов с гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой осью и/или системой эндогенных нейростероидов и требуют дальнейшего изучения. В частности, хроническое введение амитриптилина и флуоксетина имело одну общую особенность – увеличение НА в гипоталамусе, и по вектору действия такие изменения соответствовали непредсказуемому хроническому умеренному стрессу. Таким образом, хроническое введение изучаемых антидепрессантов, по-видимому, мягко потенцирует непредсказуемый хронический умеренный стресс и за счет активации естественных защитноадаптивных механизмов позволяет преодолеть толерантность, возникающую при длительном воздействии стресса. Следующая часть работы была посвящена изучению влияния блокады нейростероидогенеза на ориентировочно-исследовательское поведение у мышей линий BALB/C и C57BL/6. Результаты настоящего исследования, свидетельствующие об уменьшении параметров ориентировочно- исследовательской реакции у мышей обеих линий при внутрибрюшинном введении РК11195 или ингибиторов метаболизма прогестерона, согласуются с данными литературы об анксиогенных эффектах индометацина, финастерида, РК11195 у грызунов в условиях теста «открытое поле», приподнятого крестообразного лабиринта, при оценке реакции замирания и зоосоциальных взаимодействий при введении блокаторов 149 нейростероидогенеза непосредственно в структуры мозга (гиппокамп и область внетромедиальной покрышки) [Kalinin, 2011; Longone et al., 2011]. При системном введении РК11195, трилостана, индометацина или финастерида регистрировали ингибирование анксиолитических свойств селективных лигандов TSPO этифоксина и эмапунила [MacKenzie and Maguire, 2013; Ugale et al., 2007]. Представленные в литературе данные о влиянии экзогенного прегненолона или его сульфатов на уровень тревожности в эксперименте in vivo не однозначны, поскольку сообщается как об анксиолитическом [Melchior and Ritzmann, 1994; Reddy and Kulkarni, 1997], так и анксиогенном действии предшественника нейростероидов [Melchior and Ritzmann, 1994]. Имеются данные о том, что сульфатные производные прегненолона и дигидроэпиандростерона являются антагонистами ГАМКА-рецепторов и/или агонистами глутаматных NMDA-рецепторов [Sedlácek et al., 2008], что может объяснять анксиогенные эффекты при системном применении прегненолона. В нашем эксперименте прегненолон не только не обнаруживал анксиолитического действия на фоне применения финастерида, но даже усиливал ингибирующее влияние последнего на ориентировочно- исследовательскую реакцию мышей BALB/C. Одной из объяснений этих результатов может состоять в том, что ингибирование 5α-редуктазы приводит к увеличению содержания прогестерона, и введение прегненолона при этом может смещать соотношение нейростероидов в мозге в сторону преобладания ГАМКА-негативных метаболитов прегненолона. Фармакологическая мишень TSPO уже стала основой для создания оригинальных психотропных средств. В настоящее время в клинической практике применяется этифоксин (стрезам) с анксиолитическими и противосудорожными свойствами. Однако данный препарат, производное бензоксазина, связывается не только с TSPO, но и с небензодиазепиновым сайтом ГАМКА-рецептора [Longone et al., 2011; Micallef et al., 2001; Servant et al., 1998]. В клинических исследованиях изучают лиганд TSPO производное 150 ацетамида XBD173 (эмапунил, ранее – AC-5216), проявивший анксиолитический эффект при панических атаках, свободный от седативного действия и не вызывающий, по предварительным данным, зависимости [Rupprecht et al., 2009]. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что снижение активности основных ферментов метаболизма прогестерона ведет к подавлению исследовательской активности у мышей независимо от фенотипа ответа на эмоциональный стресс, поэтому поиск путей фармакологической коррекции биотрансформации прогестерона, направленных на образование ГАМКА-позитивных нейростероидов, следует рассматривать в качестве актуального направления для создания оригинальных анксиолитиков, превосходящих известные, в частности бензодиазепины и ингибиторы обратного захвата серотонина, по селективности эффекта и скорости его достижения. На фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса введение финастерида сопровождалось снижением тревожных реакций, а использование его комбинации с флувоксамином усиливало этот эффект. Причина инверсии эффекта финастерида может быть связана с механизмом действия препарата – ингибированием активности фермента 5α-редуктазы. С одной стороны, такая активность финастерида, казалось бы, должна рассматриваться в качестве положительной, однако с другой – может быть индикатором усугубления стресса. Для объяснения такой точки зрения следует обратиться к самой процедуре непредсказуемого хронического умеренного стресса. Проведенный интересную особенность – при анализ литературы определенных выявил условиях одну процедура непредсказуемого хронического умеренного стресса приводила к так называемому «аномальному анксиолизису» у грызунов [D’Aquila et al., 1994; Ducottet et al., 2003; Schweizer et al., 2009]. Во всех зарегистрированных случаях «аномального анксиолизиса», которые встречаются в литературе, можно обнаружить одну общую особенность – продолжительность 151 стрессовой экспозиции в представленных работах составляла от 5 до 9 недель, что значительно превышает таковую в нашей работе (3 недели). Повидимому, после 4 недель стрессовой экспозиции в организме происходят значительные изменения, которые и приводят к аномальному поведению. Одним из таких изменений может быть снижение экспрессии генов фермента 5α-редуктазы. Данное предположение небезосновательно, поскольку хорошо известно, что хронический изоляционный стресс оказывает селективное подавляющее действие в отношении 5α-редуктазы [Bortolato et al., 2011]. Вместе с этим, в литературе не описаны случаи, когда бы изоляционный стресс приводил к «аномальному анксиолизису», и это объяснимо. Если предположить, что не специфика стресса, а его продолжительность являются ключевым фактором для изменения активности 5α-редуктазы, то гипотеза о подавлении активности этого фермента под действием непредсказуемого хронического умеренного стресса представляется вполне логичной. Сам по себе непредсказуемый хронический умеренный стресс, в отличие от изоляционного, не обладает селективным действием в отношении 5αредуктазы, а приводит к целому ряду нейробиологических изменений [Hill et al., 2012]. Ингибирование 5α-редуктазы приводит к нарушению нескольких метаболических путей, одним из которых является нейростероидогенез, а точнее реакция восстановления прогестерона до 5α-дигидропрогестерона, блокада которой ведет к накоплению прогестерона и его предшественника – прегенолона в ЦНС. Ранее нами было показано, что совместное введение прегненолона и финастерида в условиях физиологической нормы усиливает тревожные реакции по сравнению с чистым финастеридом, и это, повидимому, обусловлено избыточным образованием ГАМКА-негативных нейростероидов. В условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса, скорее всего, биохимический результат не отличается, следовательно, изменения может претерпевать ГАМКА-рецептор, который склонен к изменению субъединичного состава и такие изменения имеют место при формировании толерантности к ГАМКА-позитивным 152 нейростероидам [Birzniece et al., 2006]. Возможно, что в условиях чрезмерно длительного стресса происходит истощение ресурсов организма и ГАМКергическая система, как одно из связующих звеньев между стрессзависимыми системами, подвергается функциональной перестройке [Holm et al., 2011; Maguire, 2014]. Подобные предположения требуют дальнейших исследований. При совместном введении флувоксамин и финастерида было отмечено усиление анксиолитического эффекта финастерида, похожий результат был получен при применении комбинации финастерида с другим агонистом сигма-1-рецепторов – афобазолом [Kalinina and Shimshirt, 2015], но при этом усиливалось анксиогенное действие препарата, поскольку эксперимент проходил в условиях физиологической нормы. По-видимому, в данной ситуации может иметь место участие сигма-1-рецепторов в ранних стадиях нейростероидогенеза, и в конечном результате механизм этого усиления напоминает таковой при совместном применении прегненолона и финастерида. В отличие от «открытого поля» РК11195 не вызывал поведенческих изменений в тесте закапывания шариков у мышей линий BALB/C и С57BL/6, что говорит о независимости компульсивного поведения мышей представленных линий от функциональной активности TSPO в данном тесте. РК11195 также не изменял антикомпульсивную активность ГИЖ-72 и референтных препаратов – флувоксамина и флуоксетина, в отличие от теста вынужденного плавания, где РК11195 устранял антидепрессивный эффект флуоксетина и усиливал депрессивно-подобные реакции при совместном введении с ГИЖ-72. Такая активность РК11195 свидетельствует о принципиально разных механизмах антидепрессивного и анксиолитического эффектов препаратов из группы СИОЗС, а также о различиях в нейробиологических механизмах реакции животных на стресс в тесте «открытое поле» и тесте закапывания шариков. 153 Финастерид (5 мг/кг) ингибировал компульсивное поведение мышей обеих линий, причем мыши линии BALB/C оказались более чувствительны к препарату, нежели C57BL/6. Результаты настоящего исследования не согласуются с немногочисленными данными об активности финастерида в тесте закапывания шариков, согласно которым финастерид в дозе 50 мг/кг не изменяет компульсивное поведение швейцарских мышей (Swiss mice), а на фоне иммобилизационного стресса его усиливает [Umathe et al., 2007]. Первое, на что следует обратить внимание при сравнении результатов – использование swiss mice в работе Umathe и соавторов, которое может объяснять результаты отличные от наших, поскольку на примере двух линий отчетливо видно, что существуют различия в глубине эффекта финастерида, и неизвестно изменял бы препарат уровень тревожности, например, у беспородных мышей. Второй важный момент – выбор дозы, несмотря на отсутствие литературных данных Umathe и соавторами была выбрана достаточно высокая доза – 50 мг/кг, хотя следовало изучить диапазон доз, как это было сделано для других исследуемых соединений и активного контроля – флуоксетина [Umathe et al., 2007]. Таким образом, сопоставление результатов настоящего исследования и данных Umathe и соавторов не совсем корректно по причине различий в дозе и подопытных животных. В условиях метода лекарственной дифференцировки ГИЖ-72 не изменял интероцептивные эффекты коразола, а заместительном тесте условнорефлекторное поведение, ассоциированное с введением ГИЖ-72, соответствовало инъекции физиологического раствора, что отличает ГИЖ-72 от всех известных положительных лигандов модуляторных сайтов ГАМК А рецепторов [Jung, установленных при 2002]. Учитывая сопоставлении высокую корреляцию результатов, данных, полученных при использовании оперантных методов лекарственной дифференцировки и методов рецепторного связывания [Buccafusco, 2009], можно предположить, что соединение ГИЖ-72 не является лигандом ГАМКА-рецепторов. 154 ЗАКЛЮЧЕНИЕ При исследовании влияния продолжительности острого плавательного стресса на антидепрессивный эффект флуоксетина в тесте вынужденного плавания установлено, что флуоксетин обнаруживал активность только после 5-мин предварительной посадки. Взаимосвязь между антидепрессивным эффектом препарата и продолжительностью предварительной посадки может быть обусловлена рядом причин, в том числе и активностью флуоксетина в отношении энзимов de nova биосинтеза нейростероидов в ЦНС. Учитывая, что флуоксетин наряду с другими представителями СИОЗС широко применяется в качестве референтного препарата при исследовании антидепрессивной активности, в т.ч. новых соединений, выявленная закономерность обосновывает необходимость использования модифицированной модели теста вынужденного плавания у мышей, которая включает сеанс предварительного плавания продолжительностью 5-10 мин. ГИЖ-72 обладал дозозависимым продепрессивным эффектом в тесте вынужденного плавания у мышей, что может указывать на возможный серотонинергический компонент в механизме психотропной активности этого соединения, поскольку схожая дозозависимая активность характерна для флуоксетина и буспирона. Однако по структуре поведенческих реакций продепрессивно-подобный эффект ГИЖ-72 отличается от такового у флуоксетина и может быть также связан с изменением дофаминергической нейротрансмиссии. Так или иначе, полученные результаты обосновывают необходимость изучения активности ГИЖ-72 в отношении моноаминергической системы (главным образом серотонинергической и дофаминергической) головного мозга с целью описания молекулярных механизмов действия данного соединения. В условиях модели НХУС ТЦА амитриптилин и СИОЗС флуоксетин обладали различной динамикой антидепрессивной активности в тесте вынужденного плавания. Так, флуоксетин при субхроническом введении в условиях 14-дневного НХУС обнаруживал инверсию эффекта в сторону 155 усиления депрессивных реакций, а при однократном введении в условиях стрессовой экспозиции той же продолжительности был неэффективен. Амитриптилин, напротив, демонстрировал антидепрессивную активность независимо от кратности введения и продолжительности стрессовой экспозиции. Различия в активности амитриптилина и флуоксетина в условиях стрессовой экспозиции указывают на вовлечение в механизм реализации антидепрессивного эффекта СИОЗС стресс-зависимых систем – системы эндогенных нейростероидов и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси. Антидепрессивный эффект амитриптилина и флуоксетина в тесте вынужденного плавания был сопряжен с усилением серотонинергической нейротрансмиссии, а именно с уменьшением метаболизма 5-НТ. В то же время, можно предположить, что механизмы антидепрессивного эффекта изучаемых препаратов при остром и хроническом введении на фоне НХУС могут иметь принципиальные отличия, которые связаны с взаимодействием антидепрессантов с гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой осью и/или системой эндогенных нейростероидов и требуют дальнейшего изучения. В частности, хроническое введение амитриптилина и флуоксетина имело одну общую особенность – увеличение НА в гипоталамусе, и по вектору действия такие изменения соответствовали НХУС. Таким образом, хроническое введение изучаемых антидепрессантов, по-видимому, мягко потенцирует адаптивную реакцию организма на стресс и за счет активации естественных защитно-адаптивных механизмов позволяет преодолеть толерантность, возникающую при длительном воздействии стресса. ГИЖ-72 проявлял выраженный антагонизм в отношении ДМСО, что, во-первых, может указывать на наличие у ГИЖ-72 нейропротективной активности, а во-вторых – на вовлечение в механизм психотропной активности изучаемого соединения глутаматных метаботропных рецепторов предположительно GluN1 и GluN2. Так или иначе, представленные 156 результаты делают актуальным изучение нейропротективных свойств ГИЖ72 и роли глутаматных метаботропных рецепторов в механизме его действия. ГИЖ-72 обладал анксиолитическим эффектом в тестах «открытое поле», «черно-белая камера», «гипонеофагия» и тесте закапывания шариков, причем в первом случае эффект сохранялся через 24 ч после однократного и хронического введения соединения в условиях НХУС, что говорит об отсутствии у ГИЖ-72 синдрома отмены, характерного для анксиолитиков бензодиазепинового ряда и СИОЗС. Анксиолитический эффект ГИЖ-72 в тесте «открытое поле» по своей структуре отличался от эффектов диазепама и афобазола, а по направленности – от флуоксетина, что свидетельствует о различиях в механизмах действия ГИЖ-72 и референтных препаратов. Способность ГИЖ-72 ослаблять тигмотаксис указывает на определенное сходство с анксиолитиком буспироном. Кроме того, при субхроническом введении в условиях НХУС была отмечена инверсия анксиолитического эффекта ГИЖ-72 в тесте «открытое поле». Зависимость противотревожного действия ГИЖ-72 от стресса указывает на определенное сходство ГИЖ-72 с антидепрессантами из группы СИОЗС, для которых характерна подобная динамика в условиях НХУС. Опираясь на полученные результаты, можно сделать вывод о возможной эффективности ГИЖ-72 в фармакотерапии тревожных расстройств, обусловленных стрессовыми ситуациями, и отсутствии у изучаемого соединения синдрома отмены. Как упоминалось выше, ГИЖ-72 обладал антикомпульсивной активностью в тесте закапывания шариков, которая усиливалась при длительном введении в условиях НХУС, тогда как эффект флувоксамина претерпевал инверсию. Выраженная активность и стойкий антикомпульсивный эффект ГИЖ-72 в тесте закапывания шариков могут являться прогностическими признаками эффективности ГИЖ-72 в терапии обсессивно-компульсивного расстройства. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что снижение активности ферментов метаболизма прогестерона, а именно 5α-редуктазы и 157 3α-гидрокистероид дегидрогеназы, ведет к подавлению ориентировочноисследовательской реакции у мышей независимо от эмоционального фенотипа, поэтому поиск путей фармакологической коррекции биотрансформации прогестерона, направленных на образование ГАМК Апозитивных нейростероидов, следует рассматривать в качестве актуального направления для создания оригинальных анксиолитиков, превосходящих известные, в частности бензодиазепины и ингибиторы обратного захвата серотонина, по селективности эффекта и скорости его достижения. В отличие от исследовательской активности, компульсивное поведение мышей линий BALB/C и С57BL/6 ингибировалось только введением финастерида, селективно подавляющего активность фермента 5α-редуктазы, что свидетельствует о разных механизмах, лежащих в основе формирования тревожных реакций в тесте закапывания шариков и тесте «открытое поле». При сравнении роли фенотипа эмоционального ответа на стресс в подавлении компульсивного поведения было выявлено, что мыши линии С57BL/6 оказались более чувствительными к введению финастерида, чем BALB/C. Таким образом, механизмы формирования тревожного поведения в тесте закапывания шариков и тесте «открытое поле» имеют разный механизм, а сами тесты не могут быть рассмотрены в качестве эквивалентных при изучении анксиолитической активности фармакологических агентов. В условиях модели НХУС финастерид проявлял анксиолитические свойства в тесте «открытое поле», которые, по-видимому, связаны с изменением экспрессии генов фермента 5α-редуктазы в условиях длительной стрессовой экспозиции. Вместе с этим, комбинированное введение финастерида и флувоксамина, но не ГИЖ-72, приводило к потенцированию анксиолитического эффекта финастерида. Подобное взаимодействие обусловлено активностью флувоксамина в отношении сигма-1-рецепторов и подчеркивает важную роль последних в процессе нейростероидогенеза, поскольку свидетельствует об избыточном накоплении промежуточных 158 продуктов метаболизма прогестерона в ЦНС в условиях ингибирования 5αредуктазы – одного из ключевых ферментов данного процесса. С другой стороны, полученные данные также являются убедительным доказательством отсутствия лигандных взаимодействий ГИЖ-72 и сигма-1-рецепторов по типу агониста. При изучении роли системы эндогенных нейростероидов в реализации психотропных эффектов флуоксетина и ГИЖ-72 было установлено, что антидепрессивный, но не анксиолитический эффект флуоксетина полностью устраняется при функциональной блокаде TSPO. В то же время, совместное введение РК11195 и ГИЖ-72 приводило к усилению депрессивных реакций у мышей в тесте предположить, вынужденного что плавания. антидепрессивный и Таким образом, анксиолитический можно эффекты флуоксетина имеют различные молекулярные механизмы: первый может быть связан с повышением уровня аллопрегнанолона, а второй – с усилением серотонинергической нейротрансмиссии. Депрессивно-подобное действие ГИЖ-72 в комбинации с РК11195 может говорить об однонаправленном действии изучаемых соединений, о чем косвенно свидетельствует и сходство в их химическом строении. Результаты, полученные на оперантной модели лекарственной дифференцировки, позволяют судить об отсутствии у ГИЖ-72 свойств лигандов позитивных сайтов ГАМКА-рецепторов. 159 ВЫВОДЫ 1. ГИЖ-72 (20 мг/кг) и ГМАЛ-24 (10 мг/кг) не обладают антидепрессивной активностью в тесте вынужденного плавания у мышей при субхроническом введении в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса (НХУС). Амитриптилин (10 мг/кг) и флуоксетин (20 мг/кг) сохраняют антидепрессивный эффект при хроническом введении в условиях НХУС, однако эффект флуоксетина (20 мг/кг) при субхроническом введении в тех же условиях претерпевает инверсию. 2. Антидепрессивный эффект амитриптилина (10 мг/кг) и флуоксетина (20 мг/кг) после однократного и хронического введения в условиях НХУС сопровождается уменьшением оборота серотонина гиппокампе. В тоже время, при хроническом введении этих антидепрессантов уровень норадреналина в гипоталамусе был значительно повышен. 3. ГИЖ-72 (20 мг/кг) обладает анксиолитическим эффектом в тестах «открытое поле» и «черно-белая камера», который сохраняется через 24 ч после введения, а также при хроническом введении и его отмене в условиях НХУС. ГМАЛ-24 (10 мг/кг) проявляет анксиолитическую активность в тесте «открытое поле» только после субхронического введения в условиях НХУС. 4. ГИЖ-72 (20 мг/кг) обладает антикомпульсивной активностью в тесте закапывания шариков, которая усиливается при хроническом введении в условиях НХУС в отличие от флувоксамина (25 мг/кг), для которого характерна инверсия антикомпульсивного эффекта. ГМАЛ-24 (10 мг/кг) обнаруживает антикомпульсивную активность только после субхронического введения в условиях НХУС. 5. Компульсивное поведение мышей подавляется только при селективном ингибировании 5α-редуктазы и в большей степени у мышей линии С57BL/6, в то время как подавление активности всех основных ферментов метаболизма прогестерона в ЦНС ведет к ингибированию 160 ориентировочно-исследовательской реакции у мышей независимо от фенотипа эмоциональной реакции на стрессовые события 6. Антидепрессивный эффект флуоксетина (20 мг/кг) в тесте вынужденного плавания полностью устраняется при селективной блокаде TSPO, ГИЖ-72 (20 мг/кг) в тех же условиях демонстриует усиление депрессивно-подобных реакций, однако антикомпульсивное действие обоих соединений не зависит от функциональной активности TSPO. 7. ГИЖ-72 (20 мг/кг) не ингибирует интероцептивные эффекты коразола при использовании оперантного метода лекарственной дифференцировки, что свидетельствует об отсутствии у ГИЖ-72 свойств позитивного модулятора ГАМКА-рецептора. 161 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Результаты настоящего исследования позволяют рекомендовать ГИЖ-72 для расширенного экспериментального изучения с целью дальнейшей разработки на его основе перспективного лекарственного средства для лечения обсессивно-компульсивного расстройства. 2. При проведении скрининга антидепрессивной активности в тесте вынужденного плавания на мышах с использованием в качестве референтных препаратов селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС), необходимо проводить процедуру предварительного плавания продолжительностью 5 мин за 24 ч до теста. 3. Выявленная зависимость эффектов флуоксетина и флувоксамина от продолжительности стрессовой экспозиции делает целесообразным клиническое изучение роли стрессовых факторов в резистентности к терапии СИОЗС и случаях обострения тревожной/депрессивной симптоматики на фоне фармакотерапии антидепрессантами этой группы. 162 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3-МТ – 3-метокситирамин 5-НТ - серотонин 5-ОИУК – 5-оксииндолуксусная кислота BDNF – мозговой нейротрофический фактор АД – артериальное давление АКТГ – адренокортикотропный гормон ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГВК – гомованилиновая кислота ДА - дофамин ДМСО – диметилсульфоксид ДОФУК – диоксифенилуксусная кислота иМАО – ингибиторы моноаминоксидазы ИОЗНД – ингибиторы обратного захвата норадреналина и дофамина ИОЗСН – ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина ИТ – индекс тревожности Коир – коэффциент ориентировочно-исследовательской реакции ЛкД – лекарственная дифференцировка МАО-А – моноаминоксидаза типа А МАО-В – моноаминоксидаза типа В TSPO – митохондриальный транслокационный белок НА - норадреналин НХУС – непресдказуемый хронический умеренный стресс СИОЗС – селективные ингибиторы обратного захвата серотонина ТЦА – трициклические антидепрессанты 163 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Воронина, Т.А. Методические рекомендации по доклиническому изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия лекарственных средств [текст] / Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, М.А. Яркова, М.В. Воронин // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, - 2012. – С. 264. 2. Калинина, Т.С. Дифференцировочные стимульные свойства феназепама и лоразепама: специфичность и роль ГАМКА-рецепторов [текст] / Т.С. Калинина, Т.А. Воронина, Е.В. Петрянина // Экспер. и клин. фармакол. – 2008. – 71(1). – С. 3-7. 3. Капица, И.Г. Изучение зависимости между степенью олигокинезии, вызванной нейротоксином 1-метил-4-фенил-1,2,3,6- тетрагидропиридином, и нейрохимическими изменениями в структурах мозга мышей C57Bl/6 [текст] / И.Г. Капица, Т.С. Калинина, Л.Н. Неробкова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – 146(7). – С. 58-61. 4. Королев, А.О. Сравнительное изучение дифференцировочных стимульных свойств антидепрессантов [текст] / А.О. Королев, Т.С. Калинина, А.В. Волкова [и др.] // Экспер. и клин. фармакол. – 2014. – 77(7). – С. 3-7. 5. Кудрин, В.С. Влияние амитриптилина, флуоксетина и тианептина на содержание моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс [текст] / В.С. Кудрин, В.М. Мосин, П.М. Клодт [и др.] // Экспер. и клин. фармакол. – 2010. – 73(3). – С.7-10. 6. Мелетова, О.К. Изучение нейротропной активности производных пиразоло [C]пиридина и родственных соединений: дис. … канд. биол. наук: 14.00.25 / Мелетова Ольга Константиновна. – М., 2007. – 158 с. 164 7. Островская, Р.У. нейролептической Методические активности рекомендации лекарственных по средств изучению / Р.У. Островская, К.С. Раевский, Т.А. Воронина и др. [текст] // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, - 2012. – С. 251 8. Середенин, С.Б. Рецепция н3 диазепама в мозге инбредных животных с различной реакцией на эмоциональный стресс [текст] / С.Б. Середенин, М.А. Яркова, М.В. Воронин // Экспер. и клин. фармакол. – 2001. – 1. – С. 63-65. 9. Середенин, С.Б. Патент 2472795 РФ. 2-замещенные-1,2,4,5-тетрагидро3h-пирроло[1,2-a][1,4]диазепин-3-оны / С.Б. Середенин, Г.В. Мокров, Г.М. Молодавкин [и др.]; заявитель и патентообладатель Москва. Науч.-исслед. ин-т фармакологии имени В.В. Закусова. Заявл. 20.05.11; опубл. 20.01.13. 10.Шимширт, А.А. Изучение влияния диазепама на тревожные реакции у мышей, вызванные индометацином [текст] / А.А. Шимширт, Т.С. Калинина, Т.А. Воронина // Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – 1(11). – С. 45-47. 11.Abdelkefi, A. Severe neurotoxicity associated with dimethyl sulphoxide following PBSCT [text] / A. Abdelkefi, A. Lakhal, N. Moojat [et al.] // Bone Marrow Transplant. – 2009. – 44(5). – P. 323-400. 12.Albelda, N. Animal models of obsessive-compulsive disorder: exploring pharmacology and neural substrates [text] / N. Albelda and D. Joel // Neurosci. Biobehav. Rev. – 2012. – 36(1). – P. 47-63. 13.Anacker, C. Glucocorticoid-related molecular signaling pathways regulating hippocampal neurogenesis [text] / C. Anacker, A. Cattaneo, A. Luoni [et al.] // Neuropsychopharmacology. – 2013. – 38(5). – P. 872-883. 14.Anacker, C. Role for the kinase SGK1 in stress, depression, and glucocorticoid effects on hippocampal neurogenesis [text] / C. Anacker, A. 165 Cattaneo, K. Musaelyan [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2013. – 110(21). – P. 8708-8713. 15.Andreatini, R. Depression and the hypothalamic-pituitary-adrenal axis: increasing the scope [text] / R. Andreatini // Acta Neuropsychiatrica. – 2012. – 24. – P. 1-3. 16.Anttila, S.A. A review of the pharmacological and clinical profile of mirtazapine [text] / S.A. Anttila and E.V. Leinonen // CNS Drug Rev. – 2001. – 7(3). – P. 249-264. 17.Ardayfio, P. Anxiogenic-like effect of chronic corticosterone in the lightdark emergence task in mice [text] / P. Ardayfio and K.S. Kim // Behav. Neurosci. – 2006. –120(2). – P. 249-256. 18.Arias, H.R. Functional and Structural Interaction of (-)-Reboxetine with the Human α4β2 Nicotinic Acetylcholine Receptor [text] / H.R. Arias., N.B. Fedorov, L.C. Benson [et al.] // Pharmacol. Exp. Ther. – 2013. – 344. – P. 113-123. 19.Arias, H.R. (-)-Reboxetine inhibits muscle nicotinic acetylcholine receptors by interacting with luminal and non-luminal sites [text] / H.R. Arias, M.O. Ortells, D. Feuerbach // Neurochem. Int. – 2013. – 63(5). – P. 423-431. 20.Artaiz, I. Characterization of serotonergic mechanism involved in the behavioural inhibition induced by 5-hydroxytryptophan in a modified lightdark test in mice [text] / I. Artaiz, A. Zazpe, J. del Rio // Behav. Pharmacol. – 1998. – 9. – P. 103–112. 21.Au, E. Adult cortical neurogenesis: nuanced, negligible or nonexistent? [text] / E. Au and G. Fishell // Nat. Neurosci. – 2006. – 9. P. 1086-1089. 22.Auclair, A.L. Levomilnacipran (F2695), a norepinephrine-preferring SNRI: profile in vitro and in models of depression and anxiety [text] / A.L. Auclair, J.C. Martel, M.B. Assie [et al.] // Neuropharmacology. – 2013. – 70. P. 338347. 166 23.Autry, A.E. Brain-derived neurotrophic factor and neuropsychiatric disorders [text] / A.E. Autry and L.M. Monteggia // Pharmacol. Rev. – 2012. – 64(2). – P. 238-258. 24.Azpiroz, A. Effects of chronic mild stress (CMS) and imipramine administration, on spleen mononuclear cell proliferative response, serum corticosterone level and brain norepinephrine content in male mice [text] / A. Azpiroz, E. Fano, L. Garmendia [et al.] // Psychoneuroendocrinology. – 1999. – 24(3). – P. 345-361. 25.Bäckström, T. Allopregnanolone and mood disorders [text] / T. Bäckström, M. Bixo, M. Johansson [et al.] // Prog. Neurobiol. – 2014. – 113. – P. 88-94. 26.Balakin, K.V. In Silico Approaches to Prediction of Aqueous and DMSO Solubility of Drug-Like Compounds: Trends, Problems and Solutions [text] / K.V. Balakin, N.P. Savchuk, I.V. Tetko [et al.] // Curr. Med. Chem. – 2006. – 13(2). – P. 223-241. 27.Bali, A. Multifunctional aspects of allopregnanolone in stress and related disorders [text] / A. Bali and A.S. Jaggi // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2014. – 48. – P. 64-78. 28.Balsara, J.J. Effects of the antidepressant trazodone, a 5-HT 2A/2C receptor antagonist, on dopamine-dependent behaviors in rats [text] / J.J. Balsara, S.A. Jadhav, R.K. Gaonkar [et al.] // Psychopharmacology (Berl). – 2005. – 179(3). – P. 597-605. 29.Bauwens, D. Recurrent seizure and sustained encephalopathy associated with dimethylsulfoxide-preserved stem cell infusion [text] / D. Bauwens, P. Hantson, P.F. Laterre [et al.] // Leuk. Lymphoma. – 2005. – 46. – P. 16711674. 30.Beauchamp, M.H. Neurosteroids and reward: allopregnanolone produces a conditioned place aversion in rats [text] / M.H. Beauchamp, B.K. Ormerod, K. Jhamandas [et al.] // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2000. – 67. – P. 2935 167 31.Bekris, S. Behavioural and neurochemical effects induced by chronic mild stress applied to two different rat strains [text] / S. Bekris, K. Antoniou, S. Daskas, Z. Papadopoulou-Daifoti // Behav. Brain. Res. – 2005. – 161(1). – P. 45-49. 32.Belelli, D. Neurosteroids: endogenous regulators of the GABA(A) receptor [text] / D. Belelli and J.J. Lambert // Nat. Rev. Neurosci. – 2005. – 6(7). – P. 565-575. 33.Bermack, J.E. Modulation of serotonergic neurotransmission by short- and long-term treatments with sigma ligands [text] / J.E. Bermack and G. Debonnel // Br. J. Pharmacol. – 2001. – 134(3). – P. 691-699. 34.Bermack, J.E. The role of sigma receptors in depression [text] / J.E. Bermack and G. Debonnel // J. Pharmacol. Sci. – 2005. – 97(3). – P. 317336. 35.Betry, C. Role of 5-HT3 Receptors in the Antidepressant Response [text] / C. Betry, A. Etiévant, C. Oosterhof [et al.] // Pharmaceuticals. – 2011. – 4(4). – P. 603-629. 36.Betti, L. alpha(1)-Adrenoceptor antagonists. Rational design, synthesis and biological evaluation of new trazodone-like compounds [text] / L. Betti, M. Botta, F. Corelli [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2002. – 12(3). – P. 437-440. 37.Birzniece, V. GABA(A) receptor changes in acute allopregnanolone tolerance [text] / V. Birzniece, S. Turkmen, C. Lindblad [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2006. – 535. – P. 125-134. 38.Boileau, B. A review of obsessive-compulsive disorder in children and adolescents [text] / B. Boileau // Dialogues Clin. Neurosci. – 2011. – 13(4). – P. 401-411. 39.Borsini, A. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis [text] / A. Borsini, P.A. Zunszain, S. Thuret, C.M. Pariante // Trends Neurosci. – 2015. – 38(3). – P. 145-157. 168 40.Borsini, F. Discovery of antidepressant activity by forced swimming test may depend on pre-exposure of rats to a stressful situation [text] / F. Borsini, A. Lecci, R. Sessarego [et al.] // Psychopharmacology (Berl.). – 1989. – 97. P.183-188. 41.Borsini, F. Do animal models of anxiety predict anxiolytic-like effects of antidepressants? [text] / F. Borsini, J. Podhorna, D. Marazziti // Psychopharmacology (Berl). – 2002. – 163(2). – P. 121-141. 42.Borsini, F. Models for depression in drug screening and preclinical studies: Future directions [text] / F. Borsini // World. J. Pharmacol. – 2012. – 1(1). – P.21-29. 43.Bortolato, M. Isolation rearing-induced reduction of brain 5α-reductase expression: relevance to dopaminergic impairments [text] / M. Bortolato, P. Devoto, P. Roncada [et al.] // Neuropharmacology. – 2011. – 60(7-8). – P. 1301-1308. 44.Bourin, M. The mouse light/dark box test [text] / M. Bourin and M. Hascoët // Eur. J. Pharmacol. – 2003. – 463(1-3). P. 55-65. 45.Bremner, J.D. Hippocampal volume reduction in major depression [text] / J.D. Bremner, M. Narayan, E.R. Anderson [et al.] // Am. J. Psychiatry. – 2000. – 157. – P. 115-118 46.Breton, J. Impact of Cytokines on Neural Stem/ Progenitor Cell Fate [text] / J. Breton and Y. Mao-Draayer // J. Neurol. Neurophysiol. – 2011. – S4. 47.Bridge, J.A. Clinical Response and Risk for Reported Suicidal Ideation and Suicide Attempts in Pediatric Antidepressant Treatment: A Meta-analysis of Randomized Controlled Trials [text] / J.A. Bridge, S. Iyengar, C.B. Salary [et al.] // JAMA. – 2007. – 297. – P. 1683-1696. 48.Bruins Slot, L.A. Effects of antipsychotics and reference monoaminergic ligands on marble burying behavior in mice [text] / L.A. Bruins Slot, L. Bardin, A.L. Auclair [et al.] // Behav. Pharmacol. – 2008. – 19(2). – P. 145152. 169 49.Buccafusco, J.J. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience / J.J. Buccafusco, editor. 2nd edition. Boca Raton (FL): CRC Press. 2009. 50.Bull, S.J. Functional polymorphisms in the interleukin-6 and serotonin transporter genes, and depression and fatigue induced by interferon-alpha and ribavirin treatment [text] / S.J. Bull, P. Huezo-Diaz, E.B. Binder [et al.] // Mol. Psychiatry. – 2009. – 14(12). – P. 1145. 51.Carpenter, L.L. Dex/CRH test cortisol response in outpatients with major depression and matched healthy controls [text] / L.L. Carpenter, N.S. Ross, A.R.Tyrka [et al.] // Psychoneuroendocrinology. – 2009. – 34. – P. 12081213. 52.Castagne, V. Early Behavioral Screening for Antidepressants and Anxiolytics [text] / V. Castagne , R.D. Porsolt, P. Moser // Drug development and research. – 2006. – 67. – P. 729-742. 53.Castrén, E. The role of BDNF and its receptors in depression and antidepressant drug action: Reactivation of developmental plasticity [text] / E. Castrén and T. Rantamäki // Dev. Neurobiol. – 2010. – 70(5). – P. 289297. 54.Chadwick, W. Amitriptyline-mediated cognitive enhancement in aged 3×Tg Alzheimer's disease mice is associated with neurogenesis and neurotrophic activity [text] / W. Chadwick, N. Mitchell, J. Caroll [et al.] // PLoS One. – 2011. – 6(6). – P. e21660. 55.Chatterjee, M. Comparative evaluation of forced swim test and tail suspension test as models of negative symptom of schizophrenia in rodents [text] / M. Chatterjee, M. Jaiswal, G. Palit // ISRN Psychiatry. – 2012: Article ID 595141. 56.Chen, Y. Rapid loss of dendritic spines after stress involves derangement of spine dynamics by corticotropin-releasing hormone [text] / Y. Chen, C.M. Dubé, C.J. Rice, T.Z. Baram // J. Neurosci. – 2008. – 28(11). – P. 29032911. 170 57.Chinuck, R.S. Appetite stimulants in cystic fibrosis: a systematic review [text] / R.S. Chinuck, H. Fortnum, D.R. Baldwin // Journal of Human Nutrition and Dietetics : the Official Journal of the British Dietetic Association. – 2007. – 20(6). – P. 526-537 58.Christian, K.M. Chronic stress-induced hippocampal dendritic retraction requires CA3 NMDA receptors [text] / K.M. Christian, A.D. Miracle, C.L. Wellman, K. Nakazawa // Neuroscience. – 2011. – 174. – P. 26-36. 59.Cipriani, A. Comparative efficacy and acceptability of 12 new-generation antidepressants: a multiple-treatments meta-analysis [text] / A. Cipriani, T.A. Furukawa, G. Salanti [et al.] // Lancet. – 2009. – 373(9665). – P. 746758. 60.Ciraulo, D. Pharmacotherapy of depression / D. Ciraulo and R. Shader, editors. Second edition. New York: Humana press. 2011. 61.Connor T.J. Forced Swim Test-Induced Neurochemical, Endocrine, and Immune Changes in the Rat [text] / T.J. Connor, J.P. Kelly, B.E. Leonard // Pharmacology Biochemistry and Behavior. – 1997. – 58(4). – P.961-967. 62.Conrad, C.D. What is the functional significance of chronic stress-induced CA3 dendritic retraction within the hippocampus? [text] / C.D. Conrad // Behav. Cogn. Neurosci. Rev. – 2006. – 5(1). – P. 41-60. 63.Corbett, R. Animal Models of Negative Symptoms: M100907 Antagonizes PCP-Induced Immobility in a Forced Swim Test in Mice [text] / R. Corbett, L. Zhou, S.M. Sorensen, C. Mondadori // Neuropsychopharmacology. – 1999. – 21. – P. 211-218. 64.Costa, A.P. A proposal for refining the forced swim test in Swiss mice [text] / A.P. Costa, C. Vieira, L.O. Bohner [et al.] // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2013. – 45. – P. 150-155. 65.Croom, K.F. Mirtazapine: a review of its use in major depression and other psychiatric disorders [text] / K.F. Croom, C.M. Perry, G.L. Plosker // CNS Drugs. – 2009. – 23(5). – P.427-452. 171 66.Cryan, J.F. Differential behavioral effects of the antidepressants reboxetine, fluoxetine, and moclobemide in a modified forced swim test following chronic treatment [text] / J.F. Cryan, M.E. Page, I. Lucki // Psychopharmacology (Berl). – 2005. – 182(3). – P.335-344. 67.Cryan, J.F. The ascent of mouse: advances in modelling human depression and anxiety [text] / J.F. Cryan and A. Holmes // Nat. Rev. Drug Discov. – 2005. – 4. – P. 775-790. 68.Cuijpers, P. The efficacy of psychotherapy and pharmacotherapy in treating depressive and anxiety disorders: a meta-analysis of direct comparisons [text] / P. Cuijpers, M. Sijbrandij, S.L. Koole [et al.] // World Psychiatry. – 2013. – 12(2). – P. 137-148. 69.Dannon P.N. he efficacy of reboxetine in the treatment-refractory patients with panic disorder: an open label study [text] / P.N. Dannon, I. Iancu, L. Grunhaus // Hum. Psychopharmacol. – 2002. – 17(7). – P. 329-333. 70.D'Aquila P.S. Effects of chronic mild stress on performance in behavioural tests relevant to anxiety and depression [text] / P.S. D'Aquila, P. Brain, P. Willner // Physiol Behav. – 1994. – 56(5). – P.861-867. 71.Darwish I.E. Behavioral and neuronal biochemical possible effects in experimental induced chronic mild stress in male albino rats under the effect of oral barley administration in comparison to venlafaxine [text] / I.E. Darwish, H.M. Maklad, I.H. Diab // Int. J. Physiol. Pathophysiol. Pharmacol. – 2013. – 5(2). – P. 128-136. 72.de Andrade, J.S. Chronic unpredictable mild stress alters an anxiety-related defensive response, Fos immunoreactivity and hippocampal adult neurogenesis [text] / J.S. de Andrade, I.C. Céspedes, R.O. Abrão [et al.] // Behav. Brain Res. – 2013. – 250. – P. 81-90. 73.de Boer, T. The effects of mirtazapine on central noradrenergic and serotonergic neurotransmission [text] / T. de Boer // Int. Clin. Psychopharmacol. – 1995. – 10(4). – P. 19-23. 172 74.De Bundel, D. Hippocampal and prefrontal dopamine D1/5 receptor involvement in the memory-enhancing effect of reboxetine [text] / D. De Bundel , T. Femenía, C.M. DuPont [et al.] // Int. J. Neuropsychopharmacol. – 2013. – 16(9). – P. 2041-2051. 75.Decloedt, E.H. Current trends in drug treatment of obsessive–compulsive disorder [text] / E.H. Decloedt and D.J. Stein // Neuropsychiatr. Dis. Treat. – 2010. – 6. – P. 233-242. 76.Delini-Stula, A. Milnacipran: an antidepressant with dual selectivity of action on noradrenaline and serotonin reuptake [text] / A. Delini-Stula // Hum. Psychopharmacol. – 2000. – 15. – P. 255-260. 77.Divljaković, J. βCCT, anantagonist selective for α(1)GABA(A) receptors, reverses diazepam withdrawal-induced anxiety in rats [text] / J. Divljaković, M. Milić, O.A. Namjoshi [et al.] // Brain. Res. Bull. – 2013. – 91. P. 1-7. 78.Droogleever Fortuyn, H.A. Effects of PhD examination stress on allopregnanolone and cortisol plasma levels and peripheral benzodiazepine receptor density [text] / H.A. Droogleever Fortuyn, F. van Broekhoven, P.N. Span [et al.] // Psychoneuroendocrinology. – 2004. – 29(10). – P. 13411344. 79.Ducottet, C. Effects of the selective nonpeptide corticotropin-releasing factor receptor 1 antagonist antalarmin in the chronic mild stress model of depression in mice [text] / C. Ducottet, G. Griebel, C. Belzung // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2003. – 27(4). – P. 625-631. 80.Dulawa, S.C. Effects of chronic fluoxetine in animal models of anxiety and depression [text] / S.C. Dulawa, K.A. Holick, B. Gundersen, R. Hen // Neuropsychopharmacology. – 2004. – 29(7). – P. 1321-1330. 81.Duman, R.S. A neurotrophic model for stress related mood disorders [text] / R.S. Duman and L.M. Monteggia // Biol. Psychiatry. – 2006. – 59. – P. 1116-1127. 173 82.El Mansari, M. Relevance of norepinephrine-dopamine interactions in the treatment of major depressive disorder [text] / M. El Mansari, B.P. Guiard, O. Chernoloz [et al.] // CNS Neurosci. Ther. – 2010. – 16(3). P. e1-17. 83.El-Giamal, N. Reboxetine in the treatment of bulimia nervosa: a report of seven cases [text] / N. El-Giamal, M. de Zwaan, U. Bailer [et al.] // Int. Clin. Psychopharmacol. – 2000. – 15(6). – P. 351-360. 84.Fagiolini, A. Rediscovering trazodone for the treatment of major depressive disorder [text] / A. Fagiolini, A. Comandini, M. Catena Dell'Osso, S. Kasper // CNS Drugs. – 2012. – 26(12). – P. 1033-1049. 85.Farhan, M. Unpredictable chronic mild stress induced behavioral deficits: a comparative study in male and female rats [text] / M. Farhan, H. Ikram, S. Kanwal, D.J. Haleem // Pak. J. Pharm. Sci. – 2014. – 27(4). – P.879-884. 86.Farhan, M. Anxiolytic profile of fluoxetine as monitored following repeated administration in animal rat model of chronic mild stress / M. Farhan and D.J. Haleem // Saudi Pharmaceutical Journal. – 2015. Режим доступа: http://dx.doi.org/10.1016/j.jsps.2015.03.006 87.Fava, L. Review of Obsessive Compulsive Disorders Theories [text] / L. Fava, S. Bellantuono, A. Bizzi [et al.] // Global Journal of Epidemiology and Public Health. – 2014. – Vol. 1. – P. 1-13. 88.Feighner, J.P. Mechanism of action of antidepressant medications [text] / J.P. Feighner // J. Clin. Psychiatry. – 1999. – 60(4). P. 4-11. 89.Femina, P. The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis in Major Depressive Disorder: A Brief Primer for Primary Care Physicians [text] / P. Femina, E. Varghese, B. Sherwood // Prim. Care. Companion. J. Clin. Psychiatry. – 2001. – 3(4). – P.151-155. 90.Ferguson, J.M. SSRI Antidepressant Medications: Adverse Effects and Tolerability [text] / J.M. Ferguson // Prim. Care Companion J. Clin. Psychiatry. – 2001. – 3(1). – P. 22-27. 91.Ferreri, M. Benefits from mianserin augmentation of fluoxetine in patients with major depression non-responders to fluoxetine alone [text] / M. Ferreri, 174 F. Lavergne, I. Berlin [et al.] // Acta Psychiatr. Scand. – 2001. – 103(1). – P. 66-72. 92.Finn, D.A. A new look at the 5alpha-reductase inhibitor finasteride [text] / D.A. Finn, A.S. Beadles-Bohling, E.H. Beckley [et al.] // CNS Drug Rev. – 2006. – 12(1). – P. 53-76. 93.Fisar, Z. Inhibition of monoamine oxidase activity by antidepressants and mood stabilizers [text] / Z. Fisar, J. Hroudova, J. Raboch // Neuro Endocrinol. Lett. – 2010. – 31(5). – P. 645-656. 94.Fish, E.W. Escalated aggression as a reward: corticosterone and GABA(A) receptor positive modulators in mice [text] / E.W. Fish, J.F. DeBold, K.A. Miczek // Psychopharmacology (Berl). – 2005. – 182. – P. 116-124. 95.Fishback, J.A. Sigma receptors: potential targets for a new class of antidepressant drug [text] / J.A. Fishback, M.J. Robson, Y.T. Xu, R.R. Matsumoto // Pharmacol. Ther. – 2010. – 127(3). – P. 271-282. 96.Foley, K.F. Bupropion: pharmacology and therapeutic applications [text] / K.F. Foley, K.P. DeSanty, R.E. Kast // Expert Rev. Neurother. – 2006. – 6(9). – P. 1249-1265. 97.Frecska, E. Trazodone its multifunctional mechanism of action and clinical use [text] / E. Frecska // Neuropsychopharmacol. Hung. – 2010. – 12(4). – P. 477-482. 98.Frye, C.A. 3α-hydroxy-5α-pregnan-20-one in the midbrain ventral tegmental area mediates social, sexual, and affective behaviors [text] / C.A. Frye, M.E. Rhodes, S.M. Petralia [et al.] // Neuroscience. – 2006. – 138(3). – P. 10071014. 99.Fry, J.P. Fluoxetine elevates allopregnanolone in female rat brain but inhibits a steroid microsomal dehydrogenase rather than activating an aldoketo reductase [text] / J.P. Fry, K.Y. Li, A.J. Devall [et al.] // Br. J. Pharmacol. – 2014. – 171(24). – P. 5870-5880. 175 100. Fulton, B. Moclobemide. An update of its pharmacological properties and therapeutic use [text] / B. Fulton and P. Benfield // Drugs. – 1996. – 52(3). – P. 450-474. 101. Fuster-Matanzo, A. Role of neuroinflammation in adult neurogenesis and Alzheimer disease: therapeutic approaches [text] / A. Fuster-Matanzo, M. Llorens-Martín, F. Hernández, J. Avila // Mediators Inflamm. – 2013: 260925. 102. Gahr, M. Agomelatine in the treatment of major depressive disorder: an assessment of benefits and risks [text] / M. Gahr // Curr. Neuropharmacol. – 2014. – 12(5). – P. 287-398. 103. Gavioli, E.C. Antidepressant-like effect of Ro5-4864, a peripheral- type benzodiazepine receptor ligand, in forced swimming test [text] / E.C. Gavioli, F.S. Duarte, E. Bressan [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2003. – 471(1). – P. 21-26. 104. Gavish, M. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor [text] / M. Gavish, I. Bachman, R. Shoukrun [et al.] // Pharmacol. Rev. – 1999. – 51(4). – P. 629-650. 105. Ghanbari, R. Sustained administration of trazodone enhances serotonergic neurotransmission: in vivo electrophysiological study in the rat brain [text] / R. Ghanbari, M. El Mansari, P. Blier // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2010. – 335(1). – P. 197-206. 106. Gillman, P.K. Tricyclic antidepressant pharmacology and therapeutic drug interactions updated [text] / P.K. Gillman // Br. J. Pharmacol. – 2007. – 151(6). – P. 737-748. 107. Golubchik, P. Reboxetine treatment for autistic spectrum disorder of pediatric patients with depressive and inattentive/hyperactive symptoms: an open-label trial [text] / P. Golubchik, J. Sever, A. Weizman // Clin. Neuropharmacol. – 2013. – 36(2). – P.37-41. 176 108. Gorman, J. A hypothesized role for dendritic remodeling in the etiology of mood and anxiety disorders [text] / J. Gorman and J. Docherty // J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci. – 2010. – 22(3). – P. 256-264. 109. Greaves, M.W. Itch in systemic disease: therapeutic options [text] / M.W. Greaves // Dermatologic Therapy. – 2005. – 18(4). – P. 323-327. 110. Griffin, L. Selective serotonin reuptake inhibitors directly alter activity of neurosteroidogenic enzymes [text] / L. Griffin and S. Mellon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – 96(23). – P. 13512-13517. 111. Gronli J. Chronic mild stress - an animal model of depression: from behavior to molecules. Doctoral thesis. The University of Bergen. 2006 112. Gunn, B. Neurosteroids and GABAA receptor interactions: a focus on stress [text] / B. Gunn, A. Brown, J. Lambert, D. Belelli // Front. Neurosci. – 2011. – 5. – P. A131. 113. Gunn, B.G. GABAA receptor-acting neurosteroids: A role in the development and regulation of the stress response [text] / B.G. Gunn, L. Cunningham, S.G. Mitchell [et al.] // Front Neuroendocrinol. – 2015. – 36. – P. 28-48. 114. Gunnell, D. Selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) and suicide in adults: meta-analysis of drug company data from placebo controlled, randomised controlled trials submitted to the MHRA's safety review [text] / D. Gunnell and D. Ashby // BMJ. – 2005. – 330. – P. 385. 115. Häidkind, R. Effects of partial locus coeruleus denervation and chronic mild stress on behaviour and monoamine neurochemistry in the rat [text] / R. Häidkind, M. Eller, M. Harro [et al.] // Eur Neuropsychopharmacol. – 2003. – 13(1). – P. 19-28. 116. Harvey, P.D. Cognitive Impairments in Major Depression and Bipolar Disorders [text] / P.D. Harvey // Psychiatry (Edgmont). – 2007. – 4(1). – P 12-14. 117. Hashemian, F. A comparison of the effects of reboxetine and placebo on reaction time in adults with Attention Deficit-Hyperactivity Disorder 177 (ADHD) [text] / F. Hashemian, S. Mohammadian, F. Riahi [et al.] // Daru. – 2011. – 19(3). – P.231-235. 118. Hashimoto, K. Sigma-1 receptors and selective serotonin reuptake inhibitors: clinical implications of their relationship [text] / K. Hashimoto // Cent Nerv. Syst. Agents Med. Chem. – 2009. – 9(3). – P. 197-204. 119. Hashimoto, K. Activation of sigma-1 receptor chaperone in the treatment of neuropsychiatric diseases and its clinical implication [text] / K. Hashimoto // J. Pharmacol. Sci. – 2015. – 127(1). – P. 6-9. 120. Heinzmann, J. Fluoxetine impacts hypothalamic-pituitary-adrenal axis regulation and changes stress-coping behaviour in mice selectively bred for extremes in stress reactivity [text] / J. Heinzmann, A. Knapman, P. van Nieuwenhuijzen [et al.] // Pharmacopsychiatry. – 2011. – 21. – A54. 121. Heisler, L. Serotonin activates the hypothalamic-pituitary-adrenal axis via serotonin 2C receptor stimulation [text] / L. Heisler, N. Pronchuk, K. Nonogaki [et al.] // J. Neurosci. – 2007. – 27(26). – P. 6956–6964. 122. Hellgren, C. Low serum allopregnanolone is associated with symptoms of depression in late pregnancy [text] / C. Hellgren, H. Åkerud, A. Skalkidou [et al.] // Neuropsychobiology. – 2014. – 69(3). – P. 147-153. 123. Hequet, O. Epileptic seizures after autologous peripheral blood progenitor infusion in a patient treated with high-dose chemotherapy for myeloma [text] / O. Hequet, C. Dumontet, A. El Jaafari-Corbin [et al.] // Bone Marrow Transplant. – 2002. – 29. – P.544. 124. Hernandez, M.E. Effect of selective serotonin reuptake inhibitors and immunomodulator on cytokines levels: an alternative therapy for patients with major depressive disorder [text] / M.E. Hernandez, D. Mendieta, M. Pérez-Tapia [et al.] // Clin. Dev. Immunol. – 2013: 267871. 125. Hilal-Dandan, R. Goodman and Gilman's Manual of Pharmacology and Therapeutics / R. Hilal-Dandan and L.L. Brunton, editors. Second Edition. New York: McCraw-Hill. 2014. 178 126. Hill, M.N. Neurobiology of chronic mild stress: parallels to major depression [text] / M.N. Hill, K.G. Hellemans, P. Verma [et al.] // Neurosci. Biobehav. Rev. – 2012. – 36(9). – P. 2085-2117. 127. Hindmarch, I. Cognition and depression: the effects of fluvoxamine, a sigma-1 receptor agonist, reconsidered [text] / I. Hindmarch and K. Hashimoto // Hum. Psychopharmacol. – 2010. – 25(3). – P. 193-200. 128. Hirschfeld, R.M. History and evolution of the monoamine hypothesis of depression [text] / R.M. Hirschfeld // J. Clin. Psychiatry. – 2000. – 61(6). – P. 4-6. 129. Holm, M.M. Hippocampal GABAergic dysfunction in a rat chronic mild stress model of depression [text] / M.M. Holm, J.L. Nieto-Gonzalez, I. Vardya [et al.] // Hippocampus. – 2011. – 21(4). – P. 422-433. 130. Hoyt, R. Neurological events associated with the infusion of cryopreserved bone marrow and/or peripheral blood progenitor cells [text] / R. Hoyt, J. Szer, A. Grigg // Bone Marrow Transplant. – 2000. – 25. – P. 1285-1287. 131. Hu, L. A new stress model, a scream sound, alters learning and monoamine levels in rat brain [text] / L. Hu, J. Yang, T. Song [et al.] // Physiol Behav. – 2014. – 123. – P. 102-113. 132. Huang, G.J. Chronic fluoxetine treatment alters behavior, but not adult hippocampal neurogenesis, in BALB/cJ mice [text] / G.J. Huang, D. Bannerman, J. Flint [et al.] // Molecular Psychiatry. – 2008. – 13. – P. 119121. 133. Huangfu, D. Sympatholytic effect of tricyclic antidepressants: site and mechanism of action in anesthetized rats [text] / D. Huangfu, W.B. Goodwin, P.G. Guyenet // Am. J. Physiol. – 1995. – 268. – P.1429-1441. 134. Hung, A.Y. Smaller dendritic spines, weaker synaptic transmission, but enhanced spatial learning in mice lacking Shank1 [text] / A.Y. Hung, K. Futai, C. Sala [et al.] // J. Neurosci. – 2008. – 28(7). – P. 1697-1708. 179 135. Ichimaru, Y. 5-HT1A-receptor subtype mediates the effect of fluvoxamine, a selective serotonin reuptake inhibitor, on marble-burying behavior in mice [text] / Y. Ichimaru, T. Egawa, A. Sawa // Jpn. J. Pharmacol. – 1995. – 68(1). – P. 65-70. 136. Ikeguchi, K. Mianserin treatment of patients with psychosis induced by antiparkinsonian drugs [text] / K. Ikeguchi, A. Kuroda // European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience. – 1995. – 244(6). – P. 320-324. 137. Irwin, R.W. Allopregnanolone as regenerative therapeutic for Alzheimer's disease: translational development and clinical promise [text] / R.W. Irwin and R.D. Brinton // Prog, Neurobiol. – 2014. – 113. – P. 40-55. 138. Javelot, H. Behavioral and neurochemical effects of dietary methyl donor deficiency combined with unpredictable chronic mild stress in rats [text] / H. Javelot, M. Messaoudi, C. Jacquelin [et al.] // Behav Brain Res. – 2014. – 261. – P. 8-16. 139. Jindal, R.D. Insomnia in patients with depression: some pathophysiological and treatment considerations [text] / R.D. Jindal // CNS Drugs. – 2009. – 23(4). – P. 309-329. 140. Johnson, S.A. Effect of different doses of corticosterone on depression-like behavior and HPA axis responses to a novel stressor [text] / S.A. Johnson, N.M. Fournier, L.E. Kalynchuk // Behav. Brain. Res. – 2006. – 168. – P. 280-288. 141. Jung, M.E. The discriminative stimulus effects of pentylenetetrazol as a model of anxiety: recent developments [text] / M.E. Jung, H. Lal H, M.B. Gatch // Biobehav. Rev. – 2002. – 26. – P.429-439. 142. Jung, Y.H. Strain differences in the chronic mild stress animal model of depression and anxiety in mice [text] / Y.H. Jung, S.I. Hong, S.X. Ma [et al.] // Biomol. Ther. (Seoul). – 2014. – 22(5). – P. 453-459. 143. Júnior, A.M. Neurotoxicity associated with dimethylsulfoxide- preserved hematopoietic progenitor cell infusion [text] / A.M. Júnior, C.A. 180 Arrais, R. Saboya [et al.] // Bone Marrow Transplantation. – 2008. – 41. – P. 95-96. 144. Kadoguchi, N. Mirtazapine has a therapeutic potency in 1-methyl-4- phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced mice model of Parkinson’s disease [text] / N. Kadoguchi, S. Okabe, Y. Yamamura [et al.] // BMC Neuroscience. – 2014. – 15 – P.79. 145. Kalinin, V. Anxiety Disorders / V. Kalinin, editor. Publisher: InTech. 2011. Режим доступа: http://www.intechopen.com/books/anxiety-disorders 146. Kalinina, T.S. Sigma-1 receptor ligands may potentiate behavioral effects of 5alpha-reductase block [text] / T.S Kalinina and A.A. Shimshirt // EBBS and EBPS Joint Meeting. – Verona, 2015 147. Kang, M. Nelumbinis Semen reverses a decrease in hippocampal 5- HT release induced by chronic mild stress in rats [text] / M. Kang, K.H. Pyun, C.G. Jang [et al.] // J. Pharm. Pharmacol. – 2005. – 57(5). – P. 651656. 148. Kast, R.E. ancer chemotherapy and cachexia: mirtazapine and olanzapine are 5-HT3 antagonists with good antinausea effects [text] / R.E. Kast and K.F. Foley // Eur. J. Cancer Care. – 2007. – 16(4). – P. 351-354. 149. Kaynak, H. The effects of trazodone on sleep in patients treated with stimulant antidepressants [text] / H. Kaynak, D. Kaynak, E. Gözükirmizi, C. Guilleminault // Sleep Med. – 2004. – 5(1). – P.15-20. 150. Kessler, R.C. The epidemiology of depression across cultures [text] / R.C. Kessler and E.J. Bromet // Annu. Rev. Public Health. – 2013. – 34. – P.119-138. 151. Khan, A. Vilazodone, a novel dual-acting serotonergic antidepressant for managing major depression [text] / A. Khan // Expert. Opin. Investig. Drugs. – 2009. – 18(11). – P. 1753-1764. 152. Kirby, L.G. Interaction between the forced swimming test and fluoxetine treatment on extracellular 5-hydroxytryptamine and 5- 181 hydroxyindoleacetic acid in the rat [text] / L.G. Kirby and I. Lucki // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1997. – 282(2). – P. 967-976. 153. Kitamura, Y. Buspirone enhances immobility in the forced swim test in mice [text] / Y. Kitamura and T. Nagatani // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1996. – 55(3). – P. 445-451. 154. Koenigs, M. The functional neuroanatomy of depression: Distinct roles for ventromedial and dorsolateral prefrontal cortex [text] / M. Koenigs and J. Grafman // Behav. Brain. Res. – 2009. – 201(2). – P. 239-243. 155. Kumar, P. Nitric oxide mechanism in the protective effect of antidepressants against 3-nitropropionic acid-induced cognitive deficit, glutathione and mitochondrial alterations in animal model of Huntington's disease [text] / P. Kumar, H. Kalonia, A. Kumar // Behav. Pharmacol. – 2010. – 21(3). – P. 217-230. 156. Lanes, T. Prolonged ECT seizure duration in a patient taking trazodone [letter] / T. Lanes and C.L. Ravaris // American Journal of Psychiatry. – 1993. – 150. – P. 525. 157. Lanfumey, L. Corticosteroid-serotonin interactions in the neurobiological mechanisms of stress-related disorders [text] / L. Lanfumey, R. Mongeau, C. Cohen-Salmon, M. Hamon // Neurosci. Biobehav. Rev. – 2008. – 32(6). – P. 1174-1184. 158. Larrosa, O. Stimulant and anticataplectic effects of reboxetine in patients with narcolepsy: a pilot study [text] / O. Larrosa, Y. de la Llave, S. Bario [et al.] // Sleep. – 2001. – 24(3). – P.282-285. 159. Larsen, M.B. Dopamine transport by the serotonin transporter: a mechanistically distinct mode of substrate translocation [text] / M.B. Larsen, M.S. Sonders, O.V. Mortensen [et al.] // J. Neurosci. – 2011. – 31(17). – P. 6605-6615. 160. Leykin, Y. Progressive resistance to a selective serotonin reuptake inhibitor but not to cognitive therapy in the treatment of major depression 182 [text] / Y. Leykin, J.D. Amsterdam, R.J. DeRubeis [et al.] // J. Consult. Clin. Psychol. – 2007. – 75(2). – P. 267-276. 161. Li, J.M. Behavioral and biochemical studies on chronic mild stress models in rats treated with a Chinese traditional prescription Banxia-houpu decoction [text] / J.M. Li, L.D. Kong, Y.M. Wang [et al.] // Life Sci. – 2003. – 74(1). – P. 55-73. 162. Li, T.C. Mirtazapine relieves post-electroconvulsive therapy headaches and nausea: a case series and review of the literature [text] / T.C. Li, I.S. Shiah, C.J. Sun [et al.] // The Journal of ECT. – 2011. – 27(2). – P. 165-167. 163. Llorens-Martin, M. Antidepressant and Proneurogenic Influence of Environmental Enrichment in Mice: Protective Effects vs Recovery [text] / M. Llorens-Martin, G.S. Tejeda, J.L. Trejo // Neuropsychopharmacology. – 2011. – 36(12). – P. 2460-2468. 164. Longone, P. Neurosteroids as Neuromodulators in the Treatment of Anxiety Disorders [text] / P. Longone, F. Michele, E. D’Agati [et al.] // Front. Endocrinol. (Lausanne). – 2011. – 2. – P. 55. 165. Lotrich, F.E. Depression following pegylated interferon-alpha: characteristics and vulnerability [text] / F.E. Lotrich, M. Rabinovitz, P. Gironda, B.G. Pollock // J. Psychosom. Res. – 2007. – 63. – P.131-135. 166. Lu, C. Dimethyl sulfoxide suppresses NMDA- and AMPA-induced ion currents and calcium influx and protects against excitotoxic death in hippocampal neurons [text] / C. Lu and M.P. Mattson // Exp. Neurol. – 2001. – 170(1). – P. 180-185. 167. Lunn, M.P. Duloxetine for treating painful neuropathy, chronic pain or fibromyalgia / M.P. Lunn, R.A. Hughes, P.J. Wiffen // Cochrane Database Syst. Rev. – 2014. http://dx.doi.org/10.1002/14651858.CD007115.pub3 Режим доступа: 183 168. MacKenzie, G. Neurosteroids and GABAergic signaling in health and disease [text] / G. MacKenzie and J. Maguire // Biomol. Concepts. – 2013. – 4(1). – P. 29-42. 169. Maguire, J. Stress-induced plasticity of GABAergic inhibition [text] / J. Maguire // Front Cell Neurosci. – 2014. – 8. – P.157. 170. Malberg, J.E. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus [text] / J.E. Malberg, A.J. Eisch, E.J. Nestler, R.S. Duman // J. Neurosci. – 2000. – 20(24). – P. 9104-9110. 171. Mansvelder, H.D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area [text] / H.D. Mansvelder, Z.M. Fagen, B. Chang [et al.] // Biochem. Pharmacol. – 2007. – 74(8). – P. 1283-1291. 172. Mao, X. The tricyclic antidepressant amitriptyline inhibits D-cyclin transactivation and induces myeloma cell apoptosis by inhibiting histone deacetylases: in vitro and in silico evidence [text] / X. Mao, T. Hou, B. Cao [et al.] // Mol. Pharmacol. – 2011. – 79(4). – P. 672-680. 173. Marazziti, D. Treatment strategies of obsessive-compulsive disorder and panic disorder/agoraphobia [text] / D. Marazziti, M. Carlini, L. Dell'Osso // Curr. Top Med. Chem. – 2012. – 12(4). – P. 238-253. 174. Marek, G.J. Synergistic Action of 5-HT2A Antagonists and Selective Serotonin Reuptake Inhibitors in Neuropsychiatric Disorders [text] / G.J. Marek, L.L. Carpenter, C.J. McDougle, L.H. Price // Neuropsychopharmacology. – 2003. – 28. – P. 402-412. 175. mood Martinowich, K. Interaction between BDNF and serotonin: role in disorders [text] / K. Martinowich and B. Lu // Neuropsychopharmacology. – 2008. – 33(1). – P. 73-83. 176. Mason, S.T. Chronic and acute administration of typical and atypical antidepressants on activity of brain noradrenaline systems in the rat thiopentone anaesthesia model [text] / S.T. Mason and A. Angel // Psychopharmacology (Berl). – 1984. – 84(3). – P. 304-309. 184 177. Maurice, T. The pharmacology of sigma-1 receptors [text] / T. Maurice and T.P. Su // Pharmacol. Ther. – 2009. – 124(2). – P. 195-206. 178. McArthur, R.A. Animal and Translational Models for CNS Drug Discovery: Psychiatr / R.A. McArthur and F. Borsini. – Elsevier Science, 2008. – 432 P. 179. Melchior, C.L. Pregnenolone and pregnenolone sulfate, alone and with ethanol, in mice on the plus-maze [text] / C.L. Melchior and R.F. Ritzmann // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1994. – 48. – P. 893-897. 180. Mendez-David, I. Adult hippocampal neurogenesis: An actor in the antidepressant-like action [text] / I. Mendez-David, R. Hen, A.M. Gardier, D.J. David // Ann. Pharm. Fr. – 2013. – 71(3). – P. 143-149. 181. Micallef, J. A double blind parallel group placebo controlled comparison of sedative and mnesic effects of etifoxine and lorazepam in healthy subjects [text] / J. Micallef, C. Soubrouillard, F. Guet [et al.] // Fundam. Clin. Pharmacol. – 2001. – 15(3). – P. 209-216. 182. Miczek, K.A. Neurosteroids, GABAA receptors, and escalated aggressive behavior [text] / K.A. Miczek, E.W. Fish, J.F. De Bold // Horm. Behav. – 2003. – 44. – P. 242-257. 183. Mineur, Y.S. Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice [text] / Y.S. Mineur, C. Belzung, W.E. Crusio // Behav. Brain Res. – 2006. – 175(1). – P. 43-50. 184. Ming, G.L. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions [text] / G.L. Ming and H. Song // Neuron. – 2011. – 70(4). – P. 687-702. 185. Molendijk, M.L. erum BDNF concentrations as peripheral manifestations of depression: evidence from a systematic review and metaanalyses on 179 associations (N=9484) [text] / M.L. Molendijk, P. Spinhoven, M. Polak [et al.] // Mol. Psychiatry. – 2014. – 19(7). – P.791800. 185 186. Montgomery, S.A. Tolerability of serotonin norepinephrine reuptake inhibitor antidepressants [text] / S.A. Montgomery // CNS Spectr. – 2088. – 13(7-11). – P. 27-33. 187. Moron, J.A. Dopamine uptake through the norepinephrine transporter in brain regions with low levels of the dopamine transporter: evidence from knock-out mouse lines [text] / J.A. Moron, A. Brockington, R.A. Wise [et al.] // J Neurosci. – 2002. – 22(2). – P. 389-395. 188. Nakayama, K. Mirtazapine increases dopamine release in prefrontal cortex by 5-HT1A receptor activation [text] / K. Nakayama, T. Sakurai, H. Katsu // Brain Res. Bull. – 2004. – 63(3). – P.237-241. 189. Neveus, T. Reboxetine in therapy-resistant enuresis: results and pathogenetic implications [text] / T. Neveus // Scand. J. Urol. Nephrol. – 2006. – 40(1). – P. 31-34. 190. Nicolas, L.B. A combined marble burying-locomotor activity test in mice: a practical screening test with sensitivity to different classes of anxiolytics and antidepressants [text] / L.B. Nicolas, Y. Kolb, E.P. Prinssen // Eur. J. Pharmacol. – 2006. – 547(1-3). – P. 106-115. 191. Nimchinsky, E.A. Structure and function of dendritic spines [text] / E.A. Nimchinsky, B.L. Sabatini, K. Svoboda // Annu Rev. Physiol. – 2002. – 64. – P. 313-353. 192. Nirmal, J. Evaluation of behavioural and antioxidant activity of Cytisus scoparius Link in rats exposed to chronic unpredictable mild stress [text] / J Nirmal, C.S. Babu, T. Harisudhan, M. Ramanathan // BMC Complement Altern. Med. – 2008. – 24. – P. 8-15. 193. Norman, T.R. A risk-benefit assessment of moclobemide in the treatment of depressive disorders [text] / T.R. Norman and G.D. Burrows // Drug Saf. – 1995. – 12(1). – P. 46-54. 194. Odagaki, Y. Trazodone and its active metabolite m- chlorophenylpiperazine as partial agonists at 5-HT1A receptors assessed by 186 [35S]GTPgammaS binding [text] / Y. Odagaki, R. Toyoshima, T. Yamauchi // J. Psychopharmacol. – 2005. – 19(3). – P.235-241. 195. Olfson, M. Antidepressant Drug Therapy and Suicide in Severely Depressed Children and Adults [text] / M. Olfson, S.C. Marcus, D. Shaffer // Archives of General Psychiatry. – 2006. – 63. – P. 865-872. 196. Olianas, M.C. The atypical antidepressant mianserin exhibits agonist activity at κ-opioid receptors [text] / M.C. Olianas, S. Dedoni, P. Onali // Br. J. Pharmacol. – 2012. – 167(6). – P.1329-1341. 197. Onali, P. Direct agonist activity of tricyclic antidepressants at distinct opioid receptor subtypes [text] / P. Onali, S. Dedoni, M.C. Olianas // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2010. – 332(1). – P.255-265. 198. Ortega-Alvaro, A. Effect of the antidepressant nefazodone on the density of cells expressing mu-opioid receptors in discrete brain areas processing sensory and affective dimensions of pain [text] / A. OrtegaAlvaro, I. Acebes, G. Saracíbar [et al.] // Psychopharmacology (Berl). – 2004. – 176(3-4). – P.305-311. 199. Otrock, Z.K. Transient global amnesia associated with the infusion of DMSO-cryopreserved autologous blood stem cells [text] / Z.K. Otrock, A. Beydoun, W.M. Barada [et al.] // Haematologica. – 2008. – 93. – P. 36-37. 200. Page, M. E. Serotonergic mediation of the effects of fluoxetine, but not desipramine, in the rat forced swimming test [text] / M.E. Page, M.J. Detke, A. Dalvi [et al.] // Psychopharmacology. – 1999. – 147(2). – P. 162167. 201. Page, M.E. The Promises and Pitfalls of Reboxetine [text] / M.E. Page // CNS Drug Reviews. – 2003. – 9(4). – P. 327-342. 202. Page, M.E. An analysis of the effects of acute and chronic fluoxetine on extracellular norepinephrinee in the rat hippocampus during stress [text] / M.E. Page and E.D. Abercrombie // Neuropsychopharmacology. – 1997. – 16(6). – P. 419-425. 187 203. Pariante, C.M. The HPA axis in major depression: classical theories and new developments [text] / C.M. Pariante and S.L. Lightman // Trends Neurosci. – 2008. – 31(9). – P. 464-468. 204. Paul, I.A. Glutamate and depression: clinical and preclinical studies [text] / I.A. Paul and P. Skolnick // Ann. NY Acad. Sci. – 2003. – 1003. – P. 250-272. 205. Perona, M.T. Animal models of depression in dopamine, serotonin, and norepinephrine transporter knockout mice: prominent effects of dopamine transporter deletions [text] / M.T. Perona, S. Waters, F.S. Hall [et al.] // Behav. Pharmacol. – 2008. – 19(5-6). – P. 566-574. 206. Petit-Demouliere, B. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity [text] / B. Petit-Demouliere, F. Chenu, M. Bourin // Psychopharmacology. – 2005. – 177(3). – P. 245-255. 207. Pinna, G. In socially isolated mice, the reversal of brain allopregnanolone down-regulation mediates the anti-aggressive action of fluoxetine [text] / G. Pinna, E. Dong, K. Matsumoto [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – 100. – P. 2035-2040. 208. Pinna, G. Fluoxetine and norfluoxetine stereospecifically facilitate pentobarbital sedation by increasing neurosteroids [text] / G. Pinna, E. Costa, A. Guidotti // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – 101(16). – P. 6222-6225. 209. Pinna, G. Changes in brain testosterone and allopregnanolone biosynthesis elicit aggressive behavior [text] / G. Pinna, E. Costa, A. Guidotti // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2005. – 102. – P.2135-2140. 210. Pitychoutisa, P.M. 5-HT1A, 5-HT2A, and 5-HT2C receptor mRNA modulation by antidepressant treatment in the chronic mild stress model of depression: sex differences exposed [text] / P.M. Pitychoutisa, C. Dallaa, A.C. Siderisa [et al.] // Neurosci. – 2012. – 210. – P. 152-167. 188 211. Porsolt, R.D. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments [text] / R.D. Porsolt, M. Le Pichon, M. Jalfre // Nature. – 1977. – 266. – P.730-732. 212. Porsolt, R.D. ‘Behavioural despair’ in rats and mice: strain differences and the effects of imipramine [text] / R.D. Porsolt, A. Bertin, M. Jalfre // Eur. J. Pharmacol. – 1978. – 51. – P. 291-294. 213. Poyurovsky, M. Attenuation of olanzapine-induced weight gain with reboxetine in patients with schizophrenia: a double-blind, placebo-controlled study [text] / M. Poyurovsky, I. Isaacs, C. Fuchs [et al.] // Am. J. Psychiatry. – 2003. – 160(2). – P.297-302. 214. Poyurovsky, M. Effect of the 5-HT2 antagonist mianserin on cognitive dysfunction in chronic schizophrenia patients: an add-on, doubleblind placebo-controlled study / M. Poyurovsky, D. Koren, I. Gonopolsky [et al.] // European Neuropsychopharmacology. – 2003. – 13(2). – P.123128. 215. Pull1, С.B. Pharmacotherapy of panic disorder [text] / С.B. Pull1 and C. Damsa // Neuropsychiatr. Dis. Treat. – 2008. – 4(4). – P.779-795. 216. Purdy, R.H. Stress-induced elevations of gammaaminobutyric acid type A receptor-active steroids in the rat brain [text] / R.H. Purdy, A.L. Morrow, P.H. Moore Jr., S.M. Paul // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991. – 88. – P. 4553-4557. 217. Quirk, G.J. Stimulation of medial prefrontal cortex decreases the responsiveness of central amygdala output neurons [text] / G.J. Quirk, E. Likhtik, J.G. Pelletier, D. Paré // J. Neurosci. – 2003. – 23. – P. 8800–8807. 218. Radley, J.J. Repeated stress induces dendritic spine loss in the rat medial prefrontal cortex [text] / J.J. Radley, A.B. Rocher, M. Miller [et al.] // Cereb Cortex. – 2006. – 16(3). – P. 313-320. 219. Raghavendra, V. Anti-depressant action of melatonin in chronic forced swimming-induced behavioral despair in mice, role of peripheral 189 benzodiazepine receptor modulation [text] / V. Raghavendra, G. Kaur, S.K. Kulkarni // Eur. Neuropsychopharmacol. – 2000. – 10(6). – P. 473-481. 220. Rahimi-Ardabili, B. Finasteride induced depression: a prospective study [text] / B. Rahimi-Ardabili, R. Pourandarjani, P. Habibollahi, A. Mualeki // BMC Clin. Pharmacol. – 2006. – 6. – P.7 221. Rauhut, A.S. Reboxetine: attenuation of intravenous nicotine self- administration in rats [text] / A.S. Rauhut, S.N. Mullins, L.P. Dwoskin, M.T. Bardo // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2002. – 303(2). – P.664-672. 222. Reddy, D.S. Differential anxiolytic effects of neurosteroids in the mirrored chamber behavior test in mice [text] / D.S. Reddy and S.K. Kulkarni // Brain Res. – 1997. – 752(1-2). – P. 61-71. 223. Reddy, D.S. Neurosteroids: endogenous role in the human brain and therapeutic potentials [text] / D.S. Reddy // Prog. Brain Res. – 2010. – 186. – P. 113-137. 224. Reinstein, D.K. Tyrosine prevents behavioral and neurochemical correlates of an acute stress in rats [text] / D.K. Reinstein, H. Lehnert, N.A. Scott, R.J. Wurtman // Life Sci. – 1984. – 34(23). – P. 2225-2231. 225. Rogoz, Z. Effect of repeated treatment with mirtazapine on the central dopaminergic D2/D3 receptors [text] / Z. Rogoz, A. Wrobel, D. Dlaboga, M. Dziedzicka-Wasylewska // Pol. J. Pharmacol. – 2002. – 54(4). – P. 381389. 226. Rogóz, Z. Effect of repeated treatment with reboxetine on the central alpha 1-adrenergic and dopaminergic receptors [text] / Z. Rogóz, W. Margas, G. Skuza [et al.] // Pol. J. Pharmacol. – 2002. – 54(6). – P.593-603. 227. Rong, H. Chronic mild stress induces fluoxetine-reversible decreases in hippocampal and cerebrospinal fluid levels of the neurotrophic factor S100B and its specific receptor [text] / H. Rong, G. Wang, T. Liu [et al.] // Int. J. Mol. Sci. – 2010. – 11(12). – P.5310-5322. 190 228. Rosso, G. Stressful life events and obsessive-compulsive disorder: clinical features and symptom dimensions [text] / G. Rosso, U. Albert, G.F. Asinari [et al.] // Psychiatry Res. – 2012. – 197(3). – P.259-264. 229. Rupprecht, R. Translocator protein (18 kD) as target for anxiolytics without benzodiazepine-like side effects [text] / R. Rupprecht, G. Rammes, D. Eser [et al.] // Science. – 2009. – 325(5939). – P.490-493. 230. Sahay, A. Adult hippocampal neurogenesis in depression [text] / A. Sahay and R. Hen // Nat. Neurosci. – 2007. – 10. – P. 1110-1115. 231. Sala, C. Dendritic spines: the locus of structural and functional plasticity [text] / C. Sala and M. Segal // Physiol Rev. – 2014. – 94(1). – P.141-188. 232. Sanacora, G. GABAergic contributions to the pathophysiology of depression and the mechanism of antidepressant action [text] / G. Sanacora, and A. Saricicek // CNS Neurol. Disord. Drug Targets. – 2007. – 6(2). – P. 127-140. 233. Sanacora G. Towards a glutamate hypothesis of depression: an emerging frontier of neuropsychopharmacology for mood disorders [text] / G. Sanacora, G. Treccani, M. Popoli // Neuropharmacology. – 2012. – 62(1). – P. 63-77. 234. Sansone, R.A. Serotonin Norepinephrine Reuptake Inhibitors: A Pharmacological Comparison [text] / R.A. Sansone and L.A. Sansone // Innov. Clin. Neurosci. – 2014. – 11(3-4). – P. 37-42. 235. Sarkar, J. Neurosteroidogenesis is required for the physiological response to stress: role of neurosteroid-sensitive GABAA receptors [text] / J. Sarkar, S. Wakefield, G. MacKenzie [et al.] // J. Neurosci. – 2011. – 31(50). – P. 18198-18210. 236. Sato, H. Histamine H₁ receptor occupancy by the new-generation antidepressants fluvoxamine and mirtazapine: a positron emission tomography study in healthy volunteers [text] / H. Sato, C. Ito, M. Tashiro [et al.] // Psychopharmacology (Berl). – 2013. – 230(2). – P. 227-234. 191 237. Schreiber, S. The antinociceptive effect of trazodone in mice is mediated through both mu-opioid and serotonergic mechanisms [text] / S. Schreiber, M.M. Backer, I. Herman [et al.] // Behav. Brain Res. – 2000. – 114(1-2). – P. 52-56. 238. Schreiber, S. Venlafaxine and mirtazapine: different mechanisms of antidepressant action, common opioid-mediated antinociceptive effects--a possible opioid involvement in severe depression? [text] / S. Schreiber, A. Bleich, C.G. Pick // J. Mol. Neurosci. – 2002. – 18(1-2). – P.143-149. 239. Schreiber, S. The antinociceptive effect of mirtazapine in mice is mediated through serotonergic, noradrenergic and opioid mechanisms [text] / S. Schreiber, T. Rigai, Y. Katz, C.G .Pick // Brain Res. Bull. – 2002. – 58(6). – P. 601-605. 240. Schüle, C. The role of allopregnanolone in depression and anxiety [text] / C. Schüle, C. Nothdurfter, R. Rupprecht // Prog. Neurobiol. – 2014. – 113. – P.79-87. 241. Schüle, C. Influence of mirtazapine on plasma concentrations of neuroactive steroids in major depression and on 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase activity [text] / C. Schüle, E. Romeo, D.P. Uzunov [et al.] // Mol. Psychiatry. – 2006. – 11(3). – P. 261-272. 242. Schwartz, J.I. Severe depersonalization and anxiety associated with indomethacin [text] / J.I. Schwartz and R.J Moura // South Med. J. – 1983. – 76(5). – P.679-680. 243. Schweizer, M.C. Chronic mild stress (CMS) in mice: of anhedonia, 'anomalous anxiolysis' and activity [text] / M.C. Schweizer, M.S. Henniger, I. Sillaber // PLoS One. – 2009. – 4(1). – P.e4326. 244. Sedlácek, M. Neurosteroid modulation of ionotropic glutamate receptors and excitatory synaptic transmission [text] / M. Sedlácek, M. Korínek, M. Petrovic [et al.] // Physiol. Res. – 2008. – 57(3). – P.49-57. 245. Selye, H. The Stress of Life / H. Selye – New York: McGrawHill, 1956. Rev. ed. 1976. – 515 P. 192 246. Selye, H. Stress in Health and Disease / H. Selye – Reading (Mass.): Butterworths, 1976. – 1256 P. 247. Serra, M. Prevention of the stress-induced increase in the concentration of neuroactive steroids in rat brain by long-term administration of mirtazapine but not of fluoxetine [text] / M. Serra, M.G. Pisul, L. Dazzi [et al.] // J. Psychopharmacol. – 2002. – 16(2). – P. 133-138. 248. Servant D. Treatment of adjustment disorders with anxiety: efficacy and safety of etifoxine in a double blind controlled study [text] / D. Servant, P. Graziani, D. Moyse, P. Parquet // Encephale. – 1998. – 24. – P. 569-574. 249. Shiloh, R. Mianserin or placebo as adjuncts to typical antipsychotics in resistant schizophrenia [text] / R. Shiloh; Z. Zemishlany, D. Aizenberg [et al.] // International Clinical Psychopharmacology. – 2002. – 17(2). – P. 5964. 250. Siemiatkowski, M. Effects of buspirone, diazepam, and zolpidem on open field behavior, and brain [3H]muscimol binding after buspirone pretreatment [text] / M. Siemiatkowski, H. Sienkiewicz-Jarosz, A.I. Członkowska [et al.] // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2000. – 66(3). – P.645-651. 251. Singh, M. Clinical utility of vilazodone for the treatment of adults with major depressive disorder and theoretical implications for future clinical use [text] / M. Singh and T.L. Schwartz // Neuropsychiatr. Dis. Treat. – 2012. – 8. – P. 123-130. 252. Slattery, D.A. Using the rat forced swim test to assess antidepressant- like activity in rodents [text] / D.A. Slattery and J.F. Cryan // Nat. Protoc. – 2012. – 7(6). – P.1009-1014. 253. Slemmer, J.E. Bupropion is a nicotinic antagonist [text] / J.E. Slemmer, B.R. Martin, M.I. Damaj // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2000. – 295(1). – P. 321-327. 193 254. Stahl, S.M. Basic psychopharmacology of antidepressants, part 1: Antidepressants have seven distinct mechanisms of action [text] / S.M. Stahl // J. Clin. Psychiatry. – 1998. – 59(4). – P. 5-14. 255. Stahl, S. A Review of the Neuropharmacology of Bupropion, a Dual Norepinephrine and Dopamine Reuptake Inhibitor [text] / S. Stahl, J.F. Pradko, B.R. Haight [et al.] // J. Clin. Psychiatry. – 2004. – 6(4). – P.159166. 256. Stahl, S.M. Mechanism of action of trazodone: a multifunctional drug [text] / S.M. Stahl // CNS Spectr. – 2009. – 14(10). – P. 536-546. 257. Sugimoto, Y. Involvement of the sigma1 receptor in the antidepressant-like effects of fluvoxamine in the forced swimming test in comparison with the effects elicited by paroxetine [text] / Y. Sugimoto, N. Tagawa, Y. Kobayashi [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2012. – 696(1-3). – P.96-100. 258. Szabadi, E. The human pharmacology of reboxetine [text] / E. Szabadi, C.M. Bradshaw, P.F. Boston, R.W. Langley // Human psychopharmacology. – 1998. – 13 – P. 3-12. 259. Tartara, A. Alcohol interactions with typical and atypical antidepressants [text] / A. Tartara, L. Formigli, F. Crema [et al.] // Neurobehav. Toxicol. Teratol. – 1985. – 7(2). – P.139-141. 260. Thase, M.E. Treatment of anxiety disorders with venlafaxine XR [text] / M.E. Thase // Expert. Rev. Neurother. – 2006. – 6(3). – P.269-282. 261. Connor, T.J. Forced Swim Test-Induced Neurochemical, Endocrine, and Immune Changes in the Rat [text] / T.J. Connor, J.P. Kelly, B.E. Leonard // Pharmacology Biochemistry and Behavior. – 1997. – 58(4). – P.961-967. 262. Torres, J.M. Effects of CRH and ACTH administration on plasma and brain neurosteroid levels [text] / J.M. Torres, E. Ruiz, E. Ortega // Neurochem. Res. – 2001. – 26(5). – P.555-558. 194 263. Tsvyetlynska, N.A. Role of AMPA receptor desensitization and the side effects of a DMSO vehicle on reticulospinal EPSPs and locomotor activity [text] / N.A. Tsvyetlynska, R.H. Hill, S. Grillner // J. Neurophysiol. – 2005. – 94(6). – P.3951-3960. 264. Turkmen, S. Tolerance to allopregnanolone with focus on the GABA- A receptor [text] // S. Turkmen, T. Backstrom, G. Wahlstrom [et al.] // Br. J. Pharmacol. – 2011. – 162(2). – P.311-327. 265. Ugale, R.R. Neurosteroid allopregnanolone mediates anxiolytic effect of etifoxine in rats [text] / R.R. Ugale, A.N. Sharma, D.M. Kokare [et al.] // Brain. Res. – 2007. – 1184. – P. 193-201. 266. Umathe, S.N. Neurosteroids modulate compulsive and persistent behavior in rodents: implications for obsessive-compulsive disorder [text] / S.N. Umathe, J.M. Vaghasiya, N.S. Jain, P.V. Dixit // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2009. – 33(7). – P.1161-1166. 267. Uzunova, V. Increase in the cerebrospinal fluid content of neurosteroids in patients with unipolar major depression who are receiving fluoxetine or fluvoxamine [text] / V. Uzunova, Y. Sheline, J.M. Davis [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – 95. – P.3239-3244. 268. Uzunova, V. Chronic antidepressants reverse cerebrocortical allopregnanolone decline in the olfactory-bulbectomized rat [text] / V. Uzunova, A.S. Wrynn, A. Kinnunen [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2004. – 486. – P. 31-34. 269. Uzunova, V. Relevance of endogenous 3alphareduced neurosteroids to depression and antidepressant action [text] / V. Uzunova, L. Sampson, D.P. Uzunov // Psychopharmacology. – 2006. – 186. P. 351-361. 270. Vallee, M. Quantification of neurosteroids in rat plasma and brain following swim stress and allopregnanolone administration using negative chemical ionization gas chromatography/mass spectrometry [text] / M. Vallee, J.D. Rivera, G.F. Koob [et al.] // Anal. Biochem. – 2000. – 287(1). – P.153-166. 195 271. van Amsterdam, C. Mechanism of action of the bimodal antidepressant vilazodone: evidence for serotonin1A-receptor-mediated auto-augmentation of extracellular serotonin output [text] / C. van Amsterdam and C.A. Seyfried // Psychopharmacology (Berl). – 2014. – 231(12). – P.2547-2558. 272. Van der Meersch-Mougeot, V. Benzodiazepines reverse the anti- immobility effect of antidepressants in the forced swimming test in mice [text] / V. Van der Meersch-Mougeot., M. J. da Rocha, C. Monier [et al.] // Neuropharmacology. – 1993. – 32(5). – P. 439-446. 273. Varghese, F.P. The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis in Major Depressive Disorder: A Brief Primer for Primary Care Physicians [text] / F.P. Varghese and E.S. Brown // J. Clin. Psychiatry. – 2001. – 3(4). – P. 151-155. 274. Veale, D. Obsessive-compulsive disorder [text] / D. Veale and A. Roberts // BMJ. – 2014. – 348. – g2183. 275. Videbech P. Hippocampal volume and depression: a meta-analysis of MRI studies [text] / P. Videbech and B. Ravnkilde // Am. J. Psychiatry.2004. – 161(11). – P.1957-1966. 276. Vollenweider, I. Antidepressant-like properties of α2-containing GABA(A) receptors [text] / I. Vollenweider, K.S. Smith, R. Keist, U. Rudolph // Behav. Brain. Res. – 2001. – 217(1). – P.77-80. 277. Vollmayr, B. Stress models of depression [text] / B. Vollmayr and F. Henn // Clinical Neuroscience Research. – 2003. – 3. – P.245-251. 278. Vorhees, C.V. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory [text] / C.V. Vorhees and M.T. Williams // Nat. Protoc. – 2006. – 1(2). – P.848-858. 279. Vreeburg, S.A. Major Depressive Disorder and Hypothalamic- Pituitary-Adrenal Axis Activity [text] / S.A. Vreeburg, W.J. Hoogendijk, J. van Pelt [et al.] // Arch. Gen. Psychiatry. – 2009. – 66(6). – P.617-626. 196 280. Wang, J.W. Chronic Fluoxetine Stimulates Maturation and Synaptic Plasticity of Adult-Born Hippocampal Granule Cells [text] / J.W. Wang, D.J. David, J.E. Monckton, F. Battaglia, R. Hen // J. Neurosci. – 2008. – 28(6). – P.1374-1384. 281. Wang, Y.Q. Acute administration of fluoxetine normalizes rapid eye movement sleep abnormality, but not depressive behaviors in olfactory bulbectomized rats [text] / Y.Q. Wang, Z.C. Tu, X.Y. Xu [et al.] // Neurochem. – 2012. – 120(2). – P. 314-324. 282. Wang, C. Chronic mild stress-induced changes of risk assessment behaviors in mice are prevented by chronic treatment with fluoxetine but not diazepam [text] / C. Wang, M. Li, D. Sawmiller [et al.] // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2014. – 116. – P.116-128. 283. Wang, S.M. Vilazodone for the treatment of major depressive disorder: focusing on its clinical studies and mechanism of action [text] / S.M. Wang, C. Han, S.J. Lee [et al.] // Psychiatry Investig. – 2015. – 12(2). – P.155-163. 284. Warner-Schmidt, J. Hippocampal neurogenesis: opposing effects of stress and antidepressant treatment [text] / J.L. Warner-Schmidt and R.S. Duman // Hippocampus. – 2006. – 16. – P. 239-249. 285. Watanabe, K. Effect of antidepressants on brain-derived neurotrophic factor (BDNF) release from platelets in the rats [text] / K. Watanabe, E. Hashimoto, W. Ukai [et al.] // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2010. – 34(8). – P. 1450-1454. 286. Weber, C.C. Effects of antidepressants on the brain/plasma distribution of corticosterone [text] / C.C. Weber, G.P. Eckert, W.E. Müller // Neuropsychopharmacology. – 2006. – 31(11). – P.2443-2448. 287. Weiner, I. A comparison of drug effects in latent inhibition and the forced swim test differentiates between the typical antipsychotic haloperidol, the atypical antipsychotics clozapine and olanzapine, and the antidepressants imipramine and paroxetine [text] / I. Weiner, D. Schiller, I. Gaisler- 197 Salomon, A. Green, D. Joel // Behav. Pharmacol. – 2003. – 14(3). – P. 215222. 288. Westenbroek, C. Gender-specific effects of social housing in rats after chronic mild stress exposure [text] / C. Westenbroek, G.J. Ter Horst, M.H. Roos [et al.] // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2003. – 27(1). – P. 21-30. 289. Wichers, M.C. IDO and interferon-alpha induced depressive symptoms: a shift in hypothesis from tryptophan depletion to neurotoxicity [text] / M.C. Wichers, G.H. Koek, G. Robaeys [et al.] // Mol. Psychiatry. – 2005. – 10. – P.538-544. 290. Willner, P. Chronic mild stress (CMS) revisited: Consistency and behavioural neurobiological concordance in the effects of CMS [text] // P. Willner // Neuropsychobiology. – 2005. – 52. – P. 90-110. 291. Windrum, P. Severe neurotoxicity because of dimethyl sulphoxide following peripheral blood stem cell transplantation [text] / P. Windrum and T. Morris // Bone Marrow Transplant. – 2003. – 31. – P.315. 292. Wirth, M.M. Relationship between salivary cortisol and progesterone levels in humans [text] / M.M. Wirth, E.A. Meier, B.L. Fredrickson, O.C Schultheiss // Biol. Psychol. – 2007. – 74(1). – P. 104-107. 293. Witkin, J.M. Animal models of obsessive-compulsive disorder [text] / J.M. Witkin // Curr. Protoc. Neurosci. – 2008. – Chapter 9. – P.9-30. 294. Wolak, M. Involvement of NMDA and AMPA receptors in the antidepressant-like activity of antidepressant drugs in the forced swim test [text] / M. Wolak, A. Siwek, B. Szewczyk [et al.] // Pharmacol. Rep. – 2013. – 65(4). – P.991-997. 295. Yamada, M. Clinical pharmacology of MAO inhibitors: safety and future [text] / M. Yamada and H. Yasuhara // Neurotoxicology. – 2004. – 25(1-2). – P.215-221. 198 296. Yang, T.T. Adolescents with major depression demonstrate increased amygdala activation [text] / T.T. Yang, A.N. Simmons, S.C. Matthews [et al.] // J. Am. Acad. Child. Adolesc. Psychiatry. – 2010. – 49(1). – P. 42-51. 297. Young, E.A HPA axis activation in major depression and response to fluoxetine: a pilot study [text] / E.A.Young, M. Altemus, J.F. Lopez [et al.] // Psychoneuroendocrinology. – 2004. – 29(9). – P. 1198-1204. 298. Zhou, Q. Shrinkage of dendritic spines associated with long-term depression of hippocampal synapses [text] / Q. Zhou, K.J. Homma, M.M. Poo // Neuron. – 2004. – 44(5). – P. 749-757. 299. Zhu, S. Unpredictable chronic mild stress not chronic restraint stress induces depressive behaviours in mice [text] / S. Zhu, R. Shi, J. Wang [et al.] // Neuroreport. – 2014. – 25(14). – P. 1151-1155. 300. Zink, C.F. Vasopressin modulates medial prefrontal cortex-amygdala circuitry during emotion processing in humans [text] / C.F. Zink, J.L. Stein, L. Kempf [et al.] // J. Neurosci. – 2010. – 30(20). – P. 7017-7022. 301. Zunszain, P.A. Glucocorticoids, cytokines and brain abnormalities in depression [text] / P.A. Zunszain, C. Anacker, A. Cattaneo [et al.] // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2011. – 35(3). – P. 722-729.
