ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР имени. Н. Н. Блохина»
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР имени. Н. Н. Блохина» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК На правах рукописи СИЛАЕВА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА ТРАНСГЕННЫЕ Т-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ ИММУННОМ ОТВЕТЕ 14.01.12 — Онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., проф. Казанский Д.Б. МОСКВА 2013 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ............................................................................5 ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................7 Актуальность темы исследования и степень ее разработанности...............................................7 Цели и задачи исследования............................................................................................................8 Научная новизна исследования.......................................................................................................9 Теоретическая и практическая значимость работы.....................................................................10 Методы исследования.....................................................................................................................10 Положения, выносимые на защиту...............................................................................................11 Методы статистической обработки данных.................................................................................12 Апробация диссертации................................................................................................................12 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................13 1. Развитие первичного иммунного ответа. Формирование иммунологической памяти........13 2. Идентификация CD8+ Т-клеток памяти...................................................................................16 2.1. Функциональные особенности CD8+ Т-клеток памяти..................................................17 2.2. Поверхностный фенотип Т-клеток памяти CD8+............................................................18 2.3. Соответствие поверхностного фенотипа и функциональных характеристик CD8+ Тклеток..........................................................................................................................................20 3. Центральные и эффекторные Т-клетки памяти.......................................................................22 4. TCR клеток памяти.....................................................................................................................23 5. Возможные механизмы формирования пула Т-клеток памяти..............................................24 6. Поверхностный фенотип предшественников CD8+ Т-клеток памяти..................................26 7. Транскрипционные факторы, регулирующие дифференцировку CD8+ Т-клеток во время иммунного ответа...........................................................................................................................27 8. Факторы, влияющие на формирование пула CD8+ Т-клеток памяти....................................29 9. Гомеостаз Т-клеток памяти........................................................................................................30 10. Т-клетки памяти в условиях лимфопении..............................................................................32 11. Экспериментальные системы для изучения Т-клеток памяти в условиях лимфопении.. .35 12. Влияние экспрессии трансгенного TCR на тимусную селекцию........................................36 13. Противоопухолевый иммунный ответ. Иммунологический надзор и иммунная селекция опухолевых клеток..........................................................................................................................38 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................................42 1. Растворы и среды........................................................................................................................42 2. Животные....................................................................................................................................43 3. Антитела......................................................................................................................................43 3. Клеточные линии........................................................................................................................44 4. Создание трансгенных животных.............................................................................................44 5. Получение потомства и анализ наличия трансгена.................................................................48 6. Анализ наличия трансгена в геноме мышей методом ПЦР....................................................48 7. Получение линий трансгенных мышей на генетической основе линии B10.D2(R101)......49 8. Получение гибридов F1 (1D1bFM X C57BL/10).....................................................................49 9. Выделение мононуклеаров из периферической крови...........................................................50 10. Оценка количества лимфоцитов, экспрессирующих трансген, на периферии...................50 11. Иммунизация мышей...............................................................................................................50 12. Оценка уровня противоопухолевого иммунного ответа in vivo...........................................51 13. Облучение мышей....................................................................................................................51 14. Приготовление клеточных суспензий.....................................................................................51 15. Адоптивный перенос................................................................................................................52 15. Реакция MLR.............................................................................................................................52 3 16. Реакция бласттрансформации.................................................................................................53 17. Цитотоксический тест..............................................................................................................53 18. Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре.................................54 19. Статистическая обработка данных.........................................................................................56 РЕЗУЛЬТАТЫ.......................................................................................................................................57 ГЛАВА 1. Функциональная активность Т-клеток памяти в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением.............................................................................................................57 1.1. Аллогенный иммунный ответ клеток памяти и экспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L спленоцитами сублетально облученных мышей..........................................57 1.2. Аллогенный иммунный ответ клеток памяти и экспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L клетками селезенки сублетально облученных мышей после адоптивного переноса сингенных спленоцитов............................................................................................61 1.3. Иммунный ответ сублетально облученных мышей после адоптивного переноса сингенных спленоцитов на клетки аллогенной опухоли in vivo...........................................68 ГЛАВА 2. Создание первичных трансгенов по β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 и получение трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF на генетической основе линии B10.D2(R101)..........................................................................................................70 2.1. Получение первичных трансгенов....................................................................................70 2.2. Получение линий трансгенных мышей на генетической основе линии B10.D2(R101) ......................................................................................................................................................73 ГЛАВА 3. Развитие и поддержание гомеостаза CD3+ лимфоцитов мышей трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF...............................................................................................................78 3.1 Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF.78 3.1.1. Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM..........78 3.1.2.Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFF............82 3.2. Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-лимфоцитов мышей трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF..........................................................................................................85 3.2.1. Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-клеток мышей линии 1D1bFM..................................................................................................................................85 3.2.2 Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-клеток мышей линии 1D1bFF .................................................................................................................................................91 3.3. Поверхностный фенотип тимоцитов и периферических Т-клеток мышей гибридов F1 (1D1bFM X C57BL/10)..............................................................................................................96 3.3.1. Поверхностный фенотип тимоцитов гибридов F1 (1D1bFM X C57BL/10)...........96 3.3.2. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов гибридов F1 (1D1bFM X C57BL/10)..........................................................................................................97 ГЛАВА 4. Т-лимфоциты мышей трансгенной линии 1D1bFF в условиях лимфопении.......102 ГЛАВА 5. Первичный аллогенный ответ Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM in vitro.............................................................................................................................................107 ГЛАВА 6. Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей линии 1D1bFM на клетки аллогенной опухоли in vivo..............................................................................................................................112 6.1. Первичный аллогенный ответ спленоцитов мышей линии 1D1bFM на клетки тимомы EL-4 in vivo...............................................................................................................................112 6.2. Продолжительность жизни трансгенных мышей линии 1D1bFM, иммунизированных аллогенной опухолью..............................................................................................................119 6.3. Селекция опухолевых клеток в организме трансгенных животных............................121 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................................................................................124 Функциональные особенности Т-клеток памяти в условиях лимфопении............................125 Создание TCR-трансгенной модели............................................................................................128 Развитие трансгенных Т-клеток в тимусе..................................................................................129 4 Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF у интактных животных и в условиях лимфопении.....................................................131 Аллогенный иммунный ответ спленоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM in vitro. . .134 Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей линии 1D1bFM на клетки тимомы EL-4 in vivo...135 Иммунная селекция опухолевых клеток в организме трансгенных животных......................136 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................................139 ВЫВОДЫ...........................................................................................................................................141 БЛАГОДАРНОСТИ...........................................................................................................................142 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................143 5 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ APC — антигенпрезентирующая клетка (от англ. antigen presenting cell) CD — кластер дифференцировки (от англ. claster differentiation) CDK — циклин зависимая киназа (от англ. cyclin dependent kinase) CTL — цитотоксические Т лимфоциты (от англ. cytotoxic T lymphocyte) DN – двойные негативные (от англ. double negative) DP – двойные позитивные (от англ. double positive) GFP – зеленый флуоресцентный белок (от англ. green fluorescent protein) ICAMs — молекулы межклеточной адгезии (от англ. intercellular adhesion molecules) IFN — интерферон (от англ. interferon) IL — интерлейкин (от англ. Interleukin) KLRG1 — лектин-подобный рецептор NK-клеток G1 (от англ. killer cell lectin-like receptor G1) LFA-1 — антиген, связанный с функцией лимфоцита (от англ. lymphocyte function-associated antigen-1 ) MHC – главный комплекс гистосовместимости (от англ. major histocompatibility complex) MLR – реакция смешанной культуры лимфоцитов (от англ. mixed lymphocyte reaction) mTOR — мишень рапамицина у млекопитающих (от англ. mammalian target of rapamycin) PBS – фосфатный буфер (от англ. phosphat buffer saline) PI – йодид пропидия (от англ. propidium iodide) SP — однопозитивные (от англ. single positive) TCM — центральные Т-клетки памяти (от англ. central memory) TCR — Т-клеточный рецептор (от англ. T cell receptor) TLR — Толл-подобный рецептор (от англ. Toll-like receptor) 6 TML — Т-клетки, подобные клеткам памяти (от англ. memory-like) TNF — фактор некроза опухолей (от англ. tumor necrosis factor) БСА — бычий сывороточный альбумин ГСЖК — гонадотропин сыворотки жеребых кобыл ПЦР — полимеразная цепная реакция ХгЧ — хорионический гонадотропин человека 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Одной из важных функций системы приобретенного иммунитета является осуществление иммунологического надзора, то есть своевременное распознание и уничтожение иммуногенных вариантов злокачественно трансформированных клеток, возникающих в организме человека и животных. Основная роль в осуществлении Способность иммунологического осуществлять надзора принадлежит иммунологический надзор Т-лимфоцитам. прежде всего определяется широтой репертуара Т-лимфоцитов CD8+ и специфичностью Тклеточных рецепторов отдельных клонов. Кроме того, по всей видимости, способность к осуществлению иммунологического надзора может определяться функциональным одновременно состоянием Т-лимфоцита. присутствуют Т-лимфоциты, Известно, что находящиеся в в организме различных функциональных состояниях. Наивные Т-клетки CD8+ не активированы и могут циркулировать только через лимфоидные ткани. После активации наивные Тклетки CD8+ превращаются в эффекторные CTL, способные проникать в нелимфоидные ткани и убивать клетки-мишени, несущие специфический антиген. Большая часть эффекторных Т-лимфоцитов погибает во время фазы завершения иммунного ответа, но небольшая часть становится клетками памяти. Одной из основных особенностей клеток памяти является то, что, однажды образовавшись, они циркулируют в организме длительное время, ожидая встречи со специфическим антигеном. Вторичный иммунный ответ, определяемый клетками памяти, имеет ряд особенностей, отличающих его от первичного иммунного ответа: более быстрая активация и пролиферация клеток памяти, вследствие этого быстрая элиминация антигенов, относительная независимость клеток памяти от костимуляции. Именно на этих свойствах иммунологической памяти основаны все методы вакцинации, известные на сегодняшний момент. 8 Тем не менее, не существует четких и однозначных критериев, по которым ту или иную популяцию Т-лимфоцитов можно отнести к клеткам памяти. Существуют два подхода к проблеме идентификации Т-клеток памяти: первый подход направлен на исследование функциональных особенностей Тклеток памяти, второй подход основывается на определении их специфических поверхностных маркеров. Идентификация пула Т-клеток памяти на основании экспрессии ряда поверхностных маркеров широко используется, но не всегда она коррелирует с функциональными характеристиками Т-клеток. Например, в условиях лимфопении наивные Т-лимфоциты приобретают поверхностный фенотип клеток памяти, что не всегда однозначно коррелирует с их функциональными характеристиками. Более того, в условиях лимфопении может формироваться популяция CD8+ Т-клеток с поверхностным фенотипом, характерным для клеток памяти, подавляющая противоопухолевый иммунный ответ. Таким образом, механизмы приобретения Т-клеткой того или иного поверхностного фенотипа и его взаимосвязь с функциональными характеристиками Т-лимфоцита остаются неясными. Между тем, исследование этих вопросов важно для верификации и определения границ применимости диагностических тестов, выявляющих клетки памяти методом проточной цитофлуориметрии в клинике, а также для создания новых методов иммунотерапии опухолей. Цели и задачи исследования Целью данной работы является поверхностным фенотипом популяции исследование CD8+ взаимосвязи Т-лимфоцитов между и их функциональными характеристиками. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить взаимосвязь активационного поверхностного фенотипа CD8+ Т- 9 лимфоцитов и их функциональных особенностей в условиях лимфопении. 2. Получить первичных трансгенных животных, Т-лимфоциты которых экспрессируютцепь Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, на генетической основе гибридной линии (CBA X C57BL/6)F1 . 3. Получить чистые линии трансгенных животных на генетической основе линии B10.D2(R101) и гибридов F1 (B10.D2(R101) X C57BL/10). 4. Оценить влияние экспрессии трансгенной β-цепи TCR на процессы развития Т-клеток в тимусе. 5. Охарактеризовать поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных животных. 6. Оценить поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных животных в условиях лимфопении. 7. Оценить функциональные характеристики Т-лимфоцитов трансгенных животных in vitro и in vivo. Научная новизна исследования Взаимосвязь функциональными поверхностного активационного фенотипа с характеристиками популяций Т-лимфоцитов в условиях лимфопении впервые исследована с помощью экспериментальной системы, позволяющей селективно вызвать иммунный ответ аллоспецифичных Т-клеток памяти. Впервые установлено, что появление функциональных свойств антигенспецифических клеток памяти возможно лишь после первичного контакта с антигеном. Впервые получены и охарактеризованы линии трансгенных животных, Т-лимфоциты которых экспрессируют β-цепь Тклеточного рецептора гибридомы клеток памяти CD8+. Разработана новая модель иммунной селекции опухолевых клеток трансгенных по β-цепи Т-клеточного рецептора. с использованием животных, 10 Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическое значение работы состоит в обнаружении и детализации механизмов, управляющих формированием поверхностного активационного фенотипа Т-лимфоцитов. Показана особая важность разнообразия репертуара Тлимфоцитов для эффективного развития реакций трансплантационного и противоопухолевого иммунитета. Получена принципиально новая модель иммунодефицита, который возникает вследствие генетического воздействия, ограничивающего разнообразие рецепторов Т-лимфоцитов. Практическое значение работы определяется тем, что она выявила неоднозначность оценки поверхностного фенотипа CD8+ Т-лимфоцитов как критерия принадлежности Т-клетки к популяции клеток памяти. Разработанная модель иммунной селекции опухолевых клеток может быть использована для скрининга и оценки биологической активности новых противоопухолевых препаратов и стимуляторов противоопухолевого иммунитета. Методы исследования Для исследования взаимосвязи поверхностного фенотипа и функциональных особенностей Т-клеток были использованы сублетально облученные мыши линии B10.D2(R101), предварительно иммунизированные и интактные. В ряде экспериментов переносили сингенные спленоциты сублетально от облученным интактных или животным предварительно иммунизированных животных. Способность к первичному и вторичному аллогенному ответу поверхностного in vitro активационного определяли фенотипа методом MLR. периферических Для оценки Т-лимфоцитов тотальную популяцию клеток селезенки исследуемых животных окрашивали моноклональными флуоресцентно мечеными антителами и затем анализировали на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, USA) с 11 использованием программы BD FACSDiva 6.0. Первичные трансгенные животные получены методом микроинъекции раствора ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Наличие трансгена в геноме подтверждали методом ПЦР. Для оценки количества периферических Тлимфоцитов, экспрессирующих трансген, мононуклеары периферической крови трансгенных животных окрашивали моноклональными флуоресцентно мечеными антителами к вариабельному участку β-цепи Т-клеточного рецептора Vβ6 и анализировали на проточном цитофлуориметре. Для получения чистых линий трансгенных животных на генетической основе линии B10.D2(R101) было проведено не менее 7 возвратных скрещиваний с мышами линии B10.D2(R101). Для оценки поверхностного фенотипа периферических Т-лимфоцитов трансгенных животных тотальную популяцию селезенки или лимфатических узлов окрашивали моноклональными флуоресцентно мечеными антителами, а затем анализировали на проточном цитофлуориметре. Способность Т-лимфоцитов трансгенных животных к аллогенному иммунному ответу in vitro оценивали с помощью реакции MLR. Для оценки противоопухолевого иммунного ответа in vivo трансгенных животных внутрибрюшинно иммунизировали клетками тимомы EL-4 в количестве 20 млн., через 12 дней оценивали относительное количество эффекторных клеток CD8+ в селезенке. Для оценки продолжительности жизни трансгенных животных иммунизацию клетками аллогенной опухоли проводили также. Положения, выносимые на защиту 1. Для появления функциональных свойств антигенспецифических клеток памяти необходим первичный контакт с антигеном. 2. Получены и охарактеризованы две независимые линии мышей, трансгенных по β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 на 12 генетической основе линии B10.D2(R101). 3. Экспрессия трансгена β-цепи Т-клеточного рецептора меняет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме. 4. Т-лимфоциты CD8+ линии 1D1bFF, экспрессирующие трансгенную β-цепь Т-клеточного рецептора, приобретают поверхностный фенотип активированных клеток в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением. 5. Уровень аллогенного иммунного ответа in vitro мышей трансгенной линии 1D1bFM заметно снижен по сравнению с мышами дикого типа. 6. Иммунный ответ Т-лимфоцитов трансгенных животных in vivo недостаточен для эффективного отторжения аллогенной опухоли: мыши линии 1D1bFM на генетической основе B10.D2(R101) погибают через 4060 дней после введения клеток тимомы EL-4. 7. Иммунный ответ лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе B10.D2(R101) на клетки тимомы EL-4 вызывает потерю экспрессии молекулы Kb MHC I класса клетками тимомы. Методы статистической обработки данных Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-теста Стьюдента в программе Excel (Microsoft, USA). Различия признавались значимыми при p<0,05. Апробация диссертации Апробация диссертации состоялась 10 октября 2013 года на объединенной конференции лаборатории механизмов регуляции иммунитета, лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток и лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. 13 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Развитие первичного иммунного ответа. Формирование иммунологической памяти В процессе жизни организм сталкивается с множеством чужеродных агентов, вторжение и развитие которых приведет к нарушению постоянства внутренней среды организма. В качестве таких чужеродных агентов могут выступать не только бактерии, вирусы, различные паразитические организмы, но и собственные клетки, трансформированные в результате мутаций. Задача иммунной системы заключается в распознавании и уничтожении чужеродных агентов, попавших в организм извне или сформировавшихся внутри него. Существуют врожденная и приобретенная составляющие иммунной системы. Система врожденного иммунитета служит «первой линией обороны» от различных инфекционных агентов, и одной из ее важных функций является активация системы приобретенного, или адаптивного иммунитета. Связь между врожденным и приобретенным иммунитетом осуществляется с помощью профессиональных антигенпрезентирующих клеток (antigen presenting cells, APC). Их функция заключается в представлении антигенов клеткам адаптивного иммунитета. К профессиональным антигенпрезентирующим клеткам относятся макрофаги, В-клетки и дендритные клетки. Характерной особенностью профессиональных антигенпрезентирующих клеток является наличие молекул MHC II класса на их поверхности [Murphy, 2012]. Клеточную основу адаптивного иммунитета представляют Т- и Bлимфоциты. В процессе их развития происходит соматическая реаранжировка генов T- и B-клеточных рецепторов путем случайной рекомбинации нескольких типов генных сегментов, объединенных в кластеры на хромосомах. Этот процесс что обеспечивает почти бесконечное разнообразие структур T- и В-клеточных рецепторов [Murphy, 2012]. 14 Первичный иммунный ответ начинается с распознавания и захвата антигена дендритными клетками, находящимися в периферических тканях. На поверхности незрелых дендритных клеток экспрессируются Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR). Их функция заключается в распознавании различных консервативных вирусных и бактериальных антигенов, таких как липополисахарид (TLR4), флагеллин (TLR5), двуцепочечная РНК (TLR3) [Takeda, Kaisho, Akira, 2003]. Взаимодействие TLR с инфекционными агентами инициирует захват антигена и активацию дендритных клеток, в результате которой они теряют способность к эндоцитозу, начинает продуцировать цитокины и IFN-α/β, а на их поверхности появляются костимуляторные молекулы B7-1 и B7-2 [Larsen и др., 1994] [Rescigno, Granucci, RicciardiCastagnoli, 1999]. Активированные дендритные клетки мигрируют в лимфатический узел, где представляют антигены в виде пептидов, связанных с молекулами MHC, наивным Т-клеткам. Т-клетки, TCR которых специфичен к этому антигену, активируются [Murphy, 2012]. Однако для активации Т-клетке недостаточно взаимодействия TCR c комплексом MHC/пептид. Второй необходимый для полноценной активации сигнал Т-клетки получают от взаимодействия молекулы CD28 на их поверхности с костимуляторными молекулами B7-1 (CD80) и B7-2 (CD86) на поверхности дендритной клетки [Jenkins и др., 1991]. Этих сигналов достаточно для инициации первых циклов деления активированной Т-клетки. Однако для дальнейшей клональной экспансии, приобретения CD8+ Т-клетками эффекторных свойств и формирования пула клеток памяти необходим третий сигнал, который обеспечивается IL-12 и интерферонами I типа (IFN-α/β) [Mescher и др., 2006] [Curtsinger, Mescher, 2010]. В процессе взаимодействия Т-лимфоцита и профессиональной антигенпрезентирующей клетки важную роль играют молекулы клеточной адгезии. Взаимодействие LFA-1, расположенной на поверхности Т-лимфоцита, c ICAM-1 (ICAM-2) на поверхности APC индуцирует экспрессию CD40L на 15 поверхности Т-лимфоцита. В свою очередь, взаимодейтсвие CD40L-CD40 создает условия для активации антигенпрезентирующей клетки, что приводит к индукции экспрессии костимуляторных молекул B7-1 и B7-2. По всей видимости, в случае аллогенного иммунного ответа этот путь активации профессиональных APC является ведущим (Казанский et al., 1999). Т-клетки, активировавшиеся в первичном иммунном ответе, приобретают эффекторные свойства, т. е. способность убивать клетки-мишени с помощью литических гранул [Burkhardt и др., 1990], содержащих перфорин и гранзим [Griffiths, Mueller, 1991]. Кроме того, активированные Т-клетки способны индуцировать апоптоз в клетках мишенях посредством взаимодействия FasL, находящегося на поверхности Т-клетки с Fas, расположенным на мембране клетки-мишени [Murphy, 2012]. Пул эффекторных клеток, образованный во время Т-клеточной экспансии, гетерогенен. Он состоит из терминальных эффекторных Т-клеток и предшественников клеток памяти [Joshi и др., 2007]. После устранения антигена терминальные эффекторные Т-клетки погибают, а предшественники клеток памяти дифференцируются в долгоживущие Т-клетки памяти, которые могут чрезвычайно долго циркулировать в организме, ожидая встречи со специфическим антигеном. Если специфический антиген снова попадает в организм, Т-клетки памяти активируются и приобретают эффекторные свойства значительно быстрее наивных Т-клеток, что способствует ускоренному уничтожению антигена. Именно это свойство иммунологической памяти позволяет применять вакцинацию как превентивную меру против развития ряда инфекционных и онкологических заболеваний. Тем не менее, на сегодняшний день не существует четкого понимания пути дифференцировки наивных Т-клеток в клетки памяти. Возможные направления дифференцировки наивных Т-клеток схематично представлены на рисунке 1 (адаптировано из [Jameson, Masopust, 2009]. 16 Наивные Т-клетки Пролиферативный потенциал Долгоживущие Т-клетки памяти Эффекторные Т-клетки памяти Эффекторные Т-клетки Способность к продолжительной рециркуляции Рисунок 1. Возможные направления дифференцировки наивных Т-клеток [Jameson, Masopust, 2009]. 2. Идентификация CD8+ Т-клеток памяти При исследовании Т-клеток памяти прежде всего необходимо определить критерии, по которым Т-лимфоцит можно отнести к данной популяции. Для идентификации Т-клеток памяти обычно используют два подхода. Первый подход – наиболее удобный и широко распространенный — основывается на определении их специфических поверхностных маркеров. Другой подход нацелен на оценку функциональных особенностей, отличающих клетки памяти от наивных клеток в тестах in vivo и in vitro. Разные исследователи применяют различные критерии, позволяющие отнести ту или иную популяцию Т-клеток к клеткам памяти, однако наиболее точным критерием представляется оценка функциональных особенностей исследуемой популяции Т-лимфоцитов. 17 2.1. Функциональные особенности CD8+ Т-клеток памяти В первичном иммунном ответе обычно активируется большое количество индивидуальных клонов Т-лимфоцитов, однако почти все они погибают в ходе угасания иммунного ответа. В организме остается лишь малая часть антигенспецифических клонов Т-клеток, которые дают начало популяции Тклеток памяти. При формировании пула Т-клеток памяти происходят качественные и количественные изменения в отвечающей популяции Т-лимфоцитов. В исходной популяции наивных Т-клеток достаточно низка частота предшественников, способных ответить на тот или иной специфический антиген. В процессе иммунного ответа частота клонов Т-клеток, специфичных к антигену, многократно повышается [Williams, Bevan, 2007]. Кроме того, на пути дифференцировки наивного Т-лимфоцита в клетку памяти происходит ряд эпигенетических изменений, таких как метилирование ДНК, модификация гистонов и реорганизация структуры хроматина [Wilson и др., 2005]. Сейчас известно, что эти процессы регулируются рядом транскрипционных факторов [Intlekofer и др., 2005], о роли которых в дифференцировке Т-клеток памяти будет сказано ниже. Популяция Т-клеток памяти способна к значительно более быстрой экспансии во время вторичного иммунного ответа, чем наивные Т-клетки [VeigaFernandes и др., 2000]. В цитоплазме Т-клеток памяти присутствует преактивированная киназа CDK6, связывание которой с циклином D3 вызывает переход Т-клетки из фазы G0 в G1 и далее в S-фазу клеточного цикла. Кроме этого, Т-клетки памяти характеризуются низким уровнем экспрессии ингибитора CDK6 — p27Kip1 [Veiga-Fernandes, Rocha, 2004]. Наличие этого преактивированного сигнального пути обуславливает способность Т-клеток памяти к ускоренной пролиферации по сравнению с наивными Т-клетками. После активации Т-клетки памяти приобретают эффекторные свойства 18 значительно быстрее впервые активированных наивных Т-лимфоцитов. По своим функциональным характеристикам эти клетки значительно отличаются от эффекторной популяции, сформировавшейся в ходе первичного иммунного ответа. В популяции эффекторных CD8+ Т-клеток, сформированной в ходе первичного иммунного ответа, не удается обнаружить клетки, одновременно продуцирующие IL-2 и IFN-γ. Подобной мультифункциональностью обладают только клетки памяти [Veiga-Fernandes и др., 2000]. Тем не менее, несмотря на значительные различия в функциональных свойствах впервые отвечающих эффекторных Т-клеток и эффекторных Т-клеток памяти, их профили экспрессии различных генов очень близки [Willinger и др., 2005]. Т-клетки памяти, в отличие от наивных и эффекторных Т-клеток, долгое время могут существовать без контакта со специфическим антигеном [Rocha, Tanchot, 2004]. Кроме того, для популяции CD8+ Т-клеток характерна способность к самоподдержанию в присутствии IL-15 и IL-7 [Surh, Boyman, Purton, & Sprent, 2006]. CD8+ Т-клетки памяти более устойчивы к апоптозу, чем наивные Т-клетки [Grayson и др., 2002]. Это достигается за счет повышенной экспрессии противоапоптотических молекул, например bcl-2 [Grayson и др., 2000]. Кроме того, CD8+ Т-клетки памяти устойчивы к p53-зависимому апоптозу, чем вызвана их высокая радиорезистентность [Yao, и др., 2011]. 2.2. Поверхностный фенотип Т-клеток памяти CD8+ Пул CD8+ Т-клеток памяти можно разделить на две субпопуляции: эффекторные (effector memory, TEM) и долгоживущие, или центральные (central memory, TCM) Т-клетки памяти [Sallusto, Geginat, Lanzavecchia, 2004]. Различие профиля экспрессии поверхностных маркеров у центральных и эффекторных клеток памяти известно достаточно давно и связано, в частности, с различными сайтами локализации и миграции этих субпопуляций [Tussey, Speller, Gallimore, 19 Vessey, 2000]. Центральные клетки памяти (TCM, CD62L+CCR7+) экспрессируют молекулу CD62L (ранее LECAM-1 или L-селектин), которая ответственна за взаимодействие Т-клетки с клетками высокого эндотелия венул [Mobley, Rigby, Dailey, 1994] и хемокиновый рецептор CCR7. Наличие на поверхности Т-клетки молекулы CD62L позволяет ей мигрировать в лимфатические узлы. При активации CD8+ Т-лимфоцита происходит снижение экспрессии CCR7 и CD62L [Lipp и др., 1999]. Таким образом, эффекторные Т-клетки памяти CD8+ (TEM) обладают поверхностным фенотипом CD62L—CCR7— [Sallusto и др., 1999]. Молекула CD44 (ранее pgp-1), которую экспрессируют активированные CD8+ Тклетки [Kedl, Mewher, 1997], также является маркером Т-клеток памяти [Mobley, Dailey, 1992]. CD44 является рецептором для гиалуроновой кислоты, основного компонента межклеточного матрикса. [Yasuda и др., 2002]. Различие в экспрессии адгезионных молекул определяет разные пути миграции субпопуляций клеток памяти: TCM находятся преимущественно в лимфоузлах, а TEM локализуются в основном в периферических тканях; обе популяции обнаруживаются в крови и селезенке [Bachmann и др., 2005]. Для определения клеток памяти у мышей наиболее часто оценивают плотность поверхностных маркеров CD44 и CD62L [Laouar и др., 2008]. По профилю их экспрессии клетки памяти CD8+ подразделяют на центральные (CD44+CD62L+), локализованные преимущественно в периферических лимфоидных тканях, и эффекторные (CD44+CD62L—) – способные к миграции через нелимфоидные ткани. Центральные клетки памяти лишены цитолитической функции и приобретают ее лишь в ответ на рестимуляцию специфическим антигеном. В отличие от них эффекторные клетки памяти обладают цитолитической функцией постоянно. Известно, что для длительной рециркуляции CD8+ Т-клеток памяти в организме необходимо присутствие IL-15. Поэтому в качестве дополнительного маркера клеток памяти используется молекула CD122 (общая β-цепь рецепторов IL-2 и IL-15). [Walzer и др., 2002] [Castro и др., 2011]. Ряд исследователей относит 20 к Т-клеткам памяти популяцию CD8+CD44hi, а внутри этой популяции выделяет CD44hiCD122hi и CD44hiCD122lo Т-клетки памяти. Т-лимфоциты CD8+ CD44hiCD122lo при переносе в организм животных, дефицитных по молекулам MHC I класса, практически теряют способность к пролиферации и выживают значительно хуже, чем CD8+ CD44hiCD122hi Т-клетки. Это означает, что существование в организме популяции CD8 + CD44hiCD122lo Т-клеток памяти зависит от присутствия специфического антигена. Известно, что клетки с таким поверхностным фенотипом появляются в организме в результате хронических вирусных инфекций [Boyman, и др., 2006]. Второй необходимый для поддержания пула Т-клеток памяти цитокин — IL-7. Молекула CD127 (α-цепь рецептора к IL-7, IL-7Rα) также относится к поверхностным маркерам CD8+ Т-клеток памяти. Во время первичного иммунного ответа большая часть эффекторных CD8+ Т-клеток имеет поверхностный фенотип CD62L—CD127—; по мере устранения антигена формируется популяция центральных клеток памяти с фенотипом CD62L+CD127+ [Bachmann и др., 2005]. 2.3. Соответствие поверхностного фенотипа и функциональных характеристик CD8+ Т-клеток Далеко не всегда экспрессия описанных выше поверхностных маркеров соответствует реальному «антигенному опыту» клона Т-лимфоцитов. Так, в организме неиммунизированных животных с помощью MHC-тетрамеров были идентифицированы антигенспецифические CD8+ Т-клетки с поверхностным фенотипом CD44+. Эти клетки получили название «виртуальных клеток памяти» [Haluszczak и др., 2009]. Как было сказано выше, молекула CD122 (общая β-цепь рецепторов к IL-2 и IL-15) является маркером CD8+ Т-клеток памяти [Walzer и др., 2002] [Castro и др., 2011]. Однако известно, что в организме мышей, дефицитных по CD122, 21 наблюдается повышенное количество спонтанно активированных Т-клеток и различные аутоиммунные проявления [Suzuki и др., 1995]. Было показано, что адоптивный перенос CD44hiCD122hi CD8+ Т-клеток предотвращает развитие аутоиммунных патологий у этих животных [Rifa’i и др., 2004]. CD8+ Т-клетки с поверхностным фенотипом CD44hiCD122hi выполняют регуляторную функцию, продуцируя IL-10 и подавляя продукцию IFN-γ и пролиферацию активированных Т-клеток [Endharti и др., 2005]. В условиях лимфопении популяция CD8+CD122+ способна подавлять специфический противоопухолевый иммунный ответ [Wang и др., 2010]. Однозначно ответить на вопрос о функциональных характеристиках популяции с поверхностным фенотипом CD8+ CD44+CD122+ пока не представляется возможным [Suzuki и др., 2008]. Экспериментальная система, позволяющая оценить иммунный ответ Тклеток памяти без вовлечения наивных Т-клеток, была разработана в лаборатории механизмов регуляции иммунитета (НИИ Канцерогенеза, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН). Эта экспериментальная система основана на способности аллоспецифичных Т-клеток памяти пролиферировать in vitro в ответе на аллогенные спленоциты или опухолевые клетки, подвергнутые острому тепловому шоку (прогревание в течение 1 часа при 45 оС). Было показано, что первичный пролиферативный ответ на аллоантиген in vitro не развивается, если аллогенные клетки были подвергнуты острому тепловому шоку. Блок первичного аллогенного ответа не отменяется при добавлении в культуру экзогенного IL-2. Он также не связан с делецией или супрессией клонов Т-клеток, способных ответить на антиген. Однако долгоживущие клетки памяти CD8+, индуцированные в первичном аллогенном ответе in vivo, оказываются способны к специфическому пролиферативному ответу на аллогенные стимуляторы, подвегнутые острому тепловому шоку. По всей видимости, это связано с пониженной зависимостью антигенспецифических и Т-клеток памяти костимуляторных профессиональными APC [Казанский и др., 1999]. от сигналов, колокализации осуществляемой 22 3. Центральные и эффекторные Т-клетки памяти Как было отмечено выше, в пуле Т-клеток памяти присутствуют центральные и эффекторные клетки памяти. Эти субпопуляции отличаются по локализации, профилю экспрессии поверхностных маркеров и функциональным свойствам. Не существует однозначного ответа на вопрос, являются ли эти субпопуляции разными функциональными состояниями одной популяции Тклеток, либо формируются в иммунном ответе независимо. Ряд авторов полагает, что эти популяции являются разными стадиями дифференцировки Т-клеток памяти: непосредственно после устранения антигена в организме доминируют Т-клетки с фенотипом эффекторов, которые с течением времени приобретают поверхностный фенотип и функциональные свойства центральных Т-клеток памяти [Woodland, Kohlmeier, 2009]. Кроме того, в процессе миграции в нелимфоидные ткани центральные Т-клетки памяти способны приобретать поверхностный фенотип и функциональные свойства эффекторных Т-клеток [Marzo, Yagita, Lefrançois, 2007]. Существуют, однако, и данные, подтверждающие независимость субпопуляций центральных и эффекторных Т-клеток: было показано, что у человека репертуар Т-клеточных рецепторов эффекторных и центральных Тклеток памяти, специфичных к вирусу гриппа А полностью не перекрывается [Baron и др., 2003]. При исследовании с помощью микрочипов профиля экспрессии различных генов в популяциях человеческих CD8+ Т-клеток было показано, что в эффекторных Т-клетках памяти экспрессируются в основном гены, необходимые для осуществления эффекторной функции, в то же время популяция TCM характеризуется высоким уровнем фосфорилирования STAT5, необходимого для самоподдержания пула клеток памяти. [Willinger и др., 2005]. 23 4. TCR клеток памяти Т-клетки памяти, выжившие после завершения иммунного ответа, способны активироваться и приобретать эффекторные свойства при повторной встрече с антигеном значительно быстрее наивных Т-клеток. Иммунный ответ Тклеток памяти относительно независим от костимуляторных сигналов [London, Lodge, Abbas, 2000] и может осуществляться в ответ на более низкие дозы специфического антигена по сравнению с наивными Т-клетками [Rogers, Dubey, Swain, 2000]. Уникальные свойства Т-клеток памяти обусловлены, во-первых, рядом эпигенетических изменений, произошедших в клетке во время ее дифференцировки в долгоживущую Т-клетку памяти и, во-вторых, могут определяться структурой их Т-клеточных рецепторов. До сих пор не существует окончательного ответа на вопрос, в какой мере структура TCR определяет функциональные свойства клона Т-лимфоцитов. Известно, что для TCR клеток памяти характерна более высокая аффинность взаимодействия со специфическим лигандом, чем для наивных Т-клеток, специфичных к тому же антигену [Savage, Boniface, Davis, 1999]. Ранее считалось, что это обусловлено преимущественным размножением высокоаффинных клонов Т-лимфоцитов во время иммунного ответа [Busch, Pamer, 1999]. Однако недавно было показано, что изначально в иммунном ответе активируются клоны Т-клеток с широким диапазоном аффинностей завершения Т-клеточных рецепторов, и только во время экспансии и иммунного ответа преимущество получают Т-клетки с высокоаффинным TCR [Zehn, Lee, & Bevan, 2009]. Пространственная организация Т-клеточных рецепторов на поверхности клеток также различается у наивных Т-клеток и Т-клеток памяти. На поверхности наивных клеток Т-клеточные рецепторы существуют в виде мономеров и небольших олигомеров [Schamel и др., 2005], а на поверхности Тклеток памяти комплексы Т-клеточных рецепторов с CD3 организованы в крупные олигомеры. Более того, размер олигомерных кластеров TCR 24 положительно коррелирует с чувствительностью к специфическому антигену [Kumar и др., 2011]. 5. Возможные механизмы формирования пула Т-клеток памяти Известно, что при оптимальной антигенной стимуляции лишь 5-10% CD8+ Т-клеток дифференцируются в долгоживущие клетки памяти [Wherry и др., 2003]. Однако, как именно происходит дифференцировка наивных Т-лимфоцитов в клетки памяти и эффекторные клетки, остается неясным. Существуют две группы гипотез формирования пула Т-клеток памяти. Первая группа гипотез предполагает, что одна наивная клетка последовательно проходит все стадии дифференцировки от наивной Т-клетки до клетки памяти (линейная модель). происхождение Вторая Т-клеток группа памяти и гипотез постулирует эффекторных Т-клеток независимое из разных субпопуляций наивных Т-клеток либо их дивергенцию на ранних стадиях иммунного ответа [Kalia и др., 2006]. В последние годы появились доказательства того, что одна наивная Тклетка может давать начало и эффекторным Т-клеткам и клеткам памяти [Stemberger и др., 2007] [Gerlach и др., 2010], однако неясно, на какой стадии иммунного ответа это происходит. Это может происходить во время первого контакта Т-лимфоцита с антигенпрезентирующей клеткой, т. е. еще до первого деления активированной Т-клетки. Эту модель поддерживают исследования, показывающие, что судьба индивидуального клона Т-лимфоцитов программируется во время фазы активации [Masopust и др., 2004] [Bannard, Kraman, Fearon, 2009]. Другая модель предполагает, что первое деление активированной Т-клетки после контакта с APC может происходить асимметрично: часть лимфоцита, расположенная проксимально к APC образует впоследствии эффекторную клетку, а часть Тлимфоцита, дистально расположенная к APC, дает начало Т-клеткам памяти 25 [Chang и др., 2007]. Обе описанные выше модели постулируют ведущую роль антигенпрезентирующих клеток в формировании пула долгоживущих CD8+ Тклеток памяти. Существуют и другие модели, которые предполагают зависимость формирования пула долгоживущих Т-клеток памяти от ряда сигналов, которые действуют на пул активированных Т-клеток в процессе иммунного ответа. Наиболее интересной представляется модель «сокращающегося потенциала» [Kalia и др., 2006]. Было замечено, что непродолжительная антигенная стимуляция может приводить к ухудшению образования Т-клеток памяти [Masopust и др., 2004] [Williams, Bevan, 2004]. Это означает, что для формирования полноценной популяции долгоживущих клеток памяти их контакт со специфическим антигеном должен быть достаточно продолжительным. Модель сокращающегося потенциала постулирует уменьшение вероятности дифференцировки эффекторной Т-клетки в долгоживущую клетку памяти с каждым раундом клеточного деления во время иммунного ответа. Было показано, что в ряде экспериментальных систем долгоживущие клетки памяти формируются из популяции наивных Т-клеток, активированных на ранних этапах иммунного ответа [Quigley, Huang, Yang, 2007]. Еще одна модель формирования пула долгоживущих Т-клеток памяти предполагает зависимость судьбы индивидуального Т-лимфоцита от фазы иммуного ответа: предполагается, что из Т-клеток, которые активировались на ранних сроках иммунного ответа формируется популяция эффекторных Т-клеток, а из Т-лимфоцитов, активированных на поздних стадиях иммуного ответа — долгоживущие клетки памяти [D’Souza, Hedrick, 2006]. Таким образом, факторы, определяющие судьбу индивидуального Тлимфоцита в иммунном ответе, до конца не изучены, а результаты, полученные с применением различных модели формирования пула долгоживущих CD8+ Тклеток памяти, весьма противоречивы. 26 6. Поверхностный фенотип предшественников CD8+ Т-клеток памяти На ранних стадиях иммунного ответа в пуле эффекторных клеток CD8+ присутствует субпопуляция Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD127. Было показано, что эти клетки являются предшественниками CD8+ Т-клеток памяти [Lang и др., 2005] [Huster и др., 2004]. Позднее было предложено использовать лектин-подобный рецептор NK-клеток G1 (killer cell lectin-like receptor G1, KLRG1) в качестве маркера, определяющего дальнейшую судьбу эффекторных клеток [Joshi и др., 2007]. Несмотря на то, что на ранних стадиях иммунного ответа все эффекторные Т-клетки равномерно снижают экспрессию CD127, экспрессия KLRG1 в их популяции повышается неравномерно. Среди CD8+ Тклеток с фенотипом эффекторов можно выделить клетки с промежуточной (KLRG1int) и высокой (KLRG1hi) экспрессией KLRG1. Обе популяции обладают цитотоксической активностью, продуцируют одинаковые количества IFN и TNF. Однако KLRG1int CD8+ Т-клетки, в отличие от популяции KLRG1hi способны к продукции IL-2. Популяция KLRG1hi CD8+ Т-клеток способна к реэкспресиии CD127 и лучше выживает в ходе угасания иммунного ответа. После уничтожения антигена в первичном иммунном ответе эти клетки увеличивают экспрессию CD62L и из них формируется популяция истинных долгоживущих клеток памяти. CD8+ Т-клетки, для которых характерна высокая экспресия KLRG1 представляют из себя популяцию терминальных эффекторных клеток, которые погибнут после завершения иммунного ответа. Эти клетки уже не могут снизить экспрессию KLRG1 и превратиться в предшественники клеток памяти [Sarkar и др., 2008]. Еще одним признаком, по которому эффекторную Т-клетку можно отнести к предшественникам Т-клеток памяти, может служить экспрессия гомодимера CD8αα. Функция молекулы CD8αα существенно отличается от гетеродимера CD8αβ [Bosselut и др., 2000]. Лигандом для CD8αα является тимусный лейкоцитарный антиген, неклассическая молекула МНС I класса. Было показано, 27 что во время первичного иммунного ответа на вирус LCMV, часть эффекторных Т-лимфоцитов начинает экспрессировать гомодимер гетеродимером CD8αβ. Экспрессия гомодимера CD8αα наряду с CD8αα коррелирует с поверхностным фенотипом CD127+, что характерно для предшественников Тклеток памяти. По завершении иммунного ответа экспрессия CD8αα снижается, однако клетки продолжают экспрессировать IL-7Rα. Более того, в организме животных, у которых присутствует делеция в энхансере локуса cd8, необходимого для экспрессии гомодимера CD8αα, образование клеток памяти затруднено [Madakamutil и др., 2004]. 7. Транскрипционные факторы, регулирующие дифференцировку CD8+ Тклеток во время иммунного ответа Выбор линии дифференцировки CD8+ Т-клетки между короткоживущими клетками-эффекторами и долгоживущими клетками памяти определяется сигнальными каскадами, в которые входят серин-треониновая протеинкиназа mTOR [Rao, Li, Odunsi, Shrikant, 2010] и транскрипционные факторы Foxo 1 [Rao и др., 2012], Т-bet и Эомезодермин (Eomes) [Intlekofer и др., 2005] [Hamilton, Jameson, 2007]. Серин-треониновая протеинкиназа mTOR (mammalian target of rapamycin), относящаяся к семейству PIKK киназ (phosphatidylinositol kinase-related kinase), является основным регулятором процессов дифференцировки CD8+ Т-клеток памяти [Araki и др., 2009]. Эта киназа входит в состав двух больших мультибелковых комплексов mTORC1 и mTORC2. Комплекс mTORC1 чувствителен к рапамицину, а комплекс mTORC2 — нет [Wullschleger, Loewith, Hall, 2006]. Комплексы mTORC1 и mTORC2 регулируют процессы дифференцировки во многих тканях. В CD8+ Т-клетках сигналы, проходящие через TCR, CD28 и различные цитокины (IL-12, IL-7, and IL-2) модулируют активность mTORC1 [Li и др., 2011] [Rao и др., 2010] [Sinclair и др., 2008]. 28 Транскрипционный фактор Foxo 1 играет важную роль в регуляции экспрессии транскрипционных факторов T-bet и Eomes, которые, в свою очередь, определяют выбор линии CD8+ дифференцировки Т-лимфоцита между короткоживущими эффекторами к клетками памяти. Экспрессия T-bet обычно ассоциирована с линий дифференцировки терминальных эффекторов, а экспрессия Eomes — с предшественниками клеток памяти [Joshi и др., 2011]. Foxo 1 подавляет экспрессию T-bet и увеличивает экспрессию генов Eomes, Klf-2, CD62L, IL-7Ra, Bcl-2 (клетки приобретают фенотип предшественников клеток памяти). Для Klf-2 и IL-7Ra Foxo 1 является прямым транскрипционным фактором [Rao и др., 2012]. . Гены семейства Foxo ( Foxo 1, Foxo 3, Foxo 4, Foxo 6), также участвуют в регуляции клеточного цикла, выживания и дифференцировки [Burgering, 2008]. Комплекс mTORC1 способен подавлять транскрипционную активность Foxo 1 [Rao и др., 2012], в то же время Foxo 1 также может ингибировать mTORC1 [Chen и др., 2010]. Ингибирование mTORC1 рапамицином увеличивает активность Foxo 1 и, как следствие, усиливает миграцию CD8+ Т-клеток во вторичные лимфоидные органы, улучшает их выживание и дифференцировку в клетки памяти [Rao и др., 2012]. Делеция гена Foxo 1 в Т-клетках мышей приводит к спонтанной активации Т-клеток и дифференцировке в эффекторные клетки [Ouyang и др., 2009]. Транскрипционные факторы T-bet и Eomes играют ключевую роль в осуществлении CD8+ Т-клетками эффекторной функции и формировании долгоживущих клеток памяти. У мышей, нокаутных по гену Eomes, затруднено формирование клеток памяти [Banerjee и др., 2010] а повышенная экспрессия Tbet заставляет Т-лимфоциты дифференцироваться в терминальные эффекторы [Joshi и др., 2007]. Уровень экспрессии T-bet зависит от функционального состояния клетки: T-bet не детектируется в популяции наивных (CCR7+CD45RO — ) CD8+ Т-клеток человека, на низком уровне экспрессируется в популяции долгоживущих покоящихся клеток памяти (CCR7+CD45RO+) и активно 29 экспрессируется в популяциях эффекторных клеток (CCR7 —CD45RO+) и (CCR7— CD45RO—) [McLane и др., 2013]. В выборе линии дифференцировки транскрипционные факторы, регулирующие также принимают экспрессию участие поверхностных активационных маркеров Т-клеток. Известно, что Т-клетки мышей, нокаутных по генам транскрипционных факторов Elf4 и Klf4, увеличивают экспрессию CD44 и снижают экспрессию CD62L, что, соответственно изменяет места локализации Тлимфоцитов [Yamada и др., 2009]. 8. Факторы, влияющие на формирование пула CD8+ Т-клеток памяти Для частичной активации и инициации первых циклов деления наивной CD8+ Т-клетке достаточно двух сигналов: высокоаффинного взаимодействия ее TCR c комплексом MHC/пептид и костимулирующего сигнала, полученного через CD28. Однако для клональной экспансии, приобретения CD8+ Т-клеткой эффекторных свойств и формирования пула клеток памяти необходим третий сигнал, который обеспечивается IL-12 и интерферонами I типа (IFN-α/β) [Mescher и др., 2006] [Curtsinger, Mescher, 2010]. Присутствие провоспалительного цитокина IL-12 увеличивает экспрессию транскрипционного фактора Т-bet и направляет клетку по пути дифференцировки в короткоживущие клеткиэффекторы [Takemoto и др., 2006] [Joshi и др., 2007]. Это связано с тем, что присутствие IL-12 приводит к долговременному фосфорилированию Foxo 1, что в свою очередь, приводит к потере его транскрипционной активности и усилению экспрессии T-bet [Rao и др., 2012]. В свою очередь, цитокины TNF-α, IL-2 и IFN-γ ограничивают процессы воспаления на ранних этапах иммунного ответа и этим способствуют дифференцировке CD8+ Т-клеток в предшественники долгоживущих клеток памяти [Badovinac, Porter, Harty, 2004]. Важную роль в дифференцировке Т-клеток памяти играют IL-2 и IL-15. Рецепторы этих цитокинов имеют общую β-цепь (CD122), однако их присутствие 30 в микроокружении формированию Т-лимфоцитов различных в процессе субпопуляций: активации присутствие IL-2 приводит к приводит к преимущественному формированию эффекторных Т-клеток с фенотипом CD62Llow, а в присутствии IL-15 формируется популяция CD62Lhi Т- лимфоцитов [Cornish, Sinclair, Cantrell, 2006]. По всей видимости, направление дифференцировки Т-клеток определяется силой сигнала, проведенного через молекулу CD122: слабый сигнал приводит к образованию центральных клеток памяти, а сильный — к образованию эффекторных клеток [Castro и др., 2011]. Однако несмотря на то, что IL-15 способствует дифференцировке Т-клеток в долгоживущие клетки памяти, его присутствие необходимо и для выживания короткоживущих эффекторных клеток [Joshi и др., 2007]. Различные костимуляторные сигналы также оказывают влияние на направление дифференцировки Т-клеток во время иммунного ответа. Известно, что длительная стимуляция Т-клеток через CD70 приводит к образованию эффекторных Т-клеток и препятствует формированию пула долгоживущих клеток памяти [van Gisbergen и др., 2009]. В отсутствие костимуляторного сигнала через молекулу OX40 наблюдается ухудшение формирования CD8+ Тклеток памяти и отсутствие вторичного иммунного ответа [Mousavi и др., 2008]. 9. Гомеостаз Т-клеток памяти Пул периферических Т-лимфоцитов включает в себя две большие группы Т-клеток: во-первых, это наивные Т-клетки, а, во-вторых, Т-клетки памяти. Соотношение между этими популяциями может меняться в зависимости от этапа онтогенеза а также от ряда внешних факторов. Так, например, почти половину Тклеток в периферических лимфоидных органах новорожденных мышей составляют Т-клетки с поверхностным фенотипом клеток памяти [Ichii и др., 2002], а во взрослом состоянии в периферических лимфоидных органах преобладают наивные Т-клетки. Несмотря на то, что для регуляции размера 31 пулов наивных Т-клеток и клеток памяти используются похожие механизмы, реализация этих механизмов значительно отличается у наивных Т-клеток и клеток памяти. Так, большая часть наивных Т-клеток находится в фазе G0, и механизм клеточного деления активируется только при встрече с антигеном, в то же время Т-клетки памяти способны к медленной гомеостатической пролиферации (клетка делится примерно раз в две недели) [Tough и др., 2000]. При этом размер пула Т-клеток памяти во взрослом состоянии не изменяется даже после многократных иммунизаций, что свидетельствует о том, что вновь образованные Т-клетки памяти замещают существующие ранее [Selin, Welsh, 2004]. Ранее полагали, что поддержание пула Т-клеток памяти, также как и наивных Т-клеток, обеспечивается тоническими сигналами, которые клетка получает от собственных молекул MHC [Zinkernagel и др., 1996]. Однако затем, в исследованиях на мышах, дефицитных по молекулам MHC I класса, было доказано, что для поддержания пула Т-клеток памяти взаимодействие с собственными молекулами MHC не требуется [Murali-Krishna, 1999]. Более того, для выживания CD8+ Т-клеток памяти не требуется экспрессия Т-клеточного рецептора [Leignadier и др., 2008]. К основным цитокинам, принимающим участие в поддержании гомеостаза Т-клеток памяти, относятся IL-15 и IL-7. Именно эти цитокины обеспечивают выживание и медленную гомеостатическую пролиферацию клеток памяти CD8+ на периферии [Schluns, Lefrançois, 2003] [Surh и др., 2006]. Было показано, что в организме мышей, дефицитных по IL-15, не наблюдается пролиферации CD8+ Тклеток памяти [Judge и др., 2002]. Пул наивных Т-клеток у таких мышей не страдает [Kennedy и др., 2000]. Повышенная экспрессия IL-15, наоборот, вызывает усиленное формирование CD8+ Т-клеток с фенотипом клеток памяти [Fehniger и др., 2001]. In vivo IL-15 присутствует не в растворимой форме, а представлен на мембране клеток в комплексе с IL-15Rα [Dubois и др., 2002]. При этом и IL-15, и 32 IL-15Rα должны быть синтезированы одной клеткой, а их ассоциация происходит еще в цитоплазме до выхода на клеточную мембрану [Burkett и др., 2004]. Это объясняет тот факт, что CD8+ Т-клетки с фенотипом клеток памяти, адоптивно перенесенные реципиентам, дефицитным по IL-15Rα, оказываются неспособными к самоподдержанию [Lodolce и др., 1998]. В норме IL-15 и IL15Rα синтезируют антигенпрезентирующие клетки, обеспечивая поддержание пула Т-клеток памяти (Surh et al., 2006) [Stonier и др., 2008]. Другой цитокин, также оказывающий значительное влияние на поддержание пула CD8+ Т-клеток памяти — IL-7. Т-клетки памяти способны отвечать на него in vivo [Surh и др., 2006]. Более того, показано, что у нокаутных по IL-15 мышей можно восстановить пул CD8+ Т-клеток памяти, если скрестить их с трансгенными животными с повышенной экспрессией IL-7 [Tan и др., 2002]. Таким образом, IL-7 может отчасти заменять IL-15. Однако, если суммировать современные представления о влиянии IL-15 и IL-7 на популяцию CD8+ Т-клеток памяти, то функция IL-7 заключается в поддержании жизнеспособности CD8+ Тклеток памяти, а функция IL-15 — в обеспечении их гомеостатической пролиферации [Surh и др., 2006]. Как стало известно недавно, внутриклеточный механизм действия IL-15 и IL-7 заключается в активации Spi2A — ингибитора лизосомального пути гибели Т-клетки [Byrne и др., 2012]. Этот белок ингибирует катепсин B, предотвращая, таким образом, гибель Т-лимфоцита. В организме мышей, дефицитных по Spi2A, затруднено образование CD8+ Т-клеток памяти и их гомеостатическая пролиферация. 10. Т-клетки памяти в условиях лимфопении Лимфопения – состояние организма, характеризующееся значительным снижением количества лимфоцитов в крови. Лимфопения может возникать как в результате различных патологических процессов, так и в результате 33 терапевтических воздействий, например, химио- и радиотерапии. На некоторых этапах онтогенеза лимфопения носит физиологический характер, например у новорожденных мышей [Le Campion и др., 2002]. В условиях лимфопении восстановление периферического пула Тлимфоцитов происходит за счет гомеостатической пролиферации Т-клеток, сохранившихся на периферии. В результате этого процесса формируется особая популяция «memory-like» CD8+ Т-клеток (TML), обладающих поверхностным фенотипом клеток памяти CD44+CD62L+ [Cho и др., 2000] [Goldrath, Bogatzki, Bevan, 2000][Murali-Krishna, Ahmed, 2000]. Процесс формирования пула Т- клеток с поверхностным фенотипом долгоживущих клеток памяти в условиях лимфопении не требует присутствия IL-2 и костимуляторных сигналов через CD28. Кроме того, дифференцировка наивных Т-клеток в клетки памяти происходит без образования популяции эффекторных клеток [Cho и др., 2000]. Однако для гомеостатической пролиферации в условиях лимфопении необходим контакт Т-клеточного рецептора с собственными комплексами MHC/пептид [Le Campion и др., 2002], причем уровень гомеостатической пролиферации определяется аффинностью взаимодействия TCR и комплекса MHC/пептид [Ge и др., 2001]. Аффинность взаимодействия Т-клеточного рецептора с комплексами MHC/пептид определяет уровень экспансии того или иного клона CD8+ Т-клеток в процессе гомеостатической пролиферации [Hao, Legrand, Freitas, 2006]. Приобретение активационного фенотипа клетками в процессе гомеостатической пролиферации стабильно и сохраняется в течение длительного времени [Ge и др., 2002]. CD8+ Т-клетки с поверхностным фенотипом клеток памяти не могут снова приобрести фенотип наивных Т-клеток. Восстановление пула наивных Тклеток в условиях лимфопении происходит только за счет тимопоэза [Tanchot и др., 2002]. Исследование функциональных характеристик этой популяции Т-клеток имеет прикладное и фундаментальное значение, поскольку определяет способность организма к осуществлению иммунного ответа в условиях 34 лимфопении. Однако, несмотря на большое количество исследований в этой области, сведения о функциональных особенностях популяции TML остаются противоречивыми. В ряде работ показано, что при адоптивном переносе наивных CD8+ Т-клеток формируется популяция Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти, которая в полной мере обладает всеми функциональными свойствами истинных клеток памяти. Эти клетки способны отвечать на низкие дозы специфического антигена и быстрее наивных Т-клеток начинают секретировать IFN-γ после антигенной стимуляции [Cho и др., 2000]. Было также показано, что популяция CD8+ Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти, сформировавшаяся в результате гомеостатической пролиферации в условиях лимфопении, способна эффективно отторгать аллогенный трансплантат [Moxham и др., 2008)]. Функциональные свойства этой популяции зависят от CD4+ Т-клеток: способность популяции TML контролировать бактериальную инфекцию в отсутствии CD4+ Т-хелперов значительно снижена [Hamilton и др., 2006]. Это связано с тем, что CD4+ Т-клетки способны активировать антигенпрезентирующие клетки посредством взаимодействия CD40L-CD40. Активированные дендритные клетки, в свою очередь, становятся способны активировать клетки CD8+ [Hamilton, Jameson, 2008]. Важно отметить, что способность CD8+ Т-клеток к гомеостатической пролиферации в условиях лимфопении не зависит от клеток CD4+ [Hamilton и др., 2006]. Не во всех экспериментальных системах популяция Т-клеток CD8+, образовавшаяся в результате гомеостатической пролифераци в условиях лимфопении, способна к эффективному иммунному ответу. В условиях лимфопении может формироваться популяция CD8+ Т-клеток с поверхностным фенотипом CD44+CD122+, подавляющая противоопухолевый иммунный ответ [Wang и др., 2010]. В условиях конкуренции с истинными Т-клетками памяти формирование эффекторной популяции из TML затруднено, быстрее происходит контракция образовавшегося пула эффекторных Т-клеток. Кроме того, истинные Т-клетки памяти и Т-клетки памяти, образовавшиеся в условиях лимфопении, во 35 время инфекции локализуются в разных компартментах селезенки и обладают различными профилями экспрессии цитокинов [Cheung, Yang, Goldrath, 2009]. 11. Экспериментальные системы для изучения Т-клеток памяти в условиях лимфопении Противоречия в данных о функциональной активности популяции Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти, появляющейся в условиях лимфопении, могут быть следствием использования исследователями разных экспериментальных систем. Разными исследователями используются различные модельные системы для создания условий лимфопении. Лимфопения может быть вызвана конститутивным отсутствием Т-клеток в организме. Для этого чаще всего используются животные, дефектные по генам рекомибиназ Rag1 и Rag2, или CD3ε-нокауты [Cho и др., 2000] [Tanchot и др., 2002]. В других исследованиях лимфопения создается с помощью сублетального облучения животных [Ge и др., 2002] [Hamilton и др., 2006] [Hamilton, Jameson, 2008]. Наиболее принципиальное различие между этими двумя системами заключается в отсутствии тимопоэза в организме мышей с конститутивно отсутствующими Т-клетками, что приводит к невозможности восстановления периферического пула Т-лимфоцитов за счет выхода из тимуса собственных Т-клеток реципиента. Показано, что в организме сублетально облученных реципиентов адоптивно перенесенные Т-клетки с поверхностным фенотипом клеток памяти достаточно быстро замещаются вышедшими из тимуса Т-лимфоцитами реципиента [Tanchot и др., 2002]. Для адоптивного переноса обычно используют Т-клетки с трансгенным Тклеточным рецептором, лиганд для которого известен. Наиболее часто используют OT-1 CD8+ Т-клетки, специфичные к пептиду 257-264 овальбумина [Hamilton, Jameson, 2008] [Goldrath, Bevan, 1999] [Cheung, Yang, Goldrath, 2009]. Также для адоптивного переноса используют 2С трансгенные CD8+ Т-клетки [Ge 36 и др., 2002] и трансгенные Т-клетки, специфичные к HY антигену [Maile и др., 2006]. В литературе встречаются единичные работы, в которых пул Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти создается из Т-лимфоцитов, несущих широкий спектр Т-клеточных рецепторов. В частности, было показано, что при одновременном адоптивном переносе трансгенных Т-клеток, специфичных к клеткам меланомы B16F10, и спленоцитов дикого типа из последних формируется популяция TML с поверхностным фенотипом CD8+CD122+. Эта популяция обладает выраженными регуляторными свойствами и значительно ухудшает противоопухолевый ответ трансгенных Т-лимфоцитов [Wang и др., 2010]. 12. Влияние экспрессии трансгенного TCR на тимусную селекцию Развитие α/β и γ/δ Т-клеток в тимусе начинается со стадии двойных негативных тимоцитов (DN, CD4—CD8—). На этой стадии происходит реаранжировка трех из четырех локусов TCR: Tcrb, Tcrg и Tcrd и происходит выбор между линией дифференцировки α/β и γ/δ Т-клеток [Carpenter, Bosselut, 2010] [Kreslavsky, Gleimer, 2010]. В случае успешной реаранжировки β-цепь TCR в комплексе с pTα формирует пре-TCR. Пре-TCR не детектируется на поверхности клетки и не способен к распознаванию каких бы то ни было лигандов [Irving, Alt, Killeen, 1998]. Проведение сигнала через пре-TCR обеспечивается с помощью олигомеризации [Yamasaki и др., 2006]. Кроме того, для успешного прохождения клеткой стадии β-селекции необходим сигнал от CXCR4 и Notch1 [Maillard и др., 2006]. Появления пре-TCR на поверхности тимоцита запускает процессы аллельного исключения для β-цепи TCR, кроме того подавляет реаранжировку локуса Tcrg [Aifantis и др., 1997]. Тимоциты, успешно реаранжировавшие локусы Tcrg и Tcrd, начинают экспрессировать TCR γ/δ на своей поверхности. Развитие γ/δ Т-клеток во многом похоже на развитие Т-клеток α/β, однако есть ряд важных отличий. Во-первых, 37 сигнал, необходимый для дальнейшего развития, обеспечивается полностью собранным рецептором, без экспрессии пре-TCR. Во-вторых, дифференцировка γ/δ Т-клеток не зависит от Notch [Ciofani и др., 2006]. Экспрессия трансгенного TCR α/β вызывает аллельное исключение для эндогенных β-цепей Т-клеточного рецептора и приводит к значительным нарушениям в дифференцировке γ/δ Т-клеток. Известно, у TCR-трансгенных животных могут практически полностью отсутствовать γ/δ Т-клетки из-за ингибирования реаранжировки локуса Tcrg [von Boehmer и др., 1988]. Кроме того, подавление реаранжировки γ-цепей Т-клеточного рецептора в этом случае может приводить к появлению в организме клеток, несущих TCR α/β, но при этом относящихся к линии дифференцировки γ/δ [Bruno, Fehling, von Boehmer, 1996] [Terrence и др., 2000]. Экспрессия одной трансгенной цепи TCR также приводит к ряду нарушений в процессах онтогенеза Т-лимфоцитов. Так, экспрессия трансгенной β-цепи TCR также приводит к подавлению реаранжировки локусов Tcrb и Tcrg [Gerber, Boucontet, Pereira, 2004]. Однако, как и в случае развития Т-клеток с эндогенным Т-клеточным рецептором, этот процесс опосредуется экспрессией инвариантной цепи pTα [Ferrero и др., 2007]. После прохождения стадии β-селекции тимоциты начинают активно пролиферировать, происходит повышение экспрессии маркеров CD4 и CD8, и клетки переходят на стадию двойных позитивных тимоцитов (CD4+CD8+, DP). Экспрессия пре-TCR инициирует реаранжировку α-цепи TCR [Kreslavsky, Gleimer, 2010]. На стадии DP происходит позитивная и негативная селекция развивающихся Т-клеток. Во время этого процесса из репертуара элиминируются Т-клетки, взаимодействующие с собственными комплексами MHC/пептид с высокой или слишком низкой аффинностью. Итоговый репертуар зрелых однопозитивных (CD4+CD8— и CD4—CD8+, SP) Т-клеток состоит из лимфоцитов, способных реагировать с собственными промежуточной аффинностью [Murphy, 2012]. комплексами MHC/пептид с 38 Известно, что коридор «разрешенных аффинностей» при которых Т-клетка в процессе позитивной и негативной селекции способна продолжить развитие, узок. Вследствие этого даже небольшие изменения в аффинности взаимодействия Т-клеточного рецептора с комплексами MHC/пептид могут приводить к изменению судьбы клона Т-клеток [Moran, Hogquist, 2012]. Экспрессия трансгенного Т-клеточного рецептора может приводить к нарушениям в процессах позитивной и негативной селекции. Так, например, показано, что экспрессия трансгенного аутореактивного TCR, клонированного из регуляторных CD4+ Т-клеток, приводит к 90% делеции CD4+Foxp3+ и CD4+Foxp3 — лимфоцитов на стадии CD4SP [DiPaolo, Shevach, 2009]. В случае одновременной экспрессии трансгенных α- и β-цепей Т- клеточного рецептора все тимоциты несут одинаковый TCR, и соответственно, механизмы позитивной и негативной селекции действуют на них одинаково. В случае экспрессии одной трансгенной цепи TCR ситуация меняется. В литературе имеется небольшое количество данных относительно влияния индивидуальных цепей TCR на специфичность Т-клеточного рецептора. Однако, имеющиеся данные свидетельствуют о неравнозначном вкладе α- и β-цепей в этот процесс. Так, было показано, что специфичность итогового Т-клеточного рецептора изменяется при взаимодействии одной β-цепи с различными α-цепями [Stadinski и др., 2011]. Существует ли взаимосвязь экспрессии трансгенных цепей TCR с поверхностным активационным фенотипом периферических Т- лимфоцитов, по сей день остается неизвестным. 13. Противоопухолевый иммунный ответ. Иммунологический надзор и иммунная селекция опухолевых клеток Антигены опухолей опухолеспецифические и делятся на две опухолеассоциированные. больших группы: Опухолеспецифические представляют из себя классические антигены, в основе возникновения которых 39 лежит генетическая модификация клетки (например, в результате мутаций, инфицирования вирусами, хромосомных транслокаций и т. д.). Опухолеассоциированные антигены — это нормальные (немутантные) белки организма, экспрессированные на опухолевых клетках «не в то время и не в том месте». Как правило, иммунный ответ на опухолеассоциированные антигены затруднен, поскольку аутореактивные Т-клетки, способные на них ответить, устраняются в процессе развития пула Т-лимфоцитов в тимусе [Казанский, 2007]. Таким образом, для развития эффективного противоопухолевого иммунного ответа необходимо преодолеть иммунологическую толерантность к антигенам собственного противоопухолевого организма. иммунного ответа Именно может поэтому служить индуктором гомеостатическая пролиферация Т-клеток в условиях лимфопении [Dummer и др., 2002]. Известно, что во время гомеостатической пролиферации преимущество получают клоны Тклеток, способные к высокоаффинному взаимодействию с собственными молекулами MHC [Hao, Legrand, Freitas, 2006]. С одной стороны, это увеличивает вероятность развития аутоиммунного заболевания [Theofilopoulos, Dummer, Kono, 2001], а с другой — формирует пул CD8+ Т-клеток, способных распознать опухолеассоциированные антигены в контексте собственных молекул MHC [Dummer и др., 2002]. Другой перспективный подход к получению клонов Тлимфоцитов, способных отвечать на антигены опухолевых клеток, заключается в использовании репертуара Т-клеточных рецепторов аллогенного донора [Казанский, 2007]. В этом случае репертуар периферических Т-лимфоцитов формировался в процессе взаимодействия с другими молекулами MHC, и в нем сохраняются Т-клетки, способные к аллорестриктированному распознаванию опухолевых антигенов. Молекулы MHC I класса играют важную роль во взаимодействии опухолевых клеток с клетками организма, в котором развивается опухоль. Именно эти молекулы представляют антигены опухолей цитотоксическим Тлимфоцитам [Aptsiauri и др., 2007]. Известно, что исчезновение или снижение 40 экспрессии молекул MHC I класса на поверхности опухолевых клеток является одним из наиболее известных последствий иммунной селекции [Garrido и др., 1997] [Qi и др., 2012]. Достаточно часто потеря экспрессии молекул MHC I класса опухолевыми клетками вызвана различными нарушениями в гене, кодирующем β2-микроглобулин [Bernal и др., 2012]. Поскольку в основе возникновения опухоли и опухолевой прогрессии лежат различные генетические и эпигенетические нарушения [Felsher, 2003], то опухолевые клетки, опухолеспецифических как и правило, экспрессируют опухолеассоциированных значительное антигенов. число Концепция иммунологического надзора предполагает, что иммунная система уничтожает иммуногенные варианты опухолевых клеток, экспрессирующих опухолеспецифические антигены, и «пропускает» неиммуногенные опухолевые клетки, экспрессирующие опухолеассоциированные антигены [Казанский, 2007]. Экспериментальные доказательства наличия иммунологического надзора были получены достаточно давно. Известно, что опухоли, перевитые сингенным животным, не отторгаются. Однако, если предварительно иммунизировать животных облученными клетками этой же опухоли, опухолевая прогрессия заметно замедляется и опухоль может отторгнуться [Prehn, Main, 1957]. Кроме того, фибросаркомы, химически индуцированные in vitro, отторгаются при пересадке сингенным животным. Эти опухоли, однако, растут после трансплантации иммунодефицитным животным [Woodruff, Hodson, 1985]. Опухоли, индуцированные метилхолантреном у мышей nude, отторгаются при пересадке нормальным, неиммунодефицитным животным, но если они были исходно индуцированы у животных с нормальной иммунной системой, то их пересадка нормальным животным той же линии приводит к росту опухолей и гибели реципиентов [Svane и др., 1996]. Одним из доказательств существования иммунологического надзора не только в экспериментальных моделях может служить увеличение вероятности развития сопутствующих онкологических заболеваний у больных со 41 злокачественными новообразованиями, происходящими из эпителия тимуса (тимомы типа A, AB, B, или карцинома тимуса, согласно классификации ВОЗ). Было показано, что у 32% больных карциномой тимуса развивается сопутствующее онкологическое заболевание; в то же время, вероятность развития сопутствующего онкологического заболевания для больных раком щитовидной железы составляет всего 6%, а для больных раком прямой кишки — 10% [Granato и др., 2012]. Это связано с тем, что у больных карциномой тимуса значительно нарушена функция тимусного эпителия, «ответственного» за процессы развития Т-лимфоцитов. Вследствие этого итоговый репертуар периферических Т-лимфоцитов не содержит Т-клеток, способных к эффективному ответу на антигены опухолей. Прогрессия опухоли в организме происходит, как правило, несмотря на активный иммунный ответ на опухолевые клетки. Это явление обусловлено появлением у опухолевых клеток новых генетических и фенотипических свойств, которые позволяют им сделаться «невидимыми» для иммунной системы организма [Seymour и др., 1999]. Таким образом, опухолевая прогрессия обеспечивается соматической эволюцией генетически нестабильных клеток опухоли, находящихся под давлением со стороны иммунной системы. В процессе этой эволюции преимущество получают те опухолевые клетки, фенотип которых позволяет им избежать распознавания клетками иммунной системы и, соответственно, гибели [Garcia-Lora, Algarra, Garrido, 2003]. Несмотря на то, что механизмы иммунной селекции опухолевых клеток подвергались интенсивным исследованиям в течение нескольких последних десятилетий, практически ничего не известно о том, как экспрессия индивидуальных цепей TCR может влиять на этот процесс. 42 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Растворы и среды Среда HEPES-KSOM: NaCl 95mM (Sigma-Aldrich), KCl 25mM (Sigma), KH2PO4 0.35mM (Sigma), MgSO4.7H2O 0.2mM (Sigma-Aldrich), лактат Na 10mM (Sigma), D(+) глюкоза 0.2mM (Новосибхимфарм ), пенициллин G 60мкг/мл (AppliChem), cульфат стрептомицина 50мкг/мл (AppliChem), пируват Na 0.2mM (GibcoBRL), CaCl2.7H2O 0.17mM (Sigma-Aldrich), Na2EDTA·2H2O 0.01mM (Sigma-Aldrich), Lглутамин 2mM ( Sigma-Aldrich), HEPES 10mM (Serva), NaHCO3 5.95mM (SigmaAldrich),феноловый красный 0.01г/л (Sigma),БСА (V фракция) 1 г/л (Sigma). Среду доводили до рН 7.35-7.4, используя NAOH (Sigma-Aldrich). Среда KSOM: NaCl 95mM (Sigma-Aldrich), KCl 25mM (Sigma), KH2PO4 0.35mM (Sigma), MgSO4.7H2O 0.2mM (Sigma-Aldrich), лактат Na 10mM (Sigma), D(+) глюкоза 0.2mM (Новосибхимфарм ), пенициллин G 60мкг/мл (AppliChem), cульфат стрептомицина 50мкг/мл (AppliChem), пируват Na 0.2mM (GibcoBRL), CaCl2.7H2O 0.17mM (Sigma-Aldrich), Na2EDTA·2H2O 0.01mM (Sigma-Aldrich), Lглутамин 2mM ( Sigma-Aldrich), HEPES 10mM (Serva), NaHCO3 25mM (SigmaAldrich),феноловый красный 0.01г/л (Sigma),БСА (V фракция) 1 г/л (Sigma). Полная ростовая среда: RPMI-1640 (ПанЭко, Россия), cодержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,01 мг/мл ципрофлоксацина (KRKA, Словения), 4 ммоль L-глутамина (Sigma), 20 ммоль HEPES (ПанЭко) и 5 х 10-5 М 2-меркаптоэтанола (Merck) Авертин: 2.5% водный раствор 1 г 2,2,2 –трибромэтанола (Aldrich, USA) в 1мл 2метил-2- бутанола (Sigma-Aldrich, USA). Лизирующий буфер: 0,826 г NH4Cl, 0,1 г NaHCO3, 0,0037 г Na2EDTA на 100 мл H2O. 10х PBS: 2 г KCl, 2 г KH2PO4, 80 г NaCl, 11,45 г Na2HPO4, 1л Н2О. 43 2. Животные В работе были использованы линии мыщей C57BL/6 (K bI-AbDb), C57BL/10 (KbI-AbDb), B10.D2(R101) (KdI-AdI-EdDb), FVB (KqI-AqI-EqDq), TgN(ACTbEGFP)1Osb C57BL/6- (KbI-AbDb) (далее C57BL/6.GFP) и B10.D2(R101)- TgN(ACTbEGFP)1Osb (KdI-AdI-EdDb) (далее – B10.D2(R101).GFP) разведения вивария Российского Онкологического Научного Центра РАМН, гибриды F1(CBA X C57BL/6) (питомник «Столбовая»). Мыши, трансгенные -цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 были получены и поддерживались в лаборатории механизмов регуляции иммунитета ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 3. Антитела Для анализа клеток на проточном цитофлуориметре (BD FACSCanto II, Becton Dickinson, USA) использовали следующие антитела (Таблица 1): Антитело Клон Флуорохром Производитель анти-CD8 53-6.7 FITC BD Pharmingen, USA анти-CD8 53-6.7 eFluor450 eBioscience, USA анти-CD8 53-6.7 APC eBioscience, USA анти-CD4 L3T4 APC BD Pharmingen, USA анти-CD4 GK1.5 FITC eBioscience, USA анти-mouse TCR V6 RR4-7 PE BD Pharmingen, USA анти-CD62L MEL-14 APC/Cy7 BioLegend, USA анти-CD44 IM7 PE BioLegend, USA анти-CD44 IM7 APC eBioscience, USA анти-CD3 17A2 Alexa Fluor647 eBioscience, USA анти-CD3 17A2 eFluor450 eBioscience, USA анти-CD3 17A2 FITC eBioscience, USA AF6-88.5.5.3 FITC eBioscience, USA b анти-K анти-TCRγ/δ GL3 PE BD Pharmingen, USA Таблица 1. Антитела, используемые для окраски и анализа клеток на проточном цитофлуориметре. 44 Для окрашивания мертвых клеток использовали пропидий йодид (PI) 7,5·10-5 М (Sigma, USA) или 7AAD Viability Staining Solution (BioLegend, USA). 3. Клеточные линии Клетки тимомы EL4 (KbDb) получали в асцитной форме, трансплантируя их в количестве 3-5 х 106 мышам сингенной линии C57BL/6. Через 10-14 дней собирали асцит, трижды отмывали центрифугированием в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) и использовали для внутрибрюшинной иммунизации мышей B10.D2(R101) и 1D1bFM. Клетки мастоцитомы P815 (KdDd) поддерживали культивированием in vitro в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в диапазоне клеточных концентраций 0,1 – 1х10 6 кл/мл при 37оС в атмосфере с 5% CO2 и абсолютной влажностью. Клетки трижды отмывали центрифугированием в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) и использовали для внутрибрюшинной иммунизации мышей C57BL/6.GFP. 4. Создание трансгенных животных Первичные трансгены были получены методом микроинъекций раствора ДНК в TE-буфере (концентрация ДНК 5 нг/мкл) в мужской пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток мышей гибридной линии последующей пересадкой выживших CBA X C57BL/6 с микроинъецированных зигот псевдобеременным реципиентам. Общая схема эксперимента представлена на рисунке 2. Яйцеклетки получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F1(CBA X C57BL/6) весом 12-13 г вводили внутрибрюшинно 8 ед. ГСЖК (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, 45 МОСАГРОГЕН (Россия)), а затем, через 46 часов, внутрибрюшинно вводили 8 ед. ХгЧ (хорионический гонадотропин человека, Московский эндокринный завод (Россия)). Рисунок 2. Схема эксперимента по получению трансгенных животных. После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F1(CBA X C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки. Схема индукции суперовуляции: 13:00 – ГСЖК, через 46 часов в 11:00 – ХгЧ. В 17:00 этого же дня – подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:30. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00. Самок с копулятивными пробками умерщвляли путем цервикальной дислокации и извлекали яйцеводы. Яйцеклетки вымывали в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы (Sigma, USA) под бинокуляром Zeiss Stemi DV4 при 46 увеличении 32Х. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония). После вымывания яйцеклетки культивировали в течение 2-х часов (37 0C, 5% CO2) в капле среды HEPES-KSOM или KSOM под минеральным маслом (Sigma, USA), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200M при увеличении 400Х-600Х, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Co P-97 (USA), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900. Процесс микроинъекции представлен на рисунке 3. В центре поля зрения — яйцеклетка, в которой отчетливо видны мужской и женский пронуклеусы (мужской пронуклеус более крупный). Слева в кадре видна микропипетка, удерживающая яйцеклетку (рис. 3, а). Микроинъекционная игла подходит к яйцеклетке справа (рис. 3, б). Хорошо видно, что размер мужского пронуклеуса увеличивается в процессе микроинъекции. Завершающий этап микроинъекции — выведение микроинъекционной иглы из яйцеклетки. Мужской пронуклеус увеличен и несколько деформирован в результате микроинъекции (рис. 3, в). После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM или HEPES-KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных клеток. Реципиентов получали следующим образом: половозрелых самок F1(CBA X C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Псевдобеременных реципиентов отбирали на следующее утро по наличию копулятивных пробок. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (авертин, вводился внутрибрюшинно из расчета 15 мкл на 1 г веса животного). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника 47 и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля. а б в Рисунок 3. Процесс микроинъекции раствора ДНК в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. а — яйцеклетка перед микроинъекцией; б — яйцеклетка в процессе микроинъекции; в — яйцеклетка после микроинъекции. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в левый яйцевод псевдобеременной самки. В зависимости от количества клеток, выживших после микроинъекции, одной псевдобеременной самке пересаживали от 10 до 20 48 зигот. Во время операции для обездвиживания животных использовали авертин. 5. Получение потомства и анализ наличия трансгена В случае отсутствия естественных родов на 21 день после пересадки микроинъецированных яйцеклеток реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 14-21 день после рождения у мышат, рожденных после микроинъекций, проводили забор тканей, выделяли ДНК и анализировали наличие трансгена методом ПЦР. 6. Анализ наличия трансгена в геноме мышей методом ПЦР ДНК для ПЦР выделяли из тканей по стандартному протоколу (Molecular Cloning, USA). Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью Taq полимеразы (Evrogen, Россия) в буфере (с 2.5 мМ MgCl 2), прилагаемом фирмойпроизводителем, в присутствии 2 мМ dNTP и 10 pМ каждого праймера в следующих режимах: денатурация 94 оС – 3 мин; далее следовало 4 цикла: 94 оС – 20 сек, 62 оС – 30 сек; 72оС – 35 сек; 8 циклов: 94 оС – 20 сек, 60 оС – 30 сек, 72оС – 35 сек; следовало 25 циклов: 94 оС – 20 сек, 58 оС – 30 сек, 72оС – 35 сек и, наконец, последний синтез 72 оС – 10мин. Праймеры, используемые для амплификации трансгенной -цепи Тклеточного рецептора гибридомы 1D1, а также для амплификации гена CD4, приведены в таблице 2. После завершения ПЦР 10мкл реакционной смеси наносили на 1,5% агарозный гель, содержащий бромистый этидий и разделяли электрофорезом в трис-ацетатном буфере (Molecular Cloning, USA). Гели фотографировали и анализировали, используя трансиллюминатор. 49 Ампл ифиц ируем ый ген Прямой праймер Обратный праймер 1D1 TCRBV6S1 BamHI CB2EcoRI 5’cagaggatccagaaagtccctccaaact3’ 5'- gctcagaattcataaaagtttgtc-3' CD4w-s CD4w-as 5’-gaggttcgccttcgcagtttgat-3’ 5’-tggacatggagagaactttgga-3’ CD4 Таблица 2. Праймеры, используемые для амплификации трансгенной -цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 и гена CD4. 7. Получение линий трансгенных мышей на генетической основе линии B10.D2(R101) Были проведены возвратные скрещивания первичных полученных на генетической основе F1(CBA X C57BL/6) трансгенов, с мышами линии B10.D2(R101). Потомство F1 анализировали методом ПЦР на наличие трансгена, как описано выше, и мышей, содержащих трансген в геноме, также использовали для возвратных скрещиваний с чистой линией B10.D2(R101). Для каждой линии трансгенных животных было проведено не менее 7 возвратных скрещиваний. Трансгенные линии получили названия 1D1bFM и 1D1bFF, соответственно. 8. Получение гибридов F1 (1D1bFM X C57BL/10) Мышей трансгенной линии 1D1bFM поколения F7 скрестили с мышами чистой линии C57BL/10. Полученное потомство анализировали методом ПЦР на 50 наличие трансгена, как описано выше, и мышей, содержащих трансген в геноме, далее использовали в экспериментах. 9. Выделение мононуклеаров из периферической крови Забор крови осуществляли из ретроорбитального венозного синуса. На каждые 100 мкл крови добавляли 30мкл гепарина, затем лизировали эритроциты лизирующим буфером и 2 раза отмывали центрифугированием в 1х PBS (ПанЭко, Россия). 10. Оценка количества лимфоцитов, экспрессирующих трансген, на периферии Для оценки количества периферических лимфоцитов, несущих -цепь трансгенного Т-клеточного рецептора, из периферической крови трансгенных животных выделяли фракцию мононуклеаров способом, описанным выше, окрашивали моноклональными флуоресцентно мечеными антителами к CD3 и V6 (вариабельный участок β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 относится к семейству V6) и определяли процент клеток CD3+, несущих трансгенный TCR, используя проточный цитофлуориметр BD FACSCanto II. 11. Иммунизация мышей Иммунизацию мышей проводили, вводя внутрибрюшинно каждому животному линии B10.D2(R101) 1 мл клеточной суспензии тимомы EL-4 (концентрация 2 х 107 клеток/мл) или внутрибрюшинно каждому животному 51 линии C57BL/6.GFP 1 мл клеточной суспензии мастоцитомы P815 в PBS (концентрация 2 х 107 клеток/мл). Контрольной группе мышей вводили внутрибрюшинно 1мл 1х PBS (ПанЭко, Россия). Через 2 месяца после иммунизации спленоциты этих мышей, облученных или интактных, использовали в экспериментах как источник долгоживущих клеток памяти. Иммунизацию мышей трансгенной линии 1D1bFM тимомой EL-4 проводили также, как описано выше. 12. Оценка уровня противоопухолевого иммунного ответа in vivo Через 12 дней после иммунизации выделяли клетки селезенки у интактных и иммунизированных животных, окрашивали флуоресцентно мечеными антителами и анализировали соотношение различных субпопуляций Т-клеток на проточном цитофлуориметре. 13. Облучение мышей Самок мышей линий B10.D2(R101), C57BL/6 и 1D1bFF, интактных или предварительно иммунизированных как описано выше, облучали в дозе 4,5 Gy при помощи терапевтического аппарата “Агат-Р” (Россия), содержащего источник гамма-излучения Co60 с начальной мощностью 1,9x1014 Бк. Спленоциты облученных мышей использовали для окраски флуоресцентно мечеными антителами, а также в MLR через 3 и 10 дней после облучения. 14. Приготовление клеточных суспензий Лимфоциты выделяли из селезенок мышей в гомогенизаторе Поттера с 52 коническим пестиком осторожным выдавливанием из стромы органа. Для адоптивного переноса в суспензии клеток селезенки лизировали эритроциты, добавляя к осадку последовательно 360 мкл Н 2О, 40 мкл 10хPBS и 5 мл 1х PBS. Затем спленоциты осаждали центрифугированием (200g, 5 мин) и ресуспендировали в полной среде (для клеток, используемых в MLR) или в 1х PBS (для адоптивного переноса). Жизнеспособные клетки подсчитывали в смеси трипанового синего и эозина. 15. Адоптивный перенос Интактных мышей линии B10.D2(R101) или C57BL/6 облучали в дозе 4,5 Gy как описано выше, затем через 24 часа им вводили внутривенно спленоциты от интактных или иммунных животных в количестве 1,5х107. Через 10 дней спленоциты мышей-реципиентов использовали для окраски флуоресцентно мечеными антителами, а также в MLR в качестве респондеров. 15. Реакция MLR Для постановки MLR 4х105 отвечающих спленоцитов (респондеров) инкубировали в присутствии аллогенных или сингенных стимуляторов, обработанных митомицином С (Киова Хакко Когио Ко., Лтд., Япония) (25 мкг/мл, 37oC, 30 мин), в количестве 4х105 клеток на лунку 96-луночного круглодонного планшета. Для избирательной активации клеток памяти стимуляторы подвергали острому тепловому шоку (инкубация спленоцитов при 45оС в течение 60 минут), затем их добавляли в культуру в количестве 4х10 5 на лунку 96-луночного круглодонного планшета. Клетки инкубировали в полной ростовой среде при 37оС в атмосфере с 5% CO2 и абсолютной влажностью в 53 течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценивали по включению 3Н-тимидина за последние 8 ч. Аллогенный ответ подсчитывали как разность между включением [3H]-тимидина в культуры с аллогенными и сингенными стимуляторами. 16. Реакция бласттрансформации Для получения клеточных бластов спленоциты C57BL/10-GFP и B10.D2(R101)-GFP в количестве 20-30х106 клеток инкубировали в 15 мл полной среды в присутствии митогена конканавалина А (ConA) с конечной концентрацией 5мкг/мл при 37оС, 5% СО2 и 100% влажности. Через 48 часов полученные бласты отмывали от конканавалина А в большом количестве PBS центрифугированием (200g, 5 мин). Полученные бласты использовали в качестве мишеней для определения цитолитической активности Т-клеток памяти. 17. Цитотоксический тест Спленоциты, выделенные из селезенок интактных и иммунных мышей B10.D2(R101), осаждали центрифугированием, помещали в 1мл PBS и проводили подсчет в камере Горяева в смеси трипанового синего и эозина. Эти клетки использовали в качестве предполагаемых клеток-киллеров. Суспензии клеток-киллеров и аллогенных клеток-мишеней, полученных в реакции бласттрансформации, смешивали в соотношениях: 100:1, 50:1, 20:1 и 10:1. В качестве контроля клетки-киллеры смешивали аналогично с сингенными клетками-мишенями. Клетки инкубировали 4 часа в полной ростовой среде при 37оС, 5% СО2 и 100% влажности. Затем анализировали содержание в суспензии живых GFP+ клеток методом проточной цитофлуориметрии. 54 18. Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре Окрашивание антителами проводили при 40C в течение 30-50 мин. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, USA) с использованием программы BD FACSDiva 6.0. Погибшие клетки исключали из анализа по окрашиванию PI (в ряде экспериментов – 7AAD ) и по показателям рассеивания. Анализировали не менее 100 тыс. событий для характеристики популяций Т-лимфоцитов в периферической крови трансгенных животных, не менее 1 млн. событий для характеристики популяций Тлимфоцитов в тимусе и не менее 3 млн. событий для характеристики активационного поверхностного фенотипа популяций периферических Тлимфоцитов. Для анализа результатов использовали программу FlowJo 7.6. Основные принципы цитофлуориметрического анализа различных субпопуляций тимуса показаны на рисунке 4. Цитофлуориметрический анализ проводили последовательно: сначала выделяли популяцию клеток (рис. 4, а), затем исключали из анализа конгломераты клеток (рис. 4, б) и мертвые клетки (рис.4, в), и только после этого анализировали основные популяции тимоцитов (рис. 4, г, д, е). Основываясь на этих же принципах, проводили цитофлуориметрический анализ популяций периферических Т-лимфоцитов: выделение популяции клеток — исключение из анализа конгломератов и мертвых клеток — выделение популяции CD3+ Т-лимфоцитов — выделение популяций CD4+ и CD8+ Т-клеток — анализ поверхностного фенотипа популяций CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов. Принцип цитофлуориметрического анализа бластных клеток, образующихся в MLR, представлен на рисунке 5. Бластные клетки выделяли по показателям прямого и бокового светорассеивания (рис. 5, а). Мертвые клетки в популяции бластных клеток исключали из анализа по окрашиванию 7AAD (рис. 5, б). Среди живых бластных клеток выделяли Т-лимфоциты (рис. 5, в), а среди Т-клеток — CD4+ и CD8+ клетки (рис. 5, г). 55 б в FSC д FSC-A PE CD4 г PI SSC FSC-H а Vβ6 CD8 е CD3 Рисунок 4. Основные принципы цитофлуориметрического анализа клеток тимуса. а — Выделение популяции клеток (Cells) по показателям прямого и бокового рассеивания; б — исключение из анализа клеточных конгломератов, гейт поставлен на одиночные клетки (Singlets); в — исключение из анализа мертвых клеток по окрашиванию PI или 7AAD, гейт поставлен на живые клетки (live); г — выделение популяций однопозитивных (CD4+ или CD8+), двойных позитивных (DP) и двойных негативных (DN) тимоцитов; д — анализ экспрессии трансгенной β-цепи TCR в популяции CD8+ Т-лимфоцитов; е — анализ экспрессии маркера CD3 в популяции CD8+ Т-лимфоцитов. 56 б 7AAD SSC-A а FSC-A г CD4 CD8 в PE CD3 CD8 Рисунок 5. Основные принципы цитофлуориметрического анализа MLR. а — выделение популяции бластных клеток (Blast cells) на основании показателей прямого и бокового светорассеивания; б — выделение живых клеток (live) в популяции бластов; в — выделение CD3+ клеток (CD3) в популяции живых бластных клеток; г — выделение популяций CD4+ (CD4) и CD8+ (CD8) клеток среди CD3+ бластов. В качестве примера приведен анализ популяции бластных клеток мышей линии B10.D2(R101), образующейся в ответ на аллогенные стимуляторы линии FVB, обработанные митомицином С. 19. Статистическая обработка данных Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-теста Стьюдента в программе Excel (Microsoft, USA). 57 РЕЗУЛЬТАТЫ ГЛАВА 1. Функциональная активность Т-клеток памяти в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением. Для исследования взаимосвязи поверхностного активационного фенотипа и функциональной активности CD8+ Т-клеток мы сравнили функциональные свойства спленоцитов двух групп сублетально облученных животных: в одну из групп входили неиммунизированные животные, а в другую — животные, иммунизированные клетками аллогенной опухоли за два месяца до облучения. Кроме того, мы исследовали функциональную активность спленоцитов сублетально облученных мышей, которым были адоптивно перенесены сингенные спленоциты от интактных или предварительно иммунизированных животных. Для обнаружения специфического ответа истинных клеток памяти мы использовали экспериментальную систему, ранее разработанную в нашей лаборатории и основанную на способности аллоспецифичных клеток памяти, в отличие от наивных клеток, отвечать на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку (45⁰ С, 1 час) [Казанский и др., 1999]. 1.1. Аллогенный иммунный ответ клеток памяти и экспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L спленоцитами сублетально облученных мышей. Известно, что в результате сублетального облучения большая часть CD8+ Тлимфоцитов погибает, а оставшаяся часть приобретает поверхностный фенотип активированных T-клеток (рис. 6). Для исследования функциональных характеристик периферических Тлимфоцитов в условиях лимфопении интактных и предварительно иммунизированных мышей линии B10.D2(R101) (KdI-AdI-EdDb) облучали в дозе 58 4,5 Gy, затем оценивали способность спленоцитов этих мышей к первичному и вторичному аллогенному ответу in vitro через 3 и 10 дней после сублетального облучения. CD62L Иммунные 4,5 Gy Контроль Интактные CD44 Рисунок 6. Поверхностный активационный фенотип CD8+ Т-клеток селезенки интактных и иммунных животных после сублетального облучения. Процентное соотношение CD8+ лимфоцитов с фенотипом наивных Т-клеток (CD44—CD62L+, Naive), эффекторных Т-клеток (CD44+CD62L—, Effectors) и центральных Т-клеток памяти (CD44+CD62L+, central memory) в популяции спленоцитов интактных (левая панель, интактные) и предварительно иммунизированных животных линии B10.D2(R101) (правая панель, иммунные) через 10 дней после сублетального облучения (нижняя панель, 4,5 Gy). Способность спленоцитов осуществлять первичный и вторичный ответ in vitro оценивали в MLR с использованием сингенных (B10.D2(R101), аллогенных специфических (C57BL/6 (H-2b)) и аллогенных сторонних (FVB (H-2q)) 59 стимуляторов. Для оценки первичного иммунного ответа стимуляторы обрабатывали митомицином С, а вторичный иммунный ответ оценивали по способности Т-лимфоцитов отвечать на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку (прогревание в течение 1 часа при температуре 45⁰ С). Способность Т-лимфоцитов селезенки отвечать на аллогенные стимуляторы, обработанные митомицином С, сохраняется после сублетального облучения интактных и иммунных животных (рис. 7, а, б). В то же время, способность спленоцитов отвечать на специфические аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку, сохраняется только у предварительно иммунизированных животных. Таким образом, несмотря на практически одинаковое соотношение клеток с поверхностным фенотипом активированных и наивных Т- лимфоцитов в селезенке интактных и иммунных животных (рис. 6), антигенспецифический ответ клеток памяти имеет место только у предварительно иммунизированных животных. 60 а R101 mitC R101 t°C 35000,0 BL10 mitC BL10 t°C FVB mitC FVB t°C * 30000,0 25000,0 * cpm 20000,0 * 15000,0 * 10000,0 5000,0 0,0 R101 int б R101 MitC R101 t°C R101 imm BL10 MitC R101 int rad BL10 t°C FVB MitC R101 imm rad FVB t°C * 60000,0 55000,0 * 50000,0 45000,0 40000,0 cpm 35000,0 30000,0 * * 25000,0 20000,0 15000,0 10000,0 5000,0 0,0 R101 int R101 imm R101 int rad R101 imm rad Рисунок 7. Аллогенный иммунный ответ клеток селезенки сублетально облученных животных in vitro. Пролиферация смешанной культуры лимфоцитов интактных и иммунных мышей линии B10.D2(R101) через 3 (а) и 10 (б) дней после сублетального облучения в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С (MitC) или подвегрнутые острому тепловому шоку (t˚). В качестве отвечающей популяции были использованы интактные (R101 int) или 61 иммунные (R101 imm) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101), а также интактные (R10 int rad) или иммунные (R101 imm rad) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101) через 3 и 10 дней после сублетального облучения. В качестве стимулирующей популяции были использованы спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (KdDd), обработанные митомицином С (R101 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (45˚С в течение часа) (R101 tºC); спленоциты мышей линии C57BL/10 (KbDb), обработанные митомицином С (BL10 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (BL10 tºC); спленоциты мышей линии FVB (H-2q), обработанные митомицином С (FVB MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (FVB tºC) Пролиферацию определяли через 72 часа по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру в последние 8 часов инкубации. Значимость отличия данных определяли с использованием t-теста Стьюдента (*p<0.05). На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. 1.2. Аллогенный иммунный ответ клеток памяти и экспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L клетками селезенки сублетально облученных мышей после адоптивного переноса сингенных спленоцитов. Известно, что клеткам памяти свойственна высокая радиорезистентность [Yao и др., 2011]. Таким образом, в описанной выше экспериментальной системе обогащение клеток с поверхностным фенотипом CD44+ могло происходить за счет истинных радиорезистентных клеток памяти, а не за счет наивных Тлимфоцитов, которые приобрели фенотип клеток памяти. Для исследования функциональных свойств Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти, образовавшихся в процессе гомеостатической пролиферации, мы адоптивно перенесли сублетально облученным животным линии B10.D2(R101) сингенные клетки селезенки интактных и предварительно иммунизированных мышей. Через 10 дней после адоптивного переноса мы оценивали способность спленоцитов этих мышей отвечать в MLR на аллогенные стимуляторы, обработанные митомицином С, или подвергнутые острому тепловому шоку. Независимо от того, были адоптивно перенесены сингенные спленоциты интактных или предварительно иммунизированных животных, первичный и вторичный 62 иммунный ответ in vitro практически отсутствует (рис. 8). Соотношение СD4+ и CD8+ Т-клеток в селезенке сублетально облученных мышей после адоптивного переноса не отличалось от такового у интактных животных (рис. 9), поэтому отсутствие первичного иммунного ответа не может объясняться недостаточностью одной из популяций. R101 mitC R101 t°C BL10 mitC BL10 t°C FVB mitC FVB t°C * 16000,0 14000,0 12000,0 * cpm 10000,0 8000,0 6000,0 4000,0 2000,0 0,0 R101 int R101 imm R101 rad int adopt trans R101 rad imm adopt trans Рисунок 8. Аллогенный иммунный ответ клеток селезенки сублетально облученных животных после адоптивного переноса. Пролиферация смешанной культуры спленоцитов сублетально облученных мышей линии B10.D2(R101) через 10 дней после того, как им были адоптино перенесены сингенные интактные или иммунные спленоциты, в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С (MitC) или подвегрнутые острому тепловому шоку (t˚). В качестве отвечающей популяции были использованы интактные (R101 int) или иммунные (R101 imm) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101), а также спленоциты сублетально облученных мышей, которым были адоптивно перенесены интактные (R10 rad int adopt trans) или иммунные (R101 rad imm adopt trans) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101). В качестве стимулирующей популяции были использованы спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (KdDd), обработанные митомицином С (R101 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (45˚С в течение часа) (R101 tºC); спленоциты мышей линии C57BL/10 (KbDb), 63 обработанные митомицином С (BL10 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (BL10 tºC); спленоциты мышей линии FVB (H-2q), обработанные митомицином С (FVB MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (FVB tºC) Пролиферацию определяли через 72 часа по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру в последние 8 часов инкубации. Значимость отличия данных определяли с использованием t-теста Стьюдента (*p<0.05). На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. а 80,0 70,0 60,0 Cells, % 50,0 CD4 CD8 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 R101 int R101 imm R101 int 450 Rad R101 imm 450 Rad б 80 70 60 Cells, % 50 CD4 CD8 40 30 20 10 0 R101 int + int R101 int + imm R101 450 Rad + int R101 450 Rad + imm Рисунок 9. Соотношение CD4+ и CD8+ Т-клеток в селезенке сублетально облученных животных. а — относительное количество CD4+ и CD8+ Т-клеток в тотальной популяции спленоцитов 64 через 10 дней после сублетального облучения. R101 int — интактные мыши B10.D2(R101) (n=3); R101 imm — предварительно иммунизированные мыши B10.D2(R101) (n=3); R101 int 450 Rad — интактные сублетально облученные мыши B10.D2(R101) (n=3); б — относительное количество CD4+ и CD8+ Т-клеток в популяции спленоцитов сублетально облученных мышей-реципиентов через 10 дней после адоптивного переноса интактных или иммунных спленоцитов. R101 int+int — интактные мыши B10.D2(R101), которым были адоптивно перенесены интактные сингенные спленоциты (n=3); R101 int+imm — интактные мыши B10.D2(R101), которым были адоптивно перенесены спленоциты предварительно иммунизированных животных (n=3); R101 int 450 Rad + int — сублетально облученные мыши линии B10.D2(R101), которым были адоптивно перенесены интактные сингенные спленоциты (n=3); R101 int 450 Rad + imm — сублетально облученные мыши линии B10.D2(R101), которым были адоптивно перенесены сингенные спленоциты предварительно иммунизированных животных (n=3). Представлены данные, полученные в трех независимых экспериментах. Для исследования поверхностного активационного фенотипа Т-клеток донора и реципиента мы адоптивно переносили сублетально облученным мышам линии C57BL/6 сингенные спленоциты от интактных или иммунных животных линии BL6.GFP. Через 10 дней после адоптивного переноса в селезенке реципиента обнаруживалось от 3 до 5% GFPhiCD3+ клеток (рис. 10). CD3 C57BL/6 C57BL/6+BL6.GFP int C57BL/6+BL6.GFP imm GFP Рисунок 10. Относительное количество CD3+GFPhi клеток донора в селезенке сублетально облученного реципиента. Цитофлуориметрический анализ процентного содержания перенесенных GFPhi CD3+ 65 спленоцитов у мышей-реципиентов линии C57BL/6 через 10 дней после адоптивного переноса. Количеcтво GFPhiCD3+ (GFP+) клеток в селезенке интактной мыши линии C57BL/6 (C57BL/6, левая панель), сублетально облученной мыши линии C57BL/6, которой были адоптивно перенесены интактные клетки BL6.GFP (C57BL/6+BL6.GFP int, средняя панель) и сублетально облученной мыши линии C57BL/6, которой были адоптивно перенесены иммунные клетки BL6.GFP (C57BL/6+BL6.GFP imm, правая панель); Приведены данные для 2,5x106 событий. На рисунке представлены репрезентативные данные одного из трех экспериментов. Процентное соотношение наивных (CD44—CD62L+), эффекторных (CD44+CD62L—) и центральных клеток памяти (CD44+CD62L+) CD8+ Т-клеток реципиента (CD3+GFPlow) не отличалось от соотношения этих субпопуляций в селезенке интактных животных (рис. 11, левая панель). CD3+GFPlowCD8+ CD3+GFPhiCD8+ CD3+GFPlowCD8+ CD3+GFPhiCD8+ Перенесены Иммунные клетки Перенесены интактные клетки CD62L CD44 Рисунок 11. Поверхностный активационный фенотип CD8+ Т-клеток донора и реципиента после адоптивного переноса. Относительное количество CD8+ Т-клеток с фенотипом наивных (Naive, CD44—CD62L+), 66 эффекторных Т-клеток (Еffectors, CD44+CD62L—) и центральных Т-клеток памяти (Central memory, CD44+CD62L+) в селезенке сублетально облученного донора через 10 дней после адоптивного переноса. CD3+GFPlowCD8+ — цитофлуориметрический анализ клеток реципиента; CD3+GFPhiCD8+ — цитофлуориметрический анализ клеток донора; Верхняя панель — перенесены интактные клетки; нижняя панель — перенесены иммунные клетки. На рисунке представлены репрезентативные данные одного из трех экспериментов. Однако оказалось, что среди CD8+ Т-клеток донора (GFPhi) практически все клетки приобрели поверхностный фенотип активированных Т-клеток (CD44+) (рис. 11, правая панель). Соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов CD8+ с различными профилями экспрессии активационных маркеров не изменялось вне зависимости от того, были перенесены клетки интактных или предварительно иммунизированных животных. Отсутствие пролиферативного ответа в данной экспериментальной системе могло быть вызвано тем, что Т-клетки с эффекторным фенотипом обладают цитолитической активностью, быстро уничтожают антиген и не способны пролиферировать. Поскольку существуют данные о наличии киллерной активности у клеток с поверхностным фенотипом Т-клеток памяти [Cho и др., 2000], мы оценили цитотоксическую активность спленоцитов сублетально облученных мышей-реципиентов, которым были адоптивно перенесены клетки селезенки мышей-доноров (интактных или предварительно иммунизированных) линии B10.D2(R101). В качестве контроля использовали спленоциты интактных и иммунных мышей линии B10.D2(R101). Результаты цитотоксического теста приведены на рисунке 12. В качестве мишеней использовали сингенные (B10.D2(R101)-GFP (H2-Kd)) и аллогенные (C57BL/6-GFP (H2-Kb)) бластные клетки, полученные при инкубации спленоцитов с митогеном конканавалином А (ConA). Из рисунка видно, что процент выживших сингенных мишеней не превышает процент выживших аллогенных мишеней при любом соотношении клеток-мишеней и отвечающих 67 клеток. Из этого следует, что в используемой нами экспериментальной системе спленоциты донора и реципиента специфической киллерной активностью не обладают. Таким образом, в результате адоптивного переноса сингенных спленоцитов сублетально облученным мышам формируется популяция CD8+CD44+ Т-лимфоцитов, которая не способна осуществлять аллогенный иммунный ответ in vitro. а б anti R101.GFP anti BL6.GFP 30,00% 25,00% 25,00% 20,00% 20,00% 15,00% 15,00% 10,00% 10,00% 5,00% 5,00% 0,00% 0,00% 100:1 50:1 20:1 10:1 100:1 Клетки-респондеры : клетки- мишени 50:1 20:1 10:1 Клетки-респондеры : клетки-мишени в г 30,00% 20,00% 25,00% 15,00% 20,00% 15,00% 10,00% 10,00% 5,00% 5,00% 0,00% 0,00% 100:1 50:1 20:1 Клетки-респондеры : клетки-мишени 10:1 100:1 50:1 20:1 10:1 Клетки-респондеры : клетки-мишени Рисунок 12. Процент выживших сингенных и аллогенных клеток-мишеней в цитотоксическом тесте. На гистограммах представлен процент выживших клеток-мишеней для сингенной (anti R101.GFP) и аллогенной (anti BL6.GFP) реакции относительно общего числа GFPhi клеток в популяции. В качестве клеток-эффекторов выступали: а – интактные спленоциты мышей линии B10.D2(R101), б – иммунные спленоциты мышей линии B10.D2(R101), в – спленоциты сублетально облученных мышей-реципиентов через 10 дней после адоптивного переноса им интактных спленоцитов мышей линии B10.D2(R101), г - спленоциты сублетально облученных мышей-реципиентов через 10 дней после адоптивного переноса им иммунных спленоцитов мышей линии B10.D2(R101). По оси абсцисс приведены исходные соотношения клеток- 68 эффекторов и клеток-мишеней, по оси ординат – процент выживших клеток-мишеней. Время инкубации – 4 часа. На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. 1.3. Иммунный ответ сублетально облученных мышей после адоптивного переноса сингенных спленоцитов на клетки аллогенной опухоли in vivo. Мы исследовали способность сублетально облученных мышей B10.D2(R101) после адоптивного переноса отторгать клетки аллогенной тимомы EL-4. Для этого сублетально облученным животным одновременно с адоптивным переносом сингенных спленоцитов подкожно вводили 20 млн. клеток тимомы EL-4 и в дальнейшем наблюдали рост и отторжение опухоли. Результаты эксперимента приведены в Таблице 3. Наличие опухоли через 7 дней после введения Наличие опухоли через 14 дней после введения Наличие опухоли через 21 день после введения B10.D2(R101) интактные (n=3) + — — B10.D2(R101) иммунные (n=3) — — — B10.D2(R101) интактные облученные (n=3) + — — B10.D2(R101) иммунные облученные (n=3) — — — B10.D2(R101) облученные, адоптивно перенесены клетки от интактных животных (n=3) + + — B10.D2(R101) облученные, адоптивно перенесены клетки от иммунных животных (n=3) + + — Таблица 3. Отторжение аллогенной опухоли сублетально облученными мышами после адоптивного переноса сингенных спленоцитов. 69 Скорость отторжения аллогенной опухоли у сублетально облученных животных после адоптивного переноса сравнивали со скоростью отторжения опухоли у облученных (интактных и иммунных) животных, которым не делали адоптивного переноса. Оказалось, что отторжение тимомы EL-4 у облученных мышей после адоптивного переноса происходит заметно медленнее, чем у облученных животных. Кроме того, адоптивный перенос сингенных спленоцитов от иммунных животных не ускоряет процесс отторжения опухоли. Таким образом, аллогенный иммунный ответ сублетально облученных животных in vivo снижен и не восстанавливается после адоптивного переноса сингенных лимфоцитов. 70 ГЛАВА 2. Создание первичных трансгенов по β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 и получение трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF на генетической основе линии B10.D2(R101) При исследовании пролиферативного ответа Т-клеток памяти в состоянии лимфопении мы показали, что профиль экспрессии поверхностных активационных маркеров не коррелирует не только с ответами клеток памяти, но и со способностью Т-лимфоцитов к аллогенному иммунному ответу in vitro. Таким образом, вопрос о факторах, определяющих функциональные особенности Т-клеток памяти, остается открытым. Известно, что для TCR клеток памяти характерна более высокая аффинность взаимодействия со специфическим лигандом, чем для наивных клеток с той же специфичностью [Savage, Boniface, Davis, 1999]. Это дает основания полагать, что именно структура Т-клеточного рецептора является главным фактором, определяющим судьбу и функциональные свойства индивидуального клона Т-лимфоцитов. Ранее в нашей лаборатории были клонированы α- и β-цепи TCR гибридомы клеток памяти 1D1, полученной во вторичном аллогенном ответе клеток селезенки мышей линии B10.D2(R101), иммунизированных клетками тимомы EL-4 (KbDb), на спленоциты мышей C57BL/6 (H-2b), подвергнутые острому тепловому шоку, что исключает активацию наивных клеток. Ген β-цепи был клонирован в экспрессионную кассету hCD2, которая обеспечивает специфическую экспрессию гена интереса в Т-лимфоцитах [Zhumabekov и др., 1995], и эта генетическая конструкция, получившая название 1D1b, была использована для получения первичных трансгенов. 2.1. Получение первичных трансгенов Первичные трансгены 1D1b были получены методом микроинъекции раствора ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Результаты 71 трансгенеза представлены в Таблице 4: Реципиент № Пересажено яйцеклеток Родилось животных Из них трансгенов 1 16 3 2 2 18 3 0 Всего 34 6 Таблица 4. Результаты трансгенеза генетической конструкции 1D1β. 2 Эффективность трансгенеза, рассчитанная по формуле: (кол-во трансгенов / общее кол-во рожденных животных) х 100%, составила 33.3%. Наличие или отсутствие трансгена в геноме определяли методом ПЦР. На рисунке 13 представлены результаты анализа ПЦР-продукта ДНК мышей рожденных после микроинъекций генетической конструкции 1D1b (рис. 13, а). Были получены 2 первичных трансгена (№1 и №2, соответственно). Однако наличие трансгена в геноме не гарантирует его эффективной экспрессии, поскольку процесс интеграции трансгена в геном носит случайный характер как по количеству копий, так и по месту интеграции [Al-Shawi и др., 1990]. Поэтому дополнительно был проведен цитофлуориметрический анализ для определения количества CD3+ лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих трансген на своей поверхности. (рис. 13, б). V-сегмент β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 относится к семейству V6. У мышей дикого типа доля Т-клеток, несущих определенный V-сегмент, обычно не превышает нескольких процентов, тогда как у трансгенных животных увеличивается в десятки раз. В периферической крови мышей C57BL/6 дикого типа присутствуют Т-лимфоциты, у которых V-сегмент β-цепи TCR также относится к семейству V6, однако пул этих клеток невелик. У первичного трансгена № 1 около 70% CD3+ лимфоцитов периферической крови несли на своей поверхности трансгенную β-цепь TCR, однако у первичного трансгена № 2 только 33% CD3+ лимфоцитов периферической крови экспрессировали трансген (рис. 13, б, нижняя панель). Общее количество CD3+ клеток в 72 периферической крови у первичных трансгенов не было снижено по сравнению с контролем (рис. 13, б, верхняя панель), что косвенно указывает на отсутствие нарушений в онтогенезе Т-лимфоцитов. а б C57BL/10 1D1b tg №1 1D1b tg №2 CD3 Vβ6 Рисунок 13. Получение первичных трансгенов по β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1. а — Анализ ПЦР-продукта ДНК мышей, рожденных после микроинъекции полноразмерной кДНК β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1, клонированной в экспрессионный вектор hCD2, и мышей первого поколения F1 трансгенной линии 1D1bFM. Pr wt — праймеры к гену CD4; Pr tg – праймеры к гену β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1; 1F1, 2F1, 3F1 – ДНК-матрица мышей поколения F1 трансгенной линии 1D1bFM №1, №2 и №3, соответственно; 1, 2 — ДНК-матрица первичных трансгенов 1D1b №1 и №2; spl – ДНКматрица мыши линии C57BL/6 (негативный контроль); 1D1b — ДНК-матрица экспрессионного вектора hCD2, содержащего полноразмерную кДНК β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 (позитивный контроль). б — Цитофлуориметрический анализ количества CD3+ лимфоцитов (верхняя панель) и экспрессии β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 (нижняя панель) в периферической крови первичных трансгенов 1D1b. C57BL/10 — клетки периферической крови мыши линии C57BL/10; 1D1b tg№1 — клетки периферической крови первичного трансгена 1D1b № 1; 1D1b tg№2 — клетки периферической крови первичного трансгена 1D1b №2. 73 2.2. Получение линий трансгенных мышей на генетической основе линии B10.D2(R101) Исследуемая β-цепь изначально прошла тимусную селекцию в составе TCR на молекулах МНС рекомбинантного гаплотипа H-2g1 мышей B10.D2(R101) (KdIdDb). Первичные трансгены были получены на генетической основе гибридов F1 линии (CBA X C57BL/6), потомство которых имеет смешанную генетическую основу и поэтому непригодно для проведения иммунологических экспериментов. Для перевода трансгена на генетическую основу линии B10.D2(R101) требовалось 7-9 возвратных скрещиваний [Жигачев, Уколов, Билль, 2009]. Оба первичных трансгена были использованы в качестве основателей линии: сублиния 1D1b, ведущая начало от первичного трансгена №1 получила название 1D1bFM, сублиния, основателем которой стал первичный трансген №2 – 1D1bFF. Для выявления в каждом поколении животных, у которых максимальное количество лимфоцитов экспрессирует трансген β-цепи TCR, помимо ПЦР- анализа наличия трансгена в геноме проводили цитофлуориметрическое исследование CD3+ клеток периферической крови трансгенных животных на предмет экспрессии трансгена β-цепи (рис. 14, 15). До поколения F2 количество CD3+V6+ клеток в периферической крови трансгенных животных варьировало достаточно широко (данные не представлены), однако уже в поколении F2 экспрессия трансгена в обеих трансгенных линиях стала стабильной. Животных, несущих трансген в геноме и не экспрессирующих его, мы не обнаружили (данные не представлены). Экспрессия трансгена не приводила к изменению общего количества CD3+ клеток в периферической крови (рис. 14, а). У мышей поколения F2 трансгенной линии 1D1bFM доля периферических CD3+ клеток, экспрессирующих трансген, заметно увеличилась по сравнению с основателем линии и достигла 80% (рис. 14, б). 74 а B10.D2(R101) 1D1bFM F2 CD3 б Vβ6 Рисунок 14. Экспрессия трансгенной β-цепи TCR CD3+ лимфоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFM поколения F2. Цитофлуориметрический анализ количества CD3+ лимфоцитов (а) и экспрессии β-цепи Тклеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 (б) в периферической крови трансгенов 1D1bFM поколения F2. B10.D2(R101) — клетки периферической крови мыши линии B10.D2(R101); 1D1bFM F2 — клетки периферической крови трансгена 1D1FM F2; проанализированы клетки периферической крови 3 контрольных и 6 трансгенных животных; представлены репрезентативные данные одного из трех экспериментов. Похожие закономерности наблюдались и у мышей поколения F2 трансгенной линии 1D1bFF (рис. 15): около 90% CD3+ клеток периферической крови экспрессировали трансген (рис. 15, б). Количество CD3+V6+ клеток у мышей обеих трансгенных линий практически не изменялось далее в ряду поколений (рис. 16, 17). Общее количество CD3+ клеток в периферической крови мышей обеих трансгенных линий не изменено по сравнению с контролем (рис. 16, а, рис. 17, а), что косвенно указывает на способность Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансген, проходить внутритимусную селекцию. 70-80% Т-лимфоцитов периферической крови обеих линий несут трансгенную β-цепь на своей поверхности (рис. 16, б, рис. 17, б). 75 Мы не обнаружили изменений клеточности лимфоидных органов у трансгенных животных линий 1D1bFM и 1D1bFF по сравнению с животными дикого типа. Продолжительность жизни животных обеих трансгенных линий не отличается от продолжительности жизни мышей дикого типа. а B10.D2(R101) 1D1bFF F2 CD3 б Vβ6 Рисунок 15. Экспрессия трансгенной β-цепи TCR CD3+ лимфоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFF поколения F2. Цитофлуориметрический анализ количества CD3+ лимфоцитов (а) и экспрессии β-цепи Тклеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 (б) в периферической крови трансгенов 1D1bFF поколения F2. B10.D2(R101) — клетки периферической крови мыши линии B10.D2(R101); 1D1bFF F2 — клетки периферической крови трансгена 1D1FF F2; проанализированы клетки периферической крови 3 контрольных и 3 трансгенных животных. Таким образом, мы получили две независимые сублинии мышей, трансгенных по β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, на генетической основе линии B10.D2(R101): 1D1bFM и 1D1bFF. Обе линии характеризуются трансгена. стабильной тканеспецифической экспрессией 76 а 50 Кол-во CD3+ клеток, % 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 R101 1D1b FM F2 1D1b FM F7-F8 R101 1D1b FM F2 1D1b FM F7-F8 б 90 Кол-во CD3+Vb6+ клеток, % 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Рисунок 16. Экспрессия трансгенной β-цепи TCR CD3+ лимфоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFМ поколения F7 и F8. Относительное количество CD3+ лимфоцитов (а) и экспрессия β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 (б) в периферической крови трансгенов 1D1bFM поколений F2, F7 и F8. R101 — клетки периферической крови мыши линии B10.D2(R101) (n=7); 1D1bFM F2 — клетки периферической крови трансгена 1D1FM F2 (n=6); 1D1bFM F7-F8 — клетки периферической крови трансгенных мышей 1D1bFM F7 и F8 (n=25). 77 а 80 Кол-во CD3+ клеток, % 70 60 50 40 30 20 10 0 R101 1D1bFF F2 1D1bFF F7 1D1bFF F2 1D1bFF F7 б 100 Кол-во CD3+Vb6+ клеток, % 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 R101 Рисунок 17. Экспрессия трансгенной β-цепи TCR CD3+ лимфоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFF поколения F7. Относительное количество CD3+ лимфоцитов (а) и экспрессия β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 (б) в периферической крови трансгенов 1D1bFF поколений F2 и F7. R101 — клетки периферической крови мыши линии B10.D2(R101) (n=10); 1D1bFF F2 — клетки периферической крови трансгена 1D1FF F2 (n=3); 1D1bFF F7 — клетки периферической крови трансгенных мышей 1D1bFF F7 (n=17). 78 ГЛАВА 3. Развитие и поддержание гомеостаза CD3+ лимфоцитов мышей трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF Известно, что экспрессия трансгенных α- и β-цепей TCR может влиять на прохождение Т-клеткой внутритимусной селекции и, соответственно, на периферический репертуар Т-клеток. В нашем исследовании прежде всего необходимо было оценить, вызывает ли экспрессия трансгенной β-цепи TCR клеток памяти какие-либо нарушения в онтогенезе CD3 + Т-лимфоцитов; существует ли предпочтительная линия дифференцировки (CD4+ или CD8+) трансгенных клеток; сопровождается ли экспрессия β-трансгена изменением соотношения популяций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах; изменяется ли поверхностный активационный фенотип Тклеток под влиянием экспрессии β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти. Все эксперименты были проведены на двух независимых трансгенных сублиниях (1D1bFM и 1D1bFF) для исключения возможных сторонних эффектов трансгенеза на процессы онтогенеза Т-клеток. 3.1 Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF 3.1.1. Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM Мы провели цитофлуориметрический анализ субпопуляций тимоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM по сравнению с тимоцитами мышей B10.D2(R101) (рис. 18). В тимусе трансгенных мышей линии 1D1bFM соотношение двойных негативных CD4—CD8— (DN), двойных позитивных CD4+CD8+ (DP) и однопозитивных CD4+CD8— и CD4—CD8+ (SP) тимоцитов не изменено по сравнению с мышами линии B10.D2(R101) (рис. 18, а). 79 а CD4 B10.D2(R101) 1D1bFM CD8 б B10.D2(R101) 1D1bFM в г д Vβ6 Рисунок 18. Развитие Т-клеток мышей трансгенной линии 1D1bFM. а — Цитофлуориметрический анализ экспрессии маркеров CD4 и CD8 клетками тимуса 80 мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). б, в, г, д — Цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 тимоцитами мышей 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). На рисунке представлен анализ живых CD4+ тимоцитов (CD4+, б), CD8+ тимоцитов (CD8+, в), двойных позитивных CD4+CD8+ (DP, г) и двойных негативных CD4— CD8— (DN, д) тимоцитов. Из анализа исключены конгломераты клеток. B10.D2(R101) — тимоциты мыши линии B10.D2(R101); 1D1bFM — тимоциты мыши трансгенной линии1D1bFM поколения F7; проанализировано 6 контрольных и 6 трансгенных животных; на рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. Соотношение CD4+ и CD8+ тимоцитов у трансгенных животных не нарушено, что означает отсутствие предпочтительной линии дифференцировки трансгенных клеток. Появление трансгенной β-цепи на поверхности тимоцитов коррелирует со стадиями их созревания. Среди двойных негативных тимоцитов практически нет клеток, окрашивающихся антителами к V6 (рис. 18, б). На стадии DP доля клеток, несущих трансгенную β-цепь, значительно возрастает (рис. 18, в). Это связано с тем, что на стадии DP происходит реаранжировка α-цепи и выход на поверхность клетки зрелого TCR в комплексе с молекулой CD3 [Brodeur и др., 2009]. Большая часть однопозитивных CD4+ и CD8+ тимоцитов экспрессирует трансген β-цепи и несет на поверхности его продукт (рис. 18, г, д), что, повидимому, связано с тем, что эспрессия трансгенной β-цепи TCR подавляет реаранжировку эндогенных цепей. Тем не менее, около 20% Т-клеток успевают реаранжировать собственную эндогенную β-цепь и не экспрессируют трансген. Появление комплекса CD3 на поверхности тимоцитов трансгенных животных также коррелирует со стадиями их созревания (рис. 19) и тесно связано с экспрессией трансгена. На стадиях DP и SP экспрессия гена ε-цепи молекулы CD3 трансгенными тимоцитами не отличается от контроля, однако на стадии DN количество трансгенных тимоцитов, экспрессирующих CD3, значительно ниже, чем уровень 81 в контроле (рис. 19, а). Экспрессия CD3 в популяциях однопозитивных CD4+ и CD8+ тимоцитов трансгенных мышей не изменена по сравнению с контролем (рис. 19, в, г), что еще раз подтверждает отсутствие предпочтения в выборе линии дифференцировки трансгенными клетками, т. е. тимоциты, несущие трансгенную β-цепь в комплексе с разнообразными α-цепями успешно проходят внутритимусную селекцию, взаимодействуя с молекулами MHC гаплотипа H-2g1. а B10.D2(R101) 1D1bFM б в г CD3 Рисунок 19. Экспрессия маркера CD3 тимоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFM. 82 Цитофлуориметрический анализ экспрессии маркера CD3 тимоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). На рисунке представлен анализ живых двойных негативных CD4—CD8— (DN, а) тимоцитов, двойных позитивных CD4+CD8+ (DP, б), CD4+ тимоцитов (CD4+, в) и CD8+ тимоцитов (CD8+, г). Из анализа исключены конгломераты клеток. B10.D2(R101) — тимоциты мыши линии B10.D2(R101); 1D1bFM — тимоциты мыши трансгенной линии 1D1bFM поколения F7; проанализировано 6 контрольных и 6 трансгенных животных; представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. 3.1.2.Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFF Соотношение двойных негативных CD4—CD8— (DN), двойных позитивных CD4+CD8+ (DP) и однопозитивных тимоцитов CD4+CD8— и CD4—CD8+ (SP) в тимусе трансгенных мышей линии 1D1bFF не изменено по сравнению с мышами дикого типа (рис. 20, а). Большая часть однопозитивных SP CD4+ и CD8+ тимоцитов эспрессирует трансген на своей поверхности (рис. 20, б, в). Однако, в отличие от тимоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM, экспрессия трансгенной цепи начинается на стадии DN (рис. 20, д). Количество двойных негативных тимоцитов, экспрессирующих комплекс CD3, также снижено у мышей линии 1D1bFF по сравнению мышами линии B10.D2(R101) (рис. 21). По всей видимости, это связано с уменьшением относительного количества γ/δ Т-клеток в тимусе трансгенных животных (рис. 22). Таким образом, трансгенные CD4+ и CD8+ Т-клетки мышей линий 1D1bFM и 1D1bFF успешно проходят тимусную селекцию и предпочтительной линии дифферецировки (CD4 или CD8) для них не существует. Экспрессия трансгенной β-цепи TCR в значительной степени подавляет реаранжировку эндогенных β-цепей и цепей, входящих в состав TCRγ/δ. 83 а CD4 B10.D2(R101) 1D1bFF CD8 б B10.D2(R101) 1D1bFF в г д Vβ6 Рисунок 20. Развитие Т-клеток мышей трансгенной линии 1D1bFF. а — Цитофлуориметрический анализ экспрессии маркеров CD4 и CD8 клетками тимуса 84 мышей трансгенной линии 1D1bFF на генетической основе линии B10.D2(R101). б, в, г, д — Цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 тимоцитами мышей 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). На рисунке представлен анализ живых CD4+ тимоцитов (CD4+, б), CD8+ тимоцитов (CD8+, в), двойных позитивных CD4+CD8+ (DP, г) и двойных негативных CD4— CD8— (DN, д) тимоцитов. Из анализа исключены конгломераты клеток. B10.D2(R101) — тимоциты мыши линии B10.D2(R101); 1D1bFF — тимоциты мыши трансгенной линии 1D1bFM поколения F7; проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных; на рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. B10.D2(R101) 1D1bFF CD3 Рисунок 21. Экспрессия маркера CD3 двойными негативными тимоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFF. Цитофлуориметрический анализ экспрессии маркера CD3 двойными негативными (CD4—CD8 — , DN) тимоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFF на генетической основе линии B10.D2(R101). На рисунке представлен анализ живых одиночных тимоцитов. B10.D2(R101) — тимоциты мыши линии B10.D2(R101); 1D1bFF — тимоциты мыши трансгенной линии 1D1bFF поколения F7; проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных. CD3 B10.D2(R101) 1D1bFF TCRγδ Рисунок 22. γ/δ Т-клетки в тимусе трансгенных животных линии 1D1bFF. 85 Цитофлуориметрический анализ экспрессии TCRγ/δ (CD3+TCRγδ+) двойными негативными (CD4—CD8—) тимоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFF на генетической основе линии B10.D2(R101). На рисунке представлен анализ живых тимоцитов CD4 —CD8—. Конгломераты клеток исключены из анализа. B10.D2(R101) — тимоциты мыши линии B10.D2(R101); 1D1bFF — тимоциты мыши трансгенной линии 1D1bFF поколения F7; проанализировано 2 контрольных и 3 трансгенных животных. 3.2. Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-лимфоцитов мышей трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF После прохождения тимусной селекции трансгенные CD4+ и CD8+ Тклетки выходят на периферию. В нашем исследовании было важно оценить, сохраняют ли они способность рециркулировать, поддерживается ли нормальное соотношение между CD4+ и CD8+ клетками в периферических органах иммунной системы и какая доля клеток в этих популяциях экспрессирует трансген. 3.2.1. Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-клеток мышей линии 1D1bFM Соотношение субпопуляций спленоцитов CD4+ и CD8+ не изменено у животных трансгенной линии 1D1bFM по сравнению с животными дикого типа (рис. 23, а). Трансген экспрессируют обе субпопуляции CD3+ спленоцитов (рис. 23, б, в), однако количество V6+ лимфоцитов несколько меньше в популяции CD4+ спленоцитов (рис. 23, б) по сравнению с популяцией CD8+ (рис. 23, в). Таким образом, CD4+ и CD8+ клетки, экспрессирующие трансген βцепи Т-рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, не только проходят тимусную селекцию, но и успешно рециркулируют на периферии. 86 а CD4 B10.D2(R101) 1D1bFM CD8 б B10.D2(R101) 1D1bFM в Vβ6 Рисунок 23. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM. а — цитофлуориметрический анализ экспрессии молекул CD4 и CD8 одиночными живыми клетками селезенки мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). б, в — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 CD4+ (б) и CD8+ (в) спленоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). B10.D2(R101) — спленоциты линии B10.D2(R101); 1D1bFM — спленоциты мыши трансгенной линии 1D1bFM поколения F7; проанализировано 6 контрольных и 8 трансгенных животных; на рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. Исследуемая β-цепь TCR происходит из Т-клеточного рецептора 87 гибридомы клеток памяти. Мы решили оценить, влияет ли экспрессия β-цепи TCR клеток памяти на поверхностный активационный фенотип периферических Т-лимфоцитов. Мы исследовали экспрессию маркеров клеток памяти CD62L и CD44 в популяциях CD4+ и CD8+ спленоцитов (рис. 24). B10.D2(R101) 1D1bFM CD4+ Т-клетки CD8+ Т-клетки CD62L CD44 Рисунок 24. Поверхностный активационный фенотип периферических CD8+ Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM. Цитофлуориметрический анализ коэкспрессии молекул CD62L и CD44 спленоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). Верхняя панель — цитофлуориметический анализ живых CD8+ спленоцитов; нижняя панель — цитофлуориметрический анализ живых CD4+ спленоцитов. Конгломераты клеток исключены из анализа. B10.D2(R101) — спленоциты линии B10.D2(R101); 1D1bFM — спленоциты мыши трансгенной линии 1D1bFM поколения F7; (относительное количество CD4+ и CD8+ Тлимфоцитов с поверхностным фенотипом CD44—CD62L+ и CD44+CD62L+ у трансгенных мышей достоверно отличается от мышей дикого типа (P < 0.05), проанализировано 6 контрольных животных и 8 трансгенных животных; данные получены в трех независимых экспериментах). Количество лимфоцитов с фенотипом наивных клеток (CD44–CD62L+) у 88 трансгенных животных увеличено по сравнению с контролем как в случае CD8+ лимфоцитов (рис. 24, верхняя панель), так и в случае CD4+ лимфоцитов (рис. 24, нижняя панель) Кроме того, количество клеток с фенотипом долгоживущих клеток памяти (CD44+CD62L+) и эффекторных клеток (CD44+CD62L—) у трансгенных животных снижено по сравнению с контролем. Мы решили сравнить долю активированных Т-клеток в субпопуляциях спленоцитов, экспрессирующих эндогенные цепи TCR (V6—) и трансген (V6+) (рис. 25). У мышей линии B10.D2(R101) дикого типа процентное содержание CD44+ клеток в субпопуляциях V6— и V6+ практически одинаково (рис. 25, а, б). У мышей трансгенной линии 1D1bFM в субпопуляции преобладают Т-клетки с фенотипом CD44+, а в субпопуляции V6— V6+ — Т- лимфоциты с фенотипом наивных Т-клеток CD44—. (рис. 25, в, г). Таким образом, соотношение Т-лимфоцитов с фенотипом наивных и активированных Т-клеток в субпопуляциях Vβ6— и Vβ6+ у мышей линиии 1D1bFM существенно нарушено по сравнению с животными дикого типа. Мы решили исследовать, является ли наблюдаемый феномен особенностью Т-клеток селезенки, или же эти закономерности будут наблюдаться у Тлимфоцитов в других периферических лимфоидных органах. С этой целью мы оценили соотношение CD4+ и CD8+ Т-клеток, а также коэкспрессию маркеров CD62L и CD44 лимфоцитами CD3+ паховых лимфатических узлов мышей трансгенной линии 1D1bFM. Соотношение CD4+ и CD8+ Т-клеток в лимфатических узлах мышей трансгенной линии 1D1bFM не изменено по сравнению с мышами дикого типа (рис. 26, а). Трансген экспрессируют как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоциты (рис. 26, б, в). 89 Vβ6— B10.D2(R101) Vβ6+ CD8+ Т-клетки а CD4+ Т-клетки б Vβ6— 1D1bFM Vβ6+ CD8+ Т-клетки в CD4+ Т-клетки г CD44 Рисунок 25. Поверхностный активационный фенотип Т-лимфоцитов с трансгенной и эндогенными β-цепями TCR. Процентное содержание Т-лимфоцитов с активационным фенотипом (CD44+) в субпопуляциях CD8+Vβ6—, CD8+Vβ6+, CD4+Vβ6— и CD4+Vβ6+ спленоцитов мышей линии 1D1bFM (1D1bFM, в, г) на генетической основе линии B10.D2(R101) по сравнению с линией B10.D2(R101) (B10.D2(R101), а, б). Vβ6— — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+Vβ6— и CD4+Vβ6—; Vβ6+ — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+Vβ6+ и CD4+Vβ6+; а, 90 в — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+; б, г — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD4+; проанализировано 6 контрольных животных и 8 трансгенных животных; данные получены в трех независимых экспериментах). а CD3 B10.D2(R101) 1D1bFM CD4 B10.D2(R101) 1D1bFM CD4+ Т-клетки б CD8+ Т-клетки в Vβ6 Рисунок 26. Поверхностный фенотип Т-клеток лимфатических узлов мышей трансгенной линии 1D1bFM. а — цитофлуориметрический анализ экспрессии молекул CD4 и CD8 одиночными живыми клетками паховых лимфатических узлов мыши трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). б, в — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 CD4+ (б) и CD8+ (в) Т-лимфоцитами паховых 91 лимфатических узлов мыши трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). B10.D2(R101) — Т-лимфоциты B10.D2(R101); 1D1bFM — Т-лимфоциты мыши трансгенной линии 1D1bFM поколения F9; проанализированы клетки 4 контрольных и 4 трансгенных животных; данные получены в двух независимых экспериментах. Вместе с тем, в популяции CD3+V6— большая часть клеток экспрессирует поверхностный маркер CD44, а в популяции CD3+V6+ большая часть лимфоцитов несет поверхностный фенотип наивных клеток (CD44—) (рис. 27). Таким образом, фенотипические особенности, обнаруженные при исследовании CD3+ клеток селезенки мышей трансгенной линии 1D1bFM, идентичны тем, что имеют место и в других периферических лимфоидных органах. Соответственно, наблюдаемый феномен не может быть объяснен особенностями миграции трансгенных Т-клеток. 3.2.2 Поверхностный фенотип периферических CD3+ Т-клеток мышей линии 1D1bFF Чтобы исключить влияние сторонних эффектов трансгенеза на активационный фенотип трансгенных периферических CD3 + лимфоцитов мы сравнили поверхностный фенотип спленоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM с поверхностным фенотипом спленоцитов трансгенной линии 1D1bFF. Мыши обеих линий несут в геноме один и тот же трансген, однако между ними могут существовать различия, обусловленные разным количеством копий трансгена и различными местами интеграции трансгена в геном. Если наблюдаемое нами явление уменьшения доли клеток с поверхностным фенотипом CD44+ среди трансгенных Т-лимфоцитов обусловлено не фактом экспрессии трансгенной β-цепи TCR, а эффектом положения (или числом копий) трансгена, то следует ожидать, что оно не будет воспроизводиться на другой 92 трансгенной линии. Vβ6— B10.D2(R101) Vβ6+ CD8+ Т-клетки а CD4+ Т-клетки б Vβ6— 1D1bFM Vβ6+ CD8+ Т-клетки в CD4+ Т-клетки г CD44 Рисунок 27. Поверхностный активационный фенотип Т-клеток лимфатических узлов мышей линии 1D1bFM. Процентное содержание Т-лимфоцитов с активационным фенотипом (CD44+) в субпопуляциях CD8+Vβ6—, CD8+Vβ6+, CD4+Vβ6— и CD4+Vβ6+ Т-клеток паховых лимфатических узлов мышей линии 1D1bFM (1D1bFM, в, г) на генетической основе линии B10.D2(R101) по сравнению с линией B10.D2(R101) (B10.D2(R101), а, б). Vβ6— — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+Vβ6— и CD4+Vβ6—; Vβ6+ — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+Vβ6+ и CD4+Vβ6+; а, в — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+; б, г — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в 93 субпопуляции CD4+; проанализированы клетки 6 контрольных и 6 трансгенных животных; данные получены в двух независимых экспериментах. Процентное соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов у мышей трансгенной линии 1D1bFF не отличается от такового для мышей дикого типа (рис. 28, а). Трансген экспрессируют и CD4+, и CD8+ лимфоциты (рис. 28, б, в). а CD4 B10.D2(R101) 1D1bFF CD8 б B10.D2(R101) 1D1bFF в Vβ6 Рисунок 28. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFF. а — цитофлуориметрический анализ экспрессии молекул CD4 и CD8 живыми клетками селезенки мышей трансгенной линии 1D1bFF на генетической основе линии B10.D2(R101). 94 Конгломераты клеток исключены из анализа. б, в — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 CD4+ (б) и CD8+ (в) спленоцитами мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101). B10.D2(R101) — спленоциты B10.D2(R101); 1D1bFF — спленоциты мыши трансгенной линии 1D1bFF поколения F7; проанализированы клетки 4 контрольных и 4 трансгенных животных; данные получены в двух независимых экспериментах. Также, как и в тимусе, в селезенке трансгенных животных наблюдается снижение количества γ/δ Т-клеток (рис. 29). CD3 B10.D2(R101) 1D1bFF TCRγδ Рисунок 29. γ/δ Т-клетки в селезенке трансгенных животных линии 1D1bFF. Цитофлуориметрический анализ экспрессии TCRγ/δ (CD3+TCRγδ+) двойными негативными (CD4—CD8—) Т-лимфоцитами селезенки мышей трансгенной линии 1D1bFF на генетической основе линии B10.D2(R101). На рисунке представлен анализ живых Т-лимфоцитов CD4—CD8 — . Конгломераты клеток исключены из анализа. B10.D2(R101) — спленоциты мыши линии B10.D2(R101); 1D1bFF — спленоциты мыши трансгенной линии 1D1bFF поколения F7. Доля клеток с поверхностным фенотипом CD44 + заметно снижена в популяции клеток CD3+V6+ и сильно увеличена в популяции CD3 +V6—, как в случае CD4+, так и в случае CD8+ спленоцитов (рис. 30). Это означает, что увеличение доли клеток с поверхностным фенотипом наивных Т-лимфоцитов в популяции CD3+V6+ не является следствием сторонних эффектов трансгенеза и может объясняться только влиянием экспрессии трансгенной β-цепи T-клеточного рецептора гибридомы 1D1. 95 B10.D2(R101) Vβ6— Vβ6+ CD8+ Т-клетки а CD4+ Т-клетки б Vβ6— 1D1bFF Vβ6+ CD8+ Т-клетки в CD4+ Т-клетки г CD44 Рисунок 30. Поверхностный активационный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей линии 1D1bFF. Процентное содержание Т-лимфоцитов с активационным фенотипом (CD44+) в субпопуляциях CD8+Vβ6—, CD8+Vβ6+, CD4+Vβ6— и CD4+Vβ6+ спленоцитов мышей линии 1D1bFF (1D1bFF, в, г) на генетической основе линии B10.D2(R101) по сравнению с линией B10.D2(R101) (B10.D2(R101), а, б). Vβ6— — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8 +Vβ6— и CD4+Vβ6—; Vβ6+ — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+Vβ6+ и CD4+Vβ6+; а, в — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+; б, г — процентное 96 содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD4+; проанализированы клетки 4 контрольных и 4 трансгенных животных; данные получены в двух независимых экспериментах. 3.3. Поверхностный фенотип тимоцитов и периферических Т-клеток мышей гибридов F1 (1D1bFM X C57BL/10) Исследуемая β-цепь происходит из Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти CD8+, специфичной к молекуле MHC класса I H-2Kb [Звездова и др., 2008]. Мы получили линии мышей 1D1bFM и 1D1bFF, экспрессирующих трансген, на генетической основе линии B10.D2(R101). В этой экспериментальной системе присутствует молекула H-2Kd, но нет молекулы H2Kb, к которой специфичен Т-рецептор исходной гибридомы. Между тем, внесение молекулы H-2Kb в микроокружение трансгенных Т-клеток может изменить процессы тимусной селекции, повлиять на репертуар и поверхностный фенотип периферических Т-клеток. Результат этого эксперимента позволит косвенно судить о вкладе индивидуальной β-цепи в специфичность исходного гетеродимера TCR α/β. Для того, чтобы оценить изменение процессов тимусной селекции и поверхностного фенотипа трансгенных клеток при появление молекулы H-2K b в микрокружении мы получили гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10). Клетки тимуса и селезенки этих мышей окрашивали флуоресцентно мечеными антителами и проводили цитофлуориметрический анализ различных субпопопуляций. 3.3.1. Поверхностный фенотип тимоцитов гибридов F1 (1D1bFM X C57BL/10) Соотношение различных субпопуляций в тимусе трансгенных животных F1 (1D1bFM Х C57BL/10) практически не изменено по сравнению с мышами дикого типа (рис. 31, а). 97 Экспрессия трансгена начинается на стадии DP (рис. 31, в). Большая часть однопозитивных CD4+ и CD8+ тимоцитов экспрессирует трансген (рис. 31, г, д). Общая клеточность тимуса трансгенных животных не изменялась по сравнению с животными дикого типа. Таким образом, наличие молекулы H-2K b в микроокружение тимоцитов не приводит к негативной селекции трансгенных Тклеток. 3.3.2. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов гибридов F1 (1D1bFM X C57BL/10) Как и в тимусе, в селезенке трансгенных мышей F 1 (1D1bFM Х C57BL/10) соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов не отличается от мышей дикого типа (рис. 32, а). Трансген экспрессируют обе субпопуляции Т-клеток (рис. 32, б, в). Общая клеточность селезенки трансгенных животных не изменяется по сравнению с животными дикого типа (данные не представлены). Таким образом, наличие молекулы H-2Kb в микроокружении трансгенных клеток не влияет на поддержание их гомеостаза в периферических лимфоидных органах. Можно было ожидать, что появление молекулы H-2K b в микроокружении трансгенных Т-клеток приведет к их активации из-за появления лиганда с высокой аффинностью взаимодействия с трансгенным TCR. Тем не менее, большая часть трансгенных Т-лимфоцитов, имела фенотип наивных клеток CD44 — (рис. 33). Практически все Т-лимфоциты, экспрессирующие эндогенные β-цепи TCR, находились в активированном состоянии CD44+. Таким образом, наличие молекулы MHC H-2Kb в микроокружении трансгенных Т-клеток не влияет на их поверхностный активационный фенотип. Это может означать, что исследуемая β-цепь TCR не вносила существенного вклада в специфичность исходного гетеродимера TCR α/β. 98 а CD4 WT TG CD8 б WT TG в г д Vβ6 Рисунок 31. Развитие Т-клеток в тимусе трансгенных мышей F1 (1D1bFM Х C57BL/10). а — Цитофлуориметрический анализ экспрессии маркеров CD4 и CD8 клетками тимуса гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10). 99 б, в, г, д — Цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 тимоцитами гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10). На рисунке представлен анализ живых двойных негативных CD4—CD8— (DN, б), двойных позитивных CD4+CD8+ (DP, в), CD8+ (CD8+, г) и CD4+ тимоцитов (CD4+, б). Конгломераты клеток исключены из анализа. WT — тимоциты мыши дикого типа F1 (1D1bFM Х C57BL/10); TG — тимоциты трансгенной мыши F1 (1D1bFM Х C57BL/10); проанализировано 4 контрольных и 4 трансгенных животных; данные получены в двух независимых экспериментах. а CD4 WT TG CD8 б в Vβ6 Рисунок 32. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10). а —цитофлуориметрический анализ экспрессии молекул CD4 и CD8 живыми клетками селезенки гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10). Конгломераты клеток исключены из анализа. б, в — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 CD4+ (б) и CD8+ (в) спленоцитами гибридов F1 100 (1D1bFM Х C57BL/10). WT — спленоциты мыши дикого типа F1 (1D1bFM Х C57BL/10); TG — спленоциты трансгенной мыши F1 (1D1bFM Х C57BL/10); проанализировано 5 контрольных и 5 трансгенных животных; данные получены в двух независимых экспериментах. WT Vβ6- Vβ6+ CD4+ Т-клетки а CD8+ Т-клетки б TG Vβ6- Vβ6+ CD4+ Т-клетки в CD8+ Т-клетки г CD44 Рисунок 33. Поверхностный активационный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10). 101 Процентное содержание Т-лимфоцитов с активационным фенотипом (CD44+) в субпопуляциях CD8+Vβ6—, CD8+Vβ6+, CD4+Vβ6— и CD4+Vβ6+ спленоцитов трансгенных мышей гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10) (TG) по сравнению с гибридами гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10) дикого типа (WT). Vβ6— — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8 +Vβ6— и CD4+Vβ6—; Vβ6+ — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+Vβ6+ и CD4+Vβ6+; а, в — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD8+; б, г — процентное содержание CD44+ лимфоцитов в субпопуляции CD4+; проанализированы клетки 5 контрольных и 5 трансгенных животных; данные получены в двух независимых экспериментах. 102 ГЛАВА 4. Т-лимфоциты мышей трансгенной линии 1D1bFF в условиях лимфопении Мы установили, что профиль экспрессии поверхностных активационных маркеров в Т-клетках трансгенных животных зависит от структуры TCR индивидуального клона Т-лимфоцитов: Т-лимфоциты, экспрессирующие эндогенные цепи TCR, обладают поверхностным фенотипом активированных клеток, в то же время большинство Т-клеток с трансгенной цепью имеет «наивный» фенотип. Однако, механизмы, определяющие приобретение Тклеткой определенного поверхностного фенотипа, остаются неясными. Хорошо известно, что сигнал, необходимый для выживания и поддержания гомеостаза, периферические «своими» комплексами Т-лимфоциты получают, взаимодействуя со MHC/пептид [Kirberg, Berns, von Boehmer, 1997]. У животных трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF происходит уменьшение репертуара Т-клеточных рецепторов из-за экспрессии «инвариантной» β-цепи, что, очевидно, должно приводить к сужению спектра комплексов MHC/пептид, с которыми могут взаимодействовать трансгенные Т-клетки. Таким образом, следовало ожидать, что у трансгенных животных индивидуальные клоны Тлимфоцитов с трансгенной β-цепью конкурируют за ограниченное количество комплексов MHC/пептид, необходимых для их выживания на периферии. Мы предположили, что «наивный» фенотип Т-лимфоцитов с трансгенной цепью формируется именно из-за нехватки сигналов, получаемых Т-клеткой при взаимодействии с эндогенными комплексами MHC/пептид. Для проверки этой гипотезы мы решили снизить конкуренцию Т-клеток с трансгенной β-цепью в организме животных линии 1D1bFF. Мы подвергли мышей сублетальному облучению, таким образом значительно уменьшив количество Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах. Через 3 и 10 дней после сублетального облучения мы выделяли клетки селезенки, окрашивали их флуоресцентно мечеными антителами и анализировали соотношение 103 различных популяций Т-лимфоцитов в организме трансгенных животных по сравнению с животными дикого типа. Через 3 дня после сублетального облучения соотношение CD4+ и CD8+ Тлимфоцитов в селезенке трансгенных животных не отличается от такового у мышей дикого типа (рис. 34, а). Уменьшается количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансгенную β-цепь TCR в популяциях CD4+ и CD8+ Т-клеток (рис 34, б, в). Интактные а CD4 B10.D2(R101) Облученные 1D1bFF B10.D2(R101) 1D1bFF CD8 б в Vβ6 Рисунок 34. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFF через 3 дня после сублетального облучения. а — соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке интактных и облученных мышей линии 1D1bFF по сравнению с животными линии B10.D2(R101); б, в — экспрессия трансгенной β-цепи TCR CD4+ (б) и CD8+ (в) Т-лимфоцитами селезенки интактных и облученных мышей линии 1D1bFF по сравнению с животными линии B10.D2(R101); Цитофлуориметрический анализ проведен через 3 дня после сублетального облучения 104 животных. Проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных. То есть, Т-лимфоциты с эндогенными цепями Т-клеточного рецептора имеют некоторое преимущество в выживании по сравнению с Т-клетками с трансгенной β-цепью. Возможно, это вызвано тем, что активированные Т- лимфоциты более радиорезистентны по сравнению с наивными Т-клетками [Yao и др., 2011] и, соответственно, лучше выживают при сублетальном облучении. Через 10 дней после сублетального облучения соотношение Т-клеток с трансгенной и эндогенными видимости, обусловлено β-цепями TCR восстанавливается, что, по всей гомеостатической пролиферацией Т-клеток с трансгенной цепью TCR, ограничителем для которой служит доступность комплексов MHC/пептид (рис. 35, б, в). а CD4 Интактные B10.D2(R101) Облученные 1D1bFF B10.D2(R101) 1D1bFF CD8 б в Vβ6 Рисунок 35. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFF через 10 дней после сублетального облучения. 105 а — соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке интактных и облученных мышей линии 1D1bFF по сравнению с животными линии B10.D2(R101); б, в — экспрессия трансгенной β-цепи TCR CD4+ (б) и CD8+ (в) Т-лимфоцитами селезенки интактных и облученных мышей линии 1D1bFF по сравнению с животными линии B10.D2(R101); Цитофлуориметрический анализ проведен через 10 дней после сублетального облучения животных. Проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных. Это подтверждается тем, что в условиях лимфопении большая часть Тклеток с трансгенной β-цепью приобретает поверхностный фенотип CD44+ (рис. 36, б). а Интактные CD62L R101 Vβ6- 1D1bFF Vβ6+ Vβ6- Vβ6+ CD44 б Облученные CD62L R101 Vβ6- 1D1bFF Vβ6+ Vβ6- Vβ6+ CD44 Рисунок 36. Поверхностный активационный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFF через 3 дня после сублетального облучения. Коэкспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L CD8+ Т-клетками селезенки интактных (а) и облученных (б) мышей линии 1D1bFF по сравнению с животными линии B10.D2(R101). Цитофлуориметрический анализ проведен через 3 дня после сублетального облучения животных. Проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных. Приобретение фенотипа активированных клеток оказывается достаточно 106 стабильным и сохраняется, так же, как и у мышей дикого типа, через 10 дней после сублетального облучения (рис. 37, б). Интактные а B10.D2(R101) 1D1bFF CD62L Vβ6- Vβ6+ Vβ6- Vβ6+ CD44 Облученные б B10.D2(R101) CD62L Vβ6- 1D1bFF Vβ6+ Vβ6- Vβ6+ CD44 Рисунок 37. Поверхностный активационный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFF через 10 дней после сублетального облучения. Коэкспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L CD8+ Т-клетками селезенки интактных (а) и облученных (б) мышей линии 1D1bFF по сравнению с животными линии B10.D2(R101). Цитофлуориметрический анализ проведен через 10 дней после сублетального облучения животных. Проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных. Таким образом, поверхностный фенотип наивных Т-клеток, характерный для трансгенных Т-лимфоцитов не является неизменным и способен меняться в зависимости от условий, в которых оказалась Т-клетка. По всей видимости, сигналом для изменения поверхностного фенотипа служит снижение конкуренции за эндогенные комплексы MHC/пептид между различными клонами Т-клеток, несущих трансгенную β-цепь TCR. 107 ГЛАВА 5. Первичный аллогенный ответ Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM in vitro Практически все Т-лимфоциты, экспрессирующие трансген β-цепи TCR гибридомы 1D1, имеют поверхностный фенотип наивных Т-клеток. В состоянии лимфопении трансгенные CD8+ Т-клетки приобретают активационный поверхностный фенотип, т. е. «наивный» фенотип не является их неотъемлемым свойством, и в определенных физиологических условиях эти клетки способны активироваться. В то же время, Т-лимфоциты, экспрессирующие эндогенные βцепи TCR, всегда находятся в активированном состоянии. При исследовании функциональных свойств CD8+ Т-клеток трансгенных животных необходимо прежде всего определить, способны ли Т-клетки, экспрессирующие трансгенную β-цепь, к полноценному иммунному ответу и «наследуют» ли они специфичность исходного гетеродимера TCR α/β. Т-клеточный рецептор гибридомы 1D1, из которой была клонирована исследуемая β-цепь, специфичен к молекуле MHC I класса H-2Kb. Мы решили исследовать пролиферативный ответ in vitro спленоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM на спленоциты линий C57BL/10 (KbI-AbDb), обработанные цитостатиком митомицином С (рис. 38). Оказалось, что первичный иммунный ответ спленоцитов трансгенных животных на спленоциты линии C57BL/10 снижен по сравнению с мышами дикого типа. Более того, ответ на сторонние аллогенные стимуляторы FVB (KqIAqI-EqDq) также заметно снижен по сравнению с мышами дикого типа. Таким образом, стало ясно, что трансгенные Т-лимфоциты, экспрессирующие β-цепь Tклеточного рецептора гибридомы 1D1, во-первых, не сохраняют специфичность исходного гетеродимера TCR α/β, и, во-вторых, их способность отвечать на аллоантигены снижена. В организме трансгенных животных существуют две популяции CD8+ спленоцитов с различным уровнем экспрессии поверхностных активационных 108 маркеров: Т-клетки, экспрессирующие эндогенные β-цепи TCR, и Т-лимфоциты с трансгенной β-цепью. Мы решили оценить вклад этих субпопуляций в аллогенный иммунный ответ. Спленоциты мышей линии 1D1bFM были использованы в качестве отвечающей популяции в реакции смешанной культуры лимфоцитов. В качестве стимулирующей популяции использовали спленоциты мышей линий C57BL/10 (KbI-AbDb) и FVB (KqI-AqI-EqDq). Через 72 часа после постановки реакции мы окрашивали клетки флуоресцентно меченными моноклональными антителами и анализировали популяцию живых бластных клеток на проточном цитофлуориметре. 35000,0 уровень пролиферации, cpm 30000,0 25000,0 20000,0 R101 1D1bFM 15000,0 10000,0 5000,0 0,0 R101 1D1bFM BL10 FVB Стимуляторы Рисунок 38. Пролиферация смешанной культуры лимфоцитов мышей линии 1D1bFM в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С. В качестве отвечающей популяции использованы спленоциты мышей линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (1D1bFM) и спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (R101). В качестве стимулирующей популяции использовали спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (R101); 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (1D1bFM); C57BL/10 (BL10); FVB (FVB). Пролиферацию определяли через 72 часа по включению 3Н-тимидина, внесенного в культуру в последние 8 часов инкубации. На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. Как и следовало ожидать, в реакции смешанной культуры спленоцитов 109 (MLR) мышей линии 1D1bFM на различные стимуляторы образуется значительно меньше бластных клеток по сравнению со спленоцитами линии B10.D2(R01) (рис. 39). Сингенные стимуляторы Аллогенные стимуляторы SSC-A б д е 1D1bFM в C57BL/10 г FVB B10.D2(R101) а B10.D2(R101) з 1D1bFM ж FSC-A Рисунок 39. Цитофлуориметрический анализ относительного количества бластных клеток, образующихся в реакции смешанной культуры лимфоцитов в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С. В качестве отвечающей популяции использованы спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (аг) и 1D1bFM (д-з). В качестве стимулирующей популяции использованы: спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (а, д); спленоциты мышей линии 1D1bFM (б, е); спленоциты мышей линии C57BL/10 (в, ж) и спленоциты мышей линии FVB (г, з). Относительное количество бластных клеток оценивали через 72 часа после постановки реакции. Популяцию бластных клеток выделяли по показателям прямого и бокового рассеивания. Относительное количество CD8+ бластов в MLR спленоцитов мышей линии 1D1bFM также снижено по сравнению с мышами дикого типа (рис. 40). Мы решили выяснить, изменяется ли в аллогенной реакции соотношение между популяциями CD8+V6+ (клетки, экспрессирующие трансгенную β-цепь) и CD8+V6— (клетки, экспрессирующие эндогенные цепи TCR). Оказалось, что в 110 аллогенной MLR снижается количество клеток, экспрессирующих трансгеннную β-цепь TCR, а клеток CD8+V6— становится больше (рис. 41). Таким образом, во время первичного аллогенного ответа in vitro Тлимфоциты, экспрессирующие эндогенные цепи TCR получают преимущество перед клетками, экспрессирующими трансген. CD4 B10.D2(R101) б 1D1bFM Аллогенные стимуляторы в C57BL/10 г FVB B10.D2(R101) а Сингенные стимуляторы е ж з 1D1bFM д CD8 Рисунок 40. Цитофлуориметрический анализ относительного количества CD4+ и CD8+ Тклеток в популяции бластов, образующейся в реакции смешанной культуры лимфоцитов в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С. В качестве отвечающей популяции использованы спленоциты мышей линии D10.D2(R101) (аг) и мышей линии 1D1bFM (д-з). В качестве стимулирующей популяции использованы: спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (а, д); спленоциты мышей линии 1D1bFM (б, е); спленоциты мышей линии C57BL/10 (в, ж); спленоциты мышей линии FVB (г, з). Относительное количество CD4+ и CD8+ клеток в популяции бластов оценивали через 72 часа после постановки реакции. 111 Сингенные стимуляторы B10.D2(R101) б 1D1bFM в C57BL/10 г FVB B10.D2(R101) а Аллогенные стимуляторы е ж з 1D1bFM д Vβ6 Рисунок 41. Цитофлуориметрический анализ относительного количества Vb6+ и Vb6— CD8+ бластов, образующихся в реакции смешанной культуры спленоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С. В качестве отвечающей популяции использованы спленоциты мышей B10.D2(R101) (а-г) и спленоциты мышей линии 1D1bFM (д-з). В качестве стимуляторов использованы: спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (а, д); спленоциты мышей линии 1D1bFM (б, е); спленоциты мышей линии C57BL/10 (в, ж); спленоциты мышей линии FVB (г, з). Цитофлуориметрический анализ проведен через 72 часа после постановки реакции. 112 ГЛАВА 6. Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей линии 1D1bFM на клетки аллогенной опухоли in vivo Исследуемая β-цепь происходит из TCR гибридомы клеток памяти 1D1, полученной в аллогенном ответе Т-лимфоцитов мышей линии B10.D2(R101) на клетки тимомы EL-4. Мы установили, что Т-клетки, экспрессирующие трансгенную β-цепь, не сохраняют специфичность исходной гибридомы и первичный аллогенный ответ CD8+ Т-клеток мышей трансгенной линии 1D1bFM in vitro снижен по сравнению с животными дикого типа. Следующим этапом стало исследование возможности иммунного ответа Т-лимфоцитов трансгенной линии 1D1bFM на клетки тимомы EL-4 in vivo. 6.1. Первичный аллогенный ответ спленоцитов мышей линии 1D1bFM на клетки тимомы EL-4 in vivo Мышам линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (KdIAdI-EdDb) вводили внутрибрюшинно 20 млн. клеток тимомы EL-4 (KbDb). Через 12 дней выделяли иммунизированных клетки мышей селезенки и интактных оценивали и предварительно относительное количество активированных CD8+ Т-лимфоцитов. При иммунном ответе на клетки аллогенной опухоли у трансгенных животных, так же, как и у мышей дикого типа увеличивается относительное количество CD8+ Т-лимфоцитов (рис. 42, а, в). Однако доля клеток-эффекторов (CD44+CD62L—) среди CD8+ Т-лимфоцитов с трансгенной β-цепью TCR у животных линии 1D1bFM была значительно меньше, чем среди Т-лимфоцитов CD8+ мышей дикого типа (рис. 43, а, г). Кроме того, у трансгенных животных практически не изменялась доля активированных клеток среди Т-лимфоцитов CD8+, экспрессирующих эндогенные β-цепи Тклеточного рецептора (CD8+Vβ6—). 113 B10.D2(R101) CD4 а Intact +EL-4 CD8 б Vβ6 1D1bFM CD4 в Intact +EL-4 CD8 г Vβ6 Рисунок 42. Соотношение CD8+ и CD4+ Т-клеток в иммунном ответе мышей линии 1D1bFM на клетки аллогенной опухоли in vivo. Цитофлуориметрический анализ относительного количества CD4+ и CD8+ Т-клеток (а, в) и экспрессии трансгенной β-цепи (б, г) CD8+ Т-лимфоцитами интактных и иммунных мышей линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (в, г) по сравнению с мышами линии B10.D2(R101) (а, б). Левая панель — интактные животные; правая панель — животные, иммунизированные тимомой EL-4. Проанализировано 6 контрольных и 6 114 трансгенных животных. Представлены репрезентативные данные одного из 3 независимых экспериментов. B10.D2(R101) CD62L а Интактные +EL-4 CD8+Vβ6— б CD8+Vβ6+ CD44 1D1bFM CD62L в Интактные +EL-4 CD8+Vβ6— г CD8+Vβ6+ CD44 Рисунок 43. Относительное количество клеток-эффекторов в иммунном ответе мышей линии 1D1bFM на клетки аллогенной опухоли in vivo. Цитофлуориметрический анализ коэкспрессии маркеров CD44 и CD62L CD8+ Т-клетками селезенки интактных (левая панель) и предварительно иммунизированных (правая панель) животных линии 1D1bFM (в, г) по сравнению с животными дикого типа (а, б). а, в — Т- 115 лимфоциты, экспрессирующие эндогенные β-цепи TCR (CD8+Vβ6—); б — Т-лимфоциты, экспрессирующие β-цепь семейства Vβ6 (CD8+Vβ6+); г — Т-лимфоциты, экспрессирующие трансгенную β-цепь TCR (CD8+Vβ6+). Проанализировано 6 контрольных и 6 трансгенных животных. В процессе иммунного ответа на клетки тимомы EL-4 в организме трансгенных животных формируется пул клеток-эффекторов с трансгенной β-цепью. Однако размеры этого пула значительно меньше чем у животных дикого типа. В первичном аллогенном ответе in vitro соотношение Т-клеток с трансгенной β-цепью и эндогенными цепями TCR несколько изменялось в пользу Vβ6— Т-клеток. Чтобы установить, является ли это особенностью экспериментальной системы in vitro, или происходит также при аллогенном иммунном ответе in vivo, мы исследовали относительное количество Vβ6+ и Vβ6 — CD8+ Т-клеток в периферической крови трансгенных животных через 16 дней после иммунизации клетками аллогенной опухоли (рис. 44). В периферической крови животных линии 1D1bFM снижается количество CD8+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансген, и возрастает количество Т-клеток с эндогенными βцепями TCR. Через 32 дня после иммунизации клетками тимомы EL-4 в периферической крови трансгенных животных соотношение CD4+ и CD8+ Тклеток остается значительно измененным по сравнению с контролем; наблюдается снижение относительного количества Т-клеток с трансгенной βцепью в периферической крови, как среди CD8+, так и среди CD4+ Т- лимфоцитов. При этом доля CD4+Vβ6+ Т-лимфоцитов снижается наиболее заметно (рис. 45). Через 32 дня после иммунизации тимомой EL-4 в периферической крови мышей линии 1D1bFM видно появление популяции крупных, высокогранулярных клеток (рис. 46, а). Такие бластные клетки составляют значительную часть популяции CD4+, но не CD8+ Т-лимфоцитов периферической крови животных линии 1D1bFM (рис. 46, б, в). Можно 116 предположить, что в организме трансгенных мышей происходит диссеминированный рост тимомы EL-4 CD4+. CD4 а B10.D2(R101) Интактные +EL-4 CD8 б Vβ6 CD4 1D1bFM Интактные +EL-4 в CD8 г Vβ6 Рисунок 44. Относительное количество CD8+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансген, в периферической крови мышей линии 1D1bFM через 16 дней после иммунизации клетками аллогенной опухоли. 117 а, в — цитофлуориметрический анализ экспрессии молекул CD4 и CD8 одиночными живыми Т-клетками периферической крови интактных животных (левая панель) и через 16 дней после иммунизации клетками аллогенной опухоли (правая панель). б, г — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 CD8+ Т_лимфоцитами периферической крови интактных животных (левая панель) и через 16 дней после иммунизации клетками аллогенной опухоли (правая панель). B10.D2(R101) — спленоциты линии B10.D2(R101); 1D1bFM — спленоциты мыши трансгенной линии 1D1bFM поколения F9; проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных. 1D1bFM CD4 а Интактные + EL-4 CD8 б в Vβ6 Рисунок 45. Относительное количество CD8+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансген, в периферической крови мышей линии 1D1bFM через 32 дня после иммунизации клетками аллогенной опухоли. а — цитофлуориметрический анализ экспрессии молекул CD4 и CD8 одиночными живыми Т- 118 клетками периферической крови животных линии 1D1bFM; б — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 CD8+ Т_лимфоцитами периферической животных линии 1D1bFM; в — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 CD4+ Т_лимфоцитами периферической животных линии 1D1bFM; Левая панель — интактные животные; правая панель — животные через 32 дня после введения клеток аллогенной тимомы EL-4. SSC-A а Интактные +EL-4 б в FSC-A Рисунок 46. Появление популяции крупных высокогранулярных клеток в крови мышей линии 1D1bFM через 32 дня после иммунизации клетками аллогенной опухоли. Цитофлуориметрический анализ показателей прямого и бокового светорассеивания клеток 119 периферической крови мышей линии 1D1bFM, интактных (левая панель) и через 32 дня после иммунизации клетками тимомы EL-4 (правая панель). а — мононуклеары периферической крови; б — CD3+CD8+ Т-клетки периферической крови; в — CD3+CD4+ Т-клетки периферической крови. Это означает, что снижение количества CD4+ Т-клеток с трансгенной цепью TCR в периферической крови может быть обусловлено не только преимущественным ответом Т-клеток, экспрессирующих эндогенные β-цепи TCR, или гибелью Vβ6+ CD3+ Т-лимфоцитов в процессе иммунного ответа, но и появлением в крови опухолевых клеток. Таким образом, в процессе иммунного ответа Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM на клетки аллогенной опухоли in vivo в периферической крови трансгенных животных снижается относительное количество CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансгенную βцепь TCR. Наиболее значительное снижение относительного количества Тклеток, экспрессирующих трансген, наблюдается в субпопуляции CD4+ Тлимфоцитов, что может быть связано с диссеминированным ростом тимомы EL-4 CD4+ в организме трансгенных животных. 6.2. Продолжительность жизни трансгенных мышей линии 1D1bFM, иммунизированных аллогенной опухолью Пул эффекторных Т-клеток, формирующийся в процессе иммунного ответа на клетки тимомы EL-4, у трансгенных животных значительно сокращен по сравнению с животными дикого типа. Остается неясным, достаточен ли его размер для эффективного отторжения клеток тимомы. Для исследования этого вопроса мышам трансгенной линии 1D1bFM (H2Kd) вводили внутрибрюшинно 20 млн. клеток тимомы EL-4 (H2-Kb). В качестве контроля использовали мышей линии B10.D2(R101) дикого типа (H2-Kd), которых также иммунизировали тимомой EL-4. В ходе эксперимента оценивали 120 продолжительность жизни трансгенных животных, иммунизированных тимомой EL-4 по сравнению с мышами дикого типа. Оказалось, что 90% трансгенных животных, иммунизированных тимомой EL-4, погибает в течение 80 дней после введения тимомы (рис. 47), причем пик гибели приходится на 40-60 дни после введения аллогенной опухоли. Гибели мышей дикого типа после иммунизации тимомой EL-4 зафиксировано не было. Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM на клетки аллогенной тимомы EL-4 недостаточен для ее эффективного отторжения. Популяция CD8+ Т-лимфоцитов с эндогенными цепями TCR обладает поверхностным фенотипом клеток-эффекторов, однако не способна полностью очистить организм от клеток аллогенной опухоли. 120 Выжившие животные, % 100 80 60 40 20 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 79 Время, дни 1D1bFM+EL-4 (n=9) B10.D2(R101)+EL-4 (n=9) Рисунок 47. Продолжительность жизни мышей трансгенной линии 1D1bFM после иммунизации клетками тимомы EL-4. 1D1bFM+EL-4 — мыши трансгенной линии 1D1bFM, иммунизированные клетками тимомы EL-4; B10.D2(R101)+EL-4 — мыши линии B10.D2(R101), иммунизированные клетками тимомы EL-4. Проанализировано 9 опытных и 9 контрольных животных. 121 6.3. Селекция опухолевых клеток в организме трансгенных животных Гаплотип главного комплекса гистосовместимости мышей B10.D2(R101) отличается от гаплотипа MHC тимомы EL-4 линии аллелями генетических локусов K и I главного комплекса гистосовместимости. Продукты локуса I (молекулы MHC класса II) клетки тимомы не экспрессируют и поэтому различия в главных трансплантационных антигенах сводятся к различиям продуктов, кодируемых локусом K — клетки тимомы EL-4 экспрессируют молекулу MHC I класса H-2Kb, а клетки организма мышей линии 1D1bFM молекулу H-2Kd. Этого достаточно для развития полноценного иммунного ответа, отторжения опухоли и формирования пула долгоживущих клеток памяти. Мыши трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101) оказались неспособны к эффективной элиминации опухолевых клеток. Тем не менее, как правило, тимома EL-4 развивается в организме животных линии 1D1bFM значительно медленнее, чем в организме сингенных животных. Это связано с тем, что клетки тимомы находятся под давлением иммунного ответа, который недостаточен для полного отторжения опухоли, однако способен вызвать процессы селекции опухолевых клеток. Поскольку тимома EL-4, в отличие от клеток организма мышей линии 1D1bFM, экспрессирует другую аллельную форму молекулы MHC I класса H-2K, мы предположили, что селекция опухолевых клеток пойдет по пути утраты экспрессии молекулы H- 2Kb. Из асцита брюшной полости мышей линии 1D1bFM мы выделили опухолевые клетки и проанализировали экспрессию молекулы H-2Kb. В качестве контроля были использованы клетки тимомы EL-4, выделенные из асцита брюшной полости мыши линии C57BL/10. Клетки тимомы EL-4, выделенные из асцита брюшной полости мышей линии 1D1bFM полностью утратили молекулу H-2Kb MHC I класса на своей поверхности (рис. 48). Полученная сублиния тимомы EL-4 получила название EL-4.1b. Утрата 122 экспрессии молекулы MHC I класса оказалась стабильной: поверхностный фенотип сохранялся через 21 день культивирования in vitro (рис. 49). Продолжительность жизни мышей линии C57BL/10 после внутрибрюшинного введения сублинии тимомы EL-4.1b не отличалась от продолжительности жизни мышей после введения тимомы дикого типа (рис. 50). Kb Рисунок 48. Экспрессия молекулы H-2Kb MHC I класса клетками тимомы EL-4, прошедшими иммунную селекцию в организме трансгенных животных. Сплошная линия — клетки тимомы EL-4 выделены из асцита брюшной полости мыши линии 1D1bFM на генетической основе B10.D2(R101). Пунктирная линия — клетки тимомы EL-4 выделены из асцита брюшной полости мыши линии C57BL/10; Kb Рисунок 49. Экспрессия молекулы H-2Kb MHC I класса клетками тимомы EL-4.1b после 21 дня культивирования in vitro. сплошная линия — клетки тимомы EL-4.1b; пунктир — клетки тимомы EL-4. 123 Средняя продолжительность жизни, дни 19 17 15 13 11 9 7 5 3 1 C57BL/10+EL-4 (n=6) Рисунок 50. Средняя C57BL/10+EL-4.1b (n=6) продолжительность жизни мышей линии C57BL/10 после внутрибрюшинного введения клеток тимомы EL-4.1b. C57BL/10+EL-4 — мышам линии C57BL/10 вводили внутрибрюшинно клетки тимомы EL-4 (n=6); C57BL/10+EL-4.1b — мышам линии C57BL/10 вводили внутрибрюшинно клетки сублинии тимомы EL-4.1b (n=6). Таким образом, под давлением иммунного ответа Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе линии B10.D2(R101) происходит стабильная потеря экспрессии молекулы H-2Kb MHC I класса клетками тимомы EL-4. Эта экспериментальная система может быть использована опухолевых клеток. в качестве модели иммунной селекции 124 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Среди периферических Т-лимфоцитов CD8+ можно обнаружить несколько субпопуляций клеток с различными функциональными характеристиками: наивные Т-клетки, ранее не встречавшиеся со специфическим антигеном; активированные эффекторные Т-клетки, чьей функцией является уничтожение инфицированных и трансформированных клеток организма; Т-клетки памяти — сформировавшийся по окончании иммунного ответа небольшой пул Тлимфоцитов, способных к ускоренному ответу на специфический антиген. Для идентификации различных субпопуляций Т-клеток обычно используют два подхода. Первый из них нацелен на оценку функциональных особенностей, отличающих клетки памяти от наивных клеток в тестах in vivo и in vitro. В частности, ранее в нашей лаборатории была разработана тест-система для обнаружения аллоспецифичных клеток памяти [Казанский и др., 1999] . Второй подход – наиболее удобный и широко распространенный — основывается на определении специфических поверхностных маркеров. Для определения функционально различных субпопуляций у мышей наиболее часто оценивают плотность поверхностных маркеров CD44 и CD62L. По профилю экспрессии маркера CD44 Т-клетки CD8+ подразделяют на наивные (CD44—) и активированные (CD44+) [Budd и др., 1987] [Curtsinger, Lins, Mescher, 1998]. В популяции CD44+ Т-лимфоцитов, в свою очередь присутствуют центральные клетки памяти (CD44+CD62L+) и эффекторные (CD44+CD62L—) [Tussey и др., 2000] [Laouar и др., 2008]. Известно, что в ходе иммунного ответа наивные Т-лимфоциты CD44— CD62L+ приобретают поверхностный фенотип эффекторов CD44+CD62L— и затем клеток памяти CD44+CD62L+. До недавнего времени принято было считать однозначным соответствие поверхностного фенотипа клеток их функциональным свойствам. Тем не менее, неясно, отражает ли экспрессия этих маркеров реальный статус функционирования Т-клетки как эффектора или клетки памяти, 125 поскольку появляющиеся в последние годы данные говорят об отсутствии жесткой взаимосвязи между поверхностным фенотипом и функциональными характеристиками клетки. В частности, показано, что в организме могут появляться так называемые «виртуальные» клетки памяти (virtual memory cells), несущие маркеры клеток памяти без встречи со специфическим антигеном [Haluszczak и др., 2009] [Akue, Lee, Jameson, 2012]. Кроме того, во время гомеостатической пролиферации CD3+ клеток в условиях лимфопении развивается особая популяция CD8+ Т-клеток – популяция «memory-like» клеток (клетки, подобные клеткам памяти, TML) [Goldrath, Bogatzki, Bevan, 2000]. Для этих клеток характерно наличие профиля экспрессии поверхностных маркеров, совпадающего с профилем экспрессии «истинных» клеток памяти, однако данные об их функциональной активности остаются противоречивыми. В ряде работ с использованием Т-лимфоцитов с трансгенным Т-клеточным рецептором показано появление функциональных свойств клеток памяти у трансгенных клеток, помещенных в условия лимфопении (усиленная пролиферация, продукция IFN-γ и появление цитотоксической активности в ответ на антигенную стимуляцию) [Cho и др., 2000] [Moxham et al., 2008). Показано также существование популяции CD8+CD44+ Т-лимфоцитов с иммуносупрессорными свойствами [Suzuki и др., 2008]. Таким образом, вопрос о соответствии поверхностного активационного фенотипа и функциональных характеристик Тклетки остается открытым. Функциональные особенности Т-клеток памяти в условиях лимфопении Мы предположили, что поверхностная молекула CD44 является скорее маркером гомеостатической пролиферации Т-клеток, чем свидетельством их принадлежности к пулу истинных Т-клеток памяти. Как уже было сказано выше, ранее в нашей лаборатории была разработана методика, позволяющая селективно стимулировать вторичный иммунный ответ аллоспецифичных Т-клеток памяти, 126 что позволяет их обнаружить и оценить функциональные свойства по пролиферации в ответ на аллогенные стимуляторы, убитые острым тепловым шоком. Наивные Т-клетки, ранее не встречавшие антиген к такому ответу не способны. [Казанский и др., 1999]. Используя эту методику, мы сравнили функциональные свойства популяций CD8+ Клеток, имеющих поверхностный фенотип клеток памяти, но сформированных в разных экспериментальных условиях. Во-первых, мы исследовали такую способность у спленоцитов сублетально облученных, неиммунизированных и иммунных, мышей линии B10.D2(R101). Как и следовало ожидать, CD8+ Т-лимфоциты как у иммунных, так и у интактных поверхностный сублетально фенотип CD44+. облученных Однако животных оказалось, что неиммунизированных сублетально облученных животных не приобретают Т-лимфоциты способны пролиферировать в ответ на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку. Напротив, сублетальное облучение иммунизированных животных ведет к усилению ответов клеток памяти, содержащихся в селезенке. Совсем другая феноменология обнаружилась при адоптивном переносе спленоцитов сублетально облученным животным Т-лимфоциты донора также приобретают поверхностный фенотип клеток памяти. Однако их способность к аллогенному иммунному ответу in vitro оказывается значительно подавленной. Более того, специфического ответа Т-клеток памяти на аллогенные стимуляторы, подвергутые острому тепловом шоку, не наблюдается даже после адоптивного переноса спленоцитов от предварительно иммунизированных животных. В используемой экспериментальной системе лимфопения была вызвана сублетальным облучением. Известно, что клетки памяти в меньшей степени, чем наивные клетки, подвержены апоптозу [Grayson, и др., 2002] [Yao и др., 2011], экспрессируют большее количество bcl-2 [Kurtulus и др., 2011] и, за счет этого, более радиорезистентны. облучением, может При происходить лимфопении, обогащение истинными клетками памяти за счет их вызванной пула сублетальным лимфоидных клеток гомеостатической пролиферации и 127 гибели наивных клеток. Таким образом, при сублетальном облучении иммунизированных животных может происходить обогащение периферического пула Т-лимоцитов истинными клетками памяти как за счет их гомеостатической пролиферации, так и за счет гибели наивных клеток. Именно этим может объясняться стимуляция вторичного иммунного ответа у сублетально облученных иммунных животных. Иными функциональными свойствами обладает популяция TML, происходящая из клеток, адоптивно перенесенных сублетально облученным животным: пролиферативный ответ спленоцитов этих мышей на аллогенные стимуляторы in vitro значительно подавлен после адоптивного переноса клеток не только от интактных, но и от иммунизированных животных — антигенспецифический ответ практически отсутствует. Более того, у сублетально облученных мышей после адоптивного переноса сингенных спленоцитов отторжение аллогенной опухоли замедляется. Это замедление свидетельствует о том, что полученные результаты не являются артефактом экспериментальной системы in vitro. Одно из возможных объяснений наблюдаемого феномена — сокращение популяции истинных клеток памяти во время гомеостатической пролиферации наивных Т-клеток [Peacock, Kim, Welsh, 2003]. Это явление обусловлено тем, что наивные Т-клетки в условиях лимфопении делятся значительно быстрее клеток памяти. Несмотря на то, что в ходе такой пролиферации наивные Т-клетки приобретают активационный фенотип, они лишь внешне имитируют истинные клетки памяти. Значительно более загадочным выглядит отсутствие первичного иммунного ответа в этой экспериментальной системе. Известно, что в условиях лимфопении наиболее активно пролиферируют клоны Т-клеток, способные к высокоаффинному взаимодействию с собственными комплексами MHC/пептид [Ge и др., 2001] [Hao, Legrand, Freitas, 2006]. Таким образом, при адоптивном переносе спленоцитов в условия лимфопении может происходить размножение аутореактивных клонов Т-клеток [Villa и др., 2008] 128 Создание TCR-трансгенной модели Мы показали, что функциональные характеристики популяции T ML не определяются ее поверхностным фенотипом. Тем не менее, при определенных условиях в организме формируется пул Т-клеток с поверхностным фенотипом Тклеток памяти. Возникает вопрос о механизмах, лежащих в основе приобретения Т-лимфоцитом того или иного поверхностного фенотипа. Хорошо известно, что гомеостаз наивных Т-лимфоцитов поддерживается тоническими сигналами, которые они получают при взаимодействии со «своими» комплексами MHC/пептид в ходе рециркуляции через лимфоидные ткани [Kirberg, Berns, von Boehmer, 1997]. Мы предположили, что профиль экспрессии активационных поверхностных маркеров Т-лимфоцитов также может определяться взаимодействиями Т-клеточного рецептора с собственными молекулами MHC. В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что лимфопения, приводящая к приобретению Т-лимфоцитами фенотипа активированных Тклеток, часто провоцирует развитие аутоиммунных заболеваний [Milner, Fasth, Etzioni, 2008] [Le Campion и др., 2009]. Экспериментально проверить эту гипотезу можно на животных с измененным репертуаром Т-клеточных рецепторов, в частности, животных с трансгенным TCR. Существующим моделям с трансгенным TCR присущ ряд недостатков, которые становятся серьезным препятствием для использования в исследованиях гомеостаза Тлимфоцитов. В числе таких недостатков — глубокие нарушения характера дифференцировки Т-лимфоцитов в тимусе и нефизиологически высокое содержание Т-клеток с одинаковой специфичностью, что вынуждает экспериментаторов использовать инвазивные методы и схемы экспериментов, в частности — адоптивные переносы трансгенных Т-клеток лимфопеничным животным дикого типа. Это побудило нас создать собственную трансгенную модель, в которой трансген кодирует одну из цепей TCR, допуская нормальную реаранжировку другой цепи и формирование разнообразного репертуара Т- 129 лимфоцитов. Мы создали две линии животных, трансгенных по β-цепи Т- клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, ранее клонированной в нашей лаборатории. Обе линии характеризовались стабильной тканеспецифической экспрессией трансгена. Для исключения возможных сторонних эффектов трансгенеза ключевые эксперименты были продублированы на животных обеих трансгенных линий. Развитие трансгенных Т-клеток в тимусе Т-клетки в процессе своего развития в тимусе проходят несколько стадий. На каждой из них существует «контрольная точка» — момент выбора клеткой линии дифференцировки. При исследовании онтогенеза трансгенных Т-клеток мы оценивали прежде всего наличие или отсутствие нарушений именно в этих точках. Наиболее ранняя стадия развития тимоцитов — стадия двойных негативных Т-клеток (CD4—CD8—, DN). На этой стадии в норме происходит реаранжировка трех из четырех локусов TCR: Tcrb, Tcrg и Tcrd и происходит выбор между линией дифференцировки α/β и γ/δ Т-клеток [Kreslavsky, Gleimer, 2010]. Успешная реаранжировка реаранжировки локуса β-цепи TCR приводит к подавлению Tcrg и инициирует реаранжировку α-цепи, что сопровождается вырезанием из генома локуса Tcrd. Т-клетки, успешно прошедшие стадию β-селекции, начинают активно пролиферировать, β-цепь появляется на поверхности клетки в составе пре-TCR. Происходит повышение экспрессии маркеров CD4 и CD8, и тимоциты становятся двойными позитивными (CD4+CD8+, DP). На стадии двойных позитивных тимоцитов происходят процессы негативной селекции развивающихся тимоцитов и каждый клон окончательно «выбирает» направление дифференцировки CD4+ или CD8+ [Carpenter, Bosselut, 2010]. Экспрессия исследуемой трансгенной β-цепи начинается на стадии 130 двойных позитивных (CD4+CD8+, DP) тимоцитов в случае трансгенной линии 1D1bFM и на стадии двойных негативных (CD4—CD8—, DN) в случае линии 1D1bFF. Это обусловлено тем, что экспрессионная кассета hCD2 обеспечивает стадиоспецифическую экспрессию трансгена β-цепи (в норме экспрессия маркера CD2 начинается почти одновременно с реаранжировкой β-цепи TCR [Murphy, 2012]. Трансген экспрессируют 80-90% CD3+ тимоцитов CD4+CD8— и CD4—CD8+. В тимусе трансгенных животных, однако, существует популяция CD4+CD8— и CD4—CD8+ тимоцитов (10-20%), экспрессирующих эндогенные βцепи TCR. По всей видимости, это клетки, успевшие реаранжировать собственнные β-цепи до начала экспрессии трансгена. При цитофлуориметрическом анализе тимуса трансгенных животных мы не обнаружили нарушений в онтогенезе Т-клеток. Соотношение субпопуляций двойных негативных (CD4—CD8—, DN), двойных позитивных и однопозитивных (CD4—CD8+, CD4+CD8—, SP) тимоцитов не было изменено по сравнению с животными дикого типа. Это позволило сделать вывод о том, что Т-клетки, эспрессирующие трансгенную β-цепь TCR, успешно проходят внутритимусную селекцию, и для них не существует предпочтительной линии дифференцировки (CD4+ или CD8+). При анализе субпопуляции двойных негативных Т-клеток в тимусе трансгенных мышей линий 1D1bFM и 1D1bFF мы обнаружили уменьшение количества CD4—CD8—CD3+ клеток по сравнению с мышами дикого типа. Оказалось, что это вызвано десятикратным снижением относительного количества γ/δ Т-клеток в тимусе трансгенных животных. Это согласуется с данными других исследователей: известно, что экспрессия трансгенной β-цепи подавляет реаранжировку γ-цепи TCR [Gerber, Boucontet, Pereira, 2004]. Один из наиболее интересных вопросов, возникающих при изучении трансгенных Т-клеток, экспрессирующих «инвариантную» β-цепь TCR в комплексе с эндогенными α-цепями, связан с исследованием способности этих клеток взаимодействовать с различными аллельными формами молекул MHC. 131 Иными словами, вопрос о том, какой вклад вносит исследуемая β-цепь в специфичность гетеродимера TCR α/β. Исследуемая β-цепь происходит из Тклеточного рецептора гибридомы клеток памяти CD8+ 1D1, который специфичен к молекуле MHC I класса H-2Kb. Если трансгенная β-цепь вносит существенный вклад в специфичность исходного TCR, то внесение молекулы MHC H-2Kb в микроокружение трансгенных тимоцитов существенно изменит процессы внутритимусной селекции. Мы исследовали развитие трансгенных Т- лимфоцитов в тимусе гибридов F1 (1D1bFM Х C57BL/10). Оказалось, что соотношение различных субпопуляций тимоцитов у этих животных не нарушено по сравнению с мышами дикого типа, а относительное количество Т-клеток, экспрессирующих трансген, не отличается от животных линий 1D1bFM и 1D1bFF на генетической основе B10.D2(R101) (KdDb). Таким образом, оказалось, что экспрессия трансгенной β-цепи не влияет на способность тимоцитов проходить внутритимусную селекцию вне зависимости от аллельных форм молекул MHC в микроокружении развивающихся Т-клеток. Ранее другими исследователями было показано, что специфичность Т-клеточного рецептора определяется в основном α-цепями: при «спаривании» идентичных β-цепей с различными α-цепями получались Т-клеточные рецепторы различной специфичности [Stadinski и др., 2011]. Вероятно, что отсутствие предпочтительной линии дифференцировки для трансгенных Т-клеток объясняется второстепенной ролью данной β-цепи в формировании специфичности исследуемого Т-клеточного рецептора. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных линий 1D1bFM и 1D1bFF у интактных животных и в условиях лимфопении После прохождения внутритимусной селекции Т-лимфоциты CD4+ и CD8+, экспрессирующие трансген β-цепи, выходят на периферию и успешно там рециркулируют. Их соотношение не нарушено у животных обеих трансгенных 132 линий по сравнению с животными дикого типа. Т-клетки, экспрессирующие эндогенные β-цепи TCR, также проходят внутритимусную селекцию и выходят на периферию. Одной из основных задач нашего исследования была оценка взаимосвязи структуры Т-клеточного рецептора с фенотипическими особенностями Тлимфоцита, в частности, важно было ответить на вопрос, влияет ли экспрессия трансгенной β-цепи TCR клеток памяти на поверхностный фенотип Т-клеток. Как было сказано выше, при цитофлуориметрическом анализе субпопуляции наивных Т-клеток, эффекторов и Т-клеток памяти мыши обычно идентифицируют, основываясь на экспрессии маркеров CD44 и CD62L. При этом фенотип CD44—CD62L+ характеризует наивные Т-клетки, CD44+CD62L+ — клетки памяти (central memory cells) и CD44+CD62L— — эффекторы (effector memory cells) [Laouar и др., 2008]. Для того чтобы оценить влияние экспрессии трансгенной β-цепи на поверхностный фенотип периферических Т-клеток, мы проанализировали экспрессию маркеров CD44 и CD62L Т-лимфоцитами, экспрессирующими трансгенную β-цепь TCR (Vβ6+ Т-клетки), и Т-лимфоцитами, экспрессирующими эндогенные β-цепи Т-клеточного рецептора (Vβ6— Т-клетки). Оказалось, что в популяции Vβ6+ Т-лимфоцитов наблюдается выраженное снижение доли Т-клеток с фенотипом активированных клеток и увеличение доли клеток с фенотипом наивных Т-лимфоцитов. В то же время, Vβ6— Т-лимфоциты трансгенных животных приобретают фенотип активированных Т-клеток, что обычно имеет место в условиях лимфопении, вызванной облучением или воздействием цитостатиков. В литературе есть лишь единичные сообщения о влиянии трансгенной экспрессии индивидуальных цепей TCR на поверхностный фенотип периферических Т-клеток. Показано, что экспрессия трансгенной β-цепи TCR DO-11.10 (Vβ8.2) на генетической основе линии MRL-lpr приводит к накоплению активированных Т-клеток с фенотипом CD4 +CD44+ Vβ8.2—, которые являются главными виновниками прогрессирования аутоиммунного заболевания 133 у трансгенных животных [Perkins и др., 1996]. Однако мы наблюдаем похожие Тлимфоциты с фенотипом активированных Т-клеток, несущие эндогенные цепи TCR, у интактных животных в отсутствие антигенной стимуляции и каких-либо проявлений аутоиммунных заболеваний. Известно, что взаимодействие Т-клеточного рецептора с собственными MHC-пептидными комплексами необходимо не только для прохождения внутритимусной селекции, но и для поддержания гомеостаза на периферии [Ernst и др., 1999] [Jameson, 2002]. Взаимодействие TCR с собственными молекулами MHC в условиях лимфопении вызывает гомеостатическую пролиферацию наивных Т-клеток [Goldrath, Bevan, 1999] [Kieper, Jameson, 1999] [Surh, Sprent, 2000]. Более того, аффинность взаимодействия Т-клеточного рецептора с его лигандом определяет размер периферического пула Т-лимфоцитов у TCRтрансгенных животных [Hao, Legrand, Freitas, 2006]. Восстановление пула периферических Т-лимфоцитов регулируется конкуренцией между различными клонами и определяется специфичностью их Т-клеточных рецепторов [Leitão, Freitas, Garcia, 2009]. Мы предполагаем, что различия в поверхностном активационном фенотипе между Т-клетками с трансгенной β-цепью и Т-клетками с эндогенными цепями TCR также обусловлены конкуренцией за ограниченное число собственных комплексов MHC/пептид. Экспрессия трансгенной β-цепи TCR приводит к сужению разнообразия Тклеточных рецепторов, что, в конечном итоге, увеличивает конкуренцию Тклеток с трансгенной β-цепью за ограниченное количество эндогенных MHCлигандов, способных взаимодействовать с Т-клеточными рецепторами, ее содержащими, и снижает конкуренцию за взаимодействие с собственными комплексами MHC/пептид в полуляции Т-лимфоцитов с эндогенными β-цепями TCR. В этом случае снижение количества Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах должно приводить к приобретению Vβ6+ Т-лимфоцитами поверхностного фенотипа активированных Т-клеток. Для проверки этой гипотезы мы оценили поверхностный активационный фенотип спленоцитов 134 мышей трансгенной линии 1D1bFF через 3 и 10 дней после сублетального облучения. Оказалось, что Т-клетки, экспрессирующие β-трансген, приобретают поверхностный фенотип CD44+ в условиях лимфопении точно также, как Тлимфоциты мышей дикого типа. Через 3 дня после сублетального облучения соотношение Т-лимфоцитов с трансгенной β-цепью и Т-клеток с эндогенными βцепями TCR несколько изменяется в пользу последних, что связано с большей радиорезистентностью активированных Т-клеток [Yao и др., 2011]. Через 10 дней после сублетального облучение соотношение между популяциями Т- лимфоцитов, эскпрессирующих и не экспрессирующих трансген, не изменено по сравнению с интактными животными. Таким образом, мы показали, что снижение конкуренции между клонами Т-клеток с трансгенной β-цепью приводит к появлению у них активационного фенотипа. Аллогенный иммунный ответ спленоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM in vitro Т-клеточный рецептор гибридомы 1D1, из которого была клонирована исследуемая β-цепь, специфичен к молекуле MHC H-2Kb. Поэтому неожиданным оказалось то, что пролиферативный ответ спленоцитов мышей линии 1D1bFM (KdDb) на аллогенные стимуляторы C57BL/10 (KbDb) in vitro снижен по сравнению с животными дикого типа. Этот результат однозначно свидетельствует о том, что Т-клетки, экспрессирующие трансгенную β-цепь TCR, не сохраняют специфичность исходной гибридомы, и, по всей видимости, данной β-цепи принадлежала второстепенная роль в формировании специфичности Тклеточного рецептора гибридомы 1D1. Снижение способности трансгенных Т-клеток к аллогенному иммунному ответу может являться следствием значительного сужения репертуара Т- клеточных рецепторов из-за экспресии «инвариантной» β-цепи. В результате 135 сужения репертуара уменьшается частота клонов Т-клеток, способных к ответу на аллоантиген, что, в свою очередь, приводит к снижению уровня аллогенных ответов [Jenkins, Moon, 2012] [Obar, Khanna, Lefrançois, 2008]. Подобные свойства Т-клеточного репертуара β-трансгена не являются уникальными: Листманом и колллегами было показано, что экспрессия трансгенной β-цепи TCR DO-11.10 (Vβ8.2) снижает ответы Т-лимфоцитов на ряд различных антигенов, включая аллогенные молекулы MHC [Listman и др., 1996]. Наиболее примечательным является тот факт, во время первичного аллогенного иммунного ответа in vitro уменьшается количество Т-клеток, экспрессирующих трансгенную β-цепь и увеличивается количество Т-клеток, экспрессирующих эндогенные β-цепи TCR. Создается впечатление, что Т-клетки с эндогенными β-цепями TCR более активно отвечают в аллогенном иммунном ответе, чем Т-клетки с трансгенной β-цепью. Тем не менее, их иммунный ответ не достигает уровня иммунного ответа Т-лимфоцитов мышей дикого типа. Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей линии 1D1bFM на клетки тимомы EL-4 in vivo Следующим этапом нашей работы стало изучение иммунного ответа Тлимфоцитов трансгенных мышей на клетки аллогенной опухоли. После внутрибрюшинной иммунизации мышей линии 1D1bFM (KdDb) клетками тимомы EL-4 (KbDb) в их организме образуется пул клеток-эффекторов с трансгенной β-цепью TCR и эндогенными β-цепями, однако он оказывается недостаточным для эффективного отторжения аллогенной опухоли, и большая часть трансгенных животных погибает в течение 40-60 дней после иммунизации тимомой EL-4. Вполне вероятно, что из-за сужения репертуара Т-клеточных рецепторов в организме трансгенных животных нет необходимого числа высокоаффинных клонов, способных активироваться в ответ на аллогенную молекулу MHC. 136 Известно, что частота аллорестриктированных наивных предшественников достаточно низка, и не все они в состоянии активироваться в процессе иммунного ответа [Suchin и др., 2001]. Кроме того, в начале иммунного ответа могут активироваться не только клоны Т-лимфоцитов с высокой аффинностью к конкретному антигену, но и низкоаффинные клоны, которые в норме вытесняются впоследствии высокоаффинными клонами [Zehn, Lee, Bevan, 2009]. Вероятно, что у трансгенных животных снижено количество высокоаффинных аллорестриктированных клонов, и из-за этого вытеснения низкоаффинных клонов Т-клеток не происходит. Примечательным является тот факт, что, как и в культуре in vitro, в периферической крови трансгенных животных после введения клеток аллогенной опухоли соотношение Т-клеток, экспрессирующих трансгенную βцепь, и Т-лимфоцитов с эндогенными β-цепями TCR изменяется в пользу последних. Иммунная селекция опухолевых клеток в организме трансгенных животных Введение мышам B10.D2(R101) клеток тимомы EL4 обычно приводит к развитию эффективного иммунного ответа, полному отторжению клеток опухоли и выживанию реципиентов с формированием у них иммунологической памяти. Особенностью этого иммунного ответа является то, что он направлен на один единственный «сильный» трансплантационный аллоантиген, который отличает клетки тимомы EL4 от клеток реципиента – молекулу H-2Kb. Объясняется это тем, что линия B10.D2(R101) была получена в результате генетической рекомбинации, которая создала разделила локусы I и D главного комплекса гистосовместимости на 17-й хромосоме и привела к тому, что гены, находящиеся на генетической карте левее места рекомбинации происходят из аллеля MHC H2d, а правее – из аллеля H-2b. В результате гаплотип исходной линии B10.D2 H-2d (KdI-AdI-EdLdDd) изменился на H-2g1 (KdI-AdDb) у рекомбинантной линии 137 B10.D2(R101), которая отличается от линии C57BL/6, из которой произошла тимома EL4, лишь продуктами локусов K и I. Продукты локуса I, кодирующие молекулы MHC класса II, клетки тимомы не экспрессируют и поэтому единственным трансплантационным антигеном, отличающим клетки тимомы от клеток рекомбинантной линии, является молекула H-2Kb. Иммунный ответ, развивающийся в организме трансгенных животных, недостаточен для полного отторжения клеток аллогенной тимомы EL-4 и приводит к селекции опухолевых клеток: клетки тимомы, выделенные из асцита трансгенных животных, не несут на своей поверхности молекулу MHC H-2Kb I класса. Потеря экспрессии молекул MHC I класса — достаточно частое явление при опухолевой прогрессии [Algarra и др., 2004] [Fassati, Mitchison, 2010] Считается, что снижение или потеря экспрессии молекул MHC является одним из механизмом избегания опухолевыми клетками иммунологического надзора. Однако нами впервые разработана экспериментальная система, в которой контролируемые различия в трансплантационных антигенах позволяют увидеть «грань» между полным отторжением и селекцией опухолевых клеток, при которой ослабленный аллогенный иммунный ответ на опухолевые клетки приводит к потере ими экспрессии MHC I класса и последующей гибели реципиентов. Потеря экспрессии молекулы H-2Kb в разработанной экспериментальной системе может происходить разными путями. Во-первых, в популяции клеток тимомы EL-4 присутствует минорная (<1%) популяция клеток, которые не экспрессируют молекулу H-2Kb. Вполне вероятно, что именно эта популяция получает возможность избежать гибели и пролиферирует в организме трансгенных животных. Во-вторых, мутация в геноме опухолевых клеток, вызывающая потерю экспрессии MHC I класса, могла возникнуть в ходе иммунного ответа. Потеря экспрессии молекулы H-2Kb является стабильной и сохраняется через 21 день культивирования in vitro. Продолжительность жизни мышей линии C57BL/10 при внутрибрюшинном введении сублинии тимомы EL- 138 4, не экспрессирующей молекулу H-2Kb, не отличается от продолжительности жизни мышей, которым был введен исходный вариант тимомы. По всей видимости, NK-клетки, одной из функций которых является устранение опухолевых клеток, лишенных молекул MHC класса I [Oberoi и др., 2013], в этом случае не работают, что согласуется с данными других исследователей, показавших устойчивость лимфом к цитотоксическим эффектам NK-клеток [Smithson и др., 1991]. Таким образом, иммунный ответ мышей трансгенной линии 1D1bFM на клетки тимомы EL-4 является весьма перспективной моделью процессов иммунной селекции опухолевых клеток. Мы предполагаем, что эта модель может быть с успехом использована для скрининга и оценки биологической активности новых противоопухолевых препаратов и стимуляторов противоопухолевого иммунитета. 139 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Мы исследовали взаимосвязь между поверхностным активационным фенотипом CD8+ Т-лимфоцитов и их функциональными характеристиками в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением, с помощью экспериментальной методики, позволяющей оценить иммунный ответ Т-клеток памяти без вовлечения наивных Т-лимфоцитов. Эта методика основана на способности аллоспецифичных Т-клеток памяти пролиферировать in vitro в ответе на аллогенные спленоциты или опухолевые клетки, подвергнутые острому тепловому шоку (прогревание в течение 1 часа при 45оС). Оказалось, что приобретение Т-клеткой поверхностного активационного фенотипа не приводит к появлению у нее функциональных характеристик Т-клетки памяти. Таким образом, способность Т-лимфоцита пролиферировать в ответ на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку, определяется исключительно предыдущим «антигенным опытом» Т-клетки. Для исследования механизмов, лежащих в основе приобретения Тлимфоцитом того или иного поверхностного фенотипа, мы создали две линии трансгенных животных, экспрессирующих β-цепь Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1. Экспрессия трансгенной β-цепи TCR гибридомы 1D1 не вызывает какихлибо нарушений в развитии Т-лимфоцитов. Трансгенные Т-клетки успешно проходят внутритимусную селекцию и выходят на периферию. Для трансгенных Т-лимфоцитов не существует предпочтительной линии дифференцировки (CD4 или CD8). Оказалось, что экспрессия трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора значительно изменяет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме. 70-75% CD8+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансгенную β-цепь TCR обладают поверхностным фенотипом наивных Т-клеток (CD44—CD62L+). В то же время, значительная доля Т-лимфоцитов, экспрессирующих эндогенные 140 цепи TCR, находится в активированном состоянии. Этот эффект наблюдается у мышей обеих трансгенных линий, что свидетельствует о том, что он не является следствием каких-либо сторонних эффектов трансгенеза. В условия снижения конкуренции за эндогенные комплексы MHC/пептид трансгенные Т-лимфоциты приобретают поверхностный фенотип CD44+. Таким образом, поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов определяется доступностью эндогенных MHC-пептидных лигандов, с которыми может взаимодействовать их Тклеточный рецептор. Экспрессия трансгенной β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 приводит к значительному снижению уровня аллогенных ответов in vitro и in vivo. Слабый аллогенный ответ, развивающийся в организме трансгенных животных, делает невозможным отторжение клеток аллогенной тимомы EL-4, однако приводит к иммунной селекции опухолевых клеток. Таким образом, в работе исследована взаимосвязь поверхностного активационного фенотипа CD8+ Т-клеток с их функциональными свойствами, а также механизмы, лежащие в основе приобретения Т-лимфоцитом того или иного поверхностного фенотипа. Эти результаты могут иметь важное значение для понимания процессов формирования пулов Т-клеток с различными функциональными фенотипом. характеристиками и поверхностным активационным 141 ВЫВОДЫ 1. Т-лимфоциты в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением, приобретают поверхностный фенотип клеток памяти, однако оказываются неспособными отвечать in vitro на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку. 2. Т-лимфоциты, адоптивно перенесенные сублетально облученным животным, приобретают поверхностный фенотип активированных Тклеток, однако их способность к первичному и вторичному аллогенному иммунному ответу in vitro значительно подавлена. 3. Впервые получены и охарактеризованы две независимые линии мышей, трансгенных по β-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 на генетической основе линии B10.D2(R101). 4. Генетическая структура Т-клеточного рецептора в значительной степени определяет уровень экспрессии поверхностных маркеров CD44 и CD62L. 5. Экспрессия трансгена β-цепи Т-клеточного рецептора меняет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме. 6. Т-лимфоциты CD8+ линии 1D1bFF, экспрессирующие трансгенную β-цепь, приобретают поверхностный фенотип активированных клеток в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением. 7. Уровень аллогенного иммунного ответа in vitro мышей трансгенной линии 1D1bFM заметно снижен по сравнению с мышами дикого типа. 8. Иммунный ответ Т-лимфоцитов трансгенных животных in vivo недостаточен для эффективного отторжения аллогенной опухоли: мыши линии 1D1bFM на генетической основе B10.D2(R101) погибают через 4060 дней после введения клеток тимомы EL-4. 9. Иммунный ответ лимфоцитов мышей трансгенной линии 1D1bFM на генетической основе B10.D2(R101) на клетки тимомы EL-4 вызывает потерю экспрессии молекулы Kb MHC I класса клетками тимомы. 142 БЛАГОДАРНОСТИ Я глубоко благодарна моему научному руководителю Д. Б. Казанскому — за мудрое руководство на всех этапах работы. Я очень признательна коллективу лаборатории трансгенеза ИБГ РАН — за неоценимую помощь в освоении методики создания трансгенных животных. 143 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Жигачев, А. И. Разведение сельскохозяйственных животных с основами частной зоотехнии / Жигачев, А. И., Уколов, П. И., Билль, А. В.— Москва: КолосС, 2009 — 408 с. 2. Звездова, Е. С.. Корецепторная функция CD4 в ответе на молекулу MHC класса I / Звездова, Е. С., Гриненко, Т. С., Побезинская, Е. Л., Побезинский, Л. А., Казанский, Д. Б.// Молекулярная биология. — 2008. — Т. 42. — № 4. — c. 662–672. 3. Казанский, Д. Б. Внутритимусная селекция и иммунотерапия рака / Казанский, Д. Б.// Русский журнал “СПИД, рак и общественное здоровье”. — 2007.— Т. 11.—№1. — с. 25–32. 4. Казанский, Д. Б. Использование теплового шока антигенпрезентирующих клеток для функционального тестирования аллоспецифических Т-клеток памяти / Казанский, Д. Б., Петрищев, В. Н., Штиль, А. А., Чернышева, А. Д., Сернова, Н. В., Абронина, И. Ф., Побезинский, Л. А., Агафонова, Е. Л. // Биоорганическая химия. — 1999. — Т. 25. — №2. — с. 117–128. 5. Aifantis, I. Essential role of the pre-T cell receptor in allelic exclusion of the T cell receptor beta locus./Aifantis, I., Buer, J., Von Boehmer, H., Azogui, O. // Immunity, — 1997. — V. 7. — I. 5. — p. 601–7. 6. Akue, A. D. Derivation and maintenance of virtual memory CD8 T cells. / Akue, A. D., Lee, J., Jameson, S. C. // Journal of immunology. — 2012. — V. 188. — I. 6. — p. 2516–2523. 7. Algarra, I. The selection of tumor variants with altered expression of classical and nonclassical MHC class I molecules: implications for tumor immune escape / Algarra, I., García-Lora, A., Cabrera, T., Ruiz-Cabello, F., Garrido, F..// Cancer immunology, immunotherapy. — 2004. —V. 53. — I. 10. — p.904–910. 8. Al-Shawi, R. Expression of a foreign gene in a line of transgenic mice is modulated by a chromosomal position effect / Al-Shawi, R., Kinnaird, J., Burke, J., Bishop, J. O.// Molecular and cellular biology. — 1990. — V.10. —I. 3. — p. 1192–1198. 9. Aptsiauri, N. MHC class I antigens and immune surveillance in transformed cells / Aptsiauri, N., Cabrera, T., Garcia-Lora, A., Lopez-Nevot, M. A., Ruiz-Cabello, F., Garrido, F. // International review of cytology. — 2007. — V. 256. — I. 7. — p. 139–189. 144 10. Araki, K. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation / Araki, K., Turner, A. P., Shaffer, V. O., Gangappa, S., Keller, S. A., Bachmann, M. F., Larsen, C. P., Ahmed, R.// Nature. —2009. — V. 460. — I. 7251. — p. 108–112. 11. Auerbach, A. B. Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear / Auerbach, A. B. // Acta Biochimica Polonica. — 2004. — V. 51. — I. 1. — p. 9–31. 12. Bachmann, M. F. Functional Properties and Lineage Relationship of CD8+ T Cell Subsets Identified by Expression of IL-7 Receptor CD62L / Bachmann, M. F., Wolint, P., Schwarz, K., Jager, P., Oxenius, A.// The Journal of Immunology. — 2005. — I. 175. — p. 4686–4696. 13. Badovinac, V. P. CD8+ T cell contraction is controlled by early inflammation / Badovinac, V. P., Porter, B. B., Harty, J. T. // Nature immunology. — 2004. — V. 5. — I. 8. — p. 809–817. 14. Banerjee, A.Cutting edge: The transcription factor eomesodermin enables CD8+ T cells to compete for the memory cell niche / Banerjee, A., Gordon, S. M., Intlekofer, A. M., Paley, M. A., Mooney, E. C., Lindsten, T., Wherry, E. J., Reiner, S. L. // Journal of immunology. — 2010. — V. 185. — I. 9. — p. 4988–4992. 15. Bannard, O. The Secondary Replicative Function of CD8+ T Cells That Expressed Granzyme B During a Primary Anti-Viral Response / Bannard, O., Kraman, M., Fearon, D. T. // Science. — 2009. — V. 323. — I. 5913. — p. 505–509. 16. Baron, V. The repertoires of circulating human CD8(+) central and effector memory T cell subsets are largely distinct / Baron, V., Bouneaud, C., Cumano, A., Lim, A., Arstila, T. P., Kourilsky, P., Ferradini, L., Pannetier, C. // Immunity. — 2003. — V.18. — I. 2. — p. 193– 204. 17. Bernal, M. Implication of the β2-microglobulin gene in the generation of tumor escape phenotypes / Bernal, M., Ruiz-Cabello, F., Concha, A., Paschen, A., Garrido, F. // Cancer immunology, immunotherapy. — 2012. — V. 61. — I. 9. — с 1359–1371. 18. Bosselut, R. Role of CD8beta domains in CD8 coreceptor function: importance for MHC I binding, signaling, and positive selection of CD8+ T cells in the thymus / Bosselut, R., Kubo, S., Guinter, T., Kopacz, J. L., Altman, J. D., Feigenbaum, L., Singer, A. // Immunity. — 2000. — V. 12. —I. 4. — p. 409–418. 19. Boyman, O. A major histocompatibility complex class I-dependent subset of memory phenotype CD8+ cells / Boyman, O., Cho, J.-H., Tan, J. T., Surh, C. D., Sprent, J. // The Journal of experimental medicine. — 2006. — V. 203. —I. 7. — p. 1817–1825. 145 20. Brinster, R. L. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs / Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1985. — V. 82. — I. 13. — p. 4438–4442. 21. Brodeur, J. Expression of fully assembled TCR-CD3 complex on double positive thymocytes: synergistic role for the PRS and ER retention motifs in the intra-cytoplasmic tail of CD3epsilon / Brodeur, J., Li, S., Damlaj, O., Dave, V. P. // International immunology. — 2009. — V. 21. —I. 12. — p. 1317–1327. 22. Bruno, L. The αβ T cell receptor can replace the γδ receptor in the development of γδ lineage cells / Bruno, L., Fehling, H. J., Von Boehmer, H.// Immunity. — 1996. — I. 5. — p. 343– 352. 23. Budd, R. C. Distinction of virgin and memory T lymphocytes. Stable acquisition of the Pgp-1 glycoprotein concomitant with antigenic stimulation / Budd, R. C., Cerottini, J. C., Horvath, C., Bron, C., Pedrazzini, T., Howe, R. C., MacDonald, H. R.// Journal of immunology. — 1987. — V. 138. — I. 10. — p. 3120–3129. 24. Burgering, B. M. A brief introduction to FOXOlogy Burgering, B. M. // Oncogene. — 2008. — V. 27. — I. 16. — p. 2258–2262. 25. Burkett, P. R. Coordinate expression and trans presentation of interleukin (IL)-15Ralpha and IL-15 supports natural killer cell and memory CD8+ T cell homeostasis / Burkett, P. R., Koka, R., Chien, M., Chai, S., Boone, D. L., Ma, A.// The Journal of experimental medicine. — 2004. — V. 200. —I. 7. — p. 825–834. 26. Burkhardt, J. K. The lytic granules of natural killer cells are dual-function organelles combining secretory and pre-lysosomal compartments / Burkhardt, J. K., Hester, S., Lapham, C. K., Argon, Y. // The Journal of cell biology. — 1990. — I. 111. — p. 2327–2340. 27. Busch, D. H. T cell affinity maturation by selective expansion during infection / Busch, D. H., Pamer, E. G.// The Journal of experimental medicine. — 1999. — V. 189. —I. 4. — p. 701– 710. 28. Byrne, S. M. Cathepsin B controls the persistence of memory CD8+ T lymphocytes / Byrne, S. M., Aucher, A., Alyahya, S., Elder, M., Olson, S. T., Davis, D. M., Ashton-Rickardt, P. G. // Journal of immunology. — 2012. — V. 189. — I. 3. — p. 1133–1143. 29. Carpenter, A. C. Decision checkpoints in the thymus / Carpenter, A. C., Bosselut, R. // Nature 146 immunology. — 2010. — V. 11. — I. 8. — p. 666–673. 30. Castro, I. The basis of distinctive IL-2- and IL-15-dependent signaling: weak CD122dependent signaling favors CD8+ T central-memory cell survival but not T effector-memory cell development / Castro, I., Yu, A., Dee, M. J., Malek, T. R. // Journal of immunology. — 2011. — V. 187. — I. 10. — p. 5170–1582. 31. Chang, J. T. Asymmetric T lymphocyte division in the initiation of adaptive immune responses / Chang, J. T., Palanivel, V. R., Kinjyo, I., Schambach, F., Intlekofer, A. M., Banerjee, A., Longworth, S. A., Vinup, K. E., Mrass, P., Oliaro, J., Killeen, N., Orange, J. S., Russell, S. M., Weninger, W., Reiner, S. L.// Science. — 2007. — V. 315. — I. 5819. — p. 1687–1691. 32. Chen, C. FoxOs inhibit mTORC1 and activate Akt by inducing the expression of Sestrin3 and Rictor / Chen, C., Jeon, S., Bhaskar, P. T., Nogueira, V., Sundararajan, D., Tonic, I., Park, Y., Hay, N.// Developmental cell. — 2010. — V. 18. — I. 4. — p. 592–604. 33. Cheung, K. P. Memory-like CD8+ T cells generated during homeostatic proliferation defer to antigen-experienced memory cells / Cheung, K. P., Yang, E., Goldrath, A. W.// Journal of immunology. — 2009. — V. 183. — I. 5. — p. 3364–3372. 34. Cho, B. K. Homeostasis-stimulated proliferation drives naive T cells to differentiate directly into memory T cells / Cho, B. K., Rao, V. P., Ge, Q., Eisen, H. N., Chen, J.// The Journal of experimental medicine. — 2000. — V. 192. — I. 4. — p. 549–556. 35. Ciofani, M. Stage-specific and differential notch dependency at the alphabeta and gammadelta T lineage bifurcation / Ciofani, M., Knowles, G. C., Wiest, D. L., Von Boehmer, H., ZúñigaPflücker, J. C. // Immunity. — 2006. — V. 25. — I. 1. — p. 105–116. 36. Cornish, G. H. Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15 / Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. // Blood. — 2006. — V. 108. — I. 2. — p. 600–608. 37. Curtsinger, J. M. CD8 + Memory T Cells (CD44 high , Ly-6C + ) Are More Sensitive than Naive Cells (CD44 low, Ly-6C −) to TCR/CD8 Signaling in Response to Antigen / Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Mescher, M. F. // The Journal of Immunology. — 1998. — I. 160. — p. 3236–3243. 38. Curtsinger, J. M.Inflammatory cytokines as a third signal for T cell activation / Curtsinger, J. M., Mescher, M. F. // Current opinion in immunology. — 2010. — V. 22. — I. 3. — p. 333– 340. 147 39. D’Souza, W. N. Cutting Edge: Latecomer CD8 T cells are imprinted with a unique differentiation program / D’Souza, W. N., Hedrick, S. M.// The Journal of Immunology. — 2006. — I. 177. — p. 777–781. 40. DiPaolo, R. J. CD4+ T-cell development in a mouse expressing a transgenic TCR derived from a Treg / DiPaolo, R. J., Shevach, E. M. // European journal of immunology. — 2009. — V. 39. —I. 1. — p. 234–2340. 41. Dubois, S. IL-15Ralpha recycles and presents IL-15 In trans to neighboring cells / Dubois, S., Mariner, J., Waldmann, T. A., Tagaya, Y. // Immunity. — 2002. — V. 17. — I. 5. — p. 537– 547. 42. Dummer, W. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity/ Dummer, W., Niethammer, A. G., Baccala, R., Lawson, B. R., Wagner, N., Reisfeld, R. A., Theofilopoulos, A. N.// The Journal of Clinical Investigation. — 2002. — V. 110. — I. 2. — p. 157–159. 43. Endharti, A. T. Cutting edge: CD8+CD122+ regulatory T cells produce IL-10 to suppress IFN-gamma production and proliferation of CD8+ T cells / Endharti, A. T., Rifa’I, M., Shi, Z., Fukuoka, Y., Nakahara, Y., Kawamoto, Y., Takeda, K., Isobe, K., Suzuki, H.// Journal of immunology. — 2005. — V. 175. — I. 11. — p. 7093–7097. 44. Ernst, B. The peptide ligands mediating positive selection in the thymus control T cell survival and homeostatic proliferation in the periphery / Ernst, B., Lee, D. S., Chang, J. M., Sprent, J., Surh, C. D.// Immunity. — 1999. — V. 11. — I. 2. — p. 173–181. 45. Fassati, A. Testing the theory of immune selection in cancers that break the rules of transplantation / Fassati, A., Mitchison, N. A. // Cancer immunology, immunotherapy. — 2010. — V. 59. — I. 5. — p. 643–651. 46. Fehniger, T. A. Fatal leukemia in interleukin 15 transgenic mice follows early expansions in natural killer and memory phenotype CD8+ T cells / Fehniger, T. A., Suzuki, K., Ponnappan, A., VanDeusen, J. B., Cooper, M. A., Florea, S. M., Freud, A. G., Robinson, M. L., Durbin, J., Caligiuri, M. A. // The Journal of experimental medicine. — 2001. — V. 193. — I. 2. — p. 219–231. 47. Felsher, D. W. Cancer revoked: oncogenes as therapeutic targets / Felsher, D. W.// Nanure Reviews. Cancer. — 2003. — I. 3. — p. 5–10. 48. Ferrero, I. A critical lineage-nonspecific role for pTalpha in mediating allelic and isotypic 148 exclusion in TCRbeta-transgenic mice / Ferrero, I., Grosjean, F., Fiorini, E., MacDonald, H. R.// European journal of immunology. — 2007. — V. 37. — I. 11. — p. 3220–3228. 49. Garcia-Lora, A. MHC class I antigens, immune surveillance, and tumor immune escape / Garcia-Lora, A., Algarra, I., Garrido, F.// Journal of cellular physiology. — 2003. — V. 195. — I. 3. — p. 346–355. 50. Garrick, D. Repeat-induced gene silencing in mammals / Garrick, D., Fiering, S., Martin, D., Whitelaw, E. // Nature Genetics. — 1998. — I. 1. — p. 56–69. 51. Garrido, F. Implications for immunosurveillance of altered HLA class I phenotypes in human tumours / Garrido, F., Ruiz-Cabello, F., Cabrera, T., Pérez-Villar, J. J., López-Botet, M., Duggan-Keen, M., Stern, P. L.// Immunology today. — 1997. — V. 18. — I. 2. — p. 89–95. 52. Ge, Q. Different contributions of thymopoiesis and homeostasis-driven proliferation to the reconstitution of naive and memory T cell compartments / Ge, Q., Hu, H., Eisen, H. N., Chen, J.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2002. — V. 99. — I. 5. — p. 2989–2994. 53. Ge, Q. Dependence of lymphopenia-induced T cell proliferation on the abundance of peptide/ MHC epitopes and strength of their interaction with T cell receptors / Ge, Q., Rao, V. P., Cho, B. K., Eisen, H. N., Chen, J.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2001. — V. 98. — I. 4. — p. 1728–1733. 54. Gerber, D. Early expression of a functional TCRbeta chain inhibits TCRgamma gene rearrangements without altering the frequency of TCRgammadelta lineage cells / Gerber, D., Boucontet, L., Pereira, P. // Journal of immunology/. — 2004. — V. 173. — I. 4. — p. 2516– 2523. 55. Gerlach, C. One naive T cell, multiple fates in CD8+ T cell differentiation / Gerlach, C., Van Heijst, J. W. J., Swart, E., Sie, D., Armstrong, N., Kerkhoven, R. M., Zehn, D., Bevan, M. J., Schepers, K., Schumacher, T. N. M.// The Journal of experimental medicine. — 2010. — V. 207. — I. 6. — p. 1235–1246. 56. Goldrath, A. W., Bevan, M. J. 1999. Low-Affinity Ligands for the TCR Drive Proliferation of Mature CD8+ T Cells in Lymphopenic Hosts.// Immunity, 11(2), 183–190. 57. Goldrath, A. W. Naive T cells transiently acquire a memory-like phenotype during homeostasis-driven proliferation / Goldrath, A. W., Bevan, M. J.// The Journal of experimental medicine,. — 2000. — V. 192. — I. 4. — p. 557–564. 149 58. Granato, F. Patients with thymomas have an increased risk of developing additional malignancies: lack of immunological surveillance? / Granato, F., Ambrosio, M. R., Spina, D., Lazzi, S., Rocca, B. J., Voltolini, L., Bongiolatti, S., Luzzi, L., Gotti, G., Leoncini, L., Tosi, P.// Histopathology. — 2012. — V. 60. — I. 3. — p. 437–442. 59. Grayson, J. M. Differential sensitivity of naive and memory CD8+ T cells to apoptosis in vivo / Grayson, J. M., Harrington, L. E., Lanier, J. G., Wherry, E. J., Ahmed, R.// Journal of immunology. — 2002. — V. 169. — I. 7. — p. 3760–3770. 60. Grayson, J. M. Cutting Edge: Increased Expression of Bcl-2 in Antigen-Specific Memory CD8 + T Cells / Grayson, J. M., Zajac, A. J., Altman, J. D., Ahmed, R.// Journal of Immunology. — 2000. — I. 164. — p. 3950–3954. 61. Griffiths, G. M. Expression of perforin and granzymes iI viva : potential diagnostic markers for activated cytotoxic cells / Griffiths, G. M., Mueller, C. // Immunology today. — 1991. — V. 12. — I. 11. — p. 415–419. 62. Haluszczak, C. The antigen-specific CD8+ T cell repertoire in unimmunized mice includes memory phenotype cells bearing markers of homeostatic expansion / Haluszczak, C., Akue, A. D., Hamilton, S. E., Johnson, L. D. S., Pujanauski, L., Teodorovic, L., Jameson, S. C., Kedl, R. M.// The Journal of experimental medicine. — 2009. — V. 206. — I. 2. — p. 435–448. 63. Hamilton, S. E. The nature of the lymphopenic environment dictates protective function of homeostatic-memory CD8+ T cells / Hamilton, S. E., Jameson, S. C.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2008. — V. 105. — I. 47. —p. 18484–18489. 64. Hamilton, S. E. The generation of protective memory-like CD8+ T cells during homeostatic proliferation requires CD4+ T cells / Hamilton, S. E., Wolkers, M. C., Schoenberger, S. P., Jameson, S. C.// Nature immunology. — 2006. — V. 7. — I. 5. — p. 475–481. 65. Hao, Y. The clone size of peripheral CD8 T cells is regulated by TCR promiscuity / Hao, Y., Legrand, N., Freitas, A.// The Journal of experimental medicine. — 2006. — V. 203. — I. 7. — p. 1643–1649. 66. Huster, K. M. Selective expression of IL-7 receptor on memory T cells identifies early CD40L-dependent generation of distinct CD8+ memory T cell subsets / Huster, K. M., Busch, V., Schiemann, M., Linkemann, K., Kerksiek, K. M., Wagner, H., Busch, D. H.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2004. — V. 101. — 150 I. 15. — p. 5610–5615. 67. Ichii, H. Role for Bcl-6 in the generation and maintenance of memory CD8+ T cells / Ichii, H., Sakamoto, A., Hatano, M., Okada, S., Toyama, H., Taki, S., Arima, M., Kuroda, Y., Tokuhisa, T.// Nature immunology. — 2002. — V. 3. — I. 6. — p. 558–563. 68. Intlekofer, A. M. Effector and memory CD8+ T cell fate coupled by T-bet and eomesodermin / Intlekofer, A. M., Takemoto, N., Wherry, E. J., Longworth, S. A, Northrup, J. T., Palanivel, V. R., Mullen, A. C., Gasink, C. R., Kaech, S. M., Miller, J. D., Gapin, L., Ryan, K., Russ, A. P., Lindsten, T., Orange, J. S., Goldrath, A. W., Ahmed, R., Reiner, S. L.// Nature immunology. — 2005. — V. 6. — I. 12. — p. 1236–1244. 69. Irving, B. A. Thymocyte development in the absence of pre-T cell receptor extracellular Immunoglobulin domains / Irving, B. A., Alt, F. W., Killeen, N. // Science. — 1998. — V. 280. — I. 5365. — p. 905–908. 70. Jameson, S. C. Maintaining the norm: T-cell homeostasis / Jameson, S. C. // Nature reviews. Immunology. — 2002. — V. 2. — I. 8. — 547–556. 71. Jameson, S. C. Diversity in T cell memory: an embarrassment of riches / Jameson, S. C., Masopust, D. // Immunity. — 2009. — V. 31. — I. 6. — p. 859–871. 72. Jenkins, M. K. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude / Jenkins, M. K., Moon, J. J.// Journal of immunology. — 2012. — V. 188. — I. 9. — p. 4135–4140. 73. Jenkins, M. K. CD28 delivers a costimulatory signal involved in antigen-specific IL-2 production by human T cells / Jenkins, M. K., Taylor, P. S., Norton, S. D., Urdahl, K. B.// Journal of immunology. — 1991. — V. 147. — I. 8. — p. 2461–2466. 74. Joshi, N. S. Inflammation Directs Memory Precursor and Short-Lived Effector CD8+ T Cell Fates via the Graded Expression of T-bet Transcription Factor / Joshi, N. S., Cui, W., Chandele, A., Lee, H. K., Urso, D. R., Hagman, J., Gapin, L., Kaech, S. M.// Immunity. — 2007. — V. 27. I. 2. — p. 281–295. 75. Joshi, N. S. Increased numbers of preexisting memory CD8 T cells and decreased T-bet expression can restrain terminal differentiation of secondary effector and memory CD8 T cells / Joshi, N. S., Cui, W., Dominguez, C. X., Chen, J. H., Hand, T. W., Kaech, S. M.// Journal of immunology. — 2011. — V. 187. — I. 8. — p. 4068–4076. 76. Judge, A. D. Interleukin 15 Controls both Proliferation and Survival of a Subset of Memory- 151 Phenotype CD8+ T Cells / Judge, A. D., Zhang, X., Fujii, H., Surh, C. D., Sprent, J. // Journal of Experimental Medicine. — 2002. — I. 196. — p. 935–946. 77. Kalia, V. Differentiation of memory B and T cells / Kalia, V., Sarkar, S., Gourley, T. S., Rouse, B. T., Ahmed, R. // Current opinion in immunology. — 2006. — V. 18. — I. 3. — p. 255– 264. 78. Kedl, R. M. Migration and Activation of Antigen-Specific CD8+ T Cells Upon In Vivo Stimulation with Allogeneic Tumor / Kedl, R. M., Mewher, M. F.// The Journal of Immunology. — 1997. — I. 159. — p. 650–663. 79. Kennedy, M. K. Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15-deficient mice / Kennedy, M. K., Glaccum, M., Brown, S. N., Butz, E. A., Viney, J. L., Embers, M., Matsuki, N., Charrier, K., Sedger, L., Willis, C. R., Brasel, K., Morrissey, P. J., Stocking, K., Schuh, J. C., Joyce, S., Peschon, J. J. // The Journal of experimental medicine. — .2000. — V. 191. — I. 5. — p. 771–780. 80. Kieper, W. C. Homeostatic expansion and phenotypic conversion of naïve T cells in response to self peptide/MHC ligands / Kieper, W. C., Jameson, S. C.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1999. — V. 96. — I. 23. — p. 13306–13311. 81. Kirberg, J. Peripheral T cell survival requires continual ligation of the T cell receptor to major histocompatibility complex-encoded molecules / Kirberg, J., Berns, A., Von Boehmer, H.// The Journal of experimental medicine. — 1997. — V. 186. — I. 8. — p. 1269–1275. 82. Kreslavsky, T. αβ versus γδ fate choice: counting the T‐cell lineages at the branch point / Kreslavsky, T., Gleimer, M.// Immunological reviews. — 2010. — V. 238. — I. 1. — p. 169– 181. 83. Kumar, R. Increased sensitivity of antigen-experienced T cells through the enrichment of oligomeric T cell receptor complexes / Kumar, R., Ferez, M., Swamy, M., Arechaga, I., Rejas, M. T., Valpuesta, J. M., Schamel, W. W. A., Alarcon, B., van Santen, H. M. // Immunity. — 2011. — V. 35. — I. 3. — p. 375–387. 84. Kurtulus, S. Bcl-2 allows effector and memory CD8+ T cells to tolerate higher expression of Bim / Kurtulus, S., Tripathi, P., Moreno-Fernandez, M. E., Sholl, A., Katz, J. D., Grimes, H. L., Hildeman, D. A.// Journal of immunology. — 2011. — V. 186. — I. 10. — p. 5729–5737. 85. Lang, K. S. Inverse correlation between IL-7 receptor expression and CD8 T cell exhaustion 152 during persistent antigen stimulation / Lang, K. S., Recher, M., Navarini, A. A., Harris, N. L., Löhning, M., Junt, T., Probst, H. C., Hengartner, H., Zinkernagel, R. M. // European journal of immunology. — 2005. — V. 35. — I. 3. — p. 738–745. 86. Laouar, A. Concurrent generation of effector and central memory CD8 T cells during vaccinia virus infection / Laouar, A., Manocha, M., Haridas, V., Manjunath, N.// PloS one. — 2008. — V. 3. — I. 12. — p. E4089. 87. Larsen, C. P. Regulation of immunostimulatory function and costimulatory molecule (B7-1 and B7-2) expression on murine dendritic cells / Larsen, C. P., Ritchie, S. C., Hendrix, R., Linsley, P. S., Hathcock, K. S., Hodes, R. J., Lowry, R. P., Pearson, T. C.// Journal of immunology. — 1994. — V. 152. — I. 11. — p. 5208–5219. 88. Le Campion, A. Lymphopenia-induced spontaneous T-cell proliferation as a cofactor for autoimmune disease development / Le Campion, A., Gagnerault, M., Auffray, C., Bécourt, C., Poitrasson-Rivière, M., Lallemand, E., Bienvenu, B., Martin, B., Lepault, F., Lucas, B.// Blood. — 2009. — V. 114. — I. 9. — p. 1784–1793. 89. Le Campion, A. Naive T cells proliferate strongly in neonatal mice in response to selfpeptide/self-MHC complexes / Le Campion, A., Bourgeois, C., Lambolez, F., Martin, B., Léaument, S., Dautigny, N., Tanchot, C., Pénit, C., Lucas, B.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2002. — V. 99. — I. 7. — p. 4538– 4543. 90. Leignadier, J. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression / Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutiera, M., Rooneya, J., Labrecque, N.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2008. — I. 105. — p. 20440–20445. 91. Leitão, C. The role of TCR specificity and clonal competition during reconstruction of the peripheral T cell pool / Leitão, C., Freitas, A., Garcia, S.// Journal of immunology. — 2009. — V. 182. — I. 9. — p. 5232–5239. 92. Li, Q. A central role for mTOR kinase in homeostatic proliferation induced CD8+ T cell memory and tumor immunity / Li, Q., Rao, R. R., Araki, K., Pollizzi, K., Odunsi, K., Powell, J. D., Shrikant, P. A.// Immunity. — 2011. — V. 34. — I. 4. — p. 541–553. 93. Listman, J. A. Plasticity of the T cell receptor repertoire in TCR beta-chain transgenic mice / Listman, J. A., Rimm, I. . J., Wang, Y., Geller, M. C., Tang, J. C., Ho, S., Finn, P. W., Perkins, 153 D. L.// Cellular immunology. — 1996. — V. 167. — I. 1. — p. 44–55. 94. Lodolce, J. P. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation / Lodolce, J. P., Boone, D. L., Chai, S., Swain, R. E., Dassopoulos, T., Trettin, S., Ma, A. // Immunity. — 1998. — V. 9. — I. 5. — p. 669–676. 95. London, C. A. Functional responses and costimulator dependence of memory CD4+ T cells / London, C. A., Lodge, M. P., Abbas, A. K.// Journal of immunology. — 2000. — V. 164. — I. 1. — p. 265–272. 96. Madakamutil, L. T. CD8alphaalpha-mediated survival and differentiation of CD8 memory T cell precursors / Madakamutil, L. T., Christen, U., Lena, C. J., Wang-Zhu, Y., Attinger, A., Sundarrajan, M., Ellmeier, W., von Herrath, M. G., Jensen, P., Littman, D. R., Cheroutre, H.// Science. — 2004. — I. 304. — p. 590–593. 97. Maile, R. Lymphopenia-induced homeostatic proliferation of CD8+ T cells is a mechanism for effective allogeneic skin graft rejection following burn injury / Maile, R., Barnes, C. M., Nielsen, A. I., Meyer, A. A., Frelinger, J. A., Cairns, B. A.// The Journal of Immunology. — 2006. — I. 176. — p. 6717–6726. 98. Maillard, I. The requirement for Notch signaling at the beta-selection checkpoint in vivo is absolute and independent of the pre-T cell receptor / Maillard, I., Tu, L., Sambandam, A., Yashiro-Ohtani, Y., Millholland, J., Keeshan, K., Shestova, O., Xu, L., Bhandoola, A., Pear, W. S.// The Journal of experimental medicine. — 2006. — V. 203. — I. 10. — p. 2239–2245. 99. Marzo, A. L. Cutting edge: migration to nonlymphoid tissues results in functional conversion of central to effector memory CD8 T cells / Marzo, A. L., Yagita, H., Lefrançois, L.// Journal of immunology. — 2007. — V. 179. — I. 1. — p. 36–40. 100. Masopust, D. The role of programming in memory T-cell development / Masopust, D., Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R.// Current opinion in immunology. — 2004. — V. 16. — I. 2. — p. 217–225. 101. McLane, L. M. Differential Localization of T-bet and Eomes in CD8 T Cell Memory Populations / McLane, L. M., Banerjee, P. P., Cosma, G. L., Makedonas, G., Wherry, E. J., Orange, J. S., Betts, M. R.// Journal of immunology. — 2013. — V. 190. — p. 3207–3215. 102. Mescher, M. F.Signals required for programming effector and memory development by CD8+ T cells / Mescher, M. F., Curtsinger, J. M., Agarwal, P., Casey, K. A., Gerner, M., Hammerbeck, C. D., Popescu, F., Xiao, Z.// Immunological reviews. — 2006. — I. 211. — 154 p. 81–92. 103. Milner, J. D. Autoimmunity in severe combined immunodeficiency (SCID): lessons from patients and experimental models / Milner, J. D., Fasth, A., Etzioni, A// Journal of clinical immunology. — 2008. — I. 28. — p. 29–33. 104. Mobley, J. L. Regulation of adhesion molecule expression by CD8 T cells in vivo. I. Differential regulation of gp90MEL-14 (LECAM-1), Pgp-1, LFA-1, and VLA-4 alpha during the differentiation of cytotoxic T lymphocytes induced by allografts / Mobley, J. L., Dailey, M. O.// Journal of immunology. — 1992. — V. 148. — I. 8. — p. 2348–2356. 105. Mobley, J. Regulation of Adhesion Molecule Expression by CD8 T Cells In Vivo / Mobley, J., Rigby, S. M., Dailey, M// Journaf of Immunology. — 1994. — V. 153. — p. 5443–5452. 106. Moran, A. E. T-cell receptor affinity in thymic development / Moran, A. E., Hogquist, K. A.// Immunology. — 2012. — V. 135. —I. 4. — p. 261–267. 107. Mousavi, S. F. OX40 Costimulatory Signals Potentiate the Memory Commitment of Effector CD8+ T Cells /Mousavi, S. F., Soroosh, P., Takahashi, T., Yoshikai, Y., Shen, H., Lefrancois, L., Borst, J., Sugamura, K., Ishii, N.// The Journal of Immunology. — 2008. — V. 181. — p. 5990–6001. 108. Moxham, V. F. Homeostatic proliferation of lymphocytes results in augmented memory-like function and accelerated allograft rejection / Moxham, V. F., Karegli, J., Phillips, R. E., Brown, K. L., Tapmeier, T. T., Hangartner, R., Sacks, S. H., Wong, W. // Journal of immunology. — 2008. — V. 180. — I. 6. — p. 3910–3918. 109. Murali-Krishna, K. Persistence of Memory CD8 T Cells in MHC Class I-Deficient Mice / Murali-Krishna, K.// Science. — 1999. — I. 286. — p. 1377–1381. 110. Murali-Krishna, K. Cutting edge: naive T cells masquerading as memory cells / MuraliKrishna, K., Ahmed, R.// Journal of immunology. — .2000. — V. 165. — I. 4. — p. 1733– 1737. 111. Murphy, K. P. Janeway’s immunobiology / Murphy, K. P. — New York: Garland Science.— 2012. 112. Obar, J. J. Endogenous Naive CD8+ T Cell Precursor Frequency Regulates Primary and Memory Responses to Infection /Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrançois, L. // Immunity. — 2008. — V. 28. — I. 6. — p. 859–869. 155 113. Oberoi, P. EGFR-Targeted Granzyme B Expressed in NK Cells Enhances Natural Cytotoxicity and Mediates Specific Killing of Tumor Cells / Oberoi, P., Jabulowsky, R. A., Bähr-Mahmud, H., Wels, W. S.// PloS one. — 2013. — V. 8. — I. 4. — p. e61267. 114. Ouyang, W. An essential role of the Forkhead-box transcription factor Foxo1 in control of T cell homeostasis and tolerance / Ouyang, W., Beckett, O., Flavell, R., Li, M. // Immunity. — 2009. — V. 30. — I. 3. — p. 358–371. 115. Peacock, C. D. Attrition of virus-specific memory CD8+ T cells during reconstitution of lymphopenic environments / Peacock, C. D., Kim, S., Welsh, R. M.// Journal of immunology. — 2003. — V. 171. — I. 2. — p. 655–663. 116. Perkins, D. L. Restriction of the TCR repertoire inhibits the development of memory T cells and prevents autoimmunity in lpr mice / Perkins, D. L., Listman, J. A., Marshak-Rothstein, A., Kozlow, W., Kelley, V. R., Finn, P. W., Rimm, I. J.// The Journal of Immunology. — 1996. — V. 156. — p. 4961–4968. 117. Prehn, R. T. Immunity to methylcholanthrene-induced sarcomas / Prehn, R. T., Main, J. M. // J Natl Cancer Inst. — 1957. — V. 18. — I. 6. — p. 769–778. 118. Qi, Y. How do tumor stem cells actively escape from host immunosurveillance? / Qi, Y., Li, R.-M., Kong, F.-M., Li, H., Yu, J.-P., Ren, X.-B. // Biochemical and biophysical research communications. — 2012. — V. 420. — I. 4. — p. 699–703. 119. Quigley, M. Extent of stimulation controls the formation of memory CD8 T cells / Quigley, M., Huang, X., Yang, Y// Journal of immunology. — 2007. — V. 179. — I. 9. — p. 5768– 5777. 120. Rao, R. R. Transcription factor Foxo1 represses T-bet-mediated effector functions and promotes memory CD8(+) T cell differentiation / Rao, R. R., Li, Q., Gubbels Bupp, M. R., Shrikant, P. A.// Immunity. — 2012. — V. 36. — I. 3. — p. 374–387. 121. Rao, R. R. The mTOR kinase determines effector versus memory CD8+ T cell fate by regulating the expression of transcription factors T-bet and Eomesodermin / Rao, R. R., Li, Q., Odunsi, K., Shrikant, P. A. // Immunity. — 2010. — V. 32. — I. 1. — p. 67–78. 122. Rescigno, M. Dendritic cells at the end of the millennium / Rescigno, M., Granucci, F., Ricciardi-Castagnoli, P.// Immunology and cell biology. — 1999. — V. 77. — I. 5. — p. 404– 410. 123. Rifa’i, M. Essential roles of CD8+CD122+ regulatory T cells in the maintenance of T cell 156 homeostasis / Rifa’i, M., Kawamoto, Y., Nakashima, I., Suzuki, H.// The Journal of experimental medicine. — 2004. — V. 200. — I. 9. — p. 1123–1134. 124. Rocha, B. CD8 T cell memory / Rocha, B., Tanchot, C.// Seminars in immunology. — 2004. — V. 16. — I. 5. — p. 305–14. 125. Rogers, P. R. Qualitative changes accompany memory T cell generation: faster, more effective responses at lower doses of antigen / Rogers, P. R., Dubey, C., Swain, S. L.// Journal of immunology. — 2000. — V. 164. — I. 5. — p. 2338–2346. 126. Rulicke, T. Special Review Series — Gene Manipulation and Integrative Physiology. Germ line transformation of mammals by pronuclear microinjection / Rulicke, T., Hubscher, U.// Experimental Physiology. — 2000. — V. 85. — I. 6. — p. 589—601. 127. Sallusto, F. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance / Sallusto, F., Geginat, J., Lanzavecchia, A.// Annual review of immunology. — 2004. — I. 22. — p. 745–763. 128. Sallusto, F. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials / Sallusto, F., Lenig, D., Forster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. // Nature. — 1999. — I. 401. — p. 708– 712. 129. Sarkar, S. Functional and genomic profiling of effector CD8 T cell subsets with distinct memory fates / Sarkar, S., Kalia, V., Haining, W. N., Konieczny, B. T., Subramaniam, S., Ahmed, R.// The Journal of experimental medicine. — 2008. — V. 205. —I. 3. — p. 625– 640. 130. Savage, P. A. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response / Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M.// Immunity. — 1999. — V. 10. — I. 4. — p. 485–492. 131. Schamel, W. W. A. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response / Schamel, W. W. A., Arechaga, I., Risueño, R. M., Van Santen, H. M., Cabezas, P., Risco, C., Valpuesta, J. M., Alarcón, B.// The Journal of experimental medicine. — 2005. — V. 202. — I. 4. — p. 493–503. 132. Selin, L. K. Plasticity of T cell memory responses to viruses / Selin, L. K., Welsh, R. M.// Immunity. — 2004. — I. 20. p. 5–16. 133. Seymour, K. Selection of metastatic tumour phenotypes by host immune systems / Seymour, K., Pettit, S., O’Flaherty, E., Charnley, R. M., Kirby, J. A. // The Lancet. — 1999. — V. 354. 157 — I. 9194. — p. 1989–1991. 134. Sinclair, L. V. Phosphoinositide 3-kinase ( PI3K ) and nutrient sensing mTOR ( mammalian target of rapamycin ) pathways control T lymphocyte trafficking / Sinclair, L. V., Finlay, D., Feijoo, C., Cornish, G. H., Gray, A., Ager, A., Okkenhaug, K., Hagenbeek, T. J., Spits, H., Cantrell, D. A. // Nature immunology. — 2008. — V. 9. — I. 5. — p. 513–521. 135. Smithson, G. The role of NK cells in the regulation of experimental metastasis in a murine lymphoma system / Smithson, G., Bittick, T. H., Chervenak, R., Lee, S. J., Wolcott, R. M. // Journal of leukocyte biology. — 1991. — V. 49. — I. 6. — p. 621–629. 136. Stadinski, B. D. A role for differential variable gene pairing in creating T cell receptors specific for unique major histocompatibility ligands / Stadinski, B. D., Trenh, P., Smith, R. L., Bautista, B., Huseby, P. G., Li, G., Stern, L. J., Huseby, E. S.// Immunity. — 2011. — V. 35. — I. 5. — p. 694–704. 137. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets / Stemberger, C., Huster, K. M., Koffler, M., Anderl, F., Schiemann, M., Wagner, H., Busch, D. H.// Immunity. — 2007. — V. 27. — I. 6. — p. 985–997. 138. Stonier, S. W. Dendritic cells drive memory CD8 T-cell homeostasis via IL-15 transpresentation / Stonier, S. W., Ma, L. J., Castillo, E. F., Schluns, K. S.// Blood. — 2008. — V. 112. — I. 12. — p. 4546–4554. 139. Suchin, E. J. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question / Suchin, E. J., Langmuir, P. B., Palmer, E., Sayegh, M. H., Wells, A. D., Turka, L. A.// Journal of immunology. — 2001. — V. 166. — I. 2. — p. 973–81. 140. Surh, C. D. Homeostasis of memory T cells / Surh, C. D., Boyman, O., Purton, J. F., Sprent, J. // Immunological reviews. — 2006. — I. 211. — p. 154–163. 141. Surh, C. D. Homeostatic T cell proliferation: how far can T cells be activated to self-ligands? / Surh, C. D., Sprent, J. // The Journal of experimental medicine. — 2000. — V. 192. — I. 4. — F9–F14. 142. Suzuki, H. Deregulated T cell activation and autoimmunity in mice lacking interleukin-2 receptor β / Suzuki, H., Kündig, T. M., Furlonger, C., Wakeham, A., Timms, E., Matsuyama, T., Schmits, R., Simard, J. J., Ohashi, P. S., Griesser, H., Mak, T. W. // Science. — 1995. — V. 268. — I. 5216. — p. 1472–1476. 143. Suzuki, H. Are CD8+CD122+ cells regulatory T cells or memory T cells? / Suzuki, H., Shi, 158 Z., Okuno, Y., Isobe, K.// Human immunology. — 2008. — V. 69. — I. 11. — p. 751–754. 144. Svane, I. M. Chemically induced sarcomas from nude mice are more immunogenic than similar sarcomas from congenic normal mice / Svane, I. M., Engel, A. M., Nielsen, M. B., Ljunggren, H. G., Rygaard, J., Werdelin, O. // European journal of immunology. — 1996. — V. 26. — I. 8. — p. 1844–1850. 145. Takeda, K. Toll-like receptors / Takeda, K., Kaisho, T., Akira, S.// Annual review of immunology. — 2003. — V. 21. — I. 1. — p. 335–376. 146. Takemoto, N. Cutting Edge: IL-12 inversely regulates T-bet and eomesodermin expression during pathogen-induced CD8+ T cell differentiation / akemoto, N., Intlekofer, A. M., Northrup, J. T., Wherry, E. J., Reiner, S. L.// Journal of immunology. — 2006. — V. 177. I. 11. — p. 7515–7519. 147. Tan, J. T. Interleukin (IL)-15 and IL-7 Jointly Regulate Homeostatic Proliferation of Memory Phenotype CD8+ Cells but Are Not Required for Memory Phenotype CD4+ Cells / Tan, J. T., Ernst, B., Kieper, W. C., LeRoy, E., Sprent, J., Surh, C. D.// Journal of Experimental Medicine. — 2002. — V. 195. — I. 12. — p. 1523–1532. 148. Tanchot, C. Conversion of naive T cells to a memory-like phenotype in lymphopenic hosts is not related to a homeostatic mechanism that fills the peripheral naive T cell pool / Tanchot, C., Le Campion, A., Martin, B., Leaument, S., Dautigny, N., Bruno, L.// The Journal of Immunology. — 2002. — V. 168. — p. 5042–5046. 149. Terrence, K. Premature Expression of T Cell Receptor (Tcr)αβ Suppresses Tcrγδ Gene Rearrangement but Permits Development of γδ Lineage T Cells / Terrence, K., Pavlovich, C. P., Matechak, E. O., Fowlkes, B. J.// Journal of Experimental Medicine. — 2000. — V. 192. — I. 4. — p. 537–548. 150. Theofilopoulos, A. N. T cell homeostasis and systemic autoimmunity / Theofilopoulos, A. N., Dummer, W., Kono, D. H. // Journal of Clinical Investigation. — 2001. — V. 108. — I. 3. —p. 335–340. 151. Tough, D. F. Stimulation of memory T cells by cytokines / Tough, D. F., Sun, S., Zhang, X., Sprent, J.// Vaccine. — 2000. — I. 18. — p. 1642–1648. 152. Tussey, L. Functionally distinct CD8+ memory T cell subsets in persistent EBV infection are differentiated by migratory receptor expression / Tussey, L., Speller, S., Gallimore, A., Vessey, R.// European journal of immunology. — 2000. — V. 30. — I. 7. — p. 1823–1829. 159 153. Van Gisbergen, K. P. J. M. Protective CD8 T cell memory is impaired during chronic CD70driven costimulation / Van Gisbergen, K. P. J. M., Van Olffen, R. W., Van Beek, J., Van der Sluijs, K. F., Arens, R., Nolte, M. A., Van Lier, R. A.// Journal of immunology. — 2009. — V. 182. — I. 9. — p. 5352–5362. 154. Veiga-Fernandes, H. High expression of active CDK6 in the cytoplasm of CD8 memory cells favors rapid division / Veiga-Fernandes, H., Rocha, B.// Nature immunology. — 2004. — V. 5. — I. 1. — p. 31–37. 155. Veiga-Fernandes, H. Response of naïve and memory CD8+ T cells to antigen stimulation in vivo / Veiga-Fernandes, H., Walter, U., Bourgeois, C., McLean, A., Rocha, B.// Nature immunology. — 2000. — V. 1. — I. 1. 1 p. 47–53. 156. Villa, A. Genetically determined lymphopenia and autoimmune manifestations / Villa, A., Marrella, V., Rucci, F., Notarangelo, L. D. // Current opinion in immunology. — 2008. — V. 20. — I. 3. — p. 318–324. 157. Von Boehmer, H. Early expression of a T-cell receptor beta-chain transgene suppresses rearrangement of the Vy4 gene segment / Von Boehmer, H., Bonnevillet, M., Ishidat, I., Ryser, S., Lincoln, G., Smith, R. T., Kishi, H., Scott, B., Kisielow, P., Tonegawa, S.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1988. — I. 85. — p. 9729–9732. 158. Walzer, T. Differential in vivo persistence of two subsets of memory phenotype CD8 T cells defined by CD44 and CD122 expression levels / Walzer, T., Arpin, C., Beloeil, L., Marvel, J.// Journal of immunology. — 2002. — V. 168. — I. 6. — p. 2704–2711. 159. Wang, L. X. CD122+ CD8+ Treg suppress vaccine-induced antitumor immune responses in lymphodepleted mice / Wang, L. X., Li, Y., Yang, G., Pang, P., Haley, D., Walker, E. B., Urba, W. J., Hu, H. M.// European journal of immunology. — 2010. — V. 40. — I. 5. — p. 1375– 1385. 160. Wherry, E. J. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets / Wherry, E. J., Teichgräber, V., Becker, T. C., Masopust, D., Kaech, S. M., Antia, R., Von Andrian, U. H., Ahmed, R. // Nature immunology. — 2003. — V. 4. — I. 3. — p. 225–234. 161. Williams, A. Position effect variegation and imprinting of transgenes in lymphocytes / Williams, A., Harker, N., Ktistaki, E., Veiga-Fernandes, H., Roderick, K., Tolaini, M., Norton, T., Williams, K., Kioussis, D.// Nucleic acids research. — 2008. — V. 36. — I. 7. — p. 2320– 160 2329. 162. Williams, M. A. Shortening the infectious period does not alter expansion of CD8 T cells but diminishes their capacity to differentiate into memory cells / Williams, M. A., Bevan, M. J. // The Journal of Immunology. — 2004. — V. 173. — p. 6694–6702. 163. Williams, M. A. Effector and memory CTL differentiation / Williams, M. A., Bevan, M. J.// Annual review of immunology. — 2007. — V. 25. — p. 171–192. 164. Willinger, T. Molecular signatures distinguish human central memory from effector memory CD8 T cell subsets / Willinger, T., Freeman, T., Hasegawa, H., McMichael, A. J., Callan, M. F. C.// The Journal of Immunology. — 2005. — V. 175. — p. 5895–5903. 165. Wilson, C. B. DNA methylation and the expanding epigenetics of T cell lineage commitment / Wilson, C. B., Makar, K. W., Shnyreva, M., Fitzpatrick, D. R.// Seminars in immunology. — 2005. — V. 17. — I.2. — p. 105–19. 166. Woodland, D. L. Migration, maintenance and recall of memory T cells in peripheral tissues / Woodland, D. L., Kohlmeier, J. E.// Nature reviews. Immunology. — 2009. — V. 9. — I. 3. — p. 153–161. 167. Woodruff, M. F. The effect of passage in vitro and in vivo on the properties of murine fibrosarcomas I. Tumorigenicity and immunogenicity / Woodruff, M. F., Hodson, B. A. // British journal of cancer. — 1985. — V. 51. — I. 2. — p. 161–169. 168. Wullschleger, S. TOR signaling in growth and metabolism / Wullschleger, S., Loewith, R., Hall, M. N.// Cell. — 2006. — V. 124. — I. 3. — p. 471–484. 169. Yamada, T. Transcription factor ELF4 controls the proliferation and homing of CD8+ T cells via the Krüppel-like factors KLF4 and KLF2 / Yamada, T., Park, C. S., Mamonkin, M., Lacorazza, H. D.// Nature immunology. — 2009. — V. 10. — I. 6. — p. 618–626. 170. Yamasaki, S. Mechanistic basis of pre-T cell receptor-mediated autonomous signaling critical for thymocyte development / Yamasaki, S., Ishikawa, E., Sakuma, M., Ogata, K., SakataSogawa, K., Hiroshima, M., Wiest, D. L., Tokunaga, M., Saito, T.// Nature immunology. — 2006. — V. 7. — I. 1. — p. 67–75. 171. Yao, Z. Selective resistance of CD44hi T cells to p53-dependent cell death results in persistence of immunologic memory after total body irradiation / Yao, Z., Jones, J., Kohrt, H., Strober, S. // Journal of immunology. — 2011. — V. 187. — I. 8. — p. 4100–4108. 161 172. Yasuda, M. CD44: functional relevance to inflammation and malignancy / Yasuda, M., Nakano, K., Yasumoto, K., Tanaka, Y.// Histology and Histopathology. — 2002. — V. 17. — p. 945–950. 173. Zehn, D. Complete but curtailed T cell response to very low affinity antigen / Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J.// Nature. — 2009. — V. 458. — I. 7235. — p. 211–214. 174. Zhumabekov, T. Improved version of a human CD2 minigene based vector for T cell-specific expression in transgenic mice / Zhumabekov, T., Corbella, P., Tolaini, M., Kioussis, D. // Journal of Immunological Methods. — 1995. — V. 185. —I. 1. — p. 133–140. 175. Zinkernagel, R. M. On immunological memory / Zinkernagel, R. M., Bachmann, M. F., Kündig, T. M., Oehen, S., Pirchet, H., Hengartner, H.// Annual review of immunology. — 1996. — V. 14. p. 333–367.
