Направленная корректировка фенотипа организма путем

НЕВИРУСНАЯ ТРАНСФЕКЦИЯ НА ОСНОВЕ СТРУКТУРНЫХ
БЕЛКОВ ХРОМАТИНА
Лекция посвящена проблемам невирусной трансфекции. В лекции
рассматриваются проблемы, связанные с переносом чужеродной ДНК в
клетку, показана возможная роль линкерного гистона Н1 и негистонового
ядерного белка HMGВ1 в построении трансфекционно-активных
комплексов.
Лекция подготовлена в рамках Федеральной целевой программы
"Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на
2009-2013 годы:
Соглашение № 8306 от 10 августа 2012 г. Руководитель доктор
биологических наук Александр Евгеньевич Виноградов
«Исследование роли геномных дупликаций и ремоделирования хроматина в
возникновении и предотвращении онкологических и сердечно-сосудистых
заболеваний»
В подготовке лекции принимали участие:
Доцент кафедры Молекулярной биофизики и научный сотрудник Института
цитологии Российской академии наук, кандидат физико-математических
наук Александр Михайлович Поляничко
Аспирант Института цитологии Российской академии наук
Татьяна Юрьевна Старкова
Старший научный сотрудник Института цитологии Российской академии
наук доцент, кандидат биологических наук
Елена Всеволодовна Чихиржина
Лекция вошла в курс лекций «Введение в молекулярную биологию»,
который читается кафедре Молекулярной биофизики в Санкт-Петербургском
государственном
университете
доцентом
кандидатом
физикоматематических наук Александром Михайловичем Поляничко
1
Направленная
корректировка
фенотипа
организма
путем трансфекции
(введения в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты) с целью лечения генных
заболеваний является одной из основных задач современной медицины.
Различают два принципиально разных типа трансфекции: транзиентная
(временная) и постоянная. Зачастую для изменения фенотипа необходимо ввести в
клетки
чужеродную
ДНК
лишь
на
время,
достаточное
для
экспрессии
закодированных в ее последовательности белков. В этом случае чужеродная ДНК
не включена в ядерный геном и не реплицируется в процессе клеточного цикла.
Данное обстоятельство приводит к ее утрате при размножении клеток. Такой тип
трансфекции называется транзиентной. В том случае, если необходимо закрепить
ген в потомстве трансфицированых клеток, его следует включить в ядерный геном.
В этом случае трансфекция называется стабильной. Как правило в клетки вводят
еще один ген, который обеспечивает отбор трансфицированных клеток и поэтому
именуется маркером селекции. Например, маркером селекции может быть ген
устойчивости к некоторому антибиотику.
Один из самых дешевых и наименее надежных методов является кальций-фосфатная трансфекция, изобретенная в 70-х годах ХХ века). Изотонический раствор,
содержащий буфер HEPES, фосфат и ДНК, смешивают с хлористым кальцием. Образуется осадок из частиц фосфата кальция и ДНК, размер которых лежит в нанометровом диапазоне. Суспензию добавляют к культуре клеток, которые поглощают
частицы (как именно, авторы не уточняли). Лучше всего такая трансфекция проходит с эмбриональными клетками почки человека линии 293, но с несколько меньшей эффективностью трансфицируются и многие другие линии.
Среди прочих методов трансфекции можно упомянуть электропорацию, нуклеофекцию, тепловой шок, использование магнитных частиц, и множество коммерческих реагентов, распространяемых изготовителями продукции для научных
исследований.
По способу доставки ДНК в клетку выделяют вирусную и невирусную
трансфекции. В настоящее время наиболее эффективной считается вирусная
доставка генов (трансдукция), которая представляет собой упаковку ДНК в
вирусную частицу. Перенос генов осуществляется путем нормальной вирусной
2
инфекции, поэтому он эффективен и селективен по отношению к клеткам.
Несмотря на то, что использование вирусных векторов и систем доставки,
основанных на вирусоподобных частицах, дает хорошие результаты, их
применение нежелательно вследствие возможности встраивания рекомбинантной
ДНК в геном клетки. Испытания отдельных вирусных векторов дали серьёзные
побочные эффекты, которые в нескольких случаях привели к гибели пациентов.
Это обстоятельство, на фоне негативного общественного мнения в ряде стран
привело к существенному сокращению числа разработок в этом направлении,
несмотря на более высокую эффективность вирусных векторов. По этой причине, а
также из-за ограниченности объёма генетической информации, которая может
переноситься вирусными векторами, в настоящее время многие исследователи
обратились к созданию невирусных систем переноса.
Невирусные способы доставки ДНК в клетки можно разделить на несколько
групп. Первая группа включает методы, основанные на физическом повреждении
целостности цитоплазматической мембраны, такие как электропорация (рис. 1),
микроинъекция ДНК в клетки (рис. 2), и д.р.
Рисунок 1. Метод электропорации ДНК.
Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки. Через среду
пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200-350 В, длительность им3
пульса 54 мс), приводящие к образованию пор в цитоплазматической мембране,
время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы,
как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается.
Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы
клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь высокого процента
поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях
электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток.
Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны.
Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (10 кВ/см и более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1—2
кВ/см.
Рисунок 2. Метод микроинъекции ДНК.
4
ДНК может быть также введена в клетки путем микроинъекции или с помощью "генной пушки". Последняя использует микрочастицы инертного твердого вещества (обычно золота), к которым пришита ДНК.
Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих (рис. 2) стала возможной с
появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и
микроманипулятора. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном
тимидинкиназы (ТК) и плазмиду рВR322, были инъецированы в ТК --клетки и было
показано, что ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Метод введения ДНК с помощью микроинъекций был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и Диакумакосом. В принципе, при наличии хорошего оборудования можно
за 1 час инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших экспериментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не
требуется никакого селективного давления.
Вторая группа методов основана на компактизации ДНК при помощи каких-либо вспомогательных агентов, например, поликатионов (положительно заряженных водорастворимых полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин), частичек металлов или биополимеров. Отрицательно заряженная ДНК связывает поликатионы, и образовавшийся комплекс поглощается клетками путем эндоцитоза.
Рисунок 3. Схема трансфекции с использованием липидов.
5
Наиболее эффективен метод трансфекции с использованием липосом.
Липосомы представляют собой сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Их строение напоминает строение клеток, которые тоже окружены
фосфолипидной мембраной. Липосомы могут сливаться с клеточной мембраной,
после чего их внутреннее пространство сливается с содержимым клеток. Для образования липосом обычно используют положительно заряженные липиды (рис. 3),
т.к. ДНК и клеточные фосфолипиды заряжены отрицательно, а частицы с разным
электростатическим зарядом притягиваются друг к другу. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина
и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Большим преимущетсвом использования данного способа трансфекции является защита экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Кроме этого системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по
отношению к клеткам.
На фоне меньшей эффективности, в сравнении с вирусными векторами,
системы
на
основе
синтетических
полимеров
зачастую
демонстрируют
повышенную цитотоксичность. Одним из путей преодоления подобных проблем
служит использование ядерных ДНК-связывающих белков самόй клетки.
Такие носители имеют ряд преимуществ:
1) подобные белки могут образовывать стабильные комплексы с ДНК,
защищая ее от воздействия нуклеаз при транспорте в клетке;
2) они не являются цитотоксичными и не вызывают иммунного ответа;
3) развитие техники создания фьюжен-белков (fusion proteins) позволяет
снабжать природные белки мишень-специфичными последовательностями и
иными функциональными пептидами;
4) поскольку ядерные белки имеют в своем составе собственные сигналы
ядерной локализации (nuclear localization signals – NLS), их использование
существенно повышает эффективность доставки генетического материала.
Среди ДНК-связывающих белков предпочтение отдаётся тем, которые, вопервых, образуют наиболее стабильные комплексы и способны конденсировать
6
ДНК, и, во-вторых, наиболее распространены и функционируют в различных
клетках и тканях. Перечисленным условиям в полной мере удовлетворяют гистоны
(как коровые, так и линкерный гистон Н1), а также негистоновые хромосомные
белки
семейства
HMGB
(повсеместно
распространённые
и
наиболее
многочисленные из негистоновых белков хроматина).
Как уже ранее было сказано, основным критерием отбора белков на роль
переносчиков
генетической
информации
в
клетки
является
способность
компактизации ДНК.
Рассмотрим особенности компактизации ДНК одного из белков семейства
HMGB - негистонового хромосомного белка HMGB1.
HMGB1 - это небольшой (примерно 215 аминокислотных остатков,
молекулярный вес около 24,5 кДа) высоко консервативный двухдоменный белок
HMGB семейства. Присутствует как в ядре, так и цитоплазме клетки в большом
количестве. В своем составе имеет два положительно заряженных HMGB- домена,
соединенных между собой линкером и С-концевой участок. Пространственная
организация HMGB-домена белка HMGB1 и самого белка показана на рис. 4 и 5.
HMGB-домены белка богаты положительно заряженными аминокислотными
остатками и в сумме несут заряд +20. Первые 20 аминокислотных остатков Сконцевого участка заряжены положительно (+8) за счет содержания лизинов, а
остальные 29 составляют непрерывную последовательность аспарагиновой и
глютаминовой дикарбоновых аминокислот. Распределение заряда по цепи
молекулы крайне неоднородно, однако, большая часть несет положительный заряд,
за исключением С-концевого участка.
Домены в молекуле белка соединены линкерным участком, который имеет
длину порядка 10 аминокислотных остатков. Он представляет собой одну из
высоко консервативных областей в молекуле белка. Некоторые авторы считают,
что линкерный участок при связывании с ДНК размещается в малой бороздке
между доменами А и В, а двойная спираль при этом изгибается.
7
Рисунок 4. Пространственная
организация HMGB-домена белка
HMGB1.
Рисунок 5. Пространственная организация
белка HMGB1.
Положительный заряд HMGB-доменов молекулы HMGВ1 способствует его
связыванию как с двухцепочечной, так и с одноцепочечной ДНК, обладая
особенностью
различать
её
отдельные
конформационные
характеристики.
Отличительной чертой HMGВ-доменов является их взаимодействие с ДНК строго
по малой бороздке двойной спирали, изгибая ДНК при этом на угол от 80 до 120
градусов.
Белок
избирательно
связывается
с
отрицательно
закрученной
суперспиральной ДНК. Помимо этого HMGB1 способен как раскручивать
суперспиральную ДНК, так и индуцировать в ней новые супервитки в присутствии
топоизомеразы I. Некоторые авторы считают, что неупорядоченный С-концевой
участок
белка
раскручивание
является
двойной
функциональным
спирали
ДНК.
В
элементом,
то
же
ответственным
время
есть
за
данные,
свидетельствующие лишь о косвенном влиянии С-концевого участка белка на
изменение структуры плазмидной ДНК. Было показано, что электростатическое
взаимодействие отрицательно заряженного С-концевого участка ослабляет в 4-5
раз сродство HMGВ1 к ДНК даже в области физиологических ионных сил. Однако
само суперскручивание ДНК обусловлено её взаимодействием непосредственно с
HMGВ-доменами.
8
HMGB1/2
легче
взаимодействуют
с
крестообразными
структурами,
стабилизируя их. Эти структуры могут образовываться в ДНК, содержащей
палиндромные последовательности, которые часто служат “стоп-сигналами” для
транскрипционных факторов. Таким образом, взаимодействие с крестообразными
структурами такого рода интересно как возможность регулирования различного
рода блокирующих процессов.
HMGB1 избирательно взаимодействует с такими необычными структурами
ДНК типа 4Н (рис. 6), представляющий собой синтетический аналог природных
структур
репарационных
и
сайт-специфичных
рекомбинационных
интермедиаторов типа хиазмы Холлидея. Считается, что помимо острых углов в
структуре 4H очень важным является нарушение стекинговых взаимодействий
между азотистыми основаниями и расширение малой бороздки в месте изгиба.
Рисунок 6. Структура ДНК типа 4Н.
Из наиболее разрешенных структур ДНК с HMGB-доменом при помощи
методов ЯМР в растворе и рентгеноструктурного анализа являются hSRYHMGВ/ДНК, LEF-1/ДНК, HMGВ-D/ДНК и NHP6A/ДНК. По данным этих
исследований взаимодействие с белком приводит к серьезным изменениям в
структуре олигонуклеотида по сравнению с В-формой. Рассмотрим особенности
взаимодействия HMGB-домена с ДНК на примере однодоменного сиквенсспецифичного белка LEF1 (рис. 7).
9
Рисунок 7. Структура комплекса LEF-1/ДНК, полученная методом ЯМР.
Основным фактором при изгибе ДНК является наличие двух сайтов
интеркаляции – Met в положении 11 на N-концевом участке белка LEF1 и второго –
частичной интеркаляции Ala в положении 31. Изгиб ДНК в месте связывания
сопровождается существенными отклонениями в межплоскостной ориентации 6-7
пар оснований октамера. В дополнение к этому, ДНК несколько раскручивается и,
как следствие, малая бороздка становится менее глубокой и более широкой.
Способ, которым сиквенс-неспецифичные HMGВ белки приводят к изгибу
ДНК, пока до конца не изучен. Он может включать как интеркаляцию, так и что-то
другое, например, несимметричную нейтрализацию заряда ДНК.
Экспериментально доказана возможность белка HMGB1 компактизовать ДНК
и доставлять ее в ядро клетки вследствие наличия у белка
NLS.
Однако,
эффективность трансфекции несколько ниже, чем бы этого хотелось. Данное
обстоятельство может быть связано с тем, что эффективность проникновения белка
в цитоль клетки низка.
Решением подобной проблемы может быть создание генного вектора на
основе HMGB1, содержащего дополнительную вставку, которая упростит
попадание всей конструкции в клетку, но при этом не будет оказывать токсическое
влияние на клетку. В качестве примера такой конструкции можно привести
10
разработку Yuan Shen с соавторами. На основе HMGB1 был создан вектор
HMGB1/PEG–PEI, слитый с белком GFP для визуализации локализации вектора с
ДНК в клетке. Создание данной конструкции позволило не только увеличить
уровень трансфекции ДНК в клетки, но и уменьшило цитотоксический эффект.
Несмотря на то, что в литературе сообщалось об успешном применении как
гистонов,
так
и
негистоновых
белков
для
осуществления
эффективной
трансфекции, молекулярные механизмы функционирования таких ДНК-белковых
комплексов остаются пока не вполне понятными. На сегодняшний день, поиск
более эффективных ДНК-белковых систем ведется во многом в слепую, путём
всевозможных замен и комбинаций функциональных элементов в молекулах
исходных белков. Некоторые из опробованных замен приводят к снижению
эффективности, но пока не найдено комбинации, которая привела бы к
принципиальному повышению эффективности препарата.
11
Список используемой литературы
Bianchi M.E., Beltrame M., Paonessa G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science.- 1989.- Vol. 243.- Р. 1056-1059.
Böttger M, Zaitsev SV, Otto A, Haberland A, Vorob'ev VI. Acid nuclear extracts as mediators of gene transfer and expression. Biochim Biophys Acta.-1998.- Vol.
1395(1).- P. 78–87.
Bustin M., Reeves R. High-mobility-group chromosomal proteins: architectural components that facilitate chromatin function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.-1996.Vol. 54.- Р. 35-100.
Bustin M. Regulation of DNA-Dependent Activities by the Functional Motifs of the
High-Mobility-Group Chromosomal Proteins. Mol. Cell. Biol.- 1999.- Vol. 19.№ 8.- Р. 5237–5246.
Bustin M. Revised nomenclature for high mobility group (HMG) chromosomal proteins.
Trends Biochem Sci.- 2001.- Vol. 26.- № 3.- Р. 152-153.
Edelstein ML, Abedi MR, Wixon J, Edelstein RM. Gene therapy clinical trials worldwide
1989-2004-an overview. J Gene Med. - 2004. - Vol. 6(6) - P. 597-602.
Haberland A and Bottger M. Nuclear proteins as gene-transfer vectors. Biotechnol. Appl.
Biochem. - 2005. - Vol. 42. - P. 97–106
Hardman, C.H., Broadhurst, R.W., Raine, A.R.C. et al. Structure of the A-domain of
HMG1 and its interaction with DNA as studied by heteronuclear three- and fourdimensional NMR spectroscopy. Biochemistry.– 1995.– 34 .– P. 16596 – 16607
http://www.biotechnolog.ru
Kaouass M, Beaulieu R, Balicki D. Histonefection: Novel and potent non-viral gene
delivery. J Control Release.- 2006.- Vol. 113.-P. 245–54
Love J.J. X. Li, D. A. Case et al. Structural basis for DNA bending by architectural transcription factor LEF-1.Nature.- 1995.- Vol. 376.- Р. 791-795
Mistry AR, Falciola L, Monaco L, Tagliabue R, Acerbis G, Knight A, Harbottle RP,
Soria M, Bianchi ME, Coutelle C, Hart SL. Recombinant HMG1 protein produced
in Pichia pastoris: a nonviral gene delivery agent. Biotechniques.-1997.- Vol. 22.P. 718–29
12
Mosevitsky M.I., Novitskaya V.A., Iogannsen M.G., Zabezhinsky M.A. Tissue specificity of nucleocytoplasmic distibution of HMG1 and HMG2 proteins and their
probable funtions. Eur. J. Biochem.- 1989.- Vol. 185.- Р. 303-310
Murphy 4th., F.V., Sweet, R.M., Churchill, M.E. The structure of a chromosomal high
mobility group protein-DNA complex reveals sequence-neutral mechanisms important for non-sequence-specific DNA recognition. EMBO J.- 1999.- Vol. 18.- Р.
6610-6618
Murphy, E.C., Zhurkin, V.B., Louis, J.M. et al. Structural basis for SRY-dependent 46X,Y sex reversal: modulation of DNA bending by a naturally occurring point
mutation. J.Mol.Biol.- 2001.- Vol. 312.- Р.481-499;
Pohler J., Norman D.J., Bramham J. et al. HMG box protein bind to four-way DNA junctions in their open conformation/EMBO.- 1998.- Vol. 17.- № 3.- P. 817-826
Puebla I, Esseghir S, Mortlock A, Brown A, Crisanti A, Low W. A recombinant H1
histone-based system for efficient delivery of nucleic acids. J Biotechnol-2003-,
Vol. 105.-P. 215–26
Read C.M., Cary P.D., Crane-Robinson C. et al. Solution structure of a DNA-binding domain from HMG-1. Nuc. Acids Res.- 1993. - Vol. 21.- Р. 3427-3436
Read, C.M., Cary, P.D., Crane-Robinson, C. et al. The Structure of the HMG Box and
its Interaction with DNA. Nucleic Acids Mol.Biol.- 1995.- Vol. 9.- Р. 222-231
Reeck G.R., Isackson P.J., Teller D.C. Domain structure in high molecular mass high mobility group nonhistone chomatin proteins. Nature.- 1982.- Vol. 300.- Р. 675-676
Saito K., Kikuchi T., Shirakawa H., Yoshida M. The stabilized structural array of two
HMG1/2-boxes endowed by a linker sequence between them is requisite for the
effective binding of HMG1 with DNA. J. Biochem. - 1999. - Vol. 125. - P. 399-405
Sloots A., Wels W.S. Recombinant derivatives of the human high-mobility group protein
HMGB2 mediate efficient nonviral gene delivery. Febs J.- 2005.- Vol. 272.-P.
4221–36
Seyedin S.M., Pehrson J.R., Cole D. Loss of chromosomal high-mobility-group proteins
HMG1 and HMG2 when mouse neuroblastoma and Friend erytholeukemia cell
become committed to differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1981.- Vol.
78.- Р. 5988-5992
13
Sheflin L.G., Spaulding S.W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry.- 1989.- Vol. 28.- Р.5658-5664
Stros M., Stokova J., Thomas J.O. DNA looping by the HMG-box domains of HMG1
and modulation of DNA binding by the acidic C-terminal domain. Nuc. Acids
Res.- 1994.- Vol. 22.- Р. 1044-1051
Shepelev V.A.,. Kosaganov Yu.N, Lazurkin Yu.S. Interaction of the HMGl protein with
nucleic acids. FEBS.- 1589.- Vol. 172.- № 2.- Р. 1984 - 1990
Teo S.-H., Grasser K.D., Hardman C.H. et al. Two mutations in the HMGB-box with
very different structural consequences provide insights into the nature of binding
to four-way junction DNA. EMBO J. – 1995.- Vol. 14.- Р. 3844-3853.
Travers A.A., Thomas J. O. In: Chomatin Struture and Dynamics: State-of-the-Art / Eds.
Zlatanova J.,and Leuba S.H . UK.: Elsevier, 2004.- P. 103-133
Wagstaff KM, Glover DJ, Tremethick DJ, Jans DA. Histone-mediated transduction as an
efficient means for gene delivery. Mol Ther.-2007.- Vol. 15.-P.-721–31
Walker J.M., Gooderham K., Hastings J.R., Mayes E., Johns E.W.The primary structures
of non-histone chromosomal proteins HMG 1 and 2." FEBS Lett. – 1980. - Vol.
122. – P. 264-270
Yoshida M., Shimura K. Unwinding of DNA by nonhistone chromosomal protein
(HMG1+2) from pig thimus as determined with endonuclease// J. Biochem.1984.- Vol. 95.- Р. 117-124;
Yoshida M. High glutamic and aspartic region in nonhistone protein HMG(1+2) unwinds
DNA double helical structure// J Biochem.- 1987.- Vol. 101.- Р. 175-180
Yuan Shen, Hui Peng, Shirong Pan, Min Feng,Yuting Wen, Jingjing Deng, Xin Luo and
Chuanbin Wu. Interaction of DNA/nuclear protein/polycation and the terplexes for
gene delivery. Nanotechnology. – 2010. - Vol. 21. - 045102 (12pp)
doi:10.1088/0957-4484/21/4/045102
14