исследование клеток гранулезы и кумулюса яичника человека с

УДК 612.62.014:577.336
Н.Н.Чуб, ст.н.с., канд. биол. наук.
И.В.Коваленко, ст.н.с., канд. биол. наук.
Т.С.Дюбко, ст.н.с., канд. биол. наук.
В.И.Пиняев, ст.н.с., канд. мед. наук.
И.В.Добрунова, аспирант.
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
ул. Переяславская, 23. г.Харьков, Украина 61015
E-mail:natatchoob-2@yandex.ru
ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК ГРАНУЛЕЗЫ И КУМУЛЮСА ЯИЧНИКА
ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
В последнее время все более широкое применение находят функциональные тесты
жизнеспособности, в основе которых лежит изменение флуоресценции некоторых
соединений, которое, как правило, пропорционально метаболической активности клеток.
Применение флуоресцентных зондов (ФЗ) для тестирования биообъектов позволяет
оценивать состояние клеточных мембран, липопротеидов и других органелл клетки [1], а
также функциональную активность криоконсервированных клеток [2]. В связи с этим в
данной работе представлялось целесообразным провести исследование жизнеспособности и
стероидогенной активности криоконсервированных клеток гранулезы и кумулюса (КГК),
полученных из преовуляторных фолликулов яичника человека.
КГК из преовуляторных фолликулов получали у 10 женщин, проходивших программу
экстракорпорального оплодотворения. Криоконсервирование КГК проводили по 3-х этапной
программе с двухкомпонентной средой (0.7М ДМСО + 0.3М ПЭО-400). В работе были
использованы ФЗ: нильский красный (НК) – селективный флуоресцентный краситель,
применяемый для окрашивания внутриклеточных липидных капель [3], Рropidium iodide (РI)
(Sigma,США). Для проведения анализа среду с КГК (1х1мм2) иммобилизировали на
предметном стекле, наносили небольшую каплю ФЗ и накрывали покровным стеклом.
Наблюдение осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа
LSМ-510 META (Сarl Zeiss,Германия)
Известно, что PI локализуется только в тех клетках, где повреждена цитоплазматическая
мембрана. Проникая в ядро, он связывается с ДНК и флуоресцирует красным цветом в
диапазоне 580 – 640 нм [1]. При изучении жизнеспособности КГК до и после
криоконсервирования с помощью PI было установлено, что после криоконсервирования
увеличивается количество КГК флуоресцирующих красным цветом, т.е. увеличивается число
поврежденных клеток, которое составляет около 29% по сравнению с контролем (Рис.1,б).
Известно, что в цитоплазме КГК в норме содержится значительное количество
липидных гранул – депо холестерина, который является субстратом для синтеза стероидных
гормонов.
а
б
Рис.1. Флуоресценция КГК: а) интактные образцы; б) после криоконсервирования, окраска
PI.
При возбуждении лазером с длиной волны 543 нм стероидогенные клетки, окрашенные НК,
флуоресцируют красным цветом с максимумом эмиссии зонда 628 нм (Рис.2,а). После
действия криопротекторной смеси и криоконсервирования КГК незначительно изменили
качество окрашивания НК и интенсивность флуоресценции по отношению к нативным
образцам (Рис.2,б).
а
б
Рис. 2. а – флуоресценция нативных КГК, б - после криоконсервирования, нильский красный,
х630
Нужно отметить, что интенсивность свечения в индивидуальных клетках может быть
различной, что, по-видимому, зависит от степени их гормональной активности
фолликулярных клеток. Результаты окрашивания ФЗ на выявление липидных включений
подтверждают данные, полученные ранее [4] о том, что КГК сохраняют способность к
продукции стероидных гормонов после криоконсервирования.
Таким образом, результаты данного исследования позволили установить, что
криоконсервирование снижает жизнеспособность КГК и уменьшает интенсивность свечения
НК в клетках. ФЗ могут быть использованы в качестве теста для характеристики
функционального состояния различных клеток и их органелл.
1.
Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и
липопротеидов // Г.Е.Добрецов. – М.: Наука, 1989. – 277 с.
2.
Гончарук Е.И., Онищенко Е.В., Тимон В.В., Петренко Т.Ф., Боровой И.А., Малюкин
Ю.В., Грищенко В.И. Применение карбоцианиновых флуоресцентных зондов для оценки
функционального состояния культивированных клеток после криоконсервации //
Биополимеры и клетка. −2008. −Т.24,№3. − С. 225-231.
3.
Greenspan P., Fowler S.D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe by nile red //
J.Lipid. Res. – 1985. – Vol.26,№7. – P.781-789.
4.
Чуб Н.Н., Демина Л.Г., Добрунова И.В. Эстрогенная активность ткани яичника
человека в культуре до и после низкотемпературного консервирования // В зб. тр.
Фундаментальна та клiнична ендокрiнологiя: проблеми, здобутки, перспективи. –
Харьков,2009. – С.133-134.