Описание видео файлов (перевод)

Прижизненное изображение CTL (цитотоксических Т лимфоцитов),
разрушающих β клетки островка поджелудочной железы, у
мышей, страдающих диабетом.
Причиной сахарного диабета 1 типа (СД1) является аутоиммунная деструкция
инсулинпродуцирующих β-клеток островков поджелудочной железы, по существу
являющихся мини-органами, встроенными в экзокринную ткань. Считается, что
CTL играют главную роль в аутоиммунной деструкции, которая лежит в основе
СД1. Визуализация СTL-опосредованного разрушения клеток должна облегчить
понимание патогенеза СД1, однако, является технически сложной в выполнении.
Здесь мы описываем прижизненное двухфотонное изображение динамичного
поведения увеличенной диабетогенной популяции CTL в поджелудочной железе
мыши в стадии разрушения клеток. После сосудистого торможения и
кровоизлияния, CTL начинают хаотично перемещаться по всей экзокринной ткани
и беспрепятственно мигрируют между анатомически близкими островками. При
столкновении с антигеном внутри островка, движение замедляется, что
позволяет CTL проверить поверхность клетки-мишени. Впоследствии меньшая
часть CTL останавливает движение, образуя соединения с β-клеткой мишенью,
которое сохраняется около нескольких часов. Медленное поражение возникает
при длительном присутствии существенного числа эффекторных клеток. Все эти
данные изображают передвижение CTL от одной клетки-мишени к другой, как
стохастический процесс на суборганном уровне, и противоречат мнению об
основном влиянии градиентов хемотаксиса.
Дополнительная информация к видео
Доп. Видео 1 – внутренняя ткань, 3D визуализация сосудистой сети нормального
островка in vivo
Вращение 3D изображения нормального островка поджелудочной железы (отмечено
зеленым) в различных плоскостях у животного RIP-LCMV. GP/MIP-GFP после инъекции
сосудистого красителя 70kDa Dextran-TxRed (красный). Обратите внимание на плотную,
извилистую сеть капилляров, протекающих в островок, и стекающих в более широкие
сопредельные венулы. Соответсвует изображению 2С, D. Параметры изображения
ш/в=1.52/d=5/z=32
Доп. Видео 2 – Внутрисосудистое торможение CTL (цитотоксических Т
лимфоцитов) изначально возникает в более широких панкреатических венулах.
Серия изображений, состоящая из проекционных изображений с максимальной
интенсивностью (параметры изображения ш/в=0.56, d=4/z=25/t=30s). На вкладке
изображен участок, снятый с высокой частотой смены кадров (5 к/сек.) на фоне единого
плана по оси Z (ш/в=0.51). Красными стрелками показаны неподвижные круглые клетки,
контактирующие со стенкой сосуда (коричневатые, 70kDa Dextran-TxRed).
Флюоресцирующее вещество, в виде быстро передвигающихся белых точек на вкладке,
показывает направление кровотока. Соответствует изображению 2E, F.
Доп. Видео 3 – Внутрисосудистое торможение CTL изначально возникает в более
широких панкреатических венулах.
Серия изображений, состоящая из проекционных изображений с максимальной
интенсивностью (параметры изображения ш/в=1.52, d=5/z=21/t=30s). На вкладке
изображен участок, снятый с высокой частотой смены кадров (5 к/сек.) на фоне единого
плана по оси Z (ш/в=0.51). Зелеными стрелками показаны неподвижные круглые клетки,
контактирующие со стенкой сосуда (красные, 70kDa Dextran-TxRed). Голубыми
стрелками показаны CTL, движущиеся по сосудистой стенке. Желтыми стрелками
отмечены свободно циркулирующие СTL. Белыми стрелками показаны неотмеченные
клетки, прочно контактирующие с сосудистой стенкой. Красные стрелки указывают на
протечку сосудистого контрастного вещества. Соответствует изображению 2G.
Доп. Видео 4 – фенотип протекающей венулы в предиабетической поджелудочной
железе RIP-LCMV.GP.
Изоповерхностное изображение сосудистого просачивания в предиабетической
поджелудочной железе. Сосудистый краситель Dextran-TxRed введен при Т=0.
Соответствует изображению 3А, В, сложный изоповерхностный объем был использован
для создания изображения 3E. Параметры изображения: ш/в=1.52/d=5/z=26/t=60s 46
Доп. Видео 5 – Целостные сосудистые сети в здоровой поджелудочной железе
RIP-LCMV.GP.
Изоповерхностное изображение целостных сосудистых сетей (красный цвет) и
структуры островков (зеленый) в здоровой поджелудочной железе. Сосудистый
краситель Dextran-TxRed введен при Т=0. Соответствует изображению 3С, D сложный
изоповерхностный объем был использован для создания изображения 3E . Параметры
изображения: ш/в=1.52/d=5/z=33/t=60s
Доп. Видео 6 – 3D путь движения индуцирующих диабет CTL внутри ацинуса.
Беспорядочное движение CTL внутри ацинарной ткани, премыкающей к островку
поджелудочной железы. Пурпурные точки – это единичные отслеживаемые движущиеся
CTL, связанные с цветным шлейфом, повторяющим последние 5 позиций клеток.
Соответствует изображению 4 С. Параметры изображения: ш/в=0.52/d=6/z=17/t=30s
Доп. Видео 7 – Беспорядочное движение CTL в экзокринной поджелудочной
железе в высоком разрешении.
Серия четких изображений CTL, отмеченных зеленым, и изоповерхностной сосудистой
сети (красный цвет). Обратите внимание, что все CTL находятся в ткани, а не внутри
сосудистой сети. Соответствует изображению 4Е. Параметры изображения:
ш/в=0.27/d=5/z=24/t=30s
Доп. Видео 8 – Беспорядочное движение совместно с пептидом/адъювантактиватором CTL.
Экспериментальная установка, идентичная Видео 6 и 7, но вместо неинфицированных
CTL клетки, инфицированные LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита). Обратите
внимание на образование континуума воспалительных CTL между соседними
островками на изображении. Соответствует изображению 5B. Параметры изображения:
ш/в=0.69/d=6/z=14/t=30s
Доп. Видео 9 - Континуум пораженных CTL среди анатомически соседних
островков.
Как видно CTL (подвижные клетки зеленого цвета) формируют континуум между
соседними островками (зеленое скопление слева и справа). Соответствует
изображению 5В. Параметры изображения: ш/в=0.70/d=6/z=22/t=30s
Доп. Видео 10 – Беспорядочное движение CTL среди анатомически соседних
островков.
Пример поведения CTL и отслеживание их движения в 3D проостранстве между
анатомически близкими островками (большое скопление зеленого цвета). Пурпурные
точки обозначают единичные CTL, окрашенный «шлейф» отображает пять последних
позиций клетки. Соответствует изображению 5D. Параметры изображения:
ш/в=1.11/d=6/z=16/t=30s 47
Доп. Видео 11 – Сдерживание подвижности CTL и их торможение в веществе
островка.
CTL (пурпурный флуоресцентный белок) и бета-клетки (зеленый флуоресцентный
белок) отображают рассасывание клеток. Соответствует изображению 6A. Параметры
изображения: ш/в=0.79/d=5/z=22/t=60s
Доп. Видео 12 – Торможение CTL и изучение их поведения в островках
пожделудочной железы.
Усиленное 3D пространство, соответствующее изображению 6А, показывает контакт
CTL с бета-клетками в изображении сплошного времени (под красной стрелкой) во
время миграции в зоне видимости множества подвижных CTL. Параметры изображения
и временное разрешение: смотри Доп. Видео 11.
Доп. Видео 13 – Торможение CTL и изучение их поведения в островках
пожделудочной железы.
Увеличенное 3D пространство, соответствующее изображению 6В, показывает
стабильные контакты CTL с бета-клетками в режиме сплошного (под красной стрелкой) и
прерывистого (под синей стрелкой) времени во время миграции в зоне видимости
множества подвижных CTL. Параметры изображения и оригинальная
последовательность: ш/в=0.88/d=5/z=20/t=60s
Доп. Видео 14 – Обнаружение смерти бета-клеток in vivo.
Красной стрелкой отмечена потеря GPF (флуоресцентный белок) сигнала, что связано
со смертью клетки. Соответствует изображению 7А. Параметры изображения:
ш/в=0.58/d=6/z=21/t=30s
Доп. Видео 15 – Объединение смерти бета-клеток (зеленый; под красной стрелкой)
с торможением CTL (пурпурный; под белой стрелкой).
Соответствует изображению7Е. Параметры изображения : ш/в=0.86/d=5/z=22/t=60s
Доп. Видео 16 – Детали Доп. Видео 15.
Параметры изображения : ш/в=0.06/d=5/z=22/t=60
Доп. Видео 17 – Недостаток ограничения движения и торможения CTL в клетках
пожделудочной железы, при развившимся сахарном диабете.
Единичные бета-клетки (большие, неподвижные, зеленого цвета) можно наблюдать в
центре поля, среди CTL красного цвета. Маленькие подвижные зеленые клетки – это,
возможно, фагоциты, фагоцитирующие бета-клетки с GFP (феномен уже описали Tang,
Q., Adams, J.Y., Tooley, A.J., Bi, M., Fife, B.T., Serra, P., Santamaria, P., Locksley, R.M.,
Krummel, M.F., and Bluestone, J.A. в 2006 году. Визуализация контроля аутоиммунного
ответа регулирующими Т-клетками на мышах, страдающих диабетом без ожирения: Nat
Immunol 7:83-92) Изображение представляет собой увеличенный участок Изображения
7Е. Параметры изображения и оригинальная последовательность
ш/в=1.52/d=5/z=20/t=60s
Доп. Видео 18 – Быстрое исчезновение СTL при истощении антигена.
Небольшая популяция медленно движущихся CTL (мелкие зеленые точки) вбизи
оставшихся островков (большее по объему желтовато-зеленое скопление) у животного,
тяжело болеющего сахарным диабетом. Кровеносное русло окрашено Dextran-TxRed.
Соответствует изображению 7G после инъекции сосудистого красителя. Параметры
изображения: ш/в=1.52/d=5/z=18/t=30s