Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук На правах рукописи Петрова Надежда Васильевна Молекулярные механизмы индуцированного тепловым стрессом клеточного старения Специальность 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н. Кантидзе О.Л. Москва 2015 2 Оглавление 1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................ 5 2. ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................ 7 3. 2.1. АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ .............................................................................................. 7 2.2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ............................................................................................... 8 2.3. НОВИЗНА И НАУЧНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ .............................................................. 8 2.4. ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА .............................................................................................. 9 2.5. МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................ 9 2.6. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ ................................................................... 10 2.7. СТЕПЕНЬ ДОСТОВЕРНОСТИ И АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................... 10 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................. 12 3.1. КЛЕТОЧНОЕ СТАРЕНИЕ ............................................................................................... 13 3.2. ПРИЧИНЫ АКТИВАЦИИ КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ....................................................... 17 3.2.1. Разворачивание теломерной петли ..................................................................... 18 3.2.3. Клеточное старение, вызванное повреждением ДНК ...................................... 20 3.2.4. Клеточное старение, индуцированное ионизирующей радиацией ................... 21 3.2.5. Клеточное старение, индуцированное ультрафиолетом ................................. 22 3.2.6. Клеточное старение и активные формы кислорода ........................................ 24 3.2.7. Клеточное старение, индуцированное гипоксией .............................................. 25 3.2.8. Клеточное старение, вызванное сверхэкспрессией онкогенов ......................... 26 3.2.9. Низкомолекулярные соединения, вызывающие клеточное старение .............. 28 3.3. ВЛИЯНИЕ ГИПЕРТЕРМИИ НА КЛЕТОЧНУЮ ПРОЛИФЕРАЦИЮ ..................................... 34 3.4. ПОВРЕЖДАЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ ТЕПЛОВОГО СТРЕССА .................................................. 35 3.4.1. Изменение структуры и локализации белков ..................................................... 36 3.4.2. Регуляция экспрессии генов при тепловом стрессе........................................... 37 3.4.3. Нарушение целостности ДНК ............................................................................. 39 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ......................................................................................... 41 4.1. МАТЕРИАЛЫ ............................................................................................................... 41 4.2. МЕТОДЫ ...................................................................................................................... 43 3 4.2.1. Культивирование клеток человека и синхронизация двойным тимидиновым блоком ................................................................................................................................ 43 4.2.2. Тепловой стресс и обработка химическими агентами ..................................... 43 4.2.3. Включение аналогов нуклеотидов ........................................................................ 44 4.2.4. РНК-интерференция ............................................................................................. 44 4.2.5. Иммуноцитохимия и микроскопия ...................................................................... 44 4.2.6. Совместное иммунофлуоресцентное окрашивание против белка TRF2 и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с пробой к теломерным повторам .... 45 4.2.7. Измерение активности β-галактозидазы .......................................................... 46 4.2.8. Выделение РНК ...................................................................................................... 46 4.2.9. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени ....................................... 47 4.2.10. Приготовление белковых экстрактов и вестерн-блот гибридизация ........ 47 4.2.11. Проточная цитофлуориметрия ...................................................................... 48 4.2.12. Нейтральный гель-электрофорез одиночных клеток (метод ДНК-комет) 48 4.2.13. Определение активности ДНК-топоизомеразы I (метод релаксации плазмидной ДНК) .............................................................................................................. 49 4.2.14. K+-ДСН-преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов............... 50 4.2.15. Преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов этанолом (RADAR) 51 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................. 52 5.1. ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС ИНДУЦИРУЕТ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЕ СТАРЕНИЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА 52 5.2. ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЕ СТАРЕНИЕ, ИНДУЦИРОВАННОЕ ТЕПЛОВЫМ СТРЕССОМ, РАЗВИВАЕТСЯ ПО P21-ЗАВИСИМОМУ ПУТИ .......................................................................... 54 5.3. ТОЛЬКО КЛЕТКИ, НАХОДЯЩИЕСЯ В РАННЕЙ S-ФАЗЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА В МОМЕНТ ТЕПЛОВОГО СТРЕССА, ПРИОБРЕТАЮТ ФЕНОТИП КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ .......................... 55 5.4. ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЕ СТАРЕНИЕ, ИНДУЦИРОВАННОЕ ТЕПЛОВЫМ СТРЕССОМ, ОСТАНАВЛИВАЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК В G2-ФАЗЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА .................... 57 5.5. ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС ИНДУЦИРУЕТ ПЕРСИСТИРУЮЩИЕ СИГНАЛЫ О ПОВРЕЖДЕНИЯХ ДНК ТОЛЬКО В КЛЕТКАХ, НАХОДЯЩИХСЯ В РАННЕЙ S-ФАЗЕ ............................................. 58 5.6. В РЕЗУЛЬТАТЕ ТЕПЛОВОГО СТРЕССА ВОЗНИКАЮТ ДВЕ ВОЛНЫ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ГИСТОНА H2AX, ОСУЩЕСТВЛЯЕМОГО РАЗНЫМИ КИНАЗАМИ ............................................. 60 4 5.7. ИНДУЦИРОВАННАЯ ТЕПЛОВЫМ СТРЕССОМ ДИССОЦИАЦИЯ TRF2 НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ИСТОЧНИКОМ СИГНАЛОВ О ПОВРЕЖДЕНИИ ДНК................................................................. 63 5.8. ИНГИБИРОВАНИЕ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫ I ПРИВОДИТ К ПРЕЖДЕВРЕМЕННОМУ СТАРЕНИЮ КЛЕТОК, НАХОДЯЩИХСЯ В РАННЕЙ S-ФАЗЕ ...................................................... 65 5.9. ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС ИНГИБИРУЕТ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗУ I В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА .. 67 5.10. ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗА I НЕОБХОДИМА ДЛЯ РАЗВИТИЯ ИНДУЦИРОВАННОГО ТЕПЛОВЫМ СТРЕССОМ КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ................................................................... 69 5.11. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК НЕОБХОДИМА ДЛЯ ИНДУКЦИИ КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ, ВЫЗВАННОГО ТЕПЛОВЫМ СТРЕССОМ ИЛИ ДЕЙСТВИЕМ КАМПТОТЕЦИНА ........................... 70 5.12. ДВУЦЕПОЧЕЧНЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК ЯВЛЯЮТСЯ ИСТОЧНИКОМ ПЕРСИСТИРУЮЩИХ СИГНАЛОВ О ПОВРЕЖДЕНИЯХ ДНК ...................................................................................... 72 5.13. ФОРМИРОВАНИЕ ПЕРСИСТИРУЮЩИХ СИГНАЛОВ О ПОВРЕЖДЕНИЯХ ДНК, ИНДУЦИРОВАННЫХ ТЕПЛОВЫМ СТРЕССОМ, ЗАВИСИТ ОТ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ И ПРОТЕОСОМНОЙ АКТИВНОСТЕЙ ............................................................................................ 74 5.14. ОСНОВНОЙ ПРИЧИНОЙ ИНДУКЦИИ ГЕНОТОКСИЧЕСКИМ СТРЕССОМ КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ, ЯВЛЯЮТСЯ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РАЗРЫВЫ .......................................................... 77 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................................................................. 79 7. ВЫВОДЫ ......................................................................................................................... 80 8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................ 81 5 1. Список сокращений AP-сайты апуриновые/апиримидиновые сайты ДНК APH афидиколин - ингибитор эукариотической ДНК-полимеразы α BER эксцизионная репарация оснований (от англ. base excision repair) BrdU 5-бромо-2´-дезоксиуридин CPT камптотецин - ингибитор ДНК-топоизомеразы I DAPI 4,6-диамидино-2-фенилиндол DDR клеточный ответ на повреждения ДНК (от англ. DNA damage response) DMEM модифицированная Дульбекко среда Игла (от англ. Dulbecco modified Eagle medium) DNA-PK ДНК-зависимая протеинкиназа EdU 5-этинил-2´-дезоксиуридин HR гомологичная рекомбинация (от англ. homologous recombination) HU гидроксимочевина - ингибитор рибонуклеотидредуктазы HSPs белки теплового шока (от англ. heat shock proteins) NER эксцизионная репарация нуклеотидов (от англ. nucleotide excision repair) NHEJ негомологичное соединение концов ДНК (от англ. non-homologous end joining) OIS клеточное старение, индуцированое оверэкспрессией онкогенов (от англ. oncogene-induced senescence) PBS фосфатно-солевой буфер PIKK фосфатидилинозитол-3-киназоподобные киназы PMSF Фенилметилсульфонилфлуорид RADAR преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов этанолом (от англ. rapid approach to DNA adduct recovery) SA-β-Gal фермент β-галактозидаза, связанная с клеточным старением (от англ. senescence associated β-galactosidase) SAHF фокусы гетерохроматина, ассоциированные с клеточным старением 6 (от англ. senescence-associated heterochromatin foci) SA-miRNAs микроРНК, участвующие в регуляции клеточного старения (от англ. senescence-associated miRNAs) SASP секреторный фенотип, ассоциированный с клеточным старением (от англ. senescence-associated secretory phenotype) SINE короткие диспергированные повторы (от англ. short interspersed elements) 5-FU 5’-флуороурацил АФК активные формы кислорода БСА бычий сывороточный альбумин ДМСО Диметилсульфоксид дНТФ Дезоксирибонуклеозидтрифосфат ДСН додецилсульфат натрия ДТТ Дитиотриэтол ДЦР двухцепочечный разрыв ДНК миРНК малые интерферирующие РНК ОЦР одноцепочечный разрыв ДНК ПЦР полимеразная цепная реакция т.п.н. тысяч пар нуклеотидов ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота 7 2. Введение 2.1. Актуальность работы Постоянно меняющиеся условия окружающей среды оказывают воздействие на функционирование живых систем и зачастую воспринимаются ими как стресс. Изучение молекулярных механизмов клеточного ответа на стресс является одним из важных направлений исследования современной молекулярной и клеточной биологии. Изучение механизмов, лежащих в основе клеточной адаптации, систем репарации возникающих повреждений ДНК и регуляции клеточной пролиферации в стрессовых условиях имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. В современных исследованиях большое внимание уделяется изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе индуцированного стрессом клеточного старения. В современном понимании проявление клеточного старения не ограничивается клеточным уровнем в модельных экспериментах in vitro. Раскрытие механизмов клеточного старения представляется важным для понимания причин и механизмов старения организма в целом [1]. Кроме того, феномен клеточного старения имеет тесную взаимосвязь со злокачественным перерождением клеток [2]. Клеточное старение представляет собой необратимый арест пролиферации [3]. Развитие клеточного старения может вызываться как эндогенными, так и экзогенными стимулами [3]. Классическим примером является репликативное старение, известное как предел Хайфлика, вызванное укорочением длины хромосом (теломер) с каждым последующим раундом деления клетки [4,5]. Универсальной схемы развития клеточного старения нет. Механизм развития клеточного старения зависит от рода стрессового фактора и клеточной линии. Для некоторых стрессовых факторов механизмы активации клеточного старения не известны. В частности, совершенно не исследованы механизмы активации и поддержания клеточного старения, индуцируемого тепловым стрессом. Настоящая диссертационная работа посвящена изучению молекулярных механизмов индуцированного тепловым стрессом клеточного старения. Хотя данная работа имеет четко выраженный фундаментальный характер, полученные результаты могут иметь и определенное практическое приложение. Исследование механизмов индуцированного тепловым стрессом клеточного старения позволило сформулировать обобщенную модель индукции преждевременного старения клеток, находящихся на стадии ранней S- 8 фазы клеточного цикла. Предложенная модель индукции клеточного старения оказалась справедливой и для некоторых низкомолекулярных соединений, в частности, для ингибитора ДНК-топоизомеразы I камптотецина, производные которого активно используются в химиотерапии опухолей. Интересно, что для индукции клеточного старения «ранне-S-фазных» клеток достаточно экстремально малых доз камптотецина. Этот факт может послужить основой для разработки новых и оптимизации существующих химиотерапевтических протоколов. 2.2. Цели и задачи работы Целью настоящей работы было изучение механизмов, лежащих в основе индуцированного тепловым стрессом преждевременного клеточного старения. Для реализации поставленной цели были определены следующие экспериментальные задачи: 1. Определить, приводит ли тепловой стресс к преждевременному старению человеческих клеток нормального и ракового происхождения; 2. Выявить сигнальный путь, играющий основную роль в запуске и поддержании программы клеточного старения; 3. Установить, являются ли двуцепочечные разрывы ДНК причиной запуска клеточного старения, индуцированного тепловым стрессом; 4. Определить природу формирования двуцепочечных разрывов ДНК. 2.3. Новизна и научная значимость работы В диссертационной работе продемонстрировано, что острый тепловой стресс индуцирует клеточное старение в нормальных и раковых клетках человека по p21CIP1/WAF1-зависимому пути. Показано, что развитие клеточного старения зависит от стадии клеточного цикла и происходит только в клетках, находящихся в ранней S-фазе в момент действия теплового стресса. Обоснована модель, описывающая механизм активации тепловым стрессом клеточного старения. Согласно этой модели, причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК, связанные с образованием сложнорепарируемых двуцепочечных разрывов ДНК (ДЦР). При тепловом стрессе ДЦР образуются в 9 результате столкновения вилок репликации ДНК с одноцепочечными разрывами ДНК (ОЦР), которые образуются вследствие ингибирования тепловым стрессом ДНКтопоизомеразы I. Впервые показано, что, подобно химиотерапевтическому агенту камптотецину, тепловой стресс ингибирует ДНК-топоизомеразу I на стадии внесения одноцепочечного разрыва в ДНК. Продемонстрировано, что предложенная модель активации клеточного старения тепловым стрессом справедлива не только для теплового стресса, но и для повреждающих ДНК химических соединений. 2.4. Личный вклад автора Диссертационная работа основана на собственных данных, полученных автором в период с 2012 по 2015 гг. В ходе работы автором проведены эксперименты, демонстрирующие проявление основных признаков клеточного старения в клетках после воздействия теплового стресса. Автор показал, что клеточное старение, индуцированное тепловым стрессом, развивается по p21-зависимому пути и характеризуется арестом пролиферации на стадии G2 клеточного цикла. Было установлено, что причиной индукции клеточного старения тепловым стрессом являются возникающие персистирующие сигналы о повреждении ДНК, не связанные с нарушением структуры теломер. Автор участвовал в проведении совместных экспериментов по доказательству предложенного механизма индукции клеточного старения тепловым стрессом. 2.5. Методология и методы исследования Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной и клеточной биологии. За время выполнения диссертационной работы автором освоен и использован широкий спектр методов, включающих методики молекулярного клонирования, флуоресцентной гибридизации, иммуноцитохимического окрашивания, вестерн-блот анализа, ПЦР в реальном времени, РНК-интерференции и др. 10 2.6. Положения, выносимые на защиту 1. Тепловой стресс индуцирует преждевременное старение нормальных и раковых клеток человека. 2. Причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК, которые связаны с образованием сложнорепарируемых ДЦР. 3. ДЦР, индуцированные тепловым стрессом, образуются в результате столкновения вилок репликации ДНК с ОЦР, возникшими вследствие ингибирования тепловым стрессом ДНК-топоизомеразы I. 4. Для индукции преждевременного старения клеток, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла, достаточно возникновения небольшого количества ОЦР любого происхождения. 2.7. Степень достоверности и апробация результатов Результаты работы были опубликованы в рецензируемых научных журналах (Nucleic Acids Res, Cell Mol Life Sci, Cell Biol Int) и представлены автором на международных конференциях. Публикации: 1. Velichko A.K.*, Petrova N.V.*, Razin S.V., Kantidze O.L. (2015) Mechanism of heat stress-induced cellular senescence elucidates the exclusive vulnerability of early S-phase cells to mild genotoxic stress. Nucleic Acids Res 43(13):6309-6320 *вклад авторов в работу является равным 2. Petrova N.V., Velichko A.K., Kantidze O.L., Razin S.V. (2014) Heat shock-induced dissociation of TRF2 from telomeres does not initiate a telomere-dependent DNA damage ёresponse. Cell Biol Int 38(5):675-681 3. Velichko A.K., Markova E.N., Petrova N.V., Razin S.V., Kantidze O.L. (2013) Mechanisms of heat shock response in mammals. Cell Mol Life Sci 70(22):4229-4241 Материалы конференций: 1. Petrova N.V., Velichko A.K., Razin S.V., Kantidze O.L. Dual role of γH2AX in heat shock response. XVth Gliwice Scientific Meeting, November 16-17 2012, Gliwice, Poland; 11 2. Petrova N.V., Velichko A.K., Razin S.V., Kantidze O.L. Dual effect of heat shock on DNA replication and genome integrity. Offspring-Meeting of the International Research Training Group GieBen/Marburg, June 26-29 2013, Moscow, Russia; 3. Petrova N.V., Velichko A.K., Kantidze O.L., Razin S.V. Heat shock-induced dissociation of TRF2 from telomeres does not initiate a telomere-dependent DNA damage. Workshop «Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology» of the International Research Training Group GieBen/Marburg, September 17-20 2013, SaintPetersburg, Russia. 12 3. Обзор литературы Механизмы ответа эукариотической клетки на стресс изучаются достаточно давно. Одним из примеров наиболее агрессивных типов стресса является тепловой стресс (тепловой шок, гипертермия). Среди наиболее значимых открытий, сделанных в ходе изучения механизмов клеточного ответа на тепловой стресс, можно выделить обнаружение белков теплового шока (HSPs) [6,7] и раскрытие принципов индуцированного тепловым стрессом изменения транскрипции генов, контролируемых специфическими транскрипционными факторами и различными типами РНК [8-10]. В прикладном аспекте онкологических гипертермию заболеваний. стали Было использовать показано, что в лечении некоторых гипертермия улучшает кровоснабжение и оксигенацию опухолей, и тем самым способствует более эффективному действию радио- и химиотерапии [11-13]. На клеточном уровне острый тепловой стресс ингибирует клеточную пролиферацию и индуцирует гибель клеток [14]. Таким образом, с точки зрения фундаментального и прикладного значения характеристика молекулярных механизмов клеточного ответа на тепловой стресс была и остается интересной областью исследований. Накопленные за несколько десятилетий знания о тепловом стрессе свидетельствуют, что он оказывает повреждающее действие практически на все клеточные компоненты [15]. При тепловом стрессе происходит подавление процессов макромолекулярного синтеза, денатурация и агрегация белков, дестабилизация систем регуляции клеточного цикла, нарушение процессов сплайсинга, репарации и репликации ДНК и др. [7,16]. Несмотря на то, что о механизмах клеточного ответа на тепловой стресс достаточно много известно, в данной области все же остаются белые пятна. Это связано с тем, что основное внимание исследователей было сконцентрировано на краткосрочных эффектах теплового стресса, наблюдаемых в первые часы после воздействия. Считается, что в течение этого периода происходит либо полное восстановление жизнеспособности клеток, либо их гибель [17]. С точки зрения отставленных во времени эффектов, наиболее интересным представлялся вопрос о возможности индукции сублетальным тепловым стрессом преждевременного клеточного старения. Наши предварительные данные, а также данные наших коллег [18,19], свидетельствуют о том, что тепловой стресс 13 действительно способен запускать программу преждевременного старения клеток человека. В частности, было показано, что сублетальный тепловой стресс индуцирует преждевременное старение нормальных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток человека [18,19]. Стоит отметить, что механизм зависимого от теплового стресса клеточного старения остался совершенно не ясен. В данной работе, мы попытались ответить на два принципиальных вопроса: во-первых, ограничен ли феномен индуцированного гипертермией клеточного старения только нормальными клетками человека (стволовыми клетками и фибробластами) или же может проявляться и в клетках ракового происхождения, и, во-вторых, каков механизм активации, развития и поддержания клеточного старения, индуцированного тепловым стрессом? 3.1. Клеточное старение Пионерскими работами в области клеточного старения являются эксперименты Л. Хайфлика на первичной культуре клеток человека. Было продемонстрировано, что клетки имеют ограниченный пролиферативный потенциал и через определенное количество делений наступает так называемое «клеточное старение» [4,5]. С тех пор в научном сообществе закрепилось понятие «предела Хайфлика», определяющее предельное количество делений соматических клеток. Этому явлению было дано элегантное теоретическое объяснение, высказанное независимо друг от друга А. Оловниковым (1971) и Д. Уотсоном (1972), и описанное как «проблема концевой репликации хромосом» [20,21]. Согласно данной теории, с каждым раундом деления клетки должно происходить укорочение хромосом, так как ДНК-полимеразы не способны полностью реплицировать концы линейных молекул ДНК. Чтобы предотвратить нарушение целостности кодирующих областей ДНК, на концах хромосом расположены теломерные последовательности (теломеры) - блоки некодирующих тандемных повторов ДНК. Укорочение теломер служит сигналом к остановке пролиферации. Экспериментальные подтверждения гипотезы «теломерных молекулярных часов» были получены гораздо позже в работах К. Херли и А. Боднар с соавторами [22,23]. Последовавший шквал работ, направленных на изучение клеточного старения, выявил общность данного феномена для клеточных популяций in vitro и in vivo [24,25]. Была выявлена корреляция между клеточным старением и старением организма [1]. 14 Более того, было продемонстрировано, что причиной пролиферативного ареста и последующего развития клеточного старения может быть не только укорочение теломер, но и воздействие широкого спектра стрессовых факторов, таких как повреждение ДНК, окислительный стресс, активация онкогенов, недостаток факторов роста, химические агенты [26,27]. В зависимости от природы индуктора в научной литературе принято обособлять репликативное старение от стресс-индуцированного, которое также принято называть преждевременным клеточным старением. Тем не менее, преждевременное клеточное старение по биохимическим и морфологическим признакам имеет много общего с репликативным. Накопленные экспериментальные данные дают основание утверждать, что клеточное старение является одной из программ клеточного ответа на негативные внешние или внутренние стимулы и его можно рассматривать в одной связке с такими процессами как апоптоз, аутофагия, некроз и др. Как для процесса, глобально меняющего программу развития клеток, для клеточного старения характерны определенные признаки. Некоторые из этих признаков являются универсальными, другие – дополнительными, зависящими от природы индуцирующего стрессового фактора и клеточной линии [3]. К основным признакам клеточного старения относят: (1) Изменения морфологии клеток. Клетки увеличиваются в размерах и уплощаются, диаметр ядер возрастает в несколько раз; также может увеличиваться количество ядер в клетке. Аппарат Гольджи становится более выраженным, иногда наблюдается сильная вакуолизация цитоплазмы [28,29 ]. (2) Увеличение активности фермента β-галактозидазы, связанной с клеточным старением (SA-β-Gal) при значении рН 6.0 [30]. В норме фермент β-галактозидаза локализована в лизосомах и работает при кислых значениях рН 4.0. По современным представлениям проявление активности SA-β-Gal в субоптимальном значении рН 6.0 связано с увеличением содержания лизосом или повышением активности βгалактозидазы в стареющих клетках [31-33]. (3) Повышение уровня экспрессии ингибиторов циклин-зависимых киназ, что приводит к аресту клеточной пролиферации. Наиболее характерными для клеточного старения являются ингибиторы циклин-зависимых киназ р16INK4a и p21CIP1/WAF1 [26,34]. Множество экспериментальных данных указывает на то, что р16 INK4a и p21CIP1/WAF1 работают независимо друг от друга и участвуют в развитии двух альтернативных 15 сигнальных каскадов. Первый обозначают как р16INK4a-рRb, второй как р53-p21CIP1/WAF1, подчёркивая важные функциональные роли белков ретинобластомы (рRb) и р53 в развитии этих сигнальных путей. Экспрессия р16INK4a и p21CIP1/WAF1 индуцирует арест пролиферации клеток на стадиях G1 или G2 клеточного цикла [35,36] (Рисунок 1). Рисунок 1. В ответ на стрессовые воздействия в клетках возрастает экспрессия циклинзависимых киназ. р21 и р16. Активация р21 может происходить р53-зависимым или независимым путем. р21 блокирует прохождение клеточного цикла через G1- и G2-фазы, связываясь с комплексами CDK1,2/циклинами А, В и Е, отвечающих за G1/S- и G2/M-переходы. р16 блокирует образование комплексов между циклинзависимыми киназами CDK4,6 и циклином D1, в результате чего ингибируется фосфорилирование белка ретинобластомы Rb и высвобождение транскрипционного фактора E2F, необходимого для начала S-фазы. Помимо перечисленных белков существуют и другие ингибиторы циклинзависимых киназ, которые могут участвовать в развитии фенотипа клеточного старения: p19ARF, p27KIP1, p57KIP2 и p15INK4b; однако их роль продемонстрирована не во всех случаях активации программы клеточного старения [37-41]. Остальные признаки клеточного старения являются дополнительными и, скорее, помогают определить природу стрессового фактора, индуцирующего клеточное старение. Одной из распространённых причин активации программы клеточного старения являются сигналы о повреждении ДНК [42]. В результате нарушения целостности ДНК происходит активация систем репарации (DDR, DNA damage-response) и привлечение в сайты повреждения репарационных белков. Многие репарационные белки, такие как γH2AX, 53BP1, MDC1, NBS1, MRE11 и RAD17, концентрируются в так называемых фокусах репарации, которые могут быть выявлены при иммуноокрашивании клеток соответствующими антителами [43,44]. Присутствие персистирующих репарационных фокусов в клетках может быть предпосылкой для развития фенотипа клеточного старения [42]. В ядрах состарившихся клеток наблюдается формирование областей конденсированного хроматина, получивших название фокусов гетерохроматина, 16 ассоциированных с клеточным старением (SAHF, senescence-associated heterochromatin foci) [45-47]. Цитологически, очаги гетерохроматизации выявляются с помощью интеркалирующего красителя ДНК DAPI. Формирование SAHF сопровождается общим увеличением устойчивости к нуклеазам [45], аккумуляцией белков-маркеров транскрипционно неактивного хроматина - гистона Н3 триметилированного по лизину 9 (H3K9me3), белка гетерохроматина 1 (HP1), гистона macroH2A и некоторых других [4547]. Недавно было показано, что структурной основой SAHF могут быть открепившиеся от ламины в ходе клеточного старения участки генома, ассоциированные с ламиной (LADs, lamina-associated domains) [48]. Известно, что основными индукторами клеточного старения, при котором происходит формирование SAHF, являются сверхэкспрессия онкогенов и ряд генотоксических ядов [45,49]. Стоит добавить, что формирование SAHF происходит далеко не во всех типах клеточных линий и зависит от природы индуцирующего клеточное старение агента [49]. Развитие клеточного старения, при котором наблюдается формирование SAHF происходит в основном по р16INK4a-зависимому пути [49]. Несмотря на пролиферативный арест «стареющие» клетки сохраняют высокую метаболическую активность. Одним из показателей такой активности является специфический секреторный фенотип (SASP, senescence-associated secretory phenotype) [50]. Считается, что секреция биоактивных молекул, таких как цитокины, хемокины и интерлейкины, обеспечивает паракринное общение клеток между собой и активирует воспалительный ответ внутри организма для ликвидации клеток, проявляющих признаки клеточного старения [51]. Особенностью SASP является его динамическое развитие с первым заметным проявлением через несколько суток после активации программы клеточного старения [52]. В активации SASP принимают участие MAPK-, mTOR- и DDR-сигнальные пути [53-55]. Сравнительный анализ экспрессии микроРНК нормальных клеток и клеток с признаками клеточного старения, выявил несколько десятков микроРНК, потенциально участвующих в регуляции клеточного старения (SA-miRNAs, senescence-associated miRNAs) [56,57]. Однако, однозначной корреляции между данными, полученными в независимых экспериментах, нет. Достоверно воспроизводятся изменение экспрессии только четырех SA-miRNAs: miR-146a, -34а, -29 и -15а [58-68]. Известно, что miR-146a подавляет индукцию SASP [66,67], сверхэкспрессия miR-34а регулируется р53 [62,69] и 17 приводит к ингибированию E2F-сигнального пути [60], также как и сверхэкспрессия miR-15а [70]; miR-29 подавляет экспрессию транскрипционного фактора B-Myb, необходимого для нормального прохождения клеточного цикла [65]. К группе некодирующих РНК, участвующих в регуляции клеточного старения, относится недавно обнаруженная длинная некодирующая РНК PANDA [71]. В комплексе с белками Polycomb PANDA подавляет развитие клеточного старения путем репрессии транскрипционного фактора NF-YA [71]. Следует добавить, что масштабная реорганизация метаболизма «стареющих» клеток сопровождается и другими событиями. Отмечено, что изменяется протеом внеклеточного матрикса [72,73], в ряде случаев увеличивается экспрессия виментина и фибронектина [74,75], коллагеназы [76,77], нарушается структура ядерной ламины [78,79], претерпевает серьёзную перестройку архитектура ядра [80,81], увеличивается транскрипция ретротраспозонов [82,83], изменяется общий эпигенетический статус хроматина [84]. Все перечисленные признаки являются следствиями активации программы клеточного старения и развиваются в соответствии с природой индуцирующего стрессового фактора (факультативных) и клеточной признаков линией. клеточного Широкий старения спектр говорит необязательных о разнообразии биохимических каскадов, участвующих в развитии и поддержании фенотипа клеточного старения. Ниже мы попытаемся обобщить существующие сведения о возможных механизмах индукции и развития клеточного старения. 3.2. Причины активации клеточного старения После экспериментов Л. Хайфлика и П. Мурхеда [4] возникли две точки зрения о причинах остановки пролиферации нормальных клеток [85]. Согласно первой гипотезе, существуют внутренние механизмы, определяющие предельное количество делений клеток. Согласно второй, ставившей под сомнение существование «предела Хайфлика», культивируемые клетки прекращают свое деление в результате накопления повреждений, вызванных физиологическими стрессами [86]. Две гипотезы впоследствии нашли свои подтверждения в открытии эндогенных и экзогенных факторов, активирующих программу клеточного старения. 18 3.2.1. Разворачивание теломерной петли Укорочение длины теломер было первым феноменом, обратившим на себя внимание в качестве внутреннего активатора развития репликативного старения [22]. В 1984 году К. Грейдер и Э. Блэкберн, работая на инфузории Tetrahymena thermophila, обнаружили фермент теломеразу, которая достраивает одноцепочечную 3'-цепь ДНК (G-цепь) [87]. В результате действия теломеразы образуется достаточно длинный выступающий одноцепочечный 3'-конец ДНК, который используется в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи ДНК [87]. Таким образом, происходит увеличение общей длины теломерных участков хромосом. Позднее было продемонстрировано, что в соматических клетках в норме теломераза отсутствует, в то время как ее активность присутствует в иммортализованных и большинстве раковых клеток [88,89]. Эти данные подтверждали концепцию «теломерных молекулярных часов». Измерения длины теломер в отдельных клетках и в популяции делящихся клеток продемонстрировали, что существует большая вариабельность в их длине [90-92]. В связи с этим возникло предположение, что для индукции клеточного старения синхронное укорочение всех хромосом не является необходимым, а достаточно нарушения целостности отдельных теломер [90,93,94]. С помощью гибридизации олигонуклеотидов к 3'-выступающему участку теломер было показано, что для запуска клеточного старения важна не общая длина теломер, а средняя длина 3'-выступающего участка отдельных хромосом [94,95] и присутствие специфических белков в теломерных участках [96]. Электронно-микроскопические исследования Д. Гриффита с соавторами, продемонстрировали, что теломеры организованы в так-называемые t-петли (t-loop) [97]. Формирование t-петли зависит от наличия 3'-выступающего одноцепочечного участка ДНК длиной 50-200 нуклеотидов, который гибридизуется с вышележащим двуцепочечным повтором, вытесняя одну из цепей [97] (Рисунок 2). Укорочение одноцепочечного 3'-концевого участка может приводить к разворачиванию t-петли и служить активатором клеточного старения [95]. Важную роль в организации t-петли играют белки шелтеринового комплекса, которые защищают теломеры от нежелательного действия репаративных систем и регулируют активность теломеразы [98-100]. В клетках млекопитающих в состав шелтеринового комплекса входят шесть 19 Рисунок 2. Теломеры млекопитающих длиной 2-30 т.п.н. состоят из повторов TTAGGG и организованы в t-петлю. Образование t-петли происходит в результате гибридизации 3'-выступающего одноцепочечного участка ДНК с вышележащим двуцепочечным повтором. В поддержании и организации структуры теломер важную роль выполняет белки шелтеринового комплекса: TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, POT1 и TPP1. Дополнительными белками, ассоциированными с теломерами, являются репарационные белки ERCC1/XPF, MRE11, RAD50, NBS1, PINX1, WRN, Tankyrase1/2, активация которых происходит в результате нарушения структуры теломер (адаптировано из [411]). белков: TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, POT1 и TPP1 [101]. Нарушение структуры шелтеринового комплекса приводит к активации клеточного старения. Например, экспрессия в клетках человека мутантной формы белка TRF2, который гетеродимеризуясь с нативным TRF2 блокирует его посадку на ДНК, приводит к возникновению фенотипа клеточного старения [96,102]. Таким образом, более общим феноменом, активирующим программу клеточного старения, является разворачивание теломерной петли, причинами которого могут быть: (1) общее укорочение длины теломер, (2) уменьшение 3'-одноцепочечного участка теломер или (3) нарушение состава или структуры шелтеринового комплекса. Легко представить, что разворачивание теломерной петли приводит к распознаванию конца хромосомы как ДЦР и активации системы репарации ДНК (DDR). Действительно, есть свидетельства того, что активаторами клеточного старения в случае нарушения целостности теломер, являются биохимические каскады DDR [103,104]. Эта модель подтверждается большим количеством работ, демонстрирующих локализацию репарационных белков, таких как γH2AX и 53BP1 на теломерных повторах в клетках, проявляющих фенотип клеточного старения [105,106]. Более того, инактивация белков DDR предотвращает развитие клеточного старения, индуцированного укорочением теломер [103,107,108]. Показано, что белки шелтеринового комплекса ингибируют активность репарационных белков, с некоторыми из которых они могут 20 взаимодействовать напрямую [109-111]. Нарушение структуры комплекса, вызванное отсутствием активных белков TRF2 и POT1, приводит к запуску сигнального каскада DDR в клетках человека [99,107,108,112] и мышей [98,110,113]. Общая схема активации DDR в результате дисфункции теломер представлена на рисунке 3. Рисунок 3. Нарушение структуры теломер, вызванное истощением белков шелтеринового комплекса POT1 или TRF2 приводит к активации киназ ATR или АТМ и фосфорилированию CHK1 или CHK2 соответственно. Эти сигнальные каскады приводят к убиквитин-опосредованной деградации факторов CDC25A в ядре или CDC25C в цитоплазме, необходимых для прохождения G2-фазы клеточного цикла. Более того, арест пролиферации может быть вызван активацией сигнального каскада р53р21 киназами ATR или АТМ (адаптировано из [402]). Таким образом, можно заключить, что индукция репликативного старения происходит в результате нарушения целостности теломер и активации DDR. Одним из эффекторов DDR является белок р53 [114,115], который участвует в регуляции экспрессии p21CIP1/WAF1 [116,117]. Это согласуется с тем, что в развитии клеточного старения, вызванного дисфункцией теломер, основную роль играет p21CIP1/WAF1сигнальный путь, а роль р16INK4a как для человека, так и для мышей представляется спорной [96,103,108]. Стоит отметить, что при репликативном старении может наблюдаться совместная экспрессия белков р16INK4a и p21CIP1/WAF1, которым приписываются разные функциональные роли. Считается, что p21CIP1/WAF1 и р53 играют важную роль в инициации клеточного старения, а р16INK4a необходим для его поддержания [118,119]. Увеличенная экспрессия р16INK4a и p21CIP1/WAF1 ведет к необратимому аресту пролиферации на стадиях G1 [96,99,108] или G2 [112,120] клеточного цикла. 3.2.3. Клеточное старение, вызванное повреждением ДНК Нарушение целостности ДНК, не связанное со структурой теломер, также способно индуцировать клеточное старение [42]. Источниками повреждений ДНК могут быть как 21 экзогенные, так и эндогенные факторы. К первым можно отнести ультрафиолет (УФ), ионизирующую радиацию (ИР), гипертермию, активные формы кислорода (АФК), генотоксические химические вещества, а ко вторым – эндогенные АФК и азотистые соединения, алкилирующие агенты, спонтанный гидролиз и дезаминироние нуклеотидов, ошибки процессов репликации и транскрипции, активацию экспрессии онкогенов и клеточных эндонуклеаз [121,122]. Арест пролиферации и проявление фенотипа клеточного старения наблюдаются при действии ИР [123,124], УФ [125,126], генотоксических соединений [76,127], АФК [128,129], а также в результате активации экспрессии онкогенов [130,131]. 3.2.4. Клеточное старение, индуцированное ионизирующей радиацией ИР является источником различных повреждений ДНК: модифицированных оснований, АР-сайтов (апуриновые/апиримидиновые), одно- (ОЦР) и двуцепочечных разрывов ДНК [132-135]. Ранее считали, что индуцированные ИР повреждения ДНК приводят к апоптозу [136]. Однако, позднее было замечено, что ИР может подавлять клеточную пролиферацию путём индукции клеточного старения. Например, преждевременное клеточное старение индуцируется в культуре клеток нормальных фибробластов человека при 0.1-6 Гр [137], в клетках эндотелия пупочной вены HUVEC при 4.0 Гр [138], в клетках костного мозга мышей при 4 Гр [41], в гемопоэтических клетках мышей при 6.5 Гр [139], в стволовых клетках пульпы человека при 20 Гр [140]. ИР (6.0-10 Гр) индуцирует развитие сходного с клеточным старением фенотипа и в раковых клетках, в том числе в клетках рака молочной железы MCF7 [141,142], в клетках немелкоклеточного рака легкого человека [143] и клетках простаты человека PC-3 [144]. Повреждения ДНК, вызванные ИР, приводят к активации киназ АТМ [145], ATR [146], DNA-PK [147,148] и формированию репарационных фокусов, содержащих белки 53ВР1 [149] и γН2АХ [150]. В результате ИР в течение первых минут начинают формироваться небольшие фокусы γН2АХ, которые приобретают максимальный размер и яркость к 15-60 минутам после стресса [149,151]. В течение суток происходит репарация большинства повреждений ДНК, но в клетках до нескольких недель могут сохранятся персистирующие репарационные фокусы, содержащие белки γН2АХ и 53ВР1 [152]. Есть 22 основания полагать, что именно персистирующие репарационные фокусы являются активаторами развития клеточного старения [153]. Клеточное старение, вызванное ИР, может развиваться как по р53-зависимому, так и p53-независимому пути. В большом количестве работ, было продемонстрировано, что в результате клеточного старения, индуцированного радиацией, происходит накопление фосфорилированной формы белка р53 и ингибитора циклин-зависимых киназ p21CIP1/WAF1 [143,153]. В фосфорилировании р53 при ИР участвует киназа ATM и, возможно, киназа ATR [114]. В клетках, содержащих инактивирующие мутации гена ATM и экспрессирующих hTERT, ИР индуцирует клеточное старение по ATM-независимому пути [154]. Происходящие изменения уровней экспрессии белков р53, p21CIP1/WAF1 и р16INK4a могут быть связаны с активацией MAPK (p38)-сигнального пути [154]. Необходимость р53 для индукции клеточного старения ИР подтверждается тем, что подавление экспрессии р53 предотвращает развитие клеточного старения, вызванного действием радиации [143]. Второй путь развития клеточного старения при обработке клеток ИР зависит от экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ р16INK4a [155]. В некоторых случаях можно наблюдать совместную экспрессию p21CIP1/WAF1 и р16INK4a в клетках после действия ИР [41,123,140,143], что демонстрирует возможность совместной работы двух сигнальных каскадов в индукции клеточного старения радиацией. Стоит добавить, что индукция клеточного старения ИР может быть связана с продукцией АФК [156,157]. Хорошо известно, что клетки, подвергнутые действию малых доз радиации, оказывают воздействие на соседние нормальные клетки: вызывают активацию DDR и продукцию АФК [158]. Данный эффект ИР получил название ненаправленного эффекта «свидетеля» (non-targeted bystander effect). Возникновение сигналов о повреждении ДНК в соседних клетках объясняют индукцией SASP и генерацией активных форм кислорода клетками, в которых ИР активировала программу старения [156,158]. 3.2.5. Клеточное старение, индуцированное ультрафиолетом УФ является мощным генотоксическим агентом [159]. В результате фотохимической реакции [160,161] и мощного окислительного стресса [162,163], индуцированного УФ, происходит изменение структуры нуклеотидов в ДНК [164]. Для удаления поврежденных 23 оснований в клетке существуют системы эксцизионной репарации нуклеотидов и оснований [165,166], работа которых связана с внесением разрывов в цепь ДНК. УФ также приводит к возникновению АР-сайтов, ОЦР и ДЦР [167,168]. Они возникают в следствие коллапса вилок репликации [169], неэффективной или некорректной работы систем эксцизионной репарации [170,171] или в результате действия АФК [172] (Рисунок 4). Повреждения ДНК, индуцированные УФ приводят к формированию репарационных фокусов, содержащих белки γН2АХ, NBS1, Rad51, XPA [173,174]. Рисунок 4. Ультрафиолет (УФ), ионизирующая радиация (ИР) и активные формы кислорода (АФК) являются причиной возникновения различных повреждений ДНК: модифицированных нуклеотидов, АРсайтов, одноцепочечных (ОЦР) и двуцепочечных (ДЦР) разрывов ДНК. АР-сайты, ОЦР и ДЦР возникают в следствии активации эндонуклеаз систем эксцизионной репарации ДНК (NER и BER). Дополнительной причиной возникновения ОЦР и ДЦР являются свободные радикалы, которые могут ингибировать разрешение комплексов между ДНК и ДНК-топоизомеразами. В клетках, находящихся в S-фазе, основными причинами возникновения ДЦР являются стресс-индуцированный коллапс вилок репликации LYR и конверсия ОЦР в ДЦР при прохождении репликативной машины (РМ) через ОЦР (адаптировано из [412]). Высокие дозы УФ обычно индуцируют апоптоз [175,176], низкие дозы – арест пролиферации с признаками клеточного старения [177,178]. По аналогии с ИР, можно предположить, что причинами активации клеточного старения в клетках, обработанных УФ могут быть сигналы о повреждении ДНК и окислительный стресс [178,179]. В развитии клеточного старения, индуцированного УФ, могут принимать участие несколько сигнальных путей. Один из них р53-p21CIP1/WAF1-зависимый путь [180]. Не исключено, что УФ-индуцированное клеточное старение может развиваться по р16INK4a-зависимому пути [181]. В культурах раковых и нормальных клеток УФ приводит к быстрому возрастанию экспрессии р16INK4a и аресту пролиферации [182,183]. К тому же, сверхэкспрессия р16INK4a 24 в клетках значительно снижает цитотоксический эффект УФ [184]. В активации клеточного старения УФ могут быть задействованы сигнальные каскады, связанные с активностью поверхностных клеточных рецепторов. Было показано, что, для развития клеточного старения, индуцированного УФ, в кератиноцитах человека необходимо наличие рецептора IGF-1R [126]. Авторы предполагают, что IGF-1R может участвовать в развитии клеточного старения активируя р53 MAPK(р38)-зависимым путем [126]. 3.2.6. Клеточное старение и активные формы кислорода После открытия регуляторных функций АФК в биологических системах, активно начала изучаться их роль в механизмах развития клеточного старения. Стало понятно, что АФК играют важную роль в активации и поддержании клеточного старения [185]. Действие антиоксидантов аннулирует или подавляет развитие клеточного старения [186188]. Более того, показано, что существует прямая корреляция между старением организма и накоплением окисленных форм белков [189] и нуклеотидов [190], а также возрастанием количества повреждений ДНК [191]. Основными эндогенными источниками АФК являются NADPH-оксидазы и 5-липоксигеназа (5-LOX), активность которых может изменяться при клеточном старении [192-194]. АФК могут непосредственно активировать клеточное старение. Было показано, что индукция АФК в клетках бутилгидропероксидом перекисью (t-BHP) [198,199] водорода (Н2О2) вызывает [128,195-197] развитие и трет- преждевременного клеточного старения. Индукция АФК необходима и для развития клеточного старения, вызванного действием интерферона-β [200]. Отмечено, что при репликативном и преждевременном клеточном старении, индуцированном ИР, УФ и сверхэкспрессией онкогенов, также возрастает количество АФК [157,179,201,202]. В последнее время находит подтверждение предположение о том, что АФК являются не только индукторами клеточного старения, но и необходимы для поддержания необратимого ареста за счет существующей положительной обратной связи между продукцией АФК и DDR [15,187,203]. Продемонстрирована роль АФК в акселерации репликативного старения [204]. Полной ясности в механизме активации клеточного старения с участием АФК нет. Список мишеней действия АФК достаточно широк: белки, липиды и нуклеиновые кислоты 25 [205]. Известно, что опосредованное АФК клеточное старение часто связано с активацией DDR в результате повреждения ДНК [187,203]. Прямое действие АФК касается не только целостности ДНК, но и работы важных транскрипционных факторов (NF-kB, AP-1, Nrf2, HIF) [206-208] и сигнальных каскадов (MAPK, PI3K/Akt), регулирующих жизнеспособность клеток [209,210]. В развитии фенотипа клеточного старения при действии АФК могут участвовать следующие сигнальные пути: р53-p21CIP1/WAF1, р16INK4a-рRb, DDR, MAPK (p38 и ERK) [15,211]. Участие р53 и p21CIP1/WAF1 в развитии клеточного старения, при котором наблюдается увеличение АФК, подтверждается многими экспериментами [195,196,198]. Нокдаун р53 и p21CIP1/WAF1 значительно понижает продукцию АФК при репликативном и нерепликативном клеточном старении [15]. Было показано, что клеточное старение поддерживается за счет существующей петли обратной связи между увеличением количества АФК в «стареющих» клетках, генерацией повреждений ДНК и экспрессией p21CIP1/WAF1 [15] (Рисунок 5). Более того, p21CIP1/WAF1 может независимо от р53 участвовать в развитии фенотипа клеточного старения, обеспечивая продукцию АФК [129,212]. А. Такахаши с соавторами, используя человеческие фибробласты продемонстрировали связь ингибитора циклин-зависимых киназ р16INK4a с продукцией АФК путем активации МАРКсигнального пути [211] (Рисунок.5). Рисунок 5. Продукция активных форм кислорода (АФК) может усиливаться за счет функционирования петли положительной обратной связи между сигнальными каскадами MAPK, DDR и действием АФК. Активация DDR и р53 индуцирует повышенную экспрессию р21, также обладающего положительным эффектом на продукцию АФК. Сигнальный каскад MAPK может способствовать продукции АФК блокируя негативное действие транскрипционного фактора E2F р16-опосредованным путем. Следствием повышенной продукции АФК является ингибирование репликации ДНК. 3.2.7. Клеточное старение, индуцированное гипоксией Казалось бы, если АФК индуцируют клеточное старение, то гипоксия должна обладать обратным эффектом. Действительно, множество данных указывают на то, что 26 гипоксия в основном подавляет развитие клеточного старения [213,214]. Гипоксия обладает сходным эффектом с рапамицином - ингибитором киназы mTOR, предотвращает переход обратимого ареста пролиферации к p21CIP1/WAF1-зависимому клеточному старению как в раковых, так и в нормальных клетках [215,216]. Переход от обратимого ареста пролиферации к необратимому получил название героконверсии [217]. Все же существуют работы демонстрирующие, что гипоксия может индуцировать клеточное старение in vitro [218-220] и in vivo [221]. Участие сигнальных каскадов, ингибирующих или активирующих клеточное старение при гипоксии, обсуждается в обзорах С. Велфорд и М. Благосклонного [217,222]. Следует, однако подчеркнуть, что ясности в данном вопросе до сих пор нет. Данные об участии р53 и р16INK4a в развитии клеточного старения, индуцированного гипоксией, носят противоречивый характер [218,220]. Предположительно в активации преждевременного клеточного старения, индуцированного гипоксией, может принимать участие антиапоптотический фактор Bcl-2 [220]. Было также замечено, что культивирование клеток при очень низких концентрациях кислорода приводят к активации киназ ATM и ATR в отсутствии повреждений ДНК [223-225]. Известно, что индукция DDR в отсутствии повреждений ДНК может являться причиной активации клеточного старения [226]. 3.2.8. Клеточное старение, вызванное сверхэкспрессией онкогенов В геноме человека выделяют две группы генов, по-разному влияющих на перерождение нормальных клеток в опухолевые: онкогены и гены-супрессоры опухолей. Существует третья группа генов, протоонкогены, мутации в которых переводят этот ген в группу онкогенов. Мутации сказываются либо на функциях ферментов, либо на уровне экспрессии этих генов. Многие протоонкогены кодируют белки, регулирующие прохождение клеточного цикла, сигнальные каскады и дифференцировку клеток. Примерами протоонкогенов являются RAS, STAT5A, E2F1, WNT, EGFR, MYC, циклин D1, циклин E1, ERK и др. [227]. Первые экспериментальные данные, об участии онкогенов в индукции клеточного старения были получены Серрано с соавторами в 1997 году [130]. Они показали, что экспрессия онкогена RASV12 в первичных фибробластах человека и мышей приводит к проявлениям признаков клеточного старения. С тех пор прошло около 20-ти лет и список 27 потенциальных онкогенов-индукторов клеточного старения значительно расширился, а такой тип клеточного старения получил название индуцированного онкогенами клеточного старения (OIS, oncogene-induced senescence) [228]. Стоит добавить, что в список генов, мутации в которых приводят к клеточному старению, также вошли генысупрессоры опухолей PTEN, NF1 и VHL [229-231]. Существуют две принципиально различные точки зрения о механизмах, задействованных в развитии OIS [232]. Согласно первому мнению, главным событием в индукции клеточного старения онкогенами является активация DDR [226]. Важным аргументом в пользу первой точки зрения служат эксперименты, продемонстрировавшие, что подавление экспрессии генов-компонентов DDR (ATM, ATR, p53, CHK1, CHK2), полностью или частично подавляет развитие OIS [233-235]. Считается, что индуцированные онкогенами DDR возникают в следствии повышения уровня АФК в клетках [202]. Значительное увеличение продукции АФК было продемонстрировано на примере сверхэкспрессии онкогенов RAS и MYC [202,236-240]. При этом подавление продукции АФК предотвращало развитие индуцированного RAS клеточного старения [202]. Другой возможностью возникновения индуцированного онкогенами DDR является репликативный стресс, вызванный изменением скорости движения вилок репликации ДНК [233,240-242]. Клеточное старение в данном случае может быть вызвано истощением пула нуклеотидов [243], накоплением окисленных форм нуклеотидов [239], реверсией вилок репликации [240,242] или ре-репликацией ДНК [233]. При этом, для активации клеточного старения не обязательно наличие разрывов в ДНК, главным является активация компонентов DDR [226]. Таким образом, одной из явных причин активации OIS являются DDR-сигналы, оповещающие о нарушении целостности молекулы ДНК. Иная модель развития OIS предполагает, что активация DDR не является необходимым событием в индукции OIS, а экспрессия онкогенов запускает биохимические каскады, активирующие транскрипцию геномного локуса CDKN2A, кодирующего белки р16INK4a и ARF (p14ARF у человека и p19ARF у мышей) [244,245]. Вследствие активации этих генов происходит развитие клеточного старения. Подтверждением этого мнения может служить тот факт, что эктопической экспрессии р16INK4a и p21CIP1/WAF1 вполне достаточно для развития фенотипа клеточного старения [246-248]. К тому же не во всех случаях онкогены приводят к запуску DDR и формированию репарационных фокусов [249,250]. DDR-независимый вариант OIS предполагает участие двух сигнальных каскадов: ARF- 28 p53-p21CIP1/WAF1 [131,229,251] и р16INK4a-pRb [130,247]. Согласно ряду наблюдений, ARF индуцирует арест пролиферации по р53-зависимому пути, подавляя деградацию р53 [252]. Возможно, это не единственный механизм участия ARF в активации OIS [253]. Другие авторы полагают, что ARF, является вспомогательным, а не определяющим фактором в развитии OIS [130,254]. В развитии OIS могут принимать участие и другие сигнальные каскады. Многие из известных онкогенов являются компонентами MAPK-сигнального пути: RAS, RAF, ERK, MEK [255]. Показано, что ингибирование RAF (нижележащая мишень для RAS в MAPK) подавляет развитие RAS-индуцированного клеточного старения [256]. Более того, сверхэкспрессия онкогенов MEK и RAS приводит к заметному увеличению количества р53 и р16INK4a [256]. Основываясь на этих данных можно предположить, что в развитии OIS существует комплементарность сигнальных каскадов MAPK, p53-p21CIP1/WAF1 и р16INK4apRb [131,230,247,255]. Важно подчеркнуть, что активация того или иного биохимического каскада зависит не только от природы онкогена, но и от типа клеточной линии. Например, онкоген BRAFV600E в меланоцитах человека активирует р16INK4a- и PI3K-зависимые сигнальные пути, а в клетках мышей индуцированное BRAFV600E клеточное старение развивается по р16INK4a-независимому пути [257-259]. К тому же индукция OIS происходит не во всех типах клеток [260]. 3.2.9. Низкомолекулярные соединения, вызывающие клеточное старение Преждевременное клеточное старение может быть вызвано широким спектром низкомолекулярных веществ, обладающих различным типом действия (Таблица 1). Химические вещества, индуцирующие клеточное старение, функционально можно разделить на несколько групп: (1) повреждающие ДНК агенты (цисплатин, митомицин С, бусулфан, циклофосфамид, блеомицин), (2) ингибиторы ДНК-топоизомераз I и II (доксорубицин, этопозид, камптотецин), (3) ингибиторы репликации ДНК (афидиколин, гидроксимочевина) и (4) вещества, изменяющие эпигенетический статус хроматина (5-азадезоксицитидин, бутират натрия, трихостатин А, куркумин, C646, MS-275). В каждом случае причины и механизм, по которым происходит развитие фенотипа клеточного старения различны. 29 Таблица 1. Вещество Афидиколин (ингибитор ДНКполимеразы α) Гидроксимочевина (ингибитор рибонуклеотидредукта зы) Клеточная линия Фибробласты крысы REF52, эмбриональные фибробласты человека HFF Иммортализованные клетки молочной железы MCF10A, аденокарцинома MCF7 Эмбриональные фибробласты человека REF52, HFF, MCF10A Эффект и сигнальный путь Арест пролиферации с признаками клеточного старения р53, р21 Ссылки [273] Обратимый арест пролиферации в Sфазе с признаками клеточного старения р21, DDR [75] Арест пролиферации с признаками клеточного старения р53, р21 Арест пролиферации с признаками клеточного старения р53, р21 Арест пролиферации с признаками клеточного старения p16, p21 и p27 Арест пролиферации с признаками клеточного старения p16, JNKB Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G1 p21 и MAPK Арест пролиферации с признаками клеточного старения на стадии G2 Без изменения длины теломер Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G1 р53, р21 Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G1 p53 [274] Клетки немелкоклеточного рака легкого NSCLC Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G2 р16 [280] Клетки рака толстой кишки HCT116 Клетки гепатомы человека HepG2 Преждевременное клеточное старение р53 Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G1 р53, р21, р19 АФК Преждевременное клеточное старение р16 [263] Преждевременное клеточное старение р53, р21 АФК Арест пролиферации с признаками клеточного старения на стадии G2 [261] Клетки эритролейкемии человека K562 Мышиные фибробласты Клетки гепатомы крысы McA-RH7777 Цисплатин (образует прочный комплекс с ДНК, вызывает ДНК-ДНК сшивки) Карцинома носоглотки CNE1 Клетки рака легкого H1299 Фибробласты легкого человека Плоскоклеточный рак головы и шеи HNSCC Клетки гепатомы человека HepG2 Митомицин С (алкилирующий агент Аденокарцинома легкого человека [273] [275] [276] [277] [278] [127] [279] [261] [281] [282] 30 ДНК, вносит сшивки между цепями ДНК) Бусулфан (алкилирующий агент неспецифического действия, вызывает образование ДНКДНК и ДНК-белковых сшивок) A549 p21, DDR Кроветворные клетки костного мозга мыши BM Фибробласты человека WI38 Преждевременное клеточное старение р16, р19 [41] [264] Циклофосфамид (алкилирующий агент ДНК) Лимфома мышей Преждевременное клеточное старение MAPK (p38), р21, р16 АФК Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G2 MAPK, не зависимо от р53 Преждевременное клеточное старение р53, p16 Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G1 и G2 MAPK, р21, р16 Преждевременное клеточное старение р53, р21 и р16 Преждевременное клеточное старение р21 Преждевременное клеточное старение р21, DDR, MAPK (p38) SASP Арест пролиферации с признаками клеточного старения на стадии G2 p53, p21 Преждевременное клеточное старение Не зависимо от р53 и Rb SASP Арест пролиферации с признаками клеточного старения +/-р53 Арест пролиферации с признаками клеточного старения +/-р53, +/-р21 Преждевременное клеточное старение р53, +/- р21 SASP Преждевременное клеточное старение р53 Ингибирует активность теломеразы Преждевременное клеточное старение p21 [285] Преждевременное клеточное старение p16 [293] Преждевременное клеточное старение p53, p21 Преждевременное клеточное старение Преждевременное клеточное старение p53, MAPK Через регуляцию экспрессии белков TRF2 и TRF1 [294] Блеомицин (множественное повреждающее действие на ДНК) WI38 Эмбриональные фибробласты легкого человека TIG-7 Фибробласты человека A549, крысиные первичные фибробласты Клетки фиброза легкого мыши A549 BJ и 293T Доксорубицин (множественное повреждающее действие на ДНК) 11 типов раковых клеток (HT1080, MCF7 и HCT116) HCT116, клетки фибросаркомы HT1080 Трансгенные мыши, MCF7 MCF7 Клетки нейробластомы человека SKN-SH Предшественники человеческих кардиомиоцитов CPCs HCT116 A549 Неонатальные крысиные кардиомиоциты, H9c2 крысиные [262] [283] [77] [76] [284] [286] [287] [288] [289] [290] [291] [292] [295] [296] 31 эмбриональные миоциты WI38 Этопозид, VP-16 (ингибитор ДНКтопоизомеразы II) H1299 Аденокарциномы толстой кишки LS174T и HCA-7, MCF-7, карцинома яичников A2780 REF52, HFF А549 Камптотецин, SN-38 (ингибитор ДНКтопоизомеразы I) LS174T, HCA-7, MCF-7, A2780 Клетки рака легкого человека H1299 HCT116 HCT116, Бромдезоксиуридин Интреферон-β 5-аза-дезоксицитидин, децитабин (ингибитор ДНКметилтрансфераз) Клетки аденокарциномы HeLa S3, TIG-7 Фибробласты человека IMR90 Иммортализованные клетки синдрома LiFraumeni (LFS) линии MDAH041 MDAH041 MDAH041 HepG2 Бутират натрия (ингибитор гистондеацетилаз) WI38 Мышиные эмбриональные фибробласты Преждевременное клеточное старение p53, p21, mTOR Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G2 р53, p21 [297] Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G1 и G2 p53, p21, p16 [298] Арест пролиферации с признаками клеточного старения р53, +/- р21 Арест пролиферации с признаками клеточного старения на стадии G2 p21 SAHF Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G1 и G2 p53, p21, p16 [273] Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G2 DDR Не зависит от р53 и р16 Преждевременное клеточное старение DDR, p53, p21 Преждевременное клеточное старение p53, p21 Арест пролиферации с признаками клеточного старения р21 Преждевременное клеточное старение p53, Rb, DDR АФК Преждевременное клеточное старение Два независимых пути: р16 и p21 [300] Арест пролиферации с признаками клеточного старения р16 Арест пролиферации с признаками клеточного старения р16, p21 Преждевременное клеточное старение p53, p16, DDR Арест пролиферации с признаками клеточного старения на стадии G1 Rb Арест пролиферации с признаками клеточного старения на стадии G1 р21, независимо от р53 [304] [127] [299] [298] [301] [302] [303] [200] [246] [305] [306] [307] [308] 32 NIH3T3 Рак эндометрия HHUA, аденокарцинома Hec1-A, карцинома яичников SKOV-3 WI38 Трихостатин А (ингибитор гистондеацетилаз) WI38 WI38 Куркумин и C646 (ингибиторы гистонацетилазы р300) BJ и эмбриональные клетки почек человека, тансформированные Т-антигеном 293T Имморализованые фибробласты человека TIG3 MS-275 (ингибитор гистондеацетилаз) Мезенхимальные стволовые клетки MSCs Арест пролиферации с признаками клеточного старения на стадии G1 и G2 p21 - Rb, +/-р53 [309] Преждевременное клеточное старение р21 Арест пролиферации с признаками клеточного старения на стадии G1 Rb Преждевременное клеточное старение р21 Преждевременное клеточное старение Не зависимо от р53 и Rb SASP [310] Преждевременное клеточное старение, арест на стадии G2 Не зависит от p53, p21, p16 В отсутствии повреждений ДНК SAHF Преждевременное клеточное старение р16 - Rb [311] [307] [310] [287] [312] В случае, ДНК-повреждающих агентов и ингибиторов ДНК-топоизомераз I и II индукторами клеточного старения могут быть персистирующие сигналы о повреждении ДНК и АФК [76,261,262]. Например, увеличение уровня АФК наблюдается при действии цисплатина [261,263], бусулфана [264], циклофосфамида [265,266], доксорубицина [267,268]. Интерферон-β, связываясь с поверхностными рецепторами клетки, также приводит к резкому возрастанию количества АФК в клетках и таким образом индуцирует преждевременное клеточное старение [200]. Механизмы развития фенотипа клеточного старения в результате действия афидиколина и гидроксимочевины не вполне ясны. Известно, что ингибирование репликации афидиколином и гидроксимочевиной сопровождается коллапсом вилок репликации, следствием чего являются повреждения ДНК и активация DDR [269-272]. Индукторами клеточного старения в этом случае могут быть сигналы о повреждении ДНК [226]. Одним из малоизученных является вариант клеточного старения, развитие которого происходит в результате изменения эпигенетического статуса хроматина. Эпигенетическими индукторами клеточного старения являются химические ингибиторы гистондеацетилаз [287,307,308,312], ДНК-метилтрансфераз [246,304] и ингибиторы 33 гистонацетилазы р300 [311]. Считается, что изменение статуса хроматина в промоторных областях генов, регулирующих развитие фенотипа клеточного старения, приводит к экспрессии этих генов и активации соответствующих сигнальных каскадов [244,313,314]. Многочисленные данные демонстрируют важную роль p53, p21CIP1/WAF1 и р16INK4a в активации и поддержании клеточного старения химическими агентами. Часто развитие фенотипа клеточного старения сопровождается увеличением экспрессии р53 и p21CIP1/WAF1. Экспрессия р53 коррелирует с индукцией клеточного старения и подавлением цитотоксического действия цисплатина и этопозида [127,298]; аналогичные эффекты наблюдаются при действии митомицина С [35], доксорубицина [289,290], камптотецина [302]. В тоже время, высокая экспрессия р53 может индуцировать апоптоз [127,279,315]. Для некоторых типов опухолевых клеток, дефектных по р53, продемонстрирована индукция клеточного старения умеренными дозами доксорубицина [288,289], камптотецина [300] и бутирата натрия [309]. Из этого следует важный вывод, что активация программы клеточного старения химическими веществами в опухолевых клетках может идти по р53-независимому механизму. В частности, имеет место p21CIP1/WAF1-зависимое клеточное старение, проходящее без участия р53 [308,316]. Значительное увеличение экспрессии р16INK4a наблюдается при индукции преждевременного клеточного старения низкомолекулярными веществами: бусулфаном [264], блеомицином [76], гидроксимочевиной [276], цисплатином [280], циклофосфамидом [283], 5-аза-дезоксицитидин [304], этопозидом и камптотецином [264,298]. Считается, что продолжительная экспрессия р16INK4a необходима для поддержания ареста пролиферации [75,76]. Не исключено, что экспрессия р16INK4a может зависеть от МАРК (р38) [296]. *** На основе вышеизложенных глав, хотелось бы выделить некоторые наиболее важные аспекты клеточного старения. Мы рассмотрели широкий спектр факторов стресса, вызывающих преждевременное клеточное старение: нарушение структуры теломер, ИР, УФ, АФК, гипоксию, сверхэкспрессию онкогенов, генотоксические вещества и др. Причины, по которым происходит развитие клеточного старения различны, наиболее распространенными являются АФК и повреждения ДНК. Выделяют два основных биохимических каскада, определяющих развитие программы клеточного старения: р16INK4a-рRb и р53-p21CIP1/WAF1. Причем, активация экспрессии p21CIP1/WAF1 может 34 происходить и без участия р53. Дополнительными, а в некоторых случаях и определяющими для развития клеточного старения, являются сигнальные каскады DDR и MAPK. Они могут усиливать или активировать сигнальные каскады р16 INK4a-рRb и р53p21CIP1/WAF1. Все вышеописанные сигнальные каскады в конечном счете приводят к необратимому аресту пролиферации на стадиях G1 и G2 клеточного цикла. Важное замечание состоит в том, что механизм развития клеточного старения определяется не только типом стресс-фактора, но и клеточной линией. О том может ли тепловой стресс вызывать преждевременное клеточное старение до недавнего времени данные отсутствовали. Л. Алексеенко с соавторами показали, что сублетальный тепловой стресс индуцирует преждевременное клеточное старение нормальных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток человека [18,19]. Причины и механизм активации клеточного старения, вызванного тепловым стрессом, в этих работах не рассматривались. Ниже мы рассмотрим некоторые механизмы клеточного ответа на стресс и их взаимосвязь с индукцией клеточного старения. 3.3. Влияние гипертермии на клеточную пролиферацию Тепловой стресс является одним из мощных стрессовых факторов, изменяющих метаболизм клетки [7]. При тепловом стрессе может изменяться текучесть и проницаемость мембран [317], реорганизоваться структура цитоскелета [318,319], происходить увеличение размеров митохондрий, фрагментация эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи [320], изменяться транскриптом клетки [7], подавляться репликация ДНК и происходить образование ОЦР и ДЦР [321]. Естественно, что массовые повреждения, вызванные тепловым стрессом, могут стать причиной гибели клеток. На этом эффекте основано использование гипертермии совместно с химио- и радиотерапией для предотвращения роста раковых клеток [14]. Степень выживаемости клеток зависит от силы и продолжительности стресса [322-324], типа клеточной линии [322] и фазы клеточного цикла на момент воздействия теплового стресса [325,326]. Известно, что при острой гипертермии (температуре выше 45.5С) происходит гибель клеток путем апоптоза [327,328], некроза [329] или посредством митотической катастрофы [330-332]. 35 Показано, что действие умеренного теплового стресса (41-45С) может приводить к краткосрочному аресту пролиферации на стадии G1 и G2 клеточного цикла [333-336]. Интересно, что при индуцированном тепловым стрессом G1-аресте в культурах клеток MCF-7 BUS, MCF-7GS, T47D, EVSA-T, D283MED активируется экспрессия ингибитора циклин-зависимых киназ р16INK4a [334]. В культурах клеток первичных фибробластов человека, клетках глиомы A172 и лейкемии U937 индуцированный тепловым стрессом G1арест может сопровождаться экспрессией р53 и p21CIP1/WAF1 [333,335]. В то же время для линии клеток HeLa подобный арест не наблюдался [335]. Авторы данной работы предполагают, что отсутствие G1-ареста в линии клеток HeLa связано с отсутствием экспрессии р53. Важно отметить, что индуцированная гипертермией экспрессия p21CIP1/WAF1 может происходить без участия р53 – например, в клеточных линиях T98G и MDAH041 дефектных по р53 [333]. Несмотря на то, что клетки линии HeLa не подвергаются аресту в G1-фазе, их арест пролиферации все же происходит на стадии G2 клеточного цикла [336]. Было показано, что в клетках линии Jurkat и HeLa индуцированный тепловым стрессом G2-арест обусловлен активностью ATR/Chk1сигнального пути [336]. Таким образом, следствием умеренной гипертермии может быть краткосрочный арест пролиферации и экспрессия белков р16INK4a, p21CIP1/WAF1 и р53, функции которых связаны с активацией программы клеточного старения. Существует и обратный эффект теплового стресса. Умеренная гипертермия (3943С) может способствовать пролиферации клеток путем увеличения продукции циклина D1 [337]. Тепловой стресс может улучшать регенерацию мышечных волокон, усиливая экспрессию факторов дифференцировки и пролиферации MyoD и миогенина [338,339], а также увеличивать количество мышечной массы животных [340]. При повышении температуры происходит усиленная экспрессия белков теплового шока (HSPs, heat shock proteins). Они обладают огромным спектром функций, направленных на поддержание жизнеспособности клеток в стрессовых условиях [7]. Белки теплового шока также могут способствовать усилению адгезии и миграции клеток [341]. 3.4. Повреждающие эффекты теплового стресса Клеточная гибель, арест пролиферации и клеточное старение происходят вследствие возникающих нарушений, индуцированных тепловым стрессом. Ниже мы рассматриваем 36 вызываемые гипертермией изменения, которые могут напрямую повлиять на жизнеспособность клеток и привести к индукции клеточного старения. 3.4.1. Изменение структуры и локализации белков Одной из основных мишеней гипертермии являются белки. Тепловой стресс является причиной денатурации белков [7,342]. Денатурация происходит в результате изменений нативной конформации белков под действием дестабилизирующих факторов таких как температура, рН, соли тяжелых металлов и некоторых других. Нарушение пространственной организации полипептидной цепи ведет к потере функций белка. Для предотвращения массовой денатурации белков в ответ на тепловой стресс в клетке значительно усиливается синтез HSPs [343]. HSPs являются молекулярными шаперонами и играют важнейшую роль в поддержании нативной структуры белков. Они обеспечивают правильную укладку белков (фолдинг) и рефолдинг агрегированных или неправильно уложенных белков [343]. Помимо шаперонных функций белки теплового шока обладают антиапоптотическим действием, блокируя действие цитохрома с, Apaf-1 и AIF [344-346]. Следовательно, повышенная экспрессия HSPs при стрессе повышает жизнеспособность клеток. В результате действия гипертермии происходит диссоциация и релокализация белков внутри компартментов клетки. Возможно, этот эффект связан с частичной или полной денатурацией белков, ведущей к нарушению белок-белковых взаимодействий или ДНК-, РНК-белковых. Очевидно, что диссоциация и релокализация белков из естественных мест депонирования может отражаться на их функционировании. Классическим примером является образование ядерных [347] и цитоплазматических [348,349] стресс-гранул при тепловом стрессе. В результате теплового стресса может происходить диссоциация белка НР1α из прицентромерных областей [350]. Согласно классическому представлению, НР1α участвует в организации конститутивного гетерохроматина, маркером которого является триметилированный по лизину 9 гистон H3 [351]. Ядрышко при тепловом стрессе также имеет тенденцию к деконденсации в результате релокализации нуклеолина, следствием чего предположительно является ингибирование репликации [342]. Одним из ярких примеров диссоциации комплексов цитоплазматических белков под действием теплового 37 стресса является нарушение структуры центросом, организующих клеточный центр и веретено деления. Следствием дисфункции центросом является митотическая катастрофа [331]. Как мы видим, гипертермия имеет широкий спектр действия на белковый гомеостаз клетки. Тепловой стресс сопровождается усиленной экспрессией HSPs, направленных на восстановление нативной структуры денатурированных белков, и релокализацией некоторых белков с изменением их функциональных нагрузок. Кроме того, денатурация белков может приводить к неспецифическому ингибированию таких макромолекулярных процессах как репликация, репарация, транскрипция, трансляция и др. 3.4.2. Регуляция экспрессии генов при тепловом стрессе Как было сказано ранее, при тепловом стрессе происходят масштабные изменения в транскриптоме клеток [7]. Наряду с общей репрессией транскрипции, трансляции и сплайсинга РНК, происходит активная экспрессия небольшого числа генов, ответственных за стабилизацию гомеостаза клетки [352-354]. Общее ингибирование транскрипции при тепловом стрессе изучено слабо. Известны несколько механизмов, при которых транскрибируемые SINE РНК связываются с РНКполимеразой II и блокируют сборку преинициаторного комплекса, тем самым подавляя инициацию транскрипции [355,356]. Вклад в общее снижение уровня транскрипции при тепловом стрессе может вносить гипоацетилирование гистонов и сдвиг статуса хроматина к более закрытому типу [357]. Интересно, что в деацетилировании гистонов участвует транскрипционный фактор HSF1, регулирующий транскрипцию белков теплового шока [357]. На трансляционном уровне общая репрессия происходит в результате образования цитоплазматических стресс-гранул, в которых происходит «заморозка» трансляции на уровне инициации [347,358-360]. При гипертермии специфично возрастает экспрессия многих генов, в частности, кодирующих HSPs, регуляторы шаперонов, белки систем протеасомной деградации, сигнальной трансдукции, мембранного транспорта, репарации ДНК и некоторые другие [361]. Экспрессия стресс-индуцируемых белков при гипертермии зависит от специфических транскрипционных факторов: HSF1, ATFs, XBP1, NF-kB, STAT3 [362-364]. 38 Активация этих транскрипционных факторов часто связана с регуляцией пролиферативной активности клеток. Интересно, что транскрипционный фактор HSF1 может усиливать транскрипцию р53 и p21CIP1/WAF1, а также осуществляет фосфорилирование р53 в комплексе с ATR и Chk1 при действии генотоксических ядов [365]. Данные о том, происходит ли увеличение транскрипции p21CIP1/WAF1 и р53 при тепловом стрессе, остаются противоречивыми. В культуре нормальных и раковых клеток печени тепловой стресс не вызывает увеличения количества мРНК р53 и p21CIP1/WAF1 [366]. В то же время, согласно другим экспериментальным данным, полученным на клетках глиобластомы, MDAH041 и T98G при тепловом стрессе количество мРНК p21CIP1/WAF1 значительно возрастает [333,367]. Необходимо учесть, что регуляция экспрессии генов при гипертермии может происходить на посттранскрипционном уровне. На примере культуры клеток H1299 показано, что возрастание уровня экспрессии p21CIP1/WAF1 при тепловом стрессе связано не столько с повышением уровня транскрипции, сколько со стабилизацией его мРНК [368]. Другой пример демонстрирует стабилизацию структуры и накопление белка р53 путем его прямого взаимодействия с HSPs [369]. Также на стабильности и функциональной активности белков могут сказываться посттрансляционные модификации - ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинилирование и другие. В частности, при тепловом стрессе происходит фосфорилирование р53 по серину 15 киназой ATM [369,370]. Эта модификация модулирует транскрипционную активность р53 и важна для дальнейшего развития DDR в условиях стресса [371]. На посттранскрипционном уровне экспрессия генов часто регулируется микро-РНК [372]. О роли микроРНК в регуляции экспрессии генов при гипертермии известно не так много. Недавно опубликованы данные об участии эндогенных микроРНК в массовом подавлении экспрессии генов при тепловом стрессе в клетках млекопитающих [373]. На клетках фибробластов кожи было показано, что при тепловом стрессе происходит изменение уровня экспрессии порядка сотни микроРНК. Предполагаемыми мишенями их действия являются компоненты системы клеточного ответа на стресс: TTC7A, DNAJB2, IGF1R, NOX3, HMGN3, AHSA1, HSPA4L (HSP70L), HSPA6, HOXB8 и некоторые другие [374]. Таким образом, гипертермия приводит к общей репрессии процессов транскрипции и трансляции мРНК. Но на общем фоне ингибирования этих процессов происходит 39 избирательная экспрессии генов, участвующих в поддержании гомеостаза клетки и регуляции пролиферации. 3.4.3. Нарушение целостности ДНК Одни из первых экспериментальных данных по действию гипертермии на структурную целостность ДНК показали, что гипертермия подавляет репликацию ДНК. В клетках млекопитающих после действия острого теплового стресса (45.5С) происходит замедление скорости репликации ДНК и блокируется активация новых участков начала репликации [375,376]. Причины этого феномена не вполне ясны. Изначально предполагалось, что блокирование репликации ДНК в условиях гипертермии происходит в результате денатурации белков репликативной машины [375,376]. Однако, в более поздних работах было показано, что репрессия репликации является более тонко регулируемым процессом. В частности, при тепловом шоке происходит диссоциация нуклеолина из ядрышек и ассоциация его с белком RPA, необходимым для инициации и элонгации репликации ДНК[342,377]. Иными причинами репликативного стресса могут быть повреждения ДНК и нарушение системы репарации. Было показано, что тепловой стресс может тем или иным способом блокировать практически все репаративные системы клетки: гомологичную рекомбинацию (HR, от англ. homologous recombination) и негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ, от англ. non-homologous end joining), эксцизионную репарацию оснований (BER) и нуклеотидов ДНК (NER). Подобное может происходить в результате денатурации репарационных белков, их деградации или релокализации из ядра в цитоплазму клетки [378-381]. Кроме ингибирования систем репарации, тепловой стресс сам по себе является причиной повреждения ДНК. До недавнего времени считали, что гипертермия преимущественно провоцирует формирование ОЦР в результате остановки репликации [378,382,383]. Нами и другими группами ученых было показано, что гипертермия провоцирует формирование также и ДЦР [321,324,384,385]. Более того, мы обнаружили, что тип индуцированных тепловым стрессом разрывов ДНК определяется фазой клеточного цикла на момент стресса. В G1- и G2-фазах клеточного цикла тепловой стресс вызывает образование ДЦР, а в S-фазе – ОЦР[321]. 40 Механизмы образования ОЦР и ДЦР при тепловом стрессе не ясны. Возможных причин много: активные формы кислорода, уровень которых возрастает при гипертермии [386-388], ингибирование систем репарации ДНК [171], остановка репликации ДНК [389] и др. На основе всего вышесказанного можно заключить, что тепловой стресс может индуцировать преждевременное клеточное старение по р16INK4a-рRb и р53-p21CIP1/WAF1зависимым путям. Наиболее очевидными причинами активации индуцированного тепловым стрессом клеточного старения могут быть: возникновение повреждений ДНК, окислительный стресс, изменение статуса хроматина и дисфункция белков, регулирующих прохождение клеточного цикла. 41 4. Материалы и методы 4.1. Материалы Клеточные линии В работе были использованы культивируемые линии клеток человека HeLa, MCF7 и первичная культура фибробластов кожи человека. Антитела Мы использовали кроличьи поликлональные и мышиные моноклональные антитела против гистона γH2AX (Active Motif, Abcam и Upstate/Millipore); кроличьи поликлональные и мышиные моноклональные антитела против 5-бромдезоксиуридина (Rockland и Chemicon/Millipore); кроличьи поликлональные антитела против циклина B1 (Santa-Cruz), гистона H3 (Abcam), ДНК-топоизомеразы I (Abcam), белков 53BP1 (SantaCruz Biotechnologies), GM 130 (Cell Signaling) и p21 (Cell Signaling); мышиные моноклональные антитела против белка Rad51 (Abcam) и ламина В1 (Abcam). Кроме того, в работе были использованы мышиные моноклональные антитела против белка TRF2, любезно предоставленные М.П. Светловой (Институт цитологии РАН, СанктПетербург). В экспериментах по непрямой иммунофлуоресценции первичные антитела выявляли вторичными антителами против мышиных и кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированными с Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 555 (Molecular Probes). Для проведения вестерн-блот анализа использовали вторичные антитела против мышиных и кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham/GE Healthcare). Химические реактивы Реактивы общего назначения: NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, NaHCO3, Na2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4, ЭДТА, ЭГТА, глицин, глицерин, HEPES, PIPES, трис, додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, лаурилсаркозинат натрия, декстран сульфат натрия, мочевина, борная кислота, ледяная уксусная кислота, соляная кислота, лимонная кислота, этанол, метанол, изопропанол, хлороформ, фенол, бромистый 42 этидий, йодит пропидия, бромфеноловый синий, EvaGreen, Тритон X-100, Tween 20, сахароза, параформальдегид, формальдегид, дитиотриэтол (ДТТ), β-меркаптоэтанол, диметилсульфоксид (ДМСО), бычий сывороточный альбумин (БСА), дробленная ДНК спермы лосося, Cot-1 фракция ДНК человека, тРНК, агароза, легкоплавкая агароза, коктейль ингибиторов протеаз (Fermentas), коктейль ингибиторов фосфатаз (SigmaAldrich), фенилметилсульфонилфторид (PMSF), ингибитор рибонуклеаз, смесь дНТФ, 5бромо-2´-дезоксиуридин (BrdU, Sigma-Aldrich), 5-этинил-2´-дезоксиуридин (EdU, Invitrogen), 5-флуороурацил (5-FU, Sigma-Aldrich), 4,6-диамино-2-фенилидол (DAPI), реактив для заключения препаратов «Dako fluorescent mounting medium» (Dako/Invitrogen), акриламид, N,N,-метилен-бис-акриламид (Serva), реагент Брэдфорд (Sigma-Aldrich). Низкомолекулярные генотоксические агенты и ингибиторы: афидиколин (SigmaAldrich), гидроксимочевина (Sigma-Aldrich), камптотецин (Sigma-Aldrich), кофеин (Sigma-Aldrich), ингибитор ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK) NU7026 (Tocris Bioscience), ингибитор ATM KU55933 (Tocris Bioscience), ингибитор протеосомной активности MG132 (Sigma-Aldrich), α-аманитин (Sigma-Aldrich), перекись водорода (Merck). Реактивы для культивирования клеток: модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM, Панэко) с 10% фетальной сыворотки теленка (FBS) (HyClone/GE Healthcare); раствор Версена и раствор трипсина (Панэко); фетальная сыворотка теленка (HyClone/ GE Healthcare); антибиотики ампициллин и стрептомицин; пируват натрия; глутамат натрия (Sigma-Aldrich). Ферменты: пепсин (Sigma-Aldrich), дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I, SigmaAldrich), рибонуклеаза А (Fermentas), протеиназа К (Sigma-Aldrich), Taq-полимераза (Sibenzyme), обратная транскриптаза ВЛММ (Fermentas). Наборы: набор для иммунодетекции вестерн-блотов (Pierce), набор для флуоресцентной детекции включения EdU в ДНК «Click-iT EdU Imaging kit» (Invitrogen), наборы малых интерферирующих РНК (миРНК) для подавления экспрессии DNA-PK, ATM, ATR и ДНК-топоизомеразы I (Santa-Cruz Biotechnologies), реагент для выделения РНК «TRIzol» (Invitrogen), реагент для выделения ДНК «DNAzol» (Invitrogen), реактив для трансфекции миРНК Turbofect (Fermentas), наборы для определения трипсин- и химотрипсин-подобных активностей протеосомы Proteasome- 43 Glo (Promega), набор для выделения и очистки плазмидной ДНК QIAGEN Plasmid Midi Kit (Sigma-Aldrich). 4.2. Методы 4.2.1. Культивирование клеток человека и синхронизация двойным тимидиновым блоком Линии клеток человека HeLa, MCF7 и первичных фибробластов кожи человека культивировали в DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культивирование вели при 37ºС, 5% CO2 во влажной атмосфере. Для синхронизации двойным тимидиновым блоком на границе G1/S клеточного цикла клетки культивировали в среде с добавлением 2 мМ тимидина в течение 16 часов, промывали обычной средой и культивировали в среде без тимидина в течение 9 часов; повторно инкубировали с тимидином 16 часов. После синхронизации клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS; 7 мМ Na2HPO4, 1.5 мМ KH2PO4, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl) и культивировали в обычной среде. Фракции клеток на разных стадиях клеточного цикла получали в зависимости от времени инкубации клеток в обычной среде после двойного тимидинового блока. 4.2.2. Тепловой стресс и обработка химическими агентами Воздействию гипертермии клетки подвергали в водяной бане при 45.5°С (±0.05°C) в течение 30 мин. В период восстановления клетки культивировались в нормальных условиях при 37 °С. В экспериментах по ингибированию PIKK-киназ, клетки линии HeLa инкубировали в среде с 10 мМ кофеина, 1 мкМ KU55933 или 50 мкМ NU7026 в течение 6 часов. Для ингибирования репликации ДНК клетки инкубировали в среде с 10 мкМ афидиколина или 10 мМ гидроксимочевины в течение одного часа. В экспериментах по ингибированию ДНК-топоизомеразы I клетки инкубировали с 10 нМ, 100 нМ или 1 мкМ камптотецина в течение 1 часа. Для подавления протеосомной активности клетки инкубировали в среде с 10 мкМ MG132 в течение часа. Для ингибирования 44 транскрипции клетки инкубировали в среде с 5 мкг/мл α-аманитина. Для индукции ОЦР клетки инкубировали в среде с добавлением перекиси водорода в концентрациях 50 и 100 мкМ в течение 1 часа. 4.2.3. Включение аналогов нуклеотидов Культуру клеток HeLa, MCF7 или первичных фибробластов инкубировали в среде со 100 мкМ BrdU или 10 мкМ EdU в течение 30 минут при 37°С. Для измерения уровня транскрипции в культуре клеток HeLa проводили включение 5-FU 5 мМ в течение трех часов при 37°С. После инкубации клетки промывали PBS и фиксировали либо в CSKбуфере (10 мМ PIPES pH 7.0, 1% параформальдегид, 2.5% Тритон X-100, 100 мМ NaCl, 0.3 M сахароза, 1.5 мМ MgCl2) в течение 15 мин либо в 100%-ном холодном метаноле (20°С) в течение 10 минут при комнатной температуре. Включение BrdU и 5-FU выявляли с помощью иммуноокрашивания антителами против BrdU в соответствии с методикой «Иммуноцитохимия и микроскопия». Включение EdU выявляли с помощью набора реагентов Click-iT EdU Imaging kit (Invitrogen) согласно протоколу компаниипроизводителя. 4.2.4. РНК-интерференция Клетки HeLa культивировали в среде без антибиотика. Через сутки клетки трансфецировали набором соответствующих миРНК с помощью реагента siRNA Turbofect согласно протоколу компании-производителя. Для подавления экспрессии (нокдауна) киназ ATM, ATR, DNA-PK и ДНК-топоизомеразы I клетки трансфецировали миРНК в следующих концентрациях: 100 нM, 200 нM, 80 нM и 60 нМ соответственно. Условия наиболее эффективного нокдауна PIKK-киназ были определены ранее в нашей лаборатории [321]. Спустя 4-8 часов после трансфекции клетки подвергались дальнейшим манипуляциям. 4.2.5. Иммуноцитохимия и микроскопия Клетки выращивали на покровных стеклах и фиксировали в CSK-буфере в течение 15 мин или 100% холодным метанолом (-20°С) в течение 10 минут при 45 комнатной температуре. Промывали 3 раза по 5 мин PBS. Для выявления BrdU клетки после фиксации обрабатывали 2М HCl в течение 30 минут при комнатной температуре и нейтрализовали в 100 мМ боратном буфере. После промывок в PBS стекла с иммобилизованными клетками инкубировали в 1%-ном растворе БСА в течение 30 мин, затем инкубировали с первичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза по 5 мин PBS с добавлением 0.2% БСА и 0.05% Tween 20. Первичные антитела выявляли вторичными антителами против мышиных и кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированными с Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 555. ДНК окрашивали флуоресцентным красителем DAPI. После промывок в PBS и дистиллированной воде препараты заключали в Dako fluorescent mounting medium (Dako/Invitrogen). Иммуноокрашенные флуоресцентного микроскопа Zeiss препараты AxioScope анализировали A1. Полученные с помощью изображения обрабатывали в программах ImageJ (1.44) и Adobe Photoshop CS6. 4.2.6. Совместное иммунофлуоресцентное окрашивание против белка TRF2 и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с пробой к теломерным повторам Клетки линий MCF7 и первичные фибробласты выращивали на покровных стёклах. Затем клетки промывали PBS, выдерживали в 0.55%-ном KCl 15 минут при 37°С и фиксировали в CSK-буфере в течение 15 мин при комнатной температуре. Промывали 3 раза по 5 мин PBS и проводили иммуноцитохимическое окрашивание препарата антителами против белка TRF2. После этого препараты фиксировали 1%-ным параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре, промывали PBS и выдерживали в растворе 2х SSC (2х SSC, 300 мM NaCl, 30 мM цитрат натрия) с добавлением 200 мкг/мл рибонуклеазы А 30 минут при 37°С. Затем препараты инкубировали в растворе 2 М HCl 10 минут при 37°С и промывали три раза PBS. Дегидратацию препаратов проводили последовательным проведением через охлаждённые до 4С растворы этанола 70-80-90% по 5 минут. Денатурацию ДНК проводили в 2х SSC с добавлением 70% формамида при 72°С 5 минут. После денатурации препараты сразу же проводили через охлаждённые до -20С растворы этанола 70-80-90% по 5 минут и высушивали на воздухе. На препараты наносили по 10 46 мкл заранее прогретой до 72°С в течение 10 минут гибридизационной смеси (2х SSC, 1% Tween 20, 10% декстран сульфат натрия, 5 мкг дробленой ДНК спермы лосося, 750 нг Cot-1 ДНК, 5 мкг тРНК и 75 нг олигонуклеотидов TTAGGGTTAGGGTTAGGG, конъюгированных с флуорофором). Препараты накрывали покровным стеклом и инкубировали в течение ночи при 37°С. От несвязавшихся олигонуклеотидов избавлялись последовательной промывкой растворами: 2х SSC 10 минут при комнатной температуре, 2х SSC с добавлением 50% формамида, 2х SSC 10 минут при 37С, 0.1х SSC 5 минут при 37С и 2х SSC 5 минут при комнатной температуре. ДНК окрашивали DAPI. После отмывки раствором PBS и дистиллированной водой препараты заключали в Dako fluorescent mounting medium и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss AxioScope A1. 4.2.7. Измерение активности β-галактозидазы Клетки выращивали на покровных стёклах. После соответствующих обработок и инкубаций в свежей среде клетки фиксировали в PBS с добавлением 2% формальдегидом и 0.2% глутарового альдегида в течение 5 минут при комнатной температуре. После фиксации клетки промывали 3 раза по 5 мин PBS. Для проявления активности фермента β-галактозидазы клетки инкубировали в растворе, содержащем субстрат X-gal (40 мМ раствор лимонной кислоты на PBS, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 5 мМ K3Fe(CN)6, 5 мМ K4Fe(CN)6, 1 мг/мл X-gal, рН 6.0) при 37°С в течение ночи. Препараты фиксировали метанолом, предварительно охлаждённым до 4⁰С, в течение 5 минут при комнатной температуре и промывали дистиллированной водой. Заключали в Dako fluorescent mounting medium и анализировали на микроскопе Olympus BX50F4. Полученные изображения обрабатывали в программе Adobe Photoshop CS6. 4.2.8. Выделение РНК Выделение РНК проводили с помощью реагента «TRIzol» согласно инструкции производителя. Для удаления остаточной ДНК все образцы РНК обрабатывали 10 ед. ДНКазы I при 37°С 30 минут. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически при длинах волн 260 нм и 280 нм. 47 4.2.9. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени Для проведения обратной транскрипции предварительно на матрице РНК (1 мкг) отжигали случайные шестичленные олигонуклеотиды (0.01 мкг) при 65C 5 минут. Обратную транскрипцию проводили в объёме 20 мкл (1 мкг матрицы РНК с олигонуклеотидами, буфер для обратной транскриптазы, 1 мМ смесь дНТФ, 200 ед. обратной транскриптазы ВЛММ, 20 ед. ингибитора рибонуклеаз) при температурном режиме: 25C 10 минут, 42C 60 минут, 70C 10 минут. Полученную кДНК анализировали с помощью ПЦР в реальном времени на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories). Смесь для ПЦР объёмом 20 мкл содержала 50 мM Tрис-HCl (pH 8.6), 50 мM KCl, 1.5 мM MgCl2, 0.1% Tween 20, 10 пмоль каждого праймера, 0.2 мM каждого дНТФ, 0.6 мкM EvaGreen (Biotium), 0.75 ед. HotStart Taq-полимеразы и 50 нг матрицы кДНК. ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация 5 мин при 94°C, 50 циклов – 15 сек при 94°C, 30 сек при 65°C и 15 сек при 72°C, считывание сигнала. Каждую реакцию анализировали в 4-х повторах и значение сигнала усредняли. Последовательности праймеров представлены в таблице 2. Таблица 2. Последовательности олигонуклеотидов, использованных для анализа уровня экспрессии генов. Название Последовательность прямого праймера Последовательность обратного праймера GAPDH AAACTGTGGCGTGATGGC CAGTGGGGACACGGAAGG р16 ACAACTGCCCCCGCCACAAC ACAGTGAAAAGGCAGAAGCGGTG р21 AAGGCAGGGGGAAGGTGGGG GGGGGAGGGACAGCAGCAGA Top1 ACGAATCAAGGGTGAGAAGGAC TGTCGATGAAGTACAGGGCTAC гена 4.2.10.Приготовление белковых экстрактов и вестерн-блот гибридизация Для приготовления белковых экстрактов 107 клеток промывали 2 раза PBS и лизировали в RIPA буфере (50 mM Трис-HCl pH 8.0, 150 мM NaCl, 1% Тритон X-100, 0.5% дезоксихолат натрия, 0.1% додецилсульфат натрия, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, коктейль ингибиторов протеаз, коктейль ингибиторов фосфатаз) в течение 30 мин на льду. После этого экстракты обрабатывали ультразвуком для разрушения ДНК на 48 приборе VirSonic 100 и хранили на -70С. Общее количества белка в клеточных лизатах определяли по методу Брэдфорд [390]. Белковые образцы разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях согласно оригинальной методике [391]. После электрофореза белки переносили на ПВДФ-мембрану (Amersham) в соответствии с инструкцией производителя. Мембрану блокировали PBST (PBS c добавлением 0.1% Tween) с добавлением либо 2% БСА, либо 2% ECL Advance blocking reagent в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем инкубировали с первичными антителами, разведёнными на PBST, в течение ночи при 4°С. От несвязавшихся антител мембрану отмывали PBST 3 раза по 10 минут и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена один час при комнатной температуре. После отмывок от несвязавшихся антител интересующие белки выявляли с помощью реактива для детекции хемилюминесценции Pierce ECL plus в соответствии с инструкцией производителя. 4.2.11.Проточная цитофлуориметрия Клетки линии HeLa (107) промывали PBS, снимали с чашек 0.25% раствором трипсина при 37°С 5 мин, действие трипсина нейтрализовали 4-кратным избытком среды DMEM и разбивали конгломераты клеток до одиночных. Клетки осаждали центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин) и фиксировали в растворе холодного (-20°С) 70% этанола 20 минут при комнатной температуре. Затем клетки осаждали, промывали PBS и инкубировали 30 мин в растворе, содержащем 0.1% цитрат натрия, 0.3% NP-40, 50 мг/мл пропидий йодид, 50 мг/мл рибонуклеазу А. После промывок PBS клеточную суспензию анализировали на проточном цитофлуориметре MACSQuant. 4.2.12.Нейтральный гель-электрофорез одиночных клеток (метод ДНК-комет) Клетки HeLa промывали PBS, снимали с чашек 0.25% раствором трипсина при 37°С 5 мин, действие трипсина нейтрализовали 4-кратным избытком среды DMEM и разбивали конгломераты клеток до одиночных. Затем клетки осаждали и ресуспендировали в растворе Версена в концентрации 105 клеток/мл. Каждую аликвоту объёмом 50 мкл смешивали с 50 мкл заранее нагретой до 37°С 2% легкоплавкой 49 агарозой. Смесь наносили на 3 мм подложку 2% обычной агарозы. Препараты выдерживали 10 минут при 4°С и помещали в лизирующий буфер (0.5% додецилсульфат натрия, 50 мM ЭДТА, 100 мкг/мл протеиназы K, pH 8.0) на ночь при 50°С. После промывки раствором PBS препараты помещали в камеру для горизонтального электрофореза. Электрофорез проводили при 1.5 В/см в течение 30 мин при 4°С в буфере ТБЕ (89 мМ Трис pH 8.3, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА). Затем препараты дегидратировали 96% этанолом, высушивали на воздухе и окрашивали раствором SYBR Green I. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss AxioScope A1. Анализ полученных изображений проводили с помощью программного обеспечения CometScore. 4.2.13.Определение активности ДНК-топоизомеразы I (метод релаксации плазмидной ДНК) Определение активности ДНК-топоизомеразы I проводили по оригинальной методике с изменениями [392]. Клетки HeLa (107) после соответствующих обработок промывали PBS, снимали с чашек 0.25% раствором трипсина при 37°С 5 мин. Действие трипсина нейтрализовали 4-кратным избытком среды. Клетки сразу же ресуспендировали в 180 мкл охлажденного низкосолевого буфера (20 мM Трис-HCl pH 7.5, 5 мM КCl, 1 мM MgCl2, 10% глицерол) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз, 1 мМ ДТТ и 1 мМ PMSF. Клетки вскрывали на льду с помощью гомогенизатора Даунса пятнадцатью мягкими движениями пестика, ядра осаждали центрифугированием при 15000 g 3 минуты. Ядра ресуспендировали в 180 мкл охлаждённого высокосолевого буфера (20 мM Трис-HCl pH 7.5, 350 мM КCl, 1 мM MgCl2, 10% глицерол, коктейль ингибиторов протеаз, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF) и инкубировали на льду 30 минут при мягком перемешивании. После этого ядра осаждали центрифугированием (15000 g 10 минут), а супернатант использовали для определния активности фермента. Реакцию проводили в 20 мкл раствора, содержащего 50 мM Трис-HCl pH 7.5, 100 мM КCl, 10 мM ЭДТА, 5 мг/мл БСА и 1 мкг суперскрученной плазмиды pEGFP-N1. В реакционную смесь добавляли 0.5 или 1 мкг ядерного экстракта и инкубировали при 37°С в течение 10 или 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл раствора, содержащего 50 мМ ЭДТА, 50% глицерола и 0.5% бромфенолового синего. Электрофорез ДНК 50 проводили в 0.8% агарозном геле в буфере ТАЕ (50 мM Трис-HCl pH 8.0 и 2 мМ ЭДТА). Гель окрашивали бромистым этидием. 4.2.14.K+-ДСН-преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов Метод K+/ДСН-преципитации проводили по оригинальной методике с изменениями [393]. Культуру клеток HeLa инкубировали в среде с 100 мкМ BrdU в течение 24 часов. Перед воздействием теплового стресса или камптотецина клетки промывали средой, снимали с чашек 0.25% раствором трипсина при 37°С 5 мин и ресуспендировали в растворе PBS до конечной концентрации 105 клеток/мл. Клетки лизировали добавлением 1 мл прогретого до 65°С лизирующего буфера (1.25% додецилсульфат натрия; 5 мM ЭДТА, 0.4 мкг/мл ДНК спермы лосося, pH 8.0), инкубировали 10 минут при 65°С и подвергали действию ультразвука. К экстракту добавляли 250 мкл 325 мМ КCl, тщательно перемешивали. Затем 1 мл экстракта переносили в 1.5 мл пробирки Low bind Eppendorf, охлаждали на льду 10 минут и центрифугировали (15000 g, 15 минут, 4°С). Осадок ресуспендировали в 1 мл раствора, содержащего 10 мM Трис-HCl pH 8.0, 100 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА и 0.1 мкг/мл ДНК спермы лосося, и нагревали до 65°С в течение 10 минут при перемешивании. Затем материал помещали в лёд на 10 минут и центрифугировали. Осадок растворяли в буфере для депротеинизации (0.5% додецилсульфат натрия, 10 мM Трис-HCl pH 8.0, 50 мM ЭДТА, 10 мкг/мл протеиназы K), инкубировали в течение ночи при 60°С. Выделение ДНК проводили экстракцией фенол/хлороформом с последующим осаждением этанолом. Осадок растворяли в 0.6 М NaOH и денатурировали на водяной бане при 95°С 10 минут. Затем наносили на мембрану Hybond-N (GE Healthcare) с помощью системы дот-блоттинга (Bio-Rad). После этого мембрану блокировали PBST с добавлением 2% ECL Advance blocking reagentв течение часа при комнатной температуре. ДНК выявляли с помощью первичных антител против BrdU, разведённых на PBST, в течение ночи при 4°С. От несвязавшихся антител мембрану отмывали раствором PBST 3 раза по 10 минут, затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Amersham), в течение часа при комнатной температуре. После отмывок от несвязавшихся антител ДНК выявляли с помощью реактива для детекции 51 хемилюминесценции Pierce ECL plus в соответствии с инструкцией производителя. Иммуноблот сканировали и анализировали с помощью программы ImageJ (1.44). 4.2.15.Преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов этанолом (RADAR) Метод RADAR проводили по оригинальной методике с изменениями [394,395]. Клетки HeLa (107) после соответствующих обработок промывали PBS, снимали с чашек 0.25% раствором трипсина в течение нескольких минут при 37°С. Действие трипсина нейтрализовали 4-кратным избытком DMEM. Клетки сразу ресуспендировали в 180 мкл охлажденного низкосолевого буфера (20 мM Трис-HCl pH 7.5, 5 мM КCl, 1 мM MgCl2, 10% глицерол) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз,1 мМ ДТТ и 1 мМ PMSF. Клетки вскрывали на льду с помощью гомогенизатора Даунса, ядра осаждали центрифугированием при 15000 g 3 минуты. Ядра ресуспендировали в 180 мкл охлаждённого высокосолевого буфера (20 мM Трис-HCl pH 7.5, 350 мM КCl, 1 мM MgCl2, 10% глицерол, коктейль ингибиторов протеаз, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF) и инкубировали на льду 30 минут. Ядра осаждали центрифугированием при 15000 g 10 минут и лизировали в течение 30 минут на льду в 1 мл реагента «DNAzol» с добавлением 1% лаурилсаркозината натрия. Для разрушения ДНК экстракты подвергали ультразвуковому воздействию с помощью аппарата VirSonic 100. ДНК-белковые комплексы осаждали добавлением равного объема 96% этанола, центрифугировали (15000 g 10 минут), осадок промывали 75% этанолом и растворяли в 8 мМ NaOH. Образцы наносили на мембрану PVDF-мембрану (Amersham) с помощью аппарата для дот-блоттинга (Bio-Rad). Мембрану блокировали PBST с добавлением 2% ECL Advance blocking reagent в течение часа при комнатной температуре. Затем мембрану инкубировали с первичными антителами против ДНК-топоизомеразы I, разведёнными на PBST, в течение ночи при 4°С. От несвязавшихся антител мембрану отмывали раствором PBST 3 раза по 10 минут, затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение часа при комнатной температуре. После отмывок от несвязавшихся антител иммуноблот проявляли реактивами для хемилюминесценции Pierce ECL plus в соответствии с инструкцией производителя. Иммуноблот сканировали и анализировали с помощью программы ImageJ (1.44). 52 5. Результаты и обсуждение 5.1. Тепловой стресс индуцирует преждевременное старение клеток человека История изучения клеточного ответа на тепловой стресс насчитывает не один десяток лет. Как ни странно, за всё это время внимание ученых было акцентировано лишь на краткосрочных эффектах гипертермии, т.е. на эффектах, проявляющихся в первые минуты или часы после стресса. При этом существует достаточно скромное количество работ, посвященных изучению долгосрочных или отставленных во времени эффектов теплового стресса на клетки высших эукариот. Результаты этих исследований сводятся в основном к простому дуализму: либо клетка погибает различными путями клеточной смерти, либо полностью восстанавливает свою пролиферативную активность [17]. Мы полагаем, что данный сценарий является достаточно упрощенным, поскольку, во-первых, не предполагает механизма переключения с одного варианта на другой, а вовторых, не дает ответа на немаловажный вопрос: почему клетки могут по-разному реагировать на тепловой стресс, и каков ключевой компонент такого избирательного ответа. Для того чтобы ответить на эти вопросы, мы начали с того, что следили за состоянием культуры клеток рака шейки матки (линия HeLa) в течение нескольких суток после теплового стресса. Интересно, что спустя трое суток после острого температурного воздействия (45.5°С в течение 30 минут) большинство клеток из популяции продолжали активно пролиферировать. В то же время в популяции присутствовала небольшая доля клеток с необычными морфологическими признаками. Эти клетки сильно увеличивались в размере, уплощались, диаметр их ядер возрастал в 2-3 раза. Аналогичные результаты были получены на клетках линии рака молочной железы MCF7 (Рисунок.6). Мы решили проверить пролиферативную активность обнаруженных нами морфологически измененных клеток HeLa. Для этого спустя 72 часа после теплового стресса клетки инкубировали в культуральной среде с добавлением аналога нуклеотида этинилдезоксиуридина (EdU). В процессе репликации EdU включается в новосинтезируемые цепи ДНК, и после флуоресцентного выявления с помощью Cu2+зависимой клик-реакции (click chemistry) позволяет идентифицировать 53 Рисунок 6. Морфология клеток HeLa и MCF7 спустя 5 суток после острого теплового стресса. Клетки линии HeLa и MCF7 подвергали действию теплового стресса при 45.5С в течение 30 минут и после снятия воздействия культивировали в нормальных условиях на протяжении 5 суток. Фотографии получены с помощью светового микроскопа. пролиферирующие клетки. Используя этот подход, мы обнаружили, что все клетки с аномальной морфологией не включали EdU, что свидетельствовало об их пролиферативной инертности (Рисунок 7). По совокупности признаков, а именно характерным фенотипическим изменениям (увеличение размера и уплощение) клеток и потере ими пролиферативного потенциала мы предположили, что эти клетки проявляют фенотип стресс-индуцированного клеточного старения. Одним из общепринятых маркеров старения является повышение в лизосомах активности фермента β-галактозидазы (SA-β-Gal), которая проявляет свою активность при нехарактерном значении рН 6.0. О наличии SA-β-Gal принято судить по появлению характерных синих гранул в цитоплазме после инкубации клеток с субстратом X-Gal при рН 6.0. В культуре клеток HeLa мы наблюдали значительное увеличение интенсивности окраски и числа SA-β-Gal-позитивных клеток спустя 72 часа после теплового стресса (Рисунок 8). Интересно, что подобные эффекты мы также наблюдали и в культуре клеток первичных фибробластов кожи человека (Рисунок 8). Рисунок 7. Анализ пролиферативной активности клеток HeLa после острого теплового стресса. Клетки линии HeLa подвергали действию теплового стресса при 45.5С в течение 30 минут и спустя 72 часа анализировали пролиферативную активность клеток по включению EdU (10 мкM, 30 минут). EdU выявляли с помощью набора реагентов Click-iT EdU Imaging kit. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса 25мкм. 54 Рисунок 8. Анализ активности фермента SA-β-Gal в клетках HeLa и HF после теплового стресса. Клетки линии HeLa и HF подвергали действию теплового стресса при 45.5С в течение 30 минут и спустя 72 часа анализировали активность фермента SA-β-Gal. Масштабная полоса - 25мкм. Таким образом, представленные результаты свидетельствуют, что тепловой стресс способен инициировать преждевременное старение в культурах клеток человека, причем как в трансформированных, так и в первичных. 5.2. Преждевременное старение, индуцированное тепловым стрессом, развивается по p21-зависимому пути Известно, что в активации и поддержании клеточного старения в основном задействованы два сигнальных пути: р16INK4a-рRb- и р53-p21CIP1/WAF1-зависимый. Чтобы разобраться какой из сигнальных путей реализуется при индуцированном тепловым стрессом старении, мы определили динамику экспрессии ингибиторов циклинзависимых киназ р16INK4a и p21CIP1/WAF1 в течение 72 часов после теплового стресса (Рисунок 9). С помощью количественной ОТ-ПЦР мы показали, что в течение первых суток после теплового стресса в клетках HeLa возрастает уровень экспрессии только p21CIP1/WAF1. Повышенный уровень экспрессии p21CIP1/WAF1 поддерживается как минимум Рисунок 9. Анализ уровня экспрессии генов р16 и p21 в культуре клеток HeLa после теплового стресса. А. Клетки линии HeLa подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в нормальных условиях на протяжении 6, 24 и 72 часов. На основе выделенной РНК из контрольных и подвергнутых тепловому стрессу клеток получали кДНК и анализировали уровень экспрессии р21 и р16 методом ПЦР в реальном времени. Уровень амплифицированной кДНК нормировали на уровень кДНК GAPDH. Б. Вестерн-блот анализ аналогичных кинетических точек с использованием антител против р21 и гистона Н3 (контроль нанесения). 55 до трех суток после теплового стресса (Рисунок 9А). Данные об увеличении экспрессии p21CIP1/WAF1 мы также подтвердили с помощью вестерн-блот анализа (Рисунок 9Б). Таким образом, можно полагать, что тепловой стресс индуцирует клеточное старение путем активации p21CIP1/WAF1-зависимого сигнального пути. 5.3. Только клетки, находящиеся в ранней S-фазе клеточного цикла в момент теплового стресса, приобретают фенотип клеточного старения Тот факт, что не все клетки в асинхронной клеточной культуре приобретают фенотип клеточного старения, предполагает разную чувствительность клеток к тепловому стрессу. Ранее нами было показано, что краткосрочные эффекты теплового стресса зависят от стадии клеточного цикла, на которой находится конкретная клетка в популяции [321]. Мы предположили, что проявление фенотипа клеточного старения, индуцированного тепловым стрессом, также зависит от стадии клеточного цикла. Для проверки этой гипотезы культуру клеток HeLa синхронизировали с помощью двойного тимидинового блока. На рисунке 10А представлена схема синхронизации. Варьируя время инкубации клеток в среде без тимидина мы получали клетки, синхронизированные по G1-, G2- и нескольким суб-S-фазам клеточного цикла. Таким образом, мы имели возможность работать не просто со среднестатистическими S-фазными клетками, но с каждой из подфаз синтетической стадии клеточного цикла в отдельности. Эффективность описанной схемы Рисунок 10. Синхронизация клеток HeLa двойным тимидиновым блоком. А. Схема эксперимента по синхронизации клеток HeLa двойным тимидиновым блоком. Для получения фракций клеток на разных стадиях клеточного цикла синхронизированные клетки инкубировали в среде без тимидина на протяжении 0.5, 1, 2, 3, 4, 6 и 8 часов. Б. Проверка эффективности синхронизации клеток HeLa двойным тимидиновым блоком по разным фазам клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии (FACS; внизу) и с помощью анализа паттернов включения EdU (10 мкM, 30 минут), характерных для разных суб-S-фаз клеточного цикла. EdU детектировали с помощью набора реагентов Click-iT EdU Imaging kit. Масштабная полоса - 20 мкм. 56 синхронизации мы проверяли методом проточной цитофлуориметрии (Рисунок 10Б). Разделение S-фазы клеточного цикла на субфазы (раннюю, среднюю, позднюю) проводили на основании характерного для них паттерна фокусов репликации [396,397]. Для этого, синхронизированные и инкубированные в среде без тимидина клетки HeLa инкубировали в среде с EdU; по паттерну выявленных фокусов репликации ДНК определяли принадлежность к той или иной суб-S-фазе (Рисунок 10Б). После синхронизации, клетки, находящиеся на каждой из вышеперечисленных стадий клеточного цикла, подвергали тепловому стрессу (45.5°С, 30 минут) и культивировали в нормальных условиях при 37°С в течение 72 часов (Рисунок 11А). Через трое суток после теплового стресса мы оценивали морфологию клеток (Рисунок 11Б). Выяснилось, что только клетки, находящиеся на стадии ранней S-фазы в момент действия теплового стресса, приобретали морфологические черты характерные для клеточного старения. Чтобы убедиться, что именно ранняя S-фаза проявляет повышенную чувствительность к тепловому стрессу, мы сравнили клетки, находящиеся на ранней и поздней S-фазе друг с другом по активности SA-β-Gal и экспрессии p21CIP1/WAF1. Рисунок 11. Определение чувствительности клеток HeLa, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, к тепловому стрессу А. Схема эксперимента по определению чувствительности клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, к тепловому стрессу. Фракции клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в нормальных условиях в течение 72 часов. После этого анализировали морфологические изменения клеток по увеличению размеров ядер (Б). ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 25мкм. Результаты эксперимента, представленные на рисунке 12, выглядели весьма интригующе. Признаки клеточного старения, т.е. изменение морфологии, высокая активность β-галактозидазы и экспрессия p21CIP1/WAF1, проявлялись только в тех клетках, которые были подвергнуты тепловому стрессу в ранней S-фазе. В то же время, клетки, находившиеся при тепловом стрессе на любой другой стадии клеточного цикла, через трое суток демонстрировали нормальную морфологию и активность SA-β-Gal 57 Рисунок 12. Чувствительность клеток HeLa, находящихся в ранней и поздней S-фазе, к тепловому стрессу. Клетки HeLa, находящиеся в ранней и поздней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в нормальных условиях в течении 72 часов. После этого фракции клеток вместе с контрольными клетками HeLa (без воздействия стресса) фиксировали и проводили иммуноцитохимическое окрашивание антителами против р21. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Аналогичные экспериментальные точки использовались для анализа активности SA-β-Gal. Масштабная полоса - 25мкм. сопоставимую с контрольным уровнем. Таким образом, клетки демонстрирующие признаки клеточного старения через несколько суток после гипертермии имели «раннеS-фазное» происхождение. 5.4. Преждевременное старение, индуцированное тепловым стрессом, останавливает пролиферацию клеток в G2-фазе клеточного цикла Клеточное старение является частным случаем ареста пролиферации [3,25]. Стоит отметить, что клеточное старение может представлять собой как G1-, так и G2-арест клеточного цикла [35,398]. Поскольку, мы показали, что преждевременное старение в ответ на гипертермию развивается только в S-фазных клетках, необходимо было определить к какому типу ареста пролиферации оно приводит – G1-, G2- или, даже, внутри-S-фазному. Для решения этой задачи клетки HeLa синхронизировали с помощью двойного тимидинового блока по вышеописанной схеме (Рисунок 10А), после чего каждую из полученных синхронных популяций подвергали действию теплового стресса (45.5°С, 30 минут). Затем клетки инкубировали в нормальных условиях при 37°С, и через 72 часа анализировали профили распределения клеток по фазам клеточного цикла с помощью проточной цитофлуориметрии (Рисунок 13А). Из результатов эксперимента видно, что клетки, подвергнутые тепловому стрессу на стадиях G1, G2, средней или поздней S, через трое суток после стресса демонстрируют нормальное цитометрическое распределение. В то же время клетки, подвергнутые тепловому стрессу в ранней S-фазе, 58 Рисунок 13. Профили распределения клеток HeLa, подвергнутых действию теплового стресса на разных стадиях клеточного цикла, по фазам клеточного цикла после 72-часового периода восстановления. А. Клетки HeLa, синхронизированные по разным фазам клеточного цикла с помощью двойного тимидинового блока подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в нормальных условиях в течении 72 часов. Профили распределения клеток по фазам клеточного цикла анализировали методом проточной цитофлуориметрии (FACS). Аналогичные экспериментальные точки иммуноокрашивали антителами против циклина В1 (Б). Масштабная полоса - 25 мкм через трое суток после стресса накапливались в G2-фазе клеточного цикла (Рисунок 13А). Этот результат свидетельствует о том, что клетки проявляющие признаки клеточного старения, индуцированного тепловым стрессом, находятся в G2-аресте. Поскольку не происходит увеличения количества клеток, застигнутых тепловым стрессом в ранней S-фазе, можно заключить, что они оказываются арестованными в G2 так и не пройдя ни одного раунда деления. Данные проточной цитофлуориметрии мы подтвердили с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания клеток против G2специфического маркера циклина B1 (Рисунок 13Б). 5.5. Тепловой стресс индуцирует персистирующие сигналы о повреждениях ДНК только в клетках, находящихся в ранней S-фазе Хорошо известно, что сложно- или нерепарируемые повреждения ДНК являются одной из основных причин индукции преждевременного клеточного старения [42]. Чтобы определить, присутствуют ли персистирующие сигналы о повреждениях ДНК в клетках HeLa, демонстрирующих индуцированное гипертермией преждевременное старение, мы определили наличие в таких клетках фосфорилированной по серину 139 формы гистона H2AX (γH2AX). Для этого синхронизированные по ранней и поздней Sфазам клетки HeLa подвергали действию теплового стресса, инкубировали при 37°С в течение 72 часов, после чего проводили иммунофлуоресцентное окрашивание γH2AX и 59 вестерн-блот анализ (Рисунок 14А, Б). Выяснилось, что клетки, проявляющие фенотип клеточного старения, через 3 дня после теплового стресса имеют достаточно высокий уровень γH2AX (Рисунок 14А, Б). Более того, обнаруженные фокусы γH2AX содержат и другие хорошо известные репарационные белки - 53BP1 и Rad51 (Рисунок 14В). Подобный состав репарационных фокусов обычно характерен для сложнорепарируемых повреждений ДНК, часто наблюдаемых в клетках с фенотипом клеточного старения [42]. Из этого следует, что вероятной причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК. Следует отметить, что в клетках, подвергнутых действию теплового стресса на стадии поздней Sфазы, через трое суток после стресса уровень γH2AX был сопоставим с таковым в контрольных клетках (Рисунок 14А, Б). Рисунок 14. Индукция персистирующих сигналов о повреждении ДНК в культуре клеток HeLa после теплового стресса. А. Клетки HeLa, находящиеся в ранней и поздней S-фазах, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в нормальных условиях в течении 72 часов. После этого клетки фиксировали и проводили иммуноцитохимическое окрашивание антителами против γН2АХ. В качестве контроля использовали клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе и культивированные в нормальных условиях в течение 72 часов. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса – 25 мкм. Б. Вестерн-блот анализ кинетики гистона γН2АХ в клетках HeLa, подвергнутых действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) в ранней и поздней S-фазе, и культивируемых в нормальных условиях в течение 0, 6 или 72 часов. В качестве контроля нанесения использовали коровый гистон Н3. В. Клетки HeLa, находящиеся в ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в нормальных условиях в течении 72 часов. Клетки фиксировали и проводили иммуноцитохимическое окрашивание антителами против белков 53BP1 и Rad51. В качестве контроля использовали клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе и культивируемые в нормальных условиях в течение 72 часов. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 25мкм. 60 5.6. В результате теплового стресса возникают две волны фосфорилирования гистона H2AX, осуществляемого разными киназами Известно, что аккумуляция репарационных белков в фокусы может быть вызвана следующими причинами: репликативным стрессом, одно-, двуцепочечными разрывами ДНК и нарушением структуры теломерной петли. Чтобы разобраться с природой повреждений ДНК, вызванных тепловым стрессом, мы решили проследить кинетику формирования сигналов о повреждениях ДНК и выяснить, какие из известных репарационных киназ активируются при этих повреждениях. Клетки линии HeLa, находящиеся в ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5°С, 30 минут) и культивировали при 37°С от 0 до 72 часов. Через определенные промежутки времени (0, 3, 6, 24 и 72 часа) клетки фиксировали и проводили иммунофлуоресцентное окрашивание антителами против репарационных белков: γH2AX, 53BP1и Rad51 (Рисунок 15). Видно, что сразу после теплового стресса, большинство клеток имеют большое количество маленьких фокусов γH2AX. При этом другие репарационные белки, 53BP1и Rad51 не колокализуются с этими фокусами. Однако уже через 3-6 часов после теплового стресса картина начинает меняться: количество фокусов γH2AX уменьшается, они становятся более крупными. Кроме того, к этим фокусам начинают привлекаться белки 53BP1и Rad51, которые к 6 часам после стресса полностью колокализуются с фокусами γH2AX (Рисунок 15). Все это свидетельствует о существовании двух волн функционально различных сигналов о повреждении ДНК, индуцированных тепловым стрессом. Существует несколько киназ, осуществляющих фосфорилирование гистона H2AX по серину 139 при различных типах повреждений ДНК: ATM, ATR и DNA-PK, относящихся к одному суперсемейству фосфотидилинозитол-3-подобных киназ (PIKK) [399]. Чтобы выяснить, какие из этих киназ осуществляют фосфорилирование H2AХ в различные временные интервалы после теплового стресса, мы рассчитывали интенсивность флуоресценции γH2AX в клетках в условиях ингибирования активностей PIKK-киназ. Для этого мы воспользовались методом РНК-интерференции для подавления экспрессии генов, кодирующих киназы ATM, ATR и DNA-PK, и 61 Рисунок 15. Кинетика формирования репарационных фокусов в «ранне-S-фазных» клетках HeLa после воздействия теплового стресса. Клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в нормальных условияхп 0, 1, 3, 6, 24 или 72 часа. После этого клетки фиксировали и проводили иммуноцитохимическое окрашивание антителами против γH2AX, 53BP1 и Rad51. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 25 мкм. ингибиторным анализом для подавления активности этих киназ. Клетки HeLa, трансфецированные различными наборами миРНК, либо обработанные ингибиторами киназ, синхронизировали по ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5°С, 30 минут) и иммуноокрашивали против гистона γH2AX сразу после теплового стресса (Рисунок 16А) и спустя шестичасовой период восстановления (Рисунок 16Б). Известно, что DNA-PK является основным компонентом NHEJ и необходима для репарации двуцепочечных разрывов ДНК [400]. Существуют данные, что активация DNA-PK может происходить при репликативном стрессе [321,401]. Ранее мы показали на примере клеток MCF7, что активация DNA-PK ассоциирована с индуцированным тепловым стрессом ингибированием репликации ДНК и образованием ОЦР в S-фазных 62 Рисунок 16. Количественная оценка уровня γH2AX в «ранне-S-фазных» клетках HeLa в условиях подавления активностей PIKK киназ и воздействия теплового стресса. Клетки HeLa предварительно трансфецировали миРНК (обозначены как «i») или обрабатывали химическими соединениями для подавления активности ATM (iATM и KU55933), ATR (iATR и кофеин) или DNA-PK (iPRKDC и NU7026), синхронизировали по ранней S-фазе и подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут). Сразу после теплового стресса (А) или спустя 6 часов (Б) проводили иммуноцитохимическое окрашивание антителами против γH2AX. Точка диаграмме отражает общий уровень интенсивности сигнала γH2AX в отдельной клетке. Горизонтальные линии обозначают достоверные *Р <0,0001 и недостоверные ** различия (t-тест, n > 90). клетках [321]. В клетках HeLa могут происходить аналогичные процессы. Результаты, представленные на рисунке 16, демонстрируют существенное падение интенсивности сигнала γH2AX сразу после теплового стресса при ингибировании экспрессии DNA-PK (Рисунок 16A), но не ATM или ATR. Спустя 6 часов такой же эффект наблюдается при ингибировании ATM и ATR, но не DNA-PK (Рисунок 16Б). Из этого следует, что фокусы первой волны фосфорилирования H2AX зависят от активности DNA-PK, а фокусы γH2AX второй волны – от киназ ATM и ATR. На основе полученных результатов мы заключили, что в клетках HeLa, также, как и в клетках MCF7, в первые минуты и часы после теплового стресса активируется киназа DNA-PK. Если же в клетках HeLa при восстановлении движения вилок репликации ДНК происходит конверсия одноцепочечных разрывов в двуцепочечные, можно предположить, что эти ДЦР репарируются с участием киназ ATM и ATR. Так как признаки клеточного старения развивается только спустя 24 часа после стресса, то в сигнальном каскаде активации клеточного старения могут участвовать только киназы ATM и ATR. Известно, что активация этих киназ при клеточном старении часто вызывается нарушением структуры теломер, репликативным стрессом или труднорепарируемыми двуцепочечными разрывами ДНК [42,104]. Мы решили определить природу индуцированных тепловым стрессом персистирующих сигналов о повреждении ДНК. 63 5.7. Индуцированная тепловым стрессом диссоциация TRF2 не является источником сигналов о повреждении ДНК Большое количество данных указывает на то, что одной из основных причин репликативного старения является разворачивание теломерной петли (t-петли) [402]. Развёрнутый конец хромосомы узнаётся как двуцепочечный разрыв и маркируется репарационными белками γH2AX и 53BP1. Подобное нарушение структуры концевых участков хромосом запускает сигнальный каскад с участие киназ ATM и ATR [402]. Причинами нарушения структуры t-петли могут быть укорочение длины теломер или нарушение целостности нуклеопротеинового (шелтеринового) комплекса, организующего t-петлю [101]. Мы решили проверить, реализуется ли этот сценарий активации клеточного старения при тепловом стрессе культур клеток человека. О целостности теломерной петли в первую очередь свидетельствует наличие белков шелтеринового комплекса на концах хромосом [101]. Одним из основных компонентов комплекса является белок TRF2 [100]. Методом иммунофлуоресцентного окрашивания мы проанализировали наличие белка TRF2 на концах хромосом в контрольных клетках и клетках, подвергнутых тепловому стрессу (Рисунок 17А). Результаты демонстрируют, что тепловой стресс вызывает диссоциацию большей части TRF2 из теломер (Рисунок 17А). Стоит, однако отметить, что с помощью вестернблот анализа мы показали, что диссоциация TRF2 не связана с деградацией этого белка в результате действия теплового стресса (Рисунок 17Б). Известно, что нехватка белка TRF2 нарушает нормальную организацию t-петли, приводит к аккумуляции репарационных белков γH2AX и 53ВР1 на концах хромосом и запускает ATMзависимое клеточное старение [100,107]. В связи с этим возникло предположение, что наблюдаемая релокализация белка TRF2 из теломерных участков может нарушать целостность шелтеринового комплекса, и, как следствие, служить потенциальной причиной образования персистирующих повреждений ДНК. 64 Рисунок 17. Тепловой стресс приводит к перераспределению белка TRF2 внутри ядра. А. Распределение белка TRF2 в ядрах контрольных и подвергнутых тепловому стрессу (45.5С, 30 минут) клеток MCF7 и HF. Клетки фиксировали и проводили иммуноцитохимическое окрашивание антителами против белка TRF2. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 15мкм. Б. Вестерн-блот анализ TRF2 в контрольных клетках MCF7 и в клетках после воздействия теплового стресса (45.5⁰С, 30 минут). В качестве контроля нанесения был использован ламин B1. Чтобы выяснить, приводит ли диссоциация TRF2 из теломерных петель к нарушению структуры теломер и возникновению персистирующих сигналов о повреждении ДНК, мы провели флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) с зондом к теломерной последовательности ДНК совместно с иммунокрашиванием антителами против γH2AХ (Рисунок 18). Рисунок 18. Индуцированные тепловым стрессом репарационные фокусы γH2AX не ассоциированы с теломерными последовательностями. Клетки MCF7 и HF после воздействия теплового стресса (45.5С, 30 минут) фиксировали и проводили флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) с пробой к теломерной последовательности ДНК совместно с иммуноокрашиванием антителами против γН2АХ. Масштабная полоса - 15 мкм. 65 Полученные результаты демонстрируют, что сигналы о повреждениях ДНК, индуцированные тепловым стрессом, не колокализуются с теломерными последовательностями. Таким образом, несмотря на то, что тепловой стресс приводит к диссоциации TRF2 из теломер, это не является причиной возникновения персистирующих сигналов о повреждении ДНК (и, как следствие, клеточного старения) в клетках, подвергнутых действию гипертермии. 5.8. Ингибирование ДНК-топоизомеразы I приводит к преждевременному старению клеток, находящихся в ранней S-фазе Исключительная чувствительность ранней S-фазы к тепловому стрессу заставила задуматься о причастности процесса репликации к возникновению сигналов о повреждении ДНК. Известно, что ранняя S-фаза отличается от других фаз высоким уровнем репликации ДНК [403]. Ранее нами было показано, что острый тепловой стресс (45.5°С, 30 минут) приводит к краткосрочной остановке репликации [321]. Известно, что репликативный стресс может приводить к образованию сложнорепарируемых повреждений ДНК и таким образом служить причиной активации клеточного старения. В связи с этим, у нас возникло предположение, что гипертермия активирует программу клеточного старения, вызывая репликативный стресс и связанные с ним повреждения ДНК. Чтобы проверить эту гипотезу мы решили смоделировать ситуацию репликативного ареста у клеток, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла, и проанализировать появление признаков клеточного старения. Для этого мы воспользовались химическими агентами, ингибирующими репликацию ДНК по известным механизмам. Были использованы: ингибитор эукариотической ДНКполимеразы α – афидиколин (APH, 10 мкМ, 60 минут), ингибитор рибонуклеотидредуктазы - гидроксимочевина (HU, 10 мкМ, 60 минут) и ингибитор ДНК-топоизомеразы I – камптотецин (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут). Афидиколин напрямую подавляет репликацию посредством образования комплексов между ДНК и ДНКполимеразой α [404]. Гидроксимочевина и камптотецин ингибируют репликацию опосредованно - гидроксимочевина ингибирует рибонуклеотидредуктазу и истощает пул нуклеотидов, необходимых для синтеза ДНК [405], а камптотецин стабилизирует 66 ковалентный комплекс, образованный между ДНК и ДНК-топоизомеразой I в момент внесения ферментом одноцепочечного разрыва в одну из цепей ДНК [406]. Ковалентные комплексы являются физическими преградами для прохождения репликативной машины [407]. Клетки HeLa, находящиеся в ранней S-фазе, обрабатывали вышеперечисленными химическими агентами, отмывали и инкубировали в свежей среде в течение 48 часов. Проявление фенотипа клеточного старения определяли по морфологическим признакам и появлению персистирующих сигналов о повреждении ДНК (фокусов γH2AX) (Рисунок 19А). К нашему удивлению, мы обнаружили, что только камптотецин приводил к возникновению фенотипа клеточного старения (Рисунок 19А). Более того, камптотецин, также, как и тепловой стресс, провоцировал запуск программы клеточного старения исключительно в клетках, находящихся в ранней S-фазе на момент Рисунок 19. Камптотецин индуцирует клеточное старение в клетках, находящихся в ранней Sфазе. А. Клетки HeLa, находящиеся в ранней S-фазе, инкубировали в среде с добавлением афидиколина (APH, 10 мкМ, 60 минут), гидроксимочевины (HU, 10 мкМ, 60 минут) или камптотецина (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут), отмывали и инкубировали в свежей среде в течение 24 часов. Затем клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против γН2АХ. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Б и В. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней и поздней S-фазам, инкубировали в среде с добавлением камптотецина (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут) и после отмывок инкубировали в свежей среде в течение 48 часов. Затем клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против γН2АХ (А) или анализировали в них активность SA-β-Gal. ДНК окрашивали с помощью DAPI. Масштабная полоса - 25мкм. 67 воздействия камптотецина (Рисунок 19Б). Кроме морфологических признаков о проявлении фенотипа клеточного старения свидетельствовали высокая активность SAβ-Gal и наличие фокусов γH2AХ (Рисунок 19В). Общность эффектов действия теплового стресса и камптотецина натолкнула на идею об одинаковом механизме, лежащем в основе активации преждевременного клеточного старения этими стрессовыми факторами. Поскольку механизм действия камптотецина на клетку хорошо известен – он ингибирует активность ДНК-топоизомеразы I, мы предположили, что тепловой стресс также ингибирует активность этого фермента. 5.9. Тепловой стресс ингибирует ДНК-топоизомеразу I в клетках человека Сходство эффектов теплового стресса и камптотецина дала основание предположить, что ДНК-топоизомераза I является мишенью теплового стресса в клетках высших эукариот. Другими словами, мы предположили, что тепловой стресс может ингибировать активность этого фермента и приводить к образованию ковалентного комплекса между ДНК и ферментом. Для проверки этого утверждения, мы сравнили активности фермента ДНК-топоизомеразы I в экстрактах контрольных клеток HeLa и клеток после воздействия теплового стресса (Рисунок 20А). Мы воспользовались методом релаксации плазмидной ДНК in vitro. Метод основан на способности ДНКтопоизомезары I релаксировать супервитки ДНК путем внесения одноцепочечных разрывов в ДНК с последующим лигированием цепей ДНК [392]. В результате электрофоретического разделения можно детектировать продукты реакции, обладающие разной электрофоретической подвижностью: чем выше степень релаксации плазмиды тем ниже подвижность. На рисунке 20 хорошо видно, что активность ДНКтопоизомеразы I в результате действия теплового стресса падает по сравнению с контролем. Важное замечание состоит в том, что снижение активности фермента не было связано со снижением уровня экспрессии этого белка или его деградацией в результате действия теплового стресса, о чем свидетельствуют результаты вестерн-блот анализа (Рисунок 20Б). Интересным также представлялся вопрос о том, приводит ли тепловой стресс к образованию ковалентно связанных комплексов ДНК-топоизомеразы I и ДНК. Для детекции таких комплексов мы воспользовались двумя независимыми подходами: 68 Рисунок 20. Тепловой стресс ингибирует ДНК-топоизомеразу I в клетках человека. А. Определение активности ДНК-топоизомеразы I методом релаксации плазмидной ДНК. В реакционную смесь, содержащую суперскрученную плазмиду (СП), добавляли 0.5 или 1 мкг ядерного экстракта из контрольных клеток HeLa или клеток после воздействия теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали при 37С в течение 10 или 30 минут. Степень релаксации плазмидной ДНК определяли с помощью изменения электрофоретической подвижности ДНК в геле. Релаксированная плазмида обозначена как РП. Б. Вестерн-блот анализ ДНК-топоизомеразы I в контрольных клетках HeLa и в клетках после воздействия теплового стресса (45.5С, 30 минут). В качестве контроля нанесения был использован GM130. модифицированным методом K+/ДСН-преципитации [393] и преципитации ДНК/белковых комплексов этанолом [394,395]. Суть первого подхода состоит в осаждении белков с помощью ДСН и последующем выявлении следов ДНК в полученной фракции. Для этого ДНК метили включением аналога нуклеотида бромдезоксиуридина (BrdU) в течение суток, затем проводили преципитацию суммарного белка и анализировали количество соосаждённой ДНК в полученной фракции методом дот-блот анализа с использованием специфических антител против BrdU (Рисунок 21А). Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что тепловой стресс, также, как и камптотецин, приводит к сильному возрастанию количества ковалентно связанных ДНК/белковых комплексов в клетках HeLa (Рисунок 21А). Второй метод - преципитация ДНК/белковых комплексов этанолом или RADAR (от англ. Rapid approach for DNA-adduct recovery) [394,395], - является «обратным» для предыдущего подхода. Он основан на осаждении ДНК с помощью этанола и последующем выявлении следов интересующего белка в полученной фракции. Результаты, представленные на рисунке 21Б, демонстрируют возрастание количества ковалентно связанных комплексов между ДНК и ДНК-топоизомеразой I в клетках HeLa как в случае действия камптотецина, так и теплового стресса. Суммируя полученные данные, можно с уверенностью утверждать, что тепловой стресс ингибирует активность ДНК-топоизомеразы I in vivo и приводит к формированию ковалентно связанных 69 Рисунок 21. Тепловой стресс приводит к формированию ковалентно связанных комплексов между ДНК-топоизомеразой I и ДНК. А. Схематическое изображение метода K+/ДСН-преципитации ДНК/белковых комплексов (слева). Культуру клеток HeLa инкубировали в среде с 100 мкМ BrdU в течение 24 часов. Контрольные клетки и клетки после воздействия теплового стресса (45.5С, 30 минут) или камптотецина (CPT, 1 мкМ, 60 минут) лизировали и проводили преципитацию суммарного белка растворами, содержащими додецилсульфат натрия (ДСН) и KCl. Количество соосаждённой ДНК в полученных фракциях анализировали методом дот-блот анализа с антителами против BrdU. Б. Схематическое изображение метода преципитации ДНК/белковых комплексов этанолом (RADAR). Контрольные клетки и клетки после воздействия теплового стресса (45.5С, 30 минут) или камптотецина (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут) лизировали, фрагментировали ДНК ультразвуком и проводили преципитацию ДНК/белковых комплексов этанолом. Методом дот-блот анализа с использованием первичных антител против ДНК-топоизомеразы I определяли количество ДНК-топоизомеразы I в осажденных ДНК/белковых комплексах. комплексов между ферментом и ДНК. Следовательно, тепловой стресс ингибирует активность ДНК-топоизомеразы I аналогично действию камптотецина. 5.10. ДНК-топоизомераза I необходима для развития индуцированного тепловым стрессом клеточного старения Чтобы определить роль ДНК-топоизомеразы I в развитии индуцированного тепловым стрессом клеточного старения, мы решили проанализировать проявление признаков клеточного старения в условиях ингибирования экспрессии ДНК- топоизомеразы I. Для подавления экспрессии ДНК-топоизомеразы I мы воспользовались методом РНК-интерференции. Эффективность метода оценивали по количеству мРНК топоизомеразы I, полученной из контрольных клеток HeLa и клеток, трансфецированных набором миРНК (Рисунок 22А). Подобрав оптимальные условия, клетки HeLa трансфецировали миРНК, синхронизировали по ранней S-фазе и подвергали действию теплового стресса (45.5°С, 30 минут) или инкубировали в среде с камптотецином (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут). Спустя 72 часа культивирования клеток в 70 Рисунок 22. ДНК-топоизомераза I необходима для индукции клеточного старения, вызванного действием теплового стресса или камптотецина. А. Эффективность нокдауна ДНК-топоизомеразы I в клетках линии HeLa оценивали по уровню мРНК ДНК-топоизомеразы I. РНК выделяли из контрольных и трансфецированных миРНК клеток, проводили реакцию обратной транскрипции, и полученную кДНК анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. Уровень амплифицированной кДНК нормировали на уровень кДНК GAPDH. Б. Контрольные и трансфецированные (iTop1) клетки HeLa, синхронизировали по ранней S-фазе и подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) или камптотецина (CPT, 0.5 мкМ, 30 минут). После 72-часового периода восстановления анализировали процент клеток с признаками клеточного старения. КТ- трансфекция контрольной миРНК. нормальных условиях анализировали процентное содержание клеток, проявляющих морфологические признаки клеточного старения и имевших высокий уровень γH2AХ (Рисунок 22Б). На основе полученных данных, мы заключили, что в случае снижения количества ДНК-топоизомеразы I, эффекты теплового стресса и камптотецина были существенно снижались. Следовательно, ингибирование ДНК-топоизомеразы I является необходимым этапом в развитии индуцированного тепловым стрессом клеточного старения. 5.11. Репликация ДНК необходима для индукции клеточного старения, вызванного тепловым стрессом или действием камптотецина Принимая во внимание тот факт, что тепловой стресс подавляет репликацию ДНК, а также блокирует активность ДНК-топоизомеразы I (Рисунок 20А), мы решили проверить взаимосвязь этих событий друг с другом. Мы рассматривали вероятность двух ситуаций: с одной стороны, ингибирование ДНК-топоизомеразы I может привести к остановке репликации, с другой стороны, остановка репликации и ингибирование ДНК-топоизомеразы I могут происходить независимо друг от друга. Чтобы определить, какая из ситуаций реализуется, мы проанализировали развитие фенотипа клеточного старения в ранне-S-фазных клетках HeLa в условиях пролонгированного ингибирования репликации с помощью химических агентов афидиколина или гидроксимочевины. При 71 тепловом стрессе ингибирование репликации является кратковременным, и её перезапуск происходит уже спустя 30 минут после стресса (Рисунок 23). Рисунок 23. Тепловой стресс ингибирует репликацию ДНК в клетках HeLa. Клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, инкубировали в среде с добавлением EdU (10 мкМ, 30 минут), подвергали действию теплового стресса (45.5⁰С, 30 минут) и инкубировали в среде с BrdU (100 мкМ, 30 минут) в течение 0.5, 1 или 3 часов. После фиксации EdU выявляли с помощью набора реагентов Click-iT EdU Imaging kit (красный), BrdU - с помощью специфических первичных антител (зеленый). Масштабная полоса - 3 мкм. С помощью химических ингибиторов, мы имели возможность продлить время репликативного блока на любой необходимый период. Для этого, клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали тепловому стрессу, а затем инкубировали 2-3 часа в среде с афидиколином или гидроксимочевиной. Мы обнаружили, что пролонгирование с помощью афидиколина или гидроксимочевины ареста репликации ДНК, индуцированного тепловым стрессом, полностью предотвращает развитие фенотипа клеточного старения (Рисунок 24А). Аналогичные эксперименты показали, что клеточное старение, индуцированное камптотецином, также может быть полностью предотвращено посредством дополнительной обработки клеток ингибиторами репликации ДНК (Рисунок 24Б). Однако это происходит только тогда, когда репликация ДНК ингибируется непосредственно в момент обработки клеток камптотецином, но не после того. Из описанных результатов следуют несколько важных выводов. Во-первых, тепловой стресс влияет на аппарат репликации ДНК и активность ДНК-топоизомеразы I независимо. Во-вторых, для развития фенотипа клеточного старения, индуцированного тепловым стрессом или камптотецином, необходимым фактором является активная репликация ДНК. Суммируя вышеизложенные выводы, а также принимая во внимание тот факт, что камптотецин и тепловой стресс оказывают схожее влияние на ДНКтопоизомеразу I, можно предполагать, что первичным индуктором клеточного старения в обоих случаях является столкновение вилок репликации с комплексами ДНКтопоизомеразы I с ДНК либо с ОЦР, возникшими в результате ингибирования ДНК- 72 Рисунок 24. Репликация ДНК необходима для индукции клеточного старения, вызванного тепловым стрессом или камптотецином. А. Клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут), афидиколина (APH, 10 мкМ, 60 минут) или гидроксимочевины (HU, 10 мкМ, 60 минут) в соответствии со схемами, приведенными над микрофотографиями. После 48-часового периода восстановления клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против γН2АХ (зеленый). ДНК окрашивали с помощью DAPI (синий). Б. Клетки HeLa, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию камптотецина (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут) и/или афидиколина (APH, 10 мкМ, 60 минут) в соответствии со схемами, приведенными над микрофотографиями. После 48-часового периода инкубации в свежей среде клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против γН2АХ (зеленый). ДНК окрашивали с помощью DAPI (синий). Масштабная полоса - 25 мкм. топизомеразы I. Вследствие этого столкновения могут возникать сложнорепарируемые ДЦР. 5.12. Двуцепочечные разрывы ДНК являются источником персистирующих сигналов о повреждениях ДНК Мы решили проверить наличие ДЦР и проанализировать возможную кинетику их образования в результате действия теплового стресса и камптотецина. Для решения поставленной задачи мы воспользовались методом нейтрального электрофореза одиночных клеток (метод ДНК-комет). Для оценки степени повреждения ДНК мы использовали один из измеряемых параметров - «момент хвоста» (tail moment, TM), равный произведению длины хвоста и процента ДНК в нем. 73 Мы знали, что тепловой стресс и камптотецин индуцируют появление сигналов о повреждения ДНК только в клетках, находящихся в ранней S-фазе (Рисунки 14, 19Б). Поэтому для анализа кинетики образования ДЦР, использовали клетки HeLa, находящиеся только на стадии ранней S-фазы. После синхронизации, клетки подвергали действию теплового стресса или камптотецина, и продолжали культивировать в нормальных условиях от 0 до 6 часов. После этого клетки лизировали, заключали в легкоплавкую агарозу и проводили электрофорез (Рисунок 25А). Видно, что тепловой стресс приводит к образованию ДЦР только спустя три часа после стресса, в то время как при камптотецине ДЦР образуются сразу же после воздействия (Рисунок 25А). Поскольку кинетика образования ДЦР в случае теплового стресса идентична кинетике формирования персистирующих сингалов о повреждении ДНК в виде репарационных фокусов (γH2AX, 53BP1, Rad51) (Рисунок 15), можно сделать вывод, что что возникающие персистирующие сигналы о повреждениях ДНК, вызванные гипертермией, маркируют ДЦР. Согласно нашей гипотезе, причиной замедленной кинетики образования ДЦР при тепловом стрессе могут быть долгоживущие ковалентные комплексы между ДНКтопоизомеразой I и ДНК. В связи с этим, необходимо было проанализировать кинетику диссоциации ковалентных комплексов в случае действия теплового стресса и Рисунок 25. Кинетика формирования ДЦР и ковалентных комплексов между ДНКтопоизомеразой I и ДНК после воздействия теплового стресса или камптотецина. А. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) или камптотецина (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут). Сразу после стресса или после периода восстановления в течение 1, 3 или 6 часов методом нейтрального электрофореза одиночных клеток (метод ДНК-комет) анализировали количество ДЦР по параметру «момент хвоста». Горизонтальные линии обозначают достоверные * Р <0,0001 различия (t-тест, n > 80). Б. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) или камптотецина (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут). Через соответствующий период восстановления (0, 1, 3 или 6 часов) методом RADAR анализировали количество существующих ковалентно связанных комплексов между ДНК-топоизомеразой I и ДНК в ядерных экстрактах клеток. 74 камптотецина. С помощью метода RADAR мы показали, что кинетика диссоциации ДНК/белковых комплексов для этих воздействий различна (Рисунок 25Б). В случае действия теплового стресса комплексы сохраняются как минимум в течение трехчасового периода восстановления, в то время как при действии камптотецина комплексы быстро исчезают (Рисунок 25Б). Таким образом, в результате действия теплового стресса долгоживущие комплексы между ДНК и ДНК-топоизомеразой I препятствуют свободной конвертации одноцепочечных разрывов в двуцепочечные при столкновении с вилками репликации. На следующем этапе мы решили установить причины замедленного разрешения этих комплексов при гипертермии. 5.13. Формирование персистирующих сигналов о повреждениях ДНК, индуцированных тепловым стрессом, зависит от транскрипционной и протеосомной активностей Существует масса работ, посвященных проблеме разрешения ковалентных комплексов между ДНК и ДНК-топоизомеразой I. Известны две системы, участвующие в удалении ДНК-топоизомеразы I с ДНК - это транскрипция и сопряжённая с ней убиквитин-протеосомная система [408]. Мы предположили, что гипертермия ведёт к ингибированию хотя бы одной из систем, следствием чего и является замедленная кинетика диссоциации комплексов и образования ДЦР. Для этого культуру клеток HeLa, находящуюся в ранней S-фазе, предварительно инкубировали в среде с добавлением ингибитора протеосомной активности MG132 или ингибитора транскрипции αаманитина (АА), подвергали действию теплового стресса или камптотецина и детектировали кинетику появления фокусов Rad51 и ДЦР (Рисунок 26А, Б, В). Из представленных на рисунке 26 данных видно, что ингибирование как протеосомной системы, так и транскрипции предотвращает появление сигналов о повреждении ДНК. Более того, в условиях ингибирования каждой из систем не происходит разрешения ковалентных комплексов между ДНК и ДНК-топоизомеразой I и подавляется образование ДЦР (Рисунок 26Г). Таким образом, для образования ДЦР в результате действия теплового стресса или камптотецина необходимо удаление фермента с ДНК и образование «истинного» ОЦР. 75 Рисунок 26. Транскрипционная и протеосомная активности необходимы для формирования персистирующих сигналов о повреждении ДНК, вызванных тепловым стрессом и камптотецином. А. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней S-фазе, предварительно инкубировали в среде с добавлением ингибитора протеосомной активности MG132 (10 мкМ, 3 часа) или ингибитора транскрипции α-аманитина (АА) (5 мкг/мл, 6 часов) и подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) или камптотецина (CPT, 0.1 мкМ, 60 минут). Через соответствующий период восстановления (0, 3 или 6 часов) клетки фиксировали и иммуноокрашивали антителами против Rad51 (красный). ДНК окрашивали с помощью DAPI (синий). Масштабная полоса - 3 мкм. Б и В. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней S-фазе, предварительно инкубировали в среде без или с добавлением MG132 (10 мкМ, 3 часа; Б) или АА (5 мкг/мл, 6 часов; В) и подвергали действию теплового стресса (45.5⁰С, 30 минут) или камптотецина (CPT, 1 мкМ, 60 минут). Сразу после стресса или после 6-часового периода восстановления методом ДНК-комет анализировали количество ДЦР по параметру «момент хвоста». Символами обозначены недостоверные (*) и достоверные (**, #, ##) различия Р <0,001 (t-тест, n > 80). Г. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней S-фазе, предварительно инкубировали в среде без или с добавлением MG132 (10 мкМ, 3 часа) или АА (5 мкг/мл, 6 часов) и подвергали действию камптотецина (CPT, 1 мкМ, 60 минут) или теплового стресса (45.5С, 30 минут). Сразу после стресса или после 6часового периода восстановления методом RADAR анализировали количество существующих ковалентно связанных комплексов между ДНК-топоизомеразой I и ДНК. Оставалось определить, происходит ли ингибирование этих систем при тепловом стрессе. Для измерения активности протеосомной системы в контрольных клетках HeLa и клетках после воздействия теплового стресса мы воспользовались коммерческим набором реактивов фирмы Promega по определению трипсин- и химотрипсинподобной активностей протеосомы (Рисунок 27А). Согласно полученным данным, протеосомальная активность практически не меняется в результате действия теплового стресса по сравнению с контрольным уровнем (Рисунок 27А). 76 Рисунок 27. Измерение активностей протеосомной системы и транскрипции после теплового стресса. А. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и через соответствующие временные интервалы периода восстановления (0, 1, 3 или 6 часов) анализировали химотрипсин- (ХТПА) и трипсин-подобные (ТПА) активности протеосомной системы с помощью набором реактивов фирмы Promega. Б. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней S-фазе, подвергали действию теплового стресса (45.5С, 30 минут) и инкубировали в нормальных условиях в течение 3 часов. Контрольные клетки и клетки после воздействия стресса инкубировали в среде с добавлением 5’-флуороурацила (5-FU, 5 мМ, 3 часа). 5-FU выявляли с использованием антител против BrdU (зеленый). ДНК окрашивали с помощью DAPI (синий). Масштабная полоса - 25 мкм. Хотя подавление транскрипции при тепловом стрессе является хорошо известным фактом [409,410], мы решили определить точную динамику подавления транскрипции в нашей модельной системе. Уровень транскрипции в контрольных клетках и клетках после действия теплового стресса был измерен с помощью включения аналога нуклеотида флуороурацила (5-FU) в новосинтезируемые молекулы РНК с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием препарата антителами против BrdU (Рисунок 27Б). Очевидный факт падения уровня транскрипции после теплового стресса и восстановление уровня только к 6 часам, демонстрировал ингибирующий эффект гипертермии на транскрипцию. Суммируя полученные данные, можно заключить, что транскрипция и протеосомная система необходимы для разрешения ковалентных комплексов между ДНК и ДНК-топоизомеразой I в условиях гипертермии и действия камптотецина, а отсроченное разрешение комплексов и объясняется ингибированием транскрипции. формирование ДЦР при гипертермии 77 5.14. Основной причиной индукции генотоксическим стрессом клеточного старения, являются одноцепочечные разрывы На основании полученных данных, мы предложили следующую модель индукции клеточного старения тепловым стрессом (Рисунок 28). Согласно нашей модели, причиной индукции клеточного старения в ранне-S-фазных клетках являются труднорепарируемые ДЦР, возникающие вследствие столкновения движущихся вилок репликации ДНК с ОЦР. Предложенный механизм предполагает, что именно ОЦР являются причиной индукции клеточного старения в клетках, находящихся в ранней Sфазе. Рисунок 28. Модель индукции клеточного старения тепловым стрессом. Для проверки этой модели мы решили индуцировать образование ОЦР с помощью малых доз перекиси водорода (Н2О2). Перекись водорода является известным агентом, напрямую вносящим ОЦР в ДНК. Фракции клеток HeLa, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, обработали Н2О2, инкубировали в свежей среде 72 часа и анализировали проявление фенотипа клеточного старения (Рисунок 29А). 78 Согласно полученным данным, короткая обработка Н2О2 индуцирует клеточное старение преимущественно в клетках, находящихся в ранней S-фазе на момент действия Н2О2. Более того, мы показали, что индуцированное перекисью клеточное старение предотвращается в условиях ингибирования репликации (Рисунок 29Б). Таким образом, можно утверждать, что сформулированная нами модель индукции клеточного старения применима к любым агентам, способным индуцировать ОЦР в ранне-S-фазных клетках. Рисунок 29. ОЦР являются причиной индукции клеточного старения в клетках, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла. А. Клетки HeLа, синхронизированные по G2-, ранней и поздней S-фазам, инкубировали в среде с добавлением перекиси водорода (Н2O2, 50 и 100 мкМ) или камптотецина (CPT, 10 и 100 нМ) в течение часа. После 48-часового периода восстановления анализировали процентное содержание клеток с признаками клеточного старения. Б. Клетки HeLа, синхронизированные по ранней S-фазе, инкубировали в среде с добавлением Н2O2 (100 мкМ, 60 минут), Н2O2 с афидиколином (APH, 100 мкМ, 60 минут) или APH после инкубации с Н2O2. После 48-часового периода восстановления анализировали процентное содержание клеток с признаками клеточного старения. 79 6. Заключение Мы продемонстрировали, что через несколько суток после действия острого теплового стресса часть клеток из несинхронизированной популяции демонстрируют стабильный арест пролиферации с признаками клеточного старения. Развитие клеточного старения происходит по p21CIP1/WAF1-зависимому пути. В дальнейшем мы выяснили, что клеточное старение развивается только в тех клетках, которые были застигнуты тепловым стрессом на стадии ранней S-фазы клеточного цикла. Мы продемонстрировали, что непосредственной причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК. Мы исключили возможность ассоциации этих персистирующих сигналов с нарушением структуры теломерных петель. Дальнейшие эксперименты показали, что активация программы клеточного старения в ранне-S-фазных клетках происходит в результате формирования сложнорепарируемых ДЦР. Причиной формирования этих разрывов является столкновение вилок репликации ДНК с ОЦР, образовавшимися вследствие ингибирования тепловым стрессом ДНК-топоизомеразы I на стадии ковалентносвязанного с ДНК комплекса. Таким образом, мы пришли к двум важным заключением. Во-первых, для развития фенотипа клеточного старения достаточно образование ОЦР в условиях активной репликации. Во-вторых, генотоксический эффект теплового стресса тождественен по своей природе действию ингибиторов ДНК-топоизомеразы I. Хотя наша работа имеет прежде всего фундаментальный характер, ее результаты могут составить основу гипертермии заболеваний. и для оптимизации химиотерапевтических протоколов агентов одновременного для лечения применения онкологических 80 7. Выводы 1. Продемонстрировано, что тепловой стресс индуцирует преждевременное старение нормальных и раковых клеток человека по p21-зависимому пути. 2. Продемонстрировано, что причиной индуцированного тепловым стрессом клеточного старения являются персистирующие сигналы о повреждении ДНК, которые связаны с образованием сложнорепарируемых двуцепочечных разрывов ДНК. 3. Продемонстрировано, что при тепловом стрессе двуцепочечные разрывы ДНК образуются в одноцепочечными результате разрывами столкновения ДНК, вилок которые репликации образуются ДНК с вследствие ингибирования тепловым стрессом ДНК-топоизомеразы I. 4. Обоснована модель индукции преждевременного старения клеток, находящихся в ранней S-фазе клеточного цикла, согласно которой, для развития клеточного старения достаточно возникновения в ранней S-фазе небольшого количества одноцепочечных разрывов ДНК любого происхождения. 81 8. Список литературы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. van Deursen JM. (2014) The role of senescent cells in ageing, Nature, 509, 439-446. Dimri GP. (2005) What has senescence got to do with cancer?, Cancer Cell, 7, 505-512. Kuilman T, Michaloglou C, Mooi WJ, and Peeper DS. (2010) The essence of senescence, Genes Dev, 24, 2463-2479. Hayflick L, and Moorhead PS. (1961) The serial cultivation of human diploid cell strains, Exp Cell Res, 25, 585-621. Hayflick L. (1965) The limited in vitro lifetime of human diploid cell, Exp Cell Res, 37, 614-636. Lindquist S, and Craig EA. (1988) The heat-shock proteins, Annu Rev Genet, 22, 631677. Richter K, Haslbeck M, and Buchner J. (2010) The heat shock response: life on the verge of death, Mol Cell, 40, 253-266. Akerfelt M, Morimoto RI, and Sistonen L. (2010) Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan, Nat Rev Mol Cell Biol, 11, 545-555. Mortimer SA, Kidwell MA, and Doudna JA. (2014) Insights into RNA structure and function from genome-wide studies, Nat Rev Genet, 15, 469-479. Allen TA, Von Kaenel S, Goodrich JA, and Kugel JF. (2004) The SINE-encoded mouse B2 RNA represses mRNA transcription in response to heat shock, Nat Struct Mol Biol, 11, 816-821. Bicher HI, and Bruley DF. (1983) Changes in tissue oxygenation and acidity induced by localized microwave hyperthermia and hematoporphyrin phototherapy, an update, Adv Exp Med Biol, 159, 623-630. Thrall DE, Larue SM, Pruitt AF, Case B, and Dewhirst MW. (2006) Changes in tumour oxygenation during fractionated hyperthermia and radiation therapy in spontaneous canine sarcomas, Int J Hyperthermia, 22, 365-373. Hanusch KU, Janssen CH, Billheimer D, Jenkins I, Spurgeon E et al. (2013) Whole-body hyperthermia for the treatment of major depression: associations with thermoregulatory cooling, Am J Psychiatry, 170, 802-804. Hildebrandt B, Wust P, Ahlers O, Dieing A, Sreenivasa G et al. (2002) The cellular and molecular basis of hyperthermia, Crit Rev Oncol Hematol, 43, 33-56. Passos JF, Nelson G, Wang C, Richter T, Simillion C et al. (2010) Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence, Mol Syst Biol, 6, 347. Roti Roti JL. (2008) Cellular responses to hyperthermia (40-46 degrees C): cell killing and molecular events, Int J Hyperthermia, 24, 3-15. Jolly C, and Morimoto RI. (2000) Role of the heat shock response and molecular chaperones in oncogenesis and cell death, J Natl Cancer Inst, 92, 1564-1572. Alekseenko LL, Zemelko VI, Zenin VV, Pugovkina NA, Kozhukharova IV et al. (2012) Heat shock induces apoptosis in human embryonic stem cells but a premature senescence phenotype in their differentiated progeny, Cell Cycle, 11, 3260-3269. Alekseenko LL, Zemelko VI, Domnina AP, Lyublinskaya OG, Zenin VV et al. (2014) Sublethal heat shock induces premature senescence rather than apoptosis in human mesenchymal stem cells, Cell Stress Chaperones, 19, 355-366. Olovnikov AM. (1971) [Principle of marginotomy in template synthesis of polynucleotides], Dokl Akad Nauk SSSR, 201, 1496-1499. Watson JD. (1972) Origin of concatemeric T7 DNA, Nat New Biol, 239, 197-201. 82 22. Harley CB, Futcher AB, and Greider CW. (1990) Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts, Nature, 345, 458-460. 23. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP et al. (1998) Extension of lifespan by introduction of telomerase into normal human cells, Science, 279, 349-352. 24. Erusalimsky JD, and Kurz DJ. (2005) Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease, Exp Gerontol, 40, 634-642. 25. Bernardes de Jesus B, and Blasco MA. (2012) Assessing cell and organ senescence biomarkers, Circ Res, 111, 97-109. 26. Ben-Porath I, and Weinberg RA. (2005) The signals and pathways activating cellular senescence, Int J Biochem Cell Biol, 37, 961-976. 27. Campisi J. (2013) Aging, cellular senescence, and cancer, Annu Rev Physiol, 75, 685705. 28. Robbins E, Levine EM, and Eagle H. (1970) Morphologic changes accompanying senescence of cultured human diploid cells, J Exp Med, 131, 1211-1222. 29. Greenberg SB, Grove GL, and Cristofalo VJ. (1977) Cell size in aging monolayer cultures, In Vitro, 13, 297-300. 30. Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G et al. (1995) A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo, Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 9363-9367. 31. Kurz DJ, Decary S, Hong Y, and Erusalimsky JD. (2000) Senescence-associated (beta)galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells, J Cell Sci, 113 ( Pt 20), 3613-3622. 32. Lee BY, Han JA, Im JS, Morrone A, Johung K et al. (2006) Senescence-associated betagalactosidase is lysosomal beta-galactosidase, Aging Cell, 5, 187-195. 33. Michaloglou C, Soengas MS, Mooi WJ, and Peeper DS. (2008) Comment on "Absence of senescence-associated beta-galactosidase activity in human melanocytic nevi in vivo", J Invest Dermatol, 128, 1582-1583; author reply 1583-1584. 34. Campisi J, and d'Adda di Fagagna F. (2007) Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat Rev Mol Cell Biol, 8, 729-740. 35. Fang L, Igarashi M, Leung J, Sugrue MM, Lee SW et al. (1999) p21Waf1/Cip1/Sdi1 induces permanent growth arrest with markers of replicative senescence in human tumor cells lacking functional p53, Oncogene, 18, 2789-2797. 36. Ausserlechner MJ, Obexer P, Geley S, and Kofler R. (2005) G1 arrest by p16INK4A uncouples growth from cell cycle progression in leukemia cells with deregulated cyclin E and c-Myc expression, Leukemia, 19, 1051-1057. 37. Malumbres M, Perez De Castro I, Hernandez MI, Jimenez M, Corral T et al. (2000) Cellular response to oncogenic ras involves induction of the Cdk4 and Cdk6 inhibitor p15(INK4b), Mol Cell Biol, 20, 2915-2925. 38. Tsugu A, Sakai K, Dirks PB, Jung S, Weksberg R et al. (2000) Expression of p57(KIP2) potently blocks the growth of human astrocytomas and induces cell senescence, Am J Pathol, 157, 919-932. 39. Munro J, Steeghs K, Morrison V, Ireland H, and Parkinson EK. (2001) Human fibroblast replicative senescence can occur in the absence of extensive cell division and short telomeres, Oncogene, 20, 3541-3552. 40. Alexander K, and Hinds PW. (2001) Requirement for p27(KIP1) in retinoblastoma protein-mediated senescence, Mol Cell Biol, 21, 3616-3631. 83 41. Meng A, Wang Y, Van Zant G, and Zhou D. (2003) Ionizing radiation and busulfan induce premature senescence in murine bone marrow hematopoietic cells, Cancer Res, 63, 5414-5419. 42. d'Adda di Fagagna F. (2008) Living on a break: cellular senescence as a DNA-damage response, Nat Rev Cancer, 8, 512-522. 43. Lukas C, Savic V, Bekker-Jensen S, Doil C, Neumann B et al. (2011) 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress, Nat Cell Biol, 13, 243-253. 44. Wang Q, Goldstein M, Alexander P, Wakeman TP, Sun T et al. (2014) Rad17 recruits the MRE11-RAD50-NBS1 complex to regulate the cellular response to DNA doublestrand breaks, EMBO J, 33, 862-877. 45. Narita M, Nunez S, Heard E, Narita M, Lin AW et al. (2003) Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence, Cell, 113, 703-716. 46. Narita M, Narita M, Krizhanovsky V, Nunez S, Chicas A et al. (2006) A novel role for high-mobility group a proteins in cellular senescence and heterochromatin formation, Cell, 126, 503-514. 47. Zhang R, Poustovoitov MV, Ye X, Santos HA, Chen W et al. (2005) Formation of MacroH2A-containing senescence-associated heterochromatin foci and senescence driven by ASF1a and HIRA, Dev Cell, 8, 19-30. 48. Chandra T, Ewels PA, Schoenfelder S, Furlan-Magaril M, Wingett SW et al. (2015) Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells, Cell Rep, 10, 471-483. 49. Kosar M, Bartkova J, Hubackova S, Hodny Z, Lukas J et al. (2011) Senescenceassociated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a), Cell Cycle, 10, 457-468. 50. Coppe JP, Desprez PY, Krtolica A, and Campisi J. (2010) The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression, Annu Rev Pathol, 5, 99-118. 51. Perez-Mancera PA, Young AR, and Narita M. (2014) Inside and out: the activities of senescence in cancer, Nat Rev Cancer, 14, 547-558. 52. Rodier F, Coppe JP, Patil CK, Hoeijmakers WA, Munoz DP et al. (2009) Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion, Nat Cell Biol, 11, 973-979. 53. Freund A, Patil CK, and Campisi J. (2011) p38MAPK is a novel DNA damage responseindependent regulator of the senescence-associated secretory phenotype, EMBO J, 30, 1536-1548. 54. Laberge RM, Sun Y, Orjalo AV, Patil CK, Freund A et al. (2015) MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation, Nat Cell Biol. 55. Acosta JC, O'Loghlen A, Banito A, Guijarro MV, Augert A et al. (2008) Chemokine signaling via the CXCR2 receptor reinforces senescence, Cell, 133, 1006-1018. 56. Lafferty-Whyte K, Cairney CJ, Jamieson NB, Oien KA, and Keith WN. (2009) Pathway analysis of senescence-associated miRNA targets reveals common processes to different senescence induction mechanisms, Biochim Biophys Acta, 1792, 341-352. 57. Smith-Vikos T, and Slack FJ. (2012) MicroRNAs and their roles in aging, J Cell Sci, 125, 7-17. 84 58. Zhao T, Li J, and Chen AF. (2010) MicroRNA-34a induces endothelial progenitor cell senescence and impedes its angiogenesis via suppressing silent information regulator 1, Am J Physiol Endocrinol Metab, 299, E110-116. 59. Li N, Muthusamy S, Liang R, Sarojini H, and Wang E. (2011) Increased expression of miR-34a and miR-93 in rat liver during aging, and their impact on the expression of Mgst1 and Sirt1, Mech Ageing Dev, 132, 75-85. 60. Tazawa H, Tsuchiya N, Izumiya M, and Nakagama H. (2007) Tumor-suppressive miR34a induces senescence-like growth arrest through modulation of the E2F pathway in human colon cancer cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 15472-15477. 61. Wang Y, Scheiber MN, Neumann C, Calin GA, and Zhou D. (2011) MicroRNA regulation of ionizing radiation-induced premature senescence, Int J Radiat Oncol Biol Phys, 81, 839-848. 62. Kumamoto K, Spillare EA, Fujita K, Horikawa I, Yamashita T et al. (2008) Nutlin-3a activates p53 to both down-regulate inhibitor of growth 2 and up-regulate mir-34a, mir34b, and mir-34c expression, and induce senescence, Cancer Res, 68, 3193-3203. 63. Ugalde AP, Ramsay AJ, de la Rosa J, Varela I, Marino G et al. (2011) Aging and chronic DNA damage response activate a regulatory pathway involving miR-29 and p53, EMBO J, 30, 2219-2232. 64. Wagner W, Horn P, Castoldi M, Diehlmann A, Bork S et al. (2008) Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process, PLoS One, 3, e2213. 65. Martinez I, Cazalla D, Almstead LL, Steitz JA, and DiMaio D. (2011) miR-29 and miR30 regulate B-Myb expression during cellular senescence, Proc Natl Acad Sci U S A, 108, 522-527. 66. Bhaumik D, Scott GK, Schokrpur S, Patil CK, Orjalo AV et al. (2009) MicroRNAs miR146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8, Aging (Albany NY), 1, 402-411. 67. Li G, Luna C, Qiu J, Epstein DL, and Gonzalez P. (2010) Modulation of inflammatory markers by miR-146a during replicative senescence in trabecular meshwork cells, Invest Ophthalmol Vis Sci, 51, 2976-2985. 68. Bonifacio LN, and Jarstfer MB. (2010) MiRNA profile associated with replicative senescence, extended cell culture, and ectopic telomerase expression in human foreskin fibroblasts, PLoS One, 5. 69. He L, He X, Lim LP, de Stanchina E, Xuan Z et al. (2007) A microRNA component of the p53 tumour suppressor network, Nature, 447, 1130-1134. 70. Ofir M, Hacohen D, and Ginsberg D. (2011) MiR-15 and miR-16 are direct transcriptional targets of E2F1 that limit E2F-induced proliferation by targeting cyclin E, Mol Cancer Res, 9, 440-447. 71. Puvvula PK, Desetty RD, Pineau P, Marchio A, Moon A et al. (2014) Long noncoding RNA PANDA and scaffold-attachment-factor SAFA control senescence entry and exit, Nat Commun, 5, 5323. 72. Benanti JA, Williams DK, Robinson KL, Ozer HL, and Galloway DA. (2002) Induction of extracellular matrix-remodeling genes by the senescence-associated protein APA-1, Mol Cell Biol, 22, 7385-7397. 73. Yang KE, Kwon J, Rhim JH, Choi JS, Kim SI et al. (2011) Differential expression of extracellular matrix proteins in senescent and young human fibroblasts: a comparative proteomics and microarray study, Mol Cells, 32, 99-106. 85 74. Kaneko S, Satoh Y, Ikemura K, Konishi T, Ohji T et al. (1995) Alterations of expression of the cytoskeleton after immortalization of human fibroblasts, Cell Struct Funct, 20, 107-115. 75. Maya-Mendoza A, Merchut-Maya JM, Bartkova J, Bartek J, Streuli CH et al. (2014) Immortalised breast epithelia survive prolonged DNA replication stress and return to cycle from a senescent-like state, Cell Death Dis, 5, e1351. 76. Robles SJ, and Adami GR. (1998) Agents that cause DNA double strand breaks lead to p16INK4a enrichment and the premature senescence of normal fibroblasts, Oncogene, 16, 1113-1123. 77. Palaniyappan A. (2009) Cyclophosphamide induces premature senescence in normal human fibroblasts by activating MAP kinases, Biogerontology, 10, 677-682. 78. Shimi T, Butin-Israeli V, Adam SA, Hamanaka RB, Goldman AE et al. (2011) The role of nuclear lamin B1 in cell proliferation and senescence, Genes Dev, 25, 2579-2593. 79. Freund A, Laberge RM, Demaria M, and Campisi J. (2012) Lamin B1 loss is a senescence-associated biomarker, Mol Biol Cell, 23, 2066-2075. 80. Bridger JM, Boyle S, Kill IR, and Bickmore WA. (2000) Re-modelling of nuclear architecture in quiescent and senescent human fibroblasts, Curr Biol, 10, 149-152. 81. Kar B, Liu B, Zhou Z, and Lam YW. (2011) Quantitative nucleolar proteomics reveals nuclear re-organization during stress- induced senescence in mouse fibroblast, BMC Cell Biol, 12, 33. 82. Belancio VP, Roy-Engel AM, Pochampally RR, and Deininger P. (2010) Somatic expression of LINE-1 elements in human tissues, Nucleic Acids Res, 38, 3909-3922. 83. De Cecco M, Criscione SW, Peterson AL, Neretti N, Sedivy JM et al. (2013) Transposable elements become active and mobile in the genomes of aging mammalian somatic tissues, Aging (Albany NY), 5, 867-883. 84. Koch CM, and Wagner W. (2013) Epigenetic biomarker to determine replicative senescence of cultured cells, Methods Mol Biol, 1048, 309-321. 85. Shay JW, and Wright WE. (2000) Hayflick, his limit, and cellular ageing, Nat Rev Mol Cell Biol, 1, 72-76. 86. Rubin H. (1998) Telomerase and cellular lifespan: ending the debate?, Nat Biotechnol, 16, 396-397. 87. Greider CW, and Blackburn EH. (1985) Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts, Cell, 43, 405-413. 88. Morin GB. (1989) The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats, Cell, 59, 521-529. 89. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD et al. (1994) Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer, Science, 266, 2011-2015. 90. Martens UM, Chavez EA, Poon SS, Schmoor C, and Lansdorp PM. (2000) Accumulation of short telomeres in human fibroblasts prior to replicative senescence, Exp Cell Res, 256, 291-299. 91. Baird DM, Rowson J, Wynford-Thomas D, and Kipling D. (2003) Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells, Nat Genet, 33, 203-207. 92. Martin-Ruiz C, Saretzki G, Petrie J, Ladhoff J, Jeyapalan J et al. (2004) Stochastic variation in telomere shortening rate causes heterogeneity of human fibroblast replicative life span, J Biol Chem, 279, 17826-17833. 86 93. Zou Y, Sfeir A, Gryaznov SM, Shay JW, and Wright WE. (2004) Does a sentinel or a subset of short telomeres determine replicative senescence?, Mol Biol Cell, 15, 37093718. 94. Chai W, Shay JW, and Wright WE. (2005) Human telomeres maintain their overhang length at senescence, Mol Cell Biol, 25, 2158-2168. 95. Stewart SA, Ben-Porath I, Carey VJ, O'Connor BF, Hahn WC et al. (2003) Erosion of the telomeric single-strand overhang at replicative senescence, Nat Genet, 33, 492-496. 96. Smogorzewska A, and de Lange T. (2002) Different telomere damage signaling pathways in human and mouse cells, EMBO J, 21, 4338-4348. 97. Griffith JD, Comeau L, Rosenfield S, Stansel RM, Bianchi A et al. (1999) Mammalian telomeres end in a large duplex loop, Cell, 97, 503-514. 98. Celli GB, and de Lange T. (2005) DNA processing is not required for ATM-mediated telomere damage response after TRF2 deletion, Nat Cell Biol, 7, 712-718. 99. Hockemeyer D, Sfeir AJ, Shay JW, Wright WE, and de Lange T. (2005) POT1 protects telomeres from a transient DNA damage response and determines how human chromosomes end, EMBO J, 24, 2667-2678. 100. van Steensel B, and de Lange T. (1997) Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1, Nature, 385, 740-743. 101. de Lange T. (2005) Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres, Genes Dev, 19, 2100-2110. 102. van Steensel B, Smogorzewska A, and de Lange T. (1998) TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions, Cell, 92, 401-413. 103. d'Adda di Fagagna F, Reaper PM, Clay-Farrace L, Fiegler H, Carr P et al. (2003) A DNA damage checkpoint response in telomere-initiated senescence, Nature, 426, 194-198. 104. Deng Y, Chan SS, and Chang S. (2008) Telomere dysfunction and tumour suppression: the senescence connection, Nat Rev Cancer, 8, 450-458. 105. Peuscher MH, and Jacobs JJ. (2011) DNA-damage response and repair activities at uncapped telomeres depend on RNF8, Nat Cell Biol, 13, 1139-1145. 106. Fumagalli M, Rossiello F, Clerici M, Barozzi S, Cittaro D et al. (2012) Telomeric DNA damage is irreparable and causes persistent DNA-damage-response activation, Nat Cell Biol, 14, 355-365. 107. Takai H, Smogorzewska A, and de Lange T. (2003) DNA damage foci at dysfunctional telomeres, Curr Biol, 13, 1549-1556. 108. Herbig U, Jobling WA, Chen BP, Chen DJ, and Sedivy JM. (2004) Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATM, p53, and p21(CIP1), but not p16(INK4a), Mol Cell, 14, 501-513. 109. Karlseder J, Hoke K, Mirzoeva OK, Bakkenist C, Kastan MB et al. (2004) The telomeric protein TRF2 binds the ATM kinase and can inhibit the ATM-dependent DNA damage response, PLoS Biol, 2, E240. 110. Denchi EL, and de Lange T. (2007) Protection of telomeres through independent control of ATM and ATR by TRF2 and POT1, Nature, 448, 1068-1071. 111. Buscemi G, Zannini L, Fontanella E, Lecis D, Lisanti S et al. (2009) The shelterin protein TRF2 inhibits Chk2 activity at telomeres in the absence of DNA damage, Curr Biol, 19, 874-879. 112. Thanasoula M, Escandell JM, Suwaki N, and Tarsounas M. (2012) ATM/ATR checkpoint activation downregulates CDC25C to prevent mitotic entry with uncapped telomeres, EMBO J, 31, 3398-3410. 87 113. Wu L, Multani AS, He H, Cosme-Blanco W, Deng Y et al. (2006) Pot1 deficiency initiates DNA damage checkpoint activation and aberrant homologous recombination at telomeres, Cell, 126, 49-62. 114. Tibbetts RS, Brumbaugh KM, Williams JM, Sarkaria JN, Cliby WA et al. (1999) A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53, Genes Dev, 13, 152-157. 115. Banin S, Moyal L, Shieh S, Taya Y, Anderson CW et al. (1998) Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage, Science, 281, 1674-1677. 116. Barlev NA, Liu L, Chehab NH, Mansfield K, Harris KG et al. (2001) Acetylation of p53 activates transcription through recruitment of coactivators/histone acetyltransferases, Mol Cell, 8, 1243-1254. 117. Saramaki A, Banwell CM, Campbell MJ, and Carlberg C. (2006) Regulation of the human p21(waf1/cip1) gene promoter via multiple binding sites for p53 and the vitamin D3 receptor, Nucleic Acids Res, 34, 543-554. 118. Alcorta DA, Xiong Y, Phelps D, Hannon G, Beach D et al. (1996) Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts, Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 13742-13747. 119. Stein GH, Drullinger LF, Soulard A, and Dulic V. (1999) Differential roles for cyclindependent kinase inhibitors p21 and p16 in the mechanisms of senescence and differentiation in human fibroblasts, Mol Cell Biol, 19, 2109-2117. 120. Churikov D, and Price CM. (2008) Pot1 and cell cycle progression cooperate in telomere length regulation, Nat Struct Mol Biol, 15, 79-84. 121. De Bont R, and van Larebeke N. (2004) Endogenous DNA damage in humans: a review of quantitative data, Mutagenesis, 19, 169-185. 122. Ghosal G, and Chen J. (2013) DNA damage tolerance: a double-edged sword guarding the genome, Transl Cancer Res, 2, 107-129. 123. Suzuki K, Mori I, Nakayama Y, Miyakoda M, Kodama S et al. (2001) Radiation-induced senescence-like growth arrest requires TP53 function but not telomere shortening, Radiat Res, 155, 248-253. 124. Sabin RJ, and Anderson RM. (2011) Cellular Senescence - its role in cancer and the response to ionizing radiation, Genome Integr, 2, 7. 125. Chaturvedi V, Qin JZ, Stennett L, Choubey D, and Nickoloff BJ. (2004) Resistance to UV-induced apoptosis in human keratinocytes during accelerated senescence is associated with functional inactivation of p53, J Cell Physiol, 198, 100-109. 126. Lewis DA, Yi Q, Travers JB, and Spandau DF. (2008) UVB-induced senescence in human keratinocytes requires a functional insulin-like growth factor-1 receptor and p53, Mol Biol Cell, 19, 1346-1353. 127. Wang Y, Blandino G, Oren M, and Givol D. (1998) Induced p53 expression in lung cancer cell line promotes cell senescence and differentially modifies the cytotoxicity of anti-cancer drugs, Oncogene, 17, 1923-1930. 128. Chen Q, and Ames BN. (1994) Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 4130-4134. 129. Macip S, Igarashi M, Fang L, Chen A, Pan ZQ et al. (2002) Inhibition of p21-mediated ROS accumulation can rescue p21-induced senescence, EMBO J, 21, 2180-2188. 130. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, and Lowe SW. (1997) Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a, Cell, 88, 593-602. 88 131. Ferbeyre G, de Stanchina E, Lin AW, Querido E, McCurrach ME et al. (2002) Oncogenic ras and p53 cooperate to induce cellular senescence, Mol Cell Biol, 22, 34973508. 132. Leenhouts HP, and Chadwick KH. (1974) Radiation induced DNA double strand breaks and chromosome aberrations, Theor Appl Genet, 44, 167-172. 133. Buatti JM, Rivero LR, and Jorgensen TJ. (1992) Radiation-induced DNA single-strand breaks in freshly isolated human leukocytes, Radiat Res, 132, 200-206. 134. Lomax ME, Salje H, Cunniffe S, and O'Neill P. (2005) 8-OxoA inhibits the incision of an AP site by the DNA glycosylases Fpg, Nth and the AP endonuclease HAP1, Radiat Res, 163, 79-84. 135. Chaudhry MA. (2007) Base excision repair of ionizing radiation-induced DNA damage in G1 and G2 cell cycle phases, Cancer Cell Int, 7, 15. 136. Dewey WC, Ling CC, and Meyn RE. (1995) Radiation-induced apoptosis: relevance to radiotherapy, Int J Radiat Oncol Biol Phys, 33, 781-796. 137. Di Leonardo A, Linke SP, Clarkin K, and Wahl GM. (1994) DNA damage triggers a prolonged p53-dependent G1 arrest and long-term induction of Cip1 in normal human fibroblasts, Genes Dev, 8, 2540-2551. 138. Kim KS, Kim JE, Choi KJ, Bae S, and Kim DH. (2014) Characterization of DNA damage-induced cellular senescence by ionizing radiation in endothelial cells, Int J Radiat Biol, 90, 71-80. 139. Wang Y, Schulte BA, LaRue AC, Ogawa M, and Zhou D. (2006) Total body irradiation selectively induces murine hematopoietic stem cell senescence, Blood, 107, 358-366. 140. Muthna D, Soukup T, Vavrova J, Mokry J, Cmielova J et al. (2010) Irradiation of adult human dental pulp stem cells provokes activation of p53, cell cycle arrest, and senescence but not apoptosis, Stem Cells Dev, 19, 1855-1862. 141. Jones KR, Elmore LW, Jackson-Cook C, Demasters G, Povirk LF et al. (2005) p53Dependent accelerated senescence induced by ionizing radiation in breast tumour cells, Int J Radiat Biol, 81, 445-458. 142. Kim BC, Han NK, Byun HO, Kim SS, Ahn EK et al. (2010) Time-dependently expressed markers and the characterization for premature senescence induced by ionizing radiation in MCF7, Oncol Rep, 24, 395-403. 143. Luo H, Yount C, Lang H, Yang A, Riemer EC et al. (2013) Activation of p53 with Nutlin-3a radiosensitizes lung cancer cells via enhancing radiation-induced premature senescence, Lung Cancer, 81, 167-173. 144. Barreto-Andrade JC, Efimova EV, Mauceri HJ, Beckett MA, Sutton HG et al. (2011) Response of human prostate cancer cells and tumors to combining PARP inhibition with ionizing radiation, Mol Cancer Ther, 10, 1185-1193. 145. Beucher A, Birraux J, Tchouandong L, Barton O, Shibata A et al. (2009) ATM and Artemis promote homologous recombination of radiation-induced DNA double-strand breaks in G2, EMBO J, 28, 3413-3427. 146. Gamper AM, Rofougaran R, Watkins SC, Greenberger JS, Beumer JH et al. (2013) ATR kinase activation in G1 phase facilitates the repair of ionizing radiation-induced DNA damage, Nucleic Acids Res, 41, 10334-10344. 147. Plumb MA, Smith GC, Cunniffe SM, Jackson SP, and O'Neill P. (1999) DNA-PK activation by ionizing radiation-induced DNA single-strand breaks, Int J Radiat Biol, 75, 553-561. 89 148. An J, Huang YC, Xu QZ, Zhou LJ, Shang ZF et al. (2010) DNA-PKcs plays a dominant role in the regulation of H2AX phosphorylation in response to DNA damage and cell cycle progression, BMC Mol Biol, 11, 18. 149. Schultz LB, Chehab NH, Malikzay A, and Halazonetis TD. (2000) p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks, J Cell Biol, 151, 1381-1390. 150. Redon CE, Dickey JS, Bonner WM, and Sedelnikova OA. (2009) gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin, Adv Space Res, 43, 1171-1178. 151. Rogakou EP, Boon C, Redon C, and Bonner WM. (1999) Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo, J Cell Biol, 146, 905-916. 152. Le ON, Rodier F, Fontaine F, Coppe JP, Campisi J et al. (2010) Ionizing radiationinduced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status, Aging Cell, 9, 398-409. 153. Suzuki M, Suzuki K, Kodama S, and Watanabe M. (2006) Interstitial chromatin alteration causes persistent p53 activation involved in the radiation-induced senescencelike growth arrest, Biochem Biophys Res Commun, 340, 145-150. 154. Naka K, Tachibana A, Ikeda K, and Motoyama N. (2004) Stress-induced premature senescence in hTERT-expressing ataxia telangiectasia fibroblasts, J Biol Chem, 279, 2030-2037. 155. Carbonneau CL, Despars G, Rojas-Sutterlin S, Fortin A, Le O et al. (2012) Ionizing radiation-induced expression of INK4a/ARF in murine bone marrow-derived stromal cell populations interferes with bone marrow homeostasis, Blood, 119, 717-726. 156. Nelson G, Wordsworth J, Wang C, Jurk D, Lawless C et al. (2012) A senescent cell bystander effect: senescence-induced senescence, Aging Cell, 11, 345-349. 157. Hong EH, Lee SJ, Kim JS, Lee KH, Um HD et al. (2010) Ionizing radiation induces cellular senescence of articular chondrocytes via negative regulation of SIRT1 by p38 kinase, J Biol Chem, 285, 1283-1295. 158. Dickey JS, Baird BJ, Redon CE, Sokolov MV, Sedelnikova OA et al. (2009) Intercellular communication of cellular stress monitored by gamma-H2AX induction, Carcinogenesis, 30, 1686-1695. 159. Ravanat JL, Douki T, and Cadet J. (2001) Direct and indirect effects of UV radiation on DNA and its components, J Photochem Photobiol B, 63, 88-102. 160. Wierzchowski KL, and Shugar D. (1961) Photochemistry of cytosine nucleosides and nucleotides. II, Acta Biochim Pol, 8, 219-234. 161. You YH, Szabo PE, and Pfeifer GP. (2000) Cyclobutane pyrimidine dimers form preferentially at the major p53 mutational hotspot in UVB-induced mouse skin tumors, Carcinogenesis, 21, 2113-2117. 162. Hanson KM, Gratton E, and Bardeen CJ. (2006) Sunscreen enhancement of UV-induced reactive oxygen species in the skin, Free Radic Biol Med, 41, 1205-1212. 163. Hanson KM, and Clegg RM. (2002) Observation and quantification of ultravioletinduced reactive oxygen species in ex vivo human skin, Photochem Photobiol, 76, 57-63. 164. Rastogi RP, Richa, Kumar A, Tyagi MB, and Sinha RP. (2010) Molecular mechanisms of ultraviolet radiation-induced DNA damage and repair, J Nucleic Acids, 2010, 592980. 165. Sugasawa K, Okuda Y, Saijo M, Nishi R, Matsuda N et al. (2005) UV-induced ubiquitylation of XPC protein mediated by UV-DDB-ubiquitin ligase complex, Cell, 121, 387-400. 90 166. Scott AD, and Waters R. (1997) Inducible nucleotide excision repair (NER) of UVinduced cyclobutane pyrimidine dimers in the cell cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae: evidence that inducible NER is confined to the G1 phase of the mitotic cell cycle, Mol Gen Genet, 254, 43-53. 167. Slieman TA, and Nicholson WL. (2000) Artificial and solar UV radiation induces strand breaks and cyclobutane pyrimidine dimers in Bacillus subtilis spore DNA, Appl Environ Microbiol, 66, 199-205. 168. Baumstark-Khan C, Hentschel U, Nikandrova Y, Krug J, and Horneck G. (2000) Fluorometric analysis of DNA unwinding (FADU) as a method for detecting repairinduced DNA strand breaks in UV-irradiated mammalian cells, Photochem Photobiol, 72, 477-484. 169. Batista LF, Kaina B, Meneghini R, and Menck CF. (2009) How DNA lesions are turned into powerful killing structures: insights from UV-induced apoptosis, Mutat Res, 681, 197-208. 170. Limoli CL, Giedzinski E, Bonner WM, and Cleaver JE. (2002) UV-induced replication arrest in the xeroderma pigmentosum variant leads to DNA double-strand breaks, gamma -H2AX formation, and Mre11 relocalization, Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 233-238. 171. Vilenchik MM, and Knudson AG. (2003) Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer, Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 12871-12876. 172. Greinert R, Volkmer B, Henning S, Breitbart EW, Greulich KO et al. (2012) UVAinduced DNA double-strand breaks result from the repair of clustered oxidative DNA damages, Nucleic Acids Res, 40, 10263-10273. 173. Staszewski O, Nikolova T, and Kaina B. (2008) Kinetics of gamma-H2AX focus formation upon treatment of cells with UV light and alkylating agents, Environ Mol Mutagen, 49, 734-740. 174. Wu X, Shell SM, Liu Y, and Zou Y. (2007) ATR-dependent checkpoint modulates XPA nuclear import in response to UV irradiation, Oncogene, 26, 757-764. 175. Kamarajan P, and Chao CC. (2000) UV-induced apoptosis in resistant HeLa cells, Biosci Rep, 20, 99-108. 176. Assefa Z, Van Laethem A, Garmyn M, and Agostinis P. (2005) Ultraviolet radiationinduced apoptosis in keratinocytes: on the role of cytosolic factors, Biochim Biophys Acta, 1755, 90-106. 177. Chainiaux F, Magalhaes JP, Eliaers F, Remacle J, and Toussaint O. (2002) UVB-induced premature senescence of human diploid skin fibroblasts, Int J Biochem Cell Biol, 34, 1331-1339. 178. Borlon C, Chretien A, Debacq-Chainiaux F, and Toussaint O. (2007) Transient increased extracellular release of H2O2 during establishment of UVB-induced premature senescence, Ann N Y Acad Sci, 1119, 72-77. 179. Jee HJ, Kim HJ, Kim AJ, Bae YS, Bae SS et al. (2009) UV light induces premature senescence in Akt1-null mouse embryonic fibroblasts by increasing intracellular levels of ROS, Biochem Biophys Res Commun, 383, 358-362. 180. Latonen L, Taya Y, and Laiho M. (2001) UV-radiation induces dose-dependent regulation of p53 response and modulates p53-HDM2 interaction in human fibroblasts, Oncogene, 20, 6784-6793. 181. Bertrand-Vallery V, Boilan E, Ninane N, Demazy C, Friguet B et al. (2010) Repeated exposures to UVB induce differentiation rather than senescence of human keratinocytes lacking p16(INK-4A), Biogerontology, 11, 167-181. 91 182. Chazal M, Marionnet C, Michel L, Mollier K, Dazard JE et al. (2002) P16(INK4A) is implicated in both the immediate and adaptative response of human keratinocytes to UVB irradiation, Oncogene, 21, 2652-2661. 183. Pavey S, Conroy S, Russell T, and Gabrielli B. (1999) Ultraviolet radiation induces p16CDKN2A expression in human skin, Cancer Res, 59, 4185-4189. 184. Al-Mohanna MA, Manogaran PS, Al-Mukhalafi Z, K AA-H, and Aboussekhra A. (2004) The tumor suppressor p16(INK4a) gene is a regulator of apoptosis induced by ultraviolet light and cisplatin, Oncogene, 23, 201-212. 185. Lu T, and Finkel T. (2008) Free radicals and senescence, Exp Cell Res, 314, 1918-1922. 186. Furumoto K, Inoue E, Nagao N, Hiyama E, and Miwa N. (1998) Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress, Life Sci, 63, 935-948. 187. Chen Q, Fischer A, Reagan JD, Yan LJ, and Ames BN. (1995) Oxidative DNA damage and senescence of human diploid fibroblast cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 43374341. 188. Saretzki G, Murphy MP, and von Zglinicki T. (2003) MitoQ counteracts telomere shortening and elongates lifespan of fibroblasts under mild oxidative stress, Aging Cell, 2, 141-143. 189. Oliver CN, Ahn BW, Moerman EJ, Goldstein S, and Stadtman ER. (1987) Age-related changes in oxidized proteins, J Biol Chem, 262, 5488-5491. 190. Fraga CG, Shigenaga MK, Park JW, Degan P, and Ames BN. (1990) Oxidative damage to DNA during aging: 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in rat organ DNA and urine, Proc Natl Acad Sci U S A, 87, 4533-4537. 191. Moskalev AA, Shaposhnikov MV, Plyusnina EN, Zhavoronkov A, Budovsky A et al. (2013) The role of DNA damage and repair in aging through the prism of Koch-like criteria, Ageing Res Rev, 12, 661-684. 192. Allen RG, Tresini M, Keogh BP, Doggett DL, and Cristofalo VJ. (1999) Differences in electron transport potential, antioxidant defenses, and oxidant generation in young and senescent fetal lung fibroblasts (WI-38), J Cell Physiol, 180, 114-122. 193. Lener B, Koziel R, Pircher H, Hutter E, Greussing R et al. (2009) The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells, Biochem J, 423, 363374. 194. Catalano A, Rodilossi S, Caprari P, Coppola V, and Procopio A. (2005) 5-Lipoxygenase regulates senescence-like growth arrest by promoting ROS-dependent p53 activation, EMBO J, 24, 170-179. 195. Chen QM, Bartholomew JC, Campisi J, Acosta M, Reagan JD et al. (1998) Molecular analysis of H2O2-induced senescent-like growth arrest in normal human fibroblasts: p53 and Rb control G1 arrest but not cell replication, Biochem J, 332, 43-50. 196. Duan J, Duan J, Zhang Z, and Tong T. (2005) Irreversible cellular senescence induced by prolonged exposure to H2O2 involves DNA-damage-and-repair genes and telomere shortening, Int J Biochem Cell Biol, 37, 1407-1420. 197. Zdanov S, Remacle J, and Toussaint O. (2006) Establishment of H2O2-induced premature senescence in human fibroblasts concomitant with increased cellular production of H2O2, Ann N Y Acad Sci, 1067, 210-216. 198. Dumont P, Burton M, Chen QM, Gonos ES, Frippiat C et al. (2000) Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast, Free Radic Biol Med, 28, 361-373. 92 199. Chen X, Zhang J, Fang Y, Zhao C, and Zhu Y. (2008) Ginsenoside Rg1 delays tert-butyl hydroperoxide-induced premature senescence in human WI-38 diploid fibroblast cells, J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 63, 253-264. 200. Moiseeva O, Mallette FA, Mukhopadhyay UK, Moores A, and Ferbeyre G. (2006) DNA damage signaling and p53-dependent senescence after prolonged beta-interferon stimulation, Mol Biol Cell, 17, 1583-1592. 201. Jeong SG, and Cho GW. (2015) Endogenous ROS levels are increased in replicative senescence in human bone marrow mesenchymal stromal cells, Biochem Biophys Res Commun, 460, 971-976. 202. Lee AC, Fenster BE, Ito H, Takeda K, Bae NS et al. (1999) Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species, J Biol Chem, 274, 7936-7940. 203. Rai P, Onder TT, Young JJ, McFaline JL, Pang B et al. (2009) Continuous elimination of oxidized nucleotides is necessary to prevent rapid onset of cellular senescence, Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 169-174. 204. von Zglinicki T. (2002) Oxidative stress shortens telomeres, Trends Biochem Sci, 27, 339-344. 205. Berlett BS, and Stadtman ER. (1997) Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress, J Biol Chem, 272, 20313-20316. 206. Meyer M, Schreck R, and Baeuerle PA. (1993) H2O2 and antioxidants have opposite effects on activation of NF-kappa B and AP-1 in intact cells: AP-1 as secondary antioxidant-responsive factor, EMBO J, 12, 2005-2015. 207. Gupta A, Rosenberger SF, and Bowden GT. (1999) Increased ROS levels contribute to elevated transcription factor and MAP kinase activities in malignantly progressed mouse keratinocyte cell lines, Carcinogenesis, 20, 2063-2073. 208. Patten DA, Lafleur VN, Robitaille GA, Chan DA, Giaccia AJ et al. (2010) Hypoxiainducible factor-1 activation in nonhypoxic conditions: the essential role of mitochondrial-derived reactive oxygen species, Mol Biol Cell, 21, 3247-3257. 209. Ito K, Hirao A, Arai F, Takubo K, Matsuoka S et al. (2006) Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells, Nat Med, 12, 446451. 210. Kim J, and Wong PK. (2009) Oxidative stress is linked to ERK1/2-p16 signalingmediated growth defect in ATM-deficient astrocytes, J Biol Chem, 284, 14396-14404. 211. Takahashi A, Ohtani N, Yamakoshi K, Iida S, Tahara H et al. (2006) Mitogenic signalling and the p16INK4a-Rb pathway cooperate to enforce irreversible cellular senescence, Nat Cell Biol, 8, 1291-1297. 212. Russo T, Zambrano N, Esposito F, Ammendola R, Cimino F et al. (1995) A p53independent pathway for activation of WAF1/CIP1 expression following oxidative stress, J Biol Chem, 270, 29386-29391. 213. Minamino T, Mitsialis SA, and Kourembanas S. (2001) Hypoxia extends the life span of vascular smooth muscle cells through telomerase activation, Mol Cell Biol, 21, 33363342. 214. Sullivan R, Pare GC, Frederiksen LJ, Semenza GL, and Graham CH. (2008) Hypoxiainduced resistance to anticancer drugs is associated with decreased senescence and requires hypoxia-inducible factor-1 activity, Mol Cancer Ther, 7, 1961-1973. 215. Demidenko ZN, Zubova SG, Bukreeva EI, Pospelov VA, Pospelova TV et al. (2009) Rapamycin decelerates cellular senescence, Cell Cycle, 8, 1888-1895. 93 216. Leontieva OV, Natarajan V, Demidenko ZN, Burdelya LG, Gudkov AV et al. (2012) Hypoxia suppresses conversion from proliferative arrest to cellular senescence, Proc Natl Acad Sci U S A, 109, 13314-13318. 217. Blagosklonny MV. (2014) Geroconversion: irreversible step to cellular senescence, Cell Cycle, 13, 3628-3635. 218. Klimova TA, Bell EL, Shroff EH, Weinberg FD, Snyder CM et al. (2009) Hyperoxiainduced premature senescence requires p53 and pRb, but not mitochondrial matrix ROS, FASEB J, 23, 783-794. 219. Watson JA, Watson CJ, McCrohan AM, Woodfine K, Tosetto M et al. (2009) Generation of an epigenetic signature by chronic hypoxia in prostate cells, Hum Mol Genet, 18, 3594-3604. 220. Wang W, Wang D, and Li H. (2014) Initiation of premature senescence by Bcl-2 in hypoxic condition, Int J Clin Exp Pathol, 7, 2446-2453. 221. Mo J, Sun B, Zhao X, Gu Q, Dong X et al. (2013) Hypoxia-induced senescence contributes to the regulation of microenvironment in melanomas, Pathol Res Pract, 209, 640-647. 222. Welford SM, and Giaccia AJ. (2011) Hypoxia and senescence: the impact of oxygenation on tumor suppression, Mol Cancer Res, 9, 538-544. 223. Gibson SL, Bindra RS, and Glazer PM. (2005) Hypoxia-induced phosphorylation of Chk2 in an ataxia telangiectasia mutated-dependent manner, Cancer Res, 65, 1073410741. 224. Hammond EM, Dorie MJ, and Giaccia AJ. (2003) ATR/ATM targets are phosphorylated by ATR in response to hypoxia and ATM in response to reoxygenation, J Biol Chem, 278, 12207-12213. 225. Bencokova Z, Kaufmann MR, Pires IM, Lecane PS, Giaccia AJ et al. (2009) ATM activation and signaling under hypoxic conditions, Mol Cell Biol, 29, 526-537. 226. Toledo LI, Murga M, Gutierrez-Martinez P, Soria R, and Fernandez-Capetillo O. (2008) ATR signaling can drive cells into senescence in the absence of DNA breaks, Genes Dev, 22, 297-302. 227. Collado M, and Serrano M. (2010) Senescence in tumours: evidence from mice and humans, Nat Rev Cancer, 10, 51-57. 228. Larsson LG. (2011) Oncogene- and tumor suppressor gene-mediated suppression of cellular senescence, Semin Cancer Biol, 21, 367-376. 229. Chen Z, Trotman LC, Shaffer D, Lin HK, Dotan ZA et al. (2005) Crucial role of p53dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis, Nature, 436, 725-730. 230. Courtois-Cox S, Genther Williams SM, Reczek EE, Johnson BW, McGillicuddy LT et al. (2006) A negative feedback signaling network underlies oncogene-induced senescence, Cancer Cell, 10, 459-472. 231. Young AP, Schlisio S, Minamishima YA, Zhang Q, Li L et al. (2008) VHL loss actuates a HIF-independent senescence programme mediated by Rb and p400, Nat Cell Biol, 10, 361-369. 232. Hemann MT, and Narita M. (2007) Oncogenes and senescence: breaking down in the fast lane, Genes Dev, 21, 1-5. 233. Di Micco R, Fumagalli M, Cicalese A, Piccinin S, Gasparini P et al. (2006) Oncogeneinduced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication, Nature, 444, 638-642. 94 234. Bartkova J, Rezaei N, Liontos M, Karakaidos P, Kletsas D et al. (2006) Oncogeneinduced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints, Nature, 444, 633-637. 235. Mallette FA, Gaumont-Leclerc MF, and Ferbeyre G. (2007) The DNA damage signaling pathway is a critical mediator of oncogene-induced senescence, Genes Dev, 21, 43-48. 236. Irani K, Xia Y, Zweier JL, Sollott SJ, Der CJ et al. (1997) Mitogenic signaling mediated by oxidants in Ras-transformed fibroblasts, Science, 275, 1649-1652. 237. Vafa O, Wade M, Kern S, Beeche M, Pandita TK et al. (2002) c-Myc can induce DNA damage, increase reactive oxygen species, and mitigate p53 function: a mechanism for oncogene-induced genetic instability, Mol Cell, 9, 1031-1044. 238. Dolado I, Swat A, Ajenjo N, De Vita G, Cuadrado A et al. (2007) p38alpha MAP kinase as a sensor of reactive oxygen species in tumorigenesis, Cancer Cell, 11, 191-205. 239. Ogrunc M, Di Micco R, Liontos M, Bombardelli L, Mione M et al. (2014) Oncogeneinduced reactive oxygen species fuel hyperproliferation and DNA damage response activation, Cell Death Differ, 21, 998-1012. 240. Maya-Mendoza A, Ostrakova J, Kosar M, Hall A, Duskova P et al. (2015) Myc and Ras oncogenes engage different energy metabolism programs and evoke distinct patterns of oxidative and DNA replication stress, Mol Oncol, 9, 601-616. 241. Suram A, Kaplunov J, Patel PL, Ruan H, Cerutti A et al. (2012) Oncogene-induced telomere dysfunction enforces cellular senescence in human cancer precursor lesions, EMBO J, 31, 2839-2851. 242. Neelsen KJ, Zanini IM, Herrador R, and Lopes M. (2013) Oncogenes induce genotoxic stress by mitotic processing of unusual replication intermediates, J Cell Biol, 200, 699708. 243. Aird KM, Zhang G, Li H, Tu Z, Bitler BG et al. (2013) Suppression of nucleotide metabolism underlies the establishment and maintenance of oncogene-induced senescence, Cell Rep, 3, 1252-1265. 244. Ribeiro JD, Morey L, Mas A, Gutierrez A, Luis NM et al. (2013) ZRF1 controls oncogene-induced senescence through the INK4-ARF locus, Oncogene, 32, 2161-2168. 245. Sreeramaneni R, Chaudhry A, McMahon M, Sherr CJ, and Inoue K. (2005) Ras-Raf-Arf signaling critically depends on the Dmp1 transcription factor, Mol Cell Biol, 25, 220-232. 246. Vogt M, Haggblom C, Yeargin J, Christiansen-Weber T, and Haas M. (1998) Independent induction of senescence by p16INK4a and p21CIP1 in spontaneously immortalized human fibroblasts, Cell Growth Differ, 9, 139-146. 247. Zhu J, Woods D, McMahon M, and Bishop JM. (1998) Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf, Genes Dev, 12, 2997-3007. 248. Uhrbom L, Nister M, and Westermark B. (1997) Induction of senescence in human malignant glioma cells by p16INK4A, Oncogene, 15, 505-514. 249. Efeyan A, Murga M, Martinez-Pastor B, Ortega-Molina A, Soria R et al. (2009) Limited role of murine ATM in oncogene-induced senescence and p53-dependent tumor suppression, PLoS One, 4, e5475. 250. Astle MV, Hannan KM, Ng PY, Lee RS, George AJ et al. (2012) AKT induces senescence in human cells via mTORC1 and p53 in the absence of DNA damage: implications for targeting mTOR during malignancy, Oncogene, 31, 1949-1962. 251. Sharpless NE, Ramsey MR, Balasubramanian P, Castrillon DH, and DePinho RA. (2004) The differential impact of p16(INK4a) or p19(ARF) deficiency on cell growth and tumorigenesis, Oncogene, 23, 379-385. 95 252. Tao W, and Levine AJ. (1999) P19(ARF) stabilizes p53 by blocking nucleo-cytoplasmic shuttling of Mdm2, Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 6937-6941. 253. Weber JD, Jeffers JR, Rehg JE, Randle DH, Lozano G et al. (2000) p53-independent functions of the p19(ARF) tumor suppressor, Genes Dev, 14, 2358-2365. 254. Haferkamp S, Scurr LL, Becker TM, Frausto M, Kefford RF et al. (2009) Oncogeneinduced senescence does not require the p16(INK4a) or p14ARF melanoma tumor suppressors, J Invest Dermatol, 129, 1983-1991. 255. Ohtani N, Zebedee Z, Huot TJ, Stinson JA, Sugimoto M et al. (2001) Opposing effects of Ets and Id proteins on p16INK4a expression during cellular senescence, Nature, 409, 1067-1070. 256. Lin AW, Barradas M, Stone JC, van Aelst L, Serrano M et al. (1998) Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling, Genes Dev, 12, 3008-3019. 257. Michaloglou C, Vredeveld LC, Soengas MS, Denoyelle C, Kuilman T et al. (2005) BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi, Nature, 436, 720-724. 258. Dhomen N, Reis-Filho JS, da Rocha Dias S, Hayward R, Savage K et al. (2009) Oncogenic Braf induces melanocyte senescence and melanoma in mice, Cancer Cell, 15, 294-303. 259. Vredeveld LC, Possik PA, Smit MA, Meissl K, Michaloglou C et al. (2012) Abrogation of BRAFV600E-induced senescence by PI3K pathway activation contributes to melanomagenesis, Genes Dev, 26, 1055-1069. 260. Collado M, Gil J, Efeyan A, Guerra C, Schuhmacher AJ et al. (2005) Tumour biology: senescence in premalignant tumours, Nature, 436, 642. 261. Qu K, Lin T, Wang Z, Liu S, Chang H et al. (2014) Reactive oxygen species generation is essential for cisplatin-induced accelerated senescence in hepatocellular carcinoma, Front Med, 8, 227-235. 262. Probin V, Wang Y, Bai A, and Zhou D. (2006) Busulfan selectively induces cellular senescence but not apoptosis in WI38 fibroblasts via a p53-independent but extracellular signal-regulated kinase-p38 mitogen-activated protein kinase-dependent mechanism, J Pharmacol Exp Ther, 319, 551-560. 263. Berndtsson M, Hagg M, Panaretakis T, Havelka AM, Shoshan MC et al. (2007) Acute apoptosis by cisplatin requires induction of reactive oxygen species but is not associated with damage to nuclear DNA, Int J Cancer, 120, 175-180. 264. Probin V, Wang Y, and Zhou D. (2007) Busulfan-induced senescence is dependent on ROS production upstream of the MAPK pathway, Free Radic Biol Med, 42, 1858-1865. 265. Sulkowska M, Sulkowski S, Skrzydlewska E, and Farbiszewski R. (1998) Cyclophosphamide-induced generation of reactive oxygen species. Comparison with morphological changes in type II alveolar epithelial cells and lung capillaries, Exp Toxicol Pathol, 50, 209-220. 266. Tsai-Turton M, Luong BT, Tan Y, and Luderer U. (2007) Cyclophosphamide-induced apoptosis in COV434 human granulosa cells involves oxidative stress and glutathione depletion, Toxicol Sci, 98, 216-230. 267. Tsang WP, Chau SP, Kong SK, Fung KP, and Kwok TT. (2003) Reactive oxygen species mediate doxorubicin induced p53-independent apoptosis, Life Sci, 73, 2047-2058. 268. Kim SY, Kim SJ, Kim BJ, Rah SY, Chung SM et al. (2006) Doxorubicin-induced reactive oxygen species generation and intracellular Ca2+ increase are reciprocally modulated in rat cardiomyocytes, Exp Mol Med, 38, 535-545. 96 269. Glover TW, Berger C, Coyle J, and Echo B. (1984) DNA polymerase alpha inhibition by aphidicolin induces gaps and breaks at common fragile sites in human chromosomes, Hum Genet, 67, 136-142. 270. Kurose A, Tanaka T, Huang X, Traganos F, and Darzynkiewicz Z. (2006) Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage, Cell Prolif, 39, 231-240. 271. Petermann E, Orta ML, Issaeva N, Schultz N, and Helleday T. (2010) Hydroxyureastalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair, Mol Cell, 37, 492-502. 272. Wei F, Xie Y, He L, Tao L, and Tang D. (2011) ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation, Cell Signal, 23, 259-268. 273. Marusyk A, Wheeler LJ, Mathews CK, and DeGregori J. (2007) p53 mediates senescence-like arrest induced by chronic replicational stress, Mol Cell Biol, 27, 53365351. 274. Yeo EJ, Hwang YC, Kang CM, Kim IH, Kim DI et al. (2000) Senescence-like changes induced by hydroxyurea in human diploid fibroblasts, Exp Gerontol, 35, 553-571. 275. Park JI, Jeong JS, Han JY, Kim DI, Gao YH et al. (2000) Hydroxyurea induces a senescence-like change of K562 human erythroleukemia cell, J Cancer Res Clin Oncol, 126, 455-460. 276. Yogev O, Anzi S, Inoue K, and Shaulian E. (2006) Induction of transcriptionally active Jun proteins regulates drug-induced senescence, J Biol Chem, 281, 34475-34483. 277. Hong SH, Hong B, Kim DC, Rho MS, Park JI et al. (2004) Involvement of mitogenactivated protein kinases and p21Waf1 in hydroxyurea-induced G1 arrest and senescence of McA-RH7777 rat hepatoma cell line, Exp Mol Med, 36, 493-498. 278. Wang X, Wong SC, Pan J, Tsao SW, Fung KH et al. (1998) Evidence of cisplatininduced senescent-like growth arrest in nasopharyngeal carcinoma cells, Cancer Res, 58, 5019-5022. 279. Zhao W, Lin ZX, and Zhang ZQ. (2004) Cisplatin-induced premature senescence with concomitant reduction of gap junctions in human fibroblasts, Cell Res, 14, 60-66. 280. Fang K, Chiu CC, Li CH, Chang YT, and Hwang HT. (2007) Cisplatin-induced senescence and growth inhibition in human non-small cell lung cancer cells with ectopic transfer of p16INK4a, Oncol Res, 16, 479-488. 281. Veena MS, Wilken R, Zheng JY, Gholkar A, Venkatesan N et al. (2014) p16 Protein and gigaxonin are associated with the ubiquitination of NFkappaB in cisplatin-induced senescence of cancer cells, J Biol Chem, 289, 34921-34937. 282. McKenna E, Traganos F, Zhao H, and Darzynkiewicz Z. (2012) Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence, Cell Cycle, 11, 3132-3140. 283. Schmitt CA, Fridman JS, Yang M, Lee S, Baranov E et al. (2002) A senescence program controlled by p53 and p16INK4a contributes to the outcome of cancer therapy, Cell, 109, 335-346. 284. Aoshiba K, Tsuji T, and Nagai A. (2003) Bleomycin induces cellular senescence in alveolar epithelial cells, Eur Respir J, 22, 436-443. 285. Aoshiba K, Tsuji T, Kameyama S, Itoh M, Semba S et al. (2013) Senescence-associated secretory phenotype in a mouse model of bleomycin-induced lung injury, Exp Toxicol Pathol, 65, 1053-1062. 97 286. Linge A, Weinhold K, Blasche R, Kasper M, and Barth K. (2007) Downregulation of caveolin-1 affects bleomycin-induced growth arrest and cellular senescence in A549 cells, Int J Biochem Cell Biol, 39, 1964-1974. 287. Pazolli E, Alspach E, Milczarek A, Prior J, Piwnica-Worms D et al. (2012) Chromatin remodeling underlies the senescence-associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression, Cancer Res, 72, 2251-2261. 288. Chang BD, Broude EV, Dokmanovic M, Zhu H, Ruth A et al. (1999) A senescence-like phenotype distinguishes tumor cells that undergo terminal proliferation arrest after exposure to anticancer agents, Cancer Res, 59, 3761-3767. 289. Chang BD, Xuan Y, Broude EV, Zhu H, Schott B et al. (1999) Role of p53 and p21waf1/cip1 in senescence-like terminal proliferation arrest induced in human tumor cells by chemotherapeutic drugs, Oncogene, 18, 4808-4818. 290. Jackson JG, Pant V, Li Q, Chang LL, Quintas-Cardama A et al. (2012) p53-mediated senescence impairs the apoptotic response to chemotherapy and clinical outcome in breast cancer, Cancer Cell, 21, 793-806. 291. Elmore LW, Rehder CW, Di X, McChesney PA, Jackson-Cook CK et al. (2002) Adriamycin-induced senescence in breast tumor cells involves functional p53 and telomere dysfunction, J Biol Chem, 277, 35509-35515. 292. Rebbaa A, Zheng X, Chou PM, and Mirkin BL. (2003) Caspase inhibition switches doxorubicin-induced apoptosis to senescence, Oncogene, 22, 2805-2811. 293. Piegari E, De Angelis A, Cappetta D, Russo R, Esposito G et al. (2013) Doxorubicin induces senescence and impairs function of human cardiac progenitor cells, Basic Res Cardiol, 108, 334. 294. Sliwinska MA, Mosieniak G, Wolanin K, Babik A, Piwocka K et al. (2009) Induction of senescence with doxorubicin leads to increased genomic instability of HCT116 cells, Mech Ageing Dev, 130, 24-32. 295. Litwiniec A, Grzanka A, Helmin-Basa A, Gackowska L, and Grzanka D. (2010) Features of senescence and cell death induced by doxorubicin in A549 cells: organization and level of selected cytoskeletal proteins, J Cancer Res Clin Oncol, 136, 717-736. 296. Spallarossa P, Altieri P, Aloi C, Garibaldi S, Barisione C et al. (2009) Doxorubicin induces senescence or apoptosis in rat neonatal cardiomyocytes by regulating the expression levels of the telomere binding factors 1 and 2, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 297, H2169-2181. 297. Leontieva OV, Gudkov AV, and Blagosklonny MV. (2010) Weak p53 permits senescence during cell cycle arrest, Cell Cycle, 9, 4323-4327. 298. te Poele RH, Okorokov AL, Jardine L, Cummings J, and Joel SP. (2002) DNA damage is able to induce senescence in tumor cells in vitro and in vivo, Cancer Res, 62, 1876-1883. 299. Litwiniec A, Gackowska L, Helmin-Basa A, Zuryn A, and Grzanka A. (2013) Low-dose etoposide-treatment induces endoreplication and cell death accompanied by cytoskeletal alterations in A549 cells: Does the response involve senescence? The possible role of vimentin, Cancer Cell Int, 13, 9. 300. Roberson RS, Kussick SJ, Vallieres E, Chen SY, and Wu DY. (2005) Escape from therapy-induced accelerated cellular senescence in p53-null lung cancer cells and in human lung cancers, Cancer Res, 65, 2795-2803. 301. Zhang JW, Zhang SS, Song JR, Sun K, Zong C et al. (2014) Autophagy inhibition switches low-dose camptothecin-induced premature senescence to apoptosis in human colorectal cancer cells, Biochem Pharmacol, 90, 265-275. 98 302. Han Z, Wei W, Dunaway S, Darnowski JW, Calabresi P et al. (2002) Role of p21 in apoptosis and senescence of human colon cancer cells treated with camptothecin, J Biol Chem, 277, 17154-17160. 303. Suzuki T, Minagawa S, Michishita E, Ogino H, Fujii M et al. (2001) Induction of senescence-associated genes by 5-bromodeoxyuridine in HeLa cells, Exp Gerontol, 36, 465-474. 304. Kulaeva OI, Draghici S, Tang L, Kraniak JM, Land SJ et al. (2003) Epigenetic silencing of multiple interferon pathway genes after cellular immortalization, Oncogene, 22, 41184127. 305. Fridman AL, Tang L, Kulaeva OI, Ye B, Li Q et al. (2006) Expression profiling identifies three pathways altered in cellular immortalization: interferon, cell cycle, and cytoskeleton, J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 61, 879-889. 306. Venturelli S, Berger A, Weiland T, Essmann F, Waibel M et al. (2013) Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells, Mol Cancer Ther, 12, 22262236. 307. Ogryzko VV, Hirai TH, Russanova VR, Barbie DA, and Howard BH. (1996) Human fibroblast commitment to a senescence-like state in response to histone deacetylase inhibitors is cell cycle dependent, Mol Cell Biol, 16, 5210-5218. 308. Xiao H, Hasegawa T, Miyaishi O, Ohkusu K, and Isobe K. (1997) Sodium butyrate induces NIH3T3 cells to senescence-like state and enhances promoter activity of p21WAF/CIP1 in p53-independent manner, Biochem Biophys Res Commun, 237, 457460. 309. Terao Y, Nishida J, Horiuchi S, Rong F, Ueoka Y et al. (2001) Sodium butyrate induces growth arrest and senescence-like phenotypes in gynecologic cancer cells, Int J Cancer, 94, 257-267. 310. Place RF, Noonan EJ, and Giardina C. (2005) HDACs and the senescent phenotype of WI-38 cells, BMC Cell Biol, 6, 37. 311. Prieur A, Besnard E, Babled A, and Lemaitre JM. (2011) p53 and p16(INK4A) independent induction of senescence by chromatin-dependent alteration of S-phase progression, Nat Commun, 2, 473. 312. Di Bernardo G, Squillaro T, Dell'Aversana C, Miceli M, Cipollaro M et al. (2009) Histone deacetylase inhibitors promote apoptosis and senescence in human mesenchymal stem cells, Stem Cells Dev, 18, 573-581. 313. He J, Kallin EM, Tsukada Y, and Zhang Y. (2008) The H3K36 demethylase Jhdm1b/Kdm2b regulates cell proliferation and senescence through p15(Ink4b), Nat Struct Mol Biol, 15, 1169-1175. 314. Peters G. (2008) An INKlination for epigenetic control of senescence, Nat Struct Mol Biol, 15, 1133-1134. 315. Seluanov A, Gorbunova V, Falcovitz A, Sigal A, Milyavsky M et al. (2001) Change of the death pathway in senescent human fibroblasts in response to DNA damage is caused by an inability to stabilize p53, Mol Cell Biol, 21, 1552-1564. 316. Lodygin D, Menssen A, and Hermeking H. (2002) Induction of the Cdk inhibitor p21 by LY83583 inhibits tumor cell proliferation in a p53-independent manner, J Clin Invest, 110, 1717-1727. 317. Vigh L, Maresca B, and Harwood JL. (1998) Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes?, Trends Biochem Sci, 23, 369-374. 99 318. Wang TT, Chiang AS, Chu JJ, Cheng TJ, Chen TM et al. (1998) Concomitant alterations in distribution of 70 kDa heat shock proteins, cytoskeleton and organelles in heat shocked 9L cells, Int J Biochem Cell Biol, 30, 745-759. 319. Luchetti F, Mannello F, Canonico B, Battistelli M, Burattini S et al. (2004) Integrin and cytoskeleton behaviour in human neuroblastoma cells during hyperthermia-related apoptosis, Apoptosis, 9, 635-648. 320. Welch WJ, and Suhan JP. (1985) Morphological study of the mammalian stress response: characterization of changes in cytoplasmic organelles, cytoskeleton, and nucleoli, and appearance of intranuclear actin filaments in rat fibroblasts after heat-shock treatment, J Cell Biol, 101, 1198-1211. 321. Velichko AK, Petrova NV, Kantidze OL, and Razin SV. (2012) Dual effect of heat shock on DNA replication and genome integrity, Mol Biol Cell, 23, 3450-3460. 322. Armour EP, McEachern D, Wang Z, Corry PM, and Martinez A. (1993) Sensitivity of human cells to mild hyperthermia, Cancer Res, 53, 2740-2744. 323. Coss RA, Alden ME, Wachsberger PR, and Smith NN. (1996) Response of the microtubular cytoskeleton following hyperthermia as a prognostic indicator of survival of Chinese hamster ovary cells, Int J Radiat Oncol Biol Phys, 34, 403-410. 324. Takahashi A, Matsumoto H, Nagayama K, Kitano M, Hirose S et al. (2004) Evidence for the involvement of double-strand breaks in heat-induced cell killing, Cancer Res, 64, 8839-8845. 325. Westra A, and Dewey WC. (1971) Variation in sensitivity to heat shock during the cellcycle of Chinese hamster cells in vitro, Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med, 19, 467-477. 326. Bhuyan BK, Day KJ, Edgerton CE, and Ogunbase O. (1977) Sensitivity of different cell lines and of different phases in the cell cycle to hyperthermia, Cancer Res, 37, 37803784. 327. O'Neill KL, Fairbairn DW, Smith MJ, and Poe BS. (1998) Critical parameters influencing hyperthermia-induced apoptosis in human lymphoid cell lines, Apoptosis, 3, 369-375. 328. Falcieri E, Luchetti F, Burattini S, Canonico B, Santi S et al. (2000) Lineage-related sensitivity to apoptosis in human tumor cells undergoing hyperthermia, Histochem Cell Biol, 113, 135-144. 329. Harmon BV, Corder AM, Collins RJ, Gobe GC, Allen J et al. (1990) Cell death induced in a murine mastocytoma by 42-47 degrees C heating in vitro: evidence that the form of death changes from apoptosis to necrosis above a critical heat load, Int J Radiat Biol, 58, 845-858. 330. Vidair CA, and Dewey WC. (1988) Two distinct modes of hyperthermic cell death, Radiat Res, 116, 157-171. 331. Vidair CA, Doxsey SJ, and Dewey WC. (1993) Heat shock alters centrosome organization leading to mitotic dysfunction and cell death, J Cell Physiol, 154, 443-455. 332. Nakahata K, Miyakoda M, Suzuki K, Kodama S, and Watanabe M. (2002) Heat shock induces centrosomal dysfunction, and causes non-apoptotic mitotic catastrophe in human tumour cells, Int J Hyperthermia, 18, 332-343. 333. Fuse T, Yamada K, Asai K, Kato T, and Nakanishi M. (1996) Heat shock-mediated cell cycle arrest is accompanied by induction of p21 CKI, Biochem Biophys Res Commun, 225, 759-763. 100 334. Valenzuela MT, Nunez MI, Villalobos M, Siles E, McMillan TJ et al. (1997) A comparison of p53 and p16 expression in human tumor cells treated with hyperthermia or ionizing radiation, Int J Cancer, 72, 307-312. 335. Nitta M, Okamura H, Aizawa S, and Yamaizumi M. (1997) Heat shock induces transient p53-dependent cell cycle arrest at G1/S, Oncogene, 15, 561-568. 336. Furusawa Y, Iizumi T, Fujiwara Y, Zhao QL, Tabuchi Y et al. (2012) Inhibition of checkpoint kinase 1 abrogates G2/M checkpoint activation and promotes apoptosis under heat stress, Apoptosis, 17, 102-112. 337. Han SI, Oh SY, Jeon WJ, Kim JM, Lee JH et al. (2002) Mild heat shock induces cyclin D1 synthesis through multiple Ras signal pathways, FEBS Lett, 515, 141-145. 338. Yamaguchi T, Suzuki T, Arai H, Tanabe S, and Atomi Y. (2010) Continuous mild heat stress induces differentiation of mammalian myoblasts, shifting fiber type from fast to slow, Am J Physiol Cell Physiol, 298, C140-148. 339. Hatade T, Takeuchi K, Fujita N, Arakawa T, and Miki A. (2014) Effect of heat stress soon after muscle injury on the expression of MyoD and myogenin during regeneration process, J Musculoskelet Neuronal Interact, 14, 325-333. 340. Kamanga-Sollo E, Pampusch MS, White ME, Hathaway MR, and Dayton WR. (2011) Effects of heat stress on proliferation, protein turnover, and abundance of heat shock protein messenger ribonucleic acid in cultured porcine muscle satellite cells, J Anim Sci, 89, 3473-3480. 341. Lin Y, Peng N, Zhuang H, Zhang D, Wang Y et al. (2014) Heat shock proteins HSP70 and MRJ cooperatively regulate cell adhesion and migration through urokinase receptor, BMC Cancer, 14, 639. 342. Wang Y, Guan J, Wang H, Wang Y, Leeper D et al. (2001) Regulation of dna replication after heat shock by replication protein a-nucleolin interactions, J Biol Chem, 276, 2057920588. 343. Schmitt E, Gehrmann M, Brunet M, Multhoff G, and Garrido C. (2007) Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy, J Leukoc Biol, 81, 15-27. 344. Bruey JM, Ducasse C, Bonniaud P, Ravagnan L, Susin SA et al. (2000) Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c, Nat Cell Biol, 2, 645-652. 345. Saleh A, Srinivasula SM, Balkir L, Robbins PD, and Alnemri ES. (2000) Negative regulation of the Apaf-1 apoptosome by Hsp70, Nat Cell Biol, 2, 476-483. 346. Ravagnan L, Gurbuxani S, Susin SA, Maisse C, Daugas E et al. (2001) Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor, Nat Cell Biol, 3, 839-843. 347. Biamonti G, and Vourc'h C. (2010) Nuclear stress bodies, Cold Spring Harb Perspect Biol, 2, a000695. 348. Kedersha N, Stoecklin G, Ayodele M, Yacono P, Lykke-Andersen J et al. (2005) Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling, J Cell Biol, 169, 871-884. 349. Souquere S, Mollet S, Kress M, Dautry F, Pierron G et al. (2009) Unravelling the ultrastructure of stress granules and associated P-bodies in human cells, J Cell Sci, 122, 3619-3626. 350. Velichko AK, Kantidze OL, and Razin SV. (2011) HP1alpha is not necessary for the structural maintenance of centromeric heterochromatin, Epigenetics, 6, 380-387. 351. Fischle W, Tseng BS, Dormann HL, Ueberheide BM, Garcia BA et al. (2005) Regulation of HP1-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation, Nature, 438, 1116-1122. 101 352. McMillan DR, Xiao X, Shao L, Graves K, and Benjamin IJ. (1998) Targeted disruption of heat shock transcription factor 1 abolishes thermotolerance and protection against heat-inducible apoptosis, J Biol Chem, 273, 7523-7528. 353. Bukh A, Martinez-Valdez H, Freedman SJ, Freedman MH, and Cohen A. (1990) The expression of c-fos, c-jun, and c-myc genes is regulated by heat shock in human lymphoid cells, J Immunol, 144, 4835-4840. 354. Diamond DA, Parsian A, Hunt CR, Lofgren S, Spitz DR et al. (1999) Redox factor-1 (Ref-1) mediates the activation of AP-1 in HeLa and NIH 3T3 cells in response to heat shock, J Biol Chem, 274, 16959-16964. 355. Yakovchuk P, Goodrich JA, and Kugel JF. (2009) B2 RNA and Alu RNA repress transcription by disrupting contacts between RNA polymerase II and promoter DNA within assembled complexes, Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 5569-5574. 356. Mariner PD, Walters RD, Espinoza CA, Drullinger LF, Wagner SD et al. (2008) Human Alu RNA is a modular transacting repressor of mRNA transcription during heat shock, Mol Cell, 29, 499-509. 357. Fritah S, Col E, Boyault C, Govin J, Sadoul K et al. (2009) Heat-shock factor 1 controls genome-wide acetylation in heat-shocked cells, Mol Biol Cell, 20, 4976-4984. 358. Cuesta R, Laroia G, and Schneider RJ. (2000) Chaperone hsp27 inhibits translation during heat shock by binding eIF4G and facilitating dissociation of cap-initiation complexes, Genes Dev, 14, 1460-1470. 359. Ma S, Bhattacharjee RB, and Bag J. (2009) Expression of poly(A)-binding protein is upregulated during recovery from heat shock in HeLa cells, FEBS J, 276, 552-570. 360. Kaufman RJ. (1999) Stress signaling from the lumen of the endoplasmic reticulum: coordination of gene transcriptional and translational controls, Genes Dev, 13, 12111233. 361. Murray JI, Whitfield ML, Trinklein ND, Myers RM, Brown PO et al. (2004) Diverse and specific gene expression responses to stresses in cultured human cells, Mol Biol Cell, 15, 2361-2374. 362. Mai B, and Breeden L. (1997) Xbp1, a stress-induced transcriptional repressor of the Saccharomyces cerevisiae Swi4/Mbp1 family, Mol Cell Biol, 17, 6491-6501. 363. Nivon M, Abou-Samra M, Richet E, Guyot B, Arrigo AP et al. (2012) NF-kappaB regulates protein quality control after heat stress through modulation of the BAG3-HspB8 complex, J Cell Sci, 125, 1141-1151. 364. Heldens L, Hensen SM, Onnekink C, van Genesen ST, Dirks RP et al. (2011) An atypical unfolded protein response in heat shocked cells, PLoS One, 6, e23512. 365. Logan IR, McNeill HV, Cook S, Lu X, Meek DW et al. (2009) Heat shock factor-1 modulates p53 activity in the transcriptional response to DNA damage, Nucleic Acids Res, 37, 2962-2973. 366. Han J, Xu X, Qin H, Liu A, Fan Z et al. (2013) The molecular mechanism and potential role of heat shock-induced p53 protein accumulation, Mol Cell Biochem, 378, 161-169. 367. Ohnishi T, Wang X, Ohnishi K, Matsumoto H, and Takahashi A. (1996) p53-dependent induction of WAF1 by heat treatment in human glioblastoma cells, J Biol Chem, 271, 14510-14513. 368. Fan J, Yang X, Wang W, Wood WH, 3rd, Becker KG et al. (2002) Global analysis of stress-regulated mRNA turnover by using cDNA arrays, Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 10611-10616. 369. Wang C, and Chen J. (2003) Phosphorylation and hsp90 binding mediate heat shock stabilization of p53, J Biol Chem, 278, 2066-2071. 102 370. Miyakoda M, Suzuki K, Kodama S, and Watanabe M. (2002) Activation of ATM and phosphorylation of p53 by heat shock, Oncogene, 21, 1090-1096. 371. Turenne GA, Paul P, Laflair L, and Price BD. (2001) Activation of p53 transcriptional activity requires ATM's kinase domain and multiple N-terminal serine residues of p53, Oncogene, 20, 5100-5110. 372. Leung AK, and Sharp PA. (2010) MicroRNA functions in stress responses, Mol Cell, 40, 205-215. 373. Fukuoka M, Yoshida M, Eda A, Takahashi M, and Hohjoh H. (2014) Gene silencing mediated by endogenous microRNAs under heat stress conditions in mammalian cells, PLoS One, 9, e103130. 374. Wilmink GJ, Roth CL, Ibey BL, Ketchum N, Bernhard J et al. (2010) Identification of microRNAs associated with hyperthermia-induced cellular stress response, Cell Stress Chaperones, 15, 1027-1038. 375. Warters RL, and Stone OL. (1983) The effects of hyperthermia on DNA replication in HeLa cells, Radiat Res, 93, 71-84. 376. Wong RS, Kapp LN, and Dewey WC. (1989) DNA fork displacement rate measurements in heated Chinese hamster ovary cells, Biochim Biophys Acta, 1007, 224-227. 377. Daniely Y, and Borowiec JA. (2000) Formation of a complex between nucleolin and replication protein A after cell stress prevents initiation of DNA replication, J Cell Biol, 149, 799-810. 378. Corry PM, Robinson S, and Getz S. (1977) Hyperthermic effects on DNA repair mechanisms, Radiology, 123, 475-482. 379. Burgman P, Ouyang H, Peterson S, Chen DJ, and Li GC. (1997) Heat inactivation of Ku autoantigen: possible role in hyperthermic radiosensitization, Cancer Res, 57, 2847-2850. 380. Seno JD, and Dynlacht JR. (2004) Intracellular redistribution and modification of proteins of the Mre11/Rad50/Nbs1 DNA repair complex following irradiation and heatshock, J Cell Physiol, 199, 157-170. 381. Spiro IJ, Denman DL, and Dewey WC. (1983) Effect of hyperthermia on isolated DNA polymerase-beta, Radiat Res, 95, 68-77. 382. Jorritsma JB, and Konings AW. (1984) The occurrence of DNA strand breaks after hyperthermic treatments of mammalian cells with and without radiation, Radiat Res, 98, 198-208. 383. Warters RL, Brizgys LM, and Axtell-Bartlett J. (1985) DNA damage production in CHO cells at elevated temperatures, J Cell Physiol, 124, 481-486. 384. Wong RS, Dynlacht JR, Cedervall B, and Dewey WC. (1995) Analysis by pulsed-field gel electrophoresis of DNA double-strand breaks induced by heat and/or X-irradiation in bulk and replicating DNA of CHO cells, Int J Radiat Biol, 68, 141-152. 385. Kaneko H, Igarashi K, Kataoka K, and Miura M. (2005) Heat shock induces phosphorylation of histone H2AX in mammalian cells, Biochem Biophys Res Commun, 328, 1101-1106. 386. Bruskov VI, Malakhova LV, Masalimov ZK, and Chernikov AV. (2002) Heat-induced formation of reactive oxygen species and 8-oxoguanine, a biomarker of damage to DNA, Nucleic Acids Res, 30, 1354-1363. 387. Hsu YL, Yu HS, Lin HC, Wu KY, Yang RC et al. (2011) Heat shock induces apoptosis through reactive oxygen species involving mitochondrial and death receptor pathways in corneal cells, Exp Eye Res, 93, 405-412. 103 388. Gu ZT, Wang H, Li L, Liu YS, Deng XB et al. (2014) Heat stress induces apoptosis through transcription-independent p53-mediated mitochondrial pathways in human umbilical vein endothelial cell, Sci Rep, 4, 4469. 389. Zeman MK, and Cimprich KA. (2014) Causes and consequences of replication stress, Nat Cell Biol, 16, 2-9. 390. Bradford MM. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248-254. 391. Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685. 392. Nitiss JL, Soans E, Rogojina A, Seth A, and Mishina M. (2012) Topoisomerase assays, Curr Protoc Pharmacol, 3, Unit 3 3. 393. Rowe TC, Chen GL, Hsiang YH, and Liu LF. (1986) DNA damage by antitumor acridines mediated by mammalian DNA topoisomerase II, Cancer Res, 46, 2021-2026. 394. Kiianitsa K, and Maizels N. (2013) A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells, Nucleic Acids Res, 41, e104. 395. Kiianitsa K, and Maizels N. (2014) Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay, Nucleic Acids Res, 42, e108. 396. Wei X, Samarabandu J, Devdhar RS, Siegel AJ, Acharya R et al. (1998) Segregation of transcription and replication sites into higher order domains, Science, 281, 1502-1506. 397. Jackson D, Wang X, and Rudner DZ. (2012) Spatio-temporal organization of replication in bacteria and eukaryotes (nucleoids and nuclei), Cold Spring Harb Perspect Biol, 4, a010389. 398. Sugrue MM, Shin DY, Lee SW, and Aaronson SA. (1997) Wild-type p53 triggers a rapid senescence program in human tumor cells lacking functional p53, Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 9648-9653. 399. Lovejoy CA, and Cortez D. (2009) Common mechanisms of PIKK regulation, DNA Repair (Amst), 8, 1004-1008. 400. Dobbs TA, Tainer JA, and Lees-Miller SP. (2010) A structural model for regulation of NHEJ by DNA-PKcs autophosphorylation, DNA Repair (Amst), 9, 1307-1314. 401. Lin YF, Shih HY, Shang Z, Matsunaga S, and Chen BP. (2014) DNA-PKcs is required to maintain stability of Chk1 and Claspin for optimal replication stress response, Nucleic Acids Res, 42, 4463-4473. 402. Chang S. (2012) Chromosome ends teach unexpected lessons on DNA damage signalling, EMBO J, 31, 3380-3381. 403. Picard F, Cadoret JC, Audit B, Arneodo A, Alberti A et al. (2014) The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells, PLoS Genet, 10, e1004282. 404. Krokan H, Wist E, and Krokan RH. (1981) Aphidicolin inhibits DNA synthesis by DNA polymerase alpha and isolated nuclei by a similar mechanism, Nucleic Acids Res, 9, 4709-4719. 405. Elford HL. (1968) Effect of hydroxyurea on ribonucleotide reductase, Biochem Biophys Res Commun, 33, 129-135. 406. Hertzberg RP, Caranfa MJ, and Hecht SM. (1989) On the mechanism of topoisomerase I inhibition by camptothecin: evidence for binding to an enzyme-DNA complex, Biochemistry, 28, 4629-4638. 104 407. Hsiang YH, Lihou MG, and Liu LF. (1989) Arrest of replication forks by drug-stabilized topoisomerase I-DNA cleavable complexes as a mechanism of cell killing by camptothecin, Cancer Res, 49, 5077-5082. 408. Desai SD, Zhang H, Rodriguez-Bauman A, Yang JM, Wu X et al. (2003) Transcriptiondependent degradation of topoisomerase I-DNA covalent complexes, Mol Cell Biol, 23, 2341-2350. 409. Spradling A, Penman S, and Pardue ML. (1975) Analysis of drosophila mRNA by in situ hybridization: sequences transcribed in normal and heat shocked cultured cells, Cell, 4, 395-404. 410. Higashikubo R, and Roti Roti JL. (1993) Alterations in nuclear protein mass and macromolecular synthesis following heat shock, Radiat Res, 134, 193-201. 411. de Lange T. (2005) Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres, Genes Dev., 19, 2100-10. 412. Rastogi RP, Richa, Kumar A, Tyagi MB, Sinha RP. (2010) Molecular mechanisms of ultraviolet radiation-induced DNA damage and repair, J Nucleic Acids., 16, 592980.
