Биосинтез белка

Тема лекции:
Экспрессия
генов.
Биосинтез
белка
1
Ф
У
Н
К
Ц
И
И
Д
Н
К
1.
ДНК является носителем
генетической
информации.
Функция обеспечивается
фактом существования
генетического кода.
2. Воспроизведение и
передача генетической
информации
в поколениях клеток и
организмов.
Функция обеспечивается
процессом Репликации
(редупликации)
самовоспроизведения ДНК
3. Реализация генетической
информации в виде
белков,
а также любых других
соединений,
образующихся с помощью
белков ферментов.
Функция обеспечивается
процессами
транскрипции и
трансляции.
3 109
Генетический материал живых организмов
имеет огромные размеры
и реплицируется с высокой точностью:
скорость (до 50 нуклеотидов/ с. у Mam.,
у бактерий -500 нуклеотидов /с.)
В процессе воспроизведения генома
млекопитающего
(ДНК длиной 3 млрд. пар нуклеотидов)
- не более 3 ошибок.
В процессе эволюции возникла очень точная,
хотя и не вполне свободная от ошибок
система репликации ДНК
2
В 1957 г. Артур Корнберг
обнаружил у E. coli фермент, катализирующий
процесс полимеризации ДНК из нуклеотидов
===ДНК-полимераза.
Необходимые компоненты для синтеза ДНК in vitro:
1. ДНК-матрица - образец, по которому строится
новая цепь ДНК.
2. Активированные нуклеотиды – то, из чего строятся
дочерние цепи.
3. ДНК-полимераза - то, что строит новую цепь ДНК.
4. Ионы магния - то, без чего фермент не работает.
3
Субстрат ДНК полимеразы-
дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ),
полимеризующиеся
на 1-цепочечной ДНК-матрице.
ДНК-полимераза последовательно
наращивает 1-цепочечную цепь ДНК,
шаг за шагом присоединяя к ней
следующие звенья в направлении 5\-3\.
4
Присоединение каждого
нового
нуклеотидного остатка
к 3\ концу
растущей цепи
сопровождается
гидролизом
богатой энергией связи
между 1ым и 2ым
фосфатными остатками
в дНТФ
и отщеплением
пирофосфата.
5
Для матричного синтеза новой
молекулы ДНК необходимо,
чтобы старая молекула была
1 Деспирализована,
2 Вытянута.
Механизм раскручивания или
1.денатурации двойной спирали,
а также
2. стабилизации открытой
конфигурации
6
ЭТАПЫ РЕПЛИКАЦИИ
1.Разрыв водородных связей между
комплементарными
азотистыми основаниями
двух полинуклеотидных
цепей осуществляет фермент ДНК-хеликаза,
расплетая двойную спираль ДНК.
7
2.ДНК-топоизомераза разрывает
фосфодиэфирную
связь в одной из полинуклеотидных цепей ДНК,
снимая расхождение цепей в репликационной
вилке.
8
3.Дестабилизирующие белки
(ssbp-single-stranded binding proteins),
Белки Альбертса, обнаруженные в 1968г ,
выпрямляют
участок ДНК, растягивают одиночные цепи ДНК,
не позволяя им сомкнуться
У них повышенное сродство
к одноцепочечной ДНК.
Белок не связывается с
9
двуцепочечной ДНК, не имеющей
расплавленных участков.
РЕПЛИКАЦИОННАЯ
(РЕПЛИКАТИВНАЯ)
ВИЛКАта часть молекулы ДНК,
которая уже расплелась
и
в данный момент служит
матрицей для синтеза
дочерней ДНК
10
РЕПЛИСОМАМОЛЕКУЛА ДНК+
ПОЛИМЕРАЗНЫЙ КОПЛЕКС+
УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕПЛИКАЦИИ
ФЕРМЕНТЫ
11
Дочерние цепи растут только в направлении
5\-3\,
т.е. всегда удлиняется 3\-конец затравки,
а матрица считывается ДНК-полимеразой в
направлении3\-5\
12
ЭТАПЫ РЕПЛИКАЦИИ
4. В области репликацинной вилки действуют ферменты ДНК-полимеразы:
на ведущей (лидирующей) и отстающей (запаздывающей) цепях.
На ведущей цепи ДНК-полимераза
работает непрерывно,
а на отстающей
фермент время от времени
прерывает и вновь возобновляет
свою работу, используя короткие
молекулы РНК-затравки,
синтезируемые ферментом
ДНК-праймазой.
РНК-затравка-короткий
фрагмент (5-15 нуклеотидов) РНК,
комплементарный матрице.
Затем фрагменты РНК удаляются,
Их заменяет ДНК
13
ЭТАПЫ РЕПЛИКАЦИИ
5.ДНК-праймаза синтезирует одну РНКзатравку ("праймер")
для лидирующей цепи
и для каждого фрагмента ДНК
(фрагмента Оказаки) в запаздывающей цепи.
Рейджи Оказаки (1968 г) предположил, что
синтез ДНК
идет короткими фрагментами и что
короткие фрагменты
должны сшиваться.
Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен
и составляет для фагов 1000-2000
нуклеотидов,
E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400
нукл.
14
ЭТАПЫ РЕПЛИКАЦИИ
6.РНК-затравка в дальнейшем
удаляется с помощью
ДНК-полимеразы-1, действующей как
3/ - 5/ экзонуклеаза.
7.ДНК-лигаза соединяет в нужном
порядке фрагменты ДНК,
катализируя образование
фосфодиэфирной связи.
15
Прерывистость репликации
показана для всех объектов, кроме
фагов, содержащих
одноцепочечную ДНК.
У некоторых фагов и вирусов
прерывистый синтез идет по
обеим цепям.
У бактерий и высших
организмов одна цепь образуется
непрерывно, а другая - прерывисто
(лидирующая и запаздывающая
16
цепи).
Основные этапы репликации ДНК
17
Когда синтез ДНК подходит к концу ведущей цепи,
на отстающей цепи после удаления РНК-затравки
возникает брешь==трудности.
Брешь обычно заполняется нуклеотидами,
присоединяющимися к 3-ОН-группе.
Однако на конце хромосомы (теломеры)
полинуклеотидная
цепь не имеет ОН-групп.
После каждого раунда синтеза ДНК теоретически должно
происходить укорочение хромосомы
на длину РНК-праймера.
18
Р.1948
Р.1961
в 1985 ЭЛИЗАБЕТ БЛЭКБУРН И КЭРОЛ ГРЕЙДЕР
ТЕЛОМЕРАЗА - фермент,
достраивающий концы линейных молекул ДНК хромосом
(теломеры)
короткими повторяющимися последовательностями
в половых клетках и клетках опухолей,
обеспечивая их бессмертие
19
1. Концы линейных хромосом с 3'-конца
ДНК заканчиваются повторяющимися
последовательностями нуклеотидов, теломерами,
которые синтезируются рибонуклеиновым
ферментом теломеразой
2. Структуры теломер различаются среди
простейших,
однако у всех позвоночных они одинаковы
(TTAGGG)n
3. Половые клетки и клетки иммортализированных
линий, а также опухолей имеют высокоактивную
теломеразу, которая достраивает 3'-конец ДНК,
на котором реплицируется
комплементарная цепь при делении.
4. Соматические клетки эукариот,
имеющие линейные хромосомы,
лишены теломеразной активности.
Их теломеры укорачиваются как в процессе
онтогенеза и старения in vivo),
так и при культивировании in vitro.
20
в 1971 году сформулировал теоретическую концепцию,
предполагавшую существование фермента,
открытого Кэрол Грейдер и Элизабет Блэкберн
ГИПОТЕЗА МАРГИНОТОМИИ
- механизм работы счетчика кл. делений
Алексей
Матвеевич
Оловников
(Институтб\х-ой
физики РАН)
при матричном синтезе полинуклеотидов
ДНК-полимераза
не в состоянии полностью воспроизвести
линейную матрицу,
реплика получается всегда короче в ее
начальной части.
при каждом делении клетки ее ДНК
укорачивается,
что, ограничивает
пролиферативный потенциал клеток
21
Функции ДНК:
3. Реализация генетической
информации в виде белков,
а также любых других соединений,
образующихся с помощью белковферментов.
Функция обеспечивается процессами
транскрипции и трансляции.
22
Тема лекции:
«Биосинтез белка»
23
ЭКСПРЕССИЯ
(фр. сила проявления, выражение)
ГЕНОВ
ТранскрипцияДНК-зависимый
синтез РНКсинтез РНК
на матрице ДНКначало информационного
потока в клетке.
24
Основные этапы транскрипции:
1. инициация.
Разрыв водородных связей между комплементарными
азотистыми основаниями двух полинуклеотидных
цепей
осуществляет фермент ДНК-хеликаза, расплетая
двойную спираль ДНК.
РНК-полимераза (1959 Сэмюэль Вайс)
синтезирует новую цепь от специального стартсигнала ДНК (промотора)
до стоп-сигнала (сигнала терминации).
25
Основные этапы транскрипции:
1. инициация.
РНК, которая при этом образуется- первичный
транскрипт (про-иРНК)
Скорость полимеризации при 37*С =30
нуклеонидов/секунду.
РНК 500 нуклеотидов=== 3 мин.
1 цепь ДНК – кодирующая, матричная; 2ая- не
кодирует, партнерская.
Для разных белков кодировать может 1 и 2 цепь.
26
оперон - единица транскрипции у прокариот.
структурные гены
промотор - особая
последовательность
нуклеотидов ДНК, узнаваемая
РНК-полимеразой как посадочная
площадка и старт синтеза РНК.
терминатор - особая
последовательность
нуклеотидов ДНК,
узнаваемая РНКполимеразой как
финиш транскрипции.
Только с промотора может начаться синтез специфической РНК.
27
оперон - единица транскрипции у прокариот.
структурные гены
цистрон - последовательность нуклеотидов
ДНК, кодирующая один полипептид
(в большинстве случаев - белок) или одну
tРНК, или одну rРНК.
28
оперон - единица транскрипции у прокариот.
оператор - особая
последовательность нуклеотидов
ДНК, узнаваемая белком-репрессором.
У оператора диспетчерская функция - он
разрешает или запрещает синтез РНК.
29
Основные этапы транскрипции:
2. Элонгацияпроцесс наращивания
полинуклеотидной цепи
РНК-полимераза+ Mn, Mg
Результатцепь РНК содержит азотистые основания,
комплементарные ДНК
Разные виды РНК эукариот (иРНК, тРНК, рРНК)
Транскрибируются на разных генах, разных
участках молекулы ДНК.
30
Основные этапы транскрипции:
3. ТЕРМИНАЦИЯ: РНК-полимераза
переписывает информацию
на РНК до тех пор, пока не достигнет
нуклеотидной последовательности
АТТ, АЦТ, АТЦ-терминаторов.
Транскрипт- участок молекулы
ДНК=промотор+последовательность,
которая транскрибируется+
терминатор.
31
Основные этапы транскрипции:
ПРОЦЕССИНГ- молекулярные механизмы, связанные
с дозреванием разных типов РНКосуществляются в ядре перед выходом РНК в цитоплазму.
Процессинг (созревание) rРНК и tРНК у
эукариот принципиально не отличается от
такового у прокариот.
Процессинг mРНК отличается и состоит из
нескольких этапов.
1. Кепирование 100% mРНК
2. Полиаденилирование ~95% mРНК
3.Сплайсинг ~95% mРНК. (подвергаются только
полиаденилированные mРНК).
4.Редактирование
Показано лишь для нескольких mРНК.
32
По мере синтеза про-mРНК, она
тут же образует комплексы с
ядерными белками информоферами.
На всем пути следования до
завершения трансляции mРНК
защищена от нуклеаз.
Белки придают ей
необходимую конформацию
33
Сплайсинг- процесс, происходящий при
«дозревании» РНК,
осуществляется спец.ферментами, которые
вырезают ИНТРОНЫ (неактивные участки) и
сшивают
ЭКЗОНЫ-активные участки ДНК
34
Трансляция - процесс сборки пептидной цепи,
происходящей в цитоплазме на рибосомах
на основании программы,
содержащейся в и(м)РНК.
Основные фазы трансляции: 1) инициация;
2) элонгация; 3) терминация.
35
1) инициация.
Активация аминокислот (АК): АК+АТФ+фермент
(аминоацил-тРНК-синтаза) ==
АК-АМФ-ферментный комплекс
активированная АК присоединяется к своей
специфичной тРНК
(рекогниция- распознавание АК тРНК)
АК-АМФ-ферментный комплекс+тРНК==аминоацилтРНК+АМФ+фермент.
36
Ключевым субстратом
рекогниции является
транспортная РНК.
Транспортные РНК
(tРНК) - короткие
молекулы
(70-90 нукл.),
имеющие и
вторичную, и
третичную структуру.
37
38
Активация Рибосомы:
Цепь иРНК соединяется с малой субъединицей Р.
(водородные связи м/у азотистыми
основаниями иРНК и рРНК рибосомы).
Инициирует синтез-метионин.
Кодон иРНК (АУГ) связывается
с антикодоном (УАЦ)
аминокислоты,
соединенной с тРНК
Комплекс инициации
(малая субъединица Р+
иРНК+ тРНК+метионин)
+
большая субъединица рибосомы
Активная рибосома
39
Аминоацильный и
пептидильный участки
рибосомы
40
2) Элонгация- удлинение аминокислотной цепи
на 1 аминокислоту.
Мет-тРНК занимает Р-сайт.
К А-сайту подходит новая АК с тРНК.
Пептидилтрансфераза отрывает
метионин в
Р-центре и переносит его в А-центр
Образуется пептидная связь между
формилметионином и
аминоацил-tРНК.
В результате в А участкедипептидил-тРНК, а в Р-сайте –
свободная тРНК
тРНК-дипиптидный
комплекс
переносится в А сайт
рибосомы
= транслокация- 41
перемещение.
2) Элонгация- удлинение аминокислотной цепи на 1 аминокислоту.
Рибосома претерпевает
конформационные изменения и
сдвигается на один кодон.
Метиониновая tРНК
покидает рибосому.
Второй кодон оказывается напротив Р-центра.
Сюда же переходит tРНК, несущая на хвосте
дипептид.
В А-центр попадает третий кодон, а
следовательно, очередная аминоацил-tРНК.
Скорость: 1 секунда- 2 АК (эукариоты), 15 АК (прокариоты)
Рибосомы движется по ИРНК в направлении 5”- 3”
42
3) терминация- завершение синтеза и освобождение полипептидной цепи.
Так продолжается до тех пор, пока
в А-центр
не приходит терминирующий кодон.
Стоп- кодоны: УАА, УАГ, УГА не распознают АК
Полипептид отрывается в Р-центре,
переносится в А-центр и, т.к.
присоединиться ему не к чему,
он отваливается от рибосомы.
Рибосома диссоциирует
и малая субъединица сканирует mРНК.
43
Каждая молекула иРНК транскрибируется несколько раз. Время жизни – 2 час.
Посттрансляционная модификация белка:
Освобожденный п/п- прямолинейная молекула,
не имеет метаболической активности.
В эндоплазматической сети и аппарате Гольджи
происходит дозревание белков2, 3, 4чные структуры белка; + углевод, липиды
44
Схематическое изображение роли разных типов РНК в синтезе белка (по Уотсону).
Лекция составлена на основе источников:
1. Генетика. Учебник для вузов/под ред. Академика РАМН В.И.
Иванова М.:2006.-638 с.
2. Жимулев И.Ф.Общая и молекулярная генетика.
Новосибирск:2002.-459 с.
3. Клаг Уильям С., Каммингс Майкл Р. Основы генетики. М.:
Техносфера, 2007.- 896 с.
4. Фаллер Д., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки.
Руководство для врачей. М.:Изд-во БИНОМ»- 2006.- 256 с.
5. Медицинская биология.- под ред. В.П. Пишака, Ю.И.
Бажоры. Учебник. Винница: Нова Книга, 2004.-656 с.
6. Advanced Biology/M.Roberts, M. Reiss, G. Monger. UK.
Nelson.-2009.-800 p.
7. Интернет-ресурсы
45