http://www.enu.kz УДК 581.1 ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ
advertisement
http://www.enu.kz УДК 581.1 ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МУТАНТНОЙ ЛИНИИ SALK_146186C ARABIDOPSIS THALIANA Кравченко А.П., Булгакова О.В., Берсимбай Р.И. НИИ клеточной биологии и биотехнологии, Евразийский национальный университет им. Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан alena.enu.kz@gmail.com http://www.enu.kz Введение. Arabidopsis является однолетним растением, принадлежащим к семейству крестоцветных. Известно несколько видов рода Arabidopsis, самым известным и наиболее широко используемым в исследованиях является Arabidopsis THALIANA (L.) В природе Arabidopsis встречается в умеренных регионах мира, включая Европу, Восточную Африку, Азию и Японию. Он также находится в Северной Америке и Австралии. Arabidopsis не имеет экономической ценности, но обладает преимуществами для генетических и молекулярных анализов, в том числе небольшой размер генома, быстрый цикл жизни, производство большого количества семян и наличие многочисленных мутаций. В настоящее время получено несколько тысяч мутантов арабидопсиса (генетических линий с измененным геномом), которые позволили выявить гены последовательных этапов формирования цветка, гены, обеспечивающие эмбриогенез растений, гены контроля морфогенеза светом, гены синтеза и действия фитогормонов и многие другие. Поскольку организация генов у самых разных растений сходна, используя ген арабидопсиса в качестве "зонда", можно выделить его аналог из ДНК любых других растений, в том числе хозяйственно ценных. Поэтому геном арабидопсиса не только "полигон" для исследования генетики практически всех жизненных программ растений, но и "средство" для выделения важных генов из других растений, включая хозяйственно ценные. TOR (target of rapamycin), известный также как FRAP (FKBP12-Rapamycinassociated Protein), представляет собой крупный белок (289 кДа), относящийся к семейству PIKK (phosphoinositide kinase-related kinases). Киназа TOR является эволюционно консервативным белком, присутствующим во всех эукариотических клетках и функционирующим как сенсор уровня питательных веществ и энергии в клетке, а также окислительно-восстановительного статуса [1-3]. К настоящему времени молекулярные механизмы ТОR-регуляции клеточных процессов наиболее детально изучены для животных клеток. В то же время для растительных организмов основные вопросы регуляции генетических и физиологических процессов, играющих исключительно важную роль в реализации основных онтогенетических программ организма, остаются малоисследованными. В растении Arabidopsis thaliana был обнаружен гомолог TOR - AtTOR (At1g50030). Как показали исследования D. Deprost с соавторами, рост Arabidopsis положительно коррелирует с уровнем экспрессии ТOR киназы. Гипоэкспрессия и гиперэкспрессия гена AtTOR оказывает влияние на размер клеток и органов растений, производство семян и устойчивость к осмотическому стрессу. Подавление AtTOR экспрессии РНКинтерференцией приводит к постгерминативной остановке в росте и развитии [4]. Понимание этих механизмов является неоспоримым преимуществом в повышении адаптивных возможностей растений к стрессовым условиям окружающей среды, так как TOR сигнальная система является важнейшим регулятором клеточных функций не только в клетках животных, но и растений. Материалы и методы. Исследование проводилось на двух линиях Arabidopsis thaliana: диком типе и мутантной формы SALK_146186C, имеющей T-DNA вставку в 3’UTR области гена At1G50030 (AtTOR). Семена мутантной линии Arabidуpsis thaliбna SALK_146186C были предоставлены американской ассоциацией по изучению http://www.enu.kz арабидопсиса «The Arabidopsis Information Resource» [www.arabidopsis.org]. Выращивание изучаемых объектов проводили на питательной среде Murashige and Skoog («Sigma», США) в чашках Петри и боксах в течение четырех недель в условиях умеренного дня (день 12 ч и ночь 12 ч при 23-25°C). Результаты. При наблюдении за ростом и морфологическими свойствами двух линий Arabidopsis, особых отличий в строении листа, стебля и корня не было. Интенсивность пигментации листьев была на одном уровне. Только на 3 неделе выращивания были замечены отличия в строении корневой системы. В сравнении с диким типом у мутантной линии SALK_146186C корневая система была более развита за счет образования боковых корней (Рис. 1). А Б С Рисунок 1. - Фенотипические особенности растений Arabidуpsis thaliбna мутантной линии SALK_146186C. В сравнении с диким типом Arabidopsis thaliana(А), у линии Arabidopsis SALK_146186C (Б) корневая система более развита за счет образования боковых корней. С - гистограмма, количество боковых корней в контроле и мутантной линии. На 4 неделе выращивания появились новые признаки различия между линиями, заключающиеся в развитии вегетативной системы (появление и развитие цветка). Следует отметить, что образование генеративных органов в группе Arabidopsis дикий тип происходило у 75% растений (6 из 8), в группе Arabidopsis SALK_146186C - у 12,5% (1 из 8) (Рис. 2). Для оценки влияния солевого стресса, растения двух линий Arabidopsis thaliana (мутантная линия SALK 146186C и дикий тип) выращивали на стандартной среде Murashige and Skoog и на среде с содержанием 50 mМ NaCl в течение 4 недель. Растения http://www.enu.kz мутанты характеризовались большим накоплением зеленой массы и хорошо развитой (по сравнению с контролем) корневой системой (Рис. 3). А Б Рисунок 2. - Фенотипические особенности растений Arabidуpsis thaliбna мутантной линии SALK_146186C. Образование генеративных органов в группе Arabidopsis дикий тип (А) происходило у 75% растений (6 из 8), в группе Arabidopsis SALK_146186C - у 12,5% (Б) (1 из 8) SALK_146186C Col-0 А Б Рисунок 3. - Фенотипические характеристики Arabidopsis thaliana дикого типа и мутантной линии в условиях солевого стресса. (А) Мутантная линия Arabidopsis SALK_146186C характеризовалась большим накоплением зеленой массы и хорошо http://www.enu.kz развитой (по сравнению с контролем) корневой системой при концентрации соли 50 mМ NaCl. (Б) Гистограмма длины корней Arabidopsis thaliana дикого типа и Arabidopsis SALK_146186C Кроме того, прорастание растений мутантной линии при концентрации соли 75 mМ NaCl составляло 98%, в то время как в контроле прорастало лишь 82% (Рис. 4). А Б Рисунок 4. - Прорастание Arabidopsis thaliana дикого типа и мутантной линии в условиях солевого стресса. Прорастание растений Arabidopsis дикого типа (A) при концентрации соли 75 mМ NaCl составляло 82%, в то время как в контроле мутантной линии Arabidopsis SALK_146186C (Б) прорастало 98% семян. Обсуждение. Проблема исследований регуляции сигнальными системами физиологических функций высших организмов приобретает особую важность в постгеномную эру молекулярной генетики. Знание механизмов регуляции ТОR сигнальной системы в эукариотических клетках необходимо как для понимания фундаментальных генетических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности высших организмов, так и для создания технологий нового поколения для таких отраслей как биотехнология, медицина и сельское хозяйство. Эксперименты ряда исследователей показали, что нокдаун AtTOR в Arabidopsis приводил к гибели организма на ранних этапах эмбрионального развития. В то время как гиперэкспрессия AtTOR в растительных клетках характеризовалась накоплением зеленой биомассы, усиленным развитием корневой системы, большим количеством семян и повышенной устойчивостью к стрессам [4]. С целью изучения функциональной активности pTOR в растительных клетках нами были получены мутантные линии Arabidуpsis thaliбna SALK_146186C, содержащие TDNA вставку в 3’UTR области гена At1G50030 (AtTOR). У линии Arabidopsis SALK_146186C корневая системы была более развитой за счет образования боковых корней. В исследовании D. Deprost с соавторами, у двух мутантных линий коллекции Salk, в которых предполагалась гиперэкспрессия AtTOR был показан усиленный рост корней по сравнению с контролем [4]. Энергия прорастания семян и всхожесть была примерно одинаковой у дикового типа и мутантной линии SALK_146186C. Следует отметить, что образование генеративных органов в группе Arabidopsis дикий тип происходило у 75% растений (6 из 8), в группе Arabidopsis SALK_146186C - у 12,5% (1 из 8). Также были отличия в сроках образования семяной сумки. Учитывая факт взаимосвязи различных сигналов стресса с сигнальными путями роста и TOR комплексом, нами была проведена работа по выращиванию имеющихся у нас линий Arabidopsis thaliana при солевом стрессе. При этом учитывались изменения в фенотипе, а также проводился контроль основных ферментов, участвующих в формировании стрессоустойчивости растений. Было отмечено фенотипическое http://www.enu.kz изменение Arabidopsis thaliana при выращивании растений на средах с содержанием соли, характеризующееся задержкой вегетационной фазы и увеличением растительной массы. В дальнейшем растения обоих линий были высажены в чашки Петри на среду с повышенной концентрацией соли (75 мМ NaCl). Растения мутантной линии отличались большей устойчивостью к солевому стрессу, чем контрольные растения дикого типа. Вышеизложенные факты указывают на большую степень стрессоустойчивости мутантной линии Arabidopsis thaliana по сравнению с диким типом. Список использованной литературы: 1. Rohde, J., Heitman, J., and Cardenas, M.E. The TOR kinases link nutrient sensing to cell growth. //J. Biol. Chem. – 2001. - Vol. 276. - P. 9583–9586. 2. Bjornsti, M.A., and Houghton, P.J. The TOR pathway: A target for cancer therapy. //Nat. Rev. Cancer. – 2004. - Vol. 4. – P.335–348. 3. Wullschleger S., Loewith R., Hall M.N. TOR signaling in growth and metabolism//Cell.2006. - Vol.124. - P.471-484. 4. Deprost D., Yao L., Sormani R., Moreau M., Leterreux G., Nicola M., Bedu M., Robaglia C. and Meyer C. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation// EMBO Rep. - 2007. - Vol. 8. - P. 864–870.
