диссертация кандидата наук, Календарь руслан Николаевич

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК
СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
на правах рукописи
КАЛЕНДАРЬ
РУСЛАН НИКОЛАЕВИЧ
УДК 575.11.113:633.16
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО
ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОМА ЯЧМЕНЯ
(HORDEUM VULGARE L.) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ
ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
03.00.26 - молекулярная генетика
Диссертация на соискание
ученой степени кандидата
биологических наук
Научный руководитель
доктор биологических наук,
профессор, член.-корр.УААН,
Ю.М. Сиволап
ОДЕССА - 1996
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
4
ГЛАВА 1. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма с помощью
6
молекулярных маркеров
1.1. Белковые маркеры
6
1.1.1. Особенности белковых маркеров
6
1.1.2. Применение белковых маркеров в генетико-селекционных
11
исследованиях
1.1.3. Ограничения в использовании белковых маркеров
14
1.2. ДНК-маркеры
15
1.2.1. Полиморфизм длин рестрикцированных фрагментов ДНК (ПДРФ)
17
1.2.2. Особенности ПДРФ-маркеров
19
1.2.3. Применение ПДРФ-маркеров
19
1.2.4. Полиморфизм амплифицированных фрагментов геномной
ДНК
27
ГЛАВА 2. Материалы и методы
40
2.1. Используемый материал
40
2.2. Выделение высокомолекулярной растительной ДНК
41
2.3. Полимеразная цепная реакция
41
2.4. Синтез и очистка олигонуклеотидов
42
2.4.1. Очистка коротких (до 40 нуклеотидов) олигонуклеотидов на ОРС
46
2.4.2. Очистка 10-членных олигонуклеотидов
47
2.4.3. Очистка олигонуклеотидов в полиакриламидном геле
48
2.5. Электрофорез и идентификация изоферментов
49
2.6. Компьютерный анализ полученных результатов
49
2.6.1. Определение сцепления и картирование молекулярных
49
маркеров с помощью программы “MAP_QTL”
2.6.2.
Постороение
схем филогенетических взаимоотношений
с помощью 54
программы “TREE 4.0”
2.7. Количественные показатели
57
ГЛАВА 3. Оптимизация условий полимеразной цепной реакции с произвольными 58
праймерами
3.1. Моделирование полимеразной цепной реакции
58
3.2. Оптимизация условий проведения отжига ПЦР
64
3.3. Оптимизация остальных условий полимеразной цепной реакции
70
3
3.4. Моделирование произвольных праймеров для исследования молекулярно- 76
генетического полиморфизма
ГЛАВА 4. Исследование меж- и внутривидового полиморфизма рода Hordeum L
85
4.1. Специфичность произвольных праймеров при выявлении полиморфизма
85
4.2. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма
между видами 90
рода Hordeum L
4.3. Исследование внутривидового полиморфизма вида Hordeum vulgare L.
98
ГЛАВА 5. Картирование генома ячменя и идентификация локусов количественных 106
признаков
5.1. Картирование продуктов ПЦР при помощи самоопыляющейся популяции F8, 106
Одесский115/Гольф
5.2. Маркерный анализ количественных признаков....................123
123
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
136
ЛИТЕРАТУРА
138
4
ВВЕДЕНИЕ
В
методологии
исследования
молекулярно-генетического
полиморфизма
растений за последнее время сделан шаг вперед, благодаря использованию ДНКмаркеров и, в частности, маркеров, полученных на основе полимеразной цепной
реакции (ПЦР). Быстрота получения результатов и относительная дешевизна
полимеразной цепной реакции - это то, что особенно прельщает в этом методе.
Данный
метод
легко
осваиваем
и,
поэтому,
может
быть
доступен
многим
лабораториям занимающимися изучением организации генома.
Наибольшее
развитие
в
исследовании
молекулярно-генетического
полиморфизма получил вариант полимеразной цепной реакции с единичным коротким
произвольным праймером
(ПП-ПЦР или RAPD - Random Amplified DNA). Первые
работы по использованию ПП-ПЦР были проведены на сое и микроорганизмах где
данный метод показал себя как наиболее эффективный способ дифференциации
организмов и их идентификации. Сегодня уже сложно найти в молекулярной генетике
область, где не использовался бы данный метод. Сложно найти и организмы, геномы
которых бы не исследовали с помощью полимеразной цепной реакции. Это особенно
заметно по тем мировым проектам, которые сегодня используют ДНК-маркеры для
наиболее детального исследования особоценных в народном хозяйстве организмов.
Так, Северо-американский проект по картированию генома ячменя (North American
Barley Genome Mapping Project) объединил более 26 лабораторий США, Канады и
стран Европы, в том числе и Украины для детального картирования генома ячменя,
идентификации локусов отвечающих за количественные признаки и устойчивость к
болезням. До 1994 года основными маркерами в исследовании генома ячменя служили
ПДРФ-маркеры, сегодня отработан метод полимеразной цепной реакции, ее вариант полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP - Amplified Fragment Leght
Polymorphism).
При использовании ПП-ПЦР в различных лабораториях иногда возникает
проблема воспроизводимости результатов, иногда и в пределах одного опыта.
Интерпретация
результатов
требует
разработки
теоретических
аспектов.
Как
рассматривать данную полосу - как уникальный участок генома или повтор?
Сложности возникают и в теоретическом плане. Авторы проводят реакцию в
неоптимальных условиях для конкретных праймеров или механически повторяют те
условия реакции, которые предложены первыми авторами. А это не практично при
использовании
праймеров
различных размеров и последовательности. Целью
5
настоящей работы явился анализ молекулярно-генетического полиморфизма генома
ячменя с помощью оптимизированных условий полимеразной цепной реакции с
произвольными праймерами, картирование продуктов полимеразной цепной реакции и
определение сцепления локусов количественных признаков и молекулярных маркеров.
Непосредственными задачами работы были:
1. Оптимизация условий полимеразной цепной реакции с произвольными
праймерами: оптимизация состава реакционного раствора для повышения выхода и
воспроизводимости амплификации; подбор температурного режима полимеразной
цепной реакции.
2. Исследование межвидового полиморфизма рода Hordeum L.
3. Исследование внутривидового полиморфизма вида Hordeum vulgare.
4. Картирование генома ячменя с помощью продуктов ПП-ПЦР и идентификация
локусов количественных показателей.
ГЛАВА 1. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма с помощью
молекулярных маркеров
Необходимым условием любого генетического анализа является наличие у
изучаемых форм полиморфных признаков. Полиморфным называется менделевский
(моногенный) признак, по которому в популяции присутствует не менее двух
фенотипов и, по крайней мере, два генотипа, которые встречаются с частотой не
менее 5%. В популяциях часто присутствует больше двух аллелей одного локуса и,
соответственно, более чем два фенотипа по данному локусу.
Отмечаются также
редкие генетические варианты, которые условно определяются как моногенные
признаки, присутствующие в популяции с частотой менее 5%.
полиморфный фактор локализован на хромосоме, тогда он
Если данный
становится маркером, по
которому можно выявить расположение других факторов. Обычно имеют дело не с
самим геном-маркером, а с его фенотипическим проявлением, представляющим собой
хорошо различимый качественный признак. Такой признак можно рассматривать как
фактор идентификации соответствующего ему гена, а также сцепленных с ним других
генов (Конарев и др., 1983).
6
1.1. Белковые маркеры
1.1. 1. Особенности белковых маркеров
Генетические
маркеры
играют
исключительно
важную
роль
в
оценке
наследственной конституции организма и служат одним из главных средств селекции.
В классической генетике в качестве маркеров использовались морфологические
признаки, набор которых в сравнении с количеством генов и генетических систем в
организме весьма ограничен. К тому же, подавляющая часть их нестабильна, зависит
от условий среды обитания организма, что проявляется в виде пенетрантности
(проявление фенотипа) и экспрессивности (уровень фенотипического проявления).
Полиморфизм
морфологических
признаков
является
главным
критерием
в
систематике, при изучении мутационного процесса, исследовании филогенетических
связей,
он
послужил
основой
для
формулирования
Н.И.Вавиловым
закона
гомологических рядов наследственной изменчивости.
Морфологические признаки не
всегда изменяются дискретно,
и на
их
проявление, как правило, существенное влияние оказывают условия выращивания.
Это наиболее ярко проявляется в селекции, где главное внимание уделяется
количественным полигенным признакам: продуктивности, устойчивости к абиотическим
стрессам, качеству урожая.
Новые возможности генетического маркирования
появились с привлечением молекулярных маркеров - белков и ДНК.
Белковые признаки в меньшей мере подвержены фенотипической изменчивости,
чем морфологические признаки. Белками могут быть маркированы некоторые
генетические
системы.
рибосомальных и
Исключение
составляют
системы
транспортных,
низкомолекулярных РНК, обеспечивающих синтез белка и сам
процесс передачи генетической информации от ДНК белку, а также неструктурная
зона, занимающая большую часть генома (Конарев и др., 1993). Белковые и ДНКмаркеры имеют ряд существенных преимуществ перед морфологическими. Они
позволяют при генетическом анализе избегать проблем, связанных с влиянием других
локусов. Морфологические признаки представляют собой лишь одно из проявлений
гена, а молекулярные, в случае кодоминирования, выявляют оба аллеля. Другие
аспекты фенотипа (как следствие плейотропии) могут быть скрыты от поверхностного
наблюдения. Белковые и ДНК маркеры дают возможность выявить недоступные
визуальному анализу точечные мутации.
7
В работе Vanhintum (1994) исследовали происхождение европейских сортов
ячменя с помощью полиморфных белковых систем - 19 изоферментов и гордеинов; Сокраски хромосом по Гимза; по 3-м морфологическим показателям и гену устойчивости
к DDT. Автор показал, что коэффициент сходства между сортами по эстеразе (Est1)
наибольший и равен 0.41. При окраске по Гимза значение коэффициента также велико
по сравнению с морфологическими признаками, где он минимален.
Белковые маркеры, как правило, наследуются кодоминантно и анализ генотипа
возможен непосредственно по белковому фенотипу. Благодаря этому, а также за счет
большего числа характеристик белковые маркеры дают возможность выявлять
генетическую
изменчивость
в
морфологически
однородных
популяциях
и
анализировать гибриды в популяции уже с первых поколений.
Разработка современных методов разделения и идентификации белковых
молекул
изоэлектрофокусирование,
(электрофорез,
гельфильтрация,
иммуноэлектрофорез и др.) позволила получить более достоверную информацию о
разнообразии макромолекул, а следовательно, и о различиях генотипов, так как по
ряду причин белки удобны как маркеры, но не всякий белковый признак может быть
использован как маркерный. Выбор белка-маркера и метода оценки его биологической
или генетической специфичности - одна из задач биохимической генетики. К
настоящему времени сложились и хорошо себя показали два главных принципа
маркирования, один из которых основан на использовании антигенной специфичности
белка, другой - на специфичности спектра компонентов множественных генетически
полиморфных
белков.
Им
соответствуют
два
типа
белковых
маркеров:
иммунохимические (серологические) и электрофоретические (Конарев и др., 1993).
Серологические маркеры хорошо отражают биологические свойства белка, его
принадлежность
виду,
роду,
что
позволяет
использовать белки-антигены
как
биологические, или филогенетические, маркеры. На реакции узнавания антигена
антителом основаны иммунохимические методы идентификации вида растений.
Характерно, что типы антигенов и многих полиморфных белков не изменяются в
онтогенезе и наследуется кодоминантно. Это позволяет использовать их в качестве
генетических маркеров (Созинов, 1985).
Использование
электрофоретических маркеров
основывается на физико-
химических свойствах белка, это прежде всего, - заряд, масса и форма молекулы.
Белковыми
признаками
здесь
служат
соответственно
электрофоретическая
8
подвижность, изоэлектрическая точка, число и разновидность субъединиц белка и их
позиции в электрофоретическом спектре.
В поисках генных маркеров для популяционных исследований приморского
гребешка (Mizuhopecten (Patinopecten) yessoensis Jay.) из более чем 30 изученных
белков
были
отобраны
аспартатаминотрансфераза,
7
высокополиморфных:
глюкозофосфатизомераза,
ацетат
4-метилбеллиферил
эстераза,
глутаматионредуктаза, октопиндегидрогеназа, фосфоглюкомутаза (Долганов, 1995). Их
гетерогенность
выявляли
методом
электрофореза
в
крахмальном
геле
с
использованием одной буферной системы. Автор провел идентификацию аллозимных
фенотипов этих белков, выявленных у гребешка разными авторами.
Для сортовой идентификации и решения проблем, связанных с изменчивостью
внутри
вида,
необходимы
генетически
полиморфные
белковые
системы.
Полиморфизм таких систем обусловлен аллельной изменчивостью и раскрывается при
помощи электрофореза. Это дает возможность по спектру компонентов полиморфного
белка различать генотипы и идентифицировать сорта, биотипы и линии.
Среди
группы
множественных
генов,
кодирующих
белки
с
разной
электрофоретической подвижностью, наряду с многоаллельными и диалельными
могут быть гены с большим преобладанием по частоте встречаемости в переделах
популяции или вида какого-либо одного аллеля (другие аллели очень редки или вовсе
не проявляются). Белки таких генов считаются мономорфными.
По этой причине электрофоретический спектр гетерогенных многокомпонентных
белков часто представляет собой совокупность мономорфных и в разной степени
полиморфных (аллельных) белков. Мономорфные (по подвижности) компоненты
являются общими, то есть одинаковыми, для всех представителей вида. Остальные, в
зависимости от степени полиморфизма, или множественности аллелей, могут быть
общими для представителей подвида, популяции или генетической группы, например,
биотипа. В совокупности, спектры множественных (полигенных) и генетически
полиморфных (за счет многоаллельности генов) белков дают представление о
множественности генов данного белка, аллельной структуре генов, структуре
популяций, биотипном составе сорта и о генетических отношениях между сортами,
биотипами и популяциями в пределах вида (Созинов, 1975, 1985; Конарев, 1993).
При использовании электрофореза в генетическом анализе сортов и популяций
учитывается,
что гетерогенность некоторых белков
может
быть обусловлена
9
посттрансляционной изменчивостью за счет модификаций типа гликозилирования,
метилирования, фосфорилирования, протеолиза и др.
Большое число изоферментных систем в организме позволяет маркировать
практически все хромосомы генома, а также многие локусы в пределах отдельных
хромосом. Изоферментный анализ может проводиться на больших выборках, причем
для изучения требуется, как правило, очень мало материала.
1.1.2. Применение белковых маркеров в генетико-селекционных исследованиях
Примером использования изоферментов в качестве надежных генетических
маркеров могут служить работы по картированию изоферментных локусов у ячменя
(Yoshimi, Konishi, 1995). 46 изоферментов исследовались на линиях пшеницы,
дополненных хромосомами ячменя. Для некоторых изоферментов была уточнена их
локализация на хромосомах. Такие изоферменты как эстераза 5 (Est5) и 6фосфоглюконат дегидрогеназа (Pgd1) идентифицированы на 1 хромосоме; аспартат
аминотрансфераза (Aat2) - на 6 хромосоме; эстераза 9 (Est9) - на 7. Локусы Est5 и
Pgd1 сцеплены как между собой (6.5% рекомбинации), так и с морфологическим
признаком хлорина fc (Est5-Pgd1-fc). Вторая группа сцепления связана с длинным
плечом 6 хромосомы: o-Aat2-l9 (o - оранжевая лемма; l9 - плотный колос). Третья
группа сцепления: fs-s-r-Est5 - на длинном плече 7 хромосомы. Эти изоферментные
локусы могут быть сцеплены с некоторыми важными агрономическими локусами,
такими как устойчивость к болезням.
Нецветаевым (Netsvetaev, 1992; 1993) изучена генетика b-амилаз, выделенных
из зрелого и проросшего зерна ячменя. Анализ дополненных пшенично-ячменных
линий подтвердил, что локус BmyI, контролирующий синтез b-амилаз, находится в
хромосоме 4 ячменя. Многочисленный тест по данным анализа двух комбинаций
скрещивания дал следующий порядок расположения BmyI относительно известных
генов: f9=K0=g12=ml-o=BmyI. Им идентифицирован новый аллель - Bmy IAL,
характерный для сортов Algerian, Asse, Imula, Zenit.
У пшеницы достаточно подробно исследовались изоферменты a-амилазы, так
как от активности этого фермента зависит проявление одного из очень важных
признаков - способности прорастания зерна на корню (Созинов, 1983; Netsvetaev,
1992; Илличевский и др., 1995).
10
Для идентификации сортов, биотипов и анализа популяций эффективны
многокомпонентные и генетически полиморфные изоферментные системы. По данным
ряда авторов, многокомпонентность и высокая степень полиморфизма характерны для
эстеразы овса, ячменя, ржи и многих других культур. Идентификация листовых эстераз
11 и 12 у ячменя (H.vulgare) и их генетических контроль выяснены Нецветаевым
(1992a; Netsvetaev, 1992б). Им также проведен анализ сцепления эстераз 4 и 11 с
морфологическим признаком Ble (голубой эндосперм) у H.spontaneum (Netsvetaev,
1992г).
Наибольшее распространение в сортовой идентификации получили запасные
белки семян. В комплекс признаков, по которым оценивается сортовой материал,
введен официальный контроль по запасным белкам зерна (глиадину и глютелину) всей
зерновой продукции как при закупке у производителей, так и при международной
торговле зерном, особенно семенным материалом. Запасные белки множественны,
полиморфны и локализованы в морфогенетически однородных тканях - эндосперме и
семядолях зрелого семени. Высокий процент содержания их в тканях позволяет брать
для анализа часть зерна, используя другую (с зародышем) для посева.
Спирторастворимые белки зерна ячменя (гордеины) являются одной из
наиболее полиморфных белковых систем, известных на данный момент у этой
культуры. Такая полиморфная система, как гордеины, может служить удобным
инструментом для быстрой идентификации, определения чистоты и подлинности сорта
(Поморцев и др., 1994а). Кроме того, гордеинкодирующие локусы являются удобными
фланговыми маркерами полиаллельного локуса Ml-a, контролирующего устойчивость
растений ячменя к мучнистой росе. Это позволяет в ранних поколениях, начиная с
зерен F2, применять электрофорез гордеинов для отбора гомозиготных по указанному
гену устойчивости генотипов, а также создавать формы с комплексом генов
резистентности
к
патогену.
Ведутся
исследования
и
по
использованию
гордеинокодирующих локусов в качестве маркеров генов других хозяйственнополезных признаков.
Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об адаптивном значении
полиморфизма гордеинов. Так, Nevo et al. (1983) при изучении полиморфизма
проламинов в четырех субпопуляциях дикого ячменя Hordeum spontaneum Koch.
обнаружили существенные корреляции между некоторыми фенотипами гордеинов и
микрогеографическими условиями произрастания.
11
Анализ гордеинов, контролируемых локусами Hrd A (Hor 1), Hrd B (Hor 2) и Hrd F
(Hor 5), у 226 сортов ярового ячменя, районированных за последние 62 года на
территории бывшего СССР, показал значительный полиморфизм указанных локусов,
неоднородность частот аллелей и неравномерность их распределения на территории
страны (Поморцев и др., 1994б). Показано, что на территории европейской части
СССР распространение и частоты аллелей локусов Hrd существенно зависят от
воздействия таких климатических факторов, как среднегодовое количество осадков и
средняя температура июля.
Методы белковых маркеров могут быть использованы (и используются) в
сочетании с любыми методами отбора и на всех этапах селекционного процесса - от
изучения
исходного
материала
и
поиска
источников
до
сортоиспытания
и
семеноводства созданных сортов (Конарев и др., 1986).
1.1.3. Ограничения в использовании белковых маркеров
При использовании изоферментных систем в генетическом анализе растений
учитывается ряд обстоятельств. Это, прежде всего, органная, тканевая и субклеточная
специфичность зимограмм многих ферментов, что, естественно, в большей мере
отражает функциональную разнокачественность их морфогенетических систем. В
цикле развития клеток и, особенно, при переходе эмбриональных клеток в фазу
дифференцировки
и
специализации
отмечаются
смены
типов
зимограмм.
Соответственно возможны изменения в спектре изозимов по фазам развития
организма.
Наконец,
зимограммы
ряда
ферментов,
особенно
функционально
лабильных (пероксидазы, алкогольдегидрогеназы и др.), в той или иной мере
изменяются под влиянием таких факторов, как температура, фотопериод, инфекция и
условия питания растений (Cозинов, 1983; Netsvetaev, Krestinkov, 1992).
Сложность при изоферментном анализе состоит в идентификации субъединиц
изоферментов
и
особенно
аллоферментов,
представленных
множественными
аллелями отдельных генов либо блоков генов.
Для таких экспрессируемых продуктов генов, как запасные белки и ферменты,
характерен высокий уровень полиморфизма, однако их число ограничено и,
соответственно, ограничено число исследуемых локусов. Кроме того различные
участки
генома
эволюционируют
с
различной
скоростью,
и,
следовательно,
исследование одного или нескольких участков генома дает информацию о небольшой
части генома.
12
Генетическая изменчивость, наблюдаемая на уровне ДНК, существенно выше.
Поскольку значительная часть генома, вероятно, не принимает прямого участия в
регуляции или кодировании продуктов генов, мутации в этих не регуляторных и не
кодирующих участках ДНК могут не иметь фенотипического выражения и являются
селективно нейтральными. Кроме того, очень важное преимущество ДНК-ового уровня
над белковым - это возможность исследовать изменчивость не тестируемых
неполиморфных
белковыми
локусами.
Использование
ДНК-маркеров
является
наиболее перспективным инструментом в исследовании молекулярно-генетического
полиморфизма.
1.2. ДНК-маркеры
1.2.1. Полиморфизм длин рестрицированных фрагментов ДНК
(ПДРФ)
Наиболее распространенный тип исследования полиморфизма ДНК
-
рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-либо рестриктазы
происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК.
Имея специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать геномную ДНК.
Рестриктированные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине при их
разделении на геле после электрофореза. Фрагменты ДНК, разделенные по размеру с
помощью агарозного гельэлектрофореза, сначала денатурируют, а затем переносят на
нитроцеллюлозный (капроновый) фильтр и иммобилизируют. При переносе на фильтр
относительное положение фрагментов ДНК в геле сохраняется. ДНК, связанную с
фильтром, гибридизуют с ДНК или РНК, меченую
32
P, и на радиоавтографе находят
положение полос, комплементарных радиоактивному зонду.
Обычными метками нуклеиновых кислот являются радиоизотопы, в первую
очередь
32
P,
32
Sи
125
I, которые вводятся в ДНК или РНК с помощью разнообразных
ферментативных методов. Достигаемая чувствительность составляет 10-17 - 10-18 моль
ДНК в образце (Бадашкеева, 1989). Некоторые ферменты, например пероксидазу и
щелочную
фосфатазу,
олигонуклеотидными
можно
пробами;
связывать
химически
таким образом,
с
синтетическими
появляется возможность для
высокочувствительного метода обнаружения с помощью каталитического действия
фермента на соответствующий субстрат. Действие фермента можно обнаружить по
осадку
хромофора
или
по
появлению
окрашенных,
флуоресцирующих
или
люминесцирующих молекул в растворе. Чувствительность нерадиактивного мечения
13
сходна с чувствительностью радиоизотопного метода (Ландегрен и др., 1990). Наряду
с биотином используется также дигоксигенин (Lion, 1990; Schmitz, 1991), флуорофоры
(флюоресцеин,
родамин),
они
стабильны,
обнаружить
их
можно
при
непосредственном наблюдении (Kuller, 1989; Oser, 1990). Однако, более чувствителен
нерадиоактивный метод - флуоресценция хелатов ионов редкоземельных металлов
(таких, как европий Eu(III) (Praf, 1991) или тербий Tb(III) (Oser, 1990), а так же
батофенантролин рутения Ru(II) (Bannwarth, 1989) (его чувствительность сравнима с
методом радиоизотопов) (Pollard-Knight, 1990).
14
1.2.2. Особенности ПДРФ-маркеров
ПДРФ-маркеры обладают теми же достоинствами, что и белковые: они
наследуются в соответствии с законами Менделя (Фогель и др.,Т2, c.288, 1990;
Yanagisawa et al, 1994) по кодоминантному типу, независимы от условий выращивания
растений и не опосредствованы плейотропией гена.
К указанным выше преимуществам этих маркеров следует отнести:
a) возможность использовать ДНК любой ткани для генетического анализа или
сортовой идентификации на всех этапах развития растения (при этом, для анализа по
Саузерну достаточно 5-10 мкг ДНК, для получения которой требуется навеска листьев
менее 1г.);
б) экспериментатор может использовать большое число комбинаций рестриктаз
и фактически безгранично повышать разрешающую способность метода;
в) использование зондов, получаемых на основе средних и высоких повторов
значительно увеличивает количество информации в генетическом анализе, так как
один зонд в данном случае будет гибридизоваться со многими локусами (а не
преимущественно с одним, как в случае его уникальности), причем фрагменты ДНК, к
которой принадлежат локусы, могут гораздо чаще демонстрировать полиморфизм
длин рестрикционных фрагментов.
Показано, что пробы 5S ДНК и сателлитная последовательность из ячменя
HVT01 в 5 раз и 6.7 раз, соответственно, увеличивают информацию на фрагмент
(Sorrells, 1995). Весьма важное преимущество ПДРФ-технологии - возможность
маркирования всех областей генома, включая нетранскрибируемые участки ДНК,
совокупность которых составляет до 97% генома.
Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем
районе ДНК, встречаются чаще, чем в кодирующей ДНК. Показано, что уровень
нуклеотидной изменчивости
некодирующей ДНК приблизительно на порядок выше,
чем наблюдаемый у структурных генов, кодирующих белки. Это означает, что различия
между двумя случайно выбранными гомогенными участками ДНК, обусловлены
мутационным процессом, составляют 1/500-1/250 нуклеотидов, в то время как за счет
гетерозиготности оно составляет
выявления
вариантов
ДНК
0.001-0.004 нуклеотида. Особенно подходят для
ферменты,
нуклеотида, например Msp I и TaqI.
распознающие
палиндромы
в
четыре
15
ПДРФ обусловлен, в основном, наличием или отсутствием сайта рестрикции в
альтернативных вариантах ДНК, что выражается в различной длине альтернативных
ДНК-фрагментов и, соответственно, в расположении полос на электрофорезе. Частота
полиморфного варианта в популяции может изменяться от нескольких процентов до
максимальной - 50%.
Возможны и другие причины полиморфизма ДНК, выражающиеся в различном
числе тандемных повторов, имеющих общую центральную часть 10-15 пар оснований
(“мини-сателлиты”). Участок хромосомы различных генетических источников может
иметь различное количество таких повторов. Возникновение полиморфизма этого типа
облегчается благодаря идентичности последовательностей нуклеотидов в повторах,
что приводит к делециям и дупликациям, возникающим в результате неравного
кроссинговера. Длина рестриктированных фрагментов зависит от числа повторов.
Поскольку данный тип полиморфизма ДНК выражается в разном числе повторов,
гетерозиготность по нему обычна, а гомозиготность встречается редко. Это свойство
существенно для исследований с использованием ПДРФ-маркеров, поскольку почти во
всех случаях варианты информативны.
На основе мини-сателлита интронной последовательности гена миоглобина
Джеффриз создал зонды, узнающие гипервариабельную ДНК (Анализ генома, 1990).
В различных хромосомах человека обнаружено много гипервариабельных
участков. Уровень гетерогенности в небольшой популяции, исследованной в это
время, был весьма высоким и достигал 100 %. Все гетерогенные полосы наследуются
согласно законам Менделя. С помощью этого метода каждый индивид из родословной
легко отличается от любого другого. Дальнейшее совершенствование этой методики
дало возможность различать по “отпечаткам пальцев” (fingerprint) индивидуумы, даже
установить степень родства.
Заметим,
что
различие
по
длине
рестрикционных
фрагментов
между
родителями и потомками может возникать не только в результате точковых мутаций в
сайте узнавания, но и в результате ошибки репликации или кроссинговера. Ожидается,
что эти события происходят чаще, чем точковые мутации. Cреди 27 индивидов, у
которых проанализировано 240 полос, выявлена такая полоса, которой не было ни у
одного из родителей, отсюда скорость мутирования составляет 1/240, что по крайней
мере на 4 порядка выше, чем скорость мутирования для точковых мутаций.
16
1.2.3. Применение ПДРФ-маркеров
Следует прежде всего подчеркнуть, что ПДРФ-маркеры - это эффективные
генетические маркеры. Примером использования ПДРФ-маркеров при картировании
генов
и
локусов
количественных
признаков
могут
служить
работы
Северо-
Американского проекта по картированию генома ячменя (NABGMP, 1993; Haeys, 1994;
Thomas, 1995), а так же Graner et al. (1992). Цель проекта состоит в получении
максимальной информации о
геноме ячменя
H.vulgare,
при условии, что в
исследования будут вовлечены многочисленные коллективы из разных стран, в
основном США, Канады, Англии и Германии, а также и Украины (Одесса, Сиволап
Ю.М.). Дигаплоидные линии исследуемых комбинаций получены биотехнологическим
способом (Сhen, Hayes, 1989). Список исследуемых комбинаций и направление в
исследовании этих линий приведен в журнале “Barley Genetics Newsletter” (Haeys,
1995). Например, комбинация Steptoe x Morex предназначена для выявления локусов
важных агрономических, пивоваренных и пищевых показателей; это также относится и
к комбинации Harrington x TR306. Для идентификации генов устойчивости к болезням:
листовой ржавчине и вирусу желтой карликовости ячменя, предназначена комбинация
LbIran/Gloria//Commanche x Bowman (BC). Для поиска маркеров, сцепленных с генами
зимостойкости, фотопериодизма и яровизации, предназначены две комбинации:
Doctoo x Morex и Dictoo x Plaisant. Полученные результаты будут использоваться в
широкомасштабных селекционных работах. Поэтому молекулярные маркеры должны
отвечать всем необходимым требованиям и быть удобными при использовании в
селекционных проектах. Так, маркеры, в зависимости от качества при гибридизации
зонда с геномной ДНК, различают как “отличные” - сильный гибридизационный сигнал,
удобен для исследований; “хорошие” - хороший гибридизационный сигнал, легко
прослеживается;
“посредственные”
-
удовлетворительный
сигнал,
можно
использовать, но не рекомендуется и, наконец, “плохие” - плохо прослеживается,
использовать не рекомендуется. На 150 дигаплоидных линиях от скрещивания сортов
Steptoe
x
Morex
(контрастные
по
пивоваренности)
получено
447
маркеров,
включающих в большей степени ПДРФ-маркеры, в меньшей степени изоферменты,
морфологические
маркеры
и
ПЦР-маркеры.
Треть
всех
маркеров
были
идентифицированы как “посредственные” и “плохие”. На комбинации Harrington x
TR306 получено 213 маркеров.
Song et al. (1995) сконструировали детальную ПДРФ карту сцеплений у Brassica
rapa (syn. campestris) для определения возможных сцеплений молекулярных маркеров
17
с локусами количественных признаков. Было получено 220 ПДРФ локусов с
характеристикой каждой линии по 28 количественным признакам (QTLs). Авторы
показали, что эффект уменьшения плотности расположения маркеров на геном с 220
на 126 не снижает точность локализации QTLs. Однако уменьшение с 126 до 56
маркеров приводит к потере информации более, чем на 15%. Аналогичные работы по
выявлению сцепления локусов молекулярных маркеров с локусами количественных
признаков проведены многими авторами. Более четырехсот ПДРФ-проб, 50 из которых
оказались полиморфными, использовали при картировании генома ячменя, в
частности, локусов количественных признаков и генов устойчивости к болезням
(Backes et al., 1995). Frova et al. (1994) определили локусы устойчивости к высокой
температуре у пыльцы кукурузы, используя 188 картированных ПДРФ-маркера.
Genzbittel et al. (1995), основываясь на 180 зондах и комбинациях рестриктаз,
определили 237 локусов у Helianthus annus L. Общий размер участка генома,
покрываемый 34 группами сцепления, равен 1150 cM, 16 из которых локализованы на
хромосомах. Подробная генетическая карта не идентична
физической карте.
Доказательством тому может выступать работа Song et al. (1995). Авторы оценили
адекватность физической карты риса (Oryza sativa L.), полученной с помощью
гибридизации in situ и генетической картой, основанной на ПДРФ-маркерах. 44 ПДРФмаркера образовывали группы сцепления, ассоциированные с концами 7, 8, 11 и 12
хромосом. Средняя ошибка в расхождении с данными гибридизации in situ составила
5.91%. Расстояние между двумя маркерами на генетической карте была большим, чем
на физической. Это показывает различия между генетической и физической картами.
Причины таких различий могут быть
связаны как с центромерным, теломерным
эффектом, так и различной частотой кроссинговера вдоль хромосомы. Аналогичные
работы проведены Cartilho et al. (1995) с Aegilops umbellulata, которые использовали in
situ-гибризацию последовательностей генов рибосомальной ДНК - 18S-5.8S-25S.
Данные о локализации ПДРФ-маркеров могут использоваться для картирования
генов изоферментов, генов, кодирующих морфологические или физиологические
признаки, в том числе устойчивость к патогенам и вредителям (Huestis et al., 1994).
Williams et al (1994) идентифицировали ПДРФ-маркеры, сцепленные с геном
устойчивости к нематоде злаков (Heterodera avenae Woll.) у пшеницы. Для работы
использовалась
пара
близкоизогенных
линий,
различающихся
по
наличию
и
отсутствию гена устойчивости к нематоде - Cre. 58 гибридизационных зондов
применяли для скрининга и идентификации полиморфизма у близко-изогенных линий и
18
нуле-тетрасомиков и дителосомиков и на популяции F2, полученных от скрещивания
контрастных по устойчивости форм. Анализ сцепления показал, что ПДРФ-маркеры
фланкируют ген устойчивости: зонд Xcdp588 сцеплен на 7.4 cM. Bonhomme et al. (1995)
идентифицировали ПДРФ-анализом главный ген устойчивости к листовой ржавчине
(Lr) у Aegilops ventricosa. Rayapati et al. (1994) на 88 линиях овса (Avena strigosa и
Avena weistii) сконструировали 10 групп сцепления для идентификации генов
устойчивости к стеблевой ржавчине, используя ПДРФ-анализ.
Galiba et al. (1995) идентифицировали три ПДРФ-маркера - Xpsr426, Xcdo504 и
Xwg644, плотно сцепленных с генами Vrn1 и Fr1, контролирующих, соответственно,
яровизацию и морозостойкость в длином плече 5A хромосомы Triticum spelta 5A.
Показано, что гомологичные последовательности имеются у ярового ячменя в локусе
Sh2 хромосомы 7 (5H) и в локусе Sp1 на хромосоме 5R ржи.
Карту сцепления из 74 маркеров построил Pan et al. (1994) на 100 дигаплоидных
линиях от скрещивания озимого и ярового ячменя для идентификации локусов,
контролирующих зимостойкость. В результате анализа моногенного расщепления по
исследуемым локусам и связи маркеров с устойчивостью к низким температурам было
установлено следующее: наблюдалась сопряженность между ПДРФ-маркерами и
количественным локусом по устойчивости к низким температурам на хромосоме 7.
ПДРФ-анализ
нашел
применение
в
установлении
генов-восстановителей
фертильности. Так гены Rf (restorer fertility) - Rf1, Rf4, Rf3, были идентифицированы на
5D хромосоме пшеницы (Ma et al., 1995). ПДРФ-локус Xksug48 сцеплен с геном Rf4 на
хромосоме 6BS, Rf3 сцеплен с ПДРФ-локусoм Xcdo442 на IBS. Полиморфизм
митохондриального
гена
ржи
(Secale
cereale
L.)
с
“нормальным”
генотипом
сравнивался с генотипом цитоплазматической стерильности ПДРФ-анализом и
“нозерн”-анализом (Dohmen et al., 1994). В ПДРФ-анализе использовали несколько
гетерогенных митохондриальных генов в качестве проб для сравнения данных
генотипов. Был найден один зонд, идентифицирующий корреляцию с фенотипом
цитоплазматической мужской стерильности.
Важное
значение
имеет
применение
полиморфных ПДРФ-маркеров
при
исследовании происхождения и эволюционных изменений геномов близких видов
(Gentzbittel et al., 1992).
Svitashev et al., (1994) исследовали шесть клонированных последовательностей
ДНК из генома H.vulgare, представляющих собой повторы, для исследования
19
филогенетических взаимоотношений 31 вида рода Hordeum. По результатам ПДРФанализа, in situ-гибридизации данные виды ячменей образуют четыре главных
кластера, содержащих геном I, X, Y и H. Авторы подтвердили уникальную позицию
H.bulbosum,
располагающегося
отдельно
от
всех
остальных
видов
ячменей.
Наблюдали различие среди H.vulgare и H.bulbosum, содержащих геном I.
Bark et al. (1995) использовали случайные последовательности в ПДРФ-анализе
для оценки генетического сходства среди 70 открытых популяций лука (Allium cepa),
различающихся реакцией на длительность дня. Среднее число полиморфных
фрагментов на гибридизационный зонд составило 1,9. Коэффициент сходства в
популяциях, отвечающих на длинный день (LD), и популяциях с ответом на коротким
день (SD), а также между этими популяциями равен, соответственно, 0.79, 0.67 и 0.68.
Кластерный анализ проводился парно-групповым невзвешенным методом (UPGMA Unweighted-Pair-Group Method). Совершенно неожиданным оказалось заключение о
наличии достоверной гомологии между хромосомами пшеницы, ячменя и ржи,
принадлежащих к разным родам - Triticum, Hordeum и Secale. При помощи ПДРФанализа сравнивались геномы злаков - Hordeum vulgare и Triticum tauschii (Devos et al.
(1993). Результаты показали, что более 95% малокопийных последовательностей
обоих геномов сходны, но 42% умеренных повторов показали различие. Шестьдесят
три локуса, ранее картированные у ячменя, были картированы с помощью ПДРФмаркеров у Triticum tauschii (Namuth et al., 1994). При сравнении полученных групп
сцепления у обоих видов оказалось, что наблюдается некоторый порядок в
расположении маркеров. Однако шесть из семи групп сцеплений у Triticum tauschii
ориентированы в обратном, чем у ячменя, направлении. Авторы делают вывод о том,
что
геномы
этих
видов
обменивались
друг
с
другом
сегментами,
которые
дуплицировались или удалялись из геномов.
Была установлена связь между некоторыми ПДРФ-маркерами и локусами
аллелей глиадинов Gli-1 и Gli-2 у 70 сортов пшеницы (T.aestivum L.). Зондами для
ПДРФ-анализа служили последовательности генов g-глиадина (K23) и a-глиадина
(pTU1). Все особи с аллелями Gli-B1 и Gli-D1, имеющие различие в g-глиадине,
показали полиморфизм и при ПДРФ-анализе зондом К23. Данный зонд также
определял полиморфизм по Gli-B1b и Gli-B1e-подобным аллелям и Gli-A1a среди
других Gli-A1 аллелей. Таким образом, данные гибридизационные пробы локализуют
последовательность ржи из хромосомы 1R в геноме пшеницы. Molnar et al. (1995)
также
сравнивали
полиморфизм
запасных
белков
ячменя,
гордеинов,
с
20
полиморфизмом,
выявляемым
ПДРФ-анализом,
гибридизационными пробами
в
котором выступают последовательности ДНК генов гордеинов. Авторы показали, что
полиморфизм выявляемый, как с помощью гордеинов, так и ПДРФ-анализа, сходен.
При
исследовании
селекционных
линий
молекулярно-генетического
можно
использовать
полиморфизма
короткие
последовательность которых представлена повтором, например,
на
уровне
олигонуклеотиды,
(GACA)4, (GATA)4,
(GTG)5 или (CA)8 (Schmidt et al., 1993). Авторы исследовали полиморфизм среди
представителей вида Beta vulgaris и среди селекционных дигаплоидных линий у
B.vulgaris cv altissima. Оказалось, что олигонуклеотид (GATA)4 как гибридизационная
проба является наиболее информативным при гибридизации с геномной ДНК,
рестрицированной
по Hinf I, Hae III, Rsa I и позволяет дифференцировать
дигаплоидные линии одного сорта.
Недостаток ПДРФ-анализа - его дороговизна, связанная с использованием
радиоактивной или нерадиоактивной метки и рестриктаз, методические и технические
сложности в результате чего - ПДРФ-анализ с трудом поддается автоматизации. Кроме
того, наблюдаемые полосы гибридизации иногда не отчетливо различаются, что
усложняет использование данного маркера для широкомасштабных работ. Поэтому
многие исследователи ПДРФ-маркеры “переводят” в ПЦР-маркеры. Так, на основе
последовательностей тандемных повторов, используемых в качестве зондов при
ПДРФ-анализе у пшеницы, были разработаны праймеры для ПЦР (Devos et al., 1995).
Полиморфизм, выявляемый ПЦР-анализом, был использован для идентификации
геномов и может быть полезен для селекции. Аналогичная работа проведена Han et al.
(1995). На базе нуклеотидной последовательности мРНК гена a-амилазы 2 была
подобрана пара праймеров для ПЦР. Полиморфизм между сортами Steptoe и Morex
выявлялся после рестрицирования амплифицированных продуктов BstX I. Фрагмент из
генотипа Morex был на 80 п.о. короче, чем фрагмент Steptoe. Таким образом,
выявляемый
ПЦР-маркерами
полиморфизм
оказался
кодоминантного
типа.
Полиморфизм b-глюканазы (ген Brz) был выявлен аналогичным способом - продукт
амплификации ДНК Morex был на 3 нуклеотида длиннее, чем продукт амплификации
ДНК Steptoe.
1.2.4. Полиморфизм амплифицированных фрагментов геномной ДНК
Поиск удобных ДНК-овых маркеров для изучения молекулярно-генетического
полиморфизма привел к использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР).
21
Полимеразная цепная реакция является специфическим высокочувствительным
методом, который находит применение для решения широкого спектра проблем
биологии (Mullis et al., 1986; PCR technology, 1989; PCR protocol, 1990; Дебабов, 1990;
Вартапетян, 1991).
Полимеразная цепная реакция
- это метод амплификации ДНК in vitro, с
помощью которого в течение нескольких часов можно избирательно размножить
интересующий участок ДНК в миллиарды раз. Для амплификации избранного
фрагмента
геномной
ДНК
используют
два
олигонуклеотида,
фланкирующих
интересующий нас участок ДНК. Последовательность праймеров подбирается таким
образом,
чтобы
3`-концы
их
были
ориентированы
навстречу
друг
другу,
взаимодействуя с комплементарными нитями данной последовательности. ДНКполимераза осуществляет достройку взаимнокомплементарных цепей ДНК, используя
затравку - 3`-концы олигонуклеотидных праймеров. Цикл ПЦР состоит из трех
температурных режимов: денатурация ДНК при 940C; ассоциация олигонуклеотидных
праймеров с ДНК-мишенью (отжиг) при 37-68 0C; cинтез ДНК термостабильной ДНКполимеразой (например, Taq-полимераза, из Thermus aquaticus или Tth-полимераза из
Thermus termofilus) при 720C. В каждом цикле реакции происходит удвоение
синтезируемых в предыдущем цикле молекул ДНК-матрицы.
Первоначально
ПЦР
была
разработана
для
амплификации
и
анализа
конкретных генетических локусов и базировалась на предварительном знании
нуклеотидной последовательности локусов (Анализ генома, 1990; Barghest-Nicoletti et
al., 1990; Barnett et al., 1990; Costa et al., 1994; Charalampos et al., 1990; Decorte et al.,
1990; Ford et al., 1994). Разработка разных вариантов амплификации геномной ДНК
расширила возможности применения ПЦР, особенно в выявлении полиморфизма. Так,
варианты
использования
полимеразной
цепной
реакции
при
выявлении
полиморфизма могут быть сгруппированы согласно особенностям самого процесса: а)
амплификация со специфическими праймерами, б) амплификация мини- и
микросателлитных локусов (SSRP, Simple Sequence Repeat Polymorphism), в)
амплификация с перемежающимися повторами (Alu-PCR),
г) ампликация с
произвольными праймерами (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) и д)
полиморфизм
длин
амплифицированных
Fragment Length Polymorphisms).
продуктов
(AFLP,
Amplification
22
а) Амплификация со специфическими праймерами требует в качестве
необходимого условия знание нуклеотидной последовательности амплифицируемого
участка
для
подбора
соответствующих
праймеров
к
фланкирующим
последовательностям. Размер праймеров для направленной амплификации обычно
составляет 18-22 нуклеотида; ГЦ-состав праймера должен быть выше 50 %; 3’-конец
праймера должен содержать следующие пары нуклеотидов: ЦЦ, ГГ, ЦГ и ГЦ.
Праймеры, с учетом всех этих условий, могут образовывать и неспецифический
продукт ПЦР. В таких случаях необходимо повторить подбор праймеров, сдвинув
участки поиска влево или вправо от мишени.
Полиморфизм при направленной
амплификации может быть связан с вставкой или делецией в центральной части
продукта, либо точечной мутацией в сайте, комплементарном одному из праймеров. В
первом случае продукты амплификации различаются размерами (кодоминирование),
во втором - это наличие или отсутствие продукта ампификации (образование продукта
не
будет
наблюдаться
у
особей
с
точечной
мутацией
в
первых
шести
комплементарных 3`-концу праймера последовательности). Однако мутации данных
типов маловероятны (редки), то есть выявление полиморфизма
с помощью
направленной амплификации - затруднительно. Большая же часть точечных мутаций в
амплифицированных последовательностях не заметна, так как не сказывается на
размере продукта. Рестрикция мутированного продукта позволяет выявить точечные
мутации, инактивирующие или восстанавливающие сайты рестрикции. В таком случае
рестрикты продуктов ПЦР различаются по длине, это означает, что ПЦР-продукты
наследуются по кодоминантному типу.
Faccioli et al. (1995), используя нуклеотидную последовательность кДНК гена
DB4 (B-гордеин), подобрали фланкирующие праймеры к данному участку. Продукты
амплификации ДНК различных сортов ячменя были рестрицированы по Rsa I для
выявления STS-маркеров (sequence-tagged-sites). Авторы показали возможность
выявления полиморфизма STS-маркерами в качестве дополнительного инструмента
для “фингерпринта” сортов ячменя.
б)
Амплификация
участка
высокоповторяющиеся последоватности
геномной
ДНК,
содержащего
(гипервариабельные районы генома),
демонстрирует высокую степень полиморфизма.
Гипервариабельные районы генома
(HVR), которые часто называют также тандемными повторами с изменяющимся
числом копий (VNTR), находят все большее применение в качестве генетических
23
маркеров при изучении генома эукариот. Высокий уровень полиморфизма этих
минисателлитных последовательностей часто бывает полезен при решении задач,
связанных с картированием генов и идентификацией локусов, ответственных за
злокачественное
заболеваний.
перерождение
Все
более
клеток
широкое
и
развитие
применение
многих
находят
наследственных
полиморфные
минисателлитные последовательности и при определении отцовства-материнства,
идентификации личности и ряда других задач, относящихся к судебно-медицинской
экспертизе (Чистяков и др., 1993).
Число копий в тандемных повторах может изменяться от одного до нескольких
десятков. Обычно в популяции обнаруживается определенный набор аллелей,
отличающихся друг от друга по числу повторяющихся единиц и, следовательно, по
длине. Было показано, что полиморфизм VNTR может быть эффективно использован
при идентификации личности, поскольку набор повторяющихся последовательностей
определенной длины является уникальным для каждого индивидуума.
До недавнего времени типирование гипервариабельных районов было основано
на использовании гибридизации по методу Саузерна или при ПДРФ-анализе. Однако,
данный
экспериментальный
подход
обладал
недостаточной
разрешающей
способностью в тех случаях, когда VNTR входили в состав относительно крупных
фрагментов ДНК, так как аллели мало отличались друг от друга по длине. В таких
случаях было практически невозможно различить аллели VNTR, отличавшиеся друг от
друга на 11-70 п.н. (в этот интервал укладываются размеры повторяющихся единиц
среди известных VNTR).
Кроме того, для ПДРФ-анализа требуется наличие
значительных количеств высокомолекулярной ДНК, которые практически невозможно
получить из небольшого кусочка ткани. Важное значение имеет также качество
используемой ДНК и ее состояние (ДНК не должна быть
деградированной или
загрязненной посторонними примесями).
Использование соответствующих фланкирующих олигонуклеотидных праймеров
в ПЦР позволяет амплифицировать любой фрагмент геномной ДНК. Амплификация
ДНК находит все более широкое применение при анализе полиморфизма VNTR.
Возможно
получить
принципиально
важные
результаты,
в
том
числе
по
идентификации индивидов, даже если исследователь располагает геномной ДНК,
выделенной из единственной клетки. С помощью ПЦР на 160 образцах ДНК
неродственных
индивидуумов
северо-западного
региона
России
проведено
24
исследование аллельного полиморфизма тримерного AGC-повтора экзона 1 гена
адренорецептора - AR (Xq11-12), а также тетрамерных повторов ATCT интрона 40 гена
фактора
Виллибрандта
-
гипосантинфоcфорибозилтрансферазы
vWF
HPRT
(12p12);
и
(Xq26)
AGAT-гена
AGAT-анонимной
ДНК
последовательностей короткого плеча X-хромосомы - STRX1 (Ассев и др., 1995).
Авторы обсудили перспективу использования изученных маркерных полиморфных
систем для молекулярной диагностики соответствующих болезней (спинобульбарной
атрофии мышц - AR, болезни Леш-Нихана-HPRT, болезни Виллибрандта - vWF), а
также в популяционной генетике человека, идентификации личности и молекулярных
подходов к оценке мутагенной активности.
Определение полиморфизма микросателлитного участка генома получила
название - SSRP (Morgente et al., 1994; Rougwen et al., 1995; Plaschke et al., 1995)
Полиморфизм
проявляется
в
различной
длине
продуктов
амплификации,
обусловленной различным количеством ди- или тринуклеотидных повторов в
амплифицируемом участке. В половине работ, посвященных SSRP-маркерам, при
амплификации
используется
радиоактивная
метка.
Разделение
по
размерам
продуктов амплификации производится в агарозном геле высокой концентрации или в
полиакриламидном геле. Так, Plaschke et al. (1995) определили нуклеотидную
последовательность у 23 минисателлитов Triticum aestivum L., локализовали их на 15
хромосомах и подобрали олигонуклеотидные праймеры для ПЦР.
Наследование
продуктов амплификации было кодоминантного типа. Общее число аллелей составило
142, от 3 до 16 на локус (в среднем 6.2 аллеля).
Среднее число динуклеотидных
повторов составляло от 13 до 41. Авторы продемонстрировали, что для исследования
генетического разнообразия и сортовой идентификации в элитном материале
гексаплоидной пшеницы может быть использовано небольшое число минисателлитов.
Аналогичные работы проделаны Morgante et al. (1994), Rougwen et al. (1995) на сое и
на ячмене (Maroof et al., 1994).
в) Амплификация с перемежающимися повторами (Interspersed Repetitive
Sequences IRS), Alu-PCR или REP-PCR основана на том, что в геномах высших
организмов
присутствуют
в
большом
количестве
Alu-последовательности,
перемежающиеся с уникальными. Используя праймер к консервативной части Аluповторов, можно амплифицировать участки ДНК, расположенные между ними (Breukel
1990; Barghesi-Nicoletti 1990; Nelson, 1989; Decorte, 1990).
25
г) Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами, RAPD
(Random Amplified Polimorphic DNA), произвольно-праймированная ПЦР (AP-PCR Arbitrarily Primed PCR) и фингерпринт амплифицированной ДНК (DAF - DNA
Amplification fingerprinting) (Williams et al., 1990; Welsh et al., 1990; Welsh et al., 1991;
Caetato-Anolles et al., 1991a; 1991b; Caetato-Anolles et al., 1992; Caetato-Anolles, 1993).
Эти независимо разработанные подходы основаны на использовании одного или
более произвольных олигонуклеотидных праймеров для амплификации различных
участков ДНК с неизвестной локализацией в геноме. Функцию прямого и обратного
праймеров в данном случае выполняет один и тот же олигонуклеотид. Вероятность
события, при котором происходит “встреча” инвертируемых сайтов, являющихся
мишенями для праймера, достаточна низкая. Поэтому, в результате ПЦР с
произвольными
праймерами
образуются
воспроизводимые
фингерпринты,
представляющие собой спектр уникальных (представленных в геноме по своей общей
структуре в единичном числе) продуктов, часто полиморфных. ПЦР с произвольными
праймерами пригодна для детального анализа геномов любых организмов. Многими
исследователями показано, что продукты амплификации наследуются по закону
Менделя (Williams, 1990; Yanagisawa, 1994).
Различные варианты ПЦР с произвольными праймерами различаются по
количеству продуктов амплификации, длине используемых праймеров, условиям
амплификации и способу электрофоретического разделения продуктов. К примеру, для
АР-PCR используются праймеры длиной, сравнимой с таковой при обычной ПЦР; для
анализе RAPD применяются короткие праймеры около 10 нуклеотидов; для DAF
размер праймеров составляет не менее 5 нуклеотидов (обычно 7-8). Эти и другие
различия, в конечном результате, обуславливают выбор соответствующих условий
проведения электрофореза для получения высокоразрешающих профилей продуктов
амплификации. Разделение продуктов в RAPD и AP-PCR достигается электрофорезом
в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Визуализацию продуктов DAF и
информацию
о
ДНК-профилях
получают
с
помощью
электрофореза
в
полиакриламидном геле и окраски серебром для детекции пикограммного уровня ДНК
(Bassam at el., 1991).
Выявляемый с помощью ПЦР с произвольными праймерами генетический
полиморфизм
может
быть
использован
при
исследованиях
эволюционных
взаимоотношений, видовой идентификации, для генетического картирования и
26
паспортизации генотипов (Dixkens et al., 1995). С помощью RAPD-анализа (13
декамерных праймеров) показана высокая вариабельность продуктов амплификации
(ампликонов) среди 19 видов рода Hordeum (Gonzales et al., 1993). Аналогичная
работа по изучению происхождения сортов ярового ячменя H.vulgare проведена Tinkey
et al. (1993). Исследования проведены и с сортами редких видов, таких как папайя
(Stiles et al., 1993), Azolla (Van Coppenolle et al., 1993), голубика (Vaccinium ashei)
(Azuna et al., 1993), среди видов Stylosanthes quianensis (Kazan et al., 1992; 1993) и
(Betula alleghaniensis) (Roy et al., 1992). Идентификацию с помощью RAPD-анализа
сортов цветной капусты осуществлял Hu et al., (1991), а у сортов яблонь - Koller et al.
(1993).
Полученные данные о локализации RAPD могут быть с успехом использованы
для создания эффективных генетических маркеров для картирования агрономически
важных локусов.
Тесное сцепление найдено между локусами устойчивости к стеблевой ржавчине
овса - Pg3 с RAPD-маркером (Penner et al., 1993) и Pc68 (crow rust resistence gene)
(Penner., 1993). На близкоизогенных линиях бобов Phaseolus vulgaris L. был
идентифицирован
доминантный ген
Up2
устойчивости к
ржавчине (Uromyces
appendiculatus) (Miklas et al., 1993). Найдены RAPD-маркеры, сцепленные с генами
устойчивости к мучнистой росе у салата (Paran et al., 1991; 1993), с геном ym4,
устойчивости
к
вирусу
желтой
карликовости
ячменя
(Ordon
et
al.,
1995).
Идентификацию гена устойчивости к листовой ржавчине Agropyron elongatum провели
Schacherman et al. (1995). На двух изогенных линиях “Arina” и “lr24” тестировали 115
ПДРФ-проб и 360 RAPD праймеров. Шесть ПДРФ-проб и 11 RAPD-праймеров показали
полиморфизм. Определение сцепления проводилось на 150 линиях, полученных от
скрещивания близкоизогенных линий. Оказалось, что 6 ПДРФ-маркеров и 11 RAPDмаркеров полностью сцеплены с геном устойчивости. Последовательности RAPDмаркеров были клонированы и секвенированы. Синтезированы специфические
праймеры,
детектирующие только устойчивые генотипы. Для идентификации генов
устойчивости (25 генов: с H1 по H25) к гессенской мухе (Mayetiola destructor Say.)
использовались контрастные по устойчивости к вредителю близкоизогенные линии
пшеницы T.aestivum L. После RAPD-анализа и денатурирующего гель-электрофореза
было показано, что один из ДНК-маркеров ассоциирован с геном устойчивости Н9.
27
Lefebvre et al. (1995) на 85 молекулярных маркерах, включающих и ПДРФмаркеры, определили 14 групп сцепления общей длиной в 820 cM (от 36% до 59%
генома) у перца (Capsium annum L.). Было идентифицировано два новых гена,
представляющих
агрономический
интерес:
устойчивости
к
TMV
и
L
локус,
контролирующий форму плодов. Картирование локусов важных агрономических
признаков проведено Barua et al. (1993) на ячмене H.vulgare. В анализе использовали
как RAPD,
так и ПДРФ-маркеры, и были определены QTLs, отвечающих за такие
признаки как высота, время колошения, рост. Plomion et al. (1995) на основе 263 RAPDмаркеров определили 18 групп сцепления у сосны (Pinus pinaster Ait.), что составило 90
% генома (1380 cM).
Существенный недостаток RAPD-маркеров - это в большинстве случаев
полностью доминантный характер выявляемого полиморфизма, то есть формы
различаются по наличию и отсутствию продукта амплификации. Это означает, что
сложно отделить в популяции гетерозиготную особь среди доминантных гомозигот.
Случай кодоминирования, когда затрагивается не сайт узнавания последовательности
праймера геномной ДНК, а внутренняя зона последовательности участка геномной,
расположенной
между
последовательностями
комплементарных
праймеру,
составляют исключения. Это обстоятельство, значительно усложняет исследования
гетерогенных популяций с высоким уровнем гетерозигот. Поэтому для генетических
исследований используют линии самоопылителей старших поколений и дигаплоидные
линии, гетерозиготность у которых минимальна (Gale et a;., 1992; Kleinhofs et al., 1993;
Hayes, 1995; Netsvetaev et al., 1995).
Paran I. и Michelmore R.W. (1993) предложили способ детекции полиморфизма с
помощью ПЦР, используя информацию о нуклеотидной последовательности концевых
участков продуктов амплификации с произвольными праймерами RAPDs. Подход
получил
название
“охарактеризованный
последовательностью
участок
амплификации” (SCARs, Sequence Characterized Amplified Regions). Эксперимент
состоял в клонировании и секвенировании полиморфных RAPDs, сцепленных с генами
устойчивости к болезням у салата. Концевые участки данных последовательностей
использовали для синтеза 24-членных праймеров, 5`-концы которых содержали 10нуклеотидные
последовательности
произвольных
праймеров,
остальные
14
нуклеотидов принадлежали амплифицированному продукту. Показано, что при
описанной процедуре может происходить смена наследования с доминантного (RAPDпродукта) на кодоминантный (SCAR-продукт); последний проявляется как наличие двух
28
вариантов длины отвечающего одному локусу амплифицированного фрагмента, а не
наличие-отсутствие самого фрагмента. По мнению
авторов, в RAPD-продуктах
преобладает доминантный тип наследования потому что мутационный процесс
затрагивает в данном случае их концевые участки, участвующие в гибридизации с
праймером. Если в этой зоне не будет достаточной комплементарности, то не
произойдет амплификация.
Не понятно, почему возникает кодоминирование из доминантного типа
наследования RAPD, так как кодоминантный тип наследования должен быть
продемонстрирован и 10-членными начальными праймерами, а не проявляться в
результате процедуры? Мутация, произошедшая в сайте праймирования, препятствует
гибридизации праймера с геномной ДНК, в результате чего не происходит
амплификации. В любом случае, синтезированные 24-членные праймеры, содержащие
с 3`-конца 14 нуклеотидов полностью комплементарных геномной ДНК и допускающие
возможность ошибок спаривания на оставшихся 10 нуклеотидах с 5`-конца, являются
прекрасной затравкой для ДНК-полимеразы. Таким образом, данный метод вообще не
должен выявлять полиморфизм и, тем более, не должно происходить смены
доминантного на кодоминантный тип наследования. Действительно, в одном случае
пара 24-членных праймеров не выявила полиморфизм, показанный 10-членным RAPDпраймером. Авторы, видимо, учитывали этот момент и ужесточили условия отжига
(600С),
что
обеспечивало
амплификацию
только
с
праймерами,
полностью
гибридизующимися на геномной ДНК. Данная работа интересна тем, что позволяет
исследовать конкретный участок геномной ДНК без синтеза других продуктов ПЦР, не
связанных с данным признаком.
При
больших
доминантный
выборках
SCAR-маркер
при
исследовании
упрощает
устойчивости
процедуру
анализа.
к
В
болезням
проведении
электрофореза нет необходимости, достаточно убедиться, что амплифицированный
продукт присутствует в пробирке, окрасив ДНК в ней.
Кодоминирование
в
наследовании выявляется, если продукты RAPD рестрицировать мелкощепящей
рестриктазой. Выявляемый в этом случае полиморфизм связан с мутацией в сайте
рестрикции внутри первоначального RAPD-участка. Рестрикция геномной ДНК до
амплификации не приведет к выявлению кодоминантного типа наследования, а только
продемонстрирует дополнительный доминантный полиморфизм.
Причем, общее
количество полос на электрофореграмме уменьшится, а среди оставшихся некоторые
полосы окажутся полиморфными.
29
д)
метод
полиморфизма
длин
амплифицированных
фрагментов
(AFLP)
заключается в том, что используемая ДНК подвергается рестрикции, с последующим
лигированием с коротким линкером, липкие концы которого комплементарны липким
концам рестрицированной геномной ДНК. После этого с данным образцом ДНК
проводят амплификацию с коротким праймером, комплементарным линкеру, в
присутствии одного радиоактивного нуклеотида. Выявляется сразу большое число
полиморфных локусов - от 10 до 30 на 50-100 продуктов амплификации, наследуемых
по доминантному типу (NABGMP,1994).
Хотя доминантный тип полиморфизма, выявляемого ПЦР-маркерами, несколько
ограничивает их применение в генетических исследованиях, однако, преимущество,
которое имеют ПЦР-маркеры перед ПДРФ-маркерами, гораздо выше. Преимуществом
ПЦР перед другими методами при выявлении полиморфизма является: высокая
информативность, простота и скорость анализа, значительное уменьшение количества
исходного материала для анализа, автоматизация и отсутствие необходимости в
радиоактивном мечении. Показано (Ragot et al., 1993), что стоимость ПЦР-анализа
значительно ниже, чем ПДРФ-анализа, при проведении исследований в малых и
средних объемах, однако, при крупномасштабных исследованиях ситуация обратная.
Один фильтр с иммобилизованной на нем рестрицированной геномной ДНК можно
использовать до 10 раз, что значительно снижает себестоимость ПДРФ-анализа.
Наиболее распространенные варианты ПЦР, используемых в исследовании
полиморфизма, - это RAPD, SSRP и AFLP. Однако, RAPD является нерадиоактивным,
быстрым и эффективным методом при исследовании молекулярно-генетического
полиморфизма. Хотя многими авторами показана невоспроизводимость RAPDпродуктов как в одной лаборатории, так и между лабораториями. Это обстоятельство
охлаждает пыл при широком использовании RAPD. На основании этого целью данной
работы было оптимизация ПЦР с произвольными праймерами для достижения
воспроизводимых
использованы
результатов
и
показать,
что
RAPD-маркеры
могут
быть
в исследовании полиморфизма и картирования генома ячменя
(Hordeum vulgare L.) и локусов количественных признаков.
30
ГЛАВА 2.
Материал и методы
2.1. Использованный материал
В качестве материала для исследования были использованы некоторые виды
рода Hordeum L.: H. agriocrithon A`berg., H. spontaneum C.Koch., H. lagunculiforme
Bacht., H. vulgare L., H. chilense Roem. et Shult., H. bulbosum L., а также Triticum durum
L. (линия 350-72), Triticum aestivum L. (Одесская полукарликовая), Secale cereale L.
(Харьковская 60).
Для
исследования
межвидового
полиморфизма
рода
Hordeum
L.
и
специфичности произвольных праймеров в выявлении полиморфизма использовали
линии кукурузы (Zea mays L.) - Од322 и 074/87, а также их гибрид 074/87xОд322;
сорта сои (Glycine max (L.) Merr.).
Внутривидовую изменчивость изучали на 21 сорте ярового ячменя: Джау
Кабутак, Одесский 31, Одесский 70, Одесский 100, Донецкий 8, Донецкий 9, Исток,
Циклон, Черноморец, Винер, Riso 56, Riso 1508, Нутанс 106, Корал, Паллидум 32,
Паллидум 331/13, Betzes, Bomi, Bonus, Athos, Calsberg II.
Для картирования локусов количественных признаков анализировали 150 линий
самоопыляющейся популяции №106 (F7
и
F8, Одесский 115/Golf), популяцию сорта
Productiv, линии пшеницы Chinese spring дополненные хромосомами (кроме пятой)
ячменя сорта Betzes, полученных из отделов: генетических основ селекции, селекции
ячменя и отдела генетики СГИ УААН г.Одесса.
2.2. Выделение высокомолекулярной растительной ДНК
Несколько (не более 5) этиолированных проростков (размером
около 1 см
каждый) для сортов ячменя или один проросток для популяции №106, растирали
пестиком в эппендорфе с 0.5 мл лизирующего раствора (20 mM Na3EDTA, 100 mМ
трис-НСl, рН 8.0 (250С), 1.4 М NaCl, 2 % CTAB) и выдерживали в течение 1 часа при
600С. Добавляли равный объем смеси хлороформа и изопентанола (24:1) и тщательно
перемешивали. ДНК осаждали равным объемом изопропанола после 5 минутного
центрифугирования в настольной центрифуге Eppendorf 5415 при максимальных
оборотах. Осадок ДНК растворяли в 500 мкл раствора ТЕ (10 мМ трис-НСl, рН 8.0 и 1
мМ Na3EDTA) в присутствии 1 мкг/мл РНКазы А.
Концентрацию ДНК определяли с помощью флюориметра ТКО 100 (Hoefer
Scientific Instruments, San Francisco) в растворе 1xTNE (10 mM трис-НСl, рН 7.4 (250С),
31
100 mM NaCl, 1 mM Na3EDTA ) и 100 мкг/мл интеркалирующего красителя Hoechst
33258 (Riber et al., 1990). Для определения концентрации ДНК достаточно 4 мкл
маточного раствора. Чувствительность прибора составляет 1 нг ДНК.
Маточный раствор ДНК разбавляли в отдельных пробирках до концентрации 5
мкг/мл и хранили в холодильнике при 40С. Маточный раствор хранился при -700С.
2.3. Полимеразная цепная реакция
В работе использовали Taq-полимеразу,
выделенную
в
отделе
генной
инженерии по методике Engelke et al., (1990) и Pluthero (1993). Полимеразная цепная
реакция с произвольными праймерами проводилась в реакционном растворе
присутствии
в
3 мМ ионов магния, а при направленной амплификации - 1.5 mM.
Температура отжига при направленной амлификации была на протяжении всей
реакции равной 550С, тогда как для ПЦР с произвольными праймерами отжиг на
первых четырех циклах реакции был ниже оптимальной на 5-10 градусов. Реакционная
смесь для полимеразной цепной реакции объемом 20 мкл содержала: 50 мМ КСl, 20
мМ трис-НСl, рН 8.4 (250С), 3 (1.5) мМ MgCl2 , 0.01 % Tween-20, 0.15 мМ каждого dNTP,
0.3 мкМ праймера, 5 % глицерина, 20 нг ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. В пробирки
наслаивали
40
мкл
минерального
масла.
Амплификацию
с
произвольными
праймерами проводили следующим образом: первая денатурация - 2 минуты при 940С;
первые четыре цикла - 940 C, 1 мин., 1.5 минуты при 40-430С и 2 мин. при 720С; в
последующих циклах отжиг осуществлялся при 47-550С в зависимости от праймера.
Проводилось 35 циклов реакции. Последняя элонгация длилась 10 минут.
Реакцию останавливали, добавляя 60 мкл раствора ТЕ (10 mM трис-HCl, 1 mM ЭДТАNа3, рН 8.0). Для одного электрофореза использовали шестую часть реакционной
смеси. Продукты амплификации фракционировали электрофорезом в 2 % агарозном
геле в 1xTBE (50 mM трис-H3BO3 и 1 mM ЭДТА-Nа3, рН 8.0) в течении 5-7 часов при
напряжении 50 вольт и визуализировали бромистым этидием.
2.4. Синтез и очистка олигонуклеотидов
Шестьдесят восемь праймеров, длиной от 10 до 24 нуклеотидов, были
синтезированы на автоматическом ДНК - синтезаторе “Applied Biosystems 380 В”
цианофосфорамидитным
методом
(Табл.1).
Растворы
фосфорамидитов
в
ацетонитриле доводили до концентрации 50 мг на 1 мл. Использовали колонки для
твердофазного синтеза олигонуклеотидов емкостью 0.2 мкМ (Applied Biosystems), с
32
выходом до 15 O.Е. (33 мкг олигонуклеотида на 1 О.Е.). Короткие олигонуклеотиды (1015 нуклеотидов) не требовали очистку, поэтому синтез заканчивался снятием всех
защитных (тритильных) групп (trityl-off). Синтез более длинных олигонуклеотидов
требовал очистку на колонках OPC (Oligonucleotide Purification Cartridges), поэтому
синтез заканчивали без снятия тритила (trityl-on). Очистку trityl-off олигонуклеотидов
проводили также с помощью электрофореза в денатуирующем полиакриламидном
геле с 7М мочевиной и экстракцией водой из геля.
Очистку ацетонитрила осуществляли путем длительного обезвоживания в CaH2
(Sigma) при нагревании и перегонкой с хлоркальциевой трубкой. Необходимые
реактивы для синтеза были получены из института Биоорганической химии имени
Шемякина и Овчиникова РАН (Россия):
· Окислитель - 0.1М J2 в тетрагидрофуране (ТГФ) (J2 -1.14 г., ТГФ - 60 мл, пиридин
- 20 мл, вода - 2 мл);
· САР А - 10% уксусный ангидрид, 10% 2,6-литидин, 80% ТГФ
· САР В - 6 мл 1-метилимидазол, 94 мл ТГФ;
· Трифрорацетат - 0.1М трифторацетат или дихлорацетат (3-3.4 мл) в
дихлорметане (450 мл);
· 0.1 М тетразол - 35 г. тетразола растворить в 1 литре сухого ацетонитрила.
33
Таблица 1.
Последовательность произвольных праймеров используемых в полимеразной
цепной реакции для анализа генетического полиморфизма ячменя
КОД
P1
P2
P3
P6
P7
P8
P9
P10
P22
P23
P24
P25
P26
P27
P28
P30
P31
P32
P34
P35
P36
P37
P39
P40
P41
P42
P43
P44
P45
P46
P47
P48
P49
P50
P52
P56
P57
P58
P59
P61
P62
P63
P64
P65
P66
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРАЙМЕРОВ
(5` - 3`)
AATTCGAGGATCCGGGTACCATGG
GACAGACAGACAGACA
GATTTAGGTGACACTATAG
GAGCAAGTTCAGCCTGG
TAATACGACTCACTATAGGG
CAGGAAACAGCTATGAC
ACCACAGGCAGAGTAAGAGG
CCACCCTGCTTACAGCAATG
TTATGAAAACGACGGCCAGT
TTCTCCTGAATCGGA
TGCTCTGCCC
GTGGTGGTGG
TACCTTCCCC
TACCTTCCCG
CAAACGTCGG
GCAGAGGAAGAG
CCAAGGAAGCGG
TCGTCGATCGCG
CAGCTGGGGA
GAGACCTCAC
CCGAATTCGC
CTGACCAGCC
CCAGTTCGCC
ACTCACTCGA
ATAGGCGAGT
ATGTGGTGGT
AGTCAGCTGC
GGACCCCGCC
AAGGAGTGTG
GGTTGGGGAG
GGAGAGGGGG
GCGGTGCTCG
GACAGCCTAC
CCTGGAGTTG
AGGACTGGAC
CGATTTGTCC
TCAGGACGCTAC
GAGGGGTTCGAGGCC
CAAACCCAACGA
GGACTGGGTCCG
TGCAGGACACCCGCCGCCAA
CTGCCGCACTTGATACGTTGTC
TGACCGGCAGCAAAATG
TCTTGGCGGTGGGAGCCTAGG
GTAAAACGACGGCCAGT
Tm*
59.0
50.1
51.5
53.7
52.9
52.0
54.5
55.5
55.7
52.2
50.0
49.0
49.2
49.6
46.2
49.7
52.1
52.2
50.0
47.4
50.4
49.1
50.1
47.7
47.7
48.2
48.4
52.0
47.7
49.8
50.4
50.9
47.7
48.6
48.1
48.7
49.8
54.4
50.7
51.6
59.1
56.5
54.8
58.3
54.0
34
ATCCCTCTGGCATCGGCGTAA
GAGGAAGGTCTTCATGGTGGC
AGCCTGATGCC
GGTAAGAAATTGCACTTCC
TAGCCTATTGGGCCACCC
CTGGAATATTCCCG
CCCACAAAGAAAGCAATGG
TTATCATGGGGGCAACGC
TGATCCCTCTGGCACTGG
GCTCTACAAGGCCAATGG
TGGGAAGTCCTCGTGTTGCA
TTTAGTGCTGGTATGATCGC
GAGCCGTGCTGCCGGAGC
GCCGTGAAGCCTGATGCC
CACGCCCTCGCCAACGCTCTCCA
GGGGAGATATCGACCAAAGT
ATCCAGTTCTTGTGCACCTG
GGTACGAACATGGAGGTACT
GACCTCCACGAGTTGC
GCTGCGCGCTTCAGCT
CTGGGGTTGGTTCTGG
GGCAGCAACATGGCATTC
CCACCAAGCGTGGAGTC
GGGTGGCGTGGGGTG
* - температура плавления праймера
P67
P68
P69
P73
P74
P75
P76
P77
P78
P79
P80
P81
P82
P83
P84
P85
P86
P87
P88
P89
P90
P91
P92
P93
57.8
56.0
50.5
53.8
55.8
52.0
55.1
55.9
54.7
54.5
55.8
54.5
57.4
56.1
60.4
55.2
54.5
54.0
52.9
55.5
53.8
55.0
54.2
55.1
2.4.1. Очистка коротких (до 40 нуклеотидов) олигонуклеотидов на ОРС
Необходимые растворы:
· ацетонитрил для HPLC, 5 мл
· 2.0 триэтиламин ацетат, 5 мл
· вода MilliQ
· 1.5 М NH4OH, 15 мл
· 2% трифторацетат
· 20% v/v ацетонитрил в воде, 1 мл
· ТЕ (10 мМ трис-НСl, рН 8.0 и 1 мМ Na3EDTA), 1 мл
1. После завершения trityl-on синтеза, олигонуклеотиды инкубировали в 30%
NH4OH при 55 0C в течении ночи (для снятия тритильных групп).
2. Промывали колонку ОРС (Oligonucleotide Purification Cartridges) 5 мл
ацетонитрила и затем 5 мл 2.0 М триэтиламин ацетатом.
35
3. Разбавленные на треть водой MilliQ, олигонуклеотиды (4 мл) наносили на
колонку по 1-2 капли в секунду (все процедуры с нанесением на колонку проводятся с
данной скоростью). Собранный элюат наносили повторно на колонку.
4. Промывали колонку по 5 мл три раза 1.5 М NH4OH, а затем по 5 мл два раза
водой MilliQ.
5. Пропускали через колонку 1 мл 2% трифторацетата и выжидали 5 минут.
Процедуру повторяли с оставшимися 4 мл 2% трифторацета.
6. Промывали колонку по 5 мл два раза водой MilliQ.
7. Элюировали очищенные олигонуклеотиды 1 мл 20% v/v ацетонитрилом.
Олигонуклеотиды концентрировали в SpeedVac и растворяли в 1 мл раствора ТЕ.
Концентрацию олигонуклеотида измеряли с помощью спектрофотометра при длине
волны в 260 нм.
2.4.2. Очистка 10-членных олигонуклеотидов
Необходимые растворы:
· 2% LiClO4 в ацетоне, 1 мл
· перегнанный сухой ацетон, 1 мл
· вода MilliQ
· ТЕ (10 мМ трис-НСl, рН 8.0 и 1 мМ Na3EDTA), 1 мл
1. После завершения trityl-off синтеза, олигонуклеотиды инкубировали в 30 %
NH4OH при 550C в течении ночи (для снятия тритильных групп). Аммиак упаривали в
SpeedVac.
2 . Осадок олигонуклеотидов растворяли в 100 мкл воды.
3. Наслаивали по стенке пробирки 1 мл 2% LiClO4 в ацетоне, тщательно
перемешивали и осаждали в настольной центрифуге при 14000 об/мин в течение 5
минут.
4. Осадок промывали 1 мл ацетона и высушивали.
5. Осадок олигонуклеотидов растворяли в 1 мл раствора ТЕ. Концентрация
олигонуклеотида измеряли с помощью спектрофотометра при длине волны в 260 нм.
36
2.4.3. Очистка олигонуклеотидов в полиакриламидном геле
Необходимые растворы:
· 20хSTOK (350 мл H2O, 480 г. мочевины, 190 г. акриламида, 10 г. бисакриламида)
(выдерживали при 550С в течение часа)
· 20xТВЕ (1 М трис-ОН, 1 М Н3В3О, 20 мМ ЭДТА-Na3)
· 10 % полиакриламидный гель (35 мл 20xSTOK, 35 мл 7М мочевины, 3.6 мл
20xТВЕ, 0.72 мл 10% персульфата аммония, 15 мкл ТЕМЕD)
· вода MilliQ
· 20 % ацетонитрила
· колонки AmprepC18 (по 100 мг носителя) (Amersham)
· ТЕ (10 мМ трис-НСl, рН 8.0 и 1 мМ Na3EDTA), 1 мл
1. Электрофорез проводили при напряжении тока 100 вольт в течение 1 часа.
2. Использовали люминофор для детекции локализации олигонуклеотида, под
УФ-лучами. Вырезали гель с праймером и помещали гель в наконечник объемом на 1
мл. Для предотвращения выпадения геля из наконечника - его нижную часть
заполняли стеклянной ватой и закрывали парафилмом. Наконечник заполняли
стерильной водой и выдерживали в течении ночи. Процедуру повторяли, а воду с
экстрагированным олигонуклеотидом собирали в эппендорфах.
3. Очистку олигонуклеотида от мочевины и примесей геля проводили на колонке
AmprepC18. Наносили весь собранный элюат на колонку, затем колонку промывали 5
мл стерильной воды, элюировали олигонуклеотид 2 мл 20% ацетонитрила.
4. Концентрировали олигогуклеотид в Speed Vac и растворяли в в 1 мл раствора
ТЕ. Концентрацию олигонуклеотида измеряли с помощью спектрофотометра при
длине волны в 260 нм.
2.5. Электрофорез и идентификация изоферментов
Полиморфизм a- и b-амилаз, а также эстераз I и V в линиях самоопыляющейся
популяции №106 исследовался Нецветаевым В.П. и Чаплей А.Е. (отдел генетических
основ селекции СГИ, Одесса) (Нецветаев, 1993), которые любезно предоставили нам
результаты для совместного анализа.
37
2.6. Компьютерный анализ полученных результатов
2.6.1. Определение сцепления и картирование молекулярных
маркеров с
помощью программы MAP_QTL
При генетическом картировании простых по наследованию и локусов
количественных признаков (QTL, Quantitative Trait Loci) используются в основном две
модели и, соответственно, две компьютерные программы (две модели): MAPMAKERQTL (метод максимального правдоподобия) (Lander et al., 1987) и QTL-STAT
(нелинейный метод наименьших квадратов). При сравнении результатов сцепления
QTLs с молекулярными маркерами, проведенных с помощью этих программ, сходными
оказалось 75% (Grattapaglia
et al., 1995). Многоточечный анализ по общей
генетической дисперсии, на примерах некоторых QTLs (вес проростка - 89.0%; вес
отростков после усечения - 67.1%; вес корней после усечения - 62.7%) показал, что
значительная
часть
различий
в
эффекте
этих
QTLs
у
Eucalyptus
grandis
контролируется небольшим числом родственных главных QTL. Приобретение данных
программ не представилось возможным. По этой причине, используя известные
формулы и модели разработана компьютерная программа “MAP_QTL”, производящая
расчеты даже на базе 286 процессора.
Программа “MAP_QTL” разработана для определения сцепления
локуса
молекулярного маркера c локусом количественного признака и последующего
картирования. Анализируемый файл с данными подготавливался в текстовом
редакторе, например “Q” , позволяющем создавать строки длиной до 256 знаков, так
как именно такой максимальной длиной строки могут быть представлены данные. В
начале
файла
создаются
идентификаторы
качественных
и
количественных
показателей, разделяющихся апострофом (‘ или `) и длиной до 20 знаков.
Качественные показатели имеют цифровые идентификаторы, следуемые сразу
же после апострофа, например, ‘1 - P6#900 или ‘2 - BmyI. Количественные показатели
имеют буквенные идентификаторы, следуемые сразу за апострофом, например, ‘A масса 1000 зерен или ‘B - натура. За идентификаторами следуют строки с собственно
данными: первая строка - определитель колонок количественных и качественных
показателей, а затем следуют две строки родительских генотипов идентифицируемых
в начале строки как “P1” и “P2” и только затем следуют строки, с обозначением
генотипов каждой линии. Информация качественного показателя может быть
кодирована в трех вариантах - “1” - наличие полиморфной полосы у образца, “0” отсутствие
(доминирование)
или
аллель
с
другим
молекулярным
весом
38
(кодоминирование), “*”- гетерозигота. Количественные показатели записываются в
столбик под данным идентификатором для каждой линии в виде значений, полученных
при измерении, до 5 знаков на колонку. Отсутствие информации для данного образца пустая ячейка.
Количество анализируемых линий не должно превышать 150, что можно считать
достаточным для генетического анализа. Например:
’1 - P6#900 ‘2 - P9#950 ‘3 - P66#2300’4 - BmyI ‘5 - AmyI
‘6 - Est5
‘A - масса 1000 зерен ‘ B - пленчатость % ‘C - белок %
номера линий
A
B
C
1
2
3
4
5
6
P1 Дн-4
44.3
10.8
10.1 1
1
0
1
1
1
Р2 Джау Кабутак
40.1
8.2
12.5 0
0
1
0
0
0
1
44.6
7.7
11.2 1
1
1
1
0
1
2
39.6
11.3
9.9 1
1
0
1
0
1
3
37.7
9.8
12.2 1
0
1
0
0
1
4
41.3
9.9
9.7 1
0
0
0
0
0
5
45.3
11.1
12.3 0
1
1
0
0
0
6
37.9
10.7
10.0 0
0
0
0
1
0
Частоту рекомбинации для F2-F5 оценивали предложенным Фишером методом
максимума правдоподобия, который использует всю возможную информацию выборки
о частоте рекомбинации. Формулы для вычисления частоты рекомбинации и ошибки
частот рекомбинаций представленные в работе Allard (1956), а также у Серебровского
(1970).
Вычисление частоты рекомбинации для самоопыляющейся популяции или
гибридов старших поколений (F6-10) осуществляли по формулам Созинов и др., (1978):
p=
a+b
,
2( c + d )
где p - частота рекомбинации; a и b - количество рекомбинантных, c и d - материнских
генотипов.
Ошибку частоты рекомбинации определяли:
Sp = (1 + 2 p )
p
,
2n
39
где Sp - ошибка частоты рекомбинации; n - размер выборки (a+b+c+d). Критерием
достоверности служил
X l2 = n -
X l2 , который определяли по упрощенной формуле:
4 ( c + d )( a + b )
.
n
Недостоверными считались результаты, при которых значения
Соответственно максимальная величина
X l2
X l2
были ниже 8.
будет равна размеру выборки при 0 %
рекомбинации.
Перевод данных о процентах рекомбинации (p) в сантиморганиды осуществляли
с помощью формулы:
1
cM = - ln(1 - 2 p ) ,
2
где cM - сантиморганиды, р - частота рекомбинации.
Ошибку при вычислении сантиморганид определяли по формуле:
S=
Sp
.
1- 2p
Процесс определения групп сцепления начинается с того, что определяется
сцепление между конкретными локусами с учетом достоверности. Затем определяется
принадлежность каждого маркера к определенной группе сцепления, а также
определяется количество точек в группе. При наличие маркеров сцепленных на 0%
рекомбинации, их название заменяется на общее.
Наиболее сложная наблюдается ситуация при сцеплении двух маркеров тесное сцепление маркеров, располагающихся на одинаковом расстоянии. Решение
данной проблемы состоит в использовании данных по сцеплению с дальними точками.
В дальнейшем процесс связан с отсеиванием дополнительной информации, связанной
со сцеплением каждого маркера с дальними точками. Используя только ближайшие
расстояния между точками выстраивается карта сцепления. Полученные результаты
записываются в файл.
Достоверностью
средних значений технологических показателей служили
параметрические T (Стюдента) и F (Фишера) критерии. T-критерий определялся как
40
отношение разности выборочных средних к своей ошибке, а F-критерий как отношение
выборочных дисперсией (Ли, 1978; Лакин, 1990; Компьютерная биометрика, 1990).
2.6.2. Построение
схем филогенетических взаимоотношений с помощью
программы TREE 4.0
Для установления генетических дистанций по данным полиморфизма продуктов
ПЦР использовался метод Нея и Ли (Nei, Li, 1979). Коэффициент генетического
сходства между двумя сравниваемыми на электрофорезе образцами вычисляли по
формуле :
F=
2 N xy
Nx + Ny
,
где Nxy - число общих полос у сравниваемых образцов Х и Y; Nx - количество полос
образца X; Ny - количество полос образца Y. Коэффициент генетической дистанции D
по Нею (Nei, 1972) выражается как :
D = - ln( P ) .
Р можно оценить через, F используя итеративную формулу (Nei, 1987):
P = 4 F ( 3 - 2 P1 ) ,
где Р1 имеет первоначальное равное
4
F , последующие итерации проводятся до тех
пор пока P = P1.
Любезно предоставленные нам программы “d-Value”, “UPGMA” и “NJTREE”
доктором Л. Гензбиттелем (L.Gentzbittel, Universite Baiaise-Pascal Clermont-Ferrand,
France) не позволяют быстро анализировать полученные
многочисленные данные.
Вводимая информация состояла из результата анализа каждого образца со всеми количество общих полос, и количество полос для каждого из сравниваемых образцов.
Так для построения дерева для 120 образцов необходимо было вычислить 7140
(арифметическая прогрессия
n2 - n
Sp =
2
, где n - число образцов) чисел с точность
до пятого знака после запятой. Даже для меньшего числа сравниваемых образцов
данная процедура становится нереальной. Поэтому разработана программа “TREE”
(ее модернизированая версия 4.0) позволяющая строить схемы-дендрограммы,
используя данные электрофоретического разделения белков и ДНК, а так же
использовать количественные показатели, удобным для пользователя способом.
41
Необходимым условием анализа является наличие текстового файла с данными
электрофореграмм (аналогично подготовленному в текстовом редакторе, как это
показано для программы “MAP_QTL”). Присутствие полосы на данном уровне
обозначается как “1” ее отсутствие - “0”, если на том же уровне у различных oбразцов
имеется
полоса
с
разной
интенсивностью
(сорта
имеют
различную
частоту
встречаемости данного продукта), тогда полоса с максимальной интенсивностью
обозначается как “2”, а с меньшей “1” и коэффициент сравнения тогда равен 0,5.
Первые строки в файле отводятся под комментарии, выделяемые в начале строки
апострофом (‘ или `). Затем, в каждой новой строке записываются названия образцов
(до 20 знаков и без пробелов), разделенным апострофом от последовательности цифр
данных электрофореза длиной до 256 знаков. В один и тот же файл можно дописывать
данные для других праймеров, в случае ПЦР.
Вычисление производятся по известным формулам. При сравнении образцов по
количественным
признакам
определяли
коэффициент
сходства
(F),
который
подсчитывали как отношение меньшего значения у сравниваемых образцов к
большему. В конечный результат входила средняя арифметическая от суммы по
каждому из значений технологических показателей.
Данные нескольких файлов могут быть суммированы и использованы для
построения усредненной дендрограммы. Матрицы, полученные по данным анализа
различных методов (например, анализ запасных белков и ПЦР-анализ), используются
для
построения
дендрограммы.
Программа
осуществляет
кластерный
анализ,
используя модули UPGMA (парно-групповой невзвешенный метод) (Sneath, Sokal,
1973) и NJTREE (метод ближайших соседей) (Saitou, Nei, 1973). Например:
’Образцы сортов ячменя ПЦР - праймер P6 и P9
Одесский100
‘00001110101010101010101
1101111101010000101
Одесский131
‘00010101000101010010101
1111000110101010110
Одесский151
‘10101010100111110110100
1110101001010101011
Прерия
‘11101010101111110000001
0100101010101011111
Престиж
‘01111001011100011010101
1101000101000101011
Дерибас
‘11101000000010011111110
0101000100010011210
Эдем
‘21010101000111111000001
1010101000101010011
Паллидум107
‘10101010011110100000111
1101010101011101010
КалсбергII
‘11101111101011101010001
1111110001111011011
42
2.7. Количественные показатели
Количественные показатели за 1994 и 1995 годы 150 линий самоопыляющейся
популяции №106 определял Чапля А.Е.
Исследовали следующие количественные показатели - масса 1000 зерен
(граммы), кустистости (число стеблей к числу растений), озерненности (число зерен с 5
растений к числу стеблей), продуктивности (вес зерна к числу растений), числу зерен
одного растения.
ГЛАВА 3. Оптимизация условий полимеразной цепной реакции c произвольными
праймерами
3.1. Моделирование полимеразной цепной реакции
Хотя использование ПЦР с произвольными праймерами насчитывает около 6
лет (c 1990 г.), проблема воспроизводимости результатов до сих пор не потеряла
актуальности. Об этом свидетельствуют многочисленные работы
в области
оптимизации и стандартизации процесса амплификации ДНК с помощью ПЦР (Wolff et
al., 1993; Michli et al., 1994).
На взаимодействие между отдельными нитями, дуплексами, петлями шпилек и
другими типами молекул, формируемых в течении ПЦР, влияет ряд параметров.
Использование произвольных праймеров требует определенных условий реакции, от
которых зависит воспроизводимость результатов. Для поддержания необходимого
равновесия эти условия должны быть тщательно оптимизированы. Такие параметры,
как продолжительность и температура отжига, элонгации, денатурации, число циклов,
скорость нагрева и охлаждения, концентрация праймеров, матрицы, ионов, источник и
качество ДНК-полимеразы, влияющие на результат амплификации, по нашему
мнению, должны быть стандартизированы. На результатах сказывается и качество
препаратов геномной ДНК.
Кроме того, использование различных по размерам и
нуклеотидному составу олигонуклеотидов требует и особых условий проведения
реакции. Критическим является температура отжига, так как денатурация и элонгация,
проводится всегда при фиксированной температуре (температура денатурации ДНК от
90 до 95, а элонгация от 68 до 74 градусов) и изменения не играют существенной роли
в амплификации. Отжиг - эта та стадия от которой во многом зависит амплификация
нужного фрагмента и его количественный выход. Воспроизводимый с максимальным
43
выходом продукт амлификации можно получить только при оптимальных условиях
проведения реакции. По этой причине была предложена модель полимеразной цепной
реакции с произвольными праймерами. Результаты данной модели использовались
при оптимизации условий проведения температурного режима отжига.
Для начала необходимо определить понятия, которые будут использованы в
описании механизма полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами.
Основной
продукт
полимеразной
цепной
реакции
(ампликон)
-
это
двухцепочечная молекула ДНК, концы которой фланкированы последовательностью
праймеров и комплементарного им участка ДНК.
Структура продукта амплификации с единичным произвольным праймером
представляет
фрагмент
ДНК,
фланкированный
инвертированной
последовательностью праймера.
Полупродукт полимеразной цепной реакции - это одноцепочечная молекула
ДНК, содержащая на конце последовательность праймера. Молекулы полупродуктов
участвуют в образовании основного продукта и других полупродуктов реакции (рис.1).
Накопление
полупродуктов
происходит
за
счет
образования
новых
молекул
полупродуктов в каждом цикле.
Цикл полимеразной цепной реакции начинается с денатурации ДНК, затем
отжига праймера на ДНК-матрицу (полупродукт предшествующего цикла или геномная
ДНК) и завершается синтезом полупродукта ДНК-полимеразой. Полимеразная цепная
реакция с произвольными праймерами обычно происходит в присутствии одного
праймера, который выполняет функцию прямого и обратного. При амплификации
участка ДНК праймер образовывает дуплексы с обоими комплементарными нитями
ДНК. 3'-концы праймера ориентируются внутри амплифицируемого фрагмента
(ампликона).
44
Рис.1. Схема образования продукта полимеразной цепной реакции c
произвольными праймерами
Для упрощения моделирования полупродукты амплификации ПЦР были
дифференцированы по двум признакам: по природе их образования и степени
комплементарности концевых участков.
Образование полупродуктов зависит от типа матрицы, с которой синтезирована
копия данного полупродукта (матрицей может служить как геномная ДНК, так и
синтезированные ранее полупродукты).
Каждый
тип
полупродукта
включает
нити
ДНК,
синтезированные
с
комплементарных матриц.
В формулах, описывающих динамику образования каждого типа полупродуктов
ПЦР, учитывается тип матриц, принимающих участие при их образовании в конкретном
цикле n и оценивается вклад других полупродуктов из предшествующих циклов. Тип
данного полупродукта не изменяется в течение всей реакции, формулы состоят из
двух частей: одна описывает количество образованных молекул полупродукта в
данном цикле, вторая - количество полупродукта, полученного из предыдущих циклов.
Из рисунка 1 видно, что в первом цикле образуются молекулы, более длинные,
чем продукт, связанный с ДНК-матрицей. Назовем этот тип полупродукта - «а».
Количество молекул «а», синтезируемых в каждом цикле реакции, одинаково. Сумма
молекул комплекса «a»+»Ms» - S(«a»+»Ms») (где «Ms» - матричная ДНК в
45
одноцепочечной форме) - равна количеству матричной ДНК S(«Ms»). Длина
полупродукта типа «a» больше, чем длина последовательности основного продукта,
так как терминация синтеза ограничена пределами нити ДНК или ее денатурацией.
Cуммарное количество молекул «а» - S(an), образованных за n циклов,
описывается следующей формулой:
S(an)=Ms + S(an-1)
(1)
S(an) = 2n Мd
(1.1)
Для остальных формул количество матричной ДНК - Md (Md в двухцепочечной
форме, Ms - в одноцепоченой форме) принято равным единице, в противном случае
формулы
по
динамике
образования
полупродуктов
необходимо умножить на
соответствующее количество матричной ДНК.
На втором цикле с молекул полупродукта типа «а» предыдущего синтеза S(an-1)
образуется новый тип полупродукта
- «b». Данный тип полупродукта короче, чем
молекулы «а», и в следующем цикле образует продукт реакции.
Суммарное количество молекул типа «b» - S(bn) (арифметическая прогрессия),
образованных за n циклов:
S(bn) = S(an-1) + S(bn-1)
(2)
S(bn-1) = n2 - 3n + 2
(2.1)
S(bn) = Md (n2 - n)
(2.2).
На 5`-конце праймера возможны некомплементарные матрице нуклеотиды,
характерные только для молекул полупродуктов типа «a» и «b».
В третьем цикле с молекул «b» синтезируются молекулы «d», равные по длине
молекулам «b». С третьего цикла впервые образуется продукт, который представлен
двухцепочечной молекулой ДНК, содержащей цепь молекулы «b» и молекулы «d».
Суммарное количество синтезированных молекул типа «d» S(dn) за n циклов
(геометрическая прогрессия):
S(dn) = S(bn-1)+ S(dn-1)
(3)
S(dn-1) = 2n - n2 + n - 2
(3.1)
S(dn) = Md (2n+1 - n2 - n - 2)
(3.2)
Молекулы типа «b» и «d» одинаковы по нуклеотидному составу, но происходят
от разных матриц (рис. 1, Табл. 2).
Особенности молекул этих типов состоят в следующем: во-первых, полупродукт
«b» синтезируется на матрице «a» с образованием комплекса «a»+»b», по структуре
не соответствующем характеристике продукта ПЦР (длина молекул типа «a» всегда
46
больше длины продуктов амплификации); во-вторых, матрицей полупродукта «d»
является
«b», последовательности обоих полностью комплементарны, и комплекс
«b»+»d» представляет собой полноценный продукт; синтез «d» происходит на третьем
цикле и косвенно связан с полупродуктом «a» через «b». Для удобства описания
образования продукта ПЦР полупродукта типа «b» недостаточно, и поэтому был
введен
полупродукт
типа
«d»,
который
идентичен
ему
по
нуклеотидной
последовательности.
Логические формулы (1-3) объясняют происхождение образования данного типа
полупродукта, а формулы 1.1, 2.2, 3.2 - пригодны для количественных расчетов.
В образовании основного продукта принимают участие молекулы типа «b» и «d»,
синтезированные в предыдущих циклах, то есть S(bn-1) и S(dn-1). Образование продукта
ПЦР можно описать как сумму:
Pd = S(bn-1)+ S(dn-1),
(4)
где Pd - продукт ПЦР (если количество матрицы Md = 1).
Таблица 2
Динамика образования продукта и полупродуктов ПЦР.
Число циклов
1
2
3
4
5
6
7
8
20
* Md = 1.
Количество полупродуктов
“a”
“b”
”d”
2
4
2
6
6
2
8
12
10
10
20
32
12
30
84
14
42
198
16
56
438
40
380
2096730
Продукт
Pd
2
8
22
52
114
240
1048536
Из всех синтезированных в ПЦР молекул только комплексы типа «a»+»Ms» и
«a»+»b» не являются продуктом реакции, и поэтому их количество снижает значение
2n к значению 2n -2n. Количество комплекса S(«a»+Ms») равно количеству 2Мd , а
S(«a»+»b») равно 2 (n-1). Сумма («a»+»Ms») и S(«a»+b) дает 2(Md + n-1), если Мd = 1,
то сумма равна 2n. Образование продукта возможно описать таким образом:
Pd = Md (2n - 2n)
(5).
47
Данная зависимость объективна для идеальных условий, когда все компоненты
реакции (dNTP, Taq-полимеразы, праймера) в избытке. При недостатке какого-либо
компонента эффективность образования продукта ПЦР снижается.
Предложенная математическая модель динамики образования продукта и
других молекул реакции амплификации необходима для описания начальных циклов,
так
как
в
дальнейшем
количество
комплексов
«a»+»Ms»
и
«a»+»b»
будет
незначительным по сравнению с комплексами «b»+»d» и «d»+»d»:
n -1=
S (bn ) + S ( d n )
- Pd
2
(6).
3.2. Оптимизация условий проведения отжига ПЦР
Известны эмпирические формулы измерения температуры плавления
олигонуклеотидов:
(Коробко и др., 1984),
Tm = 2 S(A+T) + 3 S(Ц+Г)
(7)
Tm = 2 S(A+T) + 4 S(Ц+Г) - 5 (Meinkoth et al., 1984)
(8).
Однако, данные формулы не применимы при вычислении оптимальной
температуры отжига ПЦР, так как полученные с помощью их значения, не
соответствуют реальной картине амплификации (праймеры с одинаковым ГЦ-составом
и одинаковым размером могут иметь разную температуру плавления, а праймеры с
разной
длиной
могут
иметь
одинаковую
температуру
плавления).
Закон
распределения ГЦ-состава для праймеров с фиксированным размером имеет
прерывистый
характер,
а
температура
плавления
праймеров
подчиняется
непрерывному закону. В ПЦР с 10-членными произвольными праймерами, отжиг
обычно проводят при температуре от 35 до 40 градусов (Williams et al., 1990).
В работе Wolff et al. (1993) было показано, что на выход конечного продукта ПЦР
влияют
следующие
праймера,
факторы:
температура
отжига
качество
и
ДНК-полимеразы,
особенности
последовательность
амплификатора.
Оптимальная
температура отжига не коррелирует с ГЦ-составом праймера.
Rychlik et al. (1990) была предложена формула для вычисления оптимальной
температуры отжига, в зависимости от последовательности праймеров и продукта
ПЦР:
Ta
opt
= 0.3Tm
primer
+ 0.7Tm
product
- 12.9 ,
(9)
48
primer
где Tm
product
, Tm
Температуру
- соответственно, температуры плавления праймера и продукта.
плавления
продукта
вычисляют
по
стандартной
формуле,
используемой при гибридизации по Саузерну:
Tm
product
[ + ] + 0.41[GC %] - 675l
= 81.5 + 16.6 lg K
,
(10)
где [K+ ] - концентрация ионов калия в молях; [G+C%] - количество G и C в продукте
ПЦР в процентах; l - длина продукта в парах нуклеотидов.
Температуру плавления олигонуклеотидного праймера определяют:
Tm primer =
dH
+ 16.6 lg K + - 273.15 (11)
dS + R ln( c / 4)
где dS и dH соответственно изменение энтропии и энтальпии праймера при отжиге, R газовая постоянная (1.987 кал/0Смоль), с - молярная концентрация праймера (авторы
подобрали эмпирически, 250 пмоль).
Значения dS и dH определялись авторами методом l-граммного разложения
последовательности праймера (l=2) (Компьютерный анализ генетических текстов,
1990). В работе Kenneth et al. (1986) представлены числовые значения dS, dH и dG для
каждой из 16 пар сочетаний нуклеотидов. Изменение температуры плавления
праймера происходит по непрерывному закону, что соответствует реальным данным.
Термодинамические параметры
Interaction
dH0
AA/TT
9.1
AT/TA
8.6
TA/AT
6.0
CA/GT
5.8
GT/CA
6.5
CT/GA
7.8
GA/CT
5.6
CG/GC
11.9
GC/CG
11.1
GG/CC
11.0
Однако,
dS0
24.0
23.9
16.9
12.9
17.3
20.8
13.5
27.8
26.7
26.6
dG0
1.9
1.5
0.9
1.9
1.3
1.6
1.6
3.6
3.1
3.1
вычисления с помощью формулы Tmprimer
не представляется
возможным, в связи с тем, что в формуле имеется ошибка или опечатка в статье. Так
правая часть формулы равна -275.15 при концентрации 50 мМ KCl в реакционной
смеси. Тогда левая часть должна превышать данную величину не менее чем на 40 (то
есть быть равной 315), но числитель dH не может иметь столь больших значений.
49
Поэтому, данная формула не может использоваться в вычислениях значения
температуры плавления олигонуклеотида. Но, значения температур плавления
праймеров в данной статье рассчитаны верно как и при вычислениях с помощью
компьютерной программы «OLIGO» , разработанную этими же авторами.
Для вычисления температуры плавления олигонуклеотидного праймера Tmprimer
мы предложили свою эмпирическую формулу, использующую термодинамический
показатель dG (свободная энергия Гиббса), изменение которого происходит по
непрерывному закону (Cиволап и Календарь 1994), что более корректно при
определении истинной температуры плавления олигонуклеотида:
Tm primer = - k
dG
l 3.3/13
(12)
где k=2.9136826, l - длина праймера (в нуклеотидах), если концентрация ионов калия
в растворе равна 50 мМ.
В общем же случае формула выглядит следующим образом:
Tm primer = -3.9
dG
l
3.3/ 13
+ 16.6 lg[K + ] .
(12.1)
Для вычисления значения свободной энергии Гиббса использовали l-граммный
метод разложения последовательности праймера (l=2). Для каждой из 16 пар
сочетаний нуклеотидов соответствовало определенное значение dGi. следовательно,
конкретной
последовательности праймера соответствовало свое определенное
значение dG, полученное суммированием всех dGi.
Значения температур плавления олигонуклеотидов, приведенные в статье
Rychlik et al., (1990), и их величины, вычисленные по формуле “12”, идентичны
(Табл.3). Таким образом, предложенные нами формулы «12» и “12.1” пригодны для
расчета температуры плавления олигонуклеотидов.
Были вычислены для каждого праймера значение Tmprimer, используя формулу
“12” и конечное значение температуры отжига по формуле “9”. При вычислении
температуры плавления продукта амлификации Tmproduct исходили из того, что размеры
амплифицированных продуктов не ниже 200 и не выше 2000 пар оснований, а ГЦсостав в среднем вероятнее всего составит у данных продуктов 50%. В результате
получили значения Тaopt в диапазоне 1,4 градуса. Отжиг, соответственно проводили
при минимальной температуре, приведенной для каждого праймера в таблице 2. Как
видно из таблицы 2, что для 10-членных праймеров минимальное значение Тaopt не
ниже 47.70С и максимально - 50.90С, что значительно отличается от тех значений
50
температур отжига, используемых в RAPD другими авторами (обычно это 370С или
400С).
Таблица 3
0
Температуру плавления олигонуклеотидов ( С), полученных с помощью формул “11” и
“12”
Последовательность 5`-3` *
Ta (“11”)
Ta (“12”)
GTCGAACCGGAAACCACCCCT
60.7
60.5
GTGGATATGGTTGTACAGAGCCC
54.3
54.4
AACGGGGAGGACGATGGC
56.8
56.1
CAGCGCCACATACATCAT
46.9
47.0
TCAGCTCCCAAATCTCGATTGC
58.0
57.4
GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC
65.2
66.5
CCGGCGCAGAAGCGGCATCAGCAAA
73.9
75.1
TCACCAGCCAGCCGCAGCACGTTCC
72.8
71.2
AGGATGGCGAACAACAAGAAACTGG
61.3
61.9
GGCGAAAGCAGAAGCAGATGAGAGA
61.9
61.9
* - последовательность олигонуклетидов взята из работы Rychlik et al., (1990)
Для стандартной амплификации точно вычисленная оптимальная температура
отжига определяет чувствительность амплификации и ее специфичность. Ошибка в
три
градуса
при
вычислении
оптимальной
температуры
отжига
существенно
сказывается на результате амплификации, и выражается в уменьшении выхода
основного и появление неспецифического продуктов (Rychlik et al., 1990). Оптимальная
температура отжига в AP-PCR различается для коротких продуктов ПЦР и для
продуктов с максимальной длиной при прочих равных условиях. Максимальная
разница может составить 6 градусов. Отжиг можно проводить только в диапазоне
температуры, оптимальном для конкретного праймера. Для праймеров равной длины
существует общий диапазон температуры отжига, в пределах которого происходит их
отжиг с матрицей.
В течение первых двух циклов ПЦР с произвольными праймерами происходит
образование разнообразных полупродуктов, участь которых определяется уже в
третьем цикле. Синтез молекул полупродукта типа «a» на матричной ДНК и при
образовании «b» на матрице «a» происходит при неполной комплементарности с
51
матрицей. Поэтому, для проведения амплификации необходимо, чтобы в течение
первых двух циклов условия отжига были оптимальны для образования дуплексов
праймера с геномной ДНК, имеющей на 5`-конце праймера до 1-3 мисметчей (в
зависимости от размера праймера). После второго цикла амплификации температуру
отжига необходимо увеличить до оптимальной, чтобы в реакцию были вовлечены
только молекулы типа «d» и «b» предшествующих циклов. Это приведет к
воспроизводимости реакции и к уменьшению фоновой амплификации (синтез
молекулы типа «a» и синтез «b» на матрице «a»). Большая часть молекул типа «a» не
принимает участия в амплификации основных продуктов реакции, так как не все
варианты амплифицируемых молекул «а» являются матрицами для синтеза молекул
типа «b», в связи с отсутствием комплементарных участков для праймера.
Таким образом, условия проведения отжига следующие: первые три цикла APPCR (олигонуклеотиды более 15 нуклеотидов) следует проводить при температуре
ниже оптимальной на 10 градусов, для RAPD (праймеры до 15 нуклеотидов) - на 5-7
градусов ниже оптимальной.
Результаты тестирования всех олигонуклеотидов (табл.1) при выше указанных
условиях
реакции
показали
количественную
и
качественную
стабильность
амплифицированных продуктов. Количество амплифицированных продуктов зависело
только от последовательности праймера, поэтому, казалось бы, при жестких условиях
отжига
должны
обусловленные
образовываться
наименьшим
только
наиболее
количеством
стабильные
мистметчей
продукты,
праймера
с
последовательностью мишени (а скорее их отсутствием), однако, образовывалось до
30 продуктов, что свидетельствует об амплификации всех стабильных комплексов при
температуре отжига не ниже 370С для 10-членников. Амплификация при температуре
отжига 370С (RAPD) и 450С образует одинаковые продукты, но при 450С эти продукты
более стабильны при воспроизведении, что связано с оптимальными условиями их
образования и накопления, и, кроме того, не накапливается неспецифический продукт
и снижается фоновая амплификация. Кроме того, суммарное время затраченное на
амплификация с температурой отжига 450С меньше, чем при температуре отжига в
370С.
3.3. Оптимизация остальных условий полимеразной цепной реакции
а) Условием успешной амплификации с произвольными праймерами является
высокая концентрация ионов магния (при стандартной амплификации концентрация
52
ионов магния составляет 1.5 мМ, для RAPD - 2-4 мМ). Высокая концентрация ионов
магния
способствует
инициации
синтеза
продукта
ПЦР
с
не
полностью
комплементарного комплекса праймера и мишени при температуре отжига ниже
оптимальной.
Мы оптимизировали концентрация ионов магния в реакционной смеси и,
показали, что при 3 мМ наблюдается наибольшее количество продукта без примеси
неспецифического продукта (Сиволап и др., 1994).
б) Для синтеза продукта амплификации необходима высокая концентрация
праймера. Для АР-РСR она составляет 0.2 - 0.3 мкМ, для DAF - до 3 мкМ (CaetanoAnnoles, 1993). Низкая концентрация праймера приводит к невоспроизводимости
результатов.
в)
На
воспроизводимость
результатов
влияет
качество
используемых
препаратов ДНК. Наличие плохо очищенной или гидролизованной ДНК-матрицы
приводит к нестабильности воспроизводства продуктов реакции или непредсказуемым
результатам.
Нами была усовершенствована методика выделения высокомолекулярной ДНК
из растений в эппендорфе без жидкого азота. Данная процедура основана на
использовании детергента цетилтриэтиламмоний бромида (СТАВ) растворяющим
нуклеиновые кислоты при высокой ионой силе (выше 0.7 М) (Генная инженерия
растений, 1991). Размалывание растительного материала происходит в эппендорфе с
лизирующем раствором при комнатной температуре. Выдерживается лизат при 650С
для полного растворения cоли СТАВ с ДНК/РНК и преципитации белков и
полисахаридов. Однократная обработка хлороформом денатурирует белки и удаляет
все нерастворимые в СТАВ примеси. Осажденная из водной фазы ДНК растворяется в
растворе ТЕ с РНКазой (примесь РНКазы в растворе ДНК не мешает амплификации).
Выделенная таким методом ДНК имеет размер не менее 50 тыс. пар оснований,
хорошо амплифицируется и хранится. Аналогичная процедура c использованием СТАВ
и без жидкого азота описана и другими авторами (Paran et al., 1993).
г) Изменение состава реакционного раствора с (50 mM KCl, 20 мМ трис-НСl, рН
8.4 (250 С)) для Taq-полимеразы на (16.6 mM (NH4)2SO4 и 56 мМ трис-НСl, рН 8.8 (250С)
для Tth-полимеразы не приводит у существенным различиям (рис.2). Наблюдается
усиленная амплификация некоторых продуктов ПЦР или ослабление других, что
связано в большей степенью с активностью полимеразы инициировать синтез данных
продуктов в этих условиях реакции.
53
Усиление амплификации происходит в случае добавления в реакционную смесь
не ионных детергентов - Tween-20, TritonX-100 или NP-40 (Hung et al., 1990; Bachmann
et al., 1990), а также глицерина (Lu et al., 1993) и форамида (Gobinda et al., 1990). Нами
было показано, что наибольшее усиление (10-100 раз) амплификации наблюдается
при добавлении в реакционную смесь полиэтиленгликоля (Mr=6000-7500) до конечной
концентрации 6%. При повышении или уменьшении концентрации полиэтиленглюголя
(PEG 6000) происходит снижение эффективности синтеза продукта (рис.3).
Объяснить факт усиления амплификации
можно следующим образом:
полиэтиленгликоль уменьшает молекулярный объем реакции и по этой причине все
компоненты реакции (матрица, праймер и ДНК-полимераза) находятся в “сжатом”
пространстве, что сказывается в уменьшении диффузии. В результате происходит
более эффективная ассоциация праймера и матрицы и не инициализирующий синтез
ДНК-полимеразы. Увеличение же концентрации полиэтиленгликоля до 10% и выше
уже пространственно препятствует контакту праймера с ДНК-матрицей.
Эффект усиления ферментативной реакции с помощью полиэтиленгликоля
наблюдается и при других реакциях, например, рестрикции.
Эффективную концентрацию PEG 6000 в реакционном растворе определяли с
помощью
электрофореза
продуктов
амплификации
с
различной
начальной
концентрацией PEG 6000, а затем измеряли концентрацию ДНК с помощью
флюориметра (Табл.4).
Использование полиэтиленгликоля предпочтительно в ситуациях связанных с
высокой чувствительностью (например, в медицине - диагностика патогенов или
медицинской экспертизе, при экологическом мониторинге и др.), или если в
исследуемом
образце
присутствуют
ингибиторы
амплификации
гемоглобин, полифенолы и др.).
Таблица 4.
Оптимизация концентрации PEG 6000 в реакционной смеси
ПЦР
Концентрация PEG 6000
Количество ДНК
№
(%)
(мкг/мл)
1.
0
0
2.
2
1
3.
4
20
4.
6
45
5.
10
36
(например,
54
При RAPD применение полиэтиленгликоля желательно, так как амплификация
завершится на 32, а не 37 цикле. Кроме того, для амплификации потребуется меньше
полимеразы и ее активность и процессивность будут более стабильны, что очень
существенно на заключительном цикле реакции. И как результат, более “плотные”, а
не “размытые” продукты амплификации.
Таким образом, оптимизированный реакционный раствор для полимеразной
цепной реакции с произвольными праймерами должен быть следующего состава: 50
mM KCl, 20 мМ трис-НСl, рН 8.4 (250С), 3 мМ MgCl2, 0.01 % Tween-20, 5% глицерина и
6% PEG 6000. Концентрация ДНК 1нг на 1 мкл реакционной смеси, а количество Taqполимеразы 1 ед. на 20 мкл реакционной смеси.
рис. 2. Электрофорез разделения продуктов амплификации ДНК ячменя с праймером
Р6 в различных реакционных растворах. 1-6: 50 mM KCl, 20 мМ трис-НСl, рН 8.4 (25
0
С); 7-12 : 16.6 mM (NH4 )2SO4 и 56 мМ трис-НСl, рН 8.8 (25 0С).
рис. 3. Электрофорез разделения продуктов амплификации ДНК ячменя с праймером
Р56 в различных концентрациях полиэтиленгликоля. 1,2 - 0%; 3 - 1%; 4 - 2%; 5 - 4% ;
6 - 6%; 7,8 - 10%.
3.4. Моделирование произвольных праймеров для исследования молекулярногенетического полиморфизма
В результате узнавания ДНК-полимеразой комплекса, образованного при отжиге
праймера с сайтом-мишенью, реакция носит специфический характер. Это выражается
в предпочтительной амплификации определенных участков ДНК-матрицы, что создает
воспроизводимую картину полиморфизма.
Присутствие длинных концевых областей с неполной комплементарностью
праймера и матрицы препятствует аффинному взаимодействию фермента с таким
комплексом и затрудняет полимеризацию.
Наличие
ошибки
при
связывании
праймера
с
мишенью
влияет
на
воспроизводимость продуктов амплификации и эффективность работы полимеразы,
которая узнает и удлиняет «ошибочный» комплекс.
Первые восемь нуклеотидов с 3`-конца праймера имеют район с высокой
степенью
комплементарности
к
матрице.
Единичная
замена
в
этом
районе
55
значительно сказывается на результатах амплификации. Поэтому для успешной
амплификации на 3`-конце праймера необходимо не менее шести нуклеотидов,
полностью комплементарных матрице. Увеличение праймера на 2 или 3 нуклеотида не
приводит
к
изменению
нуклеотидного
состава
амплифицированного
продукта
(Caetano-Annoles, 1993).
Было замечено, что в зависимости от нуклеотидной последовательности
праймеров определяется степень выявляемого меж- и внутривидового полиморфизма.
Одни
праймеры
выявляют
межвидовой
полиморфизм,
но
неприменимы
на
внутривидовом уровне; другие же выявляют внутри- и межвидовой полиморфизм.
Поэтому,
праймеры
можно
условно
разделить
на
видоспецифичные,
внутривидоспецифичные и, возможно, специфичные для более высоких таксонов.
Специфичность праймера определяется продуктами амплификации.
Нами предложен способ классификации произвольных праймеров
на основе
различия их внутри- и межвидовой специфичности и отсюда - их целенаправленного
отбора. Способ выявления основывается на свойствах пар соседних нуклеотидов, это так называемый метод l-граммного разложения (l=2) последовательности
праймера (Компьютерный анализ генетических текстов, 1990). Суть подхода состоит в
следующем: нуклеотидная последовательность праймера с 3`-конца разбивается на
пары нуклеотидов, смещенные на один нуклеотид к 5`-концу. Например, праймер 3`ATTGCCAGTT образует пары: 1 пара - AT; 2 пара - ТТ; 3 пара - TG; 4 пара - GC; 5 пара
- CC; 6 пара - CA; 7 пара - AG; 8 пара - GT; 9 пара - TT (Календарь и Сиволап, 1995).
Всего вариантов пар для четырех нуклеотидов 16 (24). Если провести анализ всех
праймеров, выявляющих внутривидовую специфичность (так как они представляют
наибольший интерес для исследований), и частоту встречаемости определенных пар
нуклеотидов
использовать
в
данном
для
положении
синтеза
последовательностью.
Такие
праймера,
произвольных
праймеры
то
полученные
праймеров
с
большой
с
данные
можно
экстраполированной
вероятностью
могут
использоваться при исследования внутривидового полиморфизма.
Поиск
экстраполированных
последовательностей
внутривидо-специфичных
праймеров можно осуществить, анализируя последовательность геномной ДНК из
банков данных. Для этой цели разработана компьютерная программа, которая
производит
поиск
произвольных
праймеров
в
данной
последовательности
и
анализирует их нуклеотидный состав. Поиск произвольных праймеров происходит с
учетом заданного числа ошибок комплементарности (для 8 - нуклеотидного праймера
56
максимальное число мисметчей равно 2, для 10 нуклеотидов, соответственно, - до 4 и
так далее) при необходимом условии полной комплементарности 6 нуклеотидов на 3'конце праймера.
Смоделирована
гипотетическая
последовательность
геномной
ДНК
с
максимальным разнообразием ее нуклеотидной последовательности. Последнее
необходимо для увеличения разнообразия последовательности и уменьшения
повторов. При моделировании этой последовательности придерживались принципа
максимального
разнообразия
нуклеотидного
состава.
Нуклеотидная
последовательность «синтезировалась» генератором случайных чисел, где каждому
варианту из трех нуклеотидных сочетаний соответствовало множество чисел,
генерирующихся компьютером. Образование нуклеотидной цепи происходило путем
добавления сочетаний, «вызываемых» генератором случайных чисел (RND(1215),
размерность в 1216 чисел). Например, «вызов» триплета «AAA» происходил только в
случае, если генерировались числа - 1, 65, 129, 193, 321, то есть по формуле 1 +
64*RND(1215); для триплета «AAT» - 2, 66, 130, 194, 258, 322, то есть 2 +
64*RND(1215). Длина «синтезируемой» нуклеотидной последовательности составляла
7500 нуклеотидов. Этой длины было достаточно, чтобы программа отобрала 450
произвольных праймеров длинной 8 нуклеотидов, без «ошибок» комплементарности
праймера с генерированной последовательностью. ГЦ-состав «синтезируемых»
нуклеотидных последовательностей составлял от 45 до 60 %.
Генераторы случайных чисел имеют один существенный недостаток - блок
генерируемых чисел повторяется каждый раз, что приводит к кластеризации
«синтезируемой»
нуклеотидной
последовательности
(Компьютерный
анализ
генетических текстов, 1990; Ferrenberg et al., 1990). Решая эту проблему, мы пришли к
следующему результату: каждому триплету присваивалось большое число чисел,
определяемого формулой; «синтез» последовательности происходит очень быстро, за
1 с «образовывалось» более 5000 нуклеотидов, что предотвращало генерации чисел
для повторного цикла, а также длина последовательности не должна превышать 10000
нуклеотидов.
Моделирование новых произвольных праймеров возможно после анализа
«генерированных» компьютером произвольных праймеров. Такая работа проведена
по
результатам
исследования
специфичности
произвольных
праймеров
и
смоделированы некоторые праймеры (P22, P23, P26, P27, P40, P41, P42-P57). Данные
праймеры выявляют внутривидоспецифичный полиморфизм.
57
В
таблице
1
показаны
праймеры
используемые в
работе.
Праймеры,
выявляющие на высоком уровне вероятности внутривидовой полиморфизм отмечены
жирным шрифтом. Среди 68 произвольных праймеров, используемых в работе 23
праймера разработаны с помощью компьютерной программы «PCR». Это праймеры:
P22, P23, P26, P27, P40-57, P69. Из них внутривидоспецифическими оказались - 19.
Сравнение праймеров длиной в 8 нуклеотидов, полученных из разных по ГЦсоставу «синтезированных» последовательностей (различие в 5%), показало, что
величина сходства наиболее часто встречаемых пар сочетаний нуклеотидов (первые 9
пар из 16), приближается к половине, но для различных последовательностей с
равным ГЦ-составом эта величина приближается к 60%. Данные приведены в
таблицах 6 и 7 (толстым шрифтом показаны сходные пары). Таким образом, для
произвольных праймеров, происходящих из контрастных по ГЦ-составу исследуемых
последовательностей,
характерны
разные
сочетания
соседних
нуклеотидов.
Наблюдается увеличение частоты встречаемости пар нуклеотидов, содержащих Ц или
Г
для
последовательностей
с
ГЦ-составом
выше
50
%
и
А
или
Т
для
последовательностей с ГЦ-составом ниже 50%. У произвольных праймеров из
последовательностей с близким ГЦ-составом (не более 5% разницы) частота
определенных пар соседних нуклеотидов приблизительно сходна (табл.5).
Таблица 5.
Зависимость частоты сочетаний соседних пар нуклеотидов
от их
положения в 8-нуклеотидном праймере (GC-состав исследуемой
модельной ДНК равна 49.9%).
Частота встречаемости пары нуклеотидов в
праймере (max-min)* с 5`-конца
No
1
2
3
4
5
6
7
1
ag
aa
ac
tt
tg
ta
ta
2
gg
gg
ct
at
ag
ga
cg
3
aa
ac
gt
tg
tt
gt
aa
4
tt
ta
gg
ca
gt
gc
at
5
ga
tc
at
ct
ac
at
tg
6
at
ct
aa
ag
gc
ag
ag
7
ta
tt
ta
ta
ta
tg
gt
8
gt
tg
ca
ga
ga
cc
ac
9
tc
ga
tt
tc
at
ca
gg
праймер
AGGTTGAA
GGATGTGT
GGACTGAT
AACTGTAG
TTCTGTAG
GACTTGAG
GACAGTGT
3`-5`
* Число «ошибок» спаривания равно 0.
Таблица 6.
Зависимость частоты сочетаний (соседних) пар нуклеотидов от их
положения в 8-нуклеотидном праймере. GC-состав исследуемой
модельной ДНК равна 50.89 %.
Частота встречаемости пары нуклеотидов в праймере (max-min)* с
5`-конца
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
праймер
3`-5`
58
1
2
3
4
5
6
7
gt
ta
ca
ac
cc
ac
cc
ag
gc
ac
aa
ta
cc
ac
aa
ag
ta
cc
cg
ct
aa
tt
ac
gc
cg
gg
ga
ca
ct
tt
aa
gg
ac
gc
cg
cg
cg
ag
ag
aa
aa
ga
ac
ca
gt
tt
gt
tt
ct
ca
gt
cc
ct
tc
cg
gc
gc
tc
gg
gc
ga
tg
tc
GTACCCTC
GTTCCGAC
GTACGGAC
GTCAGGTC
CAGTTCCA
AGCACCTC
AGTACCCA
* Число «ошибок» спаривания равно 0.
Для подбора праймеров необходимо учитывать ГЦ-состав геномной ДНК
исследуемого организма. Вероятность амплификации участков ДНК с контрастным
содержанием ГЦ-пар, представляется низкой. Богатые А-Т последовательности не
принимают участия в амплификации, так как комплекс праймера с такими участками не
стабилен и поэтому менее вероятно, что они послужат затравкой для ДНКполимеразы. В среднем же можно ориентироваться на 50 % ГЦ-состав геномной ДНК.
Таблица 7.
Зависимость частоты сочетаний (соседних) пар нуклеотидов от их
положения в 9-нуклеотидном праймере. GC-состав исследуемой
модельной ДНК равна 49.9 %.
Частота встречаемости пары нуклеотидов
праймере
(max-min)* с 5`-конца
No
1
2
3
4
5
6
7
8
1
aa
aa
ac
at
tg
ta
aa
cc
2
tt
gg
at
tt
tt
gt
ta
gt
3
ga
ta
gg
ct
ta
ga
cg
ta
4
ta
ac
ta
ca
cg
cc
ag
gg
5
gt
tt
gt
tg
ag
at
at
at
6
tc
tc
ag
gc
gt
cg
gg
ag
7
gg
ct
cc
ta
gc
ag
tc
ga
8
ag
tg
tt
cc
cc
ac
tg
ac
9
at
at
tc
ga
ac
tg
cc
cg
праймер
AACCTGTAT
AACCAGTAG
TTCCTGTAT
GAAGCGTAC
GACCTGTAG
GAACTGTAG
GACAGCCCC
GTTTGTAGG
3`-5`
* Число «ошибок» спаривания равно 1.
Праймеры длиной в 8 нуклеотидов подобны праймерам из 9 и более
нуклеотидов если они не содержат мистметчей. Этим праймерам характерны общие
пары нуклеотидов, количество праймеров в 8 нуклеотидов больше, чем праймеров в 9
нуклеотидов. Ситуация изменяется, если в 9-нуклеотидном праймере допускается хотя
бы один мистметч на последних трех нуклеотидах 5`-конца. Тогда 9-нуклеотидных
праймеров больше, и в них входит множество 8 нуклеотидных праймеров (табл.5-6).
Например, последовательность длиной 5823 нуклеотида с ГЦ-составом 49.9 %
содержит 285 произвольных праймеров длиной в 8 нуклеотидов, для этой же
последовательности число праймеров длиной в 9 нуклеотидов составит 600. При
одной и той же температуре отжига (максимально жесткой для 8-нуклеотидного и
59
близкой
к
строгой
для
9-нуклеотидного
праймеров)
в
первых трех циклах,
предпочтительно при исследовании полиморфизма применение праймеров длиннее 8
нуклеотидов.
рис. 5.
Формула 8-членного праймера для последовательности ДНК с 49.9% CG-
составом. Показаны пять наиболее часто встречающихся пар нуклеотидов в данных
положениях праймера.
При проведении отжига в максимально мягких условиях предпочтительнее
короткие праймеры (8-10 нуклеотидов), так как комплекс праймера с мишенью более
стабилен. У длинных праймеров (например, 15 и более нуклеотидов), в условиях,
допускающих комплементарность только 6 нуклеотидов на 3`-конце праймера,
значение dG увеличивается, что приводит к нестабильности данного комплекса и
маловероятнее всего, что он будет образовываться.
В таблицах 5-7 приведены произвольные праймеры полученные путем
моделирования
наиболее
встречаемых
пар
нуклеотидов
в
соответствующих
положениях праймера. Эти и другие праймеры, полученные на базе сочетаний пар
нуклеотидов,
приведенных
в
таблицах,
вероятнее
всего,
могут
выявлять
внутривидовой полиморфизм.
Максимальное число последовательностей длиной в 6 нуклеотидов равно 4096.
Однако, половина последовательностей непригодна как «ядро» произвольного
праймера, так как ГЦ-состав ниже 50% (количество оснований Г и Ц меньше или равно
двум), или выше 70 % (количество оснований Г и Ц больше или равно 5). При
удовлетворяющем ГЦ-составе возможны структуры праймеров, где 3`-концы не
содержат оснований Г или Ц или их число в первых 6 нуклеотидах меньше, например,
60
3`-AATCCC, 3`-TTTCGG. Остальные 2000 последовательностей пригодны как «ядро»
последовательностей праймеров. Таким образом, 10-членные и 15-членные праймеры
с идентичной «ядерной» нуклеотидной последовательностью на 3`-конце образуют
одинаковые ампликоны. Однако, по некоторым ампликонам могут наблюдаться
различия (Caetano-Anolles, 1993). Возможен случай, когда количество мистметчей в
дуплексе для 10-членного праймеров более 1 (на 5`-конце праймера), устойчивость
такого дуплекса мала для инициации синтеза ДНК-полимеразой. Для 15-членного
праймера
данный
сайт
может
служить матрицей,
так
как
его устойчивость
стабилизируется остальными 5 нуклеотидами с 5`-конца праймера. В результате,
образуется
дополнительный
амплификации
с
продукт
10-членным
амплификации,
праймером
с
отсутствующий
идентичной
при
нуклеотидной
последовательностью (первые 10 нуклеотидов). Однако, возможна ситуация, когда 15членный праймер не инициирует синтез ампликона. Это возможно только для
ситуации, когда количество мистметчей в дуплексе с матрицей велико для инициации
элонгации. 10-членный праймер в данном сайте устойчив и приводит к синтезу
ампликона, отсутствующего при амплификации с 15-членным праймером. Однако
такие ситуации крайне редки и скорее всего, что 10- и 15 членный праймеры образуют
идентичные
продукты
амплификации.
Доказательством
может
служить,
то
обстоятельство, что имеющиеся в работе два произвольных праймера Р22 и Р66
имели идентичные первые 15 нуклеотидов на 3`-конце (Табл.1), и образовывали
идентичные продукты амплификации. Это свидетельствует о том, что для выявления
полиморфизма достаточно применять праймеры не более 10-15 нуклеотидов.
Увеличение размера праймера более 15 нуклеотидов не вносит существенных
изменений в информацию о полиморфизме. Таким образом, число произвольных
праймеров и число выявляемых ампликонов, ограничено. Максимальное число
выявленных ампликонов для этого числа праймеров будет более чем достаточно для
любой молекулярно-генетической работы.
61
Глава 4. Исследование меж- и внутривидового полиморфизма
рода Hordeum L.
4.1. Специфичность произвольных праймеров при выявлении
полиморфизма
При выявлении полифорфизма среди сортов ячменя Hordeum vulgare показали
полифорфизм, только 55% праймеров (38 из 68). В таблице 1 показаны жирным
шрифтом праймеры выявляющие внутривидовой полиморфизм Hordeum vulgare.
Праймеры, не выявившие внутривидовой полиморфизм, выявляли таковой между
видами рода Hordeum (H.agriocrithon, H.spontaneum, H.lagunculiforme, H.vulgare,
H.chilense, H.bulbosum), а также другими злаками Triticum durum, Triticum aestivum,
Secale cereale, Zea mays и у сои Glycine max .
Это подтверждает предположение о специфичности произвольных праймеров в
выявлении полиморфизма. Внутривидоспецифичные (сортоспецифичные) праймеры
выявляют полиморфизм среди сортов одного вида,
видоспецифичные праймеры
выявляют полиморфизм между видами и показывают слабый полиморфизм среди
сортов данного вида.
Проверка специфичности праймеров осуществлялась на 21 сортах из различных
эколого-географических зон выращивания, например Одесский 100 (Украина), Cувенир
(Белоруссия), Триумф (Германия), Паллидум 18 (Россия). Праймеры, не выявившие
полиморфизм среди данных сортов и детектирующие межвидовой полиморфизм,
считались
видоспецифичными.
Четкой
границы
между
видо-
и
внутривидоспецифичными праймерами провести трудно, так как специфичность
праймера
количеству
определяется
отношением
продуктов
амплификации.
консервативных
Поэтому,
ампликонов
к
видоспецифичный
общему
праймер
ограничивает большее количество консервативных внутри вида локусов, чем
внутривидоспецифичный праймер. Консервативные внутри вида последовательности,
ограничиваемые
видоспецифичным
праймером,
между
видами
оказываются
полиморфными. Количество ампликонов зависит от последовательности праймера и
структуры генома. Например, сортоспецифический праймер P56 при амплификации с
ДНК ячменя образовывал 4 ампликона, два из которых оказались полиморфными
(P56#840 и P56#760), тогда как праймер P79 при амплификации образовывал 10
полиморфных из 25 ампликонов.
62
Специфичность праймера определяется на основании анализа ампликонов у набора
генотипов:
Is = lg(
P(P + N )
),
N
где Is - индекс специфичности праймера (только для полиморфных праймеров), P количество полиморфных полос, N - всего полос.
Величина Is стремится к 0 при уменьшении получаемой информации от
праймера.
Интересная закономерность специфичности произвольных праймеров показана
среди вышеуказанных видов. Если представить следующий ряд расположения этих
видов с увеличением уровня внутривидового полиморфизма: cоя Þ ячмень Þ
пшеница Þ кукуруза, то праймеры выявляющие сортоспецифический полиморфизм у
сои или ячменя будут выявлять таковой и у пшеницы и кукурузы, праймеры не
выявляющие сортоспецифический полиморфизм у пшеницы или ячменя, не выявят его
и у сои. Поэтому сортоспецифичные праймеры у ячменя пригодны при исследовании
сортового полиморфизма у сои, у пшеницы и кукурузы, видоспецифичные праймеры
для ячменя не пригодны при исследовании сортового полиморфизма у сои и у
пшеницы, но на кукурузе возможно выявить полиморфизм среди удаленных в
генетическом
отношении
генотипов.
Таким
образом,
праймер,
выявляющий
внутрисортовой полиморфизм у ячменя со значением индекса специфичности больше
5, вероятнее всего покажет таковой и у сои, и у пшеницы, и у кукурузы.
Был
проведен
совместный
анализ
с
Бриком
А.Ф.
(Одесса,
СГИ)
по
исследованию полиморфизма с произвольными праймерами у сортов (200) ячменя и
сои (160 сортов). Оказалось, что все праймеры, выявляющие сортоспецифический
полиморфизм
у
ячменя
показывали
полиморфизм
у
сои,
а
праймеры,
демонстрирующие слабый полиморфизм среди сортов ячменя, - не выявляли
полиморфизм среди сортов сои. Так, были исследованы сортоспецифичные праймеры
у ячменя: P1, P2, P3, P6, P8, P22, Р39, Р43, P44, P52, P63, P66, Р73 и пара праймеров
Р92/Р93 для направленной амплификации (рис.5). Все они выявили полиморфизм
среди сортов сои.
Все
сортоспецифичные
праймеры
ячменя
выявляли
внутривидовой
полиморфизм у пшеницы и у кукурузы.
Объяснить специфичность произвольных праймеров можно тем, что у близких
по происхождению видов амплифицированные продукты равного размера имеют и
63
одинаковую нуклеотидную последовательность. Чем больше генетическая дистанция
между исследуемыми видами, тем меньше у них общих (константных) продуктов
амплификации (ампликонов). Особенно это заметно при сравнении продуктов RAPD у
пшеницы и ячменя. Общие не полиморфные полосы у близких видов предполагают их
связь с общими функциями и структурами в геномах этих видов. Консервативные
ампликоны,
выявляемые
сортоспецифическим
праймером,
видимо,
связаны
с
консервативными локусами генома данного вида. Аналогичная ситуация возможна с
мономорфными ампликонами у близких видов, выявляемых видоспецифическим
праймером. Константные ампликоны у видов одного рода характеризуют геномную
структуру данного рода.
Спектры
полиморфных
ампликонов,
характерны
для
генотипов,
при
исследовании сортоспецифическим праймером. При исследовании видоспецифичным
праймером видов одного рода полиморфные ампликоны будут характеризовать
данный вид.
В работах Булата и соав. (1992) и Шигинян и соав. (1995) при исследовании
штаммов микроорганизмов делаются аналогичные выводы, «что синтезируемые
ампликоны можно разделить на две категории: филогенетически консервативные и
индивидуально-специфические.» И, как результат, Булат и соав. предложили изменить
название “произвольные” праймеры на “универсальные” праймеры.
рис. 5. Электрофорез разделения продуктов амплификации ДНК сортов сои с
праймером Р73.
4.2. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма между
видами рода Hordeum L.
Анализ филогенетических взаимоотношений данных видов осуществлялся как с
помощью
видоспецифических так
праймеров).
Данные
полученные
и
сортоспецифических праймеров
после
амплификации
с
каждым
(всего
6
праймером
вводились в текстовый файл и анализировали с помощью программы “TREE” (рис.6).
По всем праймерам прослеживалась одна тенденция, которая наблюдалась при
суммарном «дереве»: анализируемые виды распределены в два больших кластера
(рис.6-9). В одном расположены виды Hordeum (без H.chilense), в другом T.aestivum,
T.durum, S.cereale и H.chilense. H.vulgare был представлен двумя сортами Донецким-4
и Джау Кабутак, характеризующимися довольно сильными морфологическими и
64
генетическими различиями (Cиволап и Календарь, 1995). Джау Кабутак местный сорт
высокогорных районов Таджикистана; шестирядный, голозерный,
Донецкий4 -
двурядный, пленчатый.
Анализ кластера содержащих виды
Hordeum
показал, что наименьшие
генетические дистанции отмечены между H.agriocrithon и H.lagunculiforme, с которыми
рядом располагается сорт Джау Кабутак (H.vulgare). H.spontaneum (двурядный ячмень)
ближе
к
данному
субкластеру,
чем
сорт
Донецкий-4
H.vulgare.
H.bulbоsum
располагается крайне обособленно от этих видов.
H.spontaneum
рассматривается
как
одичавший
культурный
ячмень
с
характерным ему ломким колосом, опушением по ребрам колосовых члеников.
Шестирядный с ломким колосом H.agriocrithon был обнаружен на территории Тибета Е.
Обергом. По выполненности и форме зерновки H.agriocrithon близок к культурному
ячменю. Однако, по разнообразию форм H.agriocrithon делается вывод о вторичности
происхождения данного вида (Трофимовская, 1972).
Рис.6. Дендрограмма межвидововых взаимоотношений, построенная на основании
анализа генетических дистанций.
Рис.7. Образцы электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК
различных видов c праймером Р37: 1 - H.vulgare, Донецкий 4; 2 - H.vulgare, Джау
Кабутак; 3 - H.agriocrithon; 4 - H.lagunculiforme; 5 - H.bulbosum; 6 - H.spontaneum; 7 T.durum; 8 - S.cereale; 9, 10 - Glycinia max. М - маркер (T7 по HpaI).
65
Рис.8. Образцы электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК
различных видов c праймером Р76: 1 - H.vulgare, Донецкий-4; 2 - H.vulgare, Джау
Кабутак; 3 - H.agriocrithon; 4 - H.lagunculiforme; 5 - H.bulbosum; 6 - H.spontaneum; 7 T.durum; 8 - S.cereale; 9, 10 - Glycinia max.
Рис.9. Образцы электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК
различных видов c праймером
Р6: 1 - H.chilense; 2 - H.agriocrithon; 3 -
H.spontaneum; 4 - H.lagunculiforme; 5 - H.bulbosum; 6 - H.vulgare, Донецкий 4; 7 S.cereale; 8 - T.durum; 9 - T.aestivum. М - маркер.
Рис.10. Образцы электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК
различных видов c праймером
Р8: 1 - H.chilense; 2 - H.agriocrithon; 3 -
H.spontaneum; 4 - H.lagunculiforme; 5 - H.bulbosum; 6 - H.vulgare, Донецкий 4; 7 S.cereale; 8 - T.durum; 9 - T.aestivum. М - маркер.
H.lagunculiforme
также
является
шестирядным
с
ломким
колосом,
но
содержащий плодоножки на боковых колосках. И аналогично с H.agriocrithon
H.lagunculiforme не является самостоятельным видом и представляет собой крайнее
звено в системе вида H.spontaneum (Трофимовская, 1972).
Согласно анализу спектров ампликонов Джау Кабутак содержит больше общих
полос с H.agriocrithon и H.lagunculiforme, чем к Донецким 4. Поэтому на дендрограмме
Джау Кабутак ближе к данным видам, чем к сорту Донецкий 4 из того же вида.
Согласно филогенетической схеме Невского, приведенной Бахтеевым H.vulgare
и H.spontaneum находятся в VI, H.bulbosum в V, а H.chilense - в III секциях.
Геномы H.vulgare и H.bulbosum относят к одной группе - I (Svitashev et al., 1994).
Авторами показано крайнее положение этих двух видов. H.bulbosum является
многолетним растением (Бахтеев, 1953). При скрещивании H.vulgare и H.bulbosum
получаются фертильные гибридные формы, сохраняющая, однако, лишь геном
культурного ячменя (Трофимовская, 1972). Данный эффект используется при
получении гаплоидов.
Данные виды относятся к трибе Hordeae Benth. рода Hordeum L. В семейство
Gramineae Juss. кроме видов Hordeum так же относятся: Secale L., Triticum L. и другие,
всего 21 род (Бахтеев, 1953). Поэтому в анализ были включены данные виды.
66
Вид H.chilense как и H.bulbosum является многолетним растением, практически
не скрещивается с другими представителями рода Hordeum, что, в известной мере,
сказывается на обособленности этого вида на дендрограмме. Генетические дистанции
между H.chilense и другими видами Hordeum сравнимы с таковыми с рожью S.cereale
(Трофимовская, 1972). Описаны спонтанные гибриды между H.chilense и S.cereale, а
также H.chilense и пшеницей (Трофимовская, 1972). Поэтому не удивительно, что
данный вид расположен в кластере среди пшениц и S.cereale.
В таблице 8 показана суммарная информация по каждому из исследуемых
праймеров по выявлению полиморфизма среди представителей только вида Hordeum.
Количество исследуемых локусов только у представителей Hordeum составил 146, из
которых полиморфными оказались 126 (86% полиморфных полос), а индекс
специфичности данных праймеров составил 1,72. Это обстоятельство говорит о том,
что данные праймеры выявили высокий полиморфизм среди видов, а значит и
вероятнее всего данный анализ наиболее достоверен. Величина Is больше 1,5
свидетельствует о том, что данные праймеры (Р6, Р8, P43 и P76) наиболее
эффективно детектируют полиморфизм, то есть внесли существенный вклад в
дифференциацию данных видов.
Таблица 8
Исследование межвидового полиморфизма среди представителей рода Hordeum L., с
помощью ПЦР с произвольными праймерами
количество продуктов амплификации
праймер
всего полос
полиморфных
Индекс специфичности
праймера
(Is)
Р6
Р8
Р37
Р43
Р67
Р76
30
34
17
27
13
25
25
30
17
23
10
21
1,67
1,76
2,00
1,70
1,53
1,68
всего
146
126
1,72
Результаты филогенетического анализа позволяют подтвердить мнение что,
H.spontaneum, H.agriocrithon и H.lagunculiforme вероятно являются одичавшими
формами H.vulgare, отделившимися не так давно (об этом говорит тот факт, что сорт
Джау Кабутак имеет больше общего с ними, чем с современными сортами), а также,
что H.bulbosum значительно отличающийся фенотипически от культурных ячменей,
67
отличается и генетически, а H.chilense ближе к S.cereale и пшенице, чем к другим
ячменям.
68
4.3. Исследование внутривидового полиморфиза вида H.vulgare L.
В исследовании внутривидового полиморфизма вида H.vulgare использовали 21
сорт, происходивший из различных эколого-географических зон. Так местный сорт
Таджикистана - Джау Кабутак исследовался как при изучении эволюционных
взаимоотношений между видами семейства Hordeum L., так и для анализа
внутривидовых взаимоотношений. Паллидум - местный сорт Крыма, Винер выведен на
Фаленской Государственной селекционной станции из местных сортов и районирован
более чем в 60 областях бывшего СССР (нечерноземная полоса Европейской части,
север центрального черноземелья, Дальнего Востока); Нутанс 106 (получен из
Одесского 18 и местного сорта Черкасской области), Черноморец (Южный/Нутанс 215)
выведены во Всесоюзном Селекционно-генетическом институте и районирован в
Одесской области. Корал выведен в Чехословакии, Athos в Кении; Riso 1508, Bomi
выведены в Германии, причем, первый является мутантом последнего; сорт Riso 56
является мутантом Calsberg II, выведенных так же в Германии, Betzes выведен в
Канаде. Кроме того в анализ были взяты сорта - Одесский 31, Одесский 70, Одесский
100, Донецкий 9, Донецкий 8, Исток, Циклон, Корал.
Исследование внутривидовой изменчивости вида H.vulgare проводилось на
вышеуказанных сортах с помощью ПЦР, используя сортоспецифические произвольные
праймеры (Р1, P2, Р3, P4, P6 и P8 ). У 21 анализируемого сорта рассмотрено 168
локусов. Количество полос на образец составило от 25 до 30, из них полиморфных - 41
%. Существенный вклад в выявляемый уровень внутривидового полиморфизма внёс
сорт Джау Кабутак, показавший большое количество полиморфных полос (табл.9).
Индекс специфичности праймеров составил 1,05, что ниже для значения Is,
полученное на видов Hordeum.
Таблица 9
Характеристика произвольных праймеров исследуемых на 21 сорте ячменя
количество продуктов амплификации Индекс специфичности
праймера
праймер
всего полос
полиморфных
Is
Р1
Р2
Р3
Р4
Р6
Р8
25
30
27
37
25
24
4
10
14
20
10
11
0,32
0,67
1,03
1,08
0,80
0,92
всего
168
89
1,05
69
Так праймер Р8, выявивший высокий полиморфизм у видов (Is=1,76), среди сортов
показал данную величину равной - 0,92. Это относится и к праймеру Р6 (значение Is
снизилось с 1,627 до 0,80).
Диапазон генетических дистанций, рассчитанных по данным RAPD, между
сортами ниже, чем межвидовой (рис.11). Незначительно различаются генотипы
исходных сортов и полученных из них мутантов. Это показано для Riso 1508 и Bomi, а
также Riso 56 и Calsberg II. Дендрограмма иллюстрирует значительное удаление Джау
Кабутак, который значительно отличается от сортов европейской селекции и по
морфологическим признакам (например, голозерность, шестирядность).
рис.11. Дендрограмма распределения сортов Hordeum vulgare, построенная на
основании анализа генетических дистанций.
Остальные 20 сортов группируются в один большой кластер, в котором только Athos,
выведенный в Кении, несколько удален. Сорта Донецкий 8 и Донецкий 9, имеющие
общего предка - сорт Донецкого 4, находятся
на дендрограмме достаточно далеко друг от друга. Одесский 70 ближе к германским
сортам Riso 1508 и Bomi, имеющих общего предка - сорта Юниор. Это может говорить
о том, что данные сорта хотя и выведены в различных регионах имеют
общее
происхождение.
На рисунках 12-14 показаны образцы электрофоретического разделения
продуктов амплификации некоторых сортов ячменя с праймерами Р3, Р4 и Р6.
Для анализа внутрисортовой гетерогенности былы использованы 53 линии сорта
Productiv. При анализе были использованы праймеры Р3 и Р6. Праймер Р6 не выявил
полиморфизма среди линий сорта, а Р3 выявил три полиморфных продукта размером
в 800, 625 и 600 нуклеотидов (Is=0,3) (рис.14). Определение сцепление локусов
продуктов амплификции проводили с помощью программы “MAP_QTL”, используя
формулы для вычисления процента рекомбинации в популяции. При анализе
выяснилось, что между локусами, кодирующие эти продукты нет связи. Поэтому сорт
является гетерогенным по многим локусам и эта гетерогенность поддерживается
селекцией.
Таким образом, уровень полиморфизма у видов Hordeum самый высокий,
средний у сортов вида H.vulgare и минимальный у популяции сорта вида H.vulgare.
70
Праймеры, выявляющие сортоспецифичный полиморфизм, выявляют таковой и у
видов. Сортоспецифичные праймеры ячменя (Is больше или равно 0,5) выявляют
сортоспецифичный полиморфизм у сортов близкородственных видов (пшеница, рожь)
или даже у сои.
рис.12. Образцы электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК
сортов ячменя с праймером Р3. 1 - Джау Кабутак, 2 - Одесский-31, 3 - Одесский-70, 4 Одесский-100, 5 - Донецкий-9, 6 - Донецкий-8, 7 - Исток, 8 - Циклон, 9 - Черноморец, 10
- Винер, 11 - Riso-56, 12 - Riso-1508.
рис.13. Образцы электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК
сортов ячменя с праймером Р4. 1 - Джау Кабутак, 2 - Одесский-31, 3 - Одесский-70, 4
- Одесский-100, 5 - Донецкий-9, 6 - Донецкий-8, 7 - Исток, 8 - Циклон, 9 - Черноморец,
10 - Винер, 11 - Riso-56, 12 - Riso-1508.
рис.14. Образцы электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК
сортов ячменя с праймером Р6. 1 - Джау Кабутак, 2 - Одесский-31, 3 - Одесский-70, 4
- Одесский-100, 5 - Донецкий-9, 6 - Донецкий-8, 7 - Исток, 8 - Циклон, 9 - Черноморец,
10 - Винер, 11 - Riso-56, 12 - Riso-1508.
рис.15. Образцы электрофoретического разделения продуктов амплификации ДНК
линий сортов ячменя Productive с праймером Р3.
Глава 5. Картирование генома ячменя и идентификация локусов количественных
признаков
5.1. Картирование продуктов ПЦР при помощи самоопыляющейся популяции F8,
Одесский 115/Гольф
Для картирования могут быть использованы только уникальные структуры
генома.
Высокие
повторы
оказываются
таковыми в
случае
уникальности их
расположения в геноме и метода их выявления. Так полосы гибридизации при ПДРФанализе являются уникальными структурами даже если гибридизационная проба
является высоким повтором. Уникальность полос гибридизации в данном случае
придают
сайты
произвольным
рестрикции.
праймером
Структура
продукта
представляет
амплификации
фрагмент
ДНК,
с
единичным
фланкированный
71
инвертированной
последовательностью
праймера.
Центральная
часть
данной
структуры чаще всего состоит из повторов (Williams et al., 1990), однако уникальность
данной
структуры
создаёт
именно
последовательность
ее
концов,
то
есть
инвертируемые сайты праймирования, выявляемые полимеразной цепной реакцией.
Кроме того наличие полиморфизма по данному продукту ПЦР говорит так же об его
уникальности.
Наиболее распространенным типом полиморфизма среди RAPD-маркеров
является наличие или отсутствие полосы (продукта) на электрофореграмме. Вполне
вероятно, что в данном случае продукт представлен уникальной структурой.
Отсутствие продукта ПЦР связано, скорее всего, с точечной мутацией в зоне
праймирования. Если эта структура представлена повторами, то мутации в одном или
нескольких копиях не вызовут исчезновение полосы, а скажется на ее интенсивности.
Вероятность одновременных мутаций во всех копиях данной структуры в зоне
праймирования ничтожно мала.
Вставка или делеция, во внутренней части продукта амплификации, приведет к
изменению размера продукта.
При исследовании популяции №106 (F7-8, Одесский 115/Гольф), только в одном
случае наблюдался кодоминантный тип наследования продукта ПЦР - P57#1000,
который имел молекулярную массу 1000 и 980 нуклеотидов. В остальных же случаях
при
изучении
генетического
полиморфизма
на
популяции
№106
отмечено
исключительно наличие или отсутствие продукта ПЦР.
Варьирование интенсивности электрофоретически различных по молекулярной
массе полос связано не с наличием разного количества копий в геноме, а с условиями
отжига,
оптимальными
для
интенсивно
амплифицированных
продуктов
и,
соответственно, не являющихся таковыми для слабо амплифицированных.
Гетерозиготные особи популяции №106 по количеству продукта амплификации
не отличались от доминантных гомозигот. Это связано с тем, что амплификация
обычно проводится до насыщения, то есть увеличение продукта амплификации в
последующих, после «выхода» реакции на «плато», циклах происходит уже по
линейному, а не по экспоненциальному закону. Амплификация продуктов ПЦР идет со
скоростью, близкой к 2n-2n, где n - число циклов. Число копий матриц для
амплификации у гетерозигот вдвое меньше, чем у гомозигот и, соответственно, выход
на «плато» происходит на один цикл позже. Недостающее количество продукта у
72
гетерозигот может легко доамплифицироваться, в то время как у гомозигот уже
произошло торможение синтеза конечным продуктом.
Данное обстоятельство снижает информативность RAPD-анализа в F2 по
сравнению с другими методами, так как используемые доминантные RAPD-маркеры не
позволяют отличить гетерозиготы от доминантных гомозигот. Доля гетерозигот в
популяции уменьшается наполовину для каждого следующего поколения: H = 21-n, где
Н - доля гетерозигот в популяции, n - число поколений. Тогда для F2, Н = 0.5.
Ранее было показано (Созинов и др, 1978), что для картирования можно
использовать
самоопыляющуюся
популяцию
старших
поколений
в
стадии
рекомбинационного насыщения. Такая ситуация складывается к 7-8 поколению (от
1.56 до 0.78% гетерозиготность на локус). Можно отметить, что идеальная популяция
самоопылителя в стадии рекомбинационного насыщения, особенно при малых p
(частота рекомбинации), дает значительную информацию о величине p. Так, при p <
40% анализируемая популяция дает больше информации, чем фаза отталкивания F2
при полном доминировании; при p < 20% - больше, чем фаза притяжения F2 при
полном доминировании, а при p < 15% - больше, чем анализирующее скрещивание.
Поэтому, учитывая эти особенности, была использована практически гомозиготная
популяция F>10 или гибриды старших поколений.
При анализе сцепления продуктов амплификации ДНК и ферментов было
установлено, что ген b-амилазы ячменя, локализованный в длинном плече хромосомы
4 (4 М) (NABGMP, 1994), тесно сцеплен с локусом продукта Р6#900 (название
праймера#размер продукта в нуклеотидах) (рис.16,17). Был определен другой маркер
гена b-амилазы - P9#680, расположенный на расстоянии в 1% рекомбинации (рис.18)
Обнаружено, что с геном Est 5, контролирующим синтез эстеразы 5, сцеплен
локус хромосомы, маркируемый продуктами амплификации P92/93#594 и P9#1150,
которые выявлены с помощью пары праймеров P92 и P93 и произвольным праймером
Р9. Данные генетические факторы Est5, P92/93#594 и P9#1150 расположены в
коротком плече хромосомы 1.
рис.16. Электрофорез продуктов амплификации ДНК с праймером
Р6
полученных на линиях F8 Одесский 115/Гольф и родителях (P1, P2). 1 - P1, 2 - L76,
3 - L75, 4 - L74, 5 - L73, 6 - L72, 7 - L71, 8 - P2, 9 - Т7 по Hpa I. Стрелкой показан
продукт P6#900.
73
рис.17. Зимограммы b-амилаз (ПААГ; рН 8.3) зрелого зерна ячменя F8 Одесский
115/Гольф: 1 - P1, 2 - L76, 3 - L75, 4 - L74, 5 - L73, 6 - L72, 7-L71, 8 - P2
(Фотография любезно предоставлена В.П.Нецветаевым).
рис.18. Электрофорез продуктов амплификации ДНК линий популяции №106 с
праймером P9. Стрелками показаны продукты ПЦР - P9#1150 и P9#680.
рис.19. Шесть групп сцепления, полученные на данных самоопыляющейся
популяции F8 Одесский 115/Гольф.
рис.20. Электрофорез продуктов амплификации ДНК линий популяции №106 с
праймером P56. М - Т7 рестрицирован по Hpa I. Стрелкой показан продукт
P56#1050.
рис.21. Электрофорез продуктов амплификации ДНК линий популяции №106 с
праймером P2. Стрелками показаны продукты ПЦР - P2#1300 и P2#604. М - Т7
рестрицирован по Hpa I.
рис.22. Электрофорез продуктов амплификации ДНК линий популяции №106 с
праймером P66. Стрелкой показан продукт ПЦР - P66#2320.
74
рис.23. Электрофорез продуктов амплификации ДНК линий популяции №106 с
праймером P69. Стрелкой показан продукт ПЦР - P69#840. М - Т7 рестрицирован
по Hpa I.
Третья группа сцепления состоит из пяти локусов: P69#1050, P39#2300,
P44#560, P52#912 и P52#1190.
Четвертая группа сцепления: P63#700, P66#2320, P10#1300 и P52#700. Пятая:
P56#840, P69#840, P82/83#450 и P39#1188 (рис.19,20).
Шестая группа сцепления состоит из двух RAPD локусов: P2#804 и P2#1300,
амплифицированных с помощью праймера Р2 (Табл.10, рис.21).
Оценка сцепления показала, что локусы Est I и Amy I наследовались независимо
от всех приведенных ПЦР продуктов.
Из 68 произвольных праймеров 12 показали полиморфизм между линиями
популяции №106 (рис.22,23). Из 10 пар направленных праймеров полиморфными
оказались две. Всего на популяции №106 было идентифицировано 25 полиморфных
маркеров (4 изофермента и 21 ПЦР маркеров), из них 21 образовали 6 групп
сцепления, покрывающих 237 сМ, то есть шестую часть генома ячменя (размер генома
ячменя составляет около 1300 cM (Kleinhofs, et al., 1992). Большинство маркеров
расположено рядом. Не найдено сцепления локусов продуктов амплификации с геном
a-амилазы и эстеразы-I и двумя RAPD-маркерами (P57#1000, P10#1300).
Локализация продуктов RAPD при помощи линий пшеницы, дополненных
хромосомами ячменя, в большинстве случаев, оказалась затруднительной. Часть
полиморфных продуктов ПЦР у сортов Одесский 115 и Гольф отсутствуют у Betzes; вовторых, полиморфные продукты ПЦР, присутствующие у данных сортов, имеются и у
пшеницы
Chinese
spring.
Продукт
амплификации
P6#900
присутствует
в
электрофоретическом спектре ДНК сорта Betzes и идентифицируется на 4 хромосоме,
аллель продукта P57#1000 в 900 нуклеотидов присутствует как у пшеницы так и у
Betzes (рис.24). Продукт P44#560 идентифицируется на четвертой хромосоме, что
позволяет третью группу сцепления отнести к данной хромосоме (рис. 25).
Направленную амплификацию проводили с помощью 10 пар праймеров. В
результате ПЦР образуется до 20 воспроизводимых продуктов амплификации,
которые могут быть использованы как молекулярные маркеры при картировании.
75
Среди этих десяти пар только две показали полиморфизм между сортами
Одесский 115 и Гольф - P82/P83 и P92/P93. Пара праймеров P82 и P83 была
подобрана для последовательности геномной ДНК пшеницы pTaq546 (Liu, et al., 1992)
по координатам 2356 и 3897. Данный участок ДНК содержит тандемный повтор 5`TAAG-3` и более длинный инвертированный повтор. При использовании этих
праймеров для амплификации геномной ДНК ячменя и пшеницы в жестких условиях
амплификации (1.5 mM MgCl2 в реакционном растворе и 550C температура отжига)
образовывалось до 30 воспроизводимых продуктов амплификации. У сортов ячменя
данные продукты амплификации были полиморфными на 50 %. Полиморфные
продукты с этими праймерами не аллельны, и наследуются независимо друг от друга,
так как данная пара праймеров фланкирует разные участки хромосомы. Из 25
амплифицированных с этой парой праймеров продуктов ПЦР в образцах комбинации
№106 только продукт P82/83#450 оказался полиморфен. Праймированный локус
продукта P82/83#450 показал ассоциацию с локусами продуктов P56#840 и P69#840 в
5-й группе сцепления.
Информация о паре праймеров P92 и P93, получена из работы Kleinhofs, et al.,
(1993) где она использовалась
при картировании генома ячменя в комбинации
Morex/Steptoe. Локус продукта P92/93#580, фланкируемый этими праймерами, показал
сцепление с геном, кодирующим эстеразу 5.
Два произвольных праймера Р22 и Р66 имели идентичные первые 15
нуклеотидов на 3`-конце (Табл.1). Продукты амлификации, полученные с помощью
этих праймеров были идентичными, что свидетельствует о том, что для выявления
полиморфизма достаточно применять праймеры не более 15 нуклеотидов. Увеличение
размера праймера не вносит существенных изменений.
Выше было показано, что локус P6#900 тесно сцеплен с геном кодирующим bамилазу. Возможно, этот продукт является cтруктурной частью гена b-амилазы.
Косвенным доказательством данного утверждения является тот факт, что присутствие
продукт P6#900 в образцах сцеплено с менее подвижным, имеющим большую
молекулярную массу изоферментом, отсутствие продукта P6#900 сопровождается
более подвижной формой фермента (рис.16,17). При сравнении b-амилазной
активности,
обусловленной
аллелями
Bmy IBr и Bmy IAr, контролирующими
соответственно «быстрый» и «медленный» изофермент (Нецветаев, 1992), оказалось,
что более «быстрый» вариант b-амилазы характеризуется несколько меньшей
амилолитической активностью, связанный с точечной мутацией в области структурной
76
части изофермента, приводящей к изменению аминокислотного состава и снижению
ферментативной
активности (Netsvetaev, 1994). Возможно, последовательность
праймера связывается именно с этим участком гена b-амилазы. При наличии мутации
в зоне праймирования праймера P6 не происходит инициация синтеза продукта
P6#900. Однако, возможно, что продукт P6#900 не является структурной частью гена,
кодирующего
b-амилазу,
и
локализуется
на
некотором
расстоянии
от
него.
Определенную информацию можно будет получить только после сиквенирования
продукта P6#900.
Таблица 10
Анализ наследования продуктов ПЦР и биохимических маркеров, показавших
сцепление в популяции №106
Группы
сцепле
ния
1
Генетические факторы
АхВ
Est5 x P92/93#594
P9#1150 x P92/93#594
Est5 x P9#1150
2
BmyI x P6#900
BmyI x P9#680
P6#900 x P9#680
3
P39#2300 x P69#1050
P39#2300 x P44#560
P52#912 x P44#560
P52#1190 x P52#912
4
P66#2320 x P63#700
P66#2320 x P10#1300
P10#1300 x P53#700
5
P56#840 x P69#840
P69#840 x P82/83#450
Число семей
Фенотипы
BB
bb
AA 6
26
aa 37
9
AA 12
74
aa 61
1
AA 34
12
aa
4
28
AA 0
66
aa
74
0
AA
2
63
aa
72
2
AA
2 63
aa
72
2
AA 38
26
aa
22
41
AA
7
58
aa
55
17
AA 65
26
aa
6
48
AA 25
45
aa
68
10
AA 21
59
aa 64
5
AA 54
20
aa
25
49
AA 52
14
aa
19
44
AA 3
88
aa 52
0
AA 29
61
Хром
осом
а
29.5
Процент
рекомбина
ции
11.9 с 3.4
100.6
4.8 с 1.4
I
27.1
12.9 с 3.6
140.0
0.0 с 0.2
123.5
1.4 с 0.7
123.4
1.4 с 0.7
7.5
30.4 с 5.6
57.8
10.6 с 2.3
c2
IV
IV
45.2
14.1 с 2.8
41.1
15.5 с 2.9
63.1
10.6 с 2.3
22.7
21.8 с 3.9
30.8
17.2 с 3.5
131.2
1.0 с 0.6
29.3
18.6 с 3.5
77
P39#118 x P82/83#450
6
P2#1300 x P2#604
aa 41
AA 47
aa 15
AA 47
aa 16
9
17
44
6
37
V
28.3
17.6 с 3.6
36.2
13.0 с 3.1
78
рис.24.
Электрофорез
продуктов
амплификации
c
праймером
Р6
линий
пшеницы Chinese spring, дополненных хромосомами ячменя. 1 - Betzes; 2,11 Chinese spring; 3 - хромосома I; 4 - хромосома II; 5 - хромосома III; 6,7 - хромосома
IV (стрелками показан продукт P6#900); 8,9 - VI; 10 - VII.
рис.25. Электрофорез продуктов амплификации c праймером Р44
линий
пшеницы Chinese spring, дополненных хромосомами ячменя. 1,9,10 - Betzes; 2 Chinese spring; 3 - хромосома I; 4 - хромосома II; 5 - хромосома III; 6 - хромосома
IV; 7 - VI; 8 - VII. Стрелкой показан продукт P44#560.
5.2. Маркерный анализ количественных признаков
Одним из наиболее распространенных подходов при анализе количественной
изменчивости является, так называемый, биометрический подход, основы которого
заложены в работах Гальтона, Фишера, Райта, Мазера. В современной генетике
принято, что количественные признаки находятся под контролем полигенных систем.
Биометрический подход предполагает, что, хотя свойства полигенов аналогичны
свойствам
менделевских
генов,
определяющих
альтернативные
признаки,
количественные признаки контролируются большим числом генов, вклад каждого из
которых в изучаемый признак может быть не одинаков. Допущение незначительности
индивидуальных
эффектов
генов
по
сравнению
со
степенью
экологической
изменчивости количественных признаков обусловливает необходимость применения
для их анализа методов, отличных от методов обычной менделевской генетики
(разложение дисперсий и ковариаций, определение коэффициента наследственности
и так далее).
Трактовка термина «полигенный» основывается на следующих положениях
(Жученко и др., 1978):
1) признак может быть полигенным, более того, можно предположить, что
каждый из генов генома оказывает в какой-то мере влияние на данный признак. Но,
если расщепление по некоторым из них обусловливает большую часть всей
наследственной изменчивости, можно считать. что признак контролируется именно
этим небольшим числом генов и вряд ли такое упрощение является слишком грубым
для большинства приложений. Идентификация каждого из этих основных генов
представляется вполне реальной задачей;
79
2) гены, контролирующие многие количественные признаки, могут быть
распределены по геному и в пределах отдельных хромосом не равномерно, а в виде
компактных блоков, рекомбинационное разрушение которых происходит редко в силу
локализованности кроссоверных обменов (Жученко, 1980; Жученко, Король, 1985).
Целостность сравнительно протяженных сегментов хромосом может поддерживаться
также естественным отбором (Левонтин, 1978).
Одним из вариантов менделевского анализа количественной изменчивости как в
контролируемых скрещиваниях, так и в случае родословных произвольной структуры
является построение моделей, основанных на простейших гипотезах о генетической
природе наиболее подходящего описания на основе статистических критериев. Другой
подход связан с использованием маркерных генов.
Использование
маркеров
значительно
увеличивает
эффективность
и
разрешающие возможности менделевского подхода, позволяя определить вклад
отдельных хромосом и их сегментов без жестких ограничивающих предположений об
общим числе локусов, определяющих изменчивость изучаемого количественного
признака (Серебровский, 1970; Soller et al., 1976). Как известно, оценка эффекта целых
хромосом и их плеч возможна также на основе цитогенетических методов нуллисомного,
моносомного,
трисомного,
транслокационного
анализов,
индуцированных нехваток, межлинейного замещения хромосом.
Для
определения
сцепления
молекулярных
маркеров
с
локусами
количественных признаков предложены модели Jensen J. (1989) и Simpson S.P. (1989),
в которых оценка параметров рекомбинации локусов количественных признаков
относительно двух молекулярных маркеров производится методом максимального
правдоподобия.
В работе Simpson S.P. (1989) рассматривается самоопыляющаяся популяция как
модель для детекции сцепления между локусом QTL и локусами ПДРФ. Автор показал,
что достаточно несколько имбредных линий для анализа значения маркеров и
определил их влияние на фенотип. Jensen J. (1989) использовал метод максимального
правдоподобия для оценки частоты рекомбинации локусов QTL и маркерных локусов
на дигаплодных линиях. Маркерами с известной локализацией являются ген
устойчивости к гербициду DDT (ddt) и ген s (короткие остья), локализованные в 7
хромосоме и сцепленые в 31% рекомбинации. Количественный локус массы одного
зерна (Kw1) был сцеплен с геном s, то есть схема расположения локусов такова: ddt-sKw1.
80
Нашей задачей стоял анализ сцепления локусов продуктов амплификации с
локусами количественных признаков. Для этого были проанализированы за два года
(1994-1995) 150 линий популяции №106 по следующим количественным показателям:
продуктивность, озерненность, число зерен на одном растении, масса 1000 зерен и
кустистость. Покрываемый маркерами размер генома составил шестую часть (237 сМ),
то есть достаточную для предварительного анализа при определении сцепления QTLs
с молекулярными маркерами. Для этого проводился статистический анализ средних
величин между аллелями маркера, используя t-критерий Стюдента и F-критерий
Фишера (Лакин,1990).
В результате были получены следующие данные.
а) Все количественные показатели проявившиеся сцепление с определенными
маркерами в одном году не идентифицируются в другом году с этой группой
сцепления.
б) Достоверные результаты по t-критерию на высоком уровне значимости иногда
были недостоверны по F-критерию (табл. 11).
в) Основные достоверные данные получены на 3 и 4 группах сцепления и один
раз с 6 группой сцепления.
Количественный показатель “продуктивность” достоверно проявился в 3 и 4
группах сцепления. В 3 группе сцепления данный показатель определяется только в
1995 году между локусами P69#1050 и P39#2300 (Табл.11). В 4 группе сцепления
достоверным оказалось сцепление данного показателя с локусом P66#2300 в1994
году.
“Озерненность” идентифицируется на 3 и 4 группах сцепления. Локализация
данного локуса идентифицируется между локусами P39#2300 и P44#560 3 группы в
1995 году и между P63#700 и P66#2320 четвертой группе сцепления в 1994 году.
“Число зерен на одном растении” идентифицируется в 3 группе сцепления
между локусами P69#1050, P39#2300 и P44#560 в 1995 году; в 4 группе сцепления
идентифицируется с локусом P66#2300 в 1994 году.
“Масса 1000 зерен” идентифицируется с маркером P66#2300 четвертой группы
сцепления и с P2#604 и P2#1300 шестой группы за 1995 год.
“Кустистость” в 1994 году идентифицируется между локусами P66#2300 и
P63#700 четвертой группы сцепления.
Таким образом, достоверные результаты, полученные в 1995 году в третьей
группе сцепления, не проявлялись в 1994 году, но идентифицировались в четвертой
81
группе сцепления этого года. Основные маркеры показавшие достоверные результаты
в третьей группе сцепления: P69#1050, P39#2300 и P44#560. В четвертой группе за
1994-1995 годы - P66#2300. Поэтому, эти маркеры можно рекомендовать для анализа
селекционно-генетического материала.
Необходимо отметить, что год 1995-й был влажным и наиболее благоприятным
для ячменя, год же 1994-й был засушливый и привёл к резкому снижению урожая и
падению
уровня
проявления
агрономических
показателей.
Так
например,
продуктивность в 1995 году составила около 9.5, то 1994 - 3.5; число зерен на 1
растении в 1995 году насчитывало до 220, а в 1994 - 90. Аналогичная ситуация
прослеживается
и
для
других
показателей:
массе
1000
зерен,
кустистости,
озерненности, проростаемости (Табл.11).
Таким образом, представляется вероятным наличие многолокусного типа
наследования
таких
количественных
показателей
как
продуктивность,
озерненность и число зерен на одном растении, тогда как для показателей массы
1000 зерен и кустистость вероятнее характерен однолокусный тип наследования.
Локусы первой группы признаков были отнесены к четвертой группе сцепления с
маркером Р66#2300 и к третьей группе сцепления - с маркерами P69#1050, P39#2300
и P44#560. Локусы второй группы признаков ассоциируют только с маркером
P66#2300, причем проявление этих признаков зависит от влияния окружающей среды.
Проблема взаимоотношения генома с окружающей средой является важной в
генетике количественных признаков. Для решения проблемы используется анализ
исследуемой популяции в различных географических зонах интервальным методом
(IM), базирующийся на использовании остаточной ошибки (Lander et al., 1989).
82
Таблица 11
Результаты статистического анализа популяции №106 (F7-8, Одесский 115/ Гольф)
за 1994 и 1995 года
число
Количественный
Маркер
Средняя
Оценка
показатель
величина для особей
разности
аллеля
средних
Продуктивность
P39#1050
61
t=2.188**
0 9.19с0.23
(1995 г.)
64
F=1.334
1 9.98с0.27
Озерненность
P52#700
(1994 г.)
0 3.47с0.13
1 3.96с0.19
40
40
t=2.057*
F=2.182**
P57#1000
(1994 г.)
0 3.42с0.16
1 4.07с0.15
42
47
t=2.956***
F=1.09
P6#900
(1994 г.)
0 11.56с0.44
1 10.17с0.39
61
49
t=2.305*
F=1.535*
P9#680
(1994 г.)
0 11.64с0.44
1 10.39с0.39
65
52
t=2.066*
F=1.576 *
P69#1050
(1994 г.)
0 11.77с0.52
1 10.43с0.38
50
56
t=2.113*
F=1.744*
P52#700
(1995 г.)
0 17.79с0.13
1 18.94с0.35
57
71
t=2.057*
F=2.182*
P44#560
(1995 г.)
0 18.79с0.33
1 17.56с0.38
72
70
t=2.43**
F=1.336
P66#2320
(1994 г.)
0 40.39с0.29
1 39.54с0.30
57
60
t=2.473**
F=1.006
83
Количественный
показатель
Число зерен на 1
растении
Масса 1000 зерен
Кустистость
* - P<0.05; ** - P<0.01.
Маркер
P2#604
(1994 г.)
продолжение
Средняя
величина для
аллеля
0 95.9с4.02
1 81.33с4.33
таблицы 11
число
Оценка
особей разности
средних
62
t=2.465**
54
F=1.016
P69#1050
(1995 г.)
0 224.2с5.32
1 243.9с6.65
65
66
t=2.317 **
F=1.585 *
P39#2300
(1995 г.)
0 223.6с5.05
1 246.3с6.51
76
62
t=2.803**
F=1.356
P57#1000
(1994 г.)
0 80.11с3.76
1 96.90с4.44
54
60
t=2.852**
F=1.549*
P39#1188
(1995 г.)
0 39.37с0.37
1 40.60с0.31
60
62
t=2.567**
F=1.495*
P2#1300
(1995 г.)
0 40.74с 0.45
1 39.33с0.27
46
63
t=2.407**
F=2.002**
P2#604
(1995 г.)
0 40.54с0.33
1 39.47с0.27
72
68
t=2.497**
F=1.556*
P63#700
(1994 г.)
0 7.36с0.27
1 8.08с0.22
60
80
t=2.044*
F=1.051
P66#2320
(1994 г.)
0 8.21с0.24
1 7.38с0.25
66
74
t=2.405*
F=1.111
84
Таким путем пошли участники северо-американского проекта по картированию
генома ячменя: 26 лабораторий из Канады, США и стран Европы анализируют одну и
туже комбинацию в разных условиях. Суммарная информация анализируется и
составляется
полное
представление
по
локализации
локусов
количественных
признаков (NABGMP, 1993). Это сложный путь, приносящий плоды.
Jansen et al., (1995) предложили новый метод анализа локализации локусов
QTLs на основе модели множественного QTL (multiple-QTL models - MQM). Авторы
использовали Arabidopsis thaliana как модельный организм, с небольшим геномом, с
коротким периодом вегетации и простотой при размножении. Анализировали две
популяции Arabidopsis thaliana, различающихся по времени цветения - Колумбийскую
(Col) и Landsberg erecta (Ler), а также рекомбинантные имбредные линии (RIL) от
скрещивания Col на Ler. Время цветения сильно зависит от факторов окружающей
среды, среди которых наиболее важные фотопериод и температура. Поэтому проверка
данного метода проходилась в шести повторностях при различных условиях
выращивания. Короткий день (SD) (10 часов освещения), длинный день (LD) (16 часов
освещения), постоянное освещение (CL), короткий день плюс яровизация (SDV),
длинный день и яровизация (LDV), продолжительное освещение с яровизацией (CLV).
Среди 12 QTLs, найденных авторами с помощью метода MQM, четыре показали
зависимость от взаимодействия с окружающей средой.
Таким образом, проблема локализации QTLs при сильном влиянии окружающей
среды является до сих пор открытой. Решение данной проблемы, возможно при
длительном наблюдении за объектом, при наличии “плотной” генетической карты, а
идентификацию локуса количественного признака необходимо осуществлять c
помощью метода MQM.
85
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Генетико-селекционные
исследования
обогатились
новым
эффективным
методом анализа молекулярно-генетического полиморфизма. В данной работе
показано, что полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами (RAPD)
является
удобным
полиморфизма
методом
ячменя.
в
Быстрота
исследовании
и
высокая
молекулярно-генетического
эффективность
RAPD
метода,
существенно расширяет возможности использования молекулярного полиморфизма в
генетике и селекции растений.
Для применения RAPD в генетических исследованиях сельскохозяйственных
растений, необходимо было провести изучение особенности этой реакции и подобрать
необходимые параметры. Для оптимизации RAPD-анализа проведено моделирование
ПЦР с произвольными праймерами. На основании изученной модели показана
динамика образования продукта амплификации. Установлено, что в первых двух
циклах реакции не происходит образование истинного продукта реакции, поэтому
температуру
отжига
в
первых
циклах
надо
устанавливать
несколько
ниже
оптимальной. Для вычисления оптимальной температуры отжига необходимо иметь
значения температуры плавления продукта реакции и температуры плавления
праймера.
Предложена
значения
эмпирическая
температуры
формула,
плавления
с
праймера.
помощью
которой
Последняя
определяется
основывается
на
термодинамическом параметре dG (свободная энергия Гиббса), изменение которого
осуществляется согласно непрерывному закону, что более конкретно для определения
истинной температуры плавления олигонуклеотида.
Создана компьютерная программа подбора оптимальных условий ПЦР в
зависимости от размера и структуры праймера. Для всех используемых в работе
праймеров определено значение температур плавления и конечное значение
температуры отжига ПЦР. При определении температуры плавления продукта реакции
исходили из того, что размеры амплифицированных продуктов находятся в пределах
200-2000 пар оснований, с ГЦ-составом 50%.
Подобрана концентрация некоторых важных компонентов реакционной смеси:
ионов магния и полиэтиленгликоля 6000, усиливающих специфичность реакции. С
учетом всех модификаций условий реакции показана количественная и качественная
стабильность и воспроизводимость продуктов амплификации ДНК.
86
Проведен анализ различных уровней специфичности праймеров. Праймеры
классифицированы
на
видоспецифические
и
внутривидоспецифические
(сортоспецифичные). Полиморфные полосы, детектированые с помощью ПЦР с
произвольными праймерами, в межвидовом анализе составили 80%, в то время как
внутри вида H.vulgare - 50%. Некоторые праймеры, не проявляющие внутривидовой
полиморфизм у H.vulgare, обнаруживали его между видами рода Hordeum. Введено
понятие индекса специфичности праймера, который позволяет с высокой степенью
вероятности провести границу между праймерами по их специфичности при
выявлении полиморфизма. Так, значение индекса специфичности ниже 5 характерно
для
слабо
или
неполиморфных
праймеров,
выше
для
высокополиморфных
сортоспецифичных праймеров. Праймеры детектирующие генетическую изменчивость
у низкополиморфных видов (строгие самоопылители, например, соя или ячмень) могут
быть использованы для анализа у более полиморфных видов (кукуруза, пшеница перекрестники).
У близких по происхождению видов, амплифицированные продукты одинакового
размера имеют и сходную нуклеотидную последовательность. Размер генетических
дистанций зависит от соотношения общих продуктов амплификации к сумме
продуктов. Анализ дендрограммы взаимоотношения видов Hulgare и некоторых
близких видов из трибы Triticeae, показал генетическую близость H.agriocrithon и
H.lagunculiforme. Близок к ним H.spontaneum. Данные RAPD-анализа подтверждают
предположение
Трофимовской
о
вторичности
происхождения
H.spontaneum,
H.agriocrithon и H.lagunculiforme из H.vulgare. Показано значительное генетическое
удаление H.chilense от культурного ячменя (H.vulgare). Генетические дистанции между
H.chilense и другими представителями рода Hordeum сравнимы с таковыми с S.cereale.
Исследовали внутривидовой полиморфизм ячменя H.vulgare путем анализа ДНК
21 сорта из различных эколого-географических зон. Среднее значение индекса
специфичности составило 1,05 по сравнению с 1,72 для межвидового анализа.
Проведена классификация и распределение сортов ячменя в зависимости от
генетических дистанций между ними. В значительном большинстве распределение
соответствовало педигри. Незначительно отличались сорта и полученные от них
мутанты. RAPD-анализ показал значительное удаление сорта Джау Кабутак
из
Таджикистана от сортов европейской селекции. Показана возможность использования
RAPD-анализа
для
характеристики
исходного
селекционного
ранжирования сортов в соответствии с уровнем генетической близости.
материала
и
87
Проведено картирование продуктов ПЦР, при использовании самоопыляющейся
популяции
F7-8
Одесский115/Гольф.
рекомбинационном
насыщении
самоопыляющаяся
является
наиболее
популяция
F->6
подходящим
при
объектом
картирования маркерами с доминантным типом наследования. Показано, что
амплификация полиморфного продукта ПЦР происходит строго с одного уникального
места генома. Для картирования использовали маркеры с известной локализацией гены,
кодирующие изоферменты: a-амилазу I, b-амилазу I, эстеразы I и 5. Из 68
используемых произвольных праймеров и 10 пар
праймеров
для
направленной
амплификации показали различия между родителями только 12 произвольных и 2
пары направленных праймеров. На основе 19 ПЦР маркеров и 2 изоферментов (bамилаза, эстераза 5) определено 6 групп сцепления, покрывающих шестую часть
генома ячменя
(237
сМ).
Найден
один
из
полиморфного
21
продукта
амплификации, наследуемый по кодоминантному типу. Установлено, что ПЦР маркер
(P6#900) тесно сцеплен с геном кодирующим b-амилазу (BmyI).
Для
идентификации
локусов
кодирующих
количественные
признаки,
исследовали в течении двух лет (1994-1995) самоопыляющуюся популяцию F7-8
Одесского 115/Гольф по следующим количественным показателям: продуктивность,
озерненность, число зерен на одном растении, масса 1000 зерен и кустистость.
Статистический анализ средних величин количественного признака между аллелями
маркера
проводился
используя
t-критерий
Стюдента
и
F-критерий
Фишера.
Достоверные результаты получены по следующим количественным показателям:
число зерен на одном растении, озерненность кустистость и масса 1000 зерен
полученные в 1995 году в третьей группе сцепления. В 1994 году данные показатели
не идентифицировались третьей группе сцепления и определялись в четвертой. Это
связано с природными условиями окружающей среды: 1994 год был очень засушлив,
тогда как 1995 - влажный. Таким образом, данные количественные показатели
являются многолокусными. Показали достоверные результаты следующие маркеры:
P69#1050, P39#2300, P44#560 и P66#2300. Эти маркеры можно рекомендовать для
анализа селекционно-генетического материала. Показана сложность идентификации
локусов количественных признаков, проявление которых в известной мере зависит от
окружающей среды.
88
ВЫВОДЫ
Исследование меж- и внутривидовой изменчивости
ячменя
(H.vulgare)
методом полимеразной
цепной
и картирование генома
реакции
с произвольными
праймерами позволило сделать следующие выводы:
1. Для оптимизации условий проведения полимеразной цепной реакции с
произвольными праймерами на основе разработанной математической модели RAPD
необходимо в первых двух циклах реакции проводить отжиг при температуре ниже
оптимальной для данного праймера. На основании анализа процесса амплификации
предложена
эмпирическая
формула
вычисления
температуры
плавления
олигонуклеотидов, которая необходима для определения оптимальной температуры
отжига праймера и матрицы. Предложен модифицированный метод выделения
высокомолекулярной ДНК, реакционный состав для полимеразной цепной реакции,
содержащий кроме известных компонентов (глицерин, Tween-20) полиэтиленгликоль.
2.
Предложен
подход
к
выявлению
полиморфизма
последовательности
праймера при RAPD. Праймеры, выявляющие сортоспецифичный полиморфизм у
слабополиморфных видов (строгие самоопылители) выявят таковой и у средне - и
высокополиморфных близкородственных видов (перекрестноопыляющиеся).
3. Исследован межвидовой полиморфизм рода Hordeum L. Результаты
филогенетического анализа позволяют подтвердить мнение что, H.spontaneum,
H.agriocrithon и H.lagunculiforme вероятно являются одичавшими формами H.vulgare, а
также, что H.bulbosum значительно отличающийся фенотипически от культурных
ячменей, отличается и генетически, а H.chilense ближе к S.cereale и пшенице, чем к
другим ячменям.
4. При исследовании внутривидового полиморфизма вида H.vulgare на 21 сорте
показано
обособленное
положение
сорта
Джау
Кабутак,
который
ближе
по
происхождению к диким ячменям, чем к современным сортам.
5. При картировании генома ячменя с помощью RAPD-маркеров, на 150 линях
самоопыляющейся популяции F7-8, Одесский115/Гольф локализован 21 RAPD-маркер
на шести группах сцепления. Суммарный размер покрываемый молекулярными
маркерами равен 237 сМ. Идентифицирован молекулярный маркер тесно сцепленым с
геном кодирущим b-амилазу.
6. В результате количественного анализа 150 линий самоопыляющейся
популяции F7-8, Одесский 115/Гольф за 1994 и 1995 годы идентифицированы локусы
количественных признаков в 3, 4 и 6 группах сцепления.
89
ЛИТЕРАТУРА
1. Анализ генома. Методы. М:Мир, под редaкцией К. Девиса, 1990.
2. Асеев М.В., Скакун В.Н., Баранов В.С. Анализ аллельного полиморфизма
четырех коротких тандемных повторов в популяции северо-западного региона России.
// Генетика. - 1995. - T.31. - C.839-845.
3. Бадашкеева А.Г., Зарытова В.Ф. Меченные биотином олигонуклеотиды как
зонды в методе молекулярной гибридизации. // Молекулярная биология. - 1989.- Т.23. C.1221-1226.
4. Бахтеев Ф.Х. Поблеммы экологии, филогении и селекции ячменя. М.:Академии
Наук СССР., - 1953. - 218 c.
5.
Вартапетян
А.Б.
Полимеразная
цепная
реакция
(краткий
обзор)
//
Молекулярная биология. - 1991.- Т.25. C.926-937.
6. Генетика культурных растений: Зерновые культуры. Под ред.
В.Д.Кобылянского. - Л.: Агропромиздат. - 1986.- 264c.
7. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: Пер. с
англ./Под ред. Дж.Дрейпера, Р.Скотта, Ф.Армитиджа, Р.Уолдена. - М.:
Мир, 1991. - 408 c.
8. Дебабов В.Г. Локальная амплификация нуклеиновых кислот- новый метод
исследования (краткий обзор) // Молекулярная биология. - 1990. - Т.24. - C.304-309.
9. Долганов С.М. Аллозимные маркеры у приморского гребешка
Mizuhopecten yessoensis (Jay). // Генетика. - 1995. - T.31. - C.825-832.
10. Жученко А.А. Экологическая генетика культурных растений. Кишинев:
Штиинца. - 1990 - 400c.
11. Жученко А.А., Король А.Б. Рекомбинация в эволюции и селекции. М.: Наука, 1985. - 400c.
12. Жученко А.А., Король А.Б., Андрющенко В.К. Сцепление между локусами
количественных признаков и маркерными локусами. I. Модель. // Генетика. - 1978. T.14. - C.549-555.
13. Звейнек И.А. Генетический контроль типа развития ячменя. //
Генетика. - 1995. - Т. 31. - C.597-599.
14. Иллечевский Н.Н., Кудрявцев А.М., Упелниек В.П., Метаковский Е.В. Анализ
родословных сортов мягкой пшеницы на основе изучения полиморфизма a-амилазы. //
Генетика. - 1995. - Т. 31. - C.1650-1654.
90
15.
Календарь
Р.Н.,
Сиволап
Ю.М.
Полимеразная
цепная
реакция
с
произвольными праймерами. // Биополимеры и клетка. - 1995.- №3-4. - C.55-65.
16. Календарь Р.Н. Компьютерная программа для построения эволюционных
деревьев на основе электрофореграмм ДНК и белков. // Материалы конференции
«Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений».- Киев. - 1994. - С.25-26.
17. Компьютерная биометрика. / Под ре. В.Н.Носова. - М.: Изд-во
МГУ. - 1990. - 232 с.
18. Комьютерный анализ генетических текстов./ А.А.Александров,
Н.Н.Александров,
М.Ю.Бородовский,
Ю.А.Каламбет,
А.З.Кистер,
А.А.Миронов,
П.А.Певзнер, В.А.Шепелев М.: Наука. - 1990. - 267 с.
19. Конарев В.Г. Белки как генетические маркеры. М.: Колос. - 1983. - 320c.
20. Конарев В.Г., И.П. Гаврилюк, Н.К.Губарева и др. Молекулярно-биологические
аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции. Под ред. В.Г.Конарева. - М.: Колос,
1993. - 447 c. - (Теоретические основы селекции. Т.1).
21. Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Болдырев Е.Ф. Быстрый метод сборки ДНК из
синтетических олигодезоксинуклеотидов. // Докл. АН СССР. - 1984. - №.278. - C.12501253.
22. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов М.: Высш.шк., 1990.- 352 с.
23. Ландегрен У., Кайзер Р., Каски К., Худ Л. Диагностика с помощью ДНК:
молекулярные методы и их автоматизация. // Молекулярная биология. - 1990.- Т.24. C.920-939.
24. Левотин Р. Генетические основы эволюции. М.: 1978. - 351c.
25. Ли Ч. Введение в популяционную генетику. М.:Мир., 1978. - 557c.
26. Нецветаев В.П. Расположение b-амилазного локуса (Bmy I) в
хромосоме 4 ячменя. // Цитология и генетика. - 1993. - Т.27. - С.74-78.
27. Нецветаев В.П. Индентификация листовых эстераз 11 и 12 у ячменя и их
генетический контроль. // Генетика. - 1992. - T.28. - C.105-119
28. Нецветаев В.П. Использование двойных дителосомиков для локализации
генов у ячменя. // Цитология и генетика. - 1992. - Т.26. - C.26-30.
29. Нецветаев В.П., Поморцев А.А., Крестинков И.С. Распределение аллелей
супероксиддисмутазного локуса Sod S в культуре ярового ячменя по территории
бывшего СССР. // Генетика. - 1995. - T.31. - C.1664-1670.
91
30.
Поморцев
А.А.,
Нецветаев
В.П.,
Ладогина
М.П.,
Калабушкин
Б.А.
Полиморфизм гордеинов у сортов ярового ячменя. // Генетика. - 1994. - Т.30. - С.604614.
31. Прейгель И.А., Король А.Б. Маркерный анализ количественных признаков. //
Успехи современной генетики. - 1989. - T.16. - С.123-138.
32. Севериков В.Л., Беляев Ф.Ю. Аллозимный полиморфизм в природных
популяциях и культурных сортах клевера лугового (Trifolium pratense L.). // Генетика. 1995. - T.31. - C.815-819.
33. Серебровский А.С. Генетический анализ. М.:Наука., 1970. - 242c.
34. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Чеботарь С.В. Исследование генетического
полиморфизма злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами. //
Цитология и генетика. - 1994. - Т.28. - C.54-61.
35. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Генетический полиморфизм ячменя,
детектируемый ПЦР с произвольными праймерами. // Генетика. - 1995.- Т.31. - C.13581364.
36.
Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Генетический полиморфизм злаков,
детектируемый
при
помощи
полимеразной
цепной
реакции
со
случайными
праймерами. // Материалы конференции «Молекулярно-генетические маркеры и
селекция растений».- Киев. - 1994. - С.59.
37. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев В.П. Использование продуктов
полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя (Hordeum vulgare L.).
// Генетика. - 1997. - Т.33. - C.53-60.
38. Созинов А.А., Попереля Ф.А. Полиморфизм глиадина и возможности его
использования // Растительные белки и их биосинтез. М.:Наука, 1975. - C.65-76.
39. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции.
М.:Наука, 1985. - 272 c.
40. Созинов А.А., Нецветаев В.П., Григорян Э.М., Образцов Н.С. Картирование
локусов Hrd у ячменя (Hordeum vulgare L. emend. Var.et Bacht.). // Генетика. - 1978. T.14.- C.1610-1619.
41. Фогель Ф., Мотульски A. Генетика человека: В 3-х т. Т.2: Пер.с англ. - М.:Мир,
1990. - 378 c.
42. Чапля А.Е., Календарь Р.Н, Нецветаев В.П., Сиволап Ю.М. Генетический
контроль a-амилаз и продуктов амплификации с единичным произвольным праймером
92
у ячменя. // Материалы конференции «Молекулярно-генетические маркеры и селекция
растений».- Киев. - 1994. - С.73-74.
43. Чапля А.Е., Календарь Р.М. Картування геному ячменю та iдентифiкацiя
локусiв кiлькiсних ознак за допомогою iзоферментiв та полiмеразноi ланцюговоi реакцii
з довiльними праймерами. // Матерiали мiжнародноi науково-практичноi конференцii
молодих вчених та спецiалiстiв «Наслiдки наукових пошукiв молодих вчених-аграрникiв
в умовах реформування АПК». - Чабани. - 1996. - C.215.
44. Чистяков Д.А., Гаврилов Д.К., Овчинников И.В., Носиков В.В. Анализ
распределения аллельных четырех гипервариабельных тандемных повторов среди
неродственных представителей русской нации, проживающих в городе Москве, с
помощью полимеразной цепной реакции. // Молекулярная биология. - 1993. - T.27. C.1304-1314.
45. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование
патогенных микроорганизмов. // Генетика.- 1995. - T.31. - C.600-610.
46. Шулембаева K.K. Наследование признака «окраска зерна» у мягкой
пшеницы. Генетика. - 1995. - T.31. - C.1322-1324.
47. Allard R.W. Formulas and tables to facilite the calculation of recombination values
in heredity. // Hilgardia. - 1956. - V.24. - P.235-278.
48. Andersen W., Fairbanks D. Molecular markers: Important tools for plant genetic
resource characterisation. // Diversity. - 1990. - V.6.- P.51-53.
49. Ayliffe M.A., Lawrence G.J., Ellis J.G., Pryor A.J. Heteroduplex molecules formed
between allelic sequences cause nonparental RAPD bands. // Nucleic Acids Res.- 1994.V.22.- P.1632-1636.
50. Azuna M., Ozias-Akins P., Austin M.E. Genetic relatedness among rabbiteye blue
berry (Vaccinium ashei) cultivars determined by DNA amplification using single primers of
arbitrary sequence. // Genome. 1993.- V.36.- P.971-977.
51. Bachmann B., Luke W., Hunsman G. Improvement of PCR amplified DNA seguencing with the aid of detergents. // Nucleic Acids Res. - 1990.- V.18. - P.1304.
52. Backes G., Graner A., Foroughiwehr B., Fischbeck G., Wenzel G.,
Jahoor T. Location of quantitative trait loci (QTL) for agronomic impotant characters by use
of a RFLP map in barley (Hordeum vulgare L.). // Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.294302.
93
53. Bannwarth W. Bathophenanthroline-Ru (II) complex as nonradiactive label for
dideoxy DNA sequencing. // Anal. Biochem. - 1989. - V.181. - P.216-219.
54. Bark O.H., Havey M. Similarities and relationships among populations of the bulb
onion as estimated by nuclear RFLPs. // Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.407-414.
55. Barnett W.R., Erfle H. Rapid generation of DNA fragments by PCR amplification of
crude, synthetic oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P.3094.
56. Barua U.M., Chalmers K.J., Thomas W.T.B., Hackett C.A. Molecular mapping of
genes determining height, time to heading, and growth habit in barley (Hordeum vulgare). //
Genome. - 1993. - V.36. - P.1080-1087.
57. Bassam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. Fast and sensitive silve staining
of DNA in polyacrylamide gels. // Anal.Biochem. - 1991. - V.80. - P.81-84.
58. Bonhomme A., Gale M.D., Koebner R.M.D., Nocolas P., Jahier J., Bernard M.
RFLP analysis of an Aegilops ventricosa chromosome that carries a gene conferring resistance to leaf rust (Puccinia recondita) when transferred to hexaploid wheat. //
Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.1042-1048.
59. Breslauer J.K., Frank R., Blocker H., Marky L. Predicting DNA duplex stability from
the base sequence. // Proc.Natl.Acad.Sci. - 1986. - V.83. - P.3746-3750.
60. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA fingerprinting: MAAPing
out a RAPD redefinition? // Bio/Technology - 1992. - V.10. - P.937.
61. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting
using very short arbitrary oligonucleotide primers. // Bio/Technology.- 1992. - V.9. - P.553557.
62. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting: A strategy for genome analysis. // Plant. Mol. Biol. Rep. - 1991. - V.9. - P.292-305.
63. Caetano-Anolles G. Amplifying DNA with arbitrary oliginucleotide primers. // PCR
Methods and Applications. - 1993.- V.3.- P.85-94.
64. Calson J.E., Tulsieram L.K., Glaubitz J.C., Luk V.W.K., Kauffeldt C., Rutledge R.
Segregation
of
random
amplified
DNA
markers
in
F1
progeny
of
confers.
//
Theor.Appl.Genet. - 1991. - 83.- P.194-200.
65. Carbonari M., Sbarigia D., Cibati M., Fiorilli M. Optimization of PCR performance.
// Trends in Genetics. - 1993. - V.9.- P.42.
66. Castilho A., Heslopharrison J.S. Physical mapping of 5S and 18S-25S rDNA and
repetitive DNA sequences in Aegilops umbellulata. // Genome. - 1995. - V.38. - P.91-96.
94
67. Chalmers K.J., Barua U.M., Hackett C.A., Thomas W.T.B., Waugh R., Powell W.
Indentification of RAPD markers linked to genetic factors controlling the energy requeirement of barley. // Theor.Appl.Genet. 1993. - V.87. - P.314-320.
68. Chen, F., Hayes P.M. A comparison of Hordeum bulbosum-mediated haploid production efficiency in barley using in vitro floret tiller culture. // Theor.Appl.Genet. - 1989. V.77. - P.701-704.
69. Clark A.G., Lanigan C.M.S. Prospects for estimating nucleotide divergence with
RAPDs. // Mol.Biol.Evol. - 1993. - V.10. - №5 - P.1096-1111.
70. Costa G.L., Grafsky A., Weiner M.P. Cloning and analysis of PCR-generated DNA
fragments. // PCR Methods and Applications. - 1994. - V.3.- P.338-345.
71. Decorte R., Cuppens H., Marynen R., Cassiman I. Rapid detection of hypervariable regions by the polymerase chain reaction technique. // DNA. - 1990.- V.9.- P.461-469.
72. Devos K.M., Gale M.D. Extended genetic maps of homoeologous group 3 chromosomes of wheat, rye and barley. // Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.85. - P.649-552.
73. Devos K.M., Bryan G.J., Collins A.J., Stephenson P. Gale M.D. Application of 2
microsatellite
sequences
in
wheat
storage
proteins
as
molecular
markers.
//
Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.247-252.
74. Devos K.M., Gale M.D. The use of random amplified polymorphic DNA markers in
wheat. // Theor.Appl.Genet. - 1992. - V.84. - P.567-572.
75. Dohmen G., Hesserberg H., Geiger H.H., Tudzynski I. CMS in tye - comparative
RFLP and transcript analyses of mitochondria from fertile and male-sterile plants. //
Theor.Appl.Genet. - 1994. - V.89.- P.1014-1018.
76. Dovidio R., Tanzarella O.A., Masci S., Lafiandra D., Porceddu E. RFLP and PCR
analysis at Gli-1, Gli-2, Glu-1 and Glu-3 loci in cultivated and wild wheats.// Hereditas. 1992. - V.116. - P.79-85.
77. Dweikat I., Ohm H., Mackenzie S., Patterson F., Cambron S., Ratcliffe R. Assocition of a DNA marker with Hessian Fly resistence gene H9 in wheat. // Theor.Appl.Genet. 1994. - V.89.- P.967-968.
78. Eckert A.K., Kunkel T.A. High fidelity DNA synthesis by Thermus aguaticus. // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P.3739.
79. Engelke D.R., Krikos A., Bruck M.E., Ginsburg D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. // Anal. Biochem. - 1990. - V.191. P.396-400.
95
80. Faccioli P., Pecchioni N., Terzi V. Thionin STS marker for barley genotype indentification. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.54-55.
81. Ferrenberg A.M., Landau D.P., Wong Y.J. Monte Carlo simulations: Hidden erros
from «good» random number generators. // Phys.Rev.Lett. - 1992. - V.69. - P.3382-3384.
82. Ford O.S., Rose E.A. Long-distance PCR. // PCR Methods and Applications. 1994. - V.3.- P.146-161.
83. Forster B.P. Coordinator's report:Chromosome 4. //Barley genetics Newsletter. 1994. - V.24. - P.139-141.
84. Froussard P. rPCR: A powerful tool for random amplification of whole RNA sequences. // PCR Methods and Applications. - 1993.- V.2.- P.185-190.
85. Frova C., Sarigorla M. Quantative tarit loci (QTLs) for poleen thermotolerance detected in maize. // Molecular and General Genetics. - 1994. - V.245. - P.424-430.
86. Gale M.D., Witcombe J.R. DNA markers and marker-mediated applications in
plant breeding, with particular reference to Pearl millet breeding. // Biotechnology and crop
improvement in Asia (Moss, J.P., ed.). - 1992. - P.323-332.
87. Galiba G., Quarrie S.A., Sutka J., Morgounov A., Snape J. RFLP mapping of the
vernalization (Vrn1) and frost resistance (Fr1) genes on chromosome 5A of wheat. //
Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.1174-1179.
88. Gentzbittel L., Perrault A., Nicolas P. Molecular phylogeny of the helianthus genus, based on nuclear restriction fragment length polymorphism. // Mol. Biol. Evol. - 1992. V.9. - P.872-892.
89. Gentzbittel L., Vear F., Zhang Y.X., Berville A., Nicolas P. Development of a consensus
linkage
RFLP
map
of
cultivated
sunflower
(Helianthus
annus
L.).
//
Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.1079-1086.
90. Gobinda S., Kapelner S., Steve S.S. Formamid can dramatically improved the
speceficity of PCR. // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P.7465.
91. Gonzales J.M., Ferrer E. Random amplified polymorphic DNA analysis in Hordeum species. // Genome. - 1993. - V.36. - P.1029-1031.
92. Graner A., Jahoor A., Schondelmaier J., Siedler H., Pillen K., Fischbeck G.,
Wenzel G., Herrmann R.G. Construction of an RFLP map of barley. // Theor.Appl.Genet. 1991. - V.83.- P.250-256.
93. Gratapaglia D., Bertolucci F.L., Sederoff R.R. Genetic mapping of QTLs controlling vegetative propagation in Eucalyptus grandis and E.urophylla using a pseudo testcross
strategy and RAPD markers. // Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.933-947.
96
94. Hackett C.A., Ellis R.P., Forster B.P., McNicol J.W., Macaulay M. Statistical analysis of a linkage experiments in barley involving quantitative trait loci for heiht and earemergence time and two genetic markers on chromosome 4. // Theor.Appl.Genet. - 1992. V.85.- P.120-126.
95. Hayes P.M., Iyamabo O., North American Barley Genome Mapping Project Summary of QTL effects in the Steptoe x Morex population. // Barley Genetics Newsletter. - 1993.
- V.23. - P.98-143.
96. Hayes, P.M., Liu B.H., Knapp S.J., Chen F., Jones B., Blake T., Franckowiak J.,
Rasmusson D., Sorrels M., Ullrich S.E.,Wesenberg D., Kleinhofs A. Quantitative trait locus
effects and enviromental interaction in a sample of North American barley germplasm. //
Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.87. - P.392-401.
97. Hayes P.M. Genetic stocks available through the North American Barley Genome
Mapping Project. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.113-116.
98. Heum M., Kennedy A.E., Anderson J.A., Lapitan N.L.V., Sorrells
M.E., Tanksley S.D. Construction of a restriction fragment length polymorphism map for barley (Hordeum vulgare). // Genome. - 1991. - V.34. - P.437-447.
99. Heun M. Mapping quantitative powdery mildew resistance of barley usin a restriction fragment length polymorphism map. // Genome. - 1992. - V.35. - P.1019-1025.
100. Hombergen E.J., Bachma N.N. RAPD mapping of 3 QTLs determining trichome
formation in microseris hybrid H27 (Asteraceae, Lactuceae). // Theor.Appl.Genet. - 1995.V.90. - P.853-858.
101. Hon F., Clancy J.A., Ullrich S.E. Conversion of an RFLP marker associated with
malting quality to a PCR-based marker. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.7-9.
102. Hu J., Quiros C.F. Indentification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD
markers. // Plant Cell Rep. - 1991. - V.10. - P.505-511.
103. Huestis G.M., McGrath J.M., Quiros C.F. Development of genetic markers in celery based on restriction fragment length polymorphisms. // Theor.Appl.Genet. - 1994. - V.85.
- P.889-896.
104. Hung T., Mak K., Fong K. A specificy enchancer for polymerase
chain reaction. // Nucleic Acids Res. - 1990.- V.18. - P.4953.
105. Jansen R.C., Van Ooijen J.W., Stam P., Lister C., Dean C. Genotype-byenviroment
interaction
in
genetic
mapping
of
multiple
quantitatine
Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.91. - P.33-37.
106. Jauhar P.P. Morphological and cytological characteristic of some
trait
loci.
//
97
wheat x barley hybrids. // Theor.Appl.Genet. - 1995.- V.90. - P.872-877.
107. Jensen H.P. Present of barley powdery mildew resistence gene Mla8 in some
'Pallas' near-isogenic barley lines. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.71-74.
108. Jensen J. Estimation of recombination parametrs between a quantitative trait
locus (QTL) and two marker gene loci. // Theor.Appl.Genet. - 1989.- V.78. - P.613-618.
109. Joycelyn E. Primary structure of a c-hordein gene from barley. //
Carlsberg Res.Commun. - 1988. - V.53. - P.274-258.
110. Kasha K.J., Kleinhofs A., N.A.B.G.M.P. Mapping of barley cross Harrington x
TR306. // Barley Genetics Newsletter. - 1993. - V.23. - P.65-69.
111. Kazan K., Manners J.M., Cameron D.F. Inheritance of random amplified polymorphic DNA markers in an interspecific cross in the genus Stylosanthes. // Genome. 1993.- V.36.- P.50-56.
112. Kazan K., Manners J.M., Cameron D.F. Genetic relationships and variation in the
Stylosanthes guianensis species complex assessed by random amplified polymorphic DNA.
// Genome. - 1992.- V.36. - P.43-49.
113. Kleinhofs A., Kilian A., Kudrna D. The NABGMP mapping progress report, Spring
1993. // Barley Genetics Newsletter. - 1992. - V.22. - P.27-41.
114. Kleinhofs A., Kilian A., Saghai Maroof M., Biyashev R.M., Hayes P.M., Chen F.,
Lapitan N., Fenwick A., Blake T.K., Kanazin V., Ananiev E., Dahleen L., Kudrna D., Bollinger
J., Knapp S.J., Liu B., Sorrells M., Heun M., Franckowiak J.D., Hoffman D., Skadsen R.,
Steffenson B.J. A molecular, isozyme, and morphologicalmap of the barley (Hordeum vulgare) genome. // Theor.Appl.Genet. - 1993.- V.86.- P.705-712.
115. Kleinhofs A., Kilian A., Kudrna D. The NABGMP Steptoe x Morex mapping progress report. // Barley Genetics Newsletter. - 1993. - V.23. - P.79-83.
116. Knott D.R., Janet W. Genetic interactions amoung four genes for resistance to
stem rust in bread wheat. // Genome. - 1988. - V.30. - P.182-185.
117. Koller B., Lehmann A., McDermott J.M., Gessler C. Identification of apple cultivars using RAPD markers. // Theor.Appl.Genet. - 1993.- V.85. - P.901-904.
118. Kuller G.H., Huang D.P., Manak M.M. Labelling of DNA probes with a photoactivatable hapten. // Anal. Biochem. - 1989. - V.177. - P.392-395.
119. Kunzel G., Sorokin A., Marthe F. Translocation derived duplications involving
short arm segments of barley chromosome 5 as defined genetically by physical RFLP mapping. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.104-107.
120. Kutcher H.R., Bailey K.L. Association of the glossy sheath/spike
98
(gs4) and orange lemma (o) traits and a random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker
with reaction to common root (Cochliobolus sativus) in barley. // Barley Genetics Newsletter.
- 1993. - V.23. - P.33-35.
121. Lander E.S., Green P., Abrahamson J., Barlow A., Daly M.J., Lincoln S.E., Newburg L. MAPMAKER: An interactive comuter package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. // Genomics. - 1987.- V.1- P.174-181.
122. Lange K., Sobel E. A random walk method for computing genetic location
scores.// J.Hum.Genet. - 1991. - V.49. - P.1320-1334.
123. Lefebvre V., Palloix A., Caranta C., Pochard E. Construction of an intraspecific
integrated linkage map of pepper using molecular markers and double haploid progenies. //
Genome. - 1995. - V.38. - P.112-121.
124. Link W., Dixkens C., Singh M., Schwall M., Mrlchinger A.E. Genetic diversity in
European and Mediterranean Faba bean germ plasm revealed br RAPD markers. //
Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.27-32.
125. Lion T., Haas O.A. Nonradiactive labelling of probe with digoxigenin by PCR. //
Anal. Biochem. - 1990. - V.188. - P.335-237.
126. Liu Y.-G., Ikeda T.M., Tsunewaki K. Moderately repeated, dispersed, and highly
variable (MRDHV) genomic sequences of common wheat usable for cultivar indentification. //
Theor.Appl.Genet. 1992. V.84. P.535-543.
127. Love M.J., Knight A.M., McAleer M.A., Todd J.A. Towards construction of a high
resolution map of the house genome using PCR-analysed microsatellites. // Nucleic Acids
Res. - 1990.- V.18. - P.4123.
128. Lowe T., Sharefkin J., Yang S.Q., Dieffendach C.W. A computer
program for selection of oligonucleotide primers for PCR. // Nucleic Acids Res. - 1990.- V.18.
- P.1757-1562.
129. Lu Y.H., Negre S. Use of glycerol for enhanced efficiency and specificity of PCR
amplification. // Trends in Genetics. - 1993.- V.9.- P.297.
130. Ma Z.Q., Sorrels M. Genetic analysis of fertility restoration in wheat using restriction fragment lenght polymorphisms. // Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.1137-1143.
131. Maroof M.A.S., Byyashev R.M., Yang G.P., Zhang Q., Allard R.W. Extraordinarily
polymorphic microsatellite DNA in barley: species
diversity, chromosomal locations, and population dymamics. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V.91. - P.5466-5470.
99
132. McClelland M., Welsh J. RNA fingerprinting be arbitrarily primed PCR. // PCR
Methods and Applications. - 1994. - V.4.- P.66-81.
133. McClelland M., Welsh J. DNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR.// PCR
Methods and Applications. - 1994.- V.4. - P.59-65.
134. Meinkoth J., Wahl G. Hibridization of nucleic asids immobilizes on solid support.
// Anal.Biochem. - 1984. - V.138. - P.267-284.
135. Mgonja M.A., Dahleen L.S., Franckowiak J.D. Subset from mapping populations
for location of new genes in barley. // Barley Genetics
Newsletter. - 1995. - V.24. - P.14-23.
136. Micheli M.R., Bova R., Pascale E., D`Ambrosio E. Reproducible DNA fingerprinting with the random amplified polymorphic DNA (RAPD) method. // Nucleic Acids Res.1994. -V.22.- P.1921-1922.
137. Miklas P.N., Stavely J.R., Kelly J.D. Identification and potential use of a molecular marker for rust resistance in common bean. // Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.85. - P.745749.
138. Mitsuhashi M., Cooper A., Ogura M., Shinagawa T., Yano K., Hosokawa T. Oligonucleitide probe design - a new approach. // Nature. - 1994.- V.367. - P.759-761.
139. Molnar S.J., McKay A. Restriction fargment analysis of Hordeum gene in Western Canadian 2-rowed barley. // Canadian Jornal of Plant Science. - 1995. - V.75. - P.191193.
140. Moore E.R., Shepherd J.W., Hoskins J. Design of PCR primers that detect only
mRNA in the presence of DNA. // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P.1921.
141. Morgante M., Rafalski A., Biddle P., Tingey S. Genetic mapping and variability of
seven soybean simple sequence repeat loci. // Genome. - 1994. - V.37. - P.763-769.
142. Motro U., Soller M. Sequential sampling in determining linkage
between marker loci and quantitative trait loci. // Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.85.- P.658664.
143. Mullis K.B., Faloona F.A., Scharf S., SaikimR., Horn G., Erlich
H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. // Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol.. - 1986. - V.51.- P.263-273.
144. N.A.B.G.M.P. Mapping of quantitative trait loci associated with malting quality in
barley. // Barley Genetics Newsletter. - 1993. - V.23. - P.84-97.
145. Namth D.M., Lapitan N.L. Comparative RFLP mapping of Hordeum vulgare and
Triticum tauschii. // Theor.Appl.Genet. - 1994. - V.89.- P.865-872.
100
146. Nei M., Miller J.C. A simple methods for estimating average number of nucleotide
substitutions within and between populations from restriction data. // Genetics. - 1990. V.125. - P.873-879.
147. Nei M. Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York.
1987. P.106-107.
148. Nei M., Li W.-H. Mathematical model for studying genetics variation in terms of
restriction endonucleases. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - V.76. - P.5269-52-73.
149. Nelson D.L., Ledbetter S.A., Corbo L., Victoria M.F., Ramirez-Solis R., Wester
T.D., Ledbetter D.H., Gaskey C.T. Alu polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. // Proc.Natl.Acad.Sci.- 1989.V.86.- P.6686-6690.
150. Netsvetaev V.P. Linkage of Hordeum spontaneum blue endosperm gene (Ble)
and two esterase loci (Est 4, Est 11) with marker genes on barley chromosome 3. // Barley
Genetics Newsletter. 1992. V.21. P.60-63.
151. Netsvetaev V.P., Sozinov A.A. Location of a hordeum G locus, Hrd G, on chromosome 5 of barley. // Barley Genetics Newsletter. - 1984. - V.14. - P.4-6.
152. Netsvetaev V.P. Chromosomal location of loci Est I 2 and Amy 2 in barley. // Barley Genetics Newsletter. - 1992. - V.22. - P.42-43.
153. Netsvetaev V.P. Genotypic variability of malt quality in spring barley. // Cereal
Research Communications. 1994. V.22. N1-2. P.65-70.
154. Netsvetaev V.P., Kalendar R.N., Sivolap Yu.M. b-amylase polimorphism in barley is detected by PCR with arbitrary primer. // Barley Genet. Newslett., - 1995. - V.24. P.80-83.
155. Netsvetaev V.P. Location on barley chromosome 3 of loci Est 1 and Est 2, coding
esterases 1 and 2. // Barley Genetics Newsletter. 1992. V,21. P.63-66.
156. Netsvetaev V.P. Position of the b-amylase locus Bmy 1, on barley chromosome 4
in relation to four genes. // Barley Genetics Newsletter. 1992. V.21. P.67-69.
157. Netsvetaev V.P., Sozinov A.A. Location of a hordein G locus, Hrg G, on chromosome 5 of barley. // Barley Genet. Newslett. - 1984. - V.14. - P.4-6.
158. Netsvetaev V.P., Krestinkov I.S. Chrosomal position of the superoxide dismutase
locus, Sod I (=Sod B), in barley. // Barley Genetics Newsletter. - 1992. - V.22. - P.44-45.
159. Ordon F., Bauer E., Dehmer K.J., Graner A., Friedt W. Identification of a RAPDmarker linked to the BaMMV/BaYMV resistence
gene ym4. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.123-126.
101
160. Oser A., Collasius M., Valet G. Multiple end labelling of oligonucleotides with
terbium chelate-substitued psoralen for time-resolved fruorescence detection. // Anal.Bioch.
- 1990. - V.191. - P.295-301.
161. PCR protocols: A guide to methods and applications. Innis C.S.,
San Diego. - 1990. - P.482.
162. PCR technology: Principle and aplications for DNA amplification. Erlich H.A. New York. - 1989. - P.246.
163. Palazolo M.J., Stanley S.A., Christophen M.H., David S.A., Daniel H.L. Optimized
strategies
for
sequence-tagged-size
selection
in
genome
mapping.
//
Proc.Nat.Sci.USA. - 1991. - V.88. - P.8034-8038.
164. Pan A., Hayes P. Genetic-analysis of the components of winterhardiness in barley (Hordeum vulgare L.). // Theor.Appl.Genet. - 1994. - V.89.- P.900-910.
165. Paran I., Michelmore R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to
downy mildew resistance genes in lettuce. // Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.85.- P.985-993.
166. Paran I., Kesseli R., Michelmore R. Indentification of restriction fragment lenght
polymorphism and random amplified polymorphic DNA markers to downy mildew resistance
genes in lettuce, using near-isogenic lines. // Genome. - 1991. - V.34.- P.1024-1027.
167. Paterson A., Lander E., Lincoln S., Hewitt J, Peterson S.,Tankley
S. Resolution of quantitative traits into mendelian factors factors using a complete RFLP
linkage map. // Nature. - 1988. - V.335.- P.721-726.
168. Pelger S. Prolamin variation and evolution in Triticeae as recognized by monoclonal antibodies. // Genome. - 1993. - V.36. - P.1042-1048.
169. Pener G.A., Chong J., Levesque-Lemay M., Molnar S.J., Fedak G. Indentification
of a RAPD marker linked to the oat stem rust gene Pg3.
// Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.85.- P.702-705.
170. Penner G.A. Identification of an RAPD markers for the crow rust resistance gene
Pc68 in oats. // Genome. - 1993. - V.36.- P.818-820.
171. Plaschke J., Ganal M.W., Roder M.S. Detection of genetic diversity in closely
related wheat using microsatellite markers. // Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.91. - P.10011007.
172. Plomion C., Omalley D.M., Durel C.E. Genomic analysis in martime pine openpollinated seeds of the same individual. // Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.1028-1034.
173. Pluthero F.G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. // Nucleic
Acids Research. - 1993. - V. 21. - P.4850-4851.
102
174. Pollard-Knight D., Simnonds A.C., Schoap A.P. Nonradiactive DNA detection of
southern blots by enzymatically triggered chemiluminescence. // Anal.Bioch. - 1990. - V.185.
- P.353-358.
175. Praf O., Lopez E., Mathis G. Europium (III) cryptate: a fluorescent label for the
detection of DNA hybrids on solid support. // Anal. Biochem. - 1991. - V.195. - P.283-289.
176. Ragot M., Hoisington D.A. Molecular markers for plant breeding: comparisons of
RFLP and RAPD genotyping costs. // Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.86. - P.975-984.
177. Rayapati P.J., Gregory J.W., Lee N. A linkage map of diploid avena based on
RFLP loci and a locus conferring resistance to 9 isolates of Puccinia coronata var. Avenae. //
Theor.Appl.Genet. - 1994. - V.89.- P.831-837.
178. Riber S.M., Rieber M. A Hoescht H 33258 agarose plate assay for the estimation
of nanograme DNA levels without RNA interference application in PCR and estimation of
plasmid and cytoplamic DNA. // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P.1918.
179. Roder M.S., Sirrells M.E., Tanksley S.D. Pulse-field gel analysis of 5S and satellite DNA in barley. // Genome. - 1995. - V.38. - P.153-157.
180. Rongwen J., Akkaya M.S., Bhagwat A.A., Lavi U., Cregan P.B. The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype indentification. // Theor.Appl.Genet. - 1995. V.90. - P.43-48.
181. Roy A., Frascaria N., MacKay J., Bousquet J. Segregating random amplified polymorphic DNAs (RAPDs) in Betula alleghaniensis. // Theor.Appl.Genet. - 1992. - V.85. P.173-180.
182. Rychlik W., Soencer W.Y., Rhoads R.F. Optimization of the anneling temperature for DNA amplification in vitro. // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P.6400-6414.
183. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. // Mol.Biol.Evol. - 1987. - V.4. - P.406-425.
184. Schachermayr G.M., Messmer M.M., Feuillet C., Winzeler H. Winzeler M., Keller
R. Identification of molecular markers linked to the Agropyron elongatum derived leaf rust
resistence gene LR24 in wheat. // Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.982-990.
185. Schiavo F.L., Mela L., Ronchi V.N., Tetzi M. Electrophoretic mobility of isozymes
from different plant species its possible use in identifying cell hybrids. // Plant Sci.Lett., 1980. - V.18. - P.45-55.
186. Schmitz G.G., Walter T., Seibl R., Kessler C. Nonradiactive labelling of oligonucleotides in vitro with the hapten digoxigenin by tailing with terminal transferase. // Anal. Biochem. - 1991. - V.192. - P.222-231.
103
187. Schmidt T., Boblenz K., Metzlaff M., Kaemmer D., Weising K., Kahl G. DNA fingerprinting in sugar beet (Beta vulgaris) - identification
of double-haploid breeding lines. // Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.85. - P.653-657.
188. Simpson S.P. Detection of linkage between quantitative trait loci and restriction
fragment length polymorphisms using inbred lines. // Theor.Appl.Genet. - 1989.- V.77.P.815-819.
189. Sneath P.H., Socal R.R. Numerical taxonomy: the principles and practice of numerical classification. - San Francisco: W.H.Freeman, 1973.
190. Sobral B.W.S., Honeycutt R.J. High output genetic mapping of polyploids using
PCR-generated markers. // Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.86. - P.105-112.
191. Soliman K.M. Genetic analyses of rDNA spacer-length variation in barley. //
Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.85. - P.913-919.
192. Soller M., Beckmann J.S. Genetic polymorphism in varietal identification and genetic improvement. // Ibid. - 1983. - V.67. - P.25-33.
193. Song K., Slocum M.K., Osborn T. Molecular marker analysis of
genes-controlling
morphological
variation
in
Brassica
rapa
(Syn.
Campestris).
//
Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.1-10.
194. Song Y.C., Gustafson J.P. The physical location of 14 RFLP markers in rice
(Orysa satyva L.). // Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.113-119.
195. Sorokin A., Marthe F., Kunzel G. Integration of 37 translocation breakpoints of
barley chromosome 5 into the Igri/Franka derived RFLP map. // Barley Genetics Newsletter.
- 1995. - V.24. - P.108-112.
196. Stiles J.I., Lemme C., Sondur S., Morshidi M.B., Manshardt R. Using randomly
amplified polymorphic DNA for evaluating genetic relationships among papaya cultivars. //
Theor.Appl.Genet. - 1993. - V.85. - P.697-701.
197. Stuckle E.E., Emmrich C., Grob U., Neilsen P.J. Statistical analysis of nucleotide
sequences. // Nucleic Acids Res.- 1990. - V.18. - P.6641-6647.
198. Svitashev S., Bryngelsson T., Vershinin A., Pedersen C., Sall T., Vonbothmer R.
Phylogenetic analysis of the genus Hordeum using repetitive DNA-sequences. //
Theor.Appl.Genet. - 1994. - V.89. - P.801-810.
199. Tingey S.V., gel Tufo J.P. Genetic analysis with random amplified polymorphic
DNA markers. // Plant Physiol.- 1993. - V.101. - P.349-352.
200. Tinker N.A., Mather D.E., NABGMP Main effects of quantitative train loci in Harrington/TR306 two-row barley.// Barley Genetics Newsletter. - 1993. - V.23. - P.72-78.
104
201. Tinker N.A., Fortin M.G., Mather D.E. Random amplified polymorphic DNA and
pedigree relationships in spring barley. // Theor.Appl.Genet. - 1993.- V.85.- P.976-984.
202. Tomas W.T.B., Powell W., Waugh R., Forster B.P., Chalmers K.J., Barua U.M.,
Swanston J.S., Ellis R.P. Quantitative trait loci in a North West European spring barley
cross-Blenheim x E224/3. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.41-45.
203. Torres A.M., Weeden N.F., Martin A. Linkage among isozyme, RFLP and RAPD
markers in Vicia faba. // Theor.Appl.Genet. - 1993.- V.85.- P.937-945.
204. Tranckowiak J.D. Notes on linkage drag in Bowman backcross derived lines of
spring barley. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.63-70.
205. Vaccino P., Metakovsky E.V. RFLP patterns of gliadin alleles in Triticum aestivum L. - implication for analysis of the organization and evolution of complex loci. //
Theor.Appl.Genet. - 1995. - V.90. - P.173-181.
206. Vale G., Torrigiani E., Toubia-Rahme H., Delogu G. Molecular cloning of barley
pathogen induced gene coding for «Thaumatin like» protein. // Barley Genetics Newsletter. 1995. - V.24. - P.12-13.
207. Van Coppenolle B., Watanabe I., Van Hove C., Second G., Huang N., McCouch
S.R. Genetic diversity and phylogeny analusis of Azolla based on DNA amplification by arbitrary primers. // Genome. - 1993.- V.36.- P.686-693.
208. Vanhintum T.J.L. Comparison of marker systems and construstion of a core
colection in a pedigree of European spring barley. // Theor.Appl.Genet. - 1994. - V.89.P.991-997.
209. Versalovic J., Koeuth T., Lupski J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in
eubacteria and applications to fingerprinting of bacterial genomes. // Nucleic Acids Res. 1991. - V.19. - P.6823-6831.
210. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. // Nucleic Acids Res.- 1990. - V.18. - P.7213-7218.
211. Welsh J., Honeycutt R.J., McClelland M., Sobral B.W.S. Parentage determination in maize hybrids using the arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR). //
Theor.Appl.Genet. - 1991.- V.82.- P.473-476.
212. Williams K.J., Fisher J.M., Langridge I. Identification of RFLP markers linked to
the cereal Cyst-nematode resistance gene (CRE) in wheat. // Theor.Appl.Genet. - 1994. V.89. - P.927-930.
105
213. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.L., Rafalscki J.A., Tingly S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. // Nucleic Acids
Res. - 1990. - V.18 - P.6513-6535.
214. Wolff K., Schoen E.D., Peters-Van Rijn J. Optimization of random amplified polymorphic DNAs in chrysanthemum. // Theor.Appl.Genet. - 1993. - 86.- P.1033-1037.
215. Yanagisawa T., Hayashi M., Hirai A., Harada K. DNA-fingerprinting in soybean
(Glycine max L. Merrill) with oligonucleotide probes for simple repetitive sequences. //
Euphytica. - 1994. - V.80. - P.129-136.
216. Yoshimi R., Konishi T. Linkage analysis of several isozyme loci in barley. // Barley Genetics Newsletter. - 1995. - V.24. - P.35-37.
217. Lowe T., Sharefkin J., Yang S.Q., Dieffendach C.W. A computer
program for selection of oligonucleotide primers for PCR. // Nucleic Acids Res. - 1990.- V.18.
- P.1757-1562.
Автор выражает благодарность за помощь, оказанную при выполнении
диссертационной работы и за ценные советы научному руководителю, зав. отделом
генной инженерии Ю.М.Сиволапу, ведущим сотрудникам отдела генетических основ
селекции В.П. Нецветаеву, зав. отделом информатики и вычислительной техники
В.Ф.Герасименко и старшему сотруднику отдела генетических основ селекции А.Н.
Хохлову.