65 характеристика поведения крыс, различающихся по генотипу
advertisement
65 УДК 611.813.14.018: 599.323.4 ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВЕДЕНИЯ КРЫС, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ГЕНОТИПУ ЛОКУСА TAG 1A ГЕНА РЕЦЕПТОРА ДОФАМИНА ВТОРОГО ТИПА, В ТЕСТЕ «ПРИПОДНЯТЫЙ КРЕСТООБРАЗНЫЙ ЛАБИРИНТ» Н.Ф. Леушкина, А.В. Ахмадеев, Л.Б. Ка лимуллина Башкирский государственный университет, г.Уфа Кафедра морфологии и физиологии человека и животных, leona55@mail.ru В работе впервые приведены сведения об особенностях поведения двух групп крыс, гомозиготных по двуаллельному локусу TAG 1A DRD2, в установке «приподнятый крестообразный лабиринт». Ключевые слова: поведение, приподнятый крестообразный лабиринт, дофаминергическая система. Characteristic of rat’s behavior which are differ in genotype locus TAG 1A of gene receptor of dopamine second type in elevated cruciform labyrinth test. N.F. Leushkina, A.V. Akhmadeev, L.B. Kalimullina The Bashkir state university, Ufa Morphology and human physiology chair and animals, leona55@mail.ru In this work firstly gives data about peculiarities of behavioral reactions in two groups of rats, which are homozygous in biallele locus TAG 1A DRD2. in elevated cruciform labyrinth test. Key words: behavior, elevated cruciform labyrinth test, dophaminergic system. Участие дофаминергической системы моз- ния которой остаются до настоящего времени га в реализации многообразных функций неизвестными. Важным звеном в патогенезе объясняет ее вовлечение в патогенез многих абсансной эпилепсии является дефицит до- психоневрологических заболеваний, включая фаминергической системы, при этом ведущее и социально значимые, к которым относит- значение имеет изменение уровня функцио- ся эпилепсия. Эпилепсия является наиболее нирования дофаминовых рецепторов второго распространенным заболеваниям нервной типа (DRD2) [5]. системы, так как заболеваемость ею состав- Целью данной работы является характери- ляет 50–70 случаев на 100 тыс. человек, стика поведения двух групп крыс линии WAG/ у 20–30% больных заболевание является по- Rij, жизненным. TAG 1A гена DRD2, в установке «приподнятый различающихся генотипом по локусу Крысы линии WAG/Rij являются инбредной крестообразный лабиринт» (ПКЛ). ПКЛ явля- линией с генетически детерминированной аб- ется наиболее признанным тестом при оценке сансной эпилепсией. Они широко использу- уровня тревожности у грызунов [1,7,10] и ча- ются в качестве адекватной модели для изуче- сто используется при изучении анксиолитиков. ния механизмов генерализованной абсансной Основанием для проведения эксперимента по- эпилепсии человека [4], причины возникнове- служили результаты тестирования поведения фундаментальные исследования №1, 2010 66 этих крыс в «открытом поле», показавшие клеозидтрифосфата помещали в 25 мкл одно- у них признаки тревожного поведения [2]. кратного буфера для ПЦР следующего соста- Для генетического анализа ДНК (анализ выполнен совместно с Э.К. Хуснутдиной ва: 67 мM трисHCl, pH 8.8, 6,7 мМ MgCl2, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20. и А Галеевой) была выделена из лимфоци- ПЦР локуса TAG 1A (локализован в 3’- не- тов периферической крови. Для получения кодирующем регионе) DRD2 проводили с ис- ДНК использовали метод Мэтью [8]. Для это- пользованием олигонуклеотидных праймеров: го кровь с консервантом в пробирке тщательно 5' CTGGGTATCGTCCACCTTCT 3' перемешивали и переливали в 100 мл центри- 5' AACACTGCTACACCTAATCATCCA 3', фужный стакан, туда же добавляли 50 мл охлаж- подобранных с помощью программы Primer 3 денного лизирующего буфера, содержащего (http://frodo.wi.edu/primer3). 320 мМ сахарозы, 1%-ный раствор тритона После денатурации (3 мин. при 94°С) вы- Х-100, 5 мМ MgCl2, 10мМ трис HCl, pH 7,6. полняли 35 циклов амплификации по схеме: Смесь центрифугировали 20 мин. при 4000 отжиг праймеров — 1 мин. при 58°С, синтез об./мин. Надосадочную жидкость сливали, а к ДНК – 1 мин. при 72°С, денатурация — 1 мин. получившемуся осадку приливали 8 мл буфе- при 94°С. Затем пробы выдерживали 10 мин. ра ЭДТА(25 мМ ЭДТА, 75 мМ NaCl), pH 8.0, при 72°С, охлаждали [6]. Для выявления по- суспендировали. К суспензии добавляли 0,8 лиморфизма 10 мкл реакционной смеси обра- мл 10% SDS и протеинкиназу К (10мг/ мл). батывали 5 единицами рестриктазы TAG 1A. Смесь для лизиса оставляли на ночь в тер- В результате реакции аллель А1 локуса TAG 1A мостате при температуре 42° С. Экстракцию длиной 295 пар оснований оставался интакт- ДНК осуществляли порядке: ным, а аллель А2 подвергалась ферментатив- 1.Для депротеинизации к лизату добавляли ному гидролизу. Длины фрагментов аллеля А2 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, были равны 119 и 176 парам оснований. в следующем насыщенного 1М трисHCl до pH 7.8; 2.Смесь Результаты амплификации оценивали в по- центрифугировали при 3000 об./мин. в тече- лиакриламидном геле (ПААГ). Для разделения ние 10 мин.; 3.Отбирали водную фазу, содер- амплифицированных фрагментов использовали жащую ДНК, РНК и неденатурированные бел- 7%-ный гель [3]. Для заливки ПААГ готовили ки; 4. Отобранную фазу обрабатывали смесью раствор, состоящий из 5,5 мл 30%-ного раство- фенол-хлороформа (1:1), а затем хлорофор- ра акриламида, 2,5 мл 10*трис-боратного бу- мом; 5. Препараты осаждали двумя объема- фера — ТBE и 17 мл дистиллированной воды. ми 96% этанола; 6. Образовавшийся осадок Непосредственно перед заливкой геля в рас- ДНК растворяли в 1,5 мл деионизированной твор добавляли 29 мкл 10%-ного персульфата воды; раствор хранили при –20° С. Ампли- аммония и 15 мкл N,N,N',N' тетраметилэтилен- фикацию локуса TAG 1a DRD2 проводили диамина — ТЕМЕД. ПААГ заливали между с помощью метода полимеразной цепной ре- двумя стеклами, разделенными прокладками акции синтеза ДНК (ПЦР) на амплификаторе и гребенкой, и оставляли для полимеризации «Терцик» производства г.Пущино с исполь- на 20 мин. Затем вынимали гребенку, промы- зованием ДНК-полимеразы Termus aguaticus вали образовавшиеся лунки водой и помещали производства фирмы «Биотекс» (Москва). Ре- гель в вертикальную электрофорезную камеру. акционная смесь для амплификации состояла: В качестве электрофорезного буфера исполь- из 0,1-1 мкг геномной ДНК, 0,25 мкМ каждого зовали 1*ТВЕ. Проводили префорез в течение олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксину- 20 минут. фундаментальные исследования №1, 2010 67 Пробы для нанесения в гель готовили следу- Поведенческие реакции изучены у 121 кры- ющим образом: 10 мкл амплификата смешивали сы, 75 которых имели генотип А1/А1 по локусу с 2 мкл краски (смесь бромфенолового синего TAG 1a DRD2 (далее в работе они будут обо- и ксилолцианола). Наносили приготовленные значены как группа А1А1), 46 — с генотипом пробы в лунки и проводили электрофорез в те- А2/А2 по тому же локусу (группа А2А2). чение 1,5 часов при 300 В. В качестве маркера молекулярного веса использовали 2-Log Ladder Полученные результаты приведены в таблицах 1 и 2. (0,1 — 10,0 кб) (New England Biolabs, США). Приведенные в табл. 1 данные показывают, После окончания электрофореза гель окраши- что животные, гомозиготные по аллелю А2 вали раствором бромистого этидия и визуа- в локусе TAG 1A DRD2 по сравнению с дру- лизировали в проходящем ультрафиолетовом гой группой (А1А1), в четыре раза меньше по- свете. Документирование результатов электро- сещают как открытые, так и закрытые рукава. фореза проводили с использованием видеоси- При этом время, проведенное ими в закрытом стемы «Geldokulant» (Франция). рукаве, в два раза больше, чем в открытом, т.е. ПКЛ, использованный в работе, представлял меньше перемещаясь по сравнению с крысами собой установку, имеющую два рукава, в ме- А1А1 из одного рукава в другой, они надолго сте пересечения которых находилась открытая остаются в закрытом рукаве. Если рассчитать площадка. Один из рукавов лабиринта имел за- время, проведенное крысами А2А2 в закрытом крытые отсеки. Лабиринт устанавливали на вы- рукаве на одно его посещение, оно окажется соте одного метра от пола. Изучая поведение примерно равным 152 секундам, в то время крыс, мы регистрировали в течение пяти дней как этот же показатель в отношении светлого ряд параметров: количество посещений и вре- отсека значительно меньше и равен 94 секун- мя пребывания в открытых и закрытых рука- дам. Различия по времени пребывания крыса- вах, количество стоек в открытом и закрытом ми группы А2А2 в открытом и закрытом рука- рукавах, количество свешиваний с открытого вах высокозначимы (p<0,001). рукава, число эпизодов и продолжительность Подобный анализ в отношении крыс А1А1 груминга, общую неподвижность, количество показывает, что среднее время их пребыва- болюсов. Полученные результаты систематизи- ния в открытом и закрытом рукавах на одно ровали и подвергали статистической обработке его посещение равно между собой и состав- с помощью пакета программ «Statistica 5,5». ляет 36 секунд. Статистический анализ вари- Таблица 1 Показатели предпочтения крысами открытого или закрытого рукавов лабиринта и груминга Группы крыс А1А1 А2А2 p Количество посещений Время пребывания Груминг (длительность) ОР ЗР ОР ЗР ОР ЗР 4,10 4,27 147,89 152,11 1,85 4,19 +0,16 +0,16 +5,33 +5,20 +0,28 +0,78 0,96 1,38 90,26 209,74 2,38 4,38 +0,21 +0,20 +7,53 +7,52 +0,33 +0,47 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 >0,05 >0,05 Обозначения: ОР – открытый рукав (светлый отсек); ЗР – закрытый рукав (темный отсек) фундаментальные исследования №1, 2010 68 ационных рядов, выстроенных по численным Сравнение длительности и количества эпи- характеристикам количества посещений свет- зодов груминга у крыс А1А1 и А2А2 не вы- лого и темного отсеков лабиринта, а также явило статистически значимых различий, по времени, проведенному в них, показывает но обращало на себя внимание явная тенден- отсутствие значимых различий, так как кри- ция, общая для обеих групп крыс, проводить терий Стьюдента в обоих случаях соответ- груминг в закрытом рукаве. Проведенное ственно составляет t=0,73, p=0,46 и t=0,78, сравнение по показателям груминга внутри p=0,44. Полученные данные позволяют ука- групп изучаемых крыс показало, что по вы- зать на интересную особенность поведе- раженности «чесательного» рефлекса в от- ния крыс А1А1, а именно: отсутствие у них крытом и закрытом рукавах ПКЛ в каждой «способности» различать темный и светлый группе крыс существуют значимые разли- отсеки лабиринта, посещение которых напо- чия (у крыс А1А1 при р<0,05, у крыс А2А2 минает челночные движения из одного в дру- при р<0,01). Это указывает на то, что темный гой. Можно было бы предположить, что от- отсек является более комфортным для реали- меченный феномен связан с нарушениями зации «чесательного рефлекса». в светочувствительности сетчатки глаза этих Показателями исследовательской деятельно- крыс (известно, что у крыс линии WAG/Rij сти в приподнятом крестообразном лабиринте может иметь место пигментная ретинопатия являются как количество совершаемых жи- [9]. Однако против этого говорит выявленный вотными стоек, так и процедура свешивания в работе факт предпочтения для проведения крысы с открытого рукава, когда она с высоты, груминга крысами А1А1 закрытого рукава на которой находится лабиринт, осматрива- лабиринта (p<0,001, см.ниже). Поэтому сле- ет пространство, расположенное под рукавом дует думать, что высокая локомоторная ак- лабиринта. Учитывая существующую у крыс тивность крыс А1А1 связана с особенностями боязнь высоты, этот же показатель может рас- процессов дофаминергической трансмиссии. сматриваться и как проявление меньшей тре- Паттерн поведения крыс А1А1 напоминает вожности. Эти данные в сравнительном аспек- картину, описанную в литературе как син- те в отношении двух групп крыс отражены дром гиперактивности/дефицита внимания, в табл. 2. который часто встречается в детском возрас- Из данных табл. 2 следует, что крысы А1А1 те и объясняется как следствие нарушений, проявляют большую исследовательскую актив- предопределенных генетическими факторами ность по сравнению с крысами А2А2 как в за- в функционировании особых белков — пере- крытых, так и в открытых рукавах (p<0,001). носчиков дофамина [11]. Кроме того, выявлены высокозначимые раз- Таблица 2 Показатели исследовательской деятельности крыс в приподнятом крестообразном лабиринте Группы крыс Количество вертикальных стоек в рукавах Количество свешиваний открытый закрытый в ОР А1А1 6,14+0,42 7,63+0,43 14,26+0,68 А2А2 3,53+0,57 5,33+0,34 6,07+0,61 p <0,001 <0,001 <0,001 фундаментальные исследования №1, 2010 69 личия между изучаемыми группами крыс и по 4. Меерен Х.К.М., ван Луителаар Е.Л.Дж., показателю «свешивания в открытом рукаве» да Сильва Ф.Х.Лопес и др.// Успехи физиоло- лабиринта. Если рассматривать этот показатель гических наук. — 2004. — Т. 35, № 1. — С. 3. в аспекте проявления тревожности, то можно 5.Мидзяновская И.С., Кузнецова Г.Д., Туо- сказать, что крысы А2А2 значительно более мисто Л. и др. // Нейрохимия. — 2004, Т. 21, тревожны по сравнению с крысами группы № 4. — С.264. А1А1. Анализ показателей поведения крыс 6. Chen W.J., Lu M.-L., Hsu Y.-P. et al. // в ПКЛ внутри изучаемых групп по выражен- American Journal of Medical Genetics. — 1997. ности исследовательской деятельности пока- V. 74. — P. 129. зал, что она более ярко проявляется в закрытом рукаве (темном отсеке), при этом выявленные различия значимы у крыс А1А1 при р<0,05, у крыс А2А2 при р<0,01. Итак, полученные в работе данные показы- 7. Holmes A. // Neuirosci Biobehav Rev. — 2001, V. 25. — P. 261. 8. Mathew С. Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M. — New York.: Human Press, 1984. — V. 2. — P. 31. вают большую тревожность крыс с генотипом 9. O’Steen W.K., Donnelly J.E. // Invest А2/А2 по сравнению с крысами с генотипом Ophthalmol Vis. Sci. — 1982. — V. 22. — А1/А1 по локусу TAG 1A DRD2. N 252. — P. 5. Список литературы 1. Дыгало Н.Н. // Успехи физиол. наук. — 2007, Т. 38, № 1. — С. 3. 10.Pellow S., Chopin P., File S.E. et al. // J. Neurosci Methods. — 1985. — V. 14. — P. 149. 2. Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б. // Успе- 11. Steyaert J., Devriendt K., Fryns J. // хи современного естествознания. — 2008. — Am. J. Med. Genet. — 1997. — V. 74, — N 6. — №9, С. 10. P. 656. 3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984. — 399 c. фундаментальные исследования №1, 2010
