днк-днк взаимодействия в области микросателлитных повторов
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. Н.Н. БЛОХИНА На правах рукописи КАРПЕЧЕНКО НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА ДНК-ДНК ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ОБЛАСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ПОВТОРОВ КАК ФАКТОР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ, ВОВЛЕЧЕННЫЙ В ПРОЦЕСС КАНЦЕРОГЕНЕЗА (Онкология - 14.01.12) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: д.м.н. М.Г. Якубовская Москва 2014 2 Содержание ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………... 6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………............. 11 1.1. Гомологичная рекомбинация……………………………………………… 11 1.1.1. Основные стадии и пути гомологичной рекомбинации……………….. 11 1.1.2. Основные белки, вовлеченные в соматическую гомологичную рекомбинацию у человека……………………………………………………….. 14 1.1.3. Гомологичная рекомбинация в процессе канцерогенеза……………………. 17 1.1.4. Гомологичная рекомбинация при лечении онкологических заболеваний ………………………………………………………………………. 19 1.1.5. Распределение рекомбинационных событий по геному………………… 23 1.2. (CA/TG)n-микросателлитные последовательности……………………….. 25 1.2.1. Локализация и особенности строения poly(CA/TG)-локусов…………….25 1.2.2. Функциональные возможности (СА/TG)n-повторов ………………....... 26 1.2.2.1. Роль микросателлитных повторов в организации хроматина………... 26 1.2.2.2. Роль (СА/TG)n-повторов в регуляции экспрессии генов……………... 27 1.2.2.3. Участие (СА/TG)n-повторов в гомологичной рекомбинации………... 29 1.2.3. Структурные особенности poly(CA/TG)……………………………….... 31 1.2.3.1. poly(CA/TG) и Z-форма ДНК………………………………………….. 31 1.2.3.2. poly(CA/TG) и квадруплексная структура……………………………. 35 1.2.4. Мутационная изменчивость poly(СА/TG) и системы контроля стабильности у различных организмов………………………………………... 35 1.2.4.1. Механизмы изменения числа повторяющихся единиц в CAмикросателлитах………………………………………………………………… 37 1.2.4.2. Факторы, влияющие на стабильность (CA/TG)n-повторов…………. 39 1.3. CA-микросателлиты как сайты инициации и терминации гомологичной рекомбинации…………………………………………………... 42 1.3.1. CA-микросателлиты как сайты терминации гомологичной рекомбинации: модельные системы и предварительные данные…………… 42 3 1.3.2. CA-микросателлиты как сайты инициации гомологичной рекомбинации…………………………………………………………………… 45 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………………. 47 2.1. Список использованных реактивов и олигонуклеотидов………………... 47 2.2. Процедура клонирования последовательностей (CA/TG)10, (CA/TG)15, (CA/TG)25, (CA/TG)31 и RI (рэндомная) в полилинкерный сайт плазмиды PUC19……………………………………………………………………………. 50 2.2.1. Фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов………………... 50 2.2.2. Процедура формирования дуплексов…………………………………… 51 2.2.3. Реакция лигирования ДНК………………………………………………. 51 2.2.4. Трансформация бактериальных клеток E.Coli штамма XL10-Gold…... 51 2.2.4.1. Приготовление компетентных клеток E.Coli штамма XL10-Gold….. 51 2.2.4.2. Трансформация компетентных клеток E.Coli штамма XL10-Gold с использованием «бело-голубой» селекции……………………………………. 52 2.3. Выделение плазмидной ДНК…………………………………………….... 53 2.4. Выделение геномной ДНК из ткани………………………………………. 54 2.5. Обработка плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции……………… 55 2.6. Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции………. 55 2.7. Осаждение ДНК в этаноле…………………………………………………. 56 2.8. Кинирование 5'-концов олигонуклеотидов радиоактивным фосфором... 56 2.9. Электрофоретическое разделение ДНК…………………………………... 57 2.10. Визуализация ДНК………………………………………………………... 57 2.10.1. Окрашивание ДНК с помощью SYBR Gold…………………………... 57 2.10.2. Окрашивание ДНК с помощью бромистого этидия………………….. 58 2.10.3. Авторадиография………………………………………………………... 58 2.10.4. Визуализация ДНК, несущей флуоресцентные зонды FAM и TAMRA…………………………………………………………………………... 58 2.11. Извлечение ДНК из агарозного геля…………………………………….. 59 2.11.1. Экстракция с помощью ДНК-связывающего матрикса на основе двуокиси кремния……………………………………………………………….. 59 4 2.11.2. Выделение ДНК с помощью электроэлюции…………………………. 60 2.12. Определение концентрации ДНК и SYBR Gold………………………… 60 2.13. Электронная микроскопия………………………………………………... 60 2.14. Статистическая обработка результатов электронной микроскопии…... 61 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………………………... 62 3.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного расителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания……………………….. 62 3.1.1. Определение стабильности комплекса SG - ДНК при проведении агарозного гель-электрофореза…………………………………........................ 63 3.1.2. Выявление несвязавшегося с ДНК SYBR Gold в растворах при различных количественных соотношениях краситель/ДНК…………………. 65 3.1.3. Зависимость электрофоретической подвижности окрашенной ДНК от соотношения SG/ДНК………………………………………………………….. 67 3.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (CA/TG)nповторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации…………………………………………………………………… 70 3.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея……………………………………………………………… 70 3.2.1.1. Модельная система……………………………………………………... 70 3.2.1.2. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных ПЦР-продуктами…………………………………… 73 3.2.1.3. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК…………………… 74 3.2.1.4. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК, несущими разное число (CA/TG)n-повторов……………………………………………………… 75 3.2.2.Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК…………………… 76 3.2.2.1. Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов……………………... 77 5 3.2.2.2. Инвазия олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в эукариотическую ДНК………………………………………………………………………………. 79 3.2.2.3. Олигонуклеотидная инвазия в ди-, три- и терануклеотидные последовательности……………………………………………………………... 80 3.2.2.4. Анализ возможности олигонуклеотидной инвазии в (CA/TG)nпоследовательность дуплексной ДНК после удаления ранее сформированного комплекса…………………………………………………… 83 3.2.2.5. Встраивание олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в дуплексную ДНК с разной длиной (CA/TG)n-повтора……………………………………... 86 3.2.2.6. Зависимость интенсивности инвазии олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в плазмиду, содержащую (CA/TG)31-повтор, от мольного соотношения плазмида/олигонуклеотид……………………………………… 87 3.2.2.7. Олигонуклеотидная инвазия в разных солевых условиях…………… 89 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЯ………………………………………………………. 92 4.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного расителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания……………………….. 92 4.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (CA/TG)nповторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации…………………………………………………………………… 96 4.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея……………………………………………………………… 97 4.2.2. Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК…………………… 100 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………. 105 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………... 108 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………... 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………. 111 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Соматическая гомологичная рекомбинация (ГР) – один из ключевых механизмов поддержания стабильности генома клетки, обеспечивающий репарацию двунитевых разрывов ДНК. Дефекты данной репарационной системы повышают вероятность злокачественной трансформации клетки при действии генотоксических факторов и обнаруживаются в опухолевых клетках в виде хромосомных аберраций. Лежащее в основе ГР копирование генетической информации с гомологичной молекулы ДНК в ряде случаев сопровождается потерей гетерозиготности, что, в свою очередь, приводит к манифестации рецессивных мутаций, одному из наиболее распространенных процессов при канцерогенезе. Этот механизм лежит в основе патогенеза наследственной ретинобластомы и опухолей при синдроме Ли-Фраумени. Многочисленные данные свидетельствуют о неравномерном распределении по геному рекомбинационных событий. «Горячими» точками рекомбинации являются микросателлитные последовательности ДНК, наиболее распространенная из которых – poly(CA/TG). Механизмы, лежащие в основе влияния микросателлитных повторов на частоту ГР до настоящего времени остаются практически неизученными. Одним из возможных объяснений подобного влияния служит наличие конформационных особенностей в области микросателлитных повторов, влияющих на стадии инициации и (или) терминации ГР. Понимание механизмов влияния (CA/TG)n-повторов необходимо для выявления локусов с наибольшей предрасположенностью к потере гетерозиготности, что раскроет возможности для формирования групп риска и позволит более точно определять прогноз заболевания. Таким образом, изучение закономерностей ДНК-ДНК взаимодействий в области микросателлитных повторов является актуальной задачей современной молекулярной биологии и экспериментальной онкологии. 7 Цели и задачи исследования Целью данного исследования являлось изучение важных для инициации и терминации гомологичной рекомбинации структурно-функциональных особенностей микросателлитных (CA/TG)n-локусов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: оптимизация 1. метода визуализации ДНК с использованием флуоресцентного красителя SYBR Gold (SG) по протоколу предокрашивания; анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста 2. структур Холлидея; изучение 3. закономерностей взаимодействия (инвазии) олигонуклеотидов d(СА)10 и d(GT)10 с гомологичным участком плазмидной ДНК, а также геномной ДНК человека; анализ возможности олигонуклеотидной инвазии в другие, также 4. широко распространенные, микросателлитные локусы: (CT/GA)n, (AT/TA)n, (CAG/GTC)n, (СТТ/GAA)n, (CGG/GCC)n, (GGT/CCA)n и (GGGT/CCCA)n. Научная новизна В настоящем исследовании впервые проведено изучение закономерностей ранее показанного олигонуклеотидов последовательность в d(CA)10 лаборатории и d(TG)10 дуплексной ДНК. М.Г. во Якубовской внутреннюю Установлено, встраивания комплементарную что структурные особенности (CA/TG)n-повтора, лежащие в основе образования комплекса олигонуклеотид-ДНК, формируются in vivo и остаются стабильными на протяжении экстракции ДНК. Показано, что интенсивность инвазии одноцепочечных фрагментов d(CA)10 и d(GT)10 в (CA/TG)n-повторяющуюся последовательность сверхспирализованной плазмидной ДНК зависит от длины микросателлитного локуса следующим образом: (CA/TG)31 = (CA/TG)94 > (CA/TG)10 > (CA/TG)15 = (CA/TG)25. При изучении влияния мольного соотношения дуплекс/олигонуклеотид на интенсивность 8 взаимодействия (CA/TG)n-локуса плазмидной ДНК с комплементарными одноцепочечными фрагментами, обнаружено повышение интенсивности инвазии олигонуклеотидов с увеличением соотношения от 1/10 до 1/1, при достижения которого, дальнейшего возрастания интенсивности встраивания не происходит. Установлено, что интенсивность взаимодействия микросателлитных локусов (CA/TG)31 с одноцепочечными фрагментами d(CA)10 и d(GT)10, не изменяется при использовании ряда солевых буферных растворов, однако снижается в безсолевых условиях. Кроме того, анализ возможности олигонуклеотидного встраивания в другие микросателлитные последовательности показал, что среди (GA/TC)n-, (TA/AT)n-, (CAG/GTC)n-, (CGG/GCC)n-, (CTT/GAA)n-, (GGT/CCA)nи (GGGT/CCCA)n-повторов, такой способностью обладают только длинные формирующие (CTT/GAA)n-локусы, в условиях отрицательной сверхспирализации неканоническую H-форму ДНК. В рамках изучения функционирования (CA/TG)n-повторов в качестве точек терминиции ГР с помощью электронной микроскопии установлено, что гетерология между микросателлитными локусами (CA/TG)n в шесть повторяющихся единиц ингибирует миграцию ветвей структуры Холлидея, промежуточного продукта рекомбинационного процесса, чего не наблюдается в случае полной гомологии. Кроме того, при проведении данного исследования предложен новый подход в использовании для визуализации ДНК флуоресцентного красителя SYBR Gold (SG), основанный на отсутствии влияния последнего на электрофоретическую подвижность ДНК при низких соотношениях SG/ ДНК. Оптимизированный метод окрашивания нуклеиновых кислот позволяет более рационально использовать этот дорогостоящий краситель. Научно-практическая значимость исследования Настоящая работа посвящена изучению актуальной проблемы, касающейся молекулярных механизмов канцерогенеза. В данном оригинальном исследовании продемонстрированы закономерности взаимодействия дуплексной ДНК с 9 одноцепоченым фрагментом в области микросателлитных повторов, объясняющие их функционирование в качестве «горячих точек» соматической ГР. Полученные данные о взаимодействии микросателлитных локусов (CA/TG)n c комплементарной одноцепочечной ДНК, влиянии на этот процесс длины повторяющейся последовательности и мольного соотношения дуплекс / олигонуклеотид, а также о способности гетерологии в области (CA/TG)n-повтора ингибировать миграцию ветвей структуры Холлидея расширяют представление о молекулярных механизмах рекомбинационной репарации и причинах генетической нестабильности. Результаты исследования важны для сравнительной оценки вероятности соматической ГР по различным повторяющимся последовательностям, что в перспективе должно позволить выявлять предрасположенность к потере гетерозиготности по определенным локусам и, соответственно, определять риск развития онкологического заболевания и способствовать составлению более точного прогноза его течения. Кроме того, оптимизированный в ходе данной работы протокол использования флуоресцентного красителя ДНК SYBR Gold расширяет возможности его применения в молекулярно-биологических исследованиях, позволяя в целом ряде случаев избежать использования мутагенных и токсичных соединений. Методы исследования Работа выполнена биологических методов с использованием исследования классических (полимеразная молекулярно- цепная реакция, культивирование бактериальных клеток, выделение и очистка ДНК из клеток и тканей, молекулярное клонирование, электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле), электронной микроскопии и статистической обработки полученных данных. Кроме того, в настоящей работе для изучения ДНК-ДНК взаимодействий, наряду с введением радиоактивной метки, применен более современный подход, основанный на использовании флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов и флуоресцентного красителя последнего поколения SYBR Gold. 10 Положения, выносимые на защиту 1. В структуре микросателлитных (CA/TG)n-локусов in vivo возникают конформационные особенности, обуславливающие возможность их спонтанного взаимодействия с одноцепочечными фрагментами d(CA)10 и d(GT)10. Среди 2. других микросателлитных локусов способностью к спонтанному взаимодействию с гомологичной одноцепочечной ДНК обладают только длинные (CTT/GAA)n-повторы, формирующие в условиях отрицательной сверхспирализации неканоническую H-форму ДНК. Интенсивность взаимодействия d(CA)10 и d(GT)10 с (CA/TG)n-локусом 3. дуплексной ДНК зависит от длины повтора, соотношения дуплекс / олигонуклеотид и солевых условий. 4. Обладающие полной гомологией (СА/TG)n-микросателлитные локусы не влияют на миграцию ветвей структуры Холлидея, промежуточного продукта гомологичной рекомбинации, в то время как гетерология в области повторяющейся последовательности ингибирует данный процесс, что может способствовать ее ферментативному разрешению в этих участках генома. 5. Оптимизированный в ходе данной работы протокол визуализации ДНК с помощью флуоресцентного красителя последнего поколения SYBR Gold позволяет сократить финансовые и временные затраты на этапе пробоподготовки ДНК и избежать использования токсичных и мутагенных соединений. Апробация результатов Результаты работы были представлены 28 сентября 2012 года на совместной научной конференции лабораторий отдела лабораторий отдела трансформирующих химического генов опухолей, канцерогенеза, лаборатории онкогеномики и лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Основные положения диссертации представлены на 4 международных научных конференциях. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. 11 1. 1.1. Соматическая ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Гомологичная рекомбинация гомологичная рекомбинация (ГР) представляет собой ключевой механизм поддержания стабильности генома, обеспечивающий репарацию двунитевых разрывов ДНК и восстановление процесса репликации в случае остановки репликативной вилки. В его основе лежит копирование генетической информации с неповрежденной гомологичной молекулы ДНК (гомологичной хромосомы или сестринской хроматиды), что, в отличие от других путей репарации двунитевых разрывов ДНК, позволяет полностью восстановит структуру поврежденного локуса. Дефекты в системе ГР приводят к геномной нестабильности, играющей значительную роль в патогенезе как наследственных, так и спорадических форм онкологических заболеваний. С другой стороны, даже в отсутствии дефектов по данной репарационной системе, ГР может вносить значительный вклад в процесс канцерогенеза, что обусловлено потерей гетерозиготности и, соответственно, манифистацией имеющихся в геноме рецессивных мутаций. Понимание механизмов ГР и выявление ее дефектов, характерных для тех или иных онкологических заболеваний, в настоящее время уже легло в основу диагностических критериев, составления прогноза течения заболевания и выбора варианта химиотерапевтического лечения. Более того, дальнейшее детальное изучение белков и путей ГР, а также их связи с другими системами поддержания стабильности клеточного генома, открывает широкие перспективы при разработке новых противоопухолевых препаратов и терапевтических стратегий. 1.1.1. Основные стадии и пути гомологичной рекомбинации ГР представляет собой сложный, многоэтапный процесс, вовлекающий большое количество различных белковых ансамблей. Многочисленные работы, 12 направленные на изучение этой репарационной системы, привели к значительному прогрессу в понимании механизмов, лежащих в ее основе, однако окончательно сложившейся картины, всесторонне описывающей данный процесс, пока не существует. Согласно наиболее распространенной на сегодняшний день гипотезе в ходе ГР условно выделяют три основные стадии: пресинаптическую, синаптическую и постсинаптическую. Кроме того, считается, что в зависимости от особенностей двунитевого разрыва ДНК ГР может пойти по трем различным путям (рис.1). Первая, пресинаптическая стадия инициируется возникновением двунитевого разрыва ДНК и заключается в деградации 5′-конца ДНК в области разрыва. В ходе следующей, синаптической стадии на основании ранее образовавшегося формирование выступающего нуклеопротеинового 3′-конца молекулы филамента, ДНК способного происходит встроиться в комплементарную область гомологичного дуплекса ДНК. В результате такого взаимодействия образуется, так называемая, D-петля (от англ. displacement loop): встроившаяся одноцепочечная ДНК взаимодействуя с комплементарной цепью дуплекса, вытесняет вторую цепь (рис.1Г). Сформировавшаяся при этом крестообразная структура из цепей ДНК носит название «полухиазмы Холлидея» (по имени автора впервые описавшего данный процесс). Ее перемещение вдоль рекомбинирующих дуплексов - «миграция ветвления», сопровождается необходимым репаративным синтезом. На последней постсинаптической стадии происходит разрешение сложной четырехцепочечной структуры в две интактные молекулы ДНК, которые в зависимости от выбранного пути ГР, могут быть как кроссоверными, так и не кроссоверными [1]. 13 А. BIR - break-induced replication, Б. SDSA - synthesis-dependent strand annealing, В. DSBR - double-strand break-repair, Г. D-петля (от англ. displacement loop) Рисунок 1 - Стадии и пути гомологичной рекомбинации На сегодняшний день известны три пути ГР, доминирующим из которых в соматических клетках является SDSA (synthesis-dependent strand annealing). В ходе данного пути комплементарную после встраивания область нуклеопротеинового гомологичного дуплекса и филамента в необходимого репаративного синтеза, происходит поворот D-петли и освобожденный вновь синтезированный конец молекулы соединяется с комплементарной цепью ДНК, несущей двунитевой разрыв. Таким образом, исходом SDSA является образование двух некроссоверных молекул. При втором возможном пути ГР, 14 DSBR (double-strand break-repair), происходит захват и второго конца двунитевого разрыва ДНК с образование сразу двух структур Холлидея, различное направление разрешения которых может приводить как к образованию кроссоверных, так и некроссоверных молекул. Наконец третий путь ГР, BIR (break-induced replication) запускается при отсутствии второго конца двунитевого разрыв ДНК. В этом случае, сформированная в синаптическую стадию, D-петля становится репликативной вилкой. При неполной гомологии между молекулами ДНК, участвующими в данном процессе, этот путь может быть чреват возникновением нереципроктных транслокаций [2]. 1.1.2. Основные белки, вовлеченные в соматическую гомологичную рекомбинацию у человека ГР, как и любой другой сложный биохимический процесс с участием нуклеиновых кислот (репликация, транскрипция, трансляция) требует вовлечения большого количества белков. Данный раздел охватывает лишь некоторые, наиболее изученные, белки соматической ГР человека. И так, на первом этапе, образовавшийся двунитевой разрыв ДНК распознается белковым комплексом MRN (Mre11-Rad50-Nbs1). MRN связывается с ДНК по обе стороны разрыва, стабилизируя последний и запуская ATMсигнальный каскад чекпоинта клеточного цикла [3,4]. Последующая деградация 5′-концевых областей ДНК происходит в два этапа. Первоначальная резекция выполняется при участи MRN-комплекса и белка CtIP [5]. На втором этапе подключаются уже такие нуклеазы и хеликазы как hEXO1, DNA2 и BLM [6]. Ключевым белком ГР, катализирующим главную стадию этого процесс, а именно встраивание 3′-конца молекулы ДНК в комплементарную последовательность гомологичного дуплекса и образование D-петли, является RAD51 [7]. Этот белок представляет собой ДНК-зависимую АТФазу, структура которой высоко консервативна среди эукариот. Вместе с выступающим концом двунитевого разрыва ДНК RAD51 формирует 3′- спиральный 15 нуклеопротеиновый филамент, включающий в себя 18-19 нуклеотидов и около 6 молекул белка [8]. Именно этот филамент осуществляет поиск комплементарного участка на гомологичной молекуле ДНК. Внутри нуклеопротеинового филамента ДНК оказывается вытянутой приблизительно на 50% по сравнению с В-формой. Однако удлинение ДНК происходит не по всей длине: однонитевая ДНК имеет повторяющуюся единицу из трех нуклеотидов, поддерживающих В- конформацию, в то время как ДНК между этими триплетами сильно растягивается. Участки ДНК с неизмененной конформацией необходимы для создания водородных уотсон-криковских связей с комплементарными триплетами дуплексной ДНК [9]. Другим важным белком пресинаптической и синаптической стадий является RPA (replication protein A), играющий двоякую роль в процессе ГР. В пресинаптическую стадию он связывается с однонитевым концом разрыва, предотвращая, таким образом, формирование вторичных структур ДНК, способных мешать сборки нуклеопротеинового филамента. В течение синаптической стадии RPA способствует удлинению гетеродуплексной области путем связывания с перемещающимся однонитевым концом ДНК [10-13]. С другой стороны, RPA может ингибировать процесс ГР. Обладая очень высоким сродством к однонитевой ДНК, RPA связывается с ней намного быстрее RAD51, тем самым, препятствуя образованию нуклеопротеинового филамента. Ингибирующее действие RPA на этот процесс преодолевается с помощью специальных белков – медиаторов рекомбинации, например, таких как BRCA2, RAD51B-RAD51C, RAD52 и других [14-18]. Самым известным и лучше всего изученным из данного списка является белок BRCA2, кодируемый одноименным геном-супрессором опухолевого роста. Это большой белок размером около 410 кДа, включающий в себя несколько доменов, способных связываются как с RAD51, так и с молекулой ДНК [19]. Он способствует формированию нуклеопротеинового филамента, стимулирует обмен нитями ДНК и препятствует образованию нефункционального комплекса RAD51-двунитевая ДНК [20]. Еще одним белком, помогающим преодолеть ингибирующее действия RPA, является 16 RAD52. Он формирует комплекс с RAD51 и перемещает его на однонитевую ДНК, покрытую RPA, способствуя вытеснению последнего [21]. На конечных этапах ГР основными белками становятся различные хеликазы и резолвазы, участвующие в разрешении структур Холлидея, в частности, для человека это BLM-хеликазы, SLX4, а также комплекс RAD51C-XRCC3 [22-25]. Более подробный перечень известных в настоящее время белков соматической ГР человека и их предполагаемые функции отражены в Таблице 1. Таблица 1 - Основные белки соматической гомологичной рекомбинации человека Белок (белковый Функция белка (белкового комплекса) Ссылка комплекс) BLM-TOP3α-RMIIКомплекс принимает участие в разрешении 34 RMI2 двойных структур Холлидея BRCA1 Участвует в ремоделировании хроматина, 36 обладает лигазной активностью; взаимодействует с RAD51, MRN-комплексом BRCA2 Медиатор рекомбинации, способствует 19, 26, образованию нуклеопротеинового филамента; 27, 28 взаимодействует с однонитевой ДНК, RPA, RAD51, PALB2 CtIP Осуществляет резекцию 5′-концов 5 двунитевого разрыва ДНК DNA2 Обладает нуклеазной и хеликазная 35 активностью hEXO1 Обладает 5′-3′-экзонуклеазной активностью 6 MRN-комплекс Связывается с двунитевым разрывом ДНК, 1, 3, 4 (Mre11-Rad50-Nbs1) стабилизируя его; запускает АТМ-сигнальный каскад чекпоинта клеточного цикла PALB2 Стимулирует RAD51-опосредованное 39, 40 формирование D-петли Polδ, Polη Осуществляют репарационный синтез 44, 45 RAD51 Ключевой белок ГР: участвует в 7, 37, 38 формировании нуклеопротеинового филамента, синапсисе двух молекул ДНК и последующем обмене нитями ДНК 17 Продолжение таблицы 1 RAD51B-RAD51C RAD51D-XRCC2 RAD51C-XRCC3 RAD52 RAD54 RPA RTEL1 SLX1-SLX4 MUS81-EME1 ResA (GEN1) Семейство RecQхеликаз Медиаторы рекомбинации; участвуют в разрешении структур Холлидея 1, 24 Медиатор рекомбинации, способствует образованию нуклеопротеинового филамента, преодолевая ингибирующее действие RPA; участвует в захвате второго конца двунитевого разрыва ДНК; взаимодействует с однонитевой ДНК, RAD51 и RPA Стабилизирует нуклеопротеиновый филамент; стимулирует обмен нитями ДНК; участвует в ремоделировании хроматина во время поиска гомологи, а также в разрешении структур Холлидея Предотвращает формирование вторичных структур ДНК, способствует удлинению гетеродуплексной области; может препятствовать посадки RAD51 на ДНК Является промотором SDSA-пути ГР: способствует перемещению 3′-конца разрыв и последующему отжигу нитей ДНК Эндонуклеазы, участвующие в разрешении структур Холлидея 21, 29, 30 Включает 5 членов: RecQL1, RecQL4, RecQL5, BLM и WRN. Участвуют на всех этапах ГР 46 31, 32, 33 10,12 41 42, 43 1.1.3. Гомологичная рекомбинация в процессе канцерогенеза ГР – одна из ведущих систем поддержания стабильности генома, дефекты которой повышают вероятность злокачественной трансформации клеток. При этом такие дефекты могут лежать в основе как наследственного, так и спорадического канцерогенеза. Ярким примером наследственных заболеваний, ассоциированных с высоким риском развития злокачественных опухолей, являются три синдрома: Блума, Вернера и Ротмунда-Томсона. Все они связаны с мутациями в семействе RecQ- 18 хеликаз, состоящем у человека из пяти членов: RecQL1, RecQL4, RecQL5, BLM и WRN [46]. Синдром Блума - аутосомно-рецессивное заболевание, впервые описанное в 1954 году. Возникающее в следствие нарушений в гене BLM, оно характеризуется гиперрекомбинантным фенотипом и ломкостью хромосом у таких больных. Пациенты с этим синдромом имеют высокий риск развития различных онкологических заболеваний, особенно лейкозов, лимфом и аденокарцином [47]. Мутации в гене WRN связаны с синдромом Вернера, который также наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Для него характерна геномная нестабильность и предрасположенность к онкологическим заболеваниям всех типов [48]. Синдром Ротмунда-Томсона является результатом дефекта в гене RecQL4. У таких больных отмечают высокий риск развития остеосарком в детском возрасте и различных карцином в дальнейшем [49]. Помимо мутаций в семействе RecQ-хеликаз, в середине 1990-х годов были идентифицированы два гена, дефекты которых ассоциированы с подавляющим большинством наследственных форм рака молочной железы, - BRCA1 и BRCA2 [50,51]. Мутации этих генов обнаруживаются также при раке яичников, простаты, поджелудочной железы, желудка и меланоме [52,53]. Кроме вышеописанных наследственных заболеваний, нарушения в системе ГР наблюдаются и в случае самых разнообразных спорадических опухолей. Так, например, мутации PALB2 встречаются при раке поджелудочной железы, RAD51 и XRCC3 – при миелоидном лейкозе, мутации RAD54B и RAD51B были идентифицированы в первичных карциномах прямой кишки, лимфомах и маточной лейомиоме, а мутации RAD52 и CtIP характерны для неходжкинских лимфом [54-57]. С другой стороны, даже при нормальном функционировании, ГР может вносить значительный вклад в процесс канцерогенеза. Лежащее в основе данного репарационного механизма восстановление поврежденной структуры локуса хромосомной ДНК за счет взаимодействия с неповрежденным локусом, расположенным на гомологичной хромосоме, в ряде случаев приводит к переходу аллелей в гомозиготное состояние [58,59]. Потеря гетерозиготности является 19 одним из важнейших событий в патогенезе и наследственных, и спорадических опухолей [60, 61]. Так, например, если в исходной клетки один из аллелей генасупрессора опухолевого роста был нормальным, а второй - мутантным, то ГР может приводить к образованию опухолевой клетки, гомозиготной по мутантному гену. Именно этот механизм является основным в возникновении опухолей у пациентов с наследственной ретинобластомой, синдромом ЛиФраумени и нейрофиброматозом [62-64]. Кроме того, потеря гетерозиготности в результате ГР приводит к манифестации накопленных в течение всей жизни рецессивных мутаций, что объясняет существенное повышение частоты онкологических заболеваний улиц пожилого возраста. 1.1.4. Гомологичная рекомбинация при лечении онкологических заболеваний Основной целью лучевой и химиотерапии, применяемых при лечении онкологических заболеваний, является повреждение ДНК, приводящее, в конечном счете, к гибели опухолевых клеток. При этом лучевая терапия и ряд химических соединений, например, алкилирующие агенты, напрямую вызывают изменения в структуре нуклеиновых кислот, а другие химиотерапевтические препараты, в частности ингибиторы топоизомераз, - опосредованно, через повреждение белков, участвующих в метаболизме. Наиболее опасными для жизни клетки являются двунитевые разрывы ДНК, исправления которых осуществляется системой ГР. Этот репарационный механизм наиболее активен в S и G2 фазах клеточного цикла, т.е. как раз в интенсивно делящихся опухолевых клетках. Поэтому состояние системы ГР таких клеток представляет собой важный критерий выбора стратегии лечения и составления прогноза течения заболевания. Так, зачастую, этот репарационный механизм, в норме поддерживающий целостность и стабильность генома, существенно усложняет лечение того или иного онкологического заболевания, являясь причиной возникновения лекарственной устойчивости. Например, было показано, что эффективность 20 использования этопозида (ингибитора топоизомеразы II) при лечении мелкоклеточного рака легкого коррелирует с уровнем экспрессии в опухолевых клетках RAD51 – одного из ключевых белков ГР [65]. С гиперэкспрессией этого белка связана и устойчивость ряда клеточных линий к гидроксимочевине ингибитору рибонуклеотид-редуктазы, применяемому в терапии миелопролиферативных заболеваний [66]. Подавление функционирования ГР в опухолевых клетках представляется на сегодняшний день перспективным направлением в области разработки новых противоопухолевых препаратов. И хотя многочисленные попытки создания прямых ингибиторов ГР пока не увенчались успехом, уже нашли свое применение химиотерапевтические агенты, косвенно затрагивающие эту репарационную систему. Иматиниб («Gleevec») и эрлотиниб – ингибиторы тирозинкиназ, влияющие на ядерную локализацию белков RAD51 и BRCA1, используются при лечении хронического миелолейкоза и немелкоклеточного рака легкого соответственно [67]. Кроме того, было показано, что иматиниб повышает чувствительность клеток хронического лимфолейкоза к хлорамбуцилу, а глиомы - к лучевой терапии [68]. В стадии разработки находятся ингибиторы и других киназ, в частности, CHK1, CHK2, ATM, и хотя самостоятельное использование этих соединений затруднено из-за отсутствия селективности в отношении опухолевых клеток, преклинические испытания показали перспективность их применения в составе комбинированной терапии и при лечении опухолей со специфическими генетическими дефектами [69]. С другой стороны, клетки значительной части новообразований человека являются дефектными по системе ГР, что зачастую и лежит в основе развития заболевания. Такие клетки демонстрируют гиперчувствительность к широкому спектру химиотерапевтических препаратов. Например, показана высокая эффективность цисплатина в отношении BRCA1-негативных форм рака легкого и яичников, а камптотецина (ингибитора топоизомеразы II) – WRN-дефицитных клеток [70-72]. Особо перспективным на настоящей момент времени считается применение ингибиторов PARP для лечения BRCA1/2-негативных вариантов 21 опухолей. PARP – белок, принимающий участие в репарации однонитевых разрывов ДНК. В его отсутствие в геноме клетки возникает большое количество нерепарированных одноцепочечных разрывов, которые со временем трансформируются в двунитевые. В нормальной клетке последние исправляются системой ГР, что является невозможным в BRCA1/2-негативных опухолевых клетках (рис. 2). Применение ингибиторов PARP, в частности олапариба, позволило снизить побочные эффекты противоопухолевой терапии и увеличить показатель безрецидивной выживаемости у больных с раком яичников и молочной железы [67, 69]. 22 Цифрой 1 обозначен двунитевой разрыв ДНК, 2 – однонитевой разрыв ДНК Рисунок 2 - Механизм синтетической летальности, обусловленной действием ингибиторов PARP в BRCA1/2-дефицитных клетках 23 1.1.5. Распределение рекомбинационных событий по геному Как уже было сказано в предыдущих главах, ГР - это сложный биохимический процесс, сопряженный с множеством других клеточных систем, и требующий тонкой и многоплановой регуляции, осуществляемой с помощью всевозможных белковых молекул и комплексов. Но, как показали исследования, не только белки, но и сама молекула ДНК оказывает существенное влияние на этот процесс. Первоначально считалось, что рекомбинационные события происходят по геному равномерно и не зависят от локальных особенностей ДНК. Это предположение долгое время составляло основу изучения структуры хромосом. При создании генетических карт расстояние между генами рассчитывалось исходя их частоты рекомбинационных событий между определенными маркерами. Однако много позже, с развитием современной генетики и молекулярной биологии, стало ясно, что генетические карты отражают лишь приблизительное расположение генов, но не расстояние между ними. Многочисленные исследования выявили наличие так называемых «горячих» точек рекомбинации – участков генома, где данный процесс происходит чаще всего. Их существование показано для бактериофагов, бактерий, дрожжей и млекопитающих [73]. «Горячими» точками рекомбинации человеческого генома являются микросателлитные повторы ДНК, что, в частности, было продемонстрировано в работе Мажевски и соавторов при изучении рекомбинационных событий на 22-ой хромосоме [74]. микросателлитных повторов) с Анализ физической последовательностей последующей локализации (ди-, статистической три- и обработкой 59 маркеров и тетрануклеотидных данных выявили положительную корреляцию между плотностью микросателлитных повторов и интенсивностью рекомбинации. Причем наибольший вклад в эту корреляцию вносили динуклеотидные (СА/TG)n-повторы. 24 1.2. (CA/TG)n-микросателлитные последовательности Poly(CA/TG), они же (CA/TG)n–повторы или CA-микросателлиты, являются одними из наиболее распространенных микросателлитных последовательностей млекопитающих, включая человека. Как и все повторяющиеся последовательности ДНК, они долгое время считались балластной, не имеющей функциональной значимости. К настоящему времени, однако, уже накоплено достаточно большое количество данных, заставляющих понять ошибочность первоначального мнение о CA-микросателлитах. Данный раздел посвящен структурно-функциональным особенностям, мутационной изменчивости, а также системам контроля стабильности poly(CA/TG). 1.2.1. Локализация и особенности строения poly(CA/GT)-локусов Poly(СА/TG) являются вторым по распространенности (после мононуклеотидных) и наиболее распространенным динуклеотидным повтором позвоночных, представителей из числа насекомых и моллюсков, а также грибов и растений [75-77]. У человека СА-микросателлиты занимают около 105 пар оснований (0,25% генома) и локализованы в таких транскрибируемых районах генов, как интроны, а также в 5’- и 3’-нетранслируемых областях (НТО), с преобладанием в последних (52,3%) [78-80]. В частности, они были обнаружены в не кодирующих белок областях генов актинов, гистонов, тяжелых цепей иммуноглобулинов, глобинов, нейроэндокринных факторов, таких, как соматостатин и гормон роста [81-85]. Классический микросателлитный локус poly(СА/TG) состоит из одного типа повторяющейся субъединицы. Однако часто микросателлитные локусы ДНК могут быть нарушены в результате замены основания (несовершенные, ―imperfect‖, микросателлиты) микросателлиты). Кроме или того, инсерции CA-элементы (нарушенные, могут ―interrupted‖, входить в состав микросателлита, состоящего из нескольких типов повторяющихся субъединиц, 25 образуя, таким образом, сложные повторяющиеся последовательности. И, наконец, тандемные poly(СА/TG) были найдены в составе диспергированных повторов, в частности, представителей некоторых подсемейств Alu-повторов [86]. 1.2.2. Функциональные возможности (СА/TG)n-повторов Многочисленные исследования свидетельствуют об участии микросателлитных повторов ДНК, и в частности poly(CA/TG), в организации хроматина и регуляции различных клеточных процессов с участием ДНК, в частности транскрипции и рекомбинации. 1.2.2.1. Роль микросателлитных повторов в организации хроматина В ходе структурного анализа геномов различных организмов было высказано предположение о роли микроcателлитных повторов ДНК в организации хроматина. Известно, что центромерные области хромосом представлены многочисленными повторяющимися последовательности, а именно: несколькими сателлитными мотивами, фланкированными участками, состоящими из разных повторяющихся элементов. При этом у высших эукариот характер этих последовательностей является видо- и хромосомо-специфичным. Длинные тандемные повторы, входящие в состав центромерного региона, состоят из моно-, ди-, три- и тетрануклеотидных единиц, в том числе и (CA/TG)n. Существует предположение, согласно которому повторяющаяся ДНК в области центромер может выполнять две функции: коадгезию сестринских хроматид и косвенное участие в образовании и функционировании кинетохор в процеcсе мейоза [87-89]. Помимо центромерного региона, наличие длинных poly(CA/TG) наряду с другими динуклеотидными последовательностями характерно и для фрагментов ДНК, формирующих нуклеосомы, важный элемент организации хроматина [90]. Известно, что нуклеосомная ДНК отличается большей гибкостью по сравнению с другими регионами. В недавних исследованиях, анализируя гибкость ДНК 26 различной последовательности нуклеотидов, было обнаружено влияние на эту характеристику частоты встречаемости динуклеотидных повторов. Причем наибольший вклад вносили (СА/TG)n-последовательности, присутствие которых увеличивало гибкость участка ДНК в прямопропорциональной зависимости от длины повтора [91, 92]. Эти данные свидетельствуют о том что, динуклеотидные повторы, и, в особенности, (CA/TG)n-последовательности могут играть важную роль в формировании нуклеосом, а именно в укладке ДНК вокруг гистонового кора. Еще одним интересным фактом является высокая аффинность белков HMGB1 и HMGB2 к хемикатенанам – структурам, состоящим из (CA/TG)nсодержащей петли, в основании которой пересекающиеся дуплексы образуют узел, где одна из нитей дуплекса проходит между двумя нитями другого дуплекса (рис.3) [93]. Рисунок 3 - Хемикатенаны (1, 3) и псевдоузлы (2, 4), формирование которых было продемонстрировано для фрагментов ДНК, содержащих САмикросателлиты HMGB1 и HMGB2 принадлежат к HMG (high mobility group) –большой группе хромосомных негистоновых белков, представляющих собой архитектурный элемент хроматина. В ряде исследований, проведенных in vitro, была продемонстрирована способность этих белков связываться с ДНК, имеющей измененную структуру, в частности с четырехнитевыми, суперскрученными, а 27 также химически модифицированными молекулами. Однако, как показали в своей работе Гайар и Стросс, аффинность HMG1 и HMG2 к хемикатенанам более чем на 4 порядка превышает аффинность ко всем вышеуказанным структурам. На основании полученных данных высказывается предположение, что одна из функций HMG1 и HMG2 в структуре хроматина может быть связана со свойством хемикатенанов соединять два удаленных участка генома стабильным, но в тоже время обратимым образом [94-96]. 1.2.2.2. Роль (СА/TG)n-повторов в регуляции экспрессии генов Первые экспериментальные данные о влиянии poly(CA/TG) на экспрессию генов были получены в работе Хамада и соавторов при изучении бактериального гена хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CAT) под контролем раннего вирусного промотора SV40 в составе плазмид, трансфецированных в клетки млекопитающих [97]. Энхансерная активность poly(CA/TG) проявилась при клонировании в регуляторные участки гена CAT как фрагментов с совершенными (TG)15- , (TG)25- и несовершенным (TG)20-повторами из человеческого генома, так и синтетически полученных повторов различной длины (от 25 до 65). При этом наибольшее увеличение экспрессии CAT наблюдалось для 15 и 20 повторов, а в случае 65 повторов экспрессия белка была в 5 раз ниже, чем в случае 25 повторов. В последующих работах было показано модулирующее действие poly(СА/TG) на промоторные участки генов в случае пролактина крысы rPRL и фактора роста фибробластов человека FGF9 [98, 99]. Для гена коллагена I типа Col1A2 с помощью системы люциферазного репортера продемонстрирована регуляция транскрипции СА-микросателлитами в составе сложных повторов, локализованных в 5’-НТО гена. При этом эффект зависел не от длины одного из повторов, а от комбинации нескольких типов повторяющихся последовательностей, в частности (CA)m(GC)n [100]. Участие сложного микросателлита в регуляции генной экспрессии было показано и для (TC)m(TG)n в 5’-НТО гена рецептора вазопрессина AVPR1A [101]. 28 Помимо модулирующего влияния на процесс транскрипции, (CA/TG)nповторы способны оказывать эффект и на пост-транскрипционном уровне. В работе Чен и соавторов в ходе изучения влияния poly(CA/TG) 3’-НТО гена FGF9 на экспрессию в системе люциферазного репортера было обнаружено различие в стабильности соответствующей мРНК в зависимости от длины микросателлита. Полученный результат, вероятно, связан реализацией c потенциальной возможности данной последовательности формировать шпилечные структуры, которые, в свою очередь, способны замедлять процесс деградации мРНК [99]. Кроме того, CA-повторяющиеся последовательности, являясь сайтами узнавания для различных регуляторных белков, могут оказывать влияние и непосредственно на сплайсинг мРНК, как это было показано для гена сурфактантного белка SP-B [102]. Кроме экспериментальных исследований существуют также данные генетического анализа, свидетельствующие о корреляции между длиной гена, его функциональной значимостью/транскрипционной активностью и длиной poly(CA/TG) в его составе [103]. Для данного исследования 1317 генных семейств человека общей численностью 7928 генов подразделили на 6 функциональных классов, согласно участию кодируемых ими белков в процессах: 1) клеточного цикла, 2) иммунного ответа, 3) передачи информации 4) метаболизма, 5) передачи сигнала и межклеточных взаимодействиях, 6) миграции и функционировании цитоскелета. Оказалось, что (CA/TG)n-повторы содержатся преимущественно в генах, кодирующих белки, участвующие в передаче сигналов и в межклеточных взаимодействиях (рецепторов, гормонов/факторов роста, клеточной адгезии и каналов, транспортных белков). При этом данный функциональный класс генов характеризовался наибольшей средней длиной гена в сравнении с другими классами. В то же время класс с наименьшей средней длиной генов, кодирующих белки, выполняющие функции, связанные с иммунной системой, содержал наименьшее число CA-микросателлитов. На основании полученных данных был сделан вывод о том что, poly(CA/TG) являются частью аппарата регуляции генной экспрессии молодого в эволюционном отношении пятого 29 функционального класса, представляющего собой отличительную особенность эукариот. В то же время, меньшая распространенность poly(CA/TG) в генах других функциональных классов предположительно могла быть связана с их консервативностью и более высоким уровнем экспрессии, чему способствует их меньшая длина, препятствующая размещению дополнительных регуляторных элементов. 1.2.2.3. Участие (СА/TG)n-повторов в гомологичной рекомбинации Помимо корреляционного анализа, речь о котором шла в разделе 1.1.5, связь CA-микросателлитов с процессом рекомбинации была показана с помощью различных про- и эукариотических модельных систем. Мерфи с соавторами еще в 1986 году продемонстрировали влияние poly(СА/TG) на рекомбинационные события, происходящие в клетках E.coli [104]. В ходе эксперимента использовалась плазмида, несущая две вставки (СА/TG)80 и (СА/TG)90, фланкированные нуклеотидными последовательностями вируса SV40. Трансформация клеточной культуры E.coli данной плазмидой, ее выделение и последующий рестрикционный анализ показали появление плазмид с делецией одной из CA-вставок, обусловленной рекомбинационным процессом между poly(СА/TG). Рекомбинантные молекулы не обнаруживались в случае плазмид, несущих вставку, представленную только последовательностью вируса SV40, что свидетельствует о том, что СА-микросателлиты стимулируют внутриплазмидную рекомбинацию не только между собой, но и между прилегающими последовательностями. В другой работе с помощью модельной системы, позволяющей оценить роль той или иной последовательности в гомологичной мейотической рекомбинации у S. cerevisiae, было обнаружено, что различные последовательности ДНК βглобинового локуса человека по-разному влияют на частоту кроссинговера [105]. С повышенной частотой рекомбинации оказался связан фрагмент MG-1, содержащий (CA/TG)17-повтор. Для последующего выяснения роли poly(СА/TG) 30 в стимуляции рекомбинации, были получены диплоидные штаммы, несущие на гомологичных хромосомах вставки из одинакового или разного количества повторяющихся единиц (n=40, 60 и 75), а также один из маркерных генов, URA3 или LEU2 [106]. Проведенный тетрадный анализ показал семикратное увеличение реципрокных обменов между гомологичными хромосомами. Наибольшее число перестроек возникала в случае одинакового количества CA-микросателлитов на хромосомах. В работе Жандрель и соавторов было показано, что присутствие (СА)39повторов вблизи сайта инициации двунитевых разрывов в процессе мейотической рекомбинации у дрожжей приводит к появлению множественных кроcсинговеров, при этом на частоту единичных кроcсоверных событий poly(CA/TG) не влияют [107]. Анализ двойных кроcсоверов показал, что большая часть рекомбинационных событий имела место в области между сайтом инициации и микроcателлитной последовательностью, при этом один из кросcоверов находился в районе повтора. Таким образом, в ходе данного исследования, была выдвинута гипотеза о способности poly(СА/TG) ингибировать RecA-опоcредованный обмен нитей с разрешением структуры Холлидея в этой области вследствие наличия структурных особенностей. Данная теория находит подтверждение и в более ранней работе Дютре, где in vitro оценивалось влиянии (CA/TG)n-повторов на отдельные стадии RecA-зависимой гомологичной рекомбинации [108]. При выполнении экспериментов, во-первых, обнаружили, что эффективность связывания RecA белка с однонитевыми олигонуклеотидами зависит от их последовательности. Увеличение аффинности данного белка к последовательности ДНК происходила в следующем порядке: неповторяющаяся последовательность < poly(CA) < poly(GT). Во-вторых, для RecA-содержащей системы показали ингибирование обмена нитей между дуплексом ДНК, несущим (CA/TG)n-повторы, и полностью гомологичной однонитевой CA- или GT-содержащей ДНК. На основании полученных данных было сделано предположение, что высокое сродство RecA-белка к (CA)n- и 31 (GT)n-последовательностям предотвращает обмен нитей через них за счет секвестрации однонитевой ДНК. Предпочтение в связывание с повторяющимися последовательностями известно также для дрожжевого и человеческого гомологов RecA, соответственно yRAD51 и hRAD51 [109]. Было обнаружено, что как RecA, так и yRAD51 и hRAD51, обладают схожим изменением аффинности в отношении однонитевой ДНК: (СT, GT, СA)>рэндомная последовательность>(GA, AT, СG). На основании спектрофотометрических характеристик исследованных однонитевых ДНК, было сделано предположение, что различия в аффинности белков к микросателлитным повторам могут быть обусловлены структурными особенностями последних. 1.2.3. Структурные особенности poly(CA/TG) Согласно современным представлениям ДНК может кодировать биологическую информацию не только через линейный порядок нуклеотидов, но и через формирование разнообразных алтернативных структур. Способность различных геномных последовательностей к образованию неканонических структур в настоящее время находится в стадии активного изучения. Так, многочисленные исследования повторяющихся пурин-пиримидиновых in vitro свидетельствуют о последовательностей способности формировать структуры, отличающиеся по своим характеристикам от классической В-формы двойной спирали ДНК. В частности существуют экспериментальные данные о потенциальной возможности формирования (CA/TG)n-микросателлитами таких неканонических структур как Z-форма ДНК и внутримолекулярный квадруплекс. 1.2.3.1. Poly(CA/TG) и Z-форма ДНК Z-ДНК представляет собой левозакрученную спираль с измененными, по сравнению с классической B-формой, шагом и стэкингом оснований (рис. 4). 32 Рисунок 4 - B-форма (слева) и Z-форма ДНК (справа) Ее предполагаемая биологическая роль заключается в снятии сверхспирализации ДНК (встраивание в плазмиду участка, находящегося в Zконформации, меняет топологию этой молекулы) и регуляции генной экспрессии [110]. Способность poly(CA/GT), как и ранее изученной (GC/CG)n- последовательности, образовывать Z-ДНК была показана методами рентгеноструктурного анализа, кругового дихроизма и ядерно-магнитного резонанса [111, 112]. Кроме того, данные о формировании Z-формы CA-микросателлитами подтверждаются методами выполненными на химического суперскрученных и энзиматического молекулах с пробинга, отрицательной сверхспирализацией. Так, было показано, что диэтилпирокарбонат (DEPC) и хлорацетальдегид (CAA) реактивны в отношении пуринов вдоль всего повторяющегося участка, что согласуется с их син-конформацией в Z-ДНК (по данным рентгеноструктурного анализа), и, следовательно, большей доступностью для химической модификации N6-атомов, участвующих в уотсон-криковских водородных связях, а также N7-атомов пуриновых оснований. Перманганат калия и гидроксиламин модифицируют соответственно тимин и цитозин на границах 33 между повторяющейся и рэндомной последовательностями, что, по-видимому, соответствует B-Z-переходу. Аналогичными реакционными характеристиками в условиях отрицательной сверхспирализации обладают и (GC/CG)-повторы. В то же время образование Z-формы (CA/TG)n-последовательностями сопровождается рядом особенностей. Во-первых, в отличии от (GC/CG)nповторов, формирование Z-ДНК СА-микросателлитами наблюдается не только при высоких концентрациях солей натрия или цезия в присутствии двухвалентных ионов (Ni++, Zn++, Ca++), спирта (40-60%) [113, 114] и низкой температуры, но и в условиях, близких к физиологическим, а именно, в присутствии природных полиаминов (спермина и спремидина), встречающихся во всех живых клетках [115]. Во-вторых, в ряде случаев, образованная CAмикросателлитами Z-ДНК отличается по своей реактивности при проведении химического пробинга. Так, реактивность пограничных цитозинов и тиминов в случае Z-ДНК, формируемой poly(CA/TG), наблюдается только при высокой плотности отрицательных сверхвитков (-ζ = 0,084-0,1). В то же время образование неканонической структуры фиксируется методом двумерного гельэлектрофореза ДНК уже при плотности сверхвитков около 0,05, при которой пурины чувствительны к модификации DEPC [116, 117]. Граница B-Z перехода четко определяется только с одной стороны от poly(CA/TG), в отличие от двух четких границ в случае poly(GC/CG). Существует предположение о стохастическом формировании небольших участков с Z-конформацией на протяжении (CA/TG)n-последовательности (при n больше 15) [118, 119]. Структурные особенности Z-формы, формируемой (СА/TG)n-повторами в суперскрученной ДНК, также были обнаружены и при проведении энзиматического пробинга с помощью различных нуклеаз. Так, если T7 не проявляла активности в отношении GC- и CA-микросателлитов, то S1-нуклеаза, осуществляющая гидролиз фосфодиэфирных связей ДНК в области неспаренных оснований на обеих границах переходов B-Z у poly(GC/CG), в случае poly(CA/TG) проявляла активность преимущественно на одной из границ повторяющегося участка [120]. 34 Таким образом, приведенные выше данные могут свидетельствовать, как о формировании в условиях отрицательной сверхспирализации (CA/TG)n- повторами Z-формы ДНК, значительно отличающейся от описанной для poly(GC/CG), так и о способности poly(CA/TG) образовывать не описанную ранее неканоническую структуру [117]. 1.2.3.2. Poly(CA/TG) и квадруплексная структура Еще одной особенностью динуклеотидных повторов, рассматриваемых в данном обзоре, является обнаруженная с помощью метода кругового дихроизма способность однонитевой (GT)n-последовательности складываться в структуру со спектром КД, характерным для G-богатых последовательностей, формирующих квадруплексы ДНК. В основе этих неканонических структур лежат G-тетрады, представляющие собой остатки гуанина, расположенные в одной плоскости и стабилизированные хугстеновскими водородными связями. Тетрады, в свою очередь, образуют стопки, формируя четырехнитевую спиральную структуру (рис. 5). Рисунок 5 - G-квадруплексная структура 35 Квадруплексы были обнаружены в тромбинсвязывающих аптамерах, сайтах переключения классов иммуноглобулинов, регуляторных участков гена инсулина и промоторах некоторых онкогенов (c-MYC, BCL2) [121]. Кроме того, известно, что G-богатые последовательности находятся в теломерных областях, где формируют стабильный в физиологических условиях квадруплекс, нечувствительный к действию эндо- и экзонуклеаз [122]. Стабилизация квадруплексной структуры в случае (GT)n- последовательности, однако, сильно зависела от условий. На ее формирование влияли не только ионные параметры (0,1 М КCl) и температура (1-3 °С), но и количества повторяющихся единиц. Более высокие и узкие пики в спектрах КД были показаны для d(GT)8 и d(GT)16 [123]. На основании предложена модель полученных данных внутримолекулярного для (GT)n-последовательности параллельного квадруплекса с квартетами гуанинов, стабилизированными стэкинг-контактами и петлями, состоящими из единичных тиминов. Однако для подтверждения образования именно этой структуры требуются дополнительные исследования, и кроме того, необходим поиск условий стабилизирующих GT-квадруплекс при физиологической температуре. 1.2.4. Мутационная изменчивость poly(СА/TG) и системы контроля стабильности у различных организмов Одним из общих свойств микросателлитных повторов является повышенная частота мутаций по сравнению с неповторяющейся последовательностью нуклеотидов (10-6-10-2 против 10-9-10-8, соответственно) [124]. Причем скорость мутирования микросателлитных повторов различается не только в зависимости от типа повторяющейся единицы (моно-, динуклеотидные и т.д.), нуклеотидного состава, типа повтора (простой, сложный, несовершенный), его локализации и микроокружения, но таксономической группе. и принадлежности организма к той или иной 36 Характер нестабильности для poly(CA/TG) в первую очередь зависит от длины повтора. Так, среди общего числа мутаций в коротких микросателлитных локусах преобладают делеции 1-2 повторов. Длинные же (СА/TG)n-повторы (48 п.о. и выше) у про- и эукариот, в том числе и человека, отличаются большей нестабильностью и полиморфностью [125, 126]. Для них характерна более высокая частота длинных делеций (>8 оснований), хотя основное число мутаций приходится на инсерции 1-2 повторов. При этом, как было показано на дрожжах, нарушение периодичности в тандемных повторах приводит к снижению частоты возникновения мутаций [127, 128]. Кроме того, на частоту возникновения мутаций может влиять не только длина повтора, но и его локализация. Так, в частности, была продемонстрирована зависимость частоты мутаций (СА/TG)n-последовательности от ее сайта на хромосоме, что, микросателлитную по всей видимости, стабильность свидетельствует особенностей о организации влиянии на хроматина в конкретном локусе [129]. Для некоторых микросателлитных повторов было показано различие в частоте и типе мутаций в зависимости от ориентации повтора относительно точки начала репликации, формированию обусловленное относительно способностью стабильных вторичных одной из структур нитей к (шпильки, различные неканонические формы ДНК), приводящих к паузе репликативной вилки [130-133]. Для (СА/TG)n-повторов увеличение частоты мутаций в 2 раза, когда TG-нить была лидирующей, наблюдалось при использовании различных штаммов бактерий, хотя в дрожжевых системах подобных различий обнаружено не было [134]. 1.2.4.1. Механизмы изменения числа повторяющихся единиц в CAмикросателлитах На сегодняшний день выделяют два возможных механизма мутационной изменчивости микросателлитных локусов по числу повторяющихся единиц: 37 неравный кроссинговер и проскальзывание ДНК-полимеразы вдоль гомополимерной последовательности. В первом микросателлитных случае повторов объяснением является генетического процесс обмена полиморфизма нитями в ходе эктопической рекомбинации между гомологичными, но неаллельными областями молекул, содержащих повторяющиеся последовательности. Предположение заключается в том, что неравный кроссинговер может отвечать за возникновение длинных делеций или инсерций повторов [135]. Однако несмотря на многочисленность работ, не было продемонстрировано прямой корреляции между интенсивностью кроссинговера и увеличением частоты мутаций в повторах [136, 116]. Второй механизм основан на том, что в ходе репликации происходит выпетливание одной или нескольких повторяющихся единиц матричной или синтезируемой цепи в зоне репликативной вилки [137]. Такое выпетливание может приводить либо к делеции, либо к инсерции повтора. Если выпетливание ДНК происходит на материнской нити, то его репарации не происходит и наблюдается делеция повтора. Если же выпетливание ДНК происходит на дочерней нити, это приводит к инсерции повтора. У всех видов организмов мутации сдвига с делецией или инсерцией целых повторяющихся единиц преобладают над точечными заменами нуклеотидов, что является одним из доказательств, что механизм их формирования различен. На возникновение ошибок в микросателлитных повторах в процессе репликации влияют сложные взаимодействия между нуклеотидной последовательностью и ДНК-полимеразой. Этот белок образует множественные контакты с ДНК в области, прилежащей к репликативной вилке, и изменяет конфигурацию ДНК, чем и обеспечивает точный подбор нуклеотидов для полимеризации и дальнейший контроль ошибок [138]. Контакты ДНК:белок изменяются в зависимости от структурных особенностей белка (различных типов ДНК-полимераз) и от нуклеотидной последовательности. Ошибки ДНК- 38 полимераз в области микросателлитных повторов происходят в 10-100 раз чаще, чем мутации сдвига в неповторяющихся последовательностях. In vitro повышенная частота мутаций poly(СА/TG) наблюдается как при использовании прокариотических полимераз Taq, Pfu [139, 140], так и эукариотических ДНК-полимераз β, δ, ε [141, 142]. При этом замечено, что вклад, корригирующей, 3’-5’-экзонуклеазной, активности про- и эукариотических ДНКполимераз резко снижается с увеличением размера вставки (СА/TG)n-повторов больше двух повторяющихся единиц, что также характерно и для других микросателлитов [143, 144]. Для наиболее высокоточных эукариотических полимераз Polδ и Polε, участвующих, согласно современному представлению, в синтезе основной массы ядерной ДНК, но на разных цепях матрицы, продемонстрирована различная частота делеций/инсерций СА- и GT-повторяющихся единиц in vitro [145]. Так, для Polδ, участвующей в синтезе отстающей цепи, частота мутаций в (TG)10-цепи в 3 раза выше по сравнению с (СА)10-цепью, а для Polε, осуществляющей синтез лидирующей цепи, более значима была частота делеций/инсерций в CA-цепи. В свою очередь, для эукариотической ДНК-полимеразы Polβ, участвующей в репарационном синтезе, частота мутаций в СА-цепи также была выше (в 2 раза), чем в GT-цепи [146]. В тоже время, несмотря на более высокую вероятность ошибок ДНКполимераз в области микросателлитных повторов по сравнению с неповторяющимися последовательностями, частота мутаций не соответствует темпу их накопления в геномах различных организмов. Это связано с тем, что стабильность микросателлитных повторов поддерживается у про- и эукариот различными системами метаболизма ДНК. 1.2.4.2. Факторы, влияющие на стабильность (СА/TG)n-повторов Факторы, влияющие на стабильность микросателлитных повторов, можно разделить на цис- и транс-действующие [147]. К первым относят структурные 39 особенности ДНК в области повторяющегося локуса (нуклеотидный состав микросателлита, количество повторяющихся единиц, нарушения периодичности в составе локуса, вторичные структуры), а также прилегающих к нему геномных последовательностей. К транс-действующим факторам относят особенности взаимодействия микросателлитных локусов с белками различных путей метаболизма ДНК (репликации, репарации, транскрипции, рекомбинации). При этом для каждого микросателлита взаимодействие с цис- и транс-действующими факторами имеет свои особенности. Наиболее существенный вклад в контроль стабильности различных повторяющихся последовательностей ДНК вносит система эксцизионной (мисмэтч-) репарации, осуществляющая коррекцию неканонично спаренных оснований (мисмэтчей), возникающих при ошибках в ходе репликации, в результате оксидативного стресса и ультрафиолетового облучения, а также принимающая участие в процессировании продуктов гомологичной рекомбинации [148-150]. На настоящий момент времени вклад мисмэтч-репарации в поддержание стабильности poly(CA/TG) достаточно хорошо изучен на системе MutHSLU E.coli (рис.6) и гомологичной ей эукариотической системе. Дефекты белков бактериальной системы MutS и MutL и их эукариотических гомологов в различных организмах увеличивают частоту возникновения мутаций в (СА/TG)nповторах в среднем на 1-2 порядка по сравнению с частотой мутаций при наличии нормальных белковых систем. 40 Рисунок 6 - Схематичное представление мисмэтч-репарации у E.coli Обычно, в коротких микросателлитных локусах преобладают делеции 1-2 СА- или TG-единиц, но, как показали исследования, встречаются некоторые особенности в соотношении делеции/инсерции. По-видимому, эти особенности зависят от длины микросателлитного локуса, а также генетических характеристик используемых модельных систем, влияние которых до конца не выяснено и не 41 всегда легко учитывается при интерпретации данных. Так, анализ (СА/TG)nмикросателлитов (где n варьировало от 10 до 51) в различных дефектных по белкам мисмэтч-репарации штаммах E.coli показал преобладание в них коротких делеций 1-2 повторов. Однако в случае (CA/TG)19, несмотря на преобладание делеций, в соотношении делеции/инсерции наблюдался больший сдвиг в сторону инсерций. Подобный результат мог быть связан, как со структурными особенностями микросателлита данной длины, так и с функционированием систем метаболизма ДНК в использованном штамме (JM109). Еще одним примером служат данные работы Фроинда и соавторов, согласно которым 90% мутаций в области (СА/TG)24 приходилось на длинные делеции (>10 п.о.) [151]. Полученный результат, с одной стороны опять может объясняться структурными особенностями повтора такой длины. С другой стороны, известно что, используемый в данной работе штамм JM103 наряду с сохраненной функцией RecA имеет дефект 3’-5’-экзнуклеазы SbcB, в норме процессирующей 3’однонитевой конец для связывания с RecA. Кроме того, этот штамм является мутантным еще и по экзонуклеазе SbcC, удаляющей вторичные структуры в двунитевой ДНК, которые могут быть потенциальными субстратами для связывания с RecA. Таким образом, обе известные мутации штамма JM103 могут приводить к гиперрекомбинантному фенотипу, и, как следствие, к возникновению значительного числа длинных делеций [152, 153]. Дефекты различных белков системы мисмэтч-репарации в разной степени влияют на частоту возникновения микросателлитных мутаций, что, в частности, продемонстрировано для дрожжевых гомологов mutS и mutL. Так, мутации в дрожжевых гомологах MutL, MLH1 и PMS1, а также в одном из гомологов MutS, MSH2, приводят к увеличению частоты мутации в СА-микросателлитах в 100-300 раз [151, 153]. В то же время мутации в MSH3 и MSH6 повышают частоту возникновения мутаций в меньшей степени (в 25 и 7 раз, соответственно) [154]. 42 1.3. CA-микросателлиты как сайты инициации и терминации гомологичной рекомбинации ГР – биохимический процесс, представляющий собой большую сложность для изучения. В отличие от других событий жизнедеятельности клетки (трансляции, репликации, транскрипции) рекомбинация почти не включает ДНКсинтез, а ее промежуточные соединения обладают высокой лабильностью. Кроме того, следует учитывать и небольшое количество таких интермедиантов [155, 156]. И хотя за последние десятилетия был достигнут значительный прогресс в понимании механизма ГР, многие важные аспекты этого процесса остаются не изученными. Основным направлением исследований являлись белки и, во многом благодаря мутационному анализу, здесь уже накоплен достаточно большой багаж знаний [155, 157]. Иначе обстоят дела с изучением вклада различных последовательностей ДНК в этот процесс. Многочисленные работы свидетельствуют о наличии «горячих» точек рекомбинации, представленных микросателлитными повторами, особенно это касается poly(CA/TG). Однако механизм их влияния не известен. Возможно (CA/TG)n-повторы выступают в качестве точек инициации и/или терминации процесса ГР, что обусловлен структурными особенностями данной повторяющейся последовательности. 1.3.1. СА-микросателлиты как сайты терминации гомологичной рекомбинации: модельные системы и предварительные данные В основе всех существующих на сегодняшний день моделей ГР лежит схема, предложенная в 1964 году Р. Холлидеем [158]. Согласно его представлению мейотическая ГР начинается с образования одноцепочечных разрывов в гомологичных молекулах ДНК с последующим обменом цепями между дуплексами и разрешением образовавшейся точки перекреста – «полухиазмы» Холлидея - в две интактные молекулы (рис.7). 43 Рисунок 7 - Модель гомологичной рекомбинации Р. Холлидея Гипотеза Р. Холлидея подтвердилась в последующих работах, где с помощью электронной микроскопии были наглядно продемонстрированы промежуточные структуры рекомбинации [159-162]. 44 В настоящее время моделирование структур Холлидея лежит в основе многих работ в области рекомбинационного процесса. При этом чаще всего используются синтетические четырехнитевые структуры [163,164]. В предыдущих исследованиях нашей лаборатории была разработана модельная система взаимодействии структур гомологичных Холлидея, линейных основанная дуплексов на спонтанном в высоко концентрированных водных растворах ДНК (рис.8) [165, 166]. 1 - постоянный процесс диссоциации-ассоциации концевых пар оснований линейных молекул ДНК в водном растворе; 2 – взаимодействие диссоциированных пар оснований двух гомологичных фрагментов; 3,4 – «миграция ветвления» в образовавшейся структуре Холлидея; 5 – разрешение струк туры Холлидея в новые дуплексы Рисунок 8 - Механизм спонтанного взаимодействия гомологичных линейных дуплексов ДНК с образованием структур Холлидея Данный подход позволяет оценить влияние различных последовательностей ДНК на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея, не прибегая к синтетическим системам, а используя природную ДНК. С помощью настоящей модели были получены предварительные данные о способности (CA/TG)31повторов тормозить «миграцию ветвления» структур Холлидея, сформированных ПЦР-продуктами, а это может означать, что in vivo СА-микросателлиты также могут образовывать блок и, таким образом, способствовать ферментативному разрешению промежуточной четырехнитевой структуры в этой точке генома [167]. 45 1.3.2. СА-микросателлиты как сайты инициации гомологичной рекомбинации В рамках изучения ДНК-ДНК взаимодействий в лаборатории М.Г. Якубовской впервые был описан феномен олигонуклеотидной инвазии в CAмикросателлитную последовательность дуплексной ДНК [168]. А именно, показана возможность спонтанного встраивания олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в линейные и кольцевые молекулы ДНК, содержащие (CA/TG)31-повтор во внутренней олигонуклеотида, области. В то же комплементарного время аналогичного внутренней встраивания неповторяющейся последовательности дуплекса, обнаружено не было (рис.9). При этом кинетика встраивания d(CA)10 и d(TG)10 заметно различалась. Если взаимодействие d(CA)10 начиналось с первой минуты совместной инкубации олигонуклеотида и дуплексной ДНК и достигало максимума через 6 часов, то инвазия d(TG)10 достигала максимума уже в первые секунды инкубации. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о существовании конформационных особенностей в области (CA/TG)n-последовательностей, способных оказывать существенное влияние на ГР, и представляющих интерес для дальнейшего изучения. 46 Рисунок 9 - Схематичное представление инвазии СА- и TGолигонуклеотидов во внутреннюю комплементарную область линейной (А) и кольцевой (Б) молекул ДНК 47 2. 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Список использованных реактивов и олигонуклеотидов 1. Агар-агар бактериологический, «Диаэм», Испания. 2. Агароза: ―High resolution‖, «Sigma», США; IV тип, «Диаэм», Испания. 3. Борная кислота, «Sigma», США. 4. Бромистый этидий (3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиниум бромид), «Sigma», США. 5. 5-Бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal), «AppliChem», США. 6. Глицерин, «Serva», Германия. 7. Дрожжевой экстракт, «ПанЭко», Россия. 8. Двуокись кремния мелкодисперсная, «Sigma», США. 9. Изоамиловый спирт, «Химмед», Россия. 10. Изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG), «Хеликон», Россия. 11. Калий ацетат, «Химмед», Россия. 12. Красители: бромфенол синий ,«Biotech» США; ксилен–цианол , «Sigma», США. 13. Магний хлорид, «Химмед», Россия. 14. Маркеры молекулярнго веса: pBR322/Bsu RI, λ/BstЕII, «СибЭнзим», Россия. 15. Лигаза, «СибЭнзим», Россия. 16. Набор реактивов для ПЦР, «Биомастер», Россия. 17. Набор для выделения плазмидной ДНК, GeneJet Plasmid kit , «Thermo Scientific», США. 18. Набор для выделения ДНК из агарозного геля, GeneJet Gel Extraction kit , «Thermo Scientific», США. 19. Натрий ацетат, «Химмед», Россия. 48 20. Натрий гидроксид, «Химмед», Россия. 21. Натрий додецил-сульфат, «Химмед», Россия. 22. Натрий хлорид, «Химмед», Россия. 23. Полинуклеотид киназа, «СибЭнзим», Россия. 24. Протеиназа К, «Sigma», США. 25. Проявитель рентгеновских фотоматериалов, «Биохимреактив», Россия. 26. Рентгеновская пленка, «Kodak», США. 27. РНКаза А, «Fermentas», Литва. 28. Сефадекс G-25, «Sigma», США. 29. Триптон, «Диаэм», Испания. 30. Трис-гидроксиметиламинометан, «Sigma», США. 31. Фенол, «Химмед», Россия. 32. Фиксаж рентгеновских фотоматериалов, «Биохимреактив», Россия. 33. Фосфотно-солевой буфер (PBS), «Flow Laboratories», Англия. 34. Штамм клеток E.coli XL10-Gold, «Stratagene», США. 35. Эндонуклеазы рестрикции, «СибЭнзим», Россия и «New England BioLabs», Великобритания. 36. Этилен-диамин-тетрауксусная кислота, динатриевая соль (ЭДТА), «Sigma», США. 37. SYBR Gold, «Invitrogen», США 38. Все олигонуклеотиды (таблица 2) фирмы «Синтол», Россия. Таблица 2 – Олигонуклеотиды, исполуемые в работе Название Последовательность d(CA)10 3′-CACACACACACACACACACA-5′ d(TG)10 3′-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-5′ d(CAG)7 3′-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-5′ d(CTG)7 3′-CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG-5′ d(GCC)7 3′-GCCGCCGCCGCCGCCGCCGCC-5′ 49 Продолжение таблицы 2 d(CGG)7 3′-CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG-5′ d(CTT)7 3′-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-5′ d(GAA)7 3′-GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA-5′ Биотинилированные олигонуклеотиды d(CA)10-biotin-5' 3′-CACACACACACACACACACA-5′-biotin d(TG)10-biotin-5' 3′-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-5′-biotin Ki-ras-biotin-5' 3'-GTAGTTGGACCTGGTGGCG-5'-biotin Флуоресцентно-меченные олигонуклеотиды 5′T-d(CA)10 3′-CACACACACACACACACACA-5′-TAMRA 5′T-d(TG)10 3′-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-5′-TAMRA 3′T-d(CA)10 TAMRA-3′-CACACACACACACACACACA-5′ 3′T-d(TG)10 TAMRA-3′-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-5′ 5′F-d(CA)10 3′-CACACACACACACACACACA-5′-FAM 5′F-d(TG)10 3′-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-5′-FAM 3′F-d(CA)10 FAM-3′-CACACACACACACACACACA-5′ 3′F-d(TG)10 FAM-3′-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-5′ 5′T-d(AT)10 3′-TATATATATATATATATATA-5′-TAMRA 5′T-d(GA)10 3′-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA-5′-TAMRA 5′T-d(CT)10 3′-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-5′-TAMRA 5′T-d(GGT)7 3′-GGTGGTGGTGGTGGTGGTGGT-5′-TAMRA 5′T-d(CCA)7 3′-CCACCACCACCACCACCACCA-5′-TAMRA 5′T-d(GGGT)5 3′-GGGTGGGTGGGTGGGTGGGT-5′-TAMRA 5′T-d(CCCA)5 3′-CCCACCCACCCACCCACCCA-5′-TAMRA 5′T-Ki-ras 3'-GTAGTTGGACCTGGTGGCG-5′-TAMRA 3′T-Ki-ras TAMRA-3'-GTAGTTGGACCTGGTGGCG-5′ 5′F-Ki-ras 3'-GTAGTTGGACCTGGTGGCG-5′-FAM 3′F-Ki-ras FAM-3'-GTAGTTGGACCTGGTGGCG-5′ 50 2.2. Процедура клонирования последовательностей (CA/TG)10, (CA/TG)15, (CA/TG)25, (CA/TG)31 и RI (рэндомная) в полилинкерный сайт плазмиды PUC19 2.2.1. Фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов Комплементарные синтетические олигонуклеотиды («Синтол», Россия), имеющие липкие концы, соответствующие сайтам эндонуклеаз рестрикции HindIII и SalI (таблица 3), фосфорилировались с помощью полинуклеотид киназы («СибЭнзим», Россия) в присутствие 1000-кратного мольного избытка аденозинтрифосфата. Таблица 3 № группы 1 2 3 4 5 Название Последовательность 5'-Sall-(СА)10 5′-TСGACGGATCC(CA)10GGGATCTCTAGA-3′ 3'-HindIII-(GT)10 5′-AGCTTCTAGAGATCCC(GT)10GGATCCG-3′ 5'-Sall-(СА)15 5′-TСGACGGATCC(CA)15GGGATCTCTAGA-3′ 3'-HindIII-(GT)15 5′-AGCTTCTAGAGATCCC(GT)15GGATCCG-3′ 5'-Sall-(СА)25 5′-TСGACGGATCC(CA)25GGGATCTCTAGA-3′ 3'-HindIII-(GT)25 5′-AGCTTCTAGAGATCCC(GT)25GGATCCG-3′ 5'-Sall-(СА)31 5′-TСGACGGATCC(CA)31GGGATCTCTAGA-3′ 3'-HindIII-(GT)31 5′-AGCTTCTAGAGATCCC(GT)31GGATCCG-3′ 5'-Sall-RI 5′-TСGACGGATCC(R)57GGGATCTCTAGA-3′ 3'-HindIII-RI 5′-AGCTTCTAGAGATCCC(GT)57GGATCCG-3′ Реакция проводилась в течение 30 минут при 37˚С. инактивировался путем инкубации смеси при 65˚С в течение 15 минут. Фермент 51 2.2.2. Процедура формирования дуплексов Олигонуклеотиды каждой группы (таблица 3) попарно смешивались и подвергались следующей температурной программе: 95˚C - 2 минуты, снижение температуры на 2˚C каждые 30 секунд до достижения 42˚C, 42˚C – 1 минута, охлаждение до 4˚C. Сформированные дуплексы переосаждались этанолом и растворялись в бидистиллированной воде. 2.2.3. Реакция лигирования ДНК Для реакции лигирования плазмида pUC19, предварительно обработанная эндонулеазами рестрикции HindIII и SalI («СибЭнзим», Россия), смешивалась с 10-кратным мольным избытком одного из сформированных синтетических дуплексов. В качестве фермента выступала лигаза фага Т4, («СибЭнзим», Россия). Реакция проводилась в течение 16 часов при температуре 4˚С. 2.2.4. Трансформация бактериальных клеток E.coli штамма XL10-Gold 2.2.4.1. Приготовление компетентных клеток E.coli штамма XL10-Gold Ночная культура клеток E.coli разбавлялась стерильной LB-средой и инкубировалась при 37˚С на протяжении двух часов. Полученная таким образом клеточная суспензия центрифугировалась при 2700 g в течение 15 минут при 4˚С. Клеточный осадок ресуспендировался в 200 мкл 0,1 М CaCl2 (из расчета на 1,5 мл двухчасовой культуры) и оставлялся на 2 часа при 4˚С. 52 Среды и растворы для работы с бактериями: Жидкая среда LB, 30 мл: Триптон 0,3 г Дрожжевой экстракт 0,15 г NaCl 0,3 г Приготовление раствора ампицилина, 100 мг/мл: 0,5 г лиофилизированного порошка ампицилина растворялись в 2,5 мл бидистиллированной воды и 2,5 мл 96% этанола. Твердая среда L-агар, 100 мл: Триптон 1г Дрожжевой экстракт 0,5 г NaCl 1г Агар-агар бактериологический 1,5 г В жидкую и твердую среду раствор ампицилина добавлялся до конечной концентрации 0,1 мг/мл. 2.2.4.2. Трансформация компетентных клеток E.coli штамма XL10Gold с использованием «бело-голубой» селекции При трансформации компетентных клеток E.coli штамма XL10-Gold применялся метод «теплового шока»: после добавления к клеточной суспензии соответствующей плазмиды, полученная смесь подвергалась следующему тепловому воздействию: 15 минут при 4˚С, 3 минуты при 42˚С и 10 минут снова 53 при 4˚С. Обработанные таким образом клетки наращивались сначала в течение 1 часа в 800 мкл стерильной LB-среды при 37˚С, а затем переносились на чашки Петри с L-агаром, содержащим ампициллин в концентрации 100 мг/мл, IPTG («Хеликон», Россия) в концентрации 100 мг/мл и X-Gal («AppliChem», США) в концентрации 20 мг/мл. После 12-часовой инкубации при 37˚С проводился отбор колоний, основанный на методе бело-голубой селекции. В качестве отрицательного контроля трансформации использовались компетентные клетки E.coli XL10-Gold без добавления плазмидной ДНК. В качестве положительного контроля — компетентные клетки с добавлением плазмиды, обладающей высокой эффективностью трансформации (pUC19). Вновь полученные плазмиды получили следующие названия: UC-RI (плазмида, несущая рэндомную последовательность), UC-CA10 (плазмида, несущая повтор (CA/TG)10), UC-CA15 (плазмида, несущая повтор (CA/TG)15), UC-CA25 (плазмида, несущая повтор (CA/TG)25), UC-CA31 (плазмида, несущая повтор (CA/TG)31). 2.3. Выделение плазмидной ДНК 1) Выделение плазмидной ДНК осуществлялось методом щелочного лизиса. Для этого жидкая ночная культура клеток E.coli штамма XL10-Gold, несущих соответствующую плазмиду, центрифугировалась на 7000 об/мин в течение 5 минут при 4˚С. Клеточный осадок ресуспендировался в бидистиллированной воде, после чего добавлялся раствор, состоящий из 1% SDS и 0,2 M NaOH, а также 3 M ацетата натрия (рН 5,2). Полученная смесь центрифугировалась на 13000 об/мин 15 минут при 4˚С. К супернатанту добавлялись 0,6 объема изопропанола, смесь инкубировалась в течение 10 минут при комнатной температуре. Образовавшийся в результате центрифугирования при комнатной температуре, осадок промывался 96% этанолом, высушивался и растворялся в бидистиллированной воде. Последующее осаждение белков из 54 раствора осуществлялось с помощью ацетата аммония. Для этого на 200 мкл водного раствора ДНК добавлялись 100 мкл 7,5 M ацетата аммония. Смесь инкубировалась 30 минут при -20˚С, а затем центрифугировалась 15 минут на 13000 об/мин при 4˚С. Очищенный от белков супернатант переосаждался этанолом, осадок растворялся в ТЕ-буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5). Для удаления РНК полученный раствор инкубировался 30 минут при 37˚С в присутствие РНКазы («Fermentas», Литва), после чего к нему добавлялся равный объем смеси хлороформ : изоамиловый спирт (49:1). Образовавшаяся в результате центрифугирования верхняя (водная) фракция переосаждалась в этаноле, осадок растворялся в ТЕ-буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) или бидистиллированной воде. 2) Для выделения плазмидной ДНК из жидкой ночной клеточной культуры использовался коммерчески доступный набор GeneJet Plasmid kit («Thermo Scientific», США). 2.4. Выделение геномной ДНК из ткани Образцы опухолевой и нормальной тканей молочной железы были предоставлены отделением патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. ДНК из них получена методом фенольной экстракции, для чего ткань сначала в течение суток инкубировалась в лизирующем буфере (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl , 2% SDS, протеиназа К с концентрацией 20 мг/мл) при 37°С. Затем происходило добавление равного объема фенола и центрифугирование смеси 2 минуты при 2000 g. К образовавшейся водной фазе добавляли 500 мкл смеси фенол: хлороформ (1:1) и центрифугировали смесь 5 минут при 12000 g. К вновь отобранной водной фазе добавляли 500 мкл смеси хлороформа с 1/24 объема изоамилового спирта, центрифугировали 5 минут при 12000 g. Водная фракция переосаждалась этанолом, осадок растворялся в бидистиллированной воде. 55 2.5. Обработка плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции Рестриктазы к раствору плазмидной ДНК добавлялись из расчета 1-3 единицы активности на 1 мкг ДНК. Смесь инкубировалась в соответствующем, поставляемом производителем буфере, в течение 2,5 часов при 37˚С (при использовании эндонуклеаз рестрикции HindIII, SalI, SspI, EcoRI) или 3 часов при 65˚С (при использовании эндонуклеазы рестрикции TfiI). Фермент инактивировался прогреванием в течение 20 минут при 65˚С или при 80˚С в зависимости от вида рестриктазы. Его удаление достигалось за счет добавления к раствору равного объема смеси хлороформ : изоамиловый спирт (49:1) с последующим центрифугированием на 13000 об/мин 15 минут. Полученная в результате верхняя (водная) фракция переосаждалась этанолом. Осадок ДНК растворялся в бидистиллированной воде или ТЕ-буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5). 2.6. Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции Состав реакционной смеси в расчете на одну пробу: 5 мкл 10x буфера для ПЦР; 1,5 мМ МgCI2; 0,8 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов; по 10 пмоль прямого и обратного праймеров; 20 нг матрицы; 2,5 ед Taq-полимеразы; бидистиллированная вода до конечного объема смеси 50 мкл. Программа амплификации включала в себя следующие стадии: 95˚С - 1 минуна, 30 циклов (95˚С - 40 секунд, 56˚С - 1 минута, 72˚С - 1 минута), 72˚С - 10 минут и охлаждение до 4˚С. Реакция амплификации проводилась с помощью программируемого аппарата PTC (100) (MJ Research Inc., США). Праймеры и матрицы, использованные в работе, представлены в таблице 4. 56 Таблица 4 ПЦР-продукт 1129 п.о. 464 п.о. 1490 п.о. Праймеры 5'-ATATTTTCCCGACTGGAAAGCGGG-3' (смысловая последовательность) 5'-TAATTAAGGAAGCTAGAGTAAGTAG-3' (антисмысловая последовательность) 5′-TTAATTCACTCAATGCTCACTCATTAGCA CCCCA-3′ (смысловая последовательность) 5′-TTAATAACTTGCATTTATCAGGGTTATTG TCTC-3′ (антисмысловая последовательность) 5'-ATATTTTCCCGACTGGAAAGCGGG-3' (смысловая последовательность) 5'-TAATTAAGGAAGCTAGAGTAAGTAG-3' (антисмысловая последовательность) 2.7. Матрица плазмида PE10 плазмида PE10 плазмида UC-CA31 Осаждение ДНК в этаноле К раствору ДНК добавлялись 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема 96% этилового спирта; смесь тщательно перемешивалась и инкубировалась при температуре -20˚С в течение 1 часа (или -70˚С 15 минут), после чего центрифугировалась на 13000 об/мин при 4˚С 15 минут. Супернатант удалялся. Осадок промывася 70% этиловым спиртом, центрифугировался на 13000 об/мин при 4˚С в течение 5 минут. Процедура повторялась с 96% этиловым спиртом. Осадок высушивался и растворялся в бидистиллированной воде или буферном растворе. 2.8. Кинирование 5′-концов олигонуклеотидов радиоактивным фосфором Для введения метки по 5′-концам олигонуклеотидов использовались полинуклеотид киназа фага Т4 (―СибЭнзим‖, Россия) с активностью 10 ед./мкл и аденозинтрифосфат, содержащий радиоактивный фосфор 32Р по γ-положению ([γ32 Р]ATP) (NEN; 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml). Реакция кинирования проводилась в течение 30 минут при температуре 37˚С. Инактивация фермента достигалась 57 путем инкубации смеси при 65˚С в течение 15 минут. Разделение олигонуклеотидов и несвязавшейся метки проводилось на колонках с сефадексом G-25 («Sigma», США). 2.9. Электрофоретическое разделение ДНК Электрофорез растворов ДНК проводился в 1%- и 1,5%-ных агарозных гелях в стандартном 0,5-кратном Трис-боратном буфере (ТВЕ) (0,089 М Трис-борат, 0,002 М ЭДТА, рН 7,5). В качестве лидирующего красителя использовался 6-кратный буфер для нанесения проб: 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина в воде. 2.10. Визуализация ДНК 2.10.1. Окрашивание ДНК с помощью SYBR Gold SYBR Gold поставляется фирмой-производителем в виде 10000-кратного маточного раствора красителя в диметилсульфоксиде (ДМСО). Метод по стандартному протоколу заключался в окрашивании агарозного геля после проведения электрофореза в 5-кратном растворе красителя в течение 30 минут. Кроме того, в данной работе также проводилось окрашивание ДНК путем ее смешивания с красителем в буфере перед нанесением пробы в лунки геля до начала электрофореза. Положение полос ДНК в геле определялось по флуоресценции красителя, связавшегося с ДНК, под действием ультрафиолетового света (λ=254 нм) на трансиллюминаторе фирмы ―Vilber Lourmat‖ (Франция). 58 2.10.2. Окрашивание ДНК с помощью бромистого этидия Концентрация стокового раствора красителя составляла 10 мг/мл. Использовался метод окрашивания ДНК в геле: раствор бромистого этидия добавлялся в расплавленную агарозу до концентрации 0,5 мкг/мл перед проведением электрофореза. Кроме того, применялось окрашивание ДНК в геле после проведения электрофореза. Для этого гель в течение 15-30 минут выдерживался в растворе бромистого этидия с концентрацией 0,5 мкг/мл. Положение полос ДНК в геле определялось по флуоресценции красителя, связавшегося с ДНК, под действием ультрафиолетового света (λ=254 нм) на трансиллюминаторе фирмы ―Vilber Lourmat‖ (Франция). 2.10.3. Авторадиография Высушенный агарозный гель, содержащий ДНК с радиоактивным фосфором 32 Р, выдерживался на пленке Kodak в течение 1-5 суток при температуре -70˚С. Проявляли пленку, последовательно выдерживая в следующих растворах: • проявитель для рентгеновских пленок ―Kodak‖ 5 минут • проточная вода 5 минут • фиксаж для рентгеновских пленок ―Kodak‖ 5 минут 2.10.4. Визуализация ДНК, несущей флуоресцентные зонды FAM и TAMRA Визуализация ДНК в случае использования олигонуклеотидов, меченных флуоресцентными зондами FAM или TAMRA, осуществлялась c помощью лазерного сканера гелей высокого разрешения Typhoon (GE Healthcare, Германия). 59 2.11. Извлечение ДНК из агарозного геля 2.11.1. Экстракция с помощью ДНК-связывающего матрикса на основе двуокиси кремния 1.Приготовление ДНК-связывающего матрикса 10 г мелкодисперсной двуокиси кремния (размер частиц 0,5-10 мкм, приблизительно 80% частиц в диапазоне 1-5 мкм) суспендировались в 100 мл фосфатно-солевого буфера (PBS: 137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 4,3 мМ Na2HPO4 х 7 H2O; 1,4 мМ KH2PO4) и оставлялись для осаждения частиц на 40 минут. Затем супернатант сливался, и процедура повторялась. Осадок двуокиси кремния центрифугировался при 2000 g в течение 2 минут и ресуспендировался в 3М NaI до концентрации 100 мг/мл. 2. Процедура очистки Проводился электрофорез (см. выше), из агарозного геля вырезались полосы, содержащие нужный фрагмент ДНК. К вырезанным фрагментам геля добавлялся двойной объем 6 М NaI. Смесь инкубировалась при 55˚С до полного растворения агарозы (приблизительно 5 минут), после чего к ней добавлялись 20 мкл ДНКсвязывающего матрикса. Перемешивание осуществлялось на шейкере в течение 15 минут. По истечению этого времени смесь центрифугировалась на 3000 об/мин 3 минуты, супернатант удалялся. Осадок промывался 500 мкл Vashing buffer (50 мM NaCI, 10 мM Трис-HCI, 2,5M ЭДТА, 50% этиловый спирт, рН 7,5) и центрифугировался на 3000 об/мин в течение 3 минут. Супернатант удалялся. Процедура повторялась. Образовавшийся осадок высушивался с помощью вакуумной центрифуги. ДНК с мелкодисперсной двуокиси кремния смывалась путем добавления 10 мкл ТЕ-буфера и инкубации при 50˚С в течение 15 минут с периодическим перемешиванием. По истечению этого времени смесь центрифугировалась при 3000 об/мин 3 минуты, супернатант с элюированной ДНК отбирался. Процедура повторялась еще дважды. В завершение, полученный 60 супернатант центрифугировался на 3000 об/мин 3 минуты для удаления остатков мелкодисперсной двуокиси кремния и переосаждался в этаноле. 3. Процедура очистки с помощью набора для выделения После проведения электрофореза вырезались участки геля, содержащие фрагмент ДНК. Далее использовался коммерчески доступный набор GeneJet Gel Extraction kit («Thermo Scientific», США). Процедура завершалась переосаждением ДНК в этаноле. 2.11.2. Выделение ДНК с помощью электроэлюции При проведении очистки ДНК с помощью электроэлюции, электрофорез проводили в течение з часов, после чего, перед полосой нужного фрагмента вырезали лунку в агарозном геле, заполняли ее 0,5-кратным TBE-буфером и продолжали электрофорез в течение 2-3 минут. Собранный из лунки буфер центрифугировали на микроцентрифужных колонках Microcon YM-30 («Millipore», США). ДНК смывали с фильтра микроцентрифужных колонок ТЕбуфером (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5). 2.12. Определение концентрации растворов ДНК и SYBR Gold Определение концентрации ДНК в пробе осуществлялось с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-100 («Saveen Werner», Швеция). Определение концентрации SYBR Gold осуществлялось с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-1601 PC (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 478 нм. 2.13. Электронная микроскопия Препараты ДНК для электронной микроскопии готовились методом белковой пленки. 20 мкл раствора, содержащего 0,5 - 5 мкг/мл ДНК, 50 мкг/мл 61 цитохрома С, 0,1 М Tris-HCl (рН 8,5), 5 мМ ЭДТА, 40% формамида наносились на поверхность гипофазы дистиллированной воды. ―Распластанные‖ молекулы ДНК переносились на свежеприготовленную коллодиевую пленку-подложку, окрашивались спиртовым уранил-ацетатом и контрастировались оттенением сплавом платина : палладий (4:1). Просмотр препаратов в электронный микроскоп JEM 100CX (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ проводился в институте Молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта д.б.н. Попенко В.И. 2.14. Статистическая обработка результатов электронной микроскопии Статистическая обработка результатов электронной микроскопии проводилась с вычислением среднего значения количества структур Холлидея в каждой группе и доверительного интервала: х ср ± 1,96 (ζ/√n), где хср - среднее значение, ζ - среднее квадратичное отклонение, рассчитанное по формуле: ζ=√1/(n-1)∑(xi-xср)2, где n – число измерений, xi – измеряемая величина, хср – среднее значение измеряемых величин. 62 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного красителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания Визуализация ДНК с помощью флуоресцентных красителей в ходе проведения электрофореза является неотъемлемой частью многих молекулярнобиологических исследований. Наиболее широко применяемым для этих целей соединением является бромистый этидий (БЭ). Однако данный краситель представляет собой интеркалирующий агент, вызывающий изменение конформационных характеристик двойной спирали ДНК [169,170]. Таким образом, присутствие БЭ в растворе ДНК могло бы существенно повлиять на результаты экспериментов по изучению ДНК-ДНК-взаимодействий. Экстракция же БЭ из раствора ДНК приводит к значительным потерям последней. На настоящий момент времени наиболее чувствительным флуоресцентным красителем, предназначенным для визуализации как одно-, так и двуцепочечной ДНК в электрофорезных гелях, считается SYBR Gold (SG). Важным достоинством этого красителя является возможность его применения для препаративного электрофореза с использованием ДНК в последующих экспериментах. В присутствии SYBR Gold не происходит ингибирования целого ряда ферментативных реакций [171, 172]. Кроме того, SYBR Gold легко удаляется из раствора ДНК путем ее стандартного переосаждения в этаноле [173]. В виду влияния данного красителя на электрофоретическую подвижность ДНК фирмой-производителем рекомендовано применение процедуры постокрашивания при использовании SYBR Gold. Однако визуализация ДНК методом постокрашивания при проведении агарозного гель-электрофореза требует большого количества этого дорогостоящего красителя и характеризуется невысоким качеством получаемых электрофореграмм. В ряде работ было продемонстрировано, что при использовании низких концентраций красителя изменение электрофоретической подвижности может быть минимальным, однако, 63 количественные характеристики так, и не были получены [174, 175]. Таким образом, первоочередной задачей настоящего исследования являлось изучение характеристик взаимодействия двухцепочечной ДНК с SYBR Gold, важных для оптимизации протокола предокрашивания при проведении агарозного гельэлектрофореза. При описании различных флуоресцентных красителей ДНК определяющей характеристикой принято считать соотношение краситель / ДНК (отношение количества молекул красителя к числу пар оснований ДНК) [176, 177]. Поскольку молярная концентрация SYBR Gold, в поставляемых фирмой «Invitrogen» (США), растворах является коммерческой тайной, в настоящем исследовании для определения этого параметра использовался коэффициент экстинкции (50000 М-1), приведенный в работе Коза и соавторов [178]. Таким образом, на основании выполненных спектрофотометрических измерений, концентрация SYBR Gold в поставляемом фирмой растворе (10000-кратный) должна составляет порядка 1,3 х 10-2 М. Это значение и используется в дальнейшем для расчета соотношений краситель/ ДНК в анализируемых растворах. 3.1.1. Определение стабильности комплекса SG - ДНК при проведении агарозного гель-электрофореза Одним из важнейших критериев возможности использования красителя для предокрашивания является стабильность образуемого им с ДНК комплекса в условиях проведения электрофореза. Устойчивость комплекса SG- ДНК в настоящей работе определялась на основании измерения скорости его движения в агарозном геле, а также по изменению интенсивности флуоресценции данного комплекса с течением времени. В ходе эксперимента проводилась серия электрофорезов при напряжении 60В и комнатной температуре. При этом, исходя из результатов предварительного скрининга, были выбраны два значения соотношения краситель/ ДНК: 1/25 и 2/5. 64 Количество ДНК, представленной ПЦР - продуктом длиной 1129 п.о., составляло 10 нг на пробу. Добавление SYBR Gold к образцу осуществлялось за 15 минут до его нанесения в лунки геля. На полученных электрофореграммах измерялось расстояние, пройденное комплексом за определенный интервал времени. В результате было показано, что скорость движения комплекса SG - ДНК оставалась постоянной, по крайней мере, на протяжении 3-х часов проведения электрофореза и составляла 5,26 ± 0,04 мм/час при соотношении краситель/ ДНК 1/25 и 4,86 ± 0,04 мм/час при соотношении 2/5. Полученные данные свидетельствуют о высокой стабильности комплекса SG- ДНК, поскольку вымывание красителя неизбежно привело бы к изменению характера движения молекул ДНК (рис. 10). Соотношения краситель/ДНК: 1 - 1/25; 2 – 2/5; М – маркер молекулярной массы λ/BstEII (1000 нг). Внизу указано время в минутах от начала эксперимента. Рисунок 10 - Электрофореграммы ДНК, окрашенной SYBR Gold, при проведении электрофореза в течение различных интервалов времени Кроме того, сравнение электрофореграмм, полученных после 1 часа, 2 часов и 3 часов проведения электрофореза не выявило уменьшения интенсивности свечения полос геля, содержащих исследуемый комплекс. Таким образом, показана потенциальная возможность применения процедуры предокрашивания при использовании флуоресцентного красителя SYBR Gold. 65 3.1.2. Выявление несвязавшегося с ДНК SYBR Gold в растворах при различных количественных соотношениях краситель/ДНК В рамках оптимизации метода предокрашивания с SYBR Gold необходимо было оценить количество красителя, способного провзаимодействовать с ДНК. Для этого, прежде всего, проведено исследование, направленное на выявление несвязавшегося с ДНК красителя при различных количественных соотношениях SYBR Gold и ДНК. В ходе работы были приготовлены образцы, содержащие 3 мкл исходного раствора SYBR Gold (соответственно 3,9 пмоля) и различные количества геномной ДНК (0, 3, 6, 30 мкг) в 400 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА и 300 мM NaCl, pH 7,5). После 15-минутной инкубации при комнатной температуре, образовавшийся комплекс краситель-ДНК удалялся из раствора путем фильтрации на микроцентрифужных колонках Microcon YM-30 («Millipore», США). Последующие спектрофотометрические измерения показали, что, во-первых, фильтр используемых колонок не влияет на концентрацию SYBR Gold в растворе: оптическая плотность как исходного раствора SYBR Gold без ДНК, так и его фильтрата составила 0,47 при λ=487 нм. Во-вторых, свободный краситель был обнаружен в фильтратах образцов, содержащих 3 и 6 мкг ДНК, оптическая плотность которых соответственно равна 0,43 и 0,40, в то время как оптическая плотность фильтрата образца, изначально содержащего 30 мкг ДНК, оказалась всего 0,0034, что составляет менее 1% исходной концентрации (рис. 11, А). Соотношение краситель/ДНК в последнем случае составляло 4/5, а для образцов, содержащих 3 и 6 мкг ДНК, соответственно 8/1 и 4/1. 66 А. Спектры поглощения фильтратов растворов: 1 – 3 мкл стокового раствора SG в 400 мкл ТЕ-буфера; 2 – тот же раствор с добавлением 3 мкг геномной ДНК; 3 – тот же раствор с добавлением 6 мкг геномной ДНК; 4 – тот же раствор с добавлением 30 мкг геномной ДНК. Б. Электрофореграммы ДНК: 1-4 – 500 нг ПЦР-продукта размером 464 п.о., окрашенного фильтратом, полученным после удаления уже сформированного комплекса SG - ПЦР-продукт 1129 п.о. (500 нг); 58 – ранее образовавшийся комплекс SG- ПЦР-продукт 1129 п.о.; 1,5 - 2,5 нл; 2,6 25 нл; 3,7 - 50 нл; 4,8 - 250 нл стокового раствора красителя. Рисунок 11 - Определение несвязавшегося с ДНК SYBR Gold в растворах после удаления комплекса краситель-ДНК Кроме вышеописанного исследования, был проведен эксперимент, в ходе которого 500 нг ПЦР-продукта размером 1129 п.о. инкубировались с различным количеством SYBR Gold, а именно соответствующим его содержанию в 2,5; 25; 50 и 250 нл стокового раствора (10000-кратный). Таким образом, соотношение краситель/ДНК в анализируемых образцах составляло 1/25; 2/5; 4/5; и 4/1. После 15 минутной совместной инкубации образовавшийся комплекс ДНК-краситель 67 удалялся из раствора с помощью микроцентрифужных колонок Microcon YM-30 («Millipore», США), а к полученным фильтратам добавлялись 500 нг ПЦРпродукта, размер которого, существенно отличался от используемого ранее (464 п.о.). Результат повторной инкубации, а также комплексы SG-ДНК, полученные в результате эллюции с мембраны колонок после проведения фильтрации, оценивались с помощью электрофореза. Электрофореграмма, представленная на рис.11Б, свидетельствует о том, что окрашивание вновь добавленной ДНК в фильтратах образцов не происходит, если соотношение краситель/ДНК в образце до фильтрации не превышало 4/5. В условиях нашего эксперимента окрашивание фрагмента ДНК размером 464 п.о. имело место лишь в том случае, когда при первой инкубации соотношении краситель/ДНК было 4/1. Суммируя все полученные данные, можно сделать вывод, что в растворах ДНК с низкими значениями соотношения SG/ДНК практически весь краситель должен находиться в комплексе с нуклеиновой кислотой, что свидетельствует о целесообразности проведения анализа влияния соотношения краситель/ДНК на электрофоретическую подвижность комплекса. 3.1.3. Зависимость электрофоретической подвижности окрашенной ДНК от соотношения SG/ДНК Для выявления характера влияния SYBR Gold на скорость ДНК в агарозном геле, проведено сравнение электрофоретической подвижности ДНК, окрашенной до проведения электрофореза и после него. Для этого в ходе эксперимента были приготовлены серии проб объемом по 10 мкл каждая, содержащие различное количество очищенного ПЦР-продукта размером 1129 п.о. в ТЕ-буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА и 300 мM NaCl, pH 7,5). Предокрашивание осуществлялось путем добавления к каждой пробе SYBR Gold в количестве, соответствующем 5 нл стокового раствора (10000-кратный) до проведения электрофореза. Постокрашивание агарозного геля проводилось после электрофореза в 5-кратном растворе SYBR Gold в течение 30 минут (по 68 протоколу производителя). При используемом количестве красителя снижения электрофоретической подвижности не наблюдалось в пробах, содержащих 1 мкг ДНК и более, что соответствует соотношению краситель/ДНК равному или меньшему 1/25 (рис.12). А. Электрофореграмма ДНК (предокрашивание). Б. Электрофореграмма ДНК (постокрашивание). Количество ПЦР-продукта в образцах: 1 - 2000 нг, 2 – 1000 нг, 3 – 500 нг, 4 – 250 нг, 5 – 100 нг, 6 – 50 нг, 7 – 20 нг. М – 1000 нг маркера молекулярной массы λ/BstEII. Рисунок 12 - Визуализация ДНК с использованием SYBR Gold по протоколам пред- и постокрашивания Для более полного представления о характере влияния SYBR Gold на подвижность окрашенной им ДНК проанализирована электрофоретическая подвижность фракций ДНК, содержащих 1000, 100 и 10 нг ПЦР-продукта размером 1129 п.о. при трех значениях соотношения краситель/ДНК (1/50; 1/25 и 2/5). В данном эксперименте в качестве маркера электрофоретической подвижности фрагментов ДНК разной длины использовалась ДНК фага λ, рестрицированная эндонуклеазой BstEII и окрашенная SYBR Gold с соблюдением соотношения краситель/ДНК 1/25. На электрофореграмме представлены данные об отсутствии влияния SYBR Gold на подвижность ДНК при соблюдении соотношения краситель/ДНК 1/50 и 1/25. Причем интенсивность свечения окрашенного ПЦР-продукта различается в строгом соответствии количеству ДНК в образцах (рис.13, дорожки 1–6). При соотношении же краситель/ДНК равном 2/5 уменьшение электрофоретической подвижности наблюдается во всех пробах, 69 причем, снижение электрофоретической подвижности возрастает с увеличением количества ДНК в пробе (рис. 13, дорожки 7–9). М – маркер молекулярной массы λ/BstEII, 1000 нг. Количество ПЦР-продукта длиной 1129 п.о.: 1,4,7 - 1000 нг; 2,5,8 - 100 нг; 3,6,9 - 10 нг. Соотношения краситель/ДНК 1-3 - 1/50; 4-6 - 1/25; 7-9 - 2/5. Рисунок 13 - Электрофоретическая подвижность ДНК в зависимости от соотношения SG/ДНК Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии изменений подвижности ДНК при образовании комплексов с SYBR Gold, если соотношение краситель/ДНК не превышает 1/25, что позволяет использовать данный высокоэффективный краситель по протоколу предокрашивания для образцов с известным количеством ДНК. Для удобства в ходе проведения дальнейших расчетов, введено понятие коэффициента k, представляющего собой отношение количества SYBR Gold к массе ДНК, выраженной в нанограммах. Количество красителя, содержащегося в 1 мкл 1-кратного раствора SYBR Gold, при этом, принято за условную единицу (1 у.е.). Тогда, с учетом полученных экспериментальных данных, было рассчитано, что SYBR Gold не влияет на электрофоретическую подвижность ДНК при значениях k от 0,05 у.е./нг и ниже. Таким образом, необходимое количество красителя может быть легко рассчитано по формуле: n(SYBRGold ) m( ДНК ) 0.05y.e. / нг 70 где: m(ДНК) – масса ДНК, выраженная в нанограммах, n(SYBR Gold) – количество SYBR Gold в y.e. 3.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (СА/TG)nповторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации Poly(CA/TG) – один из наиболее распространенных микросателлитных повторов млекопитающих, включая человека. Многочисленные данные свидетельствуют о функционировании этой повторяющейся последовательности в качестве «горячих» точек рекомбинации. Однако, несмотря на то, что на сегодняшний день накоплено большое количество информации о белковых системах ГР, механизмы влияния (CA/TG)n-повторов на этот процесс остаются неизвестным. Вероятнее всего они связаны со структурными особенностями данных последовательностей ДНК. В настоящей работе продолжено, ранее начатое в лаборатории М.Г. Якубовской, изучение этих особенностей в аспекте процессов инициации и терминации ГР. 3.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея 3.2.1.1. Модельная система В основе, используемой в настоящем исследовании, модельной системы лежит образование симметричных крестообразных структур в высококонцентрированных водных растворах гомологичных линейных молекул ДНК. Сформированные за счет взаимодействия диссоциированных концевых пар нуклеотидов дуплексной ДНК, такие четырехнитевые структуры претерпевают «миграцию ветвления», аналогичную той, что происходит при ГР, и разрешаются 71 в новые или исходные линейные молекулы (рис. 8) [165, 166]. Описанная система является идеальной моделью, позволяющей оценить влияние последовательности ДНК на процесс миграции, основываясь на расположении точки перекреста в полученных таким образом структурах Холлидея. В качестве линейных дуплексов, образующих крестообразные структуры, в настоящем исследовании использовались фрагменты плазмидной ДНК и ПЦРпродукты, содержащие или не содержащие (CA/TG)n-повторы в своей внутренней области. Полученные популяции структур Холлидея визуализировались с помощью электронной микроскопии и подразделялись на три группы исходя из расположения точки перекреста (рис. 14) с последующим проведением статистической обработки полученных данных. 72 А. Схема строения дуплексной ДНК, образующей анализируемые структуры Холлидея. Б. Электронная микрофотография контрольной фракции дуплексной ДНК. В. Электронная микрофоторгафия структур Холлидея. Цифрами I, II и III обозначена локализация точек перекреста структур Холлидея, лежащая в основе их распределения по группам. Увеличение в 10000 раз. Рисунок 14 - Формирование структур Холлидея линейными фрагментами ДНК 73 3.2.1.2. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных ПЦР-продуктами Линейные дуплексы размером 1490 п. о., содержащие и не содержащие (CA/TG)31-повторы в своем внутреннем участке, для данного исследования были получены путем ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК плазмид UC-CA31 и UC-RI (см. Материалы и методы) соответственно. Формирование структур Холлидея осуществлялось путем инкубации очищенных гомологичных ПЦР-фрагментов в TSM-буфере (6 мM Трис-HCl, 300 мM NaCl, 6 мM MgCl2, pH 7.8) при 37˚С в течение суток. Разделение полученной смеси на фракции четырехнитевых структур и дуплексной ДНК проводилось с помощью агарозного электрофореза с последующей экстракцией структур Холлидея из геля методом электроэлюции. На основании данных электронной микроскопии, фракции структур Холлидея подразделялись на три группы исходя из расположения точки перекреста относительно концов молекул: I группа – 1-248 п.о., II группа – 248496 п.о. и III группа – 496-745 п.о. Статистический анализ показал, что в популяции структур Холлидея, образованных фрагментам неповторяющейся последовательности, максимальное число крестообразных структур принадлежит I группе. Во фракции же структур Холлидея, образованных дуплексами, содержащими (CA/TG)31-повтор, максимальное число структур принадлежит II группе с локализацией точек перекреста в районе повтора (таблица 5). 74 Таблица 5 - Локализация точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных ПЦР-продуктами Структуры Холлидея Содержащие (СА/TG)31повтор, % I – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста 38,4 ± 5,8* ветвей в области 1248 п.о. II – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста 52,27 ± 4,94** ветвей в области 248496 п.о. III – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста 9,3 ± 3,75 ветвей в области 496745 п.о. *, ** - различия статистически значимы (р < 0,01) Рэндомная последовательность, % 49,1 ± 3,71* 38,2 ± 2,52** 12,1 ± 3,07 3.2.1.3. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК В данном эксперименте структуры Холлидея были сформированы с помощью фрагментов ДНК размером около 900 п.о., полученных в результате обработки плазмид UC-CA31 и UC-RI эндонуклеазами рестрикции TfiI и SspI. Как и в предыдущем исследовании, очищенные гомологичные линейные дуплексы инкубировались в TSM-буфере (6 мM Трис-HCl, 300 мM NaCl, 6 мM MgCl2, pH 7.8) при 37˚С в течение 1 суток. Фракция образовавшихся структур Холлидея получена методом электроэлюции из геля. По результатам электронной микроскопии структуры Холлидея были разделены на следующие группы, отражающие локализацию точки перекреста: I группа– 1-150 п.о., II группа – 150-300 п.о. и III группа – 300-450 п. о. от концов молекул. Статистический анализ полученных данных показал, что как во фракциях структур Холлидея, образованных (CA/TG)31-содержащими фрагментами плазмиды, так и плазмидными фрагментами, не содержащими повторов, 75 большинство структур принадлежит I группе (таблица 6). Таблица 6 - Локализация точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК Структуры Холлидея Содержащие Рэндомная (СА/TG)31-повтор, последовательность, % % I – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 1150 п.о. II – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 150300 п.о. III – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 300450 п.о. 58,7 ± 12,27 60,7 ± 9,51 24,03 ± 7,87 23,4 ± 8,45 13,5 ± 8,2 15,9 ± 7,68 3.2.1.4. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК, несущими разное число (СА/TG)n-повторов Структуры Холлидея для данного эксперимента были сформированы фрагментами плазмид UC-CA31 и UC-CA25, несущими повторяющиеся последовательности соответствующей длины. При этом одна из популяций четырехнитевых структур была получена путем инкубации дуплексов с (CA/TG)25-повторами, а другая – в результате совместной инкубации как фрагментов, несущих последовательность (CA/TG)25, так и (CA/TG)31. После инкубации в TSM-буфере (6 мM Трис-HCl, 300 мM NaCl, 6 мM MgCl2, pH 7.8) при 37˚С в течение суток, образовавшаяся популяция структур Холлидея изолировалась от дуплексной ДНК с помощью электроэлюции из агарозного геля. Анализ данных электронной микроскопии показал, что локализация точки перекреста в области повторяющейся последовательности встречается достоверно 76 чаще в популяции структур Холлидея, имеющих (CA/TG)25/31-гетерологию, по сравнению со структурами, образованными полностью гомологичными дуплексами (таблица 7). Таблица 7 - Локализация точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК, несущими (СА/TG)n-повторы с разным числом повторяющихся единиц Содержащие (СА/TG)31/25повтор, % Структуры Холлидея I – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста 53,8 ± 2,3* ветвей в области 1150 п.о. II – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста 34,76 ± 3,92** ветвей в области 150300 п.о. III – структуры Холлидея с локализацией точки перекреста 8,55 ± 2,27 ветвей в области 300450 п.о. *, ** - различия статистически значимы (р < 0,01) Содержащие (СА/TG)25повтор, % 66 ± 5,42* 20,5 ± 5,65** 13,5 ± 4,74 3.2.2. Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК В предыдущих продемонстрирован исследованиях феномен нашей взаимодействия лаборатории (инвазии) был впервые олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 с линейной и кольцевой молекулами ДНК, содержащими (CA/TG)31-последовательность [168]. При этом в случае неповторяющейся последовательности подобное взаимодействие обнаружено не был. Полученные данные свидетельствуют о существовании конформационных особенностей в области (CA/TG)n-последовательности, по всей видимости, лежащих в основе синаптической стадии ГР. Соответственно, представляет интерес дальнейшее изучения этого феномена. 77 3.2.2.1. Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов Во всех предыдущих исследованиях, касающихся ДНК-ДНК взаимодействий, для визуализации олигонуклеотидной инвазии в дуплексную ДНК использовались олигонуклеотиды, содержащие на 5'-конце радиоактивный фосфор 32 Р. Однако применение этой методики осложняло проведение исследований, что было связано с временными затратами на пробоподготовку, коротким периодом полураспада радионуклидного изотопа и соблюдением техники безопасности при работе с ним. Таким образом, представлялось актуальным использование более современного подхода, основного на введение в состав олигонуклеотида флуоресцентной метки. В ходе оптимизации были выбраны два флуоресцентных красителя: карбоксифлуоресцеин (FAM) и тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA) и модель, ранее изученного комплементарный В.К. концевой Гасановой, участок встраивания линейного олигонуклеотида дуплекса в случайной последовательности (рис. 15) [179] Комплементарные области показаны одним цветом. Рисунок 15 - Схематичное представление олигонуклеотидной инвазии в комплементарный концевой участок линейной ДНК В качестве линейного дуплекса в настоящем исследовании выступал ПЦРпродукт, который смешивался с одним из олигонуклеотидов, представленным в таблице 8, в мольном соотношении 1/50. 78 Таблица 8 - Флуоресцентно меченные олигонуклеотиды, используемы при оптимизации метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий Название олигонуклеотида 5'-FAM- PUC19-VSP-S 3'-FAM- PUC19-VSP-S Ki-ras-5'-FAM Ki-ras-3'-FAM 5'-TAMRA-PUC19-VSP-S 3'-TAMRA-PUC19-VSP-S Ki-ras-5'-TAMRA Ki-ras-3'-TAMRA Комментарии Олигонуклеотид, комплементарный концевому участку ПЦР-продукта; FAM на 5'конце Олигонуклеотид, комплементарный концевому участку ПЦР-продукта; FAM на 3'конце Олигонуклеотид, не комплементарный последовательности ПЦР-продукта; FAM на 5'-конце Олигонуклеотид, не комплементарный последовательности ПЦР-продукта; FAM на 3'-конце Олигонуклеотид, комплементарный концевому участку ПЦР-продукта; TAMRA на 5'-конце Олигонуклеотид, комплементарный концевому участку ПЦР-продукта; TAMRA на 3'-конце Олигонуклеотид, не комплементарный последовательности ПЦР-продукта; TAMRA на 5'-конце Олигонуклеотид, не комплементарный последовательности ПЦР-продукта; TAMRA на 3'-конце После инкубации смеси в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCI, 1мМ ЭДТА и 300 мМ NaCI (pH 7.5), при 37˚С в течение суток, проводился электрофорез в 1% агарозном геле при 4˚С. Визуализация комплекса осуществлялась c помощью лазерного сканера гелей высокого разрешения Typhoon (GE Healthcare, Германия) сразу после проведения электрофореза. Анализ полученных данных показал, что расположение флуоресцентного красителя на 3'-конце, как в случае FAM, так и TAMRA, препятствует встраиванию олигонуклеотида в комплементарный ему концевой участок ПЦРпродукта (рис. 16). 79 I – электрофореграмма, II – скан геля, III - олигонуклеотиды, меченные флуоресцентным красителем. М – маркер молекулярной массы λ/BstEII (1000 нг). ПЦР-продукт (800 нг) инкубировался со следующими олигонуклеотидами: 1 - 3'метка- PUC19-VSP-S, 2 - 5'-метка- PUC19-VSP-S, 3 - Ki-ras-3'-метка, 4 - Ki-ras-5'метка. Рисунок 16 - Визуализация инвазии в линейный концевой участок ПЦРпродукта олигонуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями TAMRA (A) или FAM (Б) Таким образом, в ряде последующих экспериментов по изучению олигонуклеотидной инвазии использовались олигонуклеотиды, несущие TAMRA на 5'-конце (далее обозначенные как 5'T), так как, в отличие от FAM, данный краситель был менее подвержен фотовыцветанию. 3.2.2.2. Инвазия олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в эукариотическую ДНК Ранее исследования по изучению закономерностей олигонуклеотидной инвази выполнялись с использованием прокариотической (плазмидной) ДНК. В настоящей работе в рамках дальнейшего исследования особенностей встраивания олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 во внутренний комплементарный участок дуплексной ДНК проведен анализ возможности инвазии d(CA)10 и d(TG)10 в ДНК эукариот. В качестве объекта исследования была выбрана геномная ДНК, выделенная из нормальной и опухолевой ткани молочной железы и обработанная 80 эндонуклеазами рестрикции HindIII или EcoRI («СибЭнзим», Россия). Полученная таким образом ДНК инкубировалась с олигонуклеотидами 5′Td(CA)10 и 5′T-d(TG)10 (см. таблица 2) в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА и 300 мM NaCl (pH 7.5) при 37˚С в течение суток. Последующий электрофорез проводился в 1% агарозном геле в 0,5-кратном Трис-боратном буфере (0.089 М Трис-борат, 0.002 М ЭДТА, рН 7.5) при 4˚С. Визуализация образовавшегося комплекса осуществлялась непосредственно после проведения электрофореза с помощью лазерного сканера гелей высокого разрешения Typhoon (GE Healthcare, Германия). В результате эксперимента встраивание в геномную ДНК показано для олигонуклеотида 5′T-d(TG)10 (рис. 17, дорожки 3,5,7), в то время как инвазии 5′T-d(CA)10 обнаружено не было (рис. 17, дорожки 2,4,6). Электрофореграмма (вверху) и скан геля (внизу) геля: М – маркер молекулярной массы λ/BstEII (1000 нг); геномная ДНК (2000 нг) инкубировалась: 1 – без олигонуклеотида; 2, 4, 6 – с 5′T-d(CA)10; 3, 5, 7 – с 5′T-d(TG)10. Количество олигонуклеотида - 17 пмоль на пробу. Рисунок 17 - Инвазия олигонуклеотидов 5′T-dCA10 и 5′T-dTG10 в эукариотическую геномную ДНК, обработанную эндонуклеазами рестрикции HindIII (А) и EcoRI (Б) 3.2.2.3. Олигонуклеотидная инвазия в ди-, три- и тетрануклеотидные последовательности Для того чтобы понять является ли олигонуклеотидная инвазия свойством всех микросателлиных последовательностей или она характерна только для poly(CA/TG), проанализирована возможность подобного взаимодействия в области ди-, три- и тетрануклеотидных повторов. 81 В ходе первого эксперимента оценивалась возможность олигонуклеотдного встраивания в геномную ДНК, полученную из опухолевой и нормальной тканей молочной железы. При этом, были выбраны следующие олигонуклеотиды: 5′Td(CT)10, 5′T-d(GA)10,5′T-d(AT)10, 5′T-d(CCA)7, 5′T-d(GGT)7, 5′T-d(CCCA)5 и 5′Td(GGGT)5 (см. таблица 2). Геномная ДНК, обработанная эндонуклеазой рестрикции HindIII («СибЭнзим», Россия), инкубировалась с одним из вышеуказанных олигонуклеотидов в буфере, содержащем 10 мM Трис-HCl, 1 мM ЭДTA и 300 мM NaCl (pH 7.5) при 37˚С в течение суток. Полученный результат анализировался методом гель-электрофореза с последующей визуализацией комплекса с помощью лазерного сканера гелей высокого разрешения Typhoon (GE Healthcare, Германия). В ходе проведения эксперимента встраивания ни одного из вышеуказанных олигонуклеотидов в геномную ДНК обнаружено не было, в то время как инвазия 5′T-d(GT)10 выявлялась на обычном уровне (рис. 18). Электрофореграмма (вверху) и скан геля (внизу) геля: М – маркер молекулярной массы λ/BstEII (1000 нг); геномная ДНК (2000 нг) инкубировалась: 1 - с олигонуклеотидом случайной последовательности 5′T-Ki-ras, 2 – 5′T-d(GA)10, 3 – 5′T-d(CT)10, 4 – 5′T-d(AT)10, 5 – 5′T-d(CCA)7, 6 – 5′T-d(GGT)7, 7 – 5′T-d(CCCA)5, 8 – 5′T-d(GGGT)5, 9 – 5′T-d(GT)10. Количество олигонуклеотида – 17 пмоль на пробу. Рисунок 18 - Инвазия олигонуклеотидов различных повторяющихся последовательностей в эукариотическую геномную ДНК Для второго эксперимента были выбраны плазмиды, содержащие следующие тринуклеотидные последовательности: (CAG/GTC)80, (CGG/GCC)40, (CTT/GAA)20 и (CTT/GAA)114. Данные плазмиды смешивались с радиоактивно меченными 82 олигонуклеотидами (далее обозначенные как d(X)*), комплементарными повторяющейся последовательности дуплексной ДНК, в мольном соотношении 1/50. Полученная смесь инкубировалась в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCI, 1 мМ ЭДТА и 300 мМ NaCI (pH 7.5) при 37˚С в течение суток. Последующий электрофорез проводился в 1% агарозном геле при температуре 4˚С, после чего гель высушивался для авторадиографии. В результате было показано, что формирование комплекса происходит лишь в случае совместной инкубации d(GAA)7* с плазмидой, содержащей (CTT/GAA)114-повтор. I Электрофореграмма, II авторадиограмма комплекса, III авторадиограмма олигонуклеотидов. М - маркер молекулярной массы λ/BstEII (1000 нг). Плазмиды содержат следующие повторы: 1,2 – (CAG)80; 3,4 – (CGG)40; 5,6 – (CTT)20; 7,8 – (CTT)114. Радиоактивно меченные олигонуклеотиды: 1 – d(CAG)7*; 2 – d(CTG)7*; 3 – d(GCC)7*; 4 – d(CGG)7*; 5,7 – d(CTT)7*; 6,8 – d(GAA)7*. Рисунок 19 - Олигонуклеотидная инвазия в плазмиды, содержащие тринуклеотидные повторы 3.2.2.4. Анализ возможности олигонуклеотидной инвазии в (CA/TG)nпоследовательность дуплексной ДНК после удаления ранее сформированного комплекса Для того чтобы понять являются ли структурные особенности (CA/TG)nповтора, обеспечивающие возможность олигонуклеотидной инвазии, его 83 динамической характеристикой или они формируются только в условиях in vivo проведено исследование, в рамках которого, изучалась возможность образования межмолекулярных комплексов после удаления из раствора уже сформированных (рис. 20). Данное исследование проводилось с использованием в качестве модельной системы плазмиды pE101, и ее линеаризованной формы. На первом этапе в ходе проведения эксперимента плазмида и ее линеаризовання форма смешивались с 50-кратным мольным избытком одного из следующих олигонуклеотидов, несущих на 5'-конце биотин: d(CA)10-biotin-5', d(TG)10-biotin-5' или некомплементарного последовательности плазмиды pE10 олигонуклеотида ki-ras-biotin-5'. Для формирования комплекса олигонуклеотидДНК полученная смесь инкубировалась в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl 1мМ ЭДТА и 300 мМ NaCI (pH 7.5), при 37˚С в течение суток. Последующее удаление из раствора образовавшегося комплекса осуществлялось на основе биотин-стрептавидинового взаимодействия: в полученные растворы добавлялись магнитные частицы, покрытые стрептавидином (Dynabeads® M-280 Streptavidin, Invitrogen, США). Супернатант, полученный после удаления магнитных частиц со связавшимся с ними комплексом, переосаждали в этаноле и использовали на дальнейших стадиях эксперимента, где к нему добавлялись уже радиоактивно меченные олигонуклеотиды d(CA)10* и d(TG)10*. Инкубация смеси, как и в предыдущем случае, проводилась в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCI, 1мМ ЭДТА и 300 мМ NaCI (pH 7.5), при 37˚С в течение суток. Последующий электрофорез проводился в 1% агарозном геле при температуре 4˚С, после чего гель высушивался для авторадиографии. Результат эксперимента представлен на рисунке 20 Б. На полученной авторадиограмме видно, что встраивание радиоактивно меченных d(CA)10* и d(TG)10* олигонуклеотидов происходит в плазмиду, предварительно Плазмида pE10 является производной плазмиды PUC19, содержащей (CA/TG)31повтор. 1 84 инкубированную без олигонуклеотида (рис. 16 Б, дорожки 5,6,9,10) или в присутствии некомплементарного плазмиде олигонуклеотида ki-ras-biotin-5', не вступающего во взаимодействие с ней согласно полученным ранее данным (рис.16 Б, дорожки 1,2). Повторной же инвазии d(CA)10* и d(TG)10* в плазмиду, предварительно инкубированную с d(CA)10-biotin-5' и d(TG)10-biotin-5', не происходит (рис.16 Б, дорожки 3,4,7,8). 85 А. Схема проведения эксперимента. Б. Электрофореграмма (вверху) и авторадиограмма (внизу) геля. М – маркер молекулярной массы λ/BstEII (1000 нг). 1-6 – линеаризованная плазмида pE10, 7-10 - плазмида pE10. Инкубация дуплексной ДНК с радиоактивно меченным олигонуклеотидом d(CA)10*: 1, 3, 5, 7, 9; инкубация дуплексной ДНК с радиоактивно меченным олигонуклеотидом d(TG)10*: 2, 4, 6, 8, 10. Первая инкубация дуплексной ДНК со следующими биотинилированными олигонуклеотидами: ki-ras-biotin-5' – 1, 2; d(CA)10-biotin-5' – 3, 7; d(TG)10-biotin-5' – 4, 8; без олигонуклеотидов – 5, 6, 9, 10. Рисунок 20 - Анализ встраивания олигонуклеотидов dCA10* и dTG10* в дуплексную ДНК, содержащую (CA/TG)31-повтор, после удаления ранее сформированного комплекса 86 3.2.2.5. Встраивание олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в дуплексную ДНК с разной длиной (CA/TG)n-повтора Для лучшего понимания механизмов, лежащих в основе олигонуклеотидной инвазии, проведен анализ влияния длины (CA/TG)n-повтора дуплексной ДНК на данный процесс. С этой целью предварительно была получена коллекция плазмид, производных PUC19, содержащих разное число повторов, а именно: (CA/TG)10, (CA/TG)15, (CA/TG)25, (CA/TG)31 и (CA/TG)94. В качестве контроля использовалась плазмида PUC19 с клонированной в нее неповторяющейся последовательностью – UC-RI (см. Материалы и методы). В ходе проведения олигонулеотидов эксперимента 5′T-d(CA)10 плазмиды или смешивались 5′T-d(TG)10. с Мольное одним из соотношение плазмида/олигонуклеотид составляло 1/50. Объем пробы был равен 10 мкл. Инкубация полученной смеси проходила в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCI, 1 мМ ЭДТА и 300 мМ NaCI (pH 7.5), при 37˚С в течение суток. Последующий электрофорез проводился в 1% агарозном геле при температуре 4˚С. Визуализация образовавшегося комплекса осуществлялась непосредственно после проведения электрофореза c помощью лазерного сканера гелей высокого разрешения Typhoon (GE Healthcare, Германия). В результате анализа показано, что инвазия 5′T-d(CA)10 или 5′T-d(TG)10 олигонуклеотидов происходит в комплементарную повторяющуюся последовательность плазмидной ДНК при любой длине poly(CA/TG), но с разной интенсивностью. А именно, наблюдается резкое снижение интенсивности флуоресценции в случае плазмид, содержащих (CA/TG)15- и (CA/TG)25-повторы (рис. 21, дорожки 3,4), по сравнению с теми, которые несли (CA/TG)10, (CA/TG)31 и (CA/TG)94 (рис. 21, дорожки 2, 5, 6). 87 I – электрофореграмма, II – скан геля, III – скан олигонуклеотидов, меченных TAMRA по 5'-концу. А. Инкубация плазмид с 5′T-d(TG)10. Б. Инкубация плазмид с 5′T-d(CA)10. Количество повторов в плазмидах: 1 – без повторов, 2 – (CA/TG)10, 3 – (CA/TG)15, 4 – (CA/TG)25, 5 – (CA/TG)31, 6 – (CA/TG)94. М – маркер молекулярной массы λ/BstEII (1000 нг). Рисунок 21 - Инвазия 5′T-d(CA)10 и 5′T-d(TG)10 олигонуклеотидов в плазмиды, содержащие разное число (CA/TG)n-повторов 3.2.2.6. Зависимость интенсивности инвазии олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в плазмиду, содержащую (CA/TG)31-повтор, от мольного соотношения плазмида/олигонуклеотид В рамках изучения особенностей встраивания олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в комплементарную повторяющуюся последовательность дуплексной ДНК, проведен анализ плазмида/олигонуклеотид. влияния на этот процесс мольного соотношения Для данного эксперимента в качестве плазмиды использовалась PUC19 с клонированным в ее полилинкерный сайт (CA/TG)31повтором, - UC-CA31 (см. Материалы и методы). Плазмидная ДНК смешивалась с 5′T-d(CA)10 или 5′T-d(TG)10 олигонуклеотидами в следующих мольных соотношениях ДНК/олигонуклеотид: 1/50, 1/20, 1/1, 5/1, 10/1. Инкубация полученной смеси проходила в буфере, содержащем 10 мМ ТрисHCI, 1 мМ ЭДТА и 300 мМ NaCI (pH 7.5), при 37˚С в течение суток. Объем пробы был равен 10 мкл. Электрофорез проводился в 1% агарозном геле при 88 температуре 4˚С. Визуализация образовавшегося комплекса осуществлялась сразу после проведения электрофореза c помощью лазерного сканера гелей высокого разрешения Typhoon (GE Healthcare, Германия). Согласно полученным данным инвазия как 5′T-d(CA)10, так и 5′T-d(TG)10 олигонуклеотида в комплементарную повторяющуюся последовательность плазмидной ДНК происходит даже при его 10-кратном мольном недостатке, однако с изменением соотношения дуплекс/олигонуклеотид меняется интенсивность ДНК-ДНК взаимодействия. В ходе проведения исследования показано, что количество олигонуклеотидов, встроившихся в дуплекс, возрастает с повышение соотношения дуплекс / олигонуклеотид от 1/10 до 1/1, после достижения которого, происходит выход на плато без дальнейшего повышения интенсивности встраивания (рис. 22). I – электрофореграмма, II –скан геля, III - олигонуклеотиды, меченные TAMRA по 5'-концу. Мольное соотношение плазмида/олигонуклеотид: 1,6 – 1/50; 2,7 – 1/20; 3, 8 – 1/1; 4, 9 – 5/1; 5, 10 – 10/1. Плазмида инкубировалась с 5′T-d(CA)10: 1-5 и 5′T-d(TG)10: 6-10. Рисунок 22 - Интенсивности инвазии олигонуклеотидов 5′T-d(CA)10 и 5′Td(TG)10 в плазмиду, содержащую (CA/TG)31-повтор, от мольного соотношения плазмида/олигонуклеотид 3.2.2.7. Олигонуклеотидная инвазия в разных солевых условиях Принимая во внимания, что одним из возможных объяснений олигонуклеотидной инвазии в области CA-микросателлитов является способность 89 данной повторяющейся последовательностью формировать неканонические формы ДНК, образование которых сильно зависит от условий микроокружения, проведено сравнение интенсивности встраивания dCA10 и dTG10 при различных солевых условиях. Для эксперимента использовались олигонуклеотиды 5′Td(CA)10 и 5′T-d(TG)10, в качестве мишени встраивания выступала плазмида UCCA31 (см. Материалы и методы). Совместная инкубация плазмиды с одним из олигонуклеотидов проводилась при 37˚С в течение суток в одном из буферов из таблицы 9. Таблица 9 № Название буфера Состав, pH 1 dd бидистиллированная вода 2 TE-буфер 10 мM Tрис-HCl, 1 мM ЭДТА, pH 7.6 3 TES-буфер 6 мM Трис-HCl, 1 мM ЭДТА, 300 мM NaCl, pH 7.5 4 TSM-буфер 6 мM Трис-HCl, 300 мM NaCl, 6 мM MgCl2, pH 7.8 5 PBS 6 G-буфер 137 мМ NaCl, 2,7 мM KCl, 10 мM Na2HPO4, 1,76 мM KH2PO4, pH 7.4 20 мM HEPES, 140 мM NaCl, 50 мM KCl, pH 7.3 Мольное соотношение плазмидная ДНК/олигонуклеотид при инкубации составляло 1/1 и 1/30. Последующий электрофорез проводился в 1% агарозном геле при температуре 4˚C. Визуализация образовавшегося комплекса осуществлялась непосредственно после проведения электрофореза с помощью лазерного сканера гелей высокого разрешения Typhoon (GE Healthcare, Германия). В результате проведенного исследования было показано, что встраивание как 5′T-dCA10, так и 5′T-dTG10 в плазмидную ДНК происходит при любых солевых условиях. Более того, они практически не влияют на интенсивность ДНК-ДНК взаимодействий. Однако данный эксперимент показал небольшое различие в поведение 5′T-dCA10 и 5′T-dTG10 в условиях эксперимента. В случае 5′T-dCA10 интенсивность встраивания заметно снижается в 90 бидистиллированной воде как при мольном избытке олигонуклеотида, так и при эквимолярных соотношения дуплекс/олигонуклеотид (рис. 23А и Б, дорожка 1). Кроме того, заметно и снижение интенсивности инвазии 5′T-dCA10 в TE-буфере при эквимолярном соотношении дуплекс/олигонуклеотид (рис. 23 Б, дорожка 2). А. 30-кратный мольный избыток 5′T-d(CA)10 по отношению к плазмиде (вверху – элктрофореграмма, внизу – скан геля). Б. Эквимолярное количество 5′T-d(CA)10 по отношению к плазмиде (вверху – элктрофореграмма, внизу – скан геля). М – 1000 нг маркера молекулярного веса λ/BstEII. К – плазмида UC-CA31, инкубированная без олигонуклеотида в TES-буфере. Условия инкубации: 1 – dd, 2 - TE-буфер, 3 - TES-буфер, 4 - TSM-буфер, 5 – PBS, 6 - G-буфер. Рисунок 23 - Инвазия олигонуклеотида 5′T-d(CA)10 в плазмиду UC-CA31 в разных солевых условиях В тоже интенсивности время в случае олигонуклеотида 5′T-d(TG)10 снижение инвазии наблюдалось лишь в бидистиллированной воде при эквимолярном соотношении дуплекс/олигонуклеотид (рис. 24, дорожка 7). В остальных случаях солевые условия на интенсивность встраивания не влияли. 91 Вверху – элктрофореграмма, внизу – скан геля. М – 1000 нг маркера молекулярного веса λ/BstEII. К - UC-CA31, инкубированная в TES-буфере без олигонуклеотида. Условия инкубации: 1,7 – dd, 2,8 - TE-буфер, 3,9 - TES-буфер, 4,10 - TSM-буфер, 5,11 – PBS, 6,12 - G-буфер. Рисунок 24 - Инвазия олигонуклеотида 5′T-d(TG)10 в плазмиду UC-CA31 в разных солевых условиях 92 4. ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного красителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания Для изучения ДНК-ДНК взаимодействий необходимо получить и провести очистку достаточного количества того или иного фрагмента ДНК, что, как правило, связано с проведением препаративного гель-электрофореза. При этом визуализация ДНК, как и в случае любого другого электрофоретического разделения, осуществляется с помощью флуоресцентных красителей нуклеиновых кислот. Характерной особенностью таких красителей является наличие гетероциклических ароматических хромофоров, взаимодействие с ДНК которых, приводит к увеличению интенсивности флуоресценции по сравнению с флуоресценцией свободного красителя. Причем, связывание различных красителей с двойной спиралью ДНК может происходить двумя путями: либо по периферии молекулы (по малой бороздке ДНК), либо путем интеркаляции между соседними парами оснований. В большинстве случаев присутствие флуоресцентных красителей в растворах нуклеиновых кислот приводит к нарушениям параметров спиральной структуры этих молекул. Таким образом, наличие флуоресцентных красителей в пробах с ДНК может в значительной степени повлиять на результаты исследований структурного полиморфизма последней. Так, в частности, известно, что наиболее доступный и широко используемый в молекулярной биологии краситель бромистый этидий (3,8-диамино-5-этил-6-фенилфенантридиниум бромид), интеркалируя между парами оснований молекулы ДНК, располагается не перпендикулярно оси спирали, а наклонен к ней под углом ~35º. Это приводит к существенному нарушению конформационных характеристик молекулы ДНК, а именно: к одновременному растяжению двойной спирали вдоль оси и ее раскручиванию [169, 170]. Удаление же БЭ из комплекса, образованного им с ДНК, сопровождается значительными потерями последней. 93 В настоящее время все большее внимание привлекают представители группы несиметричных цианиновых красителей, представляющие собой по химическому строению два ароматических гетероцикла, соединенные метиновой группой. Наиболее перспективным среди них на сегодняшний день остается запатентованный еще в 1999 году фирмой «Molecular Probes» флуоресцентный краситель SYBR Gold. Предназначенный для окрашивания как одно-, так и двуцепочечных нуклеиновых кислот, по своей эффективности он существенно превосходит своих предшественников (особенно в отношении коротких фрагментов), не говоря уже о БЭ, чья чувствительность ниже в 4-19 раз [180, 174]. Кроме того, SYBR Gold легко удаляется из раствора ДНК путем ее стандартного переосаждения в этаноле [173]. Перспективность использования данного красителя объясняется еще и полным отсутствием мутагенного эффекта и низкой токсичностью SYBR Gold, в отличие от мутагенного БЭ и токсичного SYBR Green [181, 182]. Молекулярные и концентрационные характеристики данного красителя являются интеллектуальной собственностью фирмы-производителя, которая рекомендует использовать его по протоколу постокрашиания ввиду влияния SYBR Gold на электрофоретическую подвижность ДНК. Однако высокая стоимость такого окрашивания резко ограничивает использование этого красителя. При таком подходе существует и другая проблема: значительные временные затраты на окрашивание высокопроцентных агарозных гелей и достаточно низкое качество получаемых в этом случае электрофореграмм. В связи со всем вышесказанным в рамках данной работы проведена оптимизация метода визуализации ДНК в агарозном геле с использованием SYBR Gold по протоколу предокрашивания. В ходе исследования была показана крайне высокая аффинность данного красителя к ДНК и стабильность образуемого с ней комплекса. Последний оставался стабильным на протяжении, по крайней мере, трех часов проведения электрофореза. Параметр стабильности комплекса краситель-ДНК является крайне важным, когда речь идет о применении красителя для процедуры предокрашивания. Так, 94 например, такой подход крайне затруднен в случае бромистого этидия или другого представителя цианиновых красителей - тиазола оранжевого (ТО), комплексы с ДНК которых, не обладают достаточной для этого стабильностью [183, 184]. Таким образом, полученный результат уже сам по себе указывает на принципиальную возможность применения в отношении SYBR Gold методики предокрашивания. В ходе проводимого в настоящей работе анализа влияния SYBR Gold на электрофоретическую подвижность ДНК, выявлен пороговый характер зависимости. Показано, что данный краситель не влияет на скорость миграции ДНК, при соотношении SG/ДНК (количество молекул красителя к числу п.о. ДНК) 1/25 и ниже. Однако при увеличении этого значения наблюдается снижение электрофоретической подвижности не только в зависимости от соотношения SG/ДНК, но и от количества ДНК в пробе. Одним из возможных объяснений такого характера влияния может служить наличие двух механизмов связывания красителя с ДНК. Так, известно, что близкий к SYBR Gold по химическому строению SYBR Green I при низких соотношениях краситель/ДНК формирует комплекс с ДНК путем интеркаляции, а при высоких – путем встраивания по малой бороздке [180]. По такому же двойному механизму образуют с ДНК комплексы и некоторые другие представители цианинового ряда: триазол оранжевый (ТО), ТО-PRO-1, оксазол желтый (YO), YO-PRO-1, и PicoGreen [180]. Вероятным объяснением снижения электрофоретичской подвижность ДНК при высоких значения соотношения краситель/ДНК может служить, во-первых, влияние ионного окружения биополимера, а, во-вторых, изменение гибкости молекулы ДНК за счет располагающегося в ней красителя [177, 171]. Кроме того, на миграцию ДНК в геле может влиять и хорошо известная способность цианиновых красителей агрегировать в водно-солевых растворах, что, в свою очередь, создает предпосылки для образования сложных межмолекулярных комплексов, имеющих меньшую электрофоретическую подвижность [185]. Полученное в этой работе оптимальное соотношение SG/ДНК 1 к 25, соответствующее коэффициенту k (см. раздел 3.1.3), равному 0,05 у.е./нг, 95 согласуется с данными, представленными в работе Тума и соавторов [173]. В их исследовании был проведен анализ влияния разведений исходного 10000кратного раствора SYBR Gold на подвижность ДНК в количестве 100 нг в 10 мкл пробы. Авторами было показано, что при предокрашивании ДНК SYBR Gold незначительно влияет на подвижность при использовании 0,67-кратной концентрации красителя в пробе, т.е. при k=0,067 у.е./нг. В их экспериментах краситель переставал влиять на подвижность ДНК при 0,33-кратной концентрации в пробе, то есть при k=0,033 у.е./нг. Однако Тума и соавторы окрашивали в данном случае небольшое суммарное количество рестрицированной ДНК фага λ (48502 п.о.) – 100 нг, что привело к невозможности визуализации полос ДНК длиной менее 2300 п.о. (менее 5 нг ДНК в полосе), хотя постокрашивание и позволяло их детектировать. В наших же экспериментах взяты значительно большии количества ДНК, что позволило эффективно использовать метод предокрашивания ДНК с помощью SYBR Gold. Также как и в настоящей работе, использование Тумой и соавторами более высокого соотношения краситель/ДНК (k=0,14) приводило к изменению электрофоретической подвижности комплекса SG/ДНК. Таким образом, использование соотношения 1 молекула SYBR Gold на 25 п.о. молекулы ДНК (или k=0,05 у.е./нг) при проведения предокрашивания гарантирует сохранение исходной подвижности фрагмента ДНК. При этом четко визуализируются фракция ДНК, содержащая не менее 10 нг. Данный метод окрашивания ДНК позволяет повысить эффективность использования красителя (снизить его расход) более чем в 100 раз. 96 4.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (СА/TG)n- повторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации Характерной особенностью геномов всех эукариот является их высокая насыщенность повторяющимися последовательностями ДНК. Долгое время эти некодирующие элементы считались балластной ДНК, не имеющей функциональной значимости. К настоящему времени, однако, уже накоплено большое количество данных об участии повторяющихся последовательностей в регуляции экспрессии генов, а также в генетических перестройках, играющих роль, как в популяционных вариациях, так и в патогенезе различных заболеваний человека. Известно, что наиболее распространенные динуклеотидные повторы позвоночных – poly(CA/TG) – являются «горячими» точками ГР, хотя механизмы их функционирования до сих пор остаются неясным. Одним из объяснений роли (CA/TG)n-повторов может служить их участие в процессах инициации и/или терминации ГР за счет структурных особенностей данной последовательности. Согласно современным представлениям ДНК может кодировать биологическую информацию не только через линейный порядок нуклеотидов, но и через формирование разнообразных альтернативных структур. Способность различных геномных последовательностей к образованию неканонических структур в настоящее время находится в стадии активного изучения. Так, многочисленные исследования повторяющихся пурин-пиримидиновых in vitro свидетельствуют о последовательностей способности формировать структуры, отличающиеся по своим характеристикам от классической В-формы двойной спирали ДНК. В частности существуют экспериментальные данные о потенциальной возможности формирования (CA/TG)n-микросателлитами таких неканонических структур как Z-форма ДНК и внутримолекулярный квадруплекс [115, 123]. Их влияние на процесс ГР может быть обусловлен облегчением взаимодействия гомологичной последовательности с одноцепочечной ДНК, образовавшейся в результате свертывания комплементарной цепи в 97 альтернативную конформацию, либо на границе перехода одной формы ДНК в другую. Кроме того, увеличение вероятности инициации ГР может быть связано с повышенной легкостью обмена цепей внутри образованной мультиспиральной неканонической структуры или ее распознаванием ядерными белками. Кроме всего выше сказанного, poly(CA/TG), наряду с другими микросателлитными последовательностями, характеризуется таким свойством как нестабильность в условиях in vivo, что проявляется наличием нуклеотидных выпетливания одной или нескольких повторяющихся единиц [126, 130]. Такие выпетливания, как и неканонические структуры, в свою очередь, также могут являться причиной функционирования poly(CA/TG) в качестве сайтов инициации/терминации ГР. 4.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея Одним из центральных моментов ГР является образование четырехнитевой структуры – «полухиазмы» Холлидея, перемещение которой вдоль рекомбинирующих дуплексов и обеспечивает необходимый репаративный синтез. Принимая во внимание возможное наличие структурных особенностей ДНК в области (CA/TG)n-повторов, было выдвинуто предположение о влияние данной последовательности на процесс миграции ветвей структуры Холлидея и, соответственно, на ее разрешение в две независимые молекулы. Для изучения структурных особенностей ДНК в области микросателлитных повторов, а также их роли в процессе ГР необходимо создание модели той или иной стадии данного процесса. В основе моделирования «миграции ветвления» структур Холлидея, использованного в настоящем исследовании, лежит ДНКДНК взаимодействие, ранее продемонстрированное М.Г. Якубовской и соавторами. В ходе их работы было показано, что при проведении агарозного гель-электрофореза очищенных продуктов ПЦР, наряду с полосой, соответствующей по массе двунитевой ДНК, появляется дополнительная полоса, соответствующая удвоенному размеру очищенного фрагмента. Последующий 98 электронно-микроскопический анализ этих двух фракций показал, что ДНК, соответствующая ПЦР-продукту, представляет собой линейные фрагменты. В то же время фракция ДНК, соответствующая удвоенному размеру ПЦР-продукта, состоит из множества крестообразных структур. Данные структуры обладают симметрией: имеют попарно равные плечи, хотя точка перекреста фрагментов в χ-структурах локализована по-разному Формирование [166]. таких четырехнитевых структур в растворе продуктов ПЦР происходит за счет взаимодействия диссоциированных концевых пар нуклеотидов двух гомологичных дуплексов с последующей миграцией ветвей и разрешением этих структур в новые или исходные дуплексы (рис. 8). Таким образом, в растворе существует динамическое равновесие между линейными фрагментами ДНК и образованными ими четырехнитевыми структурами [165, 166]. Описанный феномен спонтанного взаимодействия гомологичных линейных дуплексов с образованием крестообразных структур (структур Холлидея) представляет собой удобную модель для изучения роли микросателлитных повторов в процессе рекомбинации. настоящей С помощью модели уже были получены предварительные данные о способности (CA/TG)31-повтора тормозить «миграцию ветвления» структур Холлидея, сформированных ПЦР-продуктами [167]. Однако дуплексы, лежащие в основе образуемых структур Холлидея, не были строго идентичными и отличались друг от друга не только областью (CA/TG)31-повтора, но и прилегающими к нему последовательностями ДНК, что затрудняло интерпретацию полученных данных. В ходе настоящего исследования для анализа влияния poly(CA/TG) на «миграцию ветвления» использовалась описанная выше модельная система, но дуплексы, составляющие основу структур Холлидея, были строго идентичными и отличались только повторяющейся последовательностью. Это было достигнуто за счет предварительного клонирования в полилинкерный сайт плазмиды PUC19 (CA/TG)31-, (CA/TG)25-последовательностей и рэндомной последовательности соответствующей длины. Таким образом, в данной работе появилась возможность 99 оценить вклад только poly(CA/TG), избегая возможного влияния со стороны фланкирующих последовательностей. В результате проведенного анализа, выполненного с помощью электронной микроскопии и последующей статистической обработки полученных результатов, продемонстрирована способность (CA/TG)n-последовательности тормозить «миграцию ветвления» структур Холлидея в ряде случаев. Так, сравнительный анализ показал, что точки перекреста структур Холлидея с (CA/TG)n-повтором, в основе которых лежат ПЦР-продукты или имеет место (CA/TG)25/31- гетерология, с большей частотой встречаются в области повтора по сравнению со структурами Холлидея без (CA/TG)n-последовательности, где точки перекреста располагаются преимущественно на концах молекул. В то же время, не было выявлено статистически достоверного различия в расположении точки перекреста четырехнитевых структур, образованных фрагментами плазмидной ДНК, как содержащими, так и не содержащими повторов. Полученные результаты совпадают с данными, представленными в работе Бенет и Азорин [186], где на модели синтетических структур Холлидея, было показано, что в отличие от (GA/TC)22-повтора, (СA/TG)30-последовательность не приводит к замедлению процесса миграции ветвей. Торможение «миграции ветвления» (GA/TC)22последовательностью триплексной было структуры обусловлено при низких формированием значениях рН. этим Для повтором образования неканонической структуры (CA/TG)n-повторами требуются более сложные для моделирования или менее физиологические условия (отрицательная сверхспирализация, высокие концентрации солей цезия и т.д.) [113], которые не были использованы ни в экспериментах Бенет, ни в настоящем исследовании. Тем не менее, показанное в данной работе торможение «миграции ветвления» (CA/TG)25/31-последовательностью, свидетельствует о влиянии СА-повтора на процесс обмена нитями за счет существования гетерологии в микросателлитном локусе. Учитывая высокую, по сравнению с неповторяющейся последовательностью, частоту мутаций микросателлитных повторов [187], а также данные И. Панютина и соавторов о способности делеции всего лишь 100 одного основания приводить к значительному снижению скорости миграции ветвей структур Холлидея [188], можно сделать вывод о том, что именно наличие одного или нескольких выпетливаний в области СА-микросателлита является основной причиной остановки структуры Холлидея в области poly(CA/TG). При этом следует учитывать, что нестабильность (СА/TG)n-последовательностей, показанная в системах in vivo за счет действия репарационных систем, значительно ниже той, что наблюдается при проведении ПЦР. Так, если делеции одной повторяющейся единицы (CA/TG)31-микросателлитного локуса в ПЦРпродуктах встречаются в 10% случаев, то в системе in vivo – порядка 1% [135, 140]. Это является объяснением того, почему в ходе нашего исследовании не было обнаружено торможения миграции ветвей в структурах Холлидея, сформированных фрагментами рестрицированной плазмидной ДНК, содержащими poly(CA/TG), в то время как торможение присутствовало, когда для их формирования использовали ПЦР-продукты. Влияние 1% выпетливаний находится за пределами чувствительности данной модельной системы и детекция тормозящего влияния со стороны poly(CA/TG) становится возможной только, когда эта нестабильность искусственно повышена путем совместной инкубации фрагментов, содержащих разное число повторов (соответственно 25 и 31). Геном человека содержит более 12000 высокополиморфных (СA/TG)nповторов [189]. Полиморфизм СА-микросателлитов в популяции человека обеспечивает высокую вероятность гетерозиготности по этим локусам, что может быть одной из причин торможения «миграции ветвления» в процессе рекомбинации и увеличения частоты разрешения структур Холидея именно в этих повторяющихся последовательностях. 4.2.2. Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК Ключевым моментом ГР является инвазия (встраивание) нуклеопротеинового филамента в комплементарную область гомологичного 101 дуплекса ДНК. Повышенная частота рекомбинационных событий именно в области СА-микросателлитов, вероятнее всего связана с облегчением этой стадии за счет конформационных особенностей (CA/TG)n-последовательности: наличия выпетливаний одной или нескольких повторяющихся единиц или формирования неканонической структуры ДНК (G-квадруплекс, Z-ДНК). Существование конформационных особенностей CA-повторов, важных для синаптической стадии ГР, нашло подтверждение в предыдущих исследования нашей лаборатории, где впервые был установлен факт спонтанной инвазии олигонуклеотидов dCA10 и dTG10 в дуплексную структуру ДНК, содержащую (CA/TG)31-последовательность. При этом в случае неповторяющейся последовательности подобное взаимодействие обнаружено не было. Таким образом, представляло интерес дальнейшее изучение феномена олигонуклеотидной инвазии, направленное на выяснение механизмов, лежащих в ее основе. Первоочередной задачей было понять, является ли спонтанная олигонуклеотидная инвазия особенностью, характерной исключительно для poly(CA/TG) или она возможна и в отношении других микросателлитных последовательностей. Анализ, выполненный с использованием геномной эукариотической и прокариотической плазмидной ДНК показал, что из целого ряда повторов, а именно (CT/GA)n, (AT/TA)n, (CCA/GGT)n, (CCCA/GGGT)n, (CAG/GTC)n, (CGG/GCC)n и (CTT/GAA)n, в условиях эксперимента олигонуклеотидная инвазия наблюдается только в случае (CTT/GAA) 114последовательности. Из литературных данных известно о способности длинных (CTT/GAA)n-микросателлитов формировать неканоническую Н-форму ДНК (рис. 25), причем не только в системах in vitro, но и в живых клетках [190-192]. Таким образом, можно сделать вывод о том, что олигонуклеотидное встраивание в (CTT/GAA)114-повтор обусловлено именно образованием неканонической формы ДНК. 102 Буквой N обозначен любой нуклеотид ДНК, • - Уотсон-Криковские водородные связи между основаниями ДНК, * - Хугстеновские водородные связи. Рисунок 25 - Н-форма ДНК на примере (CT)16-последовательности Следует заметить, что многие микросателлитные последовательности, в том числе и участвующие в данном эксперименте, способны образовывать отличные от B-формы конформации ДНК. Так, в ряде случаев (CT/GA)n- последовательность формирует триплексы [193], (CAG/GTC)n и (CGG/GCC)n – шпилечные структуры [194, 195], а (CCA/GGT)n – G-квадруплексы [196]. Однако в большинстве случаев образование любой неканонической структуры сильно зависит от совокупности многих факторов. Возможно, условия нашего эксперимента оказались подходящими только для формирования неканонической структуры (CA/TG)n- и (CTT/GAA)n-повторами. С гипотезой об образовании САмикросателлитом неканонической структуры, обуславливающей олигонуклеотидную инвазию, согласуются и данные по изучению встраивания dCA10 и dTG10 в плазмиду, содержащую повтор разной длины. В ходе исследования было показано, что с наибольшей интенсивность инвазия происходит в плазмиду, несущую (CA/TG)31 и (CA/TG)94. При этом инвазия как dCA10, так и dTG10 характеризовалась значительно меньшей интенсивностью в случае плазмид с (CA/TG)15 и (CA/TG)25. Учитывая, что длина повтора играет существенную роль в образовании и стабильности неканонических структур, можно сделать вывод об особенностях формирования неканонической структуры ДНК CA-микросателлитом при разной его длине. При этом, стоит заметить, что в работе по изучению влиянии poly(CA/TG) на экспрессию генов было показано, 103 что наибольшая энхансерная активность повтора проявлялась при его длине в 15 и 20 п.о. [97]. Вероятно, при такой длине сформированная неканоническая структура имеет особенности строение, которые помогают ей функционировать в качестве сильного регуляторного элементами, но одновременно препятствуют олигонулеотидной инвазии. С другой стороны, если предположить, что олигонуклеотидная инвазия в poly(CA/TG) обусловлена формированием данной последовательностью неканонической структуры ДНК, остается непонятным, почему после удаления из раствора ДНК уже сформировавшегося комплекса олигонуклеотид-дуплекс, повторного встраивания dCA10 и dTG10 ни в кольцевую, ни в линейную форму ДНК не происходит. Этот результат явно свидетельствует о том, что изучаемые в данной работе структурные особенности (СА/TG)n-повторов не являются динамическим свойством микросателлита, а возникают в клетках и остаются стабильными на протяжении всего процесса выделения плазмидной ДНК. Наиболее подходящими претендентами на роль таких особенностей являются выпетливания одной или нескольких повторяющихся единиц, возникающих в следствие нестабильности poly(CA/TG)n in vivo. Выпетливания СА- или TGповторов, по некоторым данным, могут плохо исправляться системой мисмэтчрепарации, приводя к существованию части плазмид в клетке с неспаренными нуклеотидами, с которыми впоследствии комплементарные олигонуклеотиды [125,126]. способны взаимодействовать Наличие таких выпетливаний остается постоянным после выделения ДНК из клетки и их конформация не зависит от солевых условий. С этой гипотезой согласуются и данные по инвазии dCA10 и dTG10 в геномную ДНК, где было обнаружено встраивание только dTG10олигонуклеотида. Из литературных данных известно, что на частоту мутации (CA/TG)n-повтора влияет его ориентация. Так, было показано, что при использовании различных штаммов бактерий, частота мутаций была в 2 раза выше, когда TG-нить была лидирующей [134]. По всей видимости этот факт стал определяющим и для геномной ДНК. Наиболее вероятно, выпетливания повторяющихся единиц носили такой характер, что инвазия dCA10- 104 олигонуклеотида либо отсутствовала, либо находилась за чувствительностью данного метода. По-видимому, недостаточной чувствительностью метода можно объяснить и отсутствие видимой инвазии в отношении других динуклеотидных повторов, тоже характеризующихся достаточно высоким уровнем нестабильности in vivo [197]. Количество (AT/TA)n и (CT/GA)n в человеческом геноме во много раз меньше, чем (CA/TG)n, и, соответственно, выход комплекса очень не велик и не детектируется [80]. Что же касается три- и терануклеотидных повторов, то их стабильность – во много раз выше. Таким образом, исходя из результатов ряда экспериментов, можно сделать вывод, что наиболее вероятной причиной возникновения олигонуклеотидной инвазии является нестабильность poly(CA/TG) и, как следствие, наличие выпетливаний повторяющихся единиц, представляющих собой область с неспаренными основаниями, создающими предпосылку для встраивания олигонуклеотида. Однако, нельзя полностью исключать и возможность CAмикросателлита формировать неканонические структуры ДНК. Такие структуры могут являться как вспомогательной основой для олигонуклеотидной инвазии, так и самостоятельным механизмом, как это было показано для (CTT/GAA)114последовательности. 105 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Соматическая репарационных гомологичная механизмов, рекомбинация обеспечивающий – один из поддержание ведущих стабильности клеточного генома путем исправления наиболее опасных повреждений – двунитевых разрывов ДНК. На сегодняшний день известно, что дефекты в системе ГР лежат в основе развития целого ряда наследственных заболеваний, ассоциированных с высоким риском развития злокачественных новообразований, а мутации белков ГР встречаются в клетках большинства спорадических опухолей. Значительный прогресс в понимании механизмов ГР, связанный с изучением ее белковых систем, уже позволил использовать накопленные знания в области диагностики онкологических заболеваний, при составлении прогноза течения и выборе стратегии химиотерапевтического лечения. Однако многое в функционировании ГР по-прежнему остается непонятным. Известно, что рекомбинационные события распределены по геному неравномерно. В качестве основных претендентов на роль «горячих» точек рекомбинации выступают микросателлитные последовательности ДНК, и, в частности, (CA/TG)n-повторы. Причины такого стимулирующего действия со стороны (CA/TG)n- последовательностей не известны, но понимание механизма их влияние необходимо, ведь даже при нормальном функционировании, ГР может вносить значительный вклад в процесс канцерогенеза. Возникающая в ходе рекомбинации потеря гетерозиготности является одним из важнейших событий в патогенезе опухолевых заболеваний. Понимание механизмов влияния (CA/TG)n-повторов, во-первых, позволит выявить локусы с наибольшей предрасположенностью к потере гетерозиготности, что раскроет возможности для формирования групп риска и позволит более точно определять прогноз заболевания. Во-вторых, изучение структурных особенностей CA-микросателлитов расширит наше представление о работе системы ГР в целом, что, возможно, в будущем откроет перспективы для создания новых химиотерапевтических препаратов. 106 Наиболее вероятной причиной влияния (CA/TG)n-последовательности на ГР является наличие структурных особенностей данного региона. В настоящей работе проведено изучение структурно-функциональных характеристик poly(CA/TG), важных для ключевых этапов ГР: стадий инициации и терминации процесса. С помощью модельной системы, основанной на спонтанном формировании четырехнитевых структур в высококонцентрированных водных растворах дуплексной ДНК, электронной микроскопии и последующей статистической обработки полученных данных показано, что гетерология между микросателлитными локусами (CA/TG)n в шесть повторяющихся единиц ингибирует миграцию ветвей структуры Холлидея. Полиморфизм СА- микросателлитов в популяции человека обеспечивает высокую вероятность гетерозиготности по этим локусам, что может быть одной из причин торможения «миграции ветвления» в процессе рекомбинации и увеличения частоты разрешения структур Холлидея именно в районе повторяющихся последовательностях. Кроме того, в данной работе продолжено, ранее начатое в лаборатории М.Г. Якубовской, изучение феномена встраивания коротких одноцепочечных ДНК в комплементарную им область CA-микросателлита дуплексной ДНК. С помощью плазмидной ДНК прокариот, а также геномной ДНК человека, установлено, что структурные особенности (CA/TG)n-повтора, лежащие в основе образования комплекса олигонуклеотид-ДНК, формируются in vivo. Кроме того, показано, что на процесс олигонуклеотидной инвазии практически не влияют условия микроокружения. Все эти данные свидетельствуют в пользу того, что встраивание одноцепочечных фрагментов d(CA)10 и d(GT)10 в (CA/TG)n-повторяющуюся последовательность обусловлено наличием в последней выпетливаний нескольких повторяющихся единиц. С другой стороны, полученные в настоящей работе данные о возможности встраивания олигонуклеотида d(GAA)7 в повторяющуюся последовательность (CTT/GAA)114, способную в условиях отрицательной сверхспирализации формировать H-структуру ДНК, а также о влиянии на интенсивность олигонуклеотидной инвазии длины (CA/TG)-повтора, свидетельствуют в пользу 107 образования CA-микросателлитом какой-либо неканонической структуры ДНК (G-квадруплекса, Z-формы), лежащей в основе наблюдаемого ДНК-ДНК взаимодействия. Дальнейшее изучение CA-микросателлитов с использованием различных про- и эукариотических систем позволит более точно выявить те структурные особенности, которые определяют возможность встраивания d(CA)10 и d(GT)10, а следовательно и стимулируют синаптическую стадию ГР. 108 ВЫВОДЫ 1. Микросателлитные локусы (CA/TG)n обладают способностью к спонтанному взаимодействию с одноцепочечной ДНК d(GT)10, что было продемонстрировано на сверхспирализованной, релаксированной и линеаризованной плазмидной ДНК, а также геномной ДНК человека. 2. Среди других микросателлитных локусов, а именно, (GA/TC)n, (TA/AT)n, (CAG/GTC)n, (CGG/GCC)n, (CTT/GAA)n, (GGT/CCA)n и (GGGT/CCCA)n, способностью к спонтанному взаимодействию с гомологичной одноцепочечной ДНК обладают только длинные (CTT/GAA)n-повторы, формирующие в условиях отрицательной сверхспирализации неканоническую Hформу ДНК. 3. Топологические особенности ДНК в области микросателлитных локусов (CA/TG)n, определяющие их способность к взаимодействию с одноцепочечными фрагментами d(CA)10 и d(GT)10, формируются in vivo. 4. При изучении влияния длины повторяющегося локуса (CA/TG)n, находящегося в составе сверхспирализованной плазмидной ДНК, на особенности встраивания в дуплекс одноцепочечных фрагментов d(СА)10 и d(GT)10 было установлено, что интенсивность ДНК-ДНК взаимодействия убывает в ряду: (CA/TG)31 = (CA/TG)94 > (CA/TG)10 > (CA/TG)15 = (CA/TG)25. 5. Интенсивность взаимодействия микросателлитных локусов (CA/TG)31 сверхспирализованной плазмидной ДНК с комплементарными одноцепочечными фрагментами зависит от их мольного соотношения и возрастает с повышением соотношения дуплекс / олигонуклеотид от 1/10 до 1/1, после достижения которого, выходит на плато. 6. Интенсивность взаимодействия микросателлитных локусов (CA/TG)31 с одноцепочечными фрагментами d(CA)10 и d(GT)10, не изменяется при использовании ряда солевых буферных растворов, однако снижается в бессолевых условиях. 109 7. Обладающие полной гомологией (СА/TG)n-микросателлитные локусы не влияют на миграцию ветвей структуры Холлидея, промежуточного продукта гомологичной рекомбинации, в то время как гетерология в области повторяющейся последовательности ингибирует данный процесс, что может способствовать ее ферментативному разрешению в этих участках генома. 8. Флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот SYBR Gold не влияет на электрофоретическую подвижность ДНК при его низких соотношениях с биополимером, что позволило оптимизировать протокол визуализации ДНК и сократить финансовые и временные затраты на этапе пробоподготовки ДНК и избежать использования токсичных и мутагенных соединений при проведении исследования. 110 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 1. АТФ – аденозинтрифосфат 2. БЭ – бромистый этидий 3. ГР – гомологичная рекомбинация 4. мРНК – матричная РНК 5. НТО – нетранслируемая область 6. п.о.– пара оснований 7. ПЦР – полимеразная цепная реакция 8. BIR – break-induced replication 9. DSBR – double-strand break repair 10. E. coli – Escherichia coli 11. HMG – high mobility group 12. RPA – replication protein A 13. S. cerevisiae – Saccharomyces cerevisiae 14. SDSA – synthesis-depend strand annealing 15. SV40 – Simian virus 40 111 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. San Filippo, J. Mechanism of eukaryotic homologous recombination / J. San Filippo, P. Sung, H. Klein // Annu Rev Biochem. – 2008. - № 77. – С. 229-257. 2. Heyer, W.D. Regulation of homologous recombination in eukaryotes / W.D. Heyer, K.T. Ehmsen, J. Liu // Annu Rev Genet. – 2010. - № 44. – С. 113-139. 3. Williams, R.S. Mre11-Rad50-Nbs1 is a keystone complex connecting DNA repair machinery, double-strand break signaling, and the chromatin template / R.S. Williams, J.S. Williams, J.A. Tainer // Biochem Cell Biol. - 2007. - № 4. – С. 509520. 4. Yuan, J. MRE11-RAD50-NBS1 complex dictates DNA repair independent of H2AX / J.Yuan, J. Chen // J Biol Chem. - 2010. - № 2. – С. 1097-1104. 5. Yuan, J. N terminus of CtIP is critical for homologous recombination-mediated double-strand break repair / J. Yuan, J. Chen // J Biol Chem. – 2010. - № 46. – С. 31746-31752. 6. Nimonkar, A.V. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair / A.V. Nimonkar, J. Genschel, E. Kinoshita, P. Polaczek, J.L. Campbell, C. Wyman, P. Modrich, S.C. Kowalczykowski // Genes Dev. – 2011. - № 4. – С. 350-362. 7. Baumann, P. Human Rad51 protein promotes ATP-dependent homologous pairing and strand transfer reactions in vitro / P. Baumann, F.E. Benson, S.C. West // Cell. - 1996. - № 4. – С. 757-766. 8. Sung, P. DNA strand exchange mediated by a RAD51-ssDNA nucleoprotein filament with polarity opposite to that of RecA / P. Sung, D.L. Robberson // Cell. 1995. - № 3. – С. 453-461. 9. Moynahan, M.E. Mitotic homologous recombination maintains genomic stability and suppresses tumorigenesis / M.E. Moynahan, M. Jasin // Nat Rev Mol Cell Biol. 2010. - № 3. – С. 196-207. 10. Sugiyama, T. A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein / T. 112 Sugiyama, E.M. Zaitseva, S.C. Kowalczykowski // J Biol Chem. – 1997. - № 12 – С. 7940-7945. 11. Van Komen, S. Functional cross-talk among Rad51, Rad54, and replication protein A in heteroduplex DNA joint formation / S. Van Komen, G. Petukhova, S. Sigurdsson, P. Sung // J Biol Chem. - 2002. - № 46– С. 43578-43587. 12. Eggler, A.L. The Rad51-dependent pairing of long DNA substrates is stabilized by replication protein A / A.L. Eggler, R.B. Inman, M.M. Cox // J Biol Chem. – 2002. № 42. – С. 39280-39288. 13. Zou, Y. Functions of human replication protein A (RPA): from DNA replication to DNA damage and stress responses / Y. Zou, Y. Liu, X. Wu, S.M. Shell // J Cell Physiol. – 2006. - № 2. – С. 267-273. 14. Sung, P. Rad51 recombinase and recombination mediators / P. Sung, L. Krejci, S. Van Komen, M.G. Sehorn // J Biol Chem. – 2003. - № 44. - С. 42729-42732. 15. Sung, P. Function of yeast Rad52 protein as a mediator between replication protein A and the Rad51 recombinase / P. Sung // J Biol Chem. – 1997.- № 45. – С. 28194-28197. 16. Sigurdsson, S. Mediator function of the human Rad51B-Rad51C complex in Rad51/RPA-catalyzed DNA strand exchange / S. Sigurdsson, S. Van Komen, W. Bussen, D. Schild, J.S. Albala, P. Sung // Genes Dev. – 2001.- № 24. – С. 3308-3318. 17. Shinohara, A. Stimulation by Rad52 of yeast Rad51-mediated recombination / A. Shinohara, T. Ogawa // Nature. - 1998. - № 6665. – С. 404-407. 18. Kanaar, R. Genetic recombination. From competition to collaboration / R. Kanaar, J.H. Hoeijmakers // Nature. - 1998. - № 6665. – С. 337-338. 19. Siaud, N. Plasticity of BRCA2 function in homologous recombination: genetic interactions of the PALB2 and DNA binding domains / N. Siaud, M.A. Barbera, A. Egashira, I. Lam, N. Christ, K. Schlacher, B. Xia, M. Jasin // PLoS Genet. – 2011. -№ 12. - e1002409. 20. Carreira, A. The BRC repeats of BRCA2 modulate the DNA-binding selectivity of RAD51 / A. Carreira, J. Hilario, I. Amitani, R.J. Baskin, M.K. Shivji, A.R. Venkitaraman, S.C. Kowalczykowski // Cell. – 2009. - № 6. – С. 1032-1043. 113 21. Baumann, P. Heteroduplex formation by human Rad51 protein: effects of DNA end-structure, hRP-A and hRad52 / P. Baumann, S.C. West // J Mol Biol. – 1999. - № 2. – С. 363-374. 22. Wu, L. The Bloom's syndrome helicase suppresses crossing over during homologous recombination / L. Wu, I.D. Hickson // Nature. – 2003. - № 6968. – С. 870-874. 23. Symington, L.S. Resolving resolvases: the final act? / L.S. Symington, W.K. Holloman // Mol Cell. – 2008. - № 5. – С. 603-604. 24. Liu, Y. RAD51C is required for Holliday junction processing in mammalian cells / Y. Liu, J.Y. Masson, R. Shah, P. O'Regan, S.C. West // Science. – 2004. - № 5655. – С. 243-246. 25. Fekairi, S. Human SLX4 is a Holliday junction resolvase subunit that binds multiple DNA repair/recombination endonucleases / S. Fekairi, S. Scaglione, C. Chahwan, E.R. Taylor, A. Tissier, S. Coulon, M.Q. Dong, C. Ruse, J.R. Yates 3rd, P. Russell, R.P. Fuchs, C.H. McGowan, P.H. Gaillard // Cell. – 2009. - № 1. – С. 78-89. 26. Wong, J.M. Interaction between BRCA2 and replication protein A is compromised by a cancer-predisposing mutation in BRCA2 / J.M. Wong, D. Ionescu, C.J. Ingles // Oncogene. – 2003. - № 1. – С. 28-33. 27. Esashi, F. Stabilization of RAD51 nucleoprotein filaments by the C-terminal region of BRCA2 / F. Esashi, V.E. Galkin, X. Yu, E.H. Egelman, S.C. West // Nat Struct Mol Biol. – 2007. - № 6. – С. 468-474. 28. Dray, E. Enhancement of RAD51 recombinase activity by the tumor suppressor PALB2 / E. Dray, J. Etchin, C. Wiese, D. Saro, G.J. Williams, M. Hammel, X. Yu, V.E. Galkin, D. Liu, M.S. Tsai, S.M. Sy, D. Schild, E. Egelman, J. Chen, P. Sung // Nat Struct Mol Biol. – 2010. - № 10. С. 1255-1259. 29. McIlwraith, M.J. DNA repair synthesis facilitates RAD52-mediated second-end capture during DSB repair / M.J. McIlwraith, S.C. West // Mol Cell. – 2008. - № 4. – С. 510-516. 114 30. Krejci, L. Interaction with Rad51 is indispensable for recombination mediator function of Rad52 / L. Krejci, B. Song, W. Bussen, R. Rothstein, U.H. Mortensen, P. Sung // J Biol Chem. – 2002. - № 42. – С. 40132-40141. 31. Mazin, A.V. Rad54, the motor of homologous recombination / A.V. Mazin, O.M. Mazina, D.V. Bugreev, M.J. Rossi // DNA Repair (Amst). – 2010. - № 3. - С. 286-302. 32. Bugreev, D.V. Rad54 protein promotes branch migration of Holliday junctions / D.V. Bugreev, O.M. Mazina, A.V. Mazin // Nature. – 2006. - № 7102. – С. 590-593. 33. Tan, T.L. Rad54, a Jack of all trades in homologous recombination / T.L. Tan, R. Kanaar, C. Wyman // DNA Repair (Amst). – 2003. - № 7. –С. 787-794. 34. Xue, X. Role of replication protein A in double holliday junction dissolution mediated by the BLM-Topo IIIα-RMI1-RMI2 protein complex / X. Xue, S. Raynard, V. Busygina, A.K. Singh, P. Sung // J Biol Chem. – 2013. - № 20. – С. 14221-14227. 35. Masuda-Sasa, T. Biochemical analysis of human Dna2 / T. Masuda-Sasa, O. Imamura, J.L. Campbell // Nucleic Acids Res. – 2006. - № 6. – С. 1865-1875. 36. Caestecker, K.W. The role of BRCA1 in DNA double-strand repair: past and present / K.W. Caestecker, G.R. Van de Walle // Exp Cell Res. – 2013. - № 5. – С. 575-587. 37. Lee, M. Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament / M. Lee, J. Lipfert, H. Sanchez, C. Wyman, N.H. Dekker // Nucleic Acids Res. – 2013. - № 14. – С. 7023-7030. 38. Krejci, L. Homologous recombination and its regulation / L. Krejci, V. Altmannova, M. Spirek, X. Zhao // Nucleic Acids Res. – 2012. - № 13. – С. 5795-5818. 39. Chi, P. Roles of ATP binding and ATP hydrolysis in human Rad51 recombinase function / P. Chi, S. Van Komen, M.G. Sehorn, S. Sigurdsson, P. Sung // DNA Repair (Amst). – 2006. - № 3. – С. 381-391. 40. Dray, E. Enhancement of RAD51 recombinase activity by the tumor suppressor PALB2 / E. Dray, J. Etchin, C. Wiese, D. Saro, G.J. Williams, M. Hammel, X. Yu, V.E. Galkin, D. Liu, M.S. Tsai, S.M. Sy, D. Schild, E. Egelman, J. Chen, P. Sung // Nat Struct Mol Biol. – 2010. - № 10. – С. 1255-1259. 115 41. Uringa, E.J. RTEL1: an essential helicase for telomere maintenance and the regulation of homologous recombination / E.J. Uringa, J.L. Youds, K. Lisaingo, P.M. Lansdorp, S.J. Boulton // Nucleic Acids Res. – 2011. - № 5. – С. 1647-1655. 42. Wyatt, H.D. Coordinated Actions of SLX1-SLX4 and MUS81-EME1 for Holliday Junction Resolution in Human Cells / H.D. Wyatt, S. Sarbajna, J. Matos, S.C. West // Mol Cell. – 2013. - № 13. - С. 00635-00637. 43. Ip, S.C. Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast / S.C. Ip, U. Rass, M.G. Blanco, H.R. Flynn, J.M. Skehel, S.C. West // Nature. – 2008. № 7220. – С. 357-361. 44. Wilson, M.A. Pif1 helicase and Polδ promote recombination-coupled DNA synthesis via bubble migration / M.A. Wilson, Y. Kwon, Y. Xu, W.H. Chung, P. Chi, H. Niu, R. Mayle, X. Chen, A. Malkova, P. Sung, G. Ira // Nature. – 2013. - № 7441. С. 393-396. 45. Sneeden, J.L. Reconstitution of recombination-associated DNA synthesis with human proteins / J.L. Sneeden, S.M. Grossi, I. Tappin, J. Hurwitz, W.D. Heyer // Nucleic Acids Res. – 2013. - № 9. – С. 4913-4925. 46. Singh, D.K. Roles of RECQ helicases in recombination based DNA repair, genomic stability and aging / D.K. Singh, B. Ahn, V.A. Bohr // Biogerontology. – 2009. - № 3. – С. 235-252. 47. Salah, G.B. Chromosomal instability associated with a novel BLM frameshift mutation (c.1980-1982delAA) in two unrelated Tunisian families with Bloom syndrome / G.B. Salah, I.H. Salem, A. Masmoudi, B.B. Rhouma, H. Turki, F. Fakhfakh, H. Ayadi, H. Kamoun // J Eur Acad Dermatol Venereol. – 2013. - doi: 10.1111/jdv.12279. 48. Muftuoglu, M. The clinical characteristics of Werner syndrome: molecular and biochemical diagnosis / M. Muftuoglu, J. Oshima, C. von Kobbe, W.H. Cheng, D.F. Leistritz, V.A. Bohr // Hum Genet. – 2008. - № 4 – С. 369-377. 49. Larizza, L. Rothmund-Thomson syndrome / L. Larizza, G. Roversi, L. Volpi // Orphanet J Rare Dis. – 2010. - № 5 – doi: 10.1186/1750-1172-5-2. 50. Futreal, P.A. BRCA1 mutations in primary breast and ovarian carcinomas / P.A. Futreal, Q. Liu, D. Shattuck-Eidens, C. Cochran, K. Harshman, S. Tavtigian, L.M. 116 Bennett, A. Haugen-Strano, J. Swensen, Y. Miki, et al. // Science. – 1994. - № 5182. – С. 120-122. 51. Wooster, R. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2 / R. Wooster, G. Bignell, J. Lancaster, S. Swift, S. Seal, J. Mangion, N. Collins, S. Gregory, C. Gumbs, G. Micklem // Nature. – 1995. - № 6559. – С. 789-792. 52. Scully, R. Role of BRCA gene dysfunction in breast and ovarian cancer predisposition / Scully R Breast Cancer Res. – 2000. - № 5. – С. 324-330. 53. Miki, Y. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 / Y. Miki, J. Swensen, D. Shattuck-Eidens, P.A. Futreal, K. Harshman, S, Liu Q. Tavtigian, C. Cochran, L.M. Bennett, W. Ding, et al. // Science. – 1994. - № 5182. – С. 66-71. 54. Evers, B. Targeting homologous recombination repair defects in cancer / B. Evers, T. Helleday, J. Jonkers // Trends Pharmacol Sci. – 2010. - № 8. – p. 372-380. 55. Miyagawa, K. Clinical relevance of the homologous recombination machinery in cancer therapy / K. Miyagawa // Cancer Sci. – 2008. - № 2. – С. 187-94. 56. Hiramoto, T. Mutations of a novel human RAD54 homologue, RAD54B, in primary cancer / T. Hiramoto, T. Nakanishi, T. Sumiyoshi, T. Fukuda, S. Matsuura, H. Tauchi, K. Komatsu, Y. Shibasaki, H. Inui, M. Watatani, M. Yasutomi, K. Sumii, G. Kajiyama, N. Kamada, K. Miyagawa, K. Kamiya // Oncogene. – 1999. - № 22. – С. 3422-3426. 57. Wong, A.K. Characterization of a carboxy-terminal BRCA1 interacting protein / A.K. Wong, P.A. Ormonde, R. Pero, Y. Chen, L. Lian, G. Salada, S. Berry, Q. Lawrence, P. Dayananth, P. Ha, S.V. Tavtigian, D.H. Teng, P.L. Bartel // Oncogene. – 1998. - № 18. - С. 2279-2285. 58. Nelson, F.K. Mitotic recombination is responsible for the loss of heterozygosity in cultured murine cell lines / F.K. Nelson, W. Frankel, T.V. Rajan // Mol Cell Biol. – 1989. - № 3. – С. 1284-1288. 59. Gupta, P.K. High frequency in vivo loss of heterozygosity is primarily a consequence of mitotic recombination / P.K. Gupta, A. Sahota, S.A. Boyadjiev, S. 117 Bye, C. Shao, J.P. O'Neill, T.C. Hunter, R.J. Albertini, P.J. Stambrook, J.A. Tischfield // Cancer Res. – 1997. - № 6. – С. 1188-1193. 60. Tischfield, J.A. Loss of heterozygosity or: how I learned to stop worrying and love mitotic recombination / J.A. Tischfield // Am J Hum Genet. – 1997. - № 5. – С. 995-999. 61. Devilee, P. Ever since Knudson / P. Devilee, A.M. Cleton-Jansen, C.J. Cornelisse // Trends Genet. – 2001. - № 10. – С. 569-573. 62. Lasko, D. Loss of constitutional heterozygosity in human cancer / D. Lasko, W. Cavenee, M. Nordenskjöld // Annu Rev Genet. – 1991. - № 25. – С. 281-314. 63. Blackburn, A.C. Loss of heterozygosity occurs via mitotic recombination in Trp53+/- mice and associates with mammary tumor susceptibility of the BALB / c strain / A.C. Blackburn, S.C. McLary, R. Naeem, J. Luszcz, D.W. Stockton, L.A. Donehower, M. Mohammed, J.B. Mailhes, T. Soferr, S.P. Naber, C.N. Otis, D.J. Jerry // Cancer Res. – 2004. - № 15. – С. 5140-5147. 64. Stewart, D.R. Mitotic recombination of chromosome arm 17q as a cause of loss of heterozygosity of NF1 in neurofibromatosis type 1-associated glomus tumors / D.R. Stewart, A. Pemov, P. Van Loo, E. Beert, H. Brems, R. Sciot, K. Claes, E. Pak, A. Dutra, C.C. Lee, E. Legius // Genes Chromosomes Cancer. – 2012. - № 5. – С. 429437. 65. Hansen, L.T. The role of RAD51 in etoposide (VP16) resistance in small cell lung cancer / L.T. Hansen, C. Lundin, M. Spang-Thomsen, L.N. Petersen, T. Helleday // Int J Cancer. – 2003. - № 4. - С. 472-479. 66. Miyagawa, K. Clinical relevance of the homologous recombination machinery in cancer therapy / K. Miyagawa // Cancer Sci. – 2008. - № 2. – С. 187-194. 67. Chernikova, S.B. Inhibiting homologous recombination for cancer therapy / S.B. Chernikova, J.C. Game, J.M. Brown // Cancer Biol Ther. – 2012. - № 2. - С. 61-68. 68. Aloyz, R. Imatinib sensitizes CLL lymphocytes to chlorambucil / R. Aloyz, K. Grzywacz, Z.Y. Xu, M. Loignon, M.A. Alaoui-Jamali, L. Panasci // Leukemia. – 2004. - № 3. – С. 409-414. 118 69. Peng, G. Exploiting the homologous recombination DNA repair network for targeted cancer therapy / G. Peng, S.Y. Lin // World J Clin Oncol. – 2011. - № 2. – С. 73-79. 70. Taniguchi, T. Disruption of the Fanconi anemia-BRCA pathway in cisplatin- sensitive ovarian tumors / T. Taniguchi, M. Tischkowitz, N. Ameziane, S.V. Hodgson, C.G. Mathew, H. Joenje, S.C. Mok, A.D. D'Andrea // Nat Med. – 2003. - № 5. –С. 568-574. 71. Taron, M. BRCA1 mRNA expression levels as an indicator of chemoresistance in lung cancer / M. Taron, R. Rosell, E. Felip, P. Mendez, J. Souglakos, M.S. Ronco, C. Queralt, J. Majo, J.M. Sanchez, J.J. Sanchez, J. Maestre // Hum Mol Genet. – 2004. - № 22. – С. 2443-2449. 72. Lebel, M. A deletion within the murine Werner syndrome helicase induces sensitivity to inhibitors of topoisomerase and loss of cellular proliferative capacity / M. Lebel, P. Leder // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1998. - № 22. – С. 13097-13102. 73. Wahls, W.P. Meiotic recombination hotspots: shaping the genome and insights into hypervariable minisatellite DNA change / W.P. Wahls // Curr Top Dev Biol. 1998. - № 37 – С. 37-75. 74. Majewski, J. GT repeats are associated with recombination on human chromosome 22 / J. Majewski, J. Ott // Genome Res. - 2000. - № 8. – С. 1108-1114. 75. Tóth, G. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis / G. Tóth, Z. Gáspári, J. Jurka // Genome Res. – 2000. - № 7. - С. 967-981. 76. Sharma, P.C. Mining microsatellites in eukaryotic genomes / P.C. Sharma, A. Grover, G. Kahl // Trends Biotechnol. – 2007. - № 11. – С. 490-498. 77. Gao, H. Discrepancy variation of dinucleotide microsatellite repeats in eukaryotic genomes / H. Gao, S. Cai, B. Yan, B. Chen, F Yu // Biol Res. – 2009. - № 3. – С. 365-375. 78. Wren, J.D. Repeat polymorphisms within gene regions: phenotypic and evolutionary implications / J.D. Wren, E. Forgacs, J.W. Fondon 3rd, A. Pertsemlidis, S.Y. Cheng, T. Gallardo, R.S. Williams, R.V. Shohet, J.D. Minna, H.R. Garner // Am J Hum Genet. – 2000. - № 2. – С. 345-356. 119 79. Li, Y.C. Microsatellites within genes: structure, function, and evolution / Y.C. Li, A.B. Korol, T. Fahima, E. Nevo // Mol Biol Evol. – 2004. - № 6. – С. 991-1007. 80. Sawaya, S. Microsatellite tandem repeats are abundant in human promoters and are associated with regulatory elements / S. Sawaya, A. Bagshaw, E. Buschiazzo, P, Kumar, S, Chowdhury, M.A. Black, N. Gemmell // PLoS One. - 2013. - № 2: e54710. 81. Hamada, H. Potential Z-DNA forming sequences are highly dispersed in the human genome / H. Hamada, T. Kakunaga // Nature. – 1982. - № 5872. – С. 396-398. 82. Hentschel, C.C. Homocopolymer sequences in the spacer of a sea urchin histone gene repeat are sensitive to S1 nuclease / C.C. Hentschel // Nature. – 1982. - № 5851. – С. 714-716. 83. Nishioka, Y. Organization and complete sequence of identical embryonic and plasmacytoma kappa V-region genes / Y. Nishioka, P. Leder / J Biol Chem. – 1980. № 8. – С. 3691-3694. 84. Miesfeld, R. A member of a new repeated sequence family which is conserved throughout eucaryotic evolution is found between the human delta and beta globin genes / R. Miesfeld, M. Krystal, N. Arnheim // Nucleic Acids Res. – 1981. - № 22. – С. 5931-5947. 85. Hayes, T.E. Z-DNA in the rat somatostatin gene / T.E. Hayes, J.E. Dixon // J Biol Chem. – 1985. - № 13. – С. 8145-8156. 86. Saffer, J.D. Unusual class of Alu sequences containing a potential Z-DNA segment / J.D Saffer., M.I. Lerman // Mol Cell Biol. - 1983. - № 5. - С. 960-964. 87. Li, Y.C. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review / Y.C. Li, A.B. Korol, T. Fahima, A. Beiles, E. Nevo // Mol Ecol. – 2002. - № 12. –С. 2453-2465. 88. Canapa, A. A centromeric satellite DNA may be involved in heterochromatin compactness in gobiid fishes / A. Canapa, P.N. Cerioni, M. Barucca, E. Olmo, V. Caputo // Chromosome Res. – 2002. - № 4. – С. 297-304. 89. Murphy, T.D. Localization of centromere function in a Drosophila minichromosome / T.D. Murphy, G.H. Karpen // Cell. – 1995. - № 4. – С. 599-609. 120 90. Tanaka, Y. An assessment of prediction algorithms for nucleosome positioning / Y. Tanaka, K. Nakai // Genome Inform. – 2009. - № 1. – С. 169-178. 91. Wu, Q. Correlation between the flexibility and periodic dinucleotide patterns in yeast nucleosomal DNA sequences / Q. Wu, W. Zhou, J. Wang, H. Yan // J Theor Biol. – 2011. - № 1. – С. 92-98. 92. Widlund, H.R. Identification and characterization of genomic nucleosome- positioning sequences / H.R. Widlund, H. Cao, S. Simonsson, E. Magnusson, T. Simonsson, P.E. Nielsen, J.D. Kahn, D.M. Crothers, M. Kubista // J Mol Biol. - 1997 . - № 4. – С. 807-817. 93. Gaillard, C. High affinity binding of proteins HMG1 and HMG2 to semicatenated DNA loops / C. Gaillard, F. Strauss // BMC Mol Biol. - 2000. - № 1. 94. Bianch, M.E. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1 / M.E. Bianch, M. Beltrame, G. Paonessa // Science. - 1989. - № 4894. - С. 1056-1059. 95. Sheflin, L.G. The specific interactions of HMG 1 and 2 with negatively supercoiled DNA are modulated by their acidic C-terminal domains and involve cysteine residues in their HMG 1/2 boxes / L.G. Sheflin, N.W. Fucile, S.W. Spaulding // Biochemistry. – 1993. - № 13. – С. 3238-3248. 96. Zappavigna, V. HMG1 interacts with HOX proteins and enhances their DNA binding and transcriptional activation / V. Zappavigna, L. Falciola, M. HelmerCitterich, F. Mavilio, M.E. Bianchi // EMBO J. – 1996. - № 18. – С. 4981-4991. 97. Hamada, H. Enhanced gene expression by the poly(dT-dG).poly(dC-dA) sequence / H. Hamada, M. Seidman, B.H. Howard, C.M. Gorman // Mol Cell Biol. – 1984. - № 12. – С. 2622-2630. 98. Naylor, L.H. d(TG)n.d(CA)n sequences upstream of the rat prolactin gene form Z-DNA and inhibit gene transcription / L.H. Naylor, E.M. Clark // Nucleic Acids Res. - 1990. - № 6. – С. 1595-1601. 99. Chen, T.M. Microsatellite in the 3' untranslated region of human fibroblast growth factor 9 (FGF9) gene exhibits pleiotropic effect on modulating FGF9 protein expression / T.M. Chen, P.L. Kuo, C.H. Hsu, S.J. Tsai, M.J. Chen, C.W. Lin, H.S. Sun // Hum Mutat. – 2007. - № 1. – С. 98. 121 100. Akai, J. Transcriptional regulation of the human type I collagen alpha2 (COL1A2) gene by the combination of two dinucleotide repeats / J. Akai, A. Kimura, R.I. Hata // Gene. – 1999. - № 1. – С. 65-73. 101. Hammock, E.A. Functional microsatellite polymorphism associated with divergent social structure in vole species / E.A. Hammock, L.J. Young // Mol Biol Evol. – 2004. - № 6. – С. 1057-1063. 102. Yang, W. Motifs within the CA-repeat-rich region of Surfactant Protein B (SFTPB) intron 4 differentially affect mRNA splicing / W. Yang, L. Ni, P. Silveyra, G. Wang, G.T. Noutsios, A. Singh, S.L. Diangelo, O. Sanusi, M. Raval, J. Floros // J Mol Biochem. – 2013. - № 1. – С. 40-55. 103. Sharma, V.K. (TG/CA)n repeats in human gene families: abundance and selective patterns of distribution according to function and gene length / V.K. Sharma, S.K. Brahmachari, S. Ramachandran // BMC Genomics. – 2005. - № 6. – С. 83. 104. Murphy, K.E. RecA independent recombination of poly[d(GT)-d(CA)] in pBR322 / K.E. Murphy, J.R. Stringer // Nucleic Acids Res. - 1986. - № 18. – С. 7325-7340. 105. Treco, D. Recombination hot spot in the human beta-globin gene cluster: meiotic recombination of human DNA fragments in Saccharomyces cerevisiae / D. Treco, B. Thomas, N. Arnheim // Mol Cell Biol. – 1985. - № 8. – С. 2029-2038. 106. Treco, D. The evolutionarily conserved repetitive sequence d(TG.AC)n promotes reciprocal exchange and generates unusual recombinant tetrads during yeast meiosis / D. Treco, N. Arnheim // Mol Cell Biol. – 1986. - № 11. – С. 3934-3947. 107. Gendrel, C.G. (CA/GT)(n) microsatellites affect homologous recombination during yeast meiosis / C.G. Gendrel, A. Boulet, M. Dutreix // Genes Dev. – 2000. - № 10. – С. 1261-1268. 108. Dutreix, M. (GT)n repetitive tracts affect several stages of RecA-promoted recombination / M. Dutreix // J Mol Biol. – 1997. - № 1. – С. 105-113. 109. Biet, E., Sun J., Dutreix . Conserved sequence preference in DNA binding among recombination proteins: an effect of ssDNA secondary structure / E. Biet, J. Sun, M. Dutreix // Nucleic Acids Res. - 1999. - № 2. - С. 596-600. 122 110. Ray, B.K. Epigenetic regulation by Z-DNA silencer function controls cancer- associated ADAM-12 expression in breast cancer: cross-talk between MeCP2 and NF1 transcription factor family / B.K. Ray, S. Dhar, C. Henry, A. Rich, A. Ray // Cancer Res. – 2013. - № 2. – С. 736-744. 111. Arnott, S. Left-handed DNA helices / S. Arnott, R. Chandrasekaran, D.L. Birdsall, A.G. Leslie, R.L. Ratliff // Nature. – 1980. - № 5749. – С. 743-745. 112. Patel, D.J. Right-handed and left-handed DNA: studies of B- and Z-DNA by using proton nuclear Overhauser effect and P NMR / D.J. Patel, S.A. Kozlowski, A. Nordheim, A. Rich // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1982. - № 5. – С. 1413-1417. 113. Zimmer, C. Conformational transitions of poly(dA-dC).poly(dG-dT) induced by high salt or in ethanolic solution / C. Zimmer, S. Tymen, C. Marck, W. Guschlbauer // Nucleic Acids Res. - 1982. - № 3. – С. 1081-1091. 114. Taboury, J.A. Right-handed and left-handed helices of poly(dA-dC) X (dG-dT) / J.A. Taboury, E. Taillandier // Nucleic Acids Res. - 1985. - № 12. – С. 4469-4483. 115. Thomas, T.J. A left-handed (Z) conformation of poly(dA-dC).poly(dG-dT) induced by polyamines / T.J. Thomas, R.P. Messner // Nucleic Acids Res. - 1986. - № 16. – С. 6721-6733. 116. Vogt, N. A study of the B-Z transition of the AC-rich region of the repeat unit of a satellite DNA from Cebus by means of chemical probes / N. Vogt, N. Rousseau, M. Leng, B. Malfoy // J Biol Chem. - 1988. - № 24. – С. 11826-11832. 117. Johnston, B.H. Stochastic distribution of a short region of Z-DNA within a long repeated sequence in negatively supercoiled plasmids / B.H. Johnston, W. Ohara, A. Rich // J Biol Chem. - 1988. - № 10. – С. 4512-4515. 118. Kladde, M.P. Multiple transitions to non-B-DNA structures occur in the distal regulatory region of the rat prolactin gene / M.P. Kladde, J. D'Cunha, J. Gorski // J Mol Biol. - 1993. - № 2. – С. 344-367. 119. Galazka, G. Site-specific OsO4 modification of the B-Z junctions formed at the (dA-dC)32 region in supercoiled DNA / G. Galazka, E. Palecek, R.D. Wells, J. Klysik // J Biol Chem. - 1986. - № 15. – С. 7093-7098. 123 120. Singleton, C.K. S1 nuclease recognizes DNA conformational junctions between left-handed helical (dT-dG n. dC-dA)n and contiguous right-handed sequences / C.K. Singleton, M.W. Kilpatrick, R.D. Wells // J Biol Chem. - 1984. - № 3. – С. 1963-1967. 121. Chen, B. G-quadruplex structure: a target for anticancer therapy and a probe for detection of potassium / B. Chen, J. Liang, X. Tian, X. Liu // Biochemistry (Mosc). 2008. - № 8. – С. 853-861. 122. Henderson, E. Telomeric DNA oligonucleotides form novel intramolecular structures containing guanine-guanine base pairs / E. Henderson, C.C. Hardin, S.K. Walk, I.Jr. Tinoco, E.H. Blackburn // Cell. - 1987. - № 6. – С. 899-908. 123. Kaluzhny, D. A novel intramolecular G-quartet-containing fold of single- stranded d(GT)(8) and d(GT)(16) oligonucleotides / D. Kaluzhny, A. Shchyolkina, M. Livshits, Y. Lysov, O. Borisova // Biophys Chem. - 2009. - № 3. – С. 161-165. 124. Schlötterer, C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA / C. Schlötterer // Chromosoma. - 2000. - № 3. – С. 365-371. 125. Weber, J.L. Informativeness of human (dC-dA)n.(dG-dT)n polymorphisms / J.L. Weber // Genomics. - 1990. - № 4. – С. 524-530. 126. Huang, Q.Y. Mutation patterns at dinucleotide microsatellite loci in humans / Q.Y. Huang, F.H. Xu, H. Shen, H.Y. Deng, Y.J. Liu, Y.Z. Liu, J.L. Li, R.R. Recker, H.W. Deng // Am J Hum Genet. - 2002. - № 3. – С. 625-634. 127. Wierdl, M. Microsatellite instability in yeast: dependence on the length of the microsatellite / M. Wierdl, M. Dominska, T.D. Petes // Genetics. - 1997. - № 3. – С. 769-77. 128. Petes, T.D. Stabilization of microsatellite sequences by variant repeats in the yeast Saccharomyces cerevisiae / T.D. Petes, P.W. Greenwell, M. Dominska // Genetics. - 1997. - №2. – С. 491-498. 129. Hawk, J.D. Variation in efficiency of DNA mismatch repair at different sites in the yeast genome / J.D. Hawk, L. Stefanovic, J.C. Boyer, T.D. Petes, R.A. Farber // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2005. - № 24. – С. 8639-8643. 124 130. Bichara, M. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli / M. Bichara, I. Pinet, S. Schumacher, R.P. Fuchs // Genetics. - 2000. - № 2. - p. 533542. 131. Eckert, K.A. Mutational analyses of dinucleotide and tetranucleotide microsatellites in Escherichia coli: influence of sequence on expansion mutagenesis / K.A. Eckert, G. Yan // Nucleic Acids Res. - 2000. - № 14. – С. 2831-2838. 132. Kang, S. Expansion and deletion of CTG repeats from human disease genes are determined by the direction of replication in E. coli / S. Kang, A. Jaworski, K. Ohshima, R.D. Wells // Nat Genet. - 1995. - № 2. – С. 213-218. 133. Henderson, S.T. Instability of simple sequence DNA in Saccharomyces cerevisiae / S.T. Henderson, T.D. Petes // Mol Cell Biol. - 1992. - № 6. – С. 27492757. 134. Morel, P. The role of SOS and flap processing in microsatellite instability in Escherichia coli / P. Morel, C. Reverdy, B. Michel, S.D. Ehrlich, E. Cassuto // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1998. - № 17. – С. 10003-10008. 135. Levinson, G. High frequencies of short frameshifts in poly-CA/TG tandem repeats borne by bacteriophage M13 in Escherichia coli K-12 / G. Levinson, G.A. Gutman // Nucleic Acids Res. - 1987. - № 13. – С. 5323-5338. 136. Payseur, B.A. Microsatellite variation and recombination rate in the human genome / B.A. Payseur, M.W. Nachman // Genetics. - 2000. - № 3. – С. 1285-1298. 137. Levinson, G. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution / G. Levinson, G.A. Gutman // Mol Biol Evol. - 1987. - № 3. – С. 203-221. 138. Kunkel, T.A. DNA replication fidelity / T.A. Kunkel, K. Bebenek // Annu Rev Biochem. - 2000. - № 69. – С. 497-529. 139. Kroutil, L.C. Exonucleolytic proofreading during replication of repetitive DNA / L.C. Kroutil, K. Register, K. Bebenek, T.A. Kunkel // Biochemistry. - 1996. - № 3. – С. 1046-1053. 140. Shinde, D. Taq DNA polymerase slippage mutation rates measured by PCR and quasi-likelihood analysis: (CA/GT)n and (A/T)n microsatellites / D. Shinde, Y. Lai, F. Sun, N. Arnheim // Nucleic Acids Res. - 2003. - № 3. – С. 974-980. 125 141. Kunkel, T.A. Frameshift mutagenesis by eucaryotic DNA polymerases in vitro / T.A. Kunkel // J Biol Chem. - 1986. - № 29. – С. 13581-13587. 142. Abdulovic, A.L. The in vitro fidelity of yeast DNA polymerase δ and polymerase ε holoenzymes during dinucleotide microsatellite DNA synthesis / A.L. Abdulovic, S.E. Hile, T.A. Kunkel, K.A. Eckert // DNA Repair (Amst). – 2011. - № 5. – С. 497-505. 143. Eckert, K.A. Misalignment-mediated DNA polymerase beta mutations: comparison of microsatellite and frame-shift error rates using a forward mutation assay / K.A. Eckert, A. Mowery, S.E. Hile // Biochemistry. - 2002. - № 33. – С. 1049010498. 144. Tran, H.T. Hypermutability of homonucleotide runs in mismatch repair and DNA polymerase proofreading yeast mutants / H.T. Tran, J.D. Keen, M. Kricker, M.A. Resnick, D.A. Gordenin // Mol Cell Biol. - 1997. - № 5. – С. 2859-2865. 145. Bayliss, C.D. Simple sequence repeats (microsatellites): mutational mechanisms and contributions to bacterial pathogenesis. A meeting review / C.D. Bayliss, K.M. Dixon, E.R. Moxon // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2004. - № 1. – С. 11-19. 146. Alani, E. Interaction between mismatch repair and genetic recombination in Saccharomyces cerevisiae / E. Alani, R.A. Reenan, R.D. Kolodner // Genetics. - 1994. - № 1. – С. 19-39. 147. Haber, J.E. Rapid kinetics of mismatch repair of heteroduplex DNA that is formed during recombination in yeast / J.E. Haber, B.L. Ray, J.M. Kolb, C.I. White // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1993. - № 8. – С. 3363-3367. 148. Degtyareva, N.P. Caenorhabditis elegans DNA mismatch repair gene msh-2 is required for microsatellite stability and maintenance of genome integrity / N.P. Degtyareva, P. Greenwell, E.R. Hofmann, M.O. Hengartner, L. Zhang, J.G. Culotti, T.D. Petes // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2002. - № 4. – С. 2158-2163. 149. Freund, A.M. Z-DNA-forming sequences are spontaneous deletion hot spots / A.M. Freund, M. Bichara, R.P. Fuchs // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1989. - № 19. – С. 7465-7469. 126 150. Bresler, S.E. The process of general recombination in Escherichia coli K-12: structure of intermediate products / S.E. Bresler, I.Yu. Goryshin, V.A. Lanzov // Mol Gen Genet. - 1981. - № 1. – С. 139-143. 151. Long, J.E. RecA4142 causes SOS constitutive expression by loading onto reversed replication forks in Escherichia coli K-12 / J.E. Long, S.C. Massoni, S.J. Sandler // J Bacteriol. - 2010. - № 10. – С. 2575-2582. 152. Strand, M. Mutations in the MSH3 gene preferentially lead to deletions within tracts of simple repetitive DNA in Saccharomyces cerevisiae / M. Strand, M.C. Earley, G.F. Crouse, T.D. Petes // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1995. - № 22. – С. 1041810421. 153. Strand, M. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair / M. Strand, T.A. Prolla, R.M. Liskay, T.D. Petes // Nature. - 1993. - № 6443. – С. 274-276. 154. Johnson, R.E. Requirement of the yeast MSH3 and MSH6 genes for MSH2- dependent genomic stability / R.E. Johnson, G.K. Kovvali, L. Prakash, S. Prakash // J Biol Chem. – 1996. - № 13. - С. 7285-7288. 155. Kowalczykowski, S.C. Biochemistry Escherichia coli / S.C. Kowalczykowski, of homologous recombination D.A. Dixon, A.K. Eggleston, in S.D. Lauder, W.M. Rehrauer // Microbiol Rev. – 1994. - № 3. – С. 401-465. 156. Kowalczykowski, S.C. In vitro reconstitution of homologous recombination reactions / S.C. Kowalczykowski // Experientia. – 1994. - № 3. – С. 204-215. 157. Hays, S.L. Complex formation in yeast double-strand break repair: participation of Rad51, Rad52, Rad55, and Rad57 proteins / S.L. Hays, A.A. Firmenich, P. Berg // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1995. - № 15. – С. 6925-6929. 158. Holliday, R. The induction of mitotic recombination by mitomycin C in ustilago and saccharomyces / R. Holliday // Genetics. – 1964. - № 50. – С. 323-335. 159. Potter, H. On the mechanism of genetic recombination: electron microscopic observation of recombination intermediates / H. Potter, D. Dressler // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1976. - № 9. – С. 3000-3004. 127 160. Sena, E.P. In vivo homologous recombination intermediates of yeast mitochondrial DNA analyzed by electron microscopy / E.P. Sena, B. Revet, E. Moustacchi // Mol Gen Genet. – 1986. - № 3. – С. 421-428. 161. Bell, L. Occurrence of crossed strand-exchange forms in yeast DNA during meiosis / L. Bell , B. Byers // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1979. - № 7. – С. 34453449. 162. Benbow, R.M. Recombinant DNA formation in a cell-free system from Xenopus laevis eggs / R.M. Benbow, M.R. Krauss // Cell. – 1977. - № 1. – С. 191-204. 163. Karymov, M.A. Structure, dynamics, and branch migration of a DNA Holliday junction: a single-molecule fluorescence and modeling study / M.A. Karymov, M. Chinnaraj, A. Bogdanov, A.R. Srinivasan, G. Zheng, W.K. Olson, Y.L. Lyubchenko // Biophys J. – 2008. - № 9. – С. 4372-4383. 164. Plank, J.L. A novel, topologically constrained DNA molecule containing a double Holliday junction: design, synthesis, and initial biochemical characterization / J.L. Plank, T.S. Hsieh // J Biol Chem. – 2006. - № 25. – С. 17510-17516. 165. Neschastnova, A.A. Spontaneous DNA-DNA interaction of homologous duplexes and factors affecting the result of heteroduplex formation / A.A. Neschastnova, V.K. Gasanova, V.I. Popenko, A. Lambrinakos, G.A. Belitsky, R.G.Cotton, M.G. Yakubovskaya // Biol Chem. – 2006. - № 3. – С. 257-261. 166. Yakubovskaya, M.G. Interaction of linear homologous DNA duplexes via Holliday junction formation / M.G. Yakubovskaya, A.A. Neschastnova, K.E. Humphrey, J.J. Babon, V.I. Popenko, M.J. Smith, A. Lambrinakos, Z.V. Lipatova, M.A. Dobrovolskaia, R. Cappai, C.L. Masters, G.A. Belitsky, R.G. Cotton // Eur J Biochem. – 2001. - № 1. – С. 7-14. 167. Гасанова, В. К. Структурно-функциональные особенности микросателлитных повторов как фактор генетической нестабильности : дис. … канд. мед. наук : 14.00.14 / Гасанова Виктория Кабилановна. – М., 2009. – 139 с. 168. Гасанова, В. К. Встраивание комплементарных олигонуклеотидов в область (CA/TG)31-повторов линейных и кольцевых дуплексов ДНК / В.К. Гасанова, Н.В. 128 Ряднинская, К. Гайар, Ф. Стросс, Г.А. Белицкий, М.Г. Якубовская // Молекулярная биология. – 2010. - № 3. – С. 520-528. 169. Зенгер, В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. Пер. с англ. / В. Зенгер. – М.: Мир, 1987. – С. 375-379. 170. Tsuboi, M. The complex of ethidium bromide with genomic DNA: structure analysis by polarized Raman spectroscopy / M. Tsuboi, J.M. Benevides, G.J. Thomas, Jr. Thomas // Biophys J. – 2007. - № 3. – С. 928-934. 171. Oba, R. A new method of competitive reverse transcription polymerase chain reaction with SYBR Gold staining for quantitative analysis of mRNA / R. Oba, Y. Kudo, N. Sato, R. Noda, Y. Otsuka // Electrophoresis. – 2006. - № 14. – С. 2865-2868. 172. Suenaga, E. Prestaining method as a useful tool for the agarose gel electrophoretic detection of polymerase chain reaction products with a fluorescent dye SYBR gold nucleic acid gel stain / E. Suenaga, H. Nakamura // Anal Sci. – 2005. - № 6. – С. 619-623. 173. Tuma, R.S. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators / R.S. Tuma, M.P. Beaudet, X. Jin, L.J. Jones, C.Y. Cheung, S. Yue, V.L. Singer // Anal Biochem. – 1999. - № 2. – С. 278-288. 174. Huang, Q. Comparative analysis of the DNA staining efficiencies of different fluorescent dyes in preparative agarose gel electrophoresis / Q. Huang, W.L. Fu // Clin Chem Lab Med. – 2005. - № 8. – С. 841-842. 175. Suenaga, E. Prestaining method as a useful tool for the agarose gel electrophoretic detection of polymerase chain reaction products with a fluorescent dye SYBR gold nucleic acid gel stain / E. Suenaga, H. Nakamura // Anal Sci. – 2005. - № 6. – С. 619-623. 176. Benson, S,C. Heterodimeric DNA-binding dyes designed for energy transfer: stability and applications of the DNA complexes / S.C. Benson, R.A. Mathies, A.N. Glazer // Nucleic Acids Res. – 1993. - № 24. – С. 5720-5726. 177. Manning, G.S. Comments on selected aspects of nucleic acid electrostatics / G.S. Manning // Biopolymers. – 2003. - № 1. – С. 137-143. 129 178. Cosa, G. Photophysical properties of fluorescent DNA-dyes bound to single- and double-stranded DNA in aqueous buffered solution / G. Cosa, K.S. Focsaneanu, J.R. McLean, J.P. McNamee, J.C. Scaiano // Photochem Photobiol. – 2001. - № 6. – С. 585599. 179. Гасанова, В.К. Специфическая инвазия олигонуклеотида в концевой участок дуплекса ДНК / В.К. Гасанова, А.А. Несчастнова, Г.А. Белицкий, М.Г. Якубовская // Молекулярная биология. – 2006. - № 1. – С. 150-157. 180. Zipper, H.F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications / H. Zipper, H. Brunner, J. Bernhagen, F. Vitzthum // Nucleic Acids Res. – 2004. - № 12. - e103. 181. Kirsanov, K.I. SYBR Gold and SYBR Green II are not mutagenic in the Ames test / K.I. Kirsanov, E.A. Lesovaya, M.G. Yakubovskaya, G.A. Belitsky // Mutat Res. – 2010. - № 1-2. – С. 1-4. 182. Singer, V.L. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella / mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test) // V.L. Singer, T.E. Lawlor, S. Yue // Mutat Res. – 1999. № 1. – С. 37-47. 183. Rye, H.S. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bisintercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications / H.S. Rye, S. Yue, D.E. Wemmer, M.A. Quesada, R.P. Haugland, R.A. Mathies, A.N. Glazer // Nucleic Acids Res. – 1992. - № 11. – С. 2803-2812. 184. Lee, L.G. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis / L.G. Lee, C.H. Chen, L.A. Chiu // Cytometry. – 1986. - № 6. – С. 508-517. 185. Armitage, B.A. Cyanine Dye–DNA Interactions: Intercalation, Groove Binding, and Aggregation / B.A. Armitage // DNA Binders and Related Subjects Topics in Current Chemistry. – 2005. - № 253. - С. 55-76 186. Benet, A. The formation of triple-stranded DNA prevents spontaneous branchmigration / A. Benet, F. Azorín // J Mol Biol. - 1999. - № 4. – С. 851-857. 130 187. Bzymek, M. Instability of repetitive DNA sequences: the role of replication in multiple mechanisms / M. Bzymek, S.T. Lovett // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2001. № 15. - С. 8319-8325. 188. Panyutin, I.G. Formation of a single base mismatch impedes spontaneous DNA branch migration / I.G. Panyutin, P. Hsieh // J Mol Biol. - 1993. - № 2. – С. 413-424. 189. Никитина, Т.В. Микросателлитные последовательности ДНК человека: мутационный процесс и эволюция / Т.В. Никитина, С.А. Назаренко // Генетика. 2004. - №10. – С. 1301-1318. 190. Karlovsky, P. Protonated triplex DNA in E. coli cells as detected by chemical probing / P. Karlovsky, P. Pecinka, M. Vojtiskova, E. Makaturova, E. Palecek // FEBS Lett. – 1990. - № 1-2. – С. 39-42. 191. Mariappan, S.V. The high-resolution structure of the triplex formed by the GAA/TTC triplet repeat associated with Friedreich's ataxia / S.V. Mariappan, P. Catasti, L.A. Silks 3rd, E.M. Bradbury, G. Gupta // J Mol Biol. – 1999. - № 5. – С. 2035-2052. 192. Mariappan, S.V. Analysis of GAA/TTC DNA triplexes using nuclear magnetic resonance and electrospray ionization mass spectrometry / S.V. Mariappan, X. Cheng, R.B. van Breemen, L.A. Silks, G. Gupta // Anal Biochem. – 2004. - № 2. – С. 216-226. 193. Beltrán, R. Characterization of the zinc-induced structural transition to *H-DNA at a d(GA.CT)22 sequence / R. Beltrán, A. Martínez-Balbás, J. Bernués, R. Bowater, F. Azorín // J Mol Biol. – 1993. - № 3. – С. 966-978. 194. Chan, N.L. Coordinated processing of 3' slipped (CAG)n/(CTG)n hairpins by DNA polymerases β and δ preferentially induces repeat expansions / N.L. Chan, J. Guo, T. Zhang, G. Mao, C. Hou, F. Yuan, J. Huang, Y. Zhang, J. Wu, L. Gu, G.M. Li // J Biol Chem. – 2013. - № 21. – С. 15015-15022. 195. Mariappan, S.V. Fragile X DNA triplet repeats, (GCC)n, form hairpins with single hydrogen-bonded cytosine.cytosine mispairs at the CpG sites: isotope-edited nuclear magnetic resonance spectroscopy on (GCC)n with selective 15N4-labeled cytosine bases / S.V. Mariappan, L.A. Silks 3rd, E.M. Bradbury, G. Gupta // J Mol Biol. – 1998. - № 1. – С. 111-120. 131 196. Zemánek, M. Conformational properties of DNA containing (CCA)n and (TGG)n trinucleotide repeats / M. Zemánek, J. Kypr, M. Vorlícková // Int J Biol Macromol. – 2005. - № 1-2. – С. 23-32. 197. Jansen, A. Unstable microsatellite repeats facilitate rapid evolution of coding and regulatory sequences / A. Jansen, R. Gemayel, K.J. Verstrepen // Genome Dyn. – 2012. - № 7. - С. 108-125.
