ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРИЗНАКОВ
advertisement
На правах рукописи ТЕРЕЩЕНКО ОЛЕСЯ ЮРЬЕВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРИЗНАКОВ АНТОЦИАНОВОЙ ОКРАСКИ У ИЗОГЕННЫХ И ИНТРОГРЕССИВНОЙ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM L.) 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2012 1 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск Научный руководитель: кандидат биологических наук Хлесткина Елена Константиновна Официальные оппоненты: Дорогина Ольга Викторовна доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск Кочетов Алексей Владимирович кандидат биологических наук, доцент, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, г. Иркутск Защита диссертации состоится «___» ____________ 2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН. Автореферат разослан «___» _____________ 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L., 2n = 6x = 42, аллогексаплоидный геном ВВAADD) является на сегодняшний день основной сельскохозяйственной культурой и одним из наиболее перспективных объектов исследования в области генетики и селекции растений. К числу активно изучаемых генетических систем данного вида относится система генов биосинтеза антоциановых соединений, функционирование которой приводит на уровне фенотипа к окрашиванию различных органов пшеницы (перикарпа зерна – гены Рр, стебля – Pc, колеоптиле – Rc, листовых пластинок – Plb, листовых влагалищ – Pls, пыльников – Pan). Интерес исследователей к системе генов биосинтеза антоцианов обусловлен ярко выраженными антиоксидантными свойствами данных соединений, способствующими устойчивости растений к воздействию широкого спектра биотических и абиотических стрессовых факторов (Chalker-Scott, 1999; Gould, 2004). На сегодняшний день гены, определяющие признаки антоциановой окраски различных органов пшеницы, картированы (McIntosh et al., 2011), однако их нуклеотидные последовательности остаются до сих пор невыделенными. Практически неизученной остаётся и функциональная активность данных генов, установлена только роль гена Rc, детерминирующего антоциановую пигментацию колеоптиле, в регуляции транскрипции генов, кодирующих ферменты биосинтеза антоцианов (Ahmed et al., 2006; Khlestkina et al., 2008, 2010). О регуляторной роли генов Рр, Pc, Plb, Pls и Pan высказывалось лишь предположение, которое в настоящее время нуждается в экспериментальном подтверждении. Для решения данной задачи, а также исследования антоциановой окраски молекулярно-генетических различных органов механизмов пшеницы были формирования выбраны такие генетические модели, как почти изогенные и интрогрессивные линии пшеницы, созданные в лаборатории хромосомной инженерии злаков ИЦиГ СО РАН. Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в установлении особенностей генетической регуляции биосинтеза антоциановых пигментов в различных органах мягкой пшеницы. В работе были поставлены следующие задачи: 1) микросателлитное генотипирование изогенных и интрогрессивных линий мягкой пшеницы, отличающихся по признакам антоциановой окраски; 3 2) сравнительный анализ транскрипции генов, кодирующих ферменты биосинтеза антоцианов халконсинтазу (CHS), халконфлаванонизомеразу (CHI), флаванон-3гидроксилазу (F3H), дигидрофлавонол-4-редуктазу (DFR) и антоцианидинсинтазу (ANS), в различных органах у линий пшеницы, отличающихся по признакам антоциановой окраски; 3) выделение и определение полноразмерных нуклеотидных последовательностей пшеницы, кодирующих один из ключевых ферментов биосинтеза антоцианов - CHI; 4) установление хромосомной локализации и картирование выделенных генов Chi в геноме мягкой пшеницы; 5) сравнительная характеристика структурно-функциональных особенностей выделенных генов Chi пшеницы. Научная новизна работы. В настоящей работе были получены новые данные, раскрывающие особенности генетической регуляции биосинтеза антоцианов в различных органах пшеницы. А именно, впервые показано, что функциональные аллели генов Pp, детерминирующих антоциановую окраску перикарпа зерна, могут встречаться не только среди образцов T. aestivum и T. durum, но и у T. timopheevii, Aеgilops speltoides и Ae. tauschii. Впервые экспериментальным путём установлено, что гены Рр, Pc, Plb и Pls, определяющие антоциановую окраску различных органов T. aestivum, участвуют в регуляции транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans. При этом показано, что механизмы регуляции транскрипции F3h отличаются от таковых у других структурных генов биосинтеза антоцианов. Впервые определены нуклеотидные последовательности трёх гомеологичных копий гена Chi пшеницы, структурно-функциональный анализ которых показал, что при некотором отличии cis-регуляторных элементов все три копии являются транскрипционно активными и кодируют высокоидентичные аминокислотные последовательности, незначительные различия в которых не затрагивают сайты, важные для правильной укладки и функциональной активности фермента СHI. Практическая ценность работы. Получен ряд новых маркеров, которые могут эффективно использоваться для идентификации отдельных хромосом мягкой пшеницы. 4 Положения, выносимые на защиту: 1) У пшеницы регуляция транскрипции гена F3h происходит обособленно от других структурных генов биосинтеза антоцианов. 2) Признак антоциановой окраски перикарпа зерна появился у аллополиплоидных пшениц в результате объединения в одном ядре геномов диплоидных видов различных родов (Triticum и Aegilops), несущих по одному из двух комплементарных генов Pp. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 15 российских и международных конференциях, среди которых 45-ая и 46-ая международные научные студенческие конференции «Студент и научно-технический прогресс» (2007 и 2008, Новосибирск), 5-ый съезд ВОГиС (2009, Москва), международная конференция «Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск), международная конференция «Генетические ресурсы и геномика пшеницы» (2011, Новосибирск), 14ая и 15-ая международные конференции Европейского сообщества по анеуплоидам пшеницы EWAC (2007, Стамбул, Турция; 2011, Нови Сад, Сербия), 2-ая международная школа-конференция молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (2011, МоскваЗвенигород) и др. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, из них 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК, 2 статьи в сборниках трудов конференций, 1 глава в коллективной монографии и 18 тезисов конференций. Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 140 страницах печатного текста, включая 14 таблиц и 34 рисунка. Список цитированной литературы содержит 261 работу. Личный вклад автора. Основные результаты работы были получены и проанализированы автором самостоятельно: в частности, микросателлитный анализ линий, изучение транскрипции структурных генов биосинтеза клонирование и структурно-функциональный анализ генов Chi пшеницы. 5 антоцианов, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для клонирования нуклеотидных последовательностей мягкой пшеницы, установления их хромосомной и внутрихромосомной локализации использовались, соответственно, сорт Chinese Spring, нуллитетрасомные (Sears, 1944, 1946) и делеционные (Endo and Gill, 1996) линии данного сорта (семена/ДНК предоставлены д-ром A. Бёрнером и д-ром М.С. Рёдер, IPK-Gatersleben, Германия). Для генетического картирования использовали F2 популяцию T. aestivum Саратовская 29T. timopheevii 842 × Скала (Leonova et al., 2004), ДНК которой и данные микросателлитного анализа любезно предоставила к.б.н. Леонова И.Н. (ИЦиГ СО РАН, Новосибирск). Хромосомную локализацию и оценку фрагментов хромосом, несущих гены, определяющие антоциановую пигментацию различных органов, а также оценку содержания антоцианов (рис. 1) и анализ транскрипции генов проводили при использовании набора линий, описанных в таблице 1, любезно предоставленных к.б.н. В.С. Арбузовой, к.б.н. Т.А. Пшеничниковой, к.б.н. Е.Б. Будашкиной (ИЦиГ СО РАН, Новосибирск) и д-ром А. Бёрнером (IPK-Gatersleben, Германия). Таблица 1. Почти изогенные, интрогрессивные и замещённые линии, а также их родительские формы, используемые для микросателлитного анализа (*), оценки содержания антоцианов (**) и анализа транскрипции генов биосинтеза антоцианов (***). Обозначение линии i:S29Pp1Pp2PF i:S29Pp1Pp3P Описание линии (ссылка) *,**,*** почти изогенная линия, ВС8 (Arbuzova et al., 1998) *,**,*** почти изогенная линия, ВС8 (Arbuzova et al., 1998) T. aestivum С29 T. aestivum С29-T. timopheevii 821 (Budashkina, 1988) * интрогрессивная линия, ВС5 (Tereshchenko et al., 2012) РС родительская форма 1 T. aestivum Саратовская 29 (С29) Контроль родительская форма 2 T. aestivum Purple Feed T. aestivum Purple T. aestivum РодинаAe. speltoides 102/00i (Лапочкина, 2001) дополнительный контроль сорта С29 и Родина *** CS(Hope 7А), CS(Hope 7B) линии мягкой пшеницы с межсортовым замещением хромосомы (Kuspira and Unrau, 1958) T. aestivum Chinese Spring (СS) T. aestivum Hope сорта СS и Мироновская 808 Структуры праймеров к генам биосинтеза антоцианов пшеницы были взяты из литературы (Himi et al., 2005), либо сконструированы в данной работе с помощью компьютерной программы OLIGO (Offerman and Rychlik, 2003) на основании нуклеотидных последовательностей генов и EST пшеницы и других видов растений, выявленных в базе данных нуклеотидных последовательностей NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/) с помощью алгоритма BLAST (Altchul et al., 1990). Для генотипирования почти изогенных 6 (далее по тексту ‘изогенных’) и интрогрессивных линий использовались праймеры к микросателлитным маркерам GWM (Gatersleben Wheat Microsatellite; Röder et al., 1998; Ganal and Röder, 2007), любезно предоставленные д-ром М.С. Рёдер (IPK-Gatersleben, Германия). Рис. 1. Окраска колеоптиле и перикарпа зерна у С29, i:S29Pp1Pp2PF и i:S29Pp1Pp3P с указанием генов, детерминирующих окраску (а). Количественное содержание антоцианов в колеоптиле данных линий с 3 по 7 день после прорастания зерна (б). OD530 – оптическая плотность при длине волны 530 нм. С помощью специфичных праймеров, разработанных в данной работе к гену Chi-B1, из геномной BAC-библиотеки сорта CS д-ром Х. Бергес (INRA, Тулуза, Франция) был отобран и любезно предоставлен для работы BAC-клон, содержащий нуклеотидную последовательность данного гена. ДНК растений выделяли согласно Plaschke et al. (1995). ДНК BAC-клона выделяли с использованием набора реагентов «Montage Plasmid MiniprepHTS Kit» (Millipore). Выделение и очистку РНК растений проводили при использовании наборов реагентов «Plant Rneasy Kit» (Qiagen) или «Plant RNA MiniPrepTM» (Zymo Research) и «RNase-Free DNase Set» (Qiagen). кДНК синтезировали из 1 мкг суммарной РНК с помощью обратной транскрипции, используя олигонуклеотидную затравку (dT)15 и набор реагентов «Omniscript Reverse Transcription Kit» (Qiagen). Синтезированную кДНК использовали в ОТ-ПЦР для анализа транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов, в качестве эндогенного контроля использовали ген Ubc. ПЦР проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл, используя протоколы, рекомендуемые разработчиками праймеров, либо протокол «Touchdown» (Somers et al., 2003). Электрофоретический анализ геномной ДНК, ДНК ВАС-клона и ПЦР-продуктов проводили согласно Maniatis et al. (1982). ПЦРфрагменты выделяли из 1% агарозного геля с помощью набора реагентов «MinElute Gel Extraction Kit» (Qiagen). При содействии ЦКП СО РАН «Межинститутский центр 7 секвенирования ДНК» анализировали клонированные фрагменты ДНК с помощью набора для секвенирования «ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit» (Perkin Elmer) и микросателлитные фрагменты с использованием маркера длины «GeneScanTM–500LIZTM Size standard» (Applied Biosystems). Антоцианы выделяли экстракцией в 1%-м растворе HCl в метаноле согласно Christie et al. (1994), их количество оценивали с помощью спектрофотометра «SmartSpecTMPlus» (BioRad) при длине волны 530 нм. Сравнение полученных данных проводилось с использованием критерия Манна-Уитни (Васильева, 2004). Кластерный анализ выполнялся с помощью программы MEGA 3.1. (Kumar et al., 2004) при использовании метода присоединения соседей (Saitou and Nei, 1987). Построение генетических карт проводилось с помощью компьютерной программы MAPMAKER 2.0 (Lander et al., 1987). Поиск cis-регуляторных элементов генов осуществлялся с помощью программы «Signal Scan» в базе данных PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/; Higo et al., 1999). Предсказание третичной структуры белков проводилось с помощью программы SWISS-MODEL (Kiefer et al., Конструирование 2009). 5'-регуляторных областей генов Сhi-A1 и Chi-D1 осуществлялось при использовании нуклеотидных последовательностей из базы данных CEREALSDB (http://www.cerealsdb.uk.net/copyright.htm). Множественное выравнивание последовательностей проводилось с помощью программы Multalin (Corpet, 1988). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Особенности формирования признаков антоциановой окраски у изогенных и интрогрессивной линий мягкой пшеницы. Для исследования нами были выбраны изогенные (i:S29Pp1Pp2PF и i:S29Pp1Pp3P) и интрогрессивная (PC) линии, полученные в ИЦиГ СО РАН на основе отбора по признаку антоциановой (фиолетовой) окраски перикарпа зерна (табл. 1). На основе оценки антоциановой пигментации различных органов, проведённой у данных линий, а также их родительских форм (табл. 2), видно, что линии отличаются не только по наличию/отсутствию окраски, но и по её интенсивности. При этом количественный анализ содержания антоцианов в колеоптиле показал, что изогенные линии, визуально характеризующиеся как интенсивно окрашенные, содержат в 3-4 раза больше антоцианов по сравнению со слабо окрашенной С29 (рис. 1). 8 Таблица 2. Визуальная оценка пигментации различных органов у изогенных линий i:S29Pp1Pp2PF и i:S29Pp1Pp3P, интрогрессивной линии PC, а также исходных форм, на основе которых они были получены. Сорт/линия Purple Purple Feed i:S29Pp1Pp2PF i:S29Pp1Pp3P Саратовская 29 Родина линия 821 линия 102/00i РС колеоптиле интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная слабая отсутствует слабая интенсивная интенсивная Антоциановая пигментация органов листовые листовые стебель пластинки влагалища интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная слабая слабая слабая отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная перикарп зерна интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует интенсивная Для того чтобы выяснить, какие участки генома ответственны за различия между изучаемыми формами по окраске колеоптиле и других органов (рис. 1, табл. 2), было проведено генотипирование ДНК данных форм с использованием микросателлитных маркеров. Сравнение результатов фенотипирования (табл. 2) и генотипирования (рис. 2) изогенных линий позволило локализовать в них гены, унаследованные от сортов-доноров: Rc, Pc, Plb, Pls и Pp1 – в хромосоме 7D, а Pp3 – в хромосоме 2А (рис. 2). При этом локализация гена Pp1 в хромосоме 7D пшеницы показана впервые. До настоящей работы ген Pp1 был картирован только в хромосоме 7B (Dobrovolskaya et al., 2006; Khlestkina et al., 2010). Сравнение локализации гена Pp1 в хромосоме 7D у линий i:S29Pp1Pp2PF и i:S29Pp1Pp3P и гена Pp1 в хромосоме 7В у тетраплоидной пшеницы (Khlestkina et al., 2010) указывает на то, что данные локусы являются гомеологичными и согласно правилам номенклатуры генов пшеницы должны быть обозначены Pp-D1 и Pp-B1, соответственно. Интересно, что у аллополиплоидной пшеницы комплементарные гены, необходимые для формирования фиолетовой окраски зерна, находятся в разных геномах: Рр3 в геноме А, а Рр-1 в геномах В или D. Этим можно объяснить тот факт, что данный признак впервые появляется на тетраплоидном уровне организации генома пшеницы. Причём у тетраплоидной пшеницы происхождение данного признака оставалось неизвестным, так как у диплоидных видов-доноров геномов пшеницы фиолетовая окраска зерна не встречается (Zeven, 1991). Однако выявление гена Рр-1 в геноме D (рис. 2) указывает на возможность присутствия функционально активных аллелей генов Рр и у диплоидных видов, что подтверждают и результаты анализа другой генетической модели – интрогрессивной линии PC (рис. 3). При объединении в данной линии функционально активных аллелей комплементарных 9 генов Pp-1 от Ae. speltoides (SS, 2n = 2x = 14) и Pp3 от T. timopheevii (GGAtAt, 2n = 4x = 28) происходит формирование антоциановой окраски перикарпа, отсутствующей у доноров интрогрессий (табл. 2, рис. 3). Рис. 2. Схематическое изображение интрогрессий от сортов-доноров в изогенные линии i:S29Pp1Pp2PF (а) и i:S29Pp1Pp3P (б), определённых с помощью микросателлитных маркеров. С29 – рекуррентный сорт, Purple Feed и Purple – сорта-доноры. На основании анализа фенотипа (табл. 2) и в согласовании с данными из каталога генных символов пшеницы (McIntosh et al., 2011) отмечены гены Pp, Pc, Rc, Plb, Pls. Слева приведены расстояния между маркерами в сМ по данным Ganal and Röder (2007). Интересно, что ген Рр3 происходит от диплоидного вида рода Triticum, а Pp-1 – от диплоидных видов рода Aegilops. Можно сделать вывод о важной роли аллополиплоидизации в появлении данного признака у тетраплоидных и гексаплоидных видов пшениц, благодаря которой в одном ядре объединяются функциональные аллели комплементарно действующих генов, унаследованных от представителей разных родов. Транскрипция структурных генов биосинтеза антоцианов в различных органах контрастно окрашенных изогенных линий. Для определения роли генов, детерминирующих окраску различных органов мягкой пшеницы, в биосинтезе антоциановых пигментов было проведено сравнительное исследование транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans у контрастно окрашенных форм пшеницы – у С29 и изогенных линий i:S29Pp1Pp2PF, i:S29Pp1Pp3P, 10 охарактеризованных выше (табл. 2, рис. 2). На рисунке 4 суммированы полученные данные по анализу транскрипции генов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans в различных органах данных линий. Рис. 3. Схематическое изображение интрогрессий от T. timopheevii (a) и Ae. speltoides (б) в линию PC и в её родительские формы – линии 821 и 102/00i. Отмечены гены Pp, Rc, Pc, Plb, Pls. Слева приведены расстояния между маркерами в сМ по данным Ganal and Röder (2007). С29 отличается от изогенных линий по экспрессии генов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans в колеоптиле, стебле, листовых пластинках, листовых влагалищах и перикарпе зерна. Выявленные отличия объясняются присутствием в геноме изогенных линий функционально активных аллелей генов Rc-D1, Pls-D1, Plb-D1, Pc-D1, Pp-D1 и Pp3 (рис. 1, 2) и свидетельствуют о регуляторной роли этих генов в биосинтезе антоцианов. Причём различия в аллельном состоянии регуляторных генов Rc, Pls, Plb, Pc и Pp сопряжены как с количественными отличиями в транскрипции структурных генов (усиление транскрипции Chs, Chi, Dfr и Ans), так и с качественным (F3h в неокрашенных тканях неактивен, в окрашенных активен). Интересно, что у различных видов растений структурные гены по-разному сочетаются в группы в зависимости от коэкспрессии (Dooner, 1983; Cone et al., 1986; Ludwig et al., 1989; Klein et al., 1989; Goff et al., 1990; Martin and Gerats, 1993). Обособленность F3h от 11 других структурных генов биосинтеза антоцианов выявлена только у пшеницы и является, по всей видимости, специфической особенностью Triticum. Рис. 4. ОТ-ПЦР-фрагменты, полученные при использовании праймеров к генам Chs (длина ПЦР-фрагмента 434 п.н.), Chi (394 п.н.), F3h-1 (479 п.н.), Dfr (373 п.н.) и Ans (163 п.н.) и кДНК, синтезированной на основе РНК, выделенной из различных органов С29, i:S29Pp1Pp2PF и i:S29Pp1Pp3P. Ubc – эндогенный контроль. Слева приведена схема биосинтеза антоцианов по Winkel-Shirley, 2001. Выделение, картирование и анализ генов Chi мягкой пшеницы. Для понимания особенностей регуляции транскрипции генов биосинтеза антоцианов важной является информация о нуклеотидных последовательностях генов, включая их регуляторные области. Однако у пшеницы до настоящей работы не была выделена полноразмерная нуклеотидная последовательность гена Chi. С помощью анализа EST пшеницы, гомологичных нуклеотидной последовательности гена Chi ячменя (AF474923), были идентифицированы 3 копии гена Chi пшеницы, локализованные в хромосомах 5А, 5B и 5D (рис. 5). Использование делеционных линий (рис. 6а), а также генетическое картирование (рис. 6б) показало, что выявленные гены локализуются в дистальных районах длинных плеч хромосом 5A, 5B и 5D в гомеологичных позициях и должны быть обозначены Chi-A1, Chi-B1 и Сhi-D1, соответственно. 12 Рис. 5. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных с использованием подобранных в данной работе копий-специфичных праймеров на ДНК CS и нуллитетрасомных линий N5AT5B, N5BT5A, N5DT5B. Справа приведена длина амплифицированных фрагментов ПЦР. Секвенирование ВАС-клона из геномной библиотеки СS, несущего ген Chi-B1, позволило определить полноразмерную нуклеотидную последовательность данного гена. Нуклеотидные последовательности генов Chi-A1 и Сhi-D1 были определены с помощью секвенирования ПЦР-фрагментов, полученных с использованием копийспецифичных праймеров. Секвенированные последовательности генов Chi-A1 (892 п.н.), Chi-B1 (1550 п.н.) и Chi-D1 (908 п.н.) размещены в базе данных NCBI под номерами JN039037, JN039038 и JN039039, соответственно. а) б) Рис. 6. Схема делеционных карт хромосом 5А, 5В и 5D пшеницы с локализованными на них генами Сhi-A1, -B1, -D1 (а) и генетическая карта хромосомы 5B мягкой пшеницы, сконструированная на основе анализа популяции 842/Скала с использованием маркера к ChiB1 (б). Анализ выделенных нуклеотидных последовательностей показал, что гены ChiA1, -B1 и -D1 содержат по три экзона и два интрона. При этом длина белоккодирующей последовательности гена Chi-A1 составляет 690 п.н., генов Chi-B1 и ChiD1 – 696 п.н. На основании выделенных нуклеотидных последовательностей предсказаны аминокислотные последовательности СHI-A1, -B1 и -D1, составившие 230, 232 и 232 аминокислотных остатка, соответственно (рис. 7). Уровень идентичности между нуклеотидными и белковыми последовательностями гомеологичных копий гена Chi пшеницы составил 96–97%. Сравнение предсказанных аминокислотных последовательностей генов Chi-A1, -B1 и -D1 с белковой последовательностью CHI Medicago sativa L., для которой была определена вторичная и третичная структура (Jez et al., 13 2000), позволило идентифицировать аминокислотные остатки, образующие активный центр ферментов CHI пшеницы и являющиеся идентичными у CHI-A1, -B1 и -D1 (рис. 7). Таким образом, данные ферменты, предположительно, являются функциональными. Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей генов Chi пшеницы и Medicago sativa L. Отмечены аминокислотные остатки, связывающие субстрат (зелёные), образующие водородные связи в активном центре фермента (розовые) и консервативные аминокислотные остатки у разных видов растений (синие). Горизонтальной линией отмечены аминокислоты, образующие структурные мотивы: α-спирали и β-складки (по Jez et al., 2000). Жёлтым цветом выделены аминокислотные замены, отличающиеся между CHI пшеницы. Сравнение нуклеотидных последовательностей регуляторных районов генов Chi пшеницы длиной 636 п.н., показало, что уровень идентичности между гомеологичными копиями составляет 69–75%, а число и взаимное расположение обнаруженных cis-регуляторных элементов отличается (рис. 8). Рис. 8. Схематическое изображение взаимного расположения cis-регуляторных элементов, специфичных для генов биосинтеза антоцианов, найденных в регуляторных областях генов Chi-A1, -B1 и -D1. MRE – MYB-recognition element, RRE – R response element, G-box (ACE – ACGT-containing region). 14 Тем не менее, все три копии являются транскрипционно активными в колеоптиле, как показал экспериментальный анализ (рис. 9), а также в других органах пшеницы, на что указывает наличие идентичных EST в базе данных NCBI (Chi-A1 – 2 EST; Chi-B1 – 5 EST; Chi-D1 – 10 EST). Рис. 9. Электрофореграмма ОТ-ПЦР-фрагментов, полученных при использовании праймеров к генам Chi-A1 (длина фрагмента с ДНК/кДНК 321/191 п.н.), Chi-B1 (325/188) и Chi-D1 (318/191) и кДНК-матрицы, полученной на основе РНК, выделенной из неокрашенного колеоптиле CS и окрашенных колеоптиле Мироновской 808, CS(Hope 7А) и CS(Hope 7B). В качестве контроля специфичности праймеров приведены результаты ПЦР с ДНК СS и нуллитетрасомных линий N5AT5B, N5BT5D и N5DT5B. Ubc – эндогенный контроль. Интересно, что среди идентифицированных cis-регуляторных элементов генов Chi пшеницы помимо MRE, RRE и G-боксов (рис. 8), которые согласно Hartmann et al. (2005) являются специфичными для генов биосинтеза антоцианов, были выявлены также предположительные cis-регуляторные элементы, ответственные за светозависимую экспрессию генов, за экспрессию генов в ответ на биотический и абиотический стресс, а также на гормональные стимулы, присутствие которых может объяснить независимую от биосинтеза антоцианов транскрипцию гена Chi (рис. 4, 9). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Длительное время признаки антоциановой окраски мягкой пшеницы использовались лишь для описания сортов и внутривидовой таксономической классификации. Однако постоянно появляющиеся данные о роли антоциановых соединений в защите растений при стрессе, а также об их положительном влиянии на здоровье человека, стали привлекать внимание исследователей к изучению генетических основ биосинтеза антоциановых соединений. В данной работе было проведено исследование, направленное на понимание молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе формирования признаков антоциановой окраски у пшеницы. Благодаря использованию изогенных 15 и интрогрессивных линий, полученных в ИЦиГ СО РАН, в настоящей работе установлено присутствие функционально активных аллелей генов Рр у диплоидных доноров геномов пшеницы и сделаны выводы о консервативности генов Pp-1 и Рp3 среди видов Triticum и Aegilops, а также о важности аллополиплоидизации в появлении новых признаков у пшеницы. Обнаружены регуляторные особенности формирования признаков антоциановой окраски у пшеницы, в частности, выявлена обособленность регуляции экспрессии гена F3h от других структурных генов биосинтеза антоцианов. Проделанная работа позволяет наметить направление дальнейших исследований в области генетики признаков антоциановой окраски пшеницы, а именно: выделение и анализ структурно-функциональной организации генов, детерминирующих окраску, регуляторная роль которых была установлена в настоящей работе; сравнительное изучение структурной организации промоторов всех структурных генов биосинтеза антоцианов с целью объяснения обособленности регуляции транскрипции гена F3h. ВЫВОДЫ 1. С помощью генотипирования изогенных и интрогрессивных линий мягкой пшеницы функционально активные аллели генов Pp-1 и Pp3, детерминирующие антоциановую окраску перикарпа зерна при комплементарном взаимодействии друг с другом, впервые локализованы в хромосомах 7D T. aestivum (Pp-1), 2А T. timopheevii (Pp3) и 7S Ae. speltoides (Pp-1). 2. С помощью сравнительного анализа изогенных линий впервые показано, что гены, определяющие антоциановую окраску стебля (Pc), листовых пластинок (Plb), листовых влагалищ (Pls) и перикарпа зерна (Pp), участвуют в регуляции транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans в соответствующих органах. 3. Различия в аллельном состоянии регуляторных генов Pc, Plb, Pls и Pp сопряжены как с количественными отличиями в транскрипции структурных генов (усиление транскрипции Chs, Chi, Dfr и Ans), так и с качественным (F3h в неокрашенных тканях неактивен, в окрашенных активен). 4. Впервые выделены полноразмерные нуклеотидные последовательности генов ChiА1, Chi-В1 и Chi-D1 мягкой пшеницы; данные гены картированы в дистальных районах длинных плеч хромосом 5А, 5В и 5D, соответственно. 16 5. Установлено, что при некотором отличии cis-регуляторных элементов все три копии гена Chi пшеницы являются транскрипционно активными и кодируют высокоидентичные аминокислотные последовательности, незначительные различия в которых не затрагивают сайты, важные для правильной укладки и функциональной активности фермента СHI. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. Khlestkina E.K, Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Anthocyanin biosynthesis genes location and expression in wheat-rye hybrids // Mol. Genet. Genom. - 2009. - V. 282. - P. 475-485. 2. Адонина И.Г., Орловская О.А., Терещенко О.Ю., Корень Л.В., Хотылева Л.В., Шумный В.К., Салина Е.А. Формирование хозяйственно-ценных признаков у линий гексаплоидных тритикале с интрогрессиями от дикорастущих видов эгилопсов в зависимости от геномного состава // Генетика. - 2011. - T. 47. - № 4. - С. 516 – 526. Главы в монографиях 3. Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Flavonoid biosynthesis genes in wheat and wheatalien hybrids: studies into gene regulation in plants with complex genomes // Mothersil C.E., Korogodina V., Seymour C.B. (Eds) Radiobiology and Environmental Security (NATO Science for Peace and Security Series C: Environmental Security): Radiobiology and Environmental Security. Dordrecht, the Netherlands: Springer, 2012. - P. 31-41. Статьи в сборниках трудов конференций 4. Khlestkina E.K., Salina E.A., Tereschenko O.Yu., Leonova I.N., Börner A., Röder M.S. Approach to comparative mapping of structural genes in polyploid wheat and rye // EWAC Newsl. - 2008. - V. 14. - P. 33-34. 5. Tereshchenko O.Yu., Khlestkina E.K., Gordeeva E.I., Arbuzova V.S., Salina E.A. The genetic basis of anthocyanin biosynthesis in wheat, rye and wheat-rye hybrids under normal and stress conditions // Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution: Abstr. and papers by young scientists of Third International Conference, Dedicated to N.W.Timofeeff-Ressovsky 9-14 October 2010. - Alushta, 2010. - P.171-174. Тезисы конференций 6. Терещенко О.Ю. Клонирование и сравнительный анализ генов флаванон-3-гидроксилазы пшеницы (Triricum aestivum) и ржи (Secale cereale) // Студент и научно-технический прогресс: Тез. докл. XLV международной научной студенческой конференции 10-12 апреля 2007 г. – Новосибирск, 2007. - С. 166-167. 7. Терещенко О.Ю., Хлесткина Е.К., Салина Е.А. Клонирование, локализация и сравнительный анализ генов флаванон-3-гидроксилазы пшеницы (Triricum aestivum) и ржи (Secale cereale) // Проблемы молекулярной и клеточной биологии: Тез. докл. Международной молодежной научнометодической конференции 9-12 мая 2007 г. – Томск, 2007. – С.165. 8. Терещенко О.Ю. Клонирование, локализация и анализ экспрессии структурных генов F3H, ANS и 3RT биосинтеза антоцианов ржи (Secale cereale) // Студент и научно-технический прогресс: Тез. докл. XLVI международной научной студенческой конференции 26 - 30 апреля 2008 г. – Новосибирск, 2008. - С. 127-128. 9. Khlestkina E.K., Salina E.A., Matthies I., Tereshchenko O.Yu., Leonova I., Börner A., Röder M. Comparative molecular-genetic mapping of flavanone 3-hydroxylase in wheat, rye and barley // Genetics – understanding living system: Abstract book of XX international congress of genetics 12-17 July 2008. – Berlin, 2008. – P.178. 10. Хлесткина Е.К., Терещенко О.Ю., Салина Е.А. Экспрессия генов защитной реакции у гибридных форм пшеницы // Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии: второе чтение, 17 посвященное памяти В.И. Корогодина и В.А. Шевченко 12 – 13 января 2009 г. – Дубна – Москва, 2009. – С. 103. 11. Терещенко О.Ю., Хлесткина Е.К., Салина Е.А. Гены биосинтеза антоцианов ржи (Secale cereale), их локализация и особенности функционирования у ржи и пшенично-ржаных гибридов // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со Дня рождения Ч. Дарвина: Тез. докл. V съезда генетиков и селекционеров 21 - 28 июня 2009 г. - Москва, 2009. - С. 336. 12. Хлесткина Е.К., Терещенко О.Ю., Салина Е.А. Структурно-функциональная организация генов биосинтеза флавоноидов в сложных геномах // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со Дня рождения Ч. Дарвина: Тез. докл. V съезда генетиков и селекционеров 21 - 28 июня 2009 г. - Москва, 2009. - С. 356. 13. Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Y., Pshenichnikova T.A., Arbuzova V.S., Röder M.S., Börner A., Salina E.A. Flavonoid biosynthesis genes in wheat: genome location and function // Abstr. 8th International wheat conference 1 - 4 June 2010. - St.Peterburg, 2010. - P.449. 14. Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Gene expression upon genome complexification: studies on flavonoid biosynthesis genes in wheat and wheat-alien hybrids // Plant genetics, genomics and biotechnology: Proceedings of the international conference 7 – 10 June 2010. – Novosibirsk, 2010. – P. 34. 15. Adonina I.G., Orlovskaya O.A., Tereshchenko O.Yu., Koren L.V., Khotyleva L.V., Salina E.A. Introgression of Aegilops genetic material into the genome of hexaploid triticale and influence of genome structure on formation of economic-valuable traits // Plant genetics, genomics and biotechnology: Proceedings of the international conference 7 – 10 June 2010. – Novosibirsk, 2010. – P. 48. 16. Tereshchenko O.Yu., Khlestkina E.K., Gordeeva E.I., Arbuzova V.S., Salina E.A. Biosynthesis of flavonoids under salinity stress in Triticum aestivum L. // Plant genetics, genomics and biotechnology: Proceedings of the international conference 7 – 10 June 2010. – Novosibirsk, 2010. – P. 84. 17. Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Salina E.A Regulatory-target gene relationships in Triticeae allopolyploid and hybride genomes // Abstracts of the seventh international conference on bioinformatics of genome regulation and structure/systems biology 20 – 27 June 2010. – Novosibirsk, 2010. – P.131. 18. Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Flavonoid biosynthesis genes in wheat and wheatalien hybrids: studies into gene regulation in plants with complex genomes // Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution: Abstr. and papers by young scientists of Third International Conference, Dedicated to N.W.Timofeeff-Ressovsky 9-14 October 2010. - Alushta, 2010. P.17. 19. Адонина И.Г., Орловская О.А., Терещенко О.Ю., Корень Л.В., Хотылева Л.В., Салина Е.А. Генотипирование линий тритикале, полученных от скрещивания с геномно-замещенными формами мягкой пшеницы. Формирование хозяйственно-ценных признаков в зависимости от структуры генома // Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий: Сборник тезисов международной научной конференции 25 – 29 октября 2010. - Минск, 2010. - С. 28. 20. Tereshchenko O.Yu., Khlestkina E.K., Leonova I.N., Berges H., Tatkov S.I., Salina E.A. Homoeologous chalcone flavanone isomerase genes in allohexaploid wheat // Wheat genetic resources and genomics: Abstracts of the international conference 28 August – 1 September 2011. – Novosibirsk, 2011. – P. 40. 21. Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Arbuzova V.S., Börner A., Pershina L.A., Salina E.A. A new range of wheat precise genetic stocks application: insights into gene function // Abstracts of the 15th EWAC Conference 7 – 11 November 2011. - Novi Sad, Serbia, 2011. - P.12. 22. Tereshchenko O.Yu., Khlestkina E.K., Gordeeva E.I., Arbuzova V.S., Salina E.A. Relationship between anthocyanin biosynthesis and abiotic stress in wheat // Abstracts of the 15th EWAC Conference 7 – 11 November 2011. - Novi Sad, Serbia, 2011. - P. 26. 23. Терещенко О.Ю., Гордеева Е.И., Арбузова В.С., Хлесткина Е.К. Генетические основы и роль в стрессоустойчивости признаков антоциановой окраски у изогенных линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) // Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях: Тез. II Международной школы-конференции молодых учёных 5 – 10 декабря 2011. – Москва-Звенигород, 2011. – С. 69. 18
