исследование антоцианов черники в плодах и препаратах на ее

16
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 3. 2006. Том 72
УДК 543.544.45
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТОЦИАНОВ ЧЕРНИКИ В ПЛОДАХ
И ПРЕПАРАТАХ НА ЕЕ ОСНОВЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ
© В. И. Дейнека1, А. М. Григорьев2, Л. А. Дейнека1, Е. И. Шапошник1, В. М. Староверов2
Статья поступила 9 февраля 2005 г.
Методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в элюентах системы ацетонитрил — муравьиная кислота
— вода исследованы антоцианы ряда растений рода Vaccinium и некоторых готовых форм,
полученных на основе черники. Предложен простой и эффективный метод идентификации
компонентов сложных смесей антоцианов с использованием метода анализа относительного
удерживания. Показано, что технология сушки имеет первостепенное значение для сохранности
исходных антоцианов черники и качества продуктов на ее основе.
Черника и препараты на ее основе заняли видное место
на прилавках аптек и среди объектов научных
исследований. Одним из важнейших компонентов
плодов этого растения является антоциановый
комплекс. Экспериментально показана высокая
биологическая активность комплекса во многих
отношениях, включая противораковую [1 – 6].
Обращенно-фазовая ВЭЖХ использовалась для
изучения антоцианов черники и других растений рода
Vaccinium (голубики, клюквы и брусники) [7 – 12].
Учет сложного состава объектов (например, 15
моногликозидных компонентов в плодах черники)
объясняет трудности традиционных многостадийных
методов выделения и идентификации компонентов
(без использования ВЭЖХ) [13]. Впрочем, если
результаты работ, выполненных такими методами [14],
качественно аналогичны найденным методом ВЭЖХ,
то антоциановый состав, приведенный в работе [15],
весьма необычен.
Настоящая работа посвящена применению метода
анализа относительного удерживания в обращеннофазовой ВЭЖХ при исследовании сложных смесей
антоцианов на примере моногликозидов плодов
черники, голубики, клюквы и брусники, некоторых
готовых форм на основе черники и исследованию
изменения антоцианового состава при сушке плодов
черники.
В работе использовали жидкостной хроматограф
Gilson cо спектрофотометрическим детектором
Holochrome (Gilson, Франция). Ввод пробы (20 мкл)
1
Белгородский государственный университет,
г. Белгород, Россия.
2
ОАО Научно-исследовательский институт технологии
медицинской промышленности, г. Белгород, Россия.
осуществляли при помощи крана-дозатора Rheodyne
7125. Для обработки и регистрации хроматограмм
применяли систему “ЮНИХРОМ 97” (ООО “Новые
аналитические системы”, г. Минск, Беларусь). Хроматографические колонки (250 × 4 мм), заполненные
сорбентами: А — Диасфер-110-С18, 6 мкм (ЗАО
“БиоХимМак СТ”); B — Reprosil-Pur C18-AQ, 5 мкм
(Dr. Maisch GmbH) и C — 250 × 4,6 мм, Ultrasphere
ODS (Beckman). Расход элюента — 1 мл/мин (колонки
В и С) и 0,7 мл/мин (колонка А). Для приготовления
элюентов использовали ацетонитрил для ВЭЖХ
(“Криохром” марки осч, сорт 1), муравьиную
кислоту (хч) и дистиллированную воду. Факторы
емкости (и логарифмы факторов емкости) веществ
[k(i) и lgk(i)] рассчитывали по времени удерживания,
используя в качестве “мертвого времени” удерживание нитрита натрия.
Обозначения антоцианов [16 – 18]: дельфинидин
— Dp; цианидин — Cy; петунидин — Pt; пеонидин
— Pn; мальвидин — Mv. Углеводные радикалы,
находящиеся в положении 3, обозначены: Glu —
глюкозид, Gala — галактозид, Ara — арабинозид.
Например, мальвидин-3-глюкозид — MvGlu.
Экстракты готовили настаиванием соответствующих материалов в 10 %-ном растворе (по
объему) муравьиной кислоты в воде. Экстракты
отфильтровывали и разбавляли водой (или элюентом)
от 1:5 до 1:10 перед анализом. Для гидролиза к
выделенным фракциям антоцианов добавляли
концентрированную хлористоводородную кислоту (в
соотношении 1:10), кипятили в течение 45 мин на
водяной бане. Охлажденные (2 – 5 мл) гидролизаты
для отделения от хлористоводородной кислоты сорбировали на патронах ДИАПАК С18, предварительно
кондиционированных пропусканием 2 – 2,5 мл
17
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 3. 2006. Том 72
ацетона и 2,5 мл экстрагента. Патрон промывали
2 мл экстрагента и антоцианы элюировали раствором
муравьиная кислота — ацетонитрил — вода в
соотношении 10:40:50 % объемн. Перед хроматографическим анализом полученные экстракты разбавляли в 4 раза экстрагентом.
Хроматограммы экстрактов черники, голубики,
клюквы и брусники представлены на рис. 1. Состав
антоцианового комплекса плодов растений приведен
в табл. 1. Очевидно усложнение состава в ряду
брусника — клюква — черника (голубика). При этом
для полного разделения всех моногликозидов
антоцианов черники (голубики) следует использовать
элюенты с относительно небольшим содержанием
ацетонитрила (7 – 9 % объемн.). Но они неудобны
при количественном определении из-за проблем
детектирования и обработки широких пиков поздно
элюирующихся производных пеонидина и мальвидина. Более эффективно в данном случае
применение градиентного элюирования. Однако
авторы использовали изократический режим,
позволяющий определять качественный состав
антоцианов по ранее установленным и подтвержденным в данной работе закономерностям удерживания [16 – 18].
Основной проблемой при анализе сложных
смесей является необходимость идентификации
каждого из компонентов, требующая либо больших
затрат рабочего времени, либо использования
труднодоступного оборудования. Применение
стандартных веществ в этих случаях также проблематично по той же причине.
Для идентификации 3-глюкозидов антоцианидинов мы предлагаем сопоставление хроматограмм
экстрактов исследуемого объекта и кожуры
А
0,1 е.о.п.
а
б
в
2
1
3+4
5
13+14
6 7+8
9+10
11+12
15
г
0
5
10
мин
tR, мин
Рис. 1. Хроматограммы экстрактов плодов растений
рода Vaccinium: а — брусники; б — клюквы; в —
голубики; г — черники.
Нумерация пиков в табл. 1 (колонка 250 × 4 мм, Диасфер110-С18 (5 мкм); подвижная фаза: 12,5 % объемн.
ацетонитрила и 10 % объемн. муравьиной кислоты в
воде; расход элюента — 1 мл/мин; детектирование при
520 нм)
виноградных ягод, записанных в одних и тех же
изократических условиях. При этом для исключения
ошибок следует воспользоваться сравнением
хроматограмм, зарегистрированных в нескольких
(обычно достаточно двух, например с 7 и 12 %
объемн. ацетонитрила при постоянном содержании
муравьиной кислоты 10 % объемн.) составах
Таблица 1. Состав антоцианового комплекса плодов некоторых растений рода Vaccinium (n = 3; p = 0,95)
№
п/п
Антоциан
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
DpGala
DpGlu
DpAra
CyGala
CyGlu
PtGala
CyAra
PtGlu
PtAra
PnGala
PnGlu
MvGala
PnAra
MvGlu
MvAra
*Определено
Время удерживания, мин
эксперимент
расчет
*
3,10
—
3,07
3,34
3,32
—
4,01
—
3,87
—
3,98
4,50
4,48
—
4,72
—
4,69
5,46
—
5,46
5,40
—
6,84
—
6,71
—
6,78
8,19
8,14
10,39
—
8,55
9,99
—
10,39
9,96
—
12,99
—
12,81
по удерживанию антоцианов винограда.
Доля антоцианов по площади пиков, %
черника
голубика
клюква
брусника
12,8 ± 1,0
11,3 ± 0,9
25,7 ± 2,3
4,5 ± 0,6
11,0 ± 1,2
12,4 ± 1,7
8,7 ± 0,8
4,4± 0,1
15,8 ± 0,4
3,4 ± 0,6
4,6 ± 1,0
11,2 ± 0,3
4,4 ± 0,1
3,6 ± 0,9
6,8 ± 0,2
11,4 ± 1,0
8,0 ± 0,6
30,8 ± 2,1
2,1 ± 0,1
6,4 ± 1,6
—
—
—
20,9 ± 0,6
4,3 ± 0,8
1,9 ± 0,5
22,0 ± 0,9
—
23,1 ± 1,2
—
10,6 ± 1,2
—
16,4 ± 1,7
—
1,5 ± 0,4
—
—
—
79,6 ± 0,5
5,9 ± 0,4
4,3 ± 0,4
10,2 ± 0,8
—
—
—
—
—
—
—
—
18
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 3. 2006. Том 72
2
0,8
lgk (Gala , Ara )
подвижных фаз. Антоцианы ягод винограда образованы, как правило, 3-глюкозидами дельфиниидина,
цианидина, петунидина, пеонидина и мальвидина
[19, 20]. Исследование винограда из различных стран
показало, что в импортных сортах обычно превалируют либо мальвидиновые (для ягод с темносиней окраской), либо пеонидиновые компоненты
(для ягод с темно-красной окраской). В винограде,
выращенном в Белгороде, доля 3-глюкозидов дельфинидина, петунидина или цианидина существенно
выше [21]. Непригодные для сопоставления сорта
встречались довольно редко (особенно можно
выделить сорт Молдова, хроматограмма которого
принципиально отличалась от обычных).
Как указывалось выше, основные компоненты
антоцианового комплекса клюквы — 3-галактозиды,
3-глюкозиды и 3-арабинозиды цианидина и пеонидина. С учетом известного порядка элюирования,
т. е. роста удерживания в ряду однотипных гликозидов
(Gly): tR(DpGly) < tR(CyGly) < tR(PtGly) < tR(PnGly) <
<tR(Mv) и различных гликозидов для одного антоцианидина: tR(ХGala) < tR(XGlu) < tR(XAra) [19],
идентификация основных антоцианов клюквы
осуществляется достаточно легко. Указанное на
рис. 1 отнесение пиков было подтверждено хроматографическим исследованием гидролизатов
выделенных индивидуальных хроматографических
зон, поскольку выделение чистых фракций из клюквы
не вызывает затруднений вследствие полного
разделения всех основных компонентов.
Данные по удерживанию антоцианов клюквы в
различных изократических условиях приведены в
табл. 2. Обработка этих результатов в координатах
относительного удерживания [16 – 18], т. е. как
удерживание 3-галактозидов и 3-арабинозидов
относительно удерживания 3-глюкозида (в виде
логарифмов факторов емкости, рис. 2), подтверждает
хорошую линейность соотношений для производных
как цианидина, так и пеонидина. Более того,
полученные данные свидетельствуют о том, что в
предложенных координатах закономерности удерживания остаются общими, по крайней мере, для
1
0,3
0
0,4
0,8
-0,2
lgk (Glu )
Рис. 2. Удерживание галактозидов и арабинозидов
цианидина и пеонидина относительно глюкозидов
цианидина и пеонидина. Линии тренда — для колонки
Reprosil (c предколонкой) для галактозидов (1), арабинозидов (2). Данные для производных цианидина —
(колонка B), (колонка A), × (колонка C), для производных пеонидина — (колонка B), (колонка A)
исследованных сорбентов (различных фирмпроизводителей), т. е. выводы о трудности сопоставления удерживания антоцианов на различных
колонках [19] несколько преувеличены, если используются элюенты системы ацетонитрил — муравьиная
кислота — вода. Удерживание 3-галактозидов (и
3-арабинозидов) относительно 3-глюкозида и
цианидина и пеонидина может быть выражено (для
колонки Reprosil-Pur C18-AQ) одним и тем же
уравнением. Для галактозидов:
lg k (3 − Gala ) = −0,095 + 0,972 lg k (3 − Glu ) , (1)
для арабинозидов:
lg k (3 − Ara ) = 0,146 + 0,978 lg k (3 − Glu ). (2)
Найденные зависимости имеют даже более
универсальный характер, поскольку данные для
колонок со стационарными фазами других произво-
Таблица 2. Параметры удерживания 3-галактозидов, 3-глюкозидов и 3-арабинозидов цианидина и пеонидина
(колонка Reprosil-Pur C18-AQ, подвижная фаза: ацетонитрил — 10 % НСООН — вода)
Агликон
Цианидин, Cy
Пеонидин, Pn
Гликозид (в положении 3)
Галактозид, Gala
Глюкозид, Glu
Арабинозид, Ara
Галактозид, Gala
Глюкозид, Glu
Арабинозид, Ara
Логарифмы факторов емкости антоцианов, lgk, в элюентах,
содержащих ацетонитрил (% объемн.)
11
10
9
8
0,105
0,216
0,358
0,504
0,627
0,745
0,232
0,349
0,481
0,629
0,755
0,866
0,529
0,660
0,778
0,945
1,088
1,184
0,644
0,752
0,865
1,009
1,135
1,235
19
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 3. 2006. Том 72
дителей (Диасфер-110-С18 и Ultrasphere ODS)
оказались довольно близкими (см. рис. 2).
Согласно литературным данным [6 – 12, 14],
антоцианы черники и голубики содержат в качестве
основных компонентов 3-галактозиды, 3-глюкозиды
и 3-арабонизиды дельфинидина, цианидина, петунидина, пеонидина и мальвидина. Перенос полученных соотношений уравнения (1) и (2) на гликозиды
дельфинидина, петунидина и мальвидина позволил
идентифицировать все основные пики. Результаты
пересчета времен удерживания в сопоставлении с экспериментальными данными представлены в табл. 1.
Видовой состав антоцианов качественно и количественно аналогичен полученному с использованием комплекса сложных исследований [6 – 12, 14].
Строгое количественное определение антоцианов
в исследуемых объектах весьма проблематично изза большого набора необходимых и, как правило,
труднодоступных стандартов. В этом случае
используется спектрофотометрическое определение
[22] с пересчетом на цианидин-3-глюкозид (ε =
= 26900). Но эта процедура практически неприменима
к экстрактам, получаемым из некоторых готовых
форм, из-за заметного искажения спектров сопутствующими добавками. Метод ВЭЖХ при этом может
быть применен без проблем. Солянокислые экстракты
нельзя непосредственно использовать для ВЭЖХ
определения, поэтому в работе для экстракции
использовали 10 %-ный раствор (по объему)
муравьиной кислоты в воде.
Необходимость создания сильнокислой среды, не
благоприятствующей долгому сроку службы хроматографической колонки, обусловлена равновесиями между заряженной флавилиевой формой и
незаряженным (и не поглощающим в видимой части
спектра) полуацеталем, который в достаточно кислой
среде находится, в частности, в равновесии с цис- и
транс-халконами [23].
В данной работе содержание антоцианов (в
пересчете на цианидин-3-глюкозид) в экстрактах ягод
черники определяли спектрофотометрическим
методом. Полученные значения концентрации
антоцианов для экстрактов ягод черники были
использованы для градуировки хроматографической
системы и исследования экстрактов сложных
препаратов, для которых прямое спектрофотометрическое определение невозможно.
По данным спектрофотометрического и хроматографического исследований содержание антоцианов
в пересчете на 1 г ягод варьировалось в пределах
±10 % для параллельных проб ягод (как свежезамороженных, так и сушеных). Это, вероятно, отражает
различие содержания антоцианов в отдельных ягодах,
собранных на разных стадиях созревания (для
экстракта использовали около 1 г ягод в каждой
серии). По этой причине метрологические характеристики хроматографического метода (табл. 3)
определяли с использованием одного концентрированного экстракта и последующих различных
разбавлений.
Таблица 3. Результаты ВЭЖХ определения антоцианов черники и готовых форм на ее основе
Образец
Относительная доля антоцианов по площади пиков, %
S·r
DpGala DpGlu DpAra + CyGlu PtGala CyAra + PtAra + PnGlu + PnAra + MvAra (содер+ CyGala
+ PtGlu + PnGala + MvGala + MvGlu
жание*)
Экстракт:
r= 2
3
4
5
6
7
Среднее
Стандартное
отклонение
Замороженная
После высушивания
“Окулист”
“Визион”
Сушеная
аптечная
13,7
13,6
14,2
13,4
12,7
13,6
13,5
0,48
14,0
14,0
13,9
14,1
12,9
14,1
13,8
0,46
20,5
21,8
21,2
20,5
21,5
19,7
20,9
0,79
8,6
9,4
9,1
9,2
9,4
9,3
9,2
0,30
3,4
4,4
3,8
4,0
4,4
3,9
4,0
0,38
16,6
14,8
15,7
15,6
15,1
16,3
15,7
0,68
3,8
3,5
3,3
3,7
3,6
3,6
3,6
0,19
7,0
7,5
7,5
6,8
7,3
6,9
7,2
0,30
9,9
8,9
9,3
10,4
10,0
10,0
9,8
0,54
2,5
2,0
2,2
2,4
3,0
2,5
2,4
0,34
4,79
4,85
4,70
4,75
4,82
5,12
4,84
0,15
12,6 ÷
13,2
11,7 ÷
13,8
14,3
12,2
12,2
12,1 ÷
10,4
12,8 ÷
13,7
15,5
16,3
14,2
23,4 ÷
28,0
20,1 ÷
21,0
22,7
18,1
20,4
9,4 ÷
7,9
9,9 ÷
9,6
10,0
10,6
16,2
4,5 ÷
4,4
4,0 ÷
4,5
5,1
4,4
5,5
16,3 ÷
15,4
17,6 ÷
15,9
14,4
16,9
15,9
4,4 ÷
4,5
4,2 ÷
4,0
3,6
4,2
1,2
6,7 ÷
6,9
7,4 ÷
7,5
5,6
6,1
7,0
8,6 ÷
7,4
9,5 ÷
8,6
7,8
9,9
6,2
2,1 ÷
2,0
2,6 ÷
1,5
1,0
1,2
1,2
(1,18 ±
± 0,12)
(1,83 ± 0,18)
(1,78 ± 0,08)
(0,26 ± 0,02)
(0,48 ± 0,12)
Примечание. r — степень разбавления экстракта, содержащего 4·10–4 моль/л суммы антоцианов; S — суммарная
площадь пиков; * — в пересчете на цианидина-3-глюкозид, г/100 г.
20
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 3. 2006. Том 72
Исследования свежезамороженных ягод и
высушенных образцов черники показали, что в
отличие от черной смородины потери исходных
антоцианов значительны: в образцах, высушенных
нами на воздухе вне прямого доступа солнечного
света, потери составили около 40 %, в сушеной
чернике, приобретенной в аптеке, они достигали
60 %, а в ряде воздушно-сухих образцов — до
80 %. Расчет сохранности антоцианов проведен по
отношению к свежезамороженной чернике, использованной в качестве образца сравнения, несмотря на
то, что содержание антоцианов в ней оказалось
несколько выше по сравнению с литературными
данными [24, 25] (возможно, вследствие вымораживания части влаги плодов). Отметим, что при
выполнении исследований нам удалось разработать
условия сушки, при которых потери антоцианов не
превышали 10 %.
Использовали элюент, содержащий 12,5 %
объемн. ацетонитрила и 10 % объемн. муравьиной
кислоты в воде; объем пробы — 20 мкл; скорость
расхода элюента — 1 мл/мин; детектирование при
520 нм. Метод позволяет с погрешностью от 5 до
10 % отн. (в зависимости от абсолютного количества
поздно элюирующихся компонентов PnAra, MvGlu,
MvAra) определять содержание индивидуальных
антоцианов и их сумму, принятую в качестве критерия
при расчете содержания антоцианов в образцах [при
суммарной концентрации антоцианов в пробе
(6 – 20)·10–5 моль/л]. Из исследованных готовых
форм максимальное содержание антоцианов найдено
в отечественном препарате “Окулист” и итальянском
“Визион”. В ряде готовых форм других производителей, содержащих чернику, найдено довольно
низкое содержание антоцианов.
Таким образом, показана эффективность
применения метода ВЭЖХ для контроля содержания
антоцианов в исходных ягодах и готовых формах.
Предложен простой и эффективный метод идентификации компонентов сложных смесей антоцианов
с использованием метода анализа относительного
удерживания. Показано, что предлагаемый метод
малочувствителен к замене неподвижных фаз.
Установлено, что при сушке черники возможны
значительные потери антоцианов, поэтому метод
может быть рекомендован для контроля производства
готовых форм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Muth E.R., Laurent J.M., Jasper P. / Altern. Med. Rev.
2000. V. 5. № 2. P. 164 – 173.
2. Levy Y., Glovininsky Y. / Eye. 1998. № 12. P. 967 – 969.
3. Logan A.C., Wong C. / Altern. Med. Rev. 2001. V. 6. № 5.
P. 450 – 459.
4. Colantuoni A., Bertuglia S., Magistretti M.J., Donato
L. / Arzneimittelforschung. 1991. V. 41. P. 905 – 909.
5. Bertuglia S., Magistretti M.J., Calantuoni A. /
Pharmacol. Res. 1995. V. 31. P. 183 – 187.
6. Katsube N., Iwashita K., Tsushida T., Yamaki K., Kobori
M. // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 51. № 1. P. 68 – 75.
7. Krawczyk U., Petri G. / Arch. Pharm. (Weinheim Ger.)
1992. V. 325. № 3. Р. 147 – 149.
8. Cabrita L., Andersen O.M. / Phytochemistry. 1999.
V. 52. № 8. Р. 1693 – 1696.
9. Sellappan S., Akoh C.C., Krewer G. / J. Agric. Food
Chem. 2002. V. 50. № 8. Р. 2432 – 2438.
10. Prior R.L., Lazarus S.A., Cao G., Muccitelli H.,
Hammerstone J.F. / J. Agric. Food Chem. 2001. V. 49.
№ 3. Р. 1270 – 1276.
11. Huopalahti R., Jarvenpaa E.P., Katina K. / J. Liquid
Chromatogr. 2000. V. 23. № 17. Р. 2695 – 2701.
12. Goiffon J.-P., Mouly P.P., Gaydou E.M. / Anal. Chim.
Acta. 1999. V. 32. Р. 39.
13. Клышев Л.К., Бандюкова В.А., Алюкина Л.С.
Флавоноиды растений. — Алма-Ата: Наука, 1978. —
220 с.
14. Вересковский В.В., Шапиро Д.К. / Химия природных
соединений. 1985. № 4. С. 570.
15. Кананыхина Е.Н., Пилипенко И.В. / Химия природных
соединений. 2000. № 2. С. 118 – 120.
16. Дейнека В.И., Григорьев А.М. / ЖАХ. 2004. Т. 59. № 3.
С. 305 – 309.
17. Дейнека В.И., Григорьев А.М. / Журнал физической
химии. 2004. Т. 78. № 5. С. 923 – 926.
18. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Староверов В.М.,
Борзенко О.Н. / Химия природных соединений. 2003.
№ 2. С. 137 – 139.
19. Goiffon J.-P., Brun M., Bourrier M.J. / J. Chromatogr.
1991. V. 537. P. 101 – 121.
20. Cantos E., Espin J.C., Tomas-Barberan F.A. / J. Agric.
Food Chem. 2002. V. 50. P. 5691 – 5696.
21. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Ермаков А.М. / Химия
природных соединений. 2003. № 5. С. 412 – 413.
22. Giusti M.M., Wrolstad R.E. — In: Current Protocols in
Food Analytical Chemistry. — N.Y.: John Wiley & Sons,
Inc, 2000. Unit F2.2. Ch. 2.
23. Goto T. / Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 1987. V. 52.
P. 113 – 158.
24. Wu X., Cao G., Prior R.L. / J. Nutr. 2002. V. 132. № 7.
Р. 1865 – 1871.
25. Nyman N.A., Kumpulainen J.T. / J. Agric. Food Chem.
2001. V. 49. P. 4183 – 4187.