Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
advertisement
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина» На правах рукописи ГОРШЕНЁВА ЕКАТЕРИНА БОРИСОВНА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЛИЯНИЯ УГЛЕРОДНОГО НАНОСТРУКТУРНОГО МАТЕРИАЛА «ТАУНИТ» НА ОРГАНИЗМ САМОК БЕЛЫХ МЫШЕЙ И ИХ ПОТОМСТВО 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Османов Эседулла Маллаалиевич доктор медицинских наук, профессор Тамбов – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. 1. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………….…………………………….4 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.……………………………………………………………12 2.1. Общие сведения о наноматериалах……………...………………………..……12 2.2. Оценка воздействия нанотехнологий и наноматериалов на биообъекты окружающей среды………………………...……………...…………....18 2.3. Характеристика влияния наноматериалов на животный организм…………...24 2.3.1. Пути проникновения в организм и основные механизмы действия наночастиц…………………………………………...……………………..24 2.3.2. Влияние отдельных наноматериалов на ткани и органы…………...…...…..30 2.3.2.1. Особенности эффектов на организм углеродных наноматериалов…...….35 2.3.2.2. Воздействие наноматериалов на репродуктивную систему………….…...40 3. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ………………………………………….46 3.1. Организация работы ……………………………….....………………...………..46 3.2. Характеристика исследуемого материала……...………...………...…………...49 3.3. Методы исследования…………......…………………………………………......50 3.4. Методы вариационно-статистического анализа полученных данных…..…....55 4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ…………………….…….56 4.1. Дозозависимые эффекты УНМ «Таунит» на организм самок белых мышей...56 4.2. Анатомо-морфологические изменения у белых мышей при воздействии УНМ «Таунит»……………………………………………………………………..….70 4.2.1. Морфометрические показатели тела………………...………......……..……..70 4.2.2. Гистологическая картина паренхиматозных органов...……………..….……73 4.3. Состояние периферической крови и печени мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит»………………...………………………………..……….78 3 Стр. 4.4. Влияние УНМ «Таунит» на поведенческие реакции белых мышей.................81 4.5. Особенности репродуктивной функции самок белых мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит»…………………………….…..……..84 4.6. Постнатальное развитие потомства первой генерации белых мышей, подвергшихся воздействию УНМ «Таунит»……………………………………….89 4.7. Сравнительная оценка биоэффектов УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала другой структуры…………………….………………….…….……96 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ…………………………...99 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………..…………………………………….………………112 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………………….114 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………….115 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………..…………116 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Развитие нанотехнологий и создание наноматериалов, являясь важнейшим направлением научно-технического прогресса будущего, в то же время ставит вопрос их взаимодействия с живым организмом. В течение последних десятилетий создано более 2000 разновидностей наноматериалов, в связи с чем возросла возможность воздействия наночастиц на животных, человека и окружающую среду (Powers, K.W. Characterization of nanoscale particles for toxicological evaluation / K.W. Powers, S.C. Brown // Toxicol. Science. - 2006. – Vol. 90, N 2. - P. 296-303; Гусев, А.А. Оценка воздействия наносодержащего материала «Таунит» на живые системы / А.А.Гусев, А.В. Емельянов, А.Г. Ткачев и др. // Сборник материалов 8-ой Международной научно-практической конференции «Экология и безопасность жизнедеятельности» – Пенза, 2008. – С. 28-29; Пиотровский, Л.Б. Будьте осторожны — следующая остановка «НАНО ЭРА» или проблема токсичности наночастиц / Л.Б. Пиотровский // Экологический вестник России. - 2008. - № 11. - С. 31). Такие антропогенные источники, как металлургическая, цементная промышленность; сгорание каменного угля, полимерных соединений, нефти, газа, дизельного топлива и другие процессы значительно увеличили содержание наночастиц в окружающей среде (Sahoo, S.K. The present and future of nanotechnology in human health care / S.K. Sahoo, S. Parveen, J.J. Panda // Nanomedicine: Nanotechnology in human health care. - 2007. - Vol.3. - P. 20-31; Иншаков, О.В. Государственная политика развития нанотехнологий: российский и зарубежный опыт / О.В. Иншаков, А.В. Фесюн. – Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2009. – 48 с.). В процессе производства наноматериалов, их транспортировки, производственных процессах, ремонте, а также утилизации объектов, содержащих наночастицы, все чаще имеет место контакт и воздействие наноматериалов на животный организм. 5 Общепризнано, что изменения физических свойств вещества при переходе в форму наночастиц закономерно сопровождаются изменениями его биологических эффектов. В частности, установлена существенная задержка наночастиц в легких, поскольку из-за малых размеров этих частиц, механизмы выведения их респираторной системой организма неэффективны. Показана способность наночастиц проникать через легкие в другие системы и проходить кожные барьеры; наличие у них так называемого «воспалительного потенциала» (Русаков, Н. В. Эколого-гигиенические проблемы отходов наноматериалов / Н. В. Русаков // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 20–21; Takeda, K. Health effects of nanomaterials on next generation / K. Takeda, Y. Shinkai, K. Suzuki et al. // Yakugaku Zasshi. – 2011. – Vol.131, N 2. – P. 229-236). Небольшие размеры и разнообразие их форм способствуют связыванию с нуклеиновыми кислотами и белками; встраиванию в мембраны клеток, изменяя функции биоструктур (Miyawaki, J. Toxicity of Single-Walled Carbon Nanohorns / J. Miyawaki, M. Yudasaka, T. Azami et al. // Acsnano. - 2008. – Vol.2. - P. 213–226; Сычева, Л. П. Оценка мутагенных свойств наноматериалов / Л.П. Сычева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 26–28; Gomes, S.I. Mechanisms of response to silver nanoparticles on Enchytraeus albidus (Oligochaeta): Survival, reproduction and gene expression profile / S.I. Gomes, A.M. Soares, J.J. Scott-Fordsmand, M.J. Amorim // Hazard Mater. – 2013. – Vol.15. – P. 254-255). Наличие у многих наноматериалов гидрофобных свойств и электрического заряда усиливает как процессы адсорбции на них различных веществ, так и способность проникать через барьеры организма. Важным свойством наночастиц является повышенная способность к аккумуляции, поскольку вследствие малых размеров эти вещества могут не распознаваться защитными системами организма, и, следовательно, не подвергаться биотрансформации (Cedervall, T. Detailed identification of plasma proteins adsorbed on copolymer nanoparticles / T. Cedervall, I. Lynch, T. Berggard // Angew Chem. Int. Ed. Engl. - 2007. – Vol. 46, N 30. - P. 5754-5756; Hooper, H.L. Comparative chronic toxicity of nanoparticulate and ionic zinc to the earthworm Eisenia 6 veneta in a soil matrix / L.H. Hooper, K. Jurkschat, A.J. Morgan et al. // Environ. Int. – 2011. – Vol. 37, N 6. – P. 1111-1117). Перечисленное свидетельствует о высокой актуальности изучения влияния наноматериалов, в том числе углеродных, на животный организм с оценкой состояния различных органов и систем, в частности, репродуктивной. Степень разработанности темы. В настоящее время усилия исследователей сосредоточены преимущественно на изучении начальных этапов процесса взаимодействия животного организма с наночастицами: идентификации и характеристике последних на основе биологических и фармакологических эффектов, полученных на моделях животных. Изучаются пути проникновения наночастиц в организм – респираторный, чрескожный, пероральный; критические органы-мишени (легкие, кожа, сердечно-сосудистая и оценивается влияние исследуются (Радилов, наноматериалов на физиологическое состояние и специфические А.С. нервная системы); механизмы Экспериментальная действия оценка некоторых токсичности и наночастиц опасности наноразмерных материалов / А.С. Радилов, А.В. Глушкова, С.А. Дулов // Нанотехнологии. Экология. Производство. – 2009. – № 1. – С. 86–88; Lim, D. Oxidative stress-related PMK-1 P38 MAPK activation as a mechanism for toxicity of silvernanoparticles to reproduction in the nematode Caenorhabditis elegans / D. Lim, J.Y. Roh, H.J. Eom et al. // Environ. Toxicol. Chem. – 2012. – Vol. 31, N 3. – P. 585592). Ведутся работы по обоснованию и разработке санитарно-гигиенических требований к содержанию наночастиц в воздухе (Малышева, А.Г. Проблемы химико-аналитических исследований при гигиенической оценке наноматериалов и нанотехнологий / А. Г. Малышева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 16–20). В то же время, превалируют сообщения, посвященные изучению свойств наноматериалов in vitro на уровне молекул (селективная адсорбция высокомолекулярных соединений, стабилизация и изменение с их помощью активности ферментов) и клеточных культур (выявление механизмов взаимодействия с клеточной мембраной, влияние на экспрессию отдельных генов) 7 (Barua, S. Non-hazardous anticancerous and antibacterial colloidal 'green' silver nanoparticles / S. Barua, R. Konwarh, S. Bhattacharya et al. // Colloids Surf. B Biointerfaces. – 2013. – Vol. 105. – P. 37-42; Gomes, S.I. Mechanisms of response to silver nanoparticles on Enchytraeus albidus (Oligochaeta): Survival, reproduction and gene expression profile / S.I. Gomes, A.M. Soares, J.J. Scott-Fordsmand, M.J. Amorim // Hazard Mater. – 2013. – Vol. 15. – P. 254-255). Исследования эффектов различных наноматериалов на организменном уровне единичны и несистематизированы, практически отсутствуют работы по изучению влияния многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) на биосистемы, их фармакокинетике и фармакодинамике; не установлены четко органы-мишени, не описан генез изменений, происходящих при поступлении в организм наночастиц, механизмы развивающихся при этом компенсаторноприспособительных реакций. В зарубежной научной литературе имеются лишь отдельные сообщения о воздействии МУНТ на репродуктивную функцию организма (Ema, M. Reproductive and developmental toxicity studies of manufactured nanomaterials / M. Ema, N. Kobayashi, M. Naya et al. // Reprod. Toxicol. – 2010. – Vol. 30, N 3. – P. 343-352; Keelan, J.A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta / J.A. Keelan // Nat. Nanotechnol. – 2011. – Vol. 6, N 5. – P. 263-264; Gao, G. Ovarian dysfunction and gene-expressed characteristics of female mice caused by long-term exposure to titanium dioxide nanoparticles / G. Gao, Y. Ze, B. Li et al. // J. Hazard Mater. – 2012. – Vol. 243. – P. 19-27), тогда как отечественные работы такого плана вообще отсутствуют. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась оценка физиологических аспектов влияния углеродного наноструктурного материала (УНМ) «Таунит» (многостенных углеродных нанотрубок) на организм самок белых мышей и их потомство первого поколения при пероральном введении. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Оценить физиологические эффекты самок белых мышей при введении различных доз УНМ «Таунит» (дозозависимый эффект). 8 Изучить 2. структурно-функциональные изменения систем крови, выделительной, пищеварительной, сердечно-сосудистой и иммунной у белых мышей под воздействием многостенных углеродных нанотрубок. Исследовать поведенческие реакции самок белых мышей и их 3. потомства при пероральном поступлении многостенных углеродных нанотрубок. Определить влияние УНМ «Таунит» на репродуктивную функцию 4. самок белых мышей и показатели развития их потомства первой генерации. Сравнить эффекты перорального поступления УНМ «Таунит» и 5. углеродного наноматериала другой структуры. Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка физиологических эффектов УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в животный организм. Получены новые данные о состоянии внутренних органов и систем организма; его функциональных и морфологических изменениях в условиях длительного поступления многостенных углеродных нанотрубок. Выявлен дозозависимый эффект наноматериала «Таунит» при поступлении в организм белых мышей, проявлявшийся отклонениями массы внутренних органов; продемонстрированы реактивные изменения иммунной системы. Впервые получены данные о влиянии УНМ «Таунит» на репродуктивную систему самок мышей, в частности, увеличении массы соответствующих органов (матки с яичниками), морфометрических а также показателей; количества снижении особей смертности в приплоде, молодняка, их числа неродивших самок и доли самцов в потомстве. Показано отсутствие изменений в гамето- и эмбриогенезе белых мышей, постимплантационной гибели, развитии плодов и потомства первой генерации при поступлении в организм УНМ «Таунит». Теоретическая и практическая значимость работы. Получены данные о развитии компенсаторно-приспособительных реакций и морфофункциональных аспектах взаимодействия наночастиц с органами и тканями белых мышей. Результаты опытов могут быть использованы для дальнейшего совершенствования нормативной базы по работе с наноматериалами. Они 9 расширяют существующие знания о воздействии на организм нанодисперсных материалов, позволяют совершенствовать подходы к гигиеническому нормированию при использовании этих веществ. Представленные сведения позволяют разработать стратегию оптимизации действия наноразмерных веществ на животный организм. По результатам исследования получен грант по проекту № 07-03/2012 «Состояние дисперсной фазы в водных суспензиях нанопорошков для разработки методик тестирования наноматериалов в физиологических жидкостях» в рамках проведения III Межвузовского конкурса исследовательских проектов (15.03.201215.11.2012 гг.); проект «Разработка инструкции по безопасному применению углеродного наноструктурного материала в качестве компонента дактилоскопических порошков для судебной медицины и криминалистики» получил поддержку ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» по программе «У.М.Н.И.К.» (2011-2013 гг.). Информации, полученные в результате экспериментального исследования, используются в учебном процессе на кафедре физиологии ФГБОУ ВПО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина» при чтении лекций и проведении семинарских занятий. Разработан и внедрѐн факультативный курс лекций «Нанотехнологии и безопасность» в 10 классах МОУ СОШ № 30 г. Тамбова. Методология и методы исследования. Методология исследования включала оценку физиологического влияния многостенных углеродных нанотрубок на организм самок белых мышей. Эксперименты проведены с соблюдением всех принципов доказательной медицины (рандомизация и формирование групп подопытных животных, обработка результатов методами вариационной статистики). Подробно методики описаны в разделе 3.3. Основные положения, выносимые на защиту: 1. УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в организм мышей вызывает дозозависимые морфофункциональные изменения в сосудистой, пищеварительной, выделительной и иммунной системах. сердечно- 10 2. В условиях поступления УНМ «Таунит» в организм самок белой мыши на 14 сутки потенцируются процессы возбуждения, что проявляется в виде снижения порога эмоциональных реакций и увеличения количества локомоций с последующим их восстановлением и угнетением общей двигательной активности к концу 45 суток потребления наноматериала. 3. При пероральном введении УНМ «Таунит» у самок белых мышей изменяется морфофункциональное состояние репродуктивной системы (увеличиваются масса репродуктивных органов (матки с яичниками), количество особей в приплоде, морфометрические показатели потомства; снижаются количество неродивших самок, смертность молодняка и доля самцов в помете). При этом эмбриогенез и постимплантационная гибель плодов не меняются. Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов исследований определяется адекватным количеством биологических объектов, рандомизацией; корректным формированием групп экспериментальных животных и адекватными методами исследования; длительными сроками наблюдения и объективными методами вариационно-статистической обработки результатов экспериментов. Сформулированные выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа результатов выполненной работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред» (Тамбов, 2009); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2010); III-м Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2010, (Москва, 2010); 2-й Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» практической (Московская конференции обл., 2011); «Современные V-й Международной проблемы контроля научнокачества природной и техногенной сред» (Тамбов, 2012); 17-й Международной Пущинской школе – конференции молодых ученых (Пущино, 2013). 11 По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ. 12 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Общие сведения о наноматериалах Пусковым фактором интенсивного развития биологии наноматериалов, наблюдаемого в последние годы, явился прогресс технологий направленного получения и использования веществ и материалов в диапазоне размеров менее 100 нм (Алферов, Ж.И. За нанотехнологиями будущее. И это не обсуждается / Ж. И. Алферов // Нанотехнологии. Экология. Производство. – 2009. – № 1. – С. 10– 14). Понимание факта, что наночастицы (НЧ) и наноматериалы обладают комплексом особых физических и химических свойств, а также специфическим биологическим действием, которые могут радикально отличаться от свойств и эффектов этого же вещества в форме сплошных фаз или макроскопических дисперсий, дало толчок экспериментальным исследованиям влияния этих веществ на различные органы и системы животного организма (Гусев, А.А. Нанобезопасность – новое направление экологических исследований / А.А. Гусев, А.В. Емельянов // Проблемы экологии в современном мире. - Тамбов, 2008. - С. 39-41; Малышева, А.Г. Проблемы химико-аналитических исследований при гигиенической оценке наноматериалов и нанотехнологий / А. Г. Малышева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 16–20). Размеры НЧ могут быть соотнесены с размерами крупных молекул или расстояний между отдельными атомами в молекулах (Гусев, А.А. Нанобезопасность – новое направление экологических исследований / А.А. Гусев, А.В. Емельянов // Проблемы экологии в современном мире. - Тамбов, 2008. - С. 39-41). Выделяют следующие физикохимические особенности частиц вещества, таких размеров: 13 – увеличение химической реактивности веществ на межфазной границе высокой кривизны. Для макрочастиц (размерами порядка микрона и более) этот эффект незначителен (не превышает долей процента). Большая кривизна поверхности наночастиц и изменение топологии связи атомов на поверхности приводят к существенным сдвигам растворимости, реакционной и каталитической способности наночастиц и их компонентов; – большая удельная поверхность наноматериалов (в расчете на единицу массы), увеличивающая их адсорбционную емкость, химическую реакционную способность и каталитические свойства. Изменение перечисленных характеристик может вызывать увеличение продукции свободных радикалов и активных форм кислорода при попадании этих веществ в организм; – небольшие размеры и разнообразие форм наночастиц, что способствует повышению возможности их связывания с нуклеиновыми кислотами (с образованием аддуктов ДНК) и белками, встраивания в мембраны клеток, проникновения в клеточные органеллы с изменением функций биоструктур. Процессы переноса наночастиц в окружающей среде с воздушными и водными потоками, их накопление в почве и донных отложениях могут также значительно отличаться от соответствующих процессов, характерных для вещества с частицами более крупного размера; – высокая адсорбционная активность, вследствие которой наночастицы способны поглощать на единицу своей массы во много раз больше адсорбируемых веществ, чем макроскопические дисперсии. Возможна, в частности, адсорбция на наночастицах различных контаминантов и облегчение их транспорта внутрь клетки. Многие наноматериалы обладают гидрофобными свойствами или являются электрически заряженными, что усиливает как процессы адсорбции на них различных веществ, так и их способность проникать через барьеры организма; – высокая способность к аккумуляции. Возможно, из-за малого размера наночастицы могут не распознаваться защитными системами организма, не вызывать иммунный ответ, не подвергаются биотрансформации и не выводятся из 14 организма. Это ведет к их накоплению, передаче по пищевой цепи, что тем самым способствует увеличению их поступления в животный организм (Малышева, А.Г. Проблемы химико-аналитических исследований при гигиенической оценке наноматериалов и нанотехнологий / А. Г. Малышева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 16–20; Рахманин, Ю.А. Влияние квантовых состояний нанообъектов на биологические системы / Ю.А. Рахманин, А.А. Стехин, Г.В. Яковлева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 4–12). Источниками НЧ могут быть действующие вулканы, лесные пожары, выветривание горных пород, микрослой океанической поверхности (Фостер, Л. Нанотехнологии. Наука, инновации, возможности / Л. Фостер. – М.: Техносфера, 2008. – 352 с.). В мире зарегистрировано и выпускается промышленностью более 1800 наименований наноматериалов (Бабкин, В. И. Государственная значимость нанотехнологий / В. И. Бабкин // Нанотехнологии. Экология. Производство. – 2009. – № 1. – С. 32–36). Согласно данным о форме и химическом составе выделяют: – углеродные наночастицы (фуллерены, нанотрубки, графен, углеродные нанопены); – наночастицы простых веществ (не углерода); – наночастицы бинарных соединений; – препараты наночастиц сложных веществ (Онищенко, Г.Г. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 23 июля 2007 г. № 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы» [Электронный ресурс]. URL: http://www.rospotrebnadzor.ru/documents/postanov/1209/). Выделяют следующие материалы, разработанные на основе углеродных наночастиц: - углеродные нанотрубки (УНТ) – протяжѐнные цилиндрические структуры диаметром от одного до нескольких десятков нм и длиной до нескольких см., 15 состоящие из одной или нескольких свѐрнутых в трубку гексагональных графитовых плоскостей и заканчивающиеся обычно полусферической головкой; - фуллерены – класс аллотропных форм углерода (другие – алмаз, карбин и графит), представляющих собой выпуклые замкнутые многогранники, составленные из чѐтного числа трѐхкоординированных атомов углерода. По диаметру фуллерен совместим с биологическими мишенями, центрами связывания ферментов, рецепторов и везикулами, что может найти применение в биологии и медицине; - графен – монослой атомов углерода (нанопленка), обладающий высокой подвижностью при комнатной температуре, его рассматривают как перспективный материал, потенциальный заменитель кремния в интегральных микросхемах (Gatti, A.M. Risk assessment of micro and nanoaprticles and the human health / A.M. Gatti // Chapter of Handbook of Nanostructured biomaterials and their applications ed American Scientific Publisher USA. - 2005. - Vol. 12. - P. 347-369). НЧ углерода, серебра и др. используются при создании искусственных костных имплантантов, челюстей, протезов, противозачаточных средств, перевязочных материалов для повышения их прочности и бактерицидности (Kagan, V.E. Nanomedicine and nanotoхicology: two sides of the same coin / V.E. Kagan, H. Bayir, A.A. Shvedova // Nanomedicine: nanotechnology, biology and medicine. - 2005. – Vol.1. - P. 313-316; Peek, L.J. Nanotechnology in vaccine de livery / L.J. Peek, C.R. Middaugh // Adv. Drug. Deliv. Rew. - 2008. - Vol. 60, N 8. – P. 915-928). Мировой объем продаж лекарств с модифицированной системой доставки с использованием наноматериалов составляет 20 % общего объема рынка фармпрепаратов (Oberdorster, G. Nanotoxicology: Am Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environmental Health Perspectives. - 2005. - Vol. 7, N 13. - P. 823839). Широкое применение находят наносенсоры для идентификации отходов химической и биотехнологической промышленности, наркотиков, боевых отравляющих веществ, взрывчатки и микроорганизмов, а также наночастичные фильтры и прочие очистные устройства, предназначенные для их удаления или 16 нейтрализации (Powers, K.W. Characterization of nanoscale particles for toxicological evaluation / K.W. Powers, S.C. Brown // Toxicol. Science. - 2006. – Vol. 90, N 2. - P. 296-303). Успешно состоящие из разрабатываются полимеров, и мицелл, проходят липосом, испытания наноконтейнеры, дендримеров, фуллеренов, гидрогелей. Внедрение лекарств в материалы, разработанные на основе наночастиц предотвращает их быстрое распространение в жидкостях и тканях организма, позволяет пролонгировать их высвобождение. Помимо этого, включение в наночастицы позволяет решить проблему плохой растворимости и повысить биодоступность лекарственного препарата (Ткачук, В.А., Конструирование наночастиц для адресной доставки терапевтических средств в клетки и их органеллы [Электронный ресурс] / В.А. Ткачук, В.П. Ширинский, Е.В. Парфенова. - URL: http: //rusnanotech08. rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/10/14.pdf). В парфюмерно-косметической отрасли наночастицы используются как составная часть солнцезащитных кремов (Hofmann, H. Supraparamagnetic nanoparticles, a multifunctional tool for medical imaging, drug and gene delivery and cancer treatment / H. Hofmann // Australian Research Council Nanotechnology Network International Conference on Nanoscience and Nanotechnology. - Brisbane, 2006 - Vol.7, N 11. - P. 82-89). В пищевой промышленности наноматериалы находят применение в фильтрах для очистки воды, при получении более легких, прочных, более термоустойчивых и обладающих антимикробным действием упаковочных материалов, при обогащении пищевых продуктов микронутриентами (Онищенко, Г.Г. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 23 июля 2007 г. № 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы» [Электронный ресурс]. URL: http://www.rospotrebnadzor.ru/documents/postanov/1209/; Радилов, А.С. Экспериментальная оценка токсичности и опасности наноразмерных материалов / 17 А.С. Радилов, А.В. Глушкова, С.А. Дулов // Нанотехнологии. Экология. Производство. – 2009. – № 1. – С. 86–89). Наконец, в экологии прогнозируется применение нанотехнологии для снижения выбросов в различных отраслях промышленности и на транспорте, а также для производства роботов по уничтожению отходов производства, в том числе отработанного ядерного топлива. Перспективно применение нанотехнологий в аэрокосмической, военной и многих других отраслях человеческой деятельности (Гусев, А.А. Нанобезопасность – новое направление экологических исследований / А.А. Гусев, А.В. Емельянов // Проблемы экологии в современном мире. - Тамбов, 2008. - С. 39-41; Иншаков, О.В. Государственная политика развития нанотехнологий: российский и зарубежный опыт / О.В. Иншаков, А.В. Фесюн. – Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2009. – 48 с.). Поскольку наноматериалы обладают широким спектром новых свойств, часто ещѐ недостаточно изученных, актуальной является постановка вопроса об их действии на организм. За рубежом исследования в этой области проводятся с начала 2000-х годов в США (под эгидой FDA), Евросоюзе (OECD, IEC, EFSA, ECETOC и др.), а также рядом международных организаций (WHO, FАО, ILSI) (Тутельян, В.А. Токсиколого-гигиенические аспекты оценки безопасности наноматериалов, используемых при производстве пищевой продукции [Электронный ресурс]. / В.А. Тутельян // ГУ НИИ питания РАМН. – М., 2010. URL: http://rusnanotech08.rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/10/15.pdf). Несмотря на широкую поддержку западными государствами программ развития нанотехнологий, руководство «Green Peace» обратилось к общественности и правительствам этих стран с заявлением о необходимости объявления моратория на разработку нанотехнологий до получения результатов исследований их биологических эффектов (Уйба, В.В. Разработка медико биологического обеспечения [Электронный ресурс] безопасности /В.В.Уйба // rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/7/14.pdf; в URL: области нанотехнологий http:// Иншаков, rusnanotech08. О.В. 18 Нанотрансформация товаров / О.В. Иншаков, А.Р. Яковлев. – Волгоград : Изд-во ВолГУ, 2009. – 32 с.). 2.2. Оценка воздействия нанотехнологий и наноматериалов на биообъекты окружающей среды Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что наноматериалы, обладающие иными физико-химическими свойствами и биологическим действием по сравнению с традиционными аналогами, следует отнести к новым видам материалов и продукции. Однако, для большинства из них гигиеническая характеристика либо отсутствует, либо представлена ограниченным числом тестов, методология выполнения и результаты которых зачастую несопоставимы. В то же время, многие специалисты сходятся во мнении, что такого рода данные должны основываться на результатах, полученных при выполнении большого объема исследований in vitro и in vivo, включая длительные эксперименты на животных (Радилов, А.С. Экспериментальная оценка токсичности и опасности наноразмерных материалов / А.С. Радилов, А.В. Глушкова, С.А. Дулов // Нанотехнологии. Экология. Производство. – 2009. – № 1. – С. 86–89; Онищенко, Г.Г. Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в условиях расширенного использования наноматериалов и нанотехнологий / Г. Г. Онищенко // Гигиена и санитария. – 2010. – № 2. – С. 4–7). При этом ежегодное увеличение номенклатуры наноматериалов, производимых промышленностью, делает практически невозможным получение в ближайшие годы исчерпывающих данных о биологических эффектах всех важнейших наноматериалов, поскольку для этого потребовалось бы привлечение неприемлемо огромных трудозатрат и материальных ресурсов (Онищенко, Г.Г. Постановление Главного 19 государственного санитарного врача РФ от 23 июля 2007 г. № 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы» [Электронный http://www.rospotrebnadzor.ru/documents/postanov/1209/). ресурс]. В связи URL: с этим, в настоящее время разрабатываются шкалы приоритетов, то есть методические подходы (алгоритмы), позволяющие на основе имеющейся научной информации о свойствах наночастиц и их биологическом действии прогнозировать их эффекты на организм человека. В свою очередь результаты такого прогнозирования позволяют осуществлять ранжирование наноматериалов по степени воздействия: для объектов с низкой степенью воздействия целесообразно проведение только отдельных, критически важных тестовых исследований, для наночастиц, характеризуемых средней степенью воздействия, круг планируемых исследований должен быть существенно расширен и, наконец, для наноматериалов с высокой степенью воздействия, гигиеническая характеристика должна осуществляться в полном объѐме (Русаков, Н. В. Эколого-гигиенические проблемы отходов наноматериалов / Н. В. Русаков // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 20–21). Имеющееся незначительное количество исследований в этом направлении указывает на то, что наноматериалы могут оказывать большие биологические эффекты в сравнении с их эквивалентами в обычной форме в этой концентрации (Hussain, S.M. The interaction of manganese nanoparticles with PC12 cells induces dopamine depletion / S.M. Hussain, A.K. Jovorina // Toxicol. Science. - 2006. – Vol. 92, N 2. - P. 456-463.). Размеры НЧ и свойства их поверхностей позволяют им вступать в прямой контакт на молекулярном уровне с биологическими тканями и системами, с микробными агентами (Roy, I. Optical tracking of organically modified silica nanoparticles as DNA carriers: a nonviral, nanomedicine approach for gene delivery / I. Roy, T.Y. Ohulchanskyy, D.J. Bharali et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. Vol. 102. - P. 279-284), эндотоксинами, токсинами, в том числе микотоксинами (Oberdorster, G. Systemic effects of inhaled ultrafine particles in two compromised, aged rat strains / G. Oberdorster // Inhal Toxicol. - 2004. - Vol. 16, N 6/7. - P. 461- 20 471), а также с различными химическими соединениями органической и неорганической природы, протеинами и отдельными структурами клеток (липидами и нуклеиновыми кислотами, в частности ДНК) (Kabanov, A.V. Polymer genomics: an insight into pharmacology and toxicology of nanomedicines / A.V. Kabanov // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2006. - Vol. 58, N 15. - P. 1597-1621; Dutta, D. Adsorbed proteins influence biological activity and moleculer targeting of nanomaterials / D. Dutta, S.K. Sundaram, J.G. Teeguarden, B.J. Riley // Toxicol Sci. 2007. – Vol. 100, N 1. - P. 303-315; Lynch, I. The nanoparticle-protein complex as a biological entity; a complex f1uids surface science challenge for the 21 st century / I. Lynch, T. Cedervall, M. Lundqvist // Adv. Colloid Interface Sci. - 2007. – Vol. 31. - P. 167-174). В экспериментах in vitro показано, что действие НЧ на альвеолярный эпителий обусловлено изменением клеточных структур вследствие прооксидантного эффекта и зависит от состава НЧ, заряда и площади их поверхности (Meng, H. Ultrahigh reactivity provokes nanotoxicity: Explanation of oral toxicity of nanocopper particles / H. Meng, Z. Chen, G. Xing et al. // Toxicology Letters. - 2007. - Vol. 175. - P. 102-110). На основании приведенной информации можно сделать вывод о большем биологическом эффекте наночастиц по сравнению с обычными микрочастицами; способности проникать в неизмененном виде через клеточные барьеры, а также через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему; циркулировать и накапливаться в органах и тканях, вызывая более выраженные морфологические изменения внутренних органов, а также, обладая длительным периодом полувыведения, крайне медленно выводятся из организма (Онищенко, Г.Г. Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в условиях расширенного использования наноматериалов и нанотехнологий / Г. Г. Онищенко // Гигиена и санитария. – 2010. – № 2. – С. 4–7; Уйба, В.В. Разработка медико - биологического обеспечения безопасности в области нанотехнологий [Электронный ресурс] /В.В.Уйба // URL: http:// rusnanotech08. rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/7/14.pdf; Hussain, S.M. In vitro toxicity of 21 nanoparticles in BRL3A rat liver cells / S.M. Hussain, K.L. Hess // Toxicol. in vitro. 2005. – Vol. 19, N 7. - P. 975-983). Следует отметить, что при попадании наноматериалов в окружающую среду последствия могут оказаться совершенно неожиданными. Например, наночастицы диоксида титана, которые находят применение в широком диапазоне устройств - от солнцезащитных экранов до перезаряжаемых батарей - поглощают и концентрируют на себе тяжелые металлы, такие как кадмий (Gao, G. Titanium dioxide nanoparticle-induced testicular damage, spermatogenesis suppression, and gene expression alterations in male mice / G. Gao, Y. Ze, X. Zhao et al. // J. Hazard Mater. – 2013. – Vol. 15. – P. 258-259; Jiang, Wen. Nanoparticles - mediated cellular response in size - dependent / Wen Jiang, B.Y.S Kim // Nanotechnol. 145-150). Остаются неясными последствия 2008. - Vol. 3. - P. появления таких наночастиц в атмосфере и их влияние на характер циркуляции других вредных компонентов, загрязняющих окружающую среду (Гусев, А.А. Нанобезопасность – новое направление экологических исследований / А.А. Гусев, А.В. Емельянов // Проблемы экологии в современном мире. - Тамбов, 2008. - С. 39-41; Bottini, M. Biomedical platforms based on composite nanomaterials and cellular toxicity / M. Bottini, A. Magrini // J. Phys. Conf. Ser. - 2007. - Vol.61. - P. 95-98; Ema, M. Reproductive and developmental toxicity studies of manufactured nanomaterials / M. Ema, N. Kobayashi, M. Naya et al. // Reprod. Toxicol. – 2010. – Vol. 30, N 3. – P. 343-352). К сожалению, традиционные подходы для оценки биологических эффектов химических веществ недостаточны для изучения их в нанофазе, так как размер частиц и площадь поверхности могут иметь особое значение, при этом повышение концентрации наноматериала может не иметь в дозозависимого выражения. Большую проблему представляет отсутствие соответствующих образцов и стандартов, необходимых для проведения тестирования биологического воздействия наноматериалов. В России исследования по проблеме биологических эффектов наночастиц проводятся по инициативе Роспотребнадзора с конца 2006 г. Исходным 22 положением является то, что наноматериалы во всех случаях должны быть отнесены к новым видам материалов и продукции, характеристика влияния которых на организм человека и состояние среды обитания является обязательной в соответствии с законами РФ №52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» и №29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов» безопасности (Тутельян, В.А. наноматериалов, Токсиколого-гигиенические используемых при аспекты производстве оценки пищевой продукции [Электронный ресурс]. / В.А. Тутельян // ГУ НИИ питания РАМН. – М., 2010. - URL: http://rusnanotech08.rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/10/15.pdf). В Постановлении Главного государственного санитарного врача РФ от 23 июля 2007 г. № 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы» описано положение дел с организацией государственного санитарно-эпидемиологического надзора за производством и оборотом продукции, с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы. В постановлении рекомендовано: «…указывать в информации для потребителей сведения об использовании при изготовлении продукции нанотехнологий или наноматериалов; при предоставлении документов для проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции представлять сведения об использовании нанотехнологий или наноматериалов с подтверждением безопасности их использования для человека; организовать работу по объективному, взвешенному информированию населения по вопросам использования нанотехнологий и наноматериалов и т.д.». Между наноматериалов, тем, унифицированная проводимая в точном гигиеническая соответствии характеристика с методическими рекомендациями, должна включать большое число исследований in vitro и in vivo, в том числе, длительные эксперименты на животных, продолжительность которых может превышать 9 - 12 месяцев. Всѐ это указывает на практическую невозможность охарактеризовать в ближайшее время биологические эффекты всех важных наноматериалов, поскольку потребует привлечения неприемлемо 23 огромных трудозатрат и материальных ресурсов контролирующих организаций (Жолдакова, З.И. Общие и специфические аспекты токсических свойств наночастиц и других химических веществ с позиций классической токсикологии / З.И. Жолдакова, О.О. Синицына, Н.В. Харчевникова // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 12–16). Таким образом, в настоящее время биоэффекты различных наноматериалов изучены крайне недостаточно, отсутствуют сведения о метаболизме и механизме их действия, не определены критические органы и системы. Согласно результатам большинства проведенных исследований, можно предположить, что важнейшим показателем, определяющим их эффект на ткани организма является не доза, то есть количество поступающего вещества, а площадь поверхности, которая и будет определять их реакционную способность. Нельзя исключать и иных механизмов, связанных, в частности, с действием наноматериалов на клеточные мембраны и органеллы, усилением транспорта определенных компонентов через тканевые барьеры организма (Онищенко, Г.Г. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 31 октября 2007 г. № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов» [Электронный ресурс]. URL: http://www.infosait.ru/norma_doc/51/51942/index.htm.). Важнейшей характеристикой, которую следует учитывать при оценке биологического действия наноматериалов, является их нерастворимость в воде и биологических средах. При растворении НЧ все эффекты, связанные с наличием у них высокоразвитой поверхности и различными гетерофазно протекающими процессами, утрачиваются, по биологическому действию водорастворимый наноматериал не отличается от своего аналога в макродисперсной форме (Решение Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Методологические проблемы изучения и оценки био- и нанотехнологий (нановолны, частицы, структуры, процессы, 24 биообъекты) в экологии человека и гигиене окружающей среды» // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 88.). Определение биоэффектов новых наноматериалов и наночастиц на лабораторных животных является ключевым этапом оценки таковых на людях при использовании нанотехнологий. Безусловно, имеется настоятельная потребность разработки минимального набора методов, позволяющих проводить относительно недорогой и быстрый скрининг исследуемых наночастиц и наноматериалов по их биологическому воздействию. Комплексные исследования их с самого начала развития такой новой технологии как нанотехнология, позволят избежать недооценки биологических эффектов нанопродуктов и нанотехнологий, и, тем самым, обеспечить здоровье животных, населения и окружающей среды (Холоденко, В.П. Биобезопасность наноматериалов и нанотехнологий [Электронный ресурс] / В.П. Холоденко, В.А. Чугунов, Е.Н. Кобзев, И.А. Дятлов // URL: http://rusnanotech08.rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/2/10/10%20(56).pdf). 2.3. Характеристика влияния наноматериалов на животный организм 2.3.1. Пути проникновения в организм и основные механизмы действия наночастиц Как уже отмечалось, значительная площадь поверхности НЧ, наличие на ней различных химически активных функциональных групп, углеводородных фрагментов и микропримесей металлов, определяют их высокие сорбционные 25 свойства по отношению к биомолекулам. В связи с этим, например, в качестве адсорбента для нейтрализации микотоксинов предлагается использовать наноалмазы (НА) детонационного синтеза и другие НЧ. Установлена их способность адсорбировать афлатоксин В1 из водных растворов, причем время адсорбции не превышает 2-3 мин. (Пузырь, А.П. Адсорбция афлатоксина В1 наноалмазами детонационного синтеза / А.П. Пузырь, К.В. Пуртов, О.А. Шендерова // Докл. РАН. - 2007. – Т. 417, № 1. - С. 117-120; Пузырь, А.П. Воздействие детонационных наноалмазов in vitro и in vivo на биологические объекты / А.П. Пузырь, В.С. Бондарь // Сложные системы в экстремальных условиях: Матер. 12 Междун. симпоз. – Красноярск, 2005. - С. 229-240). В формировании биоэффектов атмосферных НЧ размером менее 2,5 нм для сердечно-сосудистой системы показана роль повышения свертываемости крови (Meng, H. Ultrahigh reactivity provokes nanotoxicity: Explanation of oral toxicity of nanocopper particles / H. Meng, Z. Chen, G. Xing, C. Yuan et al. // Toxicology Letters. - 2007. - Vol. 175. - P. 102-110; Oberdorster, G. Nanotoxicology: Am Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J Oberdorster // Environmental Health Perspectives. - 2005. - Vol.7, N 13. - P. 823-839). Культивирование клеток эндотелия сердечно-сосудистой системы в присутствии НЧ, выделенных из атмосферного воздуха Шанхая, в концентрации 0,05 и 0,2 мг/м3 сопровождалось повышением экспрессии мРНК, интерлейкина-4 и экстаксина (Проданчук, Н.Г. Нанотоксикология: состояние и перспективы исследования [Электронный ресурс] / Н.Г. Проданчук, Г.М. Балан // URL: http://www.medved.kiev.ua/Web_journals/Arhiv/Toxicology/2009/3-4_09/str04.pdf). При анализе фракции частиц воздушного бассейна г. Дюнкерк (Франция) обнаружено присутствие Fe, Al, Ca, Na, K, Mg, Pb в нанофазе. Воздействие фракции частиц вызывало зависимые от концентрации и продолжительности экспозиции изменения пероксидации липидов, активности супероксиддисмутазы, образования 8-гидрокси-2-дезоксигуанина, поли (АДФ)-рибозилирования, активности индуцибельной NO-синтазы и образования NO (Garcon, G. Dunkerque City air pollution particulate matter — induced cytotoxicity, oxidative stress and 26 inflammation in human epithelial lung cells / G. Garcon, Z. Dagher // Toxicol. in vitro. - 2006. - Vol. 20, N 4. - P. 519-529). НЧ попадают в организм ингаляционным путем, с водой и пищей, через интактную и, особенно, поврежденную кожу (Vallhov, H. Mesoporous silica particles induce size dependent effects on human dendritic cells / H. Vallhov, S. Gabrielsson // Nano Lett. - 2007. - Vol.7, N 12. - P. 3576-3582; Shvedova, A.A. Cytotoxic and genotoxic effects of single wall carbon nanotube exposure on human keratinocytes and bronchial epithelial cells / A.A. Shvedova, E. Kisin, N. Keshava // 227th American Chemical Society National Meeting. - 2004. - P. 130-135), а также со средствами медицинского и косметического назначения. Показано, что НЧ в состоянии проникать в клетки минуя любые барьеры (в частности гематоэнцефалический, плацентарный) и избирательно накапливаться в разных типах клеток и клеточных структурах (Fischer, H.C. Nanotoxicity: the growing need for in vivo study / H.C. Fischer, W.C. Chan // Curr. Opin. Biotechnol. - 2007. – Vol. 18, N 6. - P. 565-571). НЧ способны к трансцитозу через эпителиальные и эндотелиальные клетки, распространяются по ходу дендритов и аксонов нервов, циркулируют в кровеносных и лимфатических сосудах, имеют тропность к определенным тканям (Oberdorster, G. Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environmental Health Perspectives. - 2005. - Vol. 7, N 13. - P. 823-839; Muller, R.H. Drug delivery to the brainrealization by novel drug carriers / R.H. Muller, C.M. Keck // J. Nanosci. Nanotech. - 2004. – Vol. 4. – P. 471-483). НЧ попадают в организм также при инъекциях лекарств с наноносителями (Фостер, Л. Нанотехнологии. Наука, инновации, возможности / Л. Фостер. – М.: Техносфера, 2008. – 352 с.). При ингаляционном воздействии очень мелких НЧ (1 нм), 90 % их проникает через слизистую по нервным волокнам в ткани, всасывается в кровь и уже через 2-4 ч обнаруживается в печени, почках, головном и костном мозге. Лишь 15 % более крупных НЧ депонируется в носоглотке и более 50 % - в альвеолярном регионе (Проданчук, Н.Г. Нанотоксикология: состояние и перспективы исследования [Электронный ресурс] / Н.Г. Проданчук, 27 Г.М. Балан // URL: http://www.medved.kiev.ua/Web_journals/Arhiv/Toxicology/2009/3-4_09/str04.pdf). Вследствие трансцитоза через эпителиальные клетки дыхательной системы и сенсорные нервные окончания, НЧ проникают в кровь и лимфу. Биоперсистенция НЧ в альвеолярном регионе наблюдается от 70 суток - у крыс, до 700 суток - у человека (Oberdorster, G. Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environmental Health Perspectives. - 2005. - Vol. 7, N 13. - P. 823839). Из-за неспособности альвеолярных макрофагов фагоцитировать мелкие НЧ (<20 нм), они легко преодолевают альвеолярный эпителий и продолжают внутритканевое перемещение. На примере полимерных композитов с НЧ фтора, которые широко используются в качестве нанопропелентов для доставки гормонов и бронхолитиков в бронхолегочную систему, показано наличие уже через 2-6 ч НЧ фтора в кровеносной системе, внутренних органах и костях, особенно в зоне их роста вследствие особой тропности фтора к остеокластам. В то же время, отмечено влияние НЧ фтора на систему гемостаза (Nemmar, A. Passage of inhaled particles into the blood circulation in humans / A. Nemmar, P.H. Hoet, B. Vanquickenborne // Circulation. - 2002. - Vol. 105. - P. 411-414), что ограничивает применение данных бронхолитиков у пожилых и больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы. Доказано перемещение НЧ по обонятельным, тройничным, трахеобронхиальным нервам и нейро-мускульным соединениям (Фостер, Л. Нанотехнологии. Наука, инновации, возможности / Л. Фостер. – М.: Техносфера, 2008. – 352 с.). Отмеченные в некоторых исследованиях сердечно-сосудистые эффекты, вызванные наличием наночастиц в атмосферном воздухе окружающей среды, отчасти обусловлены прямым воздействием этих веществ на вегетативную нервную систему через чувствительные нервные окончания дыхательного тракта. Предполагается, что наночастицы в окружающем воздухе могут способствовать развитию нейродегенеративных изменений у животных (Boxall Alistair, B.A. 28 Assessing environmental exposure to engineered nanoparticles / B.A. Alistai Boxall // ICP Inf. Newslett. - 2007. – Vol. 32, N 2. - P. 1262-1264.). Известно о значительных изменениях баланса микробных сообществ при попадании в окружающую среду синтезированных наноматериалов, используемых как противомикробные препараты (Oberdorster, G. Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environmental Health Perspectives. 2005. - Vol. 7, N 13. - P. 823-839). Ввиду повышенной адсорбционной ѐмкости, НЧ могут выступать в роли «проводников» при поступлении в организм некоторых распространѐнных токсикантов (тяжѐлых металлов, пестицидов и др.). НЧ с высокой каталитической активностью могут служить инициаторами процессов свободнорадикального окисления (СРО), приводящего к трансформации биологических структур липидов, белков, нуклеиновых кислот, в частности, ДНК (Тутельян, В.А. Токсиколого-гигиенические аспекты оценки безопасности наноматериалов, используемых при производстве пищевой продукции [Электронный ресурс]. / В.А. Тутельян // ГУ НИИ питания РАМН. – М., 2010. - URL: http://rusnanotech08.rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/10/15.pdf). Как указывалось выше, наночастицы, вследствие своих небольших размеров, могут связываться с нуклеиновыми кислотами (вызывая, в частности, образование аддуктов ДНК), белками; встраиваться в мембраны; проникать в клеточные органеллы и, тем самым, изменять функции биоструктур (Cedervall, T. Detailed identification of plasma proteins adsorbed on copolymer nanoparticles / T. Cedervall, I. Lynch, T. Berggard // Angew Chem. Int. Ed. Engl. - 2007. – Vol.46, N 30. - P. 57545756). Высокая способность к аккумуляции может привести к накоплению наноматериалов в растительных и животных организмах, а также микроорганизмах, передаче по пищевой цепи, что, тем самым, увеличит их поступление в организм человека (Онищенко, Г.Г. Обеспечение санитарноэпидемиологического благополучия населения в условиях расширенного 29 использования наноматериалов и нанотехнологий / Г. Г. Онищенко // Гигиена и санитария. – 2010. – № 2. – С. 4–7). Некоторые наночастицы способны из легких попадать в кровь, тогда как при обычных обстоятельствах такой путь для более крупных частиц предотвращен барьерными механизмами на уровне тканей и отдельных клеток. Размеры пор в оболочке ядра эукариотической клетки, составляющие 80-90 нм, теоретически позволяют наноматериалам меньших размеров проникать вглубь клетки, вплоть до хромосом и отдельных генов (Гусев, А.А. Оценка воздействия наносодержащего материала «Таунит» на живые системы Емельянов, А.Г. Ткачев и др. научно-практической конференции / А.А.Гусев, А.В. // Сборник материалов 8-ой Международной «Экология и безопасность жизнедеятельности». – Пенза, 2008. – С. 28-29). Имеются данные об эффектах некоторых нанообъектов на клетки различных тканей. Так, нанотрубки могут проникать через клеточную мембрану, накапливаться в цитоплазме и ядре; при этом механизм проникновении до конца не ясен (Трусов, Л.А. Поведение углеродных нанотрубок в живых клетках [Электронный ресурс] /Л.А. Трусов // URL: http: //www.nanometer.ru /2007/12/04/ carbon_nanotube_5319.html; Flahaut, E. Study nanocytotoxicity of CCVD carbon nanotubes / E. Flahaut, M.C. Durriu // J. Mater. Sci. - 2006. - Vol. 41, N 8. – P. 2411-2416). Как установили исследователи из Национального института стандартов и технологий (NIST) США, однослойные УНТ длиной до 200 нанометров, покрытые фрагментами ДНК, беспрепятственно проникают внутрь клеток легких (Гусев, А.А. Нанобезопасность – новое направление экологических исследований / А.А. Гусев, А.В. Емельянов // Проблемы экологии в современном мире. - Тамбов, 2008. - С. 39-41). Итак, наночастицы попадают в животный организм всеми известными путями (через органы дыхания, желудочно-кишечный тракт, неповрежденные кожные покровы, рецепторы обонятельного нерва, конъюнктиву глаз). Классическими органами-мишенями для наночастиц являются легкие, печень, почки, головной мозг, желудочно-кишечный тракт. Накапливаясь в различных 30 тканях они способны вызывать значительные изменения в животном организме, в частности в легких, костном мозге, мозговом и коронарном кровообращении, сердечной деятельности, процессе репликации ДНК (генома клетки) (Уйба, В.В. Разработка медико-биологического обеспечения безопасности в области нанотехнологий [Электронный ресурс] /В.В.Уйба // URL: http:// rusnanotech08. rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/7/14.pdf). 2.3.2. Влияние отдельных наноматериалов на ткани и органы К настоящему времени накоплен определенный экспериментальный материал по биологическим эффектам отдельных наноматериалов, методам их оценки при ингаляционном и пероральном поступлении в организм (Онищенко, Г.Г. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 23 июля 2007 г. N 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы» [Электронный ресурс]. URL: http://www.rospotrebnadzor.ru/documents/postanov/1209/). Более широко изучены эффекты ингаляционного поступления отдельных наноматериалов в организм человека, при этом отмечено, что изменения в легочной ткани обусловлены преимущественно прооксидантным и генным действием НЧ (Elder, A.C.P. Pulmonary inflammatory response to inhaled ultrafine particles is modified by age, ozone exposure and bacterial toxin / A.C.P Elder, R. Gelein, J.N. Finkelstein et al. // Inhal Toxicol. - 2000. - Vol. 12 (suppl. 4). - P. 227-246; Chin, Wing Lam. Pulmonary toxicity of single wall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation / ChinWing Lam, J.T. James, R. McCluskey // Toxicol. Science. - 2006. – Vol. 77. - P. 126-134; Zhu, X. Toxicity assessment of iron oxide nanoparticles in zebrafish (Danio rerio) early life stages / X. Zhu, S. Tian, Z. Cai 31 // PLoS One. – 2012. – Vol. 7, N 9. – P. 46-48). Описаны результаты ингаляционного воздействия НЧ серебра, кадмия, цинка, диоксида титана, ванадия, меди, кварца и ряда других химических веществ (Barua, S. Non- hazardous anticancerous and antibacterial colloidal 'green' silver nanoparticles / S. Barua, R. Konwarh, S. Bhattacharya et al. // Colloids Surf. B Biointerfaces. – 2013. – Vol. 105. – P. 37-42; Gao, G. Toxicity of Silver and Titanium Dioxide Nanoparticle Suspensions to the Aquatic Invertebrate, Daphnia magna / G. Gao, Y. Ze, X. Zhao et al. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. - 2013. – Vol. 91, N 1. – P. 76-82). У крыс, подвергавшихся воздействию НЧ серебра размером 19,8-64,9 нм по 6 ч в течение 5 суток с двухдневным перерывом на протяжении 4 недель, выявлено увеличение в крови активности γ-глютамилтрансферазы; содержания нейтрофилов, эозинофилов и гемоглобина при концентрации 1,27х105 частиц/см3; кальция и общего белка при концентрации 1,27х106 частиц/см3 (Проданчук, Н.Г. Нанотоксикология: состояние и перспективы исследования [Электронный ресурс] / Н.Г. Проданчук, Г.М. Балан // URL: http://www.medved.kiev.ua/Web_journals/Arhiv/Toxicology/2009/3-4_09/str04.pdf). Продемонстрирована способность НЧ серебра осаждаться в легких, печени, почках; проникать в результате аксонального транспорта в обонятельную луковицу и другие структуры головного мозга. Сообщается о высокой стабильности НЧ серебра в окружающей среде и способности сохранять биологическую активность на протяжении нескольких лет (Sahoo, S.K. The present and future of nanotechnology in human health care / S.K. Sahoo, S. Parveen, J.J. Panda // Nanomedicine: Nanotechnology in human health care. - 2007. - Vol. 3. - P. 2031). Отмечается способность полупроводниковых нанокристаллов (квантовые точки), содержащих CdSe/ZnS в виде ультратонких НЧ с диаметром 3,2 нм при ингаляции проникать в головной мозг (Oberdorster, G. Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environmental Health Perspectives. - 2005. - Vol. 7, N 13. - P. 823-839; Blum, J.L. Cadmium associated with inhaled cadmium 32 oxide nanoparticles impacts fetal and neonatal development and growth / J.L. Blum, J.Q. Xiong, C. Hoffman, J.T. Zelikoff // Toxicol. Sci. - 2012. – Vol. 126, N 2. – P. 478-486). Авторы подвергали животных воздействию аэрозоля водного раствора фосфолипидных капсулированных CdSe/ZnS квантовых точек в концентрации 7 мг/м3 интраназально в течение 3 ч с использованием ингалятора со скоростью потока 8 л/мин. В период до 2-5 ч после воздействия было обнаружено проникновение НЧ по ольфакторному нерву через гематоэнцефалический барьер в кору головного мозга. Показано, что ингаляционное воздействие НЧ TiO2 размером 80-100 нм приводит к распределению их в легких; увеличивает активность СРО, оказывая выраженный прооксидантный эффект (Warheit, D.B. Pulmonary toxicity studies with Ti02 particles containing various commercial coatings / D.B. Warheit, T.R. Webb, K.L. Reed // Toxicologist. - 2003. - Vol. 72, N 1. - P. 298-300; Gao, G. Ovarian dysfunction and gene-expressed characteristics of female mice caused by long-term exposure to titanium dioxide nanoparticles / G. Gao, Y. Ze, B. Li et al. // J. Hazard Mater. – 2012. – Vol. 243. – P. 19-27); повышает количество нейтрофилов и фагоцитов в бронхоальвеолярных смывах (Driscoll, K.E. Pulmonary response to silica or titanium dioxide: inflammatory cells, alveolar macrophage-derived cytokines, and histopathology / K.E. Driscoll, R.C. Lindenschmidt, J.K. Maurer // AM. J. Repair. Cell Mol. Вio. - 1990. - Vol. 2. - P. 381-390; Bermudez, E. Pulmonary responses of mice, rats and hamsters to subchronic inhalation of ultrafine titanium dioxide particles / E. Bermudez, J.B. Mangum, B.A. Wong // Toxicol. Sci. - 2004. – Vol. 77. - P. 347357). Пероральное однократное введение НЧ TiO2 размерами 25 и 80 нм характеризуется еще большим эффектом: интенсивнее проникновение в легкие, печень, селезенку, почки по сравнению с более крупными НЧ размером 155 нм (Wang, J. Acute toxicity and biodistribution of different sized titanium dioxide particles in mice after oral administration / J. Wang, G. Zhou, C. Chan // J. Physical Chemistry. 2007. - Vol. 168. - P. 176-185; Warheit, D.B. Pulmonary bioassay studies with nanoscale and fine quarts particles in rats: Toxicity is not dependent upon particle size but on surface characteristics / D.B. Warheit, T.R. Webb // Toxicol. Sci. - 2007. - Vol. 33 95, N 1. - P. 86-97; Gao, J. Polyhydroxy fullerenes (fullerols or fullerenols): beneficial effects on growth and lifespan in diverse biological models / J. Gao, Y. Wang, K. Folta et al. // PLoS One. - 2011. – Vol. 6, N 5. – P. 19-25). Авторы отмечают, что эти НЧ имеют длительный период полувыведения (более 500 суток) как при ингаляционном, так и пероральном поступлении; практически не выводятся почками. Однократное пероральное введение НЧ TiO2 размером 25 и 80 нм в дозе 5000 мг/кг мышам вызывало их накопление в селезенке, почках и легких; повышение в сыворотке крови активности ферментов лактат- и гидроксибутиратдегидрогеназы (25 нм); увеличение печени. Эффект этих частиц определяется не только размером, но и формой. Влияние на клетки НЧ дендрической и веретенообразной формы выраженнее, по сравнению со сферическими частицами (Wang, J. Acute toxicity and biodistribution of different sized titanium dioxide particles in mice after oral administration / J. Wang, G. Zhou, C. Chan // J. Physical Chemistry. - 2007. - Vol. 168. - P. 176-185). Показан эффект ингаляционного воздействия НЧ ванадия на животных и культуру эпителиальных клеток легких (Knirsch, W. Nanoparticulate vanadium oxide potentiated vanadium toxicity in human lung cells / W. Knirsch, K. Kern, C. Schleh, C. Adelhelm // Environ. Sci Technol. - 2006. - Vol. 41, N 1. - P. 331-336). Исследователи связывают его со способностью вызывать развитие окислительного стресса как в легочных макрофагах, так и в эпителиальных клетках легких. Низкие концентрации НЧ ванадия (10 мкг/мл) при однократном воздействии на порядок уменьшали in vitro жизнеспособность эпителиальных клеток линии А 549. Ингаляционное и пероральное воздействие НЧ меди выявило высокую зависимость эффекта от размера частиц (Tao, T.Y. The copper toxicosis gene product Murr 1 directly interacts with the Wilson disease protein / T.Y. Tao, F.L. Liu, L. Klomp // Biol. Chem. - 2004. – Vol. 278. - P. 41593-41596; Meng, H. Ultrahigh reactivity provokes nanotoxicity: Explanation of oral toxicity of nanocopper particles / H. Meng, Z. Chen, G. Xing, C. Yuan et al. // Toxicology Letters. - 2007. - Vol. 175. 34 - P. 102-110). Продемонстрировано, что низкие концентрации НЧ меди потенциируют эффекты других элементарных химических веществ при воздействии на легочные клетки человека. Пероральное воздействие НЧ меди изменяет кислотно-щелочной баланс крови (Williams, A.J. Assessing and interpreting arterial blood gases and acid base balance / A.J. Williams // BMJ. - 2005. - Vol. 317. - P. 1213-1216; Nighswonger, G. A Medical Device Link MD & DI column: New polymers and nanotubes add muscle to prothetic limbs. Available From URL: http://www.devicelink.com/mddi/ archive /99/08/004. html (Assessed 2006 Jan 25)), структуру печени, мозговой ткани и почек. Отмечен повышенный эффект водорастворимых НЧ меди (Meng, H. Ultrahigh reactivity provokes nanotoxicity: Explanation of oral toxicity of nanocopper particles / H. Meng, Z. Chen, G. Xing, C. Yuan et al. // Toxicology Letters. - 2007. - Vol. 175. - P. 102-110), они вызывают генетические и морфологические изменения (Tao, T.Y. The copper toxicosis gene product Murr 1 directly interacts with the Wilson disease protein / T.Y. Tao, F.L. Liu, L Klomp // Biol. Chem. - 2004. – Vol. 278. - P. 41593-41596). У крыс, получавших НЧ меди, наблюдали выраженные изменения в ЖКТ. Выявлены также биохимические сдвиги в виде повышения уровня в крови мочевины, креатинина, общих желчных кислот и щелочной фосфатазы (Chen, Z. Acute toxicological еffects of copper nanoparticles in vivo / Z. Chen, H. Meng, G. Hing // J. Phys. Chem. Toxicol. Lett. - 2006. – Vol. 163. - P. 109-120; Hong, J.S. Combined repeated-dose toxicity study of silver nanoparticles with thereproduction/developmental toxicity screening test [Электронный ресурс] / J.S. Hong, S. Kim, S.H. Lee et al. // URL: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.3109/17435390.2013.857734). 35 2.3.2.1. Особенности эффектов на организм углеродных наноматериалов В последние годы появились публикации о биологических эффектах наночастиц углерода как при пероральном, так и ингаляционном воздействиях. Атом углерода, в отличие от других элементов, способен образовывать различные типы химической связи за счет гибридизации S- и P-орбиталей. Этим обусловлены его свойства создавать значительное число аллотропов. В настоящее время разработаны и широко используются во многих отраслях промышленности, в том числе в фармакологии, различные углеродные наноматериалы: фуллерены и фуллериты, содержащие пяти- (пентагоны С5) и шестичленные (гексагоны С6) циклы, одно- и многослойные нанотрубки, цилиндры, стенки которых образованы гексагонами С6, графитовые ленты, кристаллообразующие кластеры С16, С24, С60 и т.д., шварциты, шварцаны, тороиды, нанотубулярные кристаллы, наноалмазы и другие наноматериалы (Покропивный, В.В. Новые наноформы углерода и нитрида бора. В.В. Покропивный, А.Л. Ивановский // Успехи химии. - 2008. – Т.77, № 10. - С. 897-992), производство которых в ряде стран составляет сотни и тысячи тонн в год (Кац, Е.А. Фуллерены, углеродные нанотрубки и нанокластеры: Родословная форм и идей / Е.А. Кац. – М.: Изд-во ЛКИ, 2008. – 296 с.; Borm, P.J.A. Toxicological hazards of inhaled nanoparticles potential implications for drug de livery / P.J.A Borm, W. Kreylin // J. Nanosci. Nanotech. - 2004. – Vol. 4, N 6. - P. 1-11). Площадь поверхности углеродных наноматериалов является наиболее важным критерием в отношении прогнозирования их клеточноопосредованного эффекта (Sayes, C.M. Functionalization density dependence of single walled carbon nanotubes cytotoxicity in vitro / C.M. Sayes, F. Liang, J.L. Hudson // Toxicol. Lett. 2006. - Vol. 161. - P. 135-138; Shvedova, A.A. Cytotoxic and genotoxic effects of single wall carbon nanotube exposure on human keratinocytes and bronchial epithelial cells / A.A. Shvedova, E. Kisin, N. Keshava // 227th American Chemical Society 36 National Meeting. - 2004. - P. 130-135). Наиболее выражен этот эффект при использовании очищенных одностенных УНТ (Jia, G. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single wall nanotube and fullerene / G. Jia, H. Wang, L Yan // Environ. Sci. Technol. - 2005. - Vol. 39. - P. 1378- 1380; Nemmar, A. Ultrafine particles affect experimental thrombosis in an in vivo hamster model / A. Nemmar, M.F. Hoylaerts, P.H. Hoet // Am. J. Respi Crit Care Med. - 2002. - Vol. 166. - P. 9981004). Изучены структура и функционирование белков при контакте с углеродными наноматериалами (НЧ, нанопроволокой и УНТ), в том числе при иммобилизации на носителях (Kane Ravi, S. Nanobiotechnology: Protein - nanomaterial interactions / Ravi S. Kane, Abraham D. Strook // Biotechnol. Progr. 2007. – Vol. 23, N 2. - P. 316-319). Показана возможность использования таких взаимодействий для создания биосенсоров; диагностической визуализации; сборки наноматериалов с помощью белков и белковых структур; изучения и терапевтического применения взаимодействия клеток с наноматериалами (при доставке лекарств, исследовании фармакокинетики) (Hooper, H.L. Comparative chronic toxicity of nanoparticulate and ionic zinc to the earthworm Eisenia veneta in a soil matrix / L.H. Hooper, K. Jurkschat, A.J. Morgan et al. // Environ. Int. – 2011. – Vol. 37, N 6. – P. 1111-1117). Биологическая эффективность углеродных материалов, обработанных белком, значительно возрастает вследствие повышения их способности проникать в клетки, что, несомненно, должно быть учтено при использовании их в качестве наноносителей (Kane Ravi, S. Nanobiotechnology: Protein - nanomaterial interactions / Ravi S. Kane, Abraham D. Strook // Biotechnol. Progr. - 2007. – Vol. 23, N 2. - P. 316-319; Kashiwada, Shosaku Distribution of nanoparticles in the seethrough medaka / Shosaku Kashiwada // Environ. Health Perspect. - 2006. – Vol. 11. - P. 1697-1702). В отдельных сообщениях продемонстрированы раздражающие эффекты УНТ на кожу. Предпринята попытка изучения влияния на кожу сажи, содержащей УНТ (Huczko, A. Carbon nanotubes: experimental evidence for a null risk of skin irritation and allergy / A. Huczko, A. Lange // Fullerene Sci. Tech. - 2001. - Vol. 9, N 37 2. - P. 247-250). У 40 добровольцев проводили аппликационный тест, у 4 кроликов-альбиносов исследовали влияние УНТ на слизистую оболочку глаз. Согласно авторам, сажа, содержащая УНТ неизвестной концентрации, не оказывает раздражающего эффекта. Проводятся исследования проникновения через интактную кожу НЧ, изготовленных из углеродных и полимерных материалов, которые могут использоваться для трансдермальной доставки лекарственных средств. Методом конфокальной микроскопии при нанесении на кожу эллипсоидных наносфер (4,6х12 нм), покрытых полиэтиленгликолем, продемонстрировано проникновение их через роговой слой и накопление в эпидермисе и дерме через 8 ч (Vallhov, H. Mesoporous silica particles induce size dependent effects on human dendritic cells / H. Vallhov, S. Gabrielsson // Nano Lett. - 2007. - Vol. 7, N 12. - P. 3576-3582). Исследование in vitro биосовместимости УНТ показало, культивирование фибробластов и остеобластов в присутствии что УНТ не способствовало снижению жизнеспособности клеток. Присутствие УНТ не вызывало секреции интерлейкина-6 и генерации свободных радикалов, однако индуцировало повышенный синтез фибро- и остеобластами коллагена (Chlopek, J. In vitro studies of carbon nanotubes biocompatibility / J. Chlopek, B. Czajkowska // Carbon. - 2006. – Vol. 44, N 6. - P. 1106-1111). Выявлено, что подвергнутая воздействию УНТ кровь проявляет повышенную способность индуцировать миграцию макрофагов (Barlow, P.Y. Serum exposed to nanoparticle carbon black displays increased potential to induce macrophage migration / P.Y. Barlow, K. Donaldson // Toxicol. Lett. - 2005. - Vol. 155, N 3. - P. 397-401). Наноматералы на основе углерода и содержащие в своем составе многочисленные УНТ, нановолокна и НЧ влияют также на клетки легких в условиях in vitro, причем эффект этих материалов зависит от размера и усиливается после кислотной обработки их поверхности (Magrez, A. Cellular toxicity of carbon — based nanomaterials / A. Magrez, S. Kasas // Nano Lett. - 2005. - Vol. 6. - P. 1112-1125). Воздействие УНТ на макрофагов крыс и клетки легких человека в течение 24 ч в концентрации 10-100 мкг/мл сопровождается 38 проникновением УНТ в цитоплазму клеток. Инкубация клеток с УНТ приводит к внутриклеточному мембранного накоплению потенциала активных митохондрий. форм кислорода Выявлены и снижению изменения ДНК, индуцируемые УНТ в эмбриональных стволовых клетках мышей (Zhu, Lin. DNA damage induced by multiwalled carbon nanotubes in mouse embryonic stem cells / Lin Zhu, Dong Chang // Nano Lett. - 2007. - Vol. 7, N 12. - P. 3592-3597). Отмечается большая биологическая эффективность одностенных УНТ в сравнении с многостенными и фуллеренами (Donaldson, K. Carbon nanotubes: A review of their properties in relation to pulmonary toxicology and workplace safety / K. Donaldson, R. Aitken // Toxicol. Science. - 2006. – Vol. 92, N 1. - P. 5-22), что проявляется изменением морфологии клеток, митохондриальной и фагоцитарной функций. Cчитается, что в механизме цитологических и генных эффектов НЧ участвуют кальцийзависимые реакции и металлы с переходной валентностью (Oberdorster, G. Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environmental Health Perspectives. - 2005. - Vol. 7, N 13. - P. 823-839). При воздействии углеродных фуллеренов в митохондриях накапливается их производное - фуллеренкарбоновая кислота (Пиотровский, Л.Б. Будьте осторожны — следующая остановка «НАНО ЭРА» или проблема токсичности наночастиц / Л.Б. Пиотровский // Экологический вестник России. - 2008. - № 11. - С. 31). Фуллерены включаются в молекулы белков; это происходит в комплексе с полимерами, например, с поливинилпирролидоном. Молекулы фуллеренов в таких комплексах имеют разные размеры, заряд, гидрофобность. Биологический эффект этих веществ повышается при световом облучении, что связано с генерацией свободнорадикальных форм кислорода. Исследовано влияние фуллеренов (С60Ф) на тучные клетки и базофилы человека в культуре in vitro. Показано угнетение ими зависимого от IgE освобождения медиаторов тучных клеток и базофилов. Эффект реализуется через снижение активации сигнальных молекул, вовлекаемых в освобождение медиаторов и индукцию окислительного стресса. Фуллерены подавляют освобождение гистамина и 39 температурную реакцию (Ryan, J. Fullerene nanomaterials inhibit the allergic response / J. Ryan, H. Bateman // J. Immunolol. - 2007. - Vol. 179, N 1. - P. 665672). Между тем, отдельные авторы не рекомендуют применять углеродные НЧ (УНТ, фуллерены и другие) с лечебной целью, особенно для биодетоксикации (Leroux, J.C. Injectable nanocarriers for biodetoxification // J. C. Leroux // Nature Nanotechnol. - 2007. – Vol. 2, N 11. - P. 679-684). Как в условиях in vivo, так и in vitro, клеточные биоэффекты НЧ углерода (фуллеренов, УНТ, квантовых точек и других наноструктур) и НЧ других химических веществ, особенно при ультрафиолетовом воздействии или в присутствии металлов с переходной валентностью, обусловлены формированием реактивных свободнорадикальных форм кислорода вследствие окисления белков и пероксидации липидов (Zhou, Y.M. Oxidative stress and NFkB activation in the lungs of rats: a synergistic interaction between soot and iron particles / Y.M. Zhou, C.Y. Zhong, I.M. Kennedy et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2003. – Vol. 190. P. 157-169; Jia, G. Cytotoxicity of carbon nanoma terials: singlewall nanotube, and fullerene / G. Jia, H. Wang, L Yan // Environ. Sci. Technol. - 2005. - Vol. 39. - P. 1378-1380). Низкие концентрации НЧ вызывают умеренный прооксидантный эффект на фоне активизации факторов антиоксидантной защиты (каталазы, окисленного и восстановленного глютатиона, супероксиддисмутазы) (Li, N. Ultrafine particulate pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage / N. Li, C. Sioutas, A. Cho, D. Schmitz // Environ. Health Perspec. - 2003. - Vol. 111. P. 455-459). Установлены разнообразные биологические эффекты частиц модифицированных наноалмазов, включая гибель животных. В длительных экспериментах пероральное введение гидрозолей модифицированных наноалмазов вызывает повышение содержания лейкоцитов в крови мышей и выраженность этого процесса зависит от их концентрации. Обнаруженный эффект связывают со значительным повышением уровня иммунного ответа, который реализуется через взаимодействие модифицированных наноалмазов с макрофагами (Garcon, G. Dunkerque City air pollution particulate matter — induced 40 cytotoxicity, oxidative stress and inflammation in human epithelial lung cells / G. Garcon, Z. Dagher // Toxicol. in vitro. - 2006. - Vol. 20, N 4. - P. 519-529). 2.3.2.2. Воздействие наноматериалов на репродуктивную систему Репродуктивное состояние традиционно является объектом изучения последствий влияния факторов окружающей среды (Григорьева, Е.Е. Резервы оптимизации репродуктивного здоровья в современных социально- экономических условиях крупного промышленного города: Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук / Е.Е. Григорьева. - М., 2007. - 38 с.; Медведева, И.Б. Оценка репродуктивного потенциала девочек-подростков / И.Б. Медведева // Проблемы репродукции. Специальный выпуск. - 2009. - С. 153-154.). Особую значимость имеет репродуктивное здоровье женских особей, в связи с чем в последние годы сформировалось новое научное направление – экологическая репродуктология, изучающая влияние окружающей среды на фертильный потенциал человека и животных. Общепризнано, что центральное место среди факторов, влияющих на становление и функционирование репродуктивной системы, занимают экологогеографические условия (Айламазян, Э.К. Репродуктивное здоровье женщины как критерий биоэкологической оценки окружающей среды / Э.К. Айламазян, Т.В. Беляева, Е.Г. Виноградова, И.А. Шутова // Вестн. Рос. ассоц. акушеров- гинекологов. - 1997. - № 3. - С. 72-78). Выявлено, что в догестационный период воздействие факторов окружающей среды может изменять гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковые взаимоотношения и иммунную систему, на фоне которых формируется период беременности (Сивочалова, О.В. Медико-экологические аспекты проблемы охраны репродуктивного здоровья работающих России / О.В.Сивочалова, Г.К. 41 Радионова // Медицина труда и промышленная экология. - 1999. - № 3. - С. 1-5; Алиева, Н.А. Особенности репродуктивного здоровья девушек-подростков с ожирением различного генеза: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук / Н.А. Алиева Волгоград, 2007. - 22 с.). В настоящее время признано, что эффекты на эмбриогенез химических веществ обусловлены: - тропностью ряда химических веществ к органам и системам, обеспечивающим протекание беременности; - способностью проникновения через плаценту и контакта вещества или его метаболитов с эмбриональными клетками; - избирательным накоплением веществ в тканях плода в период внутриутробного развития; - изменением проницаемости плаценты (Курляндский Б.А., 2002). Определен спектр веществ, которые могут влиять на репродуктивную систему женских и мужских особей. Это дезаминирующие соединения, цитостатики, алкилы металлов и др. (Джатдоева, Ф.А. Проблемы репродуктивного здоровья россиян / Ф.А. Джатдоева // Мать и Дитя: Материалы VIII Рос. форума. - М., 2006. - С. 624-325). У мужских особей повышается проницаемость гематотестикулярного барьера (собственная оболочка семенных канальцев, цитоплазма клеток Сертоли, стенка сосудов, белочная оболочка) (Кулаков, В.И. Репродуктивное здоровье населения России / В.И. Кулаков. // Гинекология. – 2007. – Т. 9. - № 1. – С. 7-9; Campagnolo, L. Physico-chemical properties mediating reproductive and developmental toxicity of engineered nanomaterials / L. Campagnolo, M. Massimiani, A. Magrini et al. // Curr. Med. Chem. – 2012. – Vol. 19, N 26. – P. 4488-4494). Эффекты действия химических веществ на женскую репродуктивную систему проявляются широким спектром изменений в половых органах, оплодотворенной яйцеклетке в предимплантационный период, анатомическими изменениями (Коломейцев, М.Г. Проблемы и перспективы развития репродуктивного образования в системе здоровьесбережения молодежи в России / 42 М.Г. Коломейцев // Репродуктивное здоровье детей и подростков. - 2009. - № 2. - С. 83-92). В последние годы к большому числу факторов, влияющих на репродуктивную функцию животного организма, добавился еще один наноматериалы, о влиянии которых до настоящего времени практически ничего не было известно (Иншаков, О.В. Нанотрансформация товаров / О.В. Иншаков, А.Р. Яковлев. – Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2009. – 32 с.). Имеется лишь небольшое количество сообщений, посвященных исследованию этих аспектов биологического действия НЧ; в отдельных работах изучается состояние репродуктивной системы экспериментальных животных – кроликов и крыс (Сычева, Л. П. Оценка мутагенных свойств наноматериалов / Л.П. Сычева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 26–28; Boisen, A.M. NanoTIO(2) (UVTitan) does not induce ESTR mutations in the germline of prenatally exposed female mice / A.M.Boisen, T. Shipley, P. Jackson et al. // Part. Fibre Toxicol. – 2012. – Vol. 9. – P. 9-19; Hsu, P.C. Quantum dot nanoparticles affect the reproductive system of Caenorhabditis elegans / P.C. Hsu, M. O'Callaghan, N. Al-Salim, M.R. Hurst // Environ. Toxicol. Chem. - 2012. – Vol. 31, N 10. – P. 2366-2374). Сообщалось о влиянии НЧ на ткань плаценты человека (Juch, H. Nanomaterial interference with early human placenta: Sophisticated matter meets sophisticated tissues // H. Juch, L. Nikitina, P. Debbage et al. // Reprod. Toxicol. - 2013. - 39 p.). Исследовано воздействие УНМ на репродуктивную функцию самцов мышей (Гусев А.А., 2010). В течение 30 суток животным опытной группы перорально вводился УНМ путем замены питьевой воды на коллоидный водный раствор. Среднесуточная доза исследуемого материала на каждого самца в экспериментальной группе составляла 30 мг/кг. По истечении срока экспозиции к каждой особи подсаживалось по 3 половозрелых неэкспонированных самки. Через 3 суток совместного содержания фиксировали наличие сперматозоидов во влагалищных мазках самок, после чего их отсаживали в отдельные клетки. Внешних изменений в экспериментальной группе отмечено не было. Последующее наблюдение за самками позволило установить, что углеродный 43 наноматериал, вводимый перорально в исследуемой дозировке, вызывает угнетение репродуктивной функции самцов. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что наряду с такими органами, как печень, селезенка и легкие, органами-мишенями для наночастиц являются и семенники (Гусев, А.А. Гендерные различия физиологического эффекта углеродного наноструктурного материала – перспективного носителя лекарственных препаратов в эксперименте на лабораторных мышах / А.А. Гусев, И.А. Полякова, А.Г. Ткачев и др. // Научные ведомости Белогородского государственного университета. Серия: Естественные науки. - Белгород, 2010. - Т. 21, № 13. - С. 107-112). Присутствие в ткани достаточно длинных и жѐстких (многослойных) нанотрубок вызывает изменение активности макрофагов (Насибуллаев, Ш.К. Фуллерены, их производные и нанотрубки [Электронный ресурс]. URL: http://originweb.info/education/chemistry/fullerenes6.html). В результате поступления наноматериала в организм животного, возможно появление хромосомных аббераций, большинство которых возникает у отца (Уйба, В.В. Разработка медико-биологического обеспечения безопасности в области нанотехнологий [Электронный ресурс] /В.В.Уйба // URL: http:// rusnanotech08. rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/7/14.pdf). Одним из сопутствующих эффектов воздействия УНМ на мышей является повышенный синтез гормонов – кортикостероидов, катехоламинов. Гормональные сдвиги способны вызывать адаптивные изменения на уровне ЦНС, в частности в гипоталамусе, в результате чего возможны изменения секреции в нем гормона гонадолиберина; при этом снижается выделение лютеинизирующего гормона, действующего на находящиеся в семенниках клетки Лейдига, которые в ответ выделяют гормон тестостерон. Это впоследствии может обусловить изменения в функционировании репродуктивной системы самцов мыши (Кэттайл, В.М. Патофизиология эндокринной системы / В.М. Кэттайл, Р.А. Арки. – СПб.: Невский диалект, 2001. – 336 с.). Таким образом, изменение гормонального баланса под воздействием наноматериала могло привести к угнетению репродуктивной функции на уровне гуморальной регуляции сперматогенеза 44 (Гусев, А.А. Половые наноструктурного различия материала – физиологического перспективного эффекта носителя углеродного лекарственных препаратов в эксперименте на лабораторных мышах / А.А. Гусев, И.А. Полякова, А.Г. Ткачев и др. // Научные ведомости Белогородского государственного университета. Серия: Естественные науки. - Белгород, 2010. - Т. 21, № 13. - С. 107-112). Эффекты воздействия НЧ серебра на сперматогенез выявлены у экспериментальных животных (Braydich Stolle, L. In vitro toxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells / L. Braydich Stolle, Saber Hussain // Toxicol. Sci. 2005. – Vol. 88, N 2. - P. 412-419; Gomes, S.I. Mechanisms of response to silver nanoparticles on Enchytraeus albidus (Oligochaeta): Survival, reproduction and gene expression profile / S.I. Gomes, A.M. Soares, J.J. Scott-Fordsmand, M.J. Amorim // Hazard Mater. – 2013. – Vol. 15. – P. 254-255). НЧ серебра с бактерицидной целью более 10 лет применяются в медицине в костных имплантантах, перевязочных и других материалах (Alt, V. An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement / V. Alt, T. Bechert, P. Steinrucke // Biomaterials. - 2004. – Vol. 25. - P. 4383-4391). Оценка биологических эффектов наноматериалов разной природы на репродуктивный потенциал человека и животных неразрывно связана с изучением закономерностей их проявления. На сегодняшний день преобладающее количество работ посвящено изучению свойств наноматериалов in vitro на уровне отдельных молекул (селективная адсорбция высокомолекулярных соединений, стабилизация и изменение с их помощью активности ферментов и т.д.) и клеточных культур (выявление механизмов взаимодействия с клеточной мембраной, влияние на экспрессию отдельных генов и т.д.). В то же время, в доступной литературе практически отсутствуют сведения о влиянии различных видов наноматериалов на организменном уровне, в том числе на ткани и органы репродуктивной системы. Специалисты сопровождаться признают, параллельным, что а любая в идеале новая технология опережающим, должна изучением 45 биологических эффектов, возникающих в результате ее масштабного внедрения. В ближайшем будущем нанотехнологиями будет контакт только человечества усиливаться. с наноматериалами Форсированное и развитие наноиндустрии способно в корне изменить современные представления о здоровье, активном возрасте, комфортности и чистоте окружающей среды (Решение Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Актуализирование проблемы здоровья человека и среды его обитания и пути их решения» [Электронный ресурс] / Ю.А. Рахманин. – Москва. – http://www.sysin.ru/assets/files/plenum2011.pdf). 2011 Обсуждаться – должны, URL: прежде всего, биологические эффекты нанотехнологического прогресса, требующие глубокого анализа и междисциплинарных научных дискуссий. Следует отметить, что до настоящего времени отсутствуют стандартизованные индикаторы биоэффектов наночастиц, которые должны учитывать такие характеристики, как площадь поверхности, размер, форма, состав, химическая реактивность. Имеются лишь отдельные сведения об органах-мишенях действия конкретных НЧ. Недостаточно разработаны методы выявления, идентификации и количественного определения НЧ в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биосредах. Изучение биоэффектов наноматериалов должно включать полный комплекс исследований по их проникновению через биологические мембраны и барьеры организма, распределению по органам, накоплению в жировой ткани и различных органах, выведению из организма. Вышеизложенное в полной мере относится к экспериментальной оценке действия исследуемого класса веществ на различные органы и системы, в частности, на состояние репродуктивной системы самок, которому в значительной степени посвящена представленная работа. 46 3. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 3.1. Организация работы Исследование проведено на базе кафедры физиологии, Центра медицинской экологии и нанотоксикологии и Научно-образовательного центра «Нанотехнологии и наноматериалы» ФГБОУ ВПО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина». Животных содержали группами по 5 особей в клетке, самцов отдельно от самок. Клетки были оборудованы стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением, стальным разделителем для корма. На всем протяжении исследования использовался гранулированный корм (сертификат № РОСС RU/ПО81.ВОО.365 ГОСТ 50258-92). Вода в поилках была питьевой, обеззараженной облучением ультрафиолетом. Параметры окружающей среды отслеживались ежедневно на всем протяжении исследования и предполагали контроль температуры и влажности. Фотопериод: 12 ч ночь – 12 ч день при искусственном освещении лампами дневного света. На протяжении всего эксперимента животные содержались в стандартных условиях (ГОСТ Р. 53434-2009 Принципы надлежащей лабораторной практики //М.: Стандартинформ. – 2010»). Карантин составлял 10-14 суток (Сернов, Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии/ Л.Н. Сернов, В.В.Гацура. – М.: ВНЦ БАВ, 2000. – 352 с; Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. чл.-корр. РАМН проф. Р.У. Хабриева. – 2-изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2005. – 832 с). 47 В течение всех этапов исследования были изучены показатели у 93 особей контрольной и 149 особей экспериментальной групп животных. На 1 этапе работы были сформированы 4 экспериментальные группы (n=10), при этом использовали различные дозы УНМ «Таунит»: - группа № 1 – концентрация УНМ «Таунит» в воде для поения – 0,0008 %, что соответствует 1,2 мг/кг массы тела животного; - группа № 2 – концентрация УНМ «Таунит» в воде для поения – 0,004 %, что соответствует 6 мг/кг массы тела животного; - группа № 3 – концентрация УНМ «Таунит» в воде для поения – 0,02 %, что соответствует 30 мг/кг массы тела животного; - группа № 4 – концентрация УНМ «Таунит» в воде для поения – 0,1 %, что соответствует 150 мг/кг массы тела животного; Животные контрольной группы получали обычную питьевую воду. Оценивали характеристики динамику внутренних массы органов. и длины тела, морфологические Продолжительность эксперимента составляла 65 суток. На 2 этапе оценивали влияние углеродного наноматериала «Таунит» на организм мышей при пероральном поступлении путем сравнения ряда показателей у экспериментальной (n=15) и контрольной (n=15) групп животных. Продолжительность эксперимента составляла 45 суток. У подопытных мышей воду для поения заменяли коллоидным раствором УНМ «Таунит». Концентрация раствора составляла 0,3 % по массе в дистиллированной воде, что соответствует 450 мг/кг массы животного, исходя из предварительных экспериментов на других тест-объектах, результатов, полученных на 1 этапе работы и литературных данных о подобных опытах (Гусев, А.А. Влияние углеродных нанотрубок на ранние стадии онтогенеза мышей (Mus Domestica Linnaeus, 1758) / А.А. Гусев, А.В. Емельянов, С.В. Шутова и др. // Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред / Материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Тамбов, 2009. С. 78-79; Горшенѐва, Е.Б. Углеродный наноструктурный материал – 48 перспективный вектор доставки лекарственных препаратов меняет некоторые функциональные показатели самок Mus musculus L. при пероральном введении / Е.Б. Горшенѐва, А.А. Гусев, С.В. Шутова и др. // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. Т. 16, № 1 - Тамбов, 2011.- С. 273-277; Убогов, А.Ю. Углеродные нанотрубки как фактор развития воспалительного процесса в печени мышей / А.Ю. Убогов, И.А. Полякова, А.А. Гусев и др. // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. Т. 16, № 5- Тамбов, 2011.- С. 1338-1343). Оценивались общее состояние, метрические и весовые характеристики, состояние периферической крови, выделительная и поглотительная функции печени, поведенческие реакции, морфологические характеристики (макро- и микроскопическое исследование органов). На следующем этапе работы изучали действие УНМ «Таунит» в дозировке 450 мг/кг на репродуктивную функцию самок и развитие потомства первой генерации. Продолжительность эксперимента составляла 55 суток. Формировались две одновозрастные группы животных (экспериментальная и контрольная), состоящие из 20 половозрелых особей каждая. По завершению карантина самок переводили на поение тестируемым наноматериалом в течение 2 недель. Затем, после несколько суток совместного содержания с неэкспонированными самцами, самок отсаживали в отдельные клетки и возобновляли поступление УНМ «Таунит». Экспериментальных и контрольных животных, в свою очередь, делили на две группы по 10 особей в каждой. Самок первой группы умерщвляли в конце третьей недели беременности и оценивали пред- и постимплантационную смертность эмбрионов, степень развития органов и скелета, массу тела, краниокаудальный размер и количество живых плодов. Во второй группе самок эксперимент завершался после окончания молочного вскармливания потомства. Оценивались размер помета (плодовитость самок), доля неродивших самок, число живых и мертвых особей в потомстве, летальность (в течение 21 суток постнатального развития), масса тела, сроки отлипания ушных раковин, 49 появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, созревание сенсорно-двигательных рефлексов и эмоционально-двигательного поведения, половой состав потомства. На заключительном этапе работы проводили сравнение эффектов перорального поступления УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала, имеющего другую структуру. Были сформированы 3 группы самок белой мыши: одна контрольная (n=10) и две экспериментальных (n=10). Для поения животных экспериментальной группы (№ 1) использовали 0,02 %-й коллоидный раствор УНМ «Таунит», в группе № 2 – 0,02 %-ю суспензию сажи (УНМ). Продолжительность эксперимента – 65 суток. Оценивались метрические и весовые характеристики, морфология внутренних органов. 3.2. Характеристика исследуемого материала Объект исследования – углеродный наноматериал «Таунит» (УНМ «Таунит», многостенные углеродые нанотрубки), производимый в промышленных масштабах ООО «НаноТехЦентр» (г. Тамбов). Материал представляет собой одномерные, наномасштабные, нитевидные образования поликристаллического графита, цилиндрической формы с внутренним каналом, в виде сыпучего порошка черного цвета. Гидрофобен, химически инертен, чистота – более 98 %. Гранулы УНМ микрометрических размеров имеют структуру спутанных пучков многостенных трубок (рисунок 1), способ получения – газофазное химическое осаждение на металлическом катализаторе (ГФХО) или CDC-процесс. УНМ «Таунит» является перспективным материалом для авиационной, атомной и космической промышленности, медицины, фармацевтики, для 50 производства суперкомпьютеров, видеотехники, плоских экранов, мониторов, фильтров широкого назначения. Добавка УНМ «Таунит» улучшает качество смазок, конструкционных композитов, строительных материалов. Гранулы «Таунита» могут служить носителями катализаторов или лекарственных препаратов, также в качестве адсорбентов, источников холодной эмиссии электронов (Ткачев, А.Г. Аппаратура и методы синтеза твердотельных наноструктур: монография / А.Г. Ткачев, И.В. Золотухин. – М.: Машиностроение, 2007. – 316 с). Рисунок 1 – Электронные микрофотографии углеродного наноструктурного материала «Таунит» 3.3. Методы исследования Общее состояние подопытных животных оценивали по внешнему виду, поведенческим реакциям и интегральным показателям (потребление корма и воды). 51 Метрические измерения проводились с помощью штангенциркуля в миллиметрах и включали замеры общей длины тела самок, длину задней правой лапы, хвоста, головы. Весовые измерения. Определяли массу тела белых мышей в начале и в конце эксперимента, а после вскрытия - массу отдельных органов (сердца, легких, ЖКТ, селезенки, матки с яичниками, печени, почек, тимуса, щитовидной железы). Исследование проводили на медицинских электронных весах «Digital scale 300» (Китай) с точностью до тысячных долей грамма. В случае гибели животного внепланово измеряли все параметры и сравнивали их с аналогичными показателями у животных контрольной группы, что позволяло сделать заключение об интегрированной степени благополучности среды обитания (Шварц, С.С. Метод морфофизиологических индикаторов в экологии наземных позвоночных / С.С. Шварц, В.С. Смирнов, Л.Н. Добринский // Тр. Ин-та экологии растений и животных. УФАН СССР. - 1968. - Вып. 58. - 386 с.). О состоянии периферической крови судили по количеству эритроцитов и лейкоцитов (подсчет в камере Горяева), тромбоцитов (подсчет в мазках крови, окрашенных бриллиантовым крезиловым синим), лейкограмме (подсчет в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе), гемоглобина (измерение на гемоглобинометре ГФ-3, Санкт-Петербург), глюкозы (измерение на глюкометре «Accu Сheck Active», Швейцария) (Меньшиков, В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / В.В. Меньшиков. - М.: Медицина, 1987. — 368 с.). Функцию печени изучали методом бромсульфалеиновой (БСФ) пробы (Израйлет, Л.И. Модификация бромсульфалеиновой пробы для изучения функционального состояния печени у крыс / Л.И. Израйлет, В.Н. Соминский, Т.Н. Шибаева // Гигиена и санитария. – 1976. – №. 3. – С. 59-61; Степанова, О.И. Метод взятия крови из малой подкожной вены голени у мышей / О.И. Степанова // Биомедицина. – 2006. - № 2. – С. 137-139). 52 Влияние наноматериала на поведенческие реакции мышей оценивали по спонтанной двигательной активности, которая определялась на актометре «Ugo basile» (Италия), порогу эмоциональных реакций (Сперанский, С.В. Определение суммационно-порогового показателя при различных формах токсикологического эксперимента: методические рекомендации / С.В. Сперанский. - Новосибирск, 1975. - 25 с.), а также в тесте «открытое поле» в течение 3 минут. Тест «открытое поле» является самым распространенным при изучении влияния препаратов на центральную нервную систему и заключается в исследовании двигательного компонента, ориентировочной эмоциональной реактивности животных (Буреш, Я. реакции и Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Джозеф П.Хьюстон. – М.: Высш. школа, 1991. – 399 с.). Самок помещали на площадку размерами 30х30 см, на которой проведенные линии образовывали 36 квадратов. Регистрировали следующие показатели: - горизонтальные перемещения животных (пересечение квадратов; 1 усл.ед. – 1 пересеченный квадрат в «открытом поле»); - вертикальная активность (число вертикальных, пристеночных и свободных стоек; 1 усл.ед. – 1 стойка на площадке «открытого поля»); - груминг (косметическое ухаживание за своим телом) – продолжительность касаний морды лапами – двигательная, эмоциональная и вегетативная составляющие поведения; - исследовательское поведение - посещение норок (число заглядываний в отверстия во внутреннем квадрате; 1 заглядывание – 1 усл.ед.); - вегетативное состояние животных: дефекации (количество болюсов). Морфологические исследования. Для морфологических исследований были взяты от животных всех групп образцы следующих органов: головной мозг, сердце, лимфатические узлы, селезенка, щитовидная и паращитовидная железы, тимус, надпочечники, гипофиз, желудок, тонкий и толстый кишечник, поджелудочная железа, печень, легкие, почки, яичники. Гистологический материал фиксировали в 10 %-м формалине, обезвоживали в серии спиртов 53 возрастающей концентрации и заключали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. При изучении эмбриогенеза в условиях воздействия УНМ «Таунит» показателями служили пред- и постимплантационная эмбриональная смертность, а также анатомические особенности развития. Предимплантационную смертность определяли по разности между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантаций в матке, постимплантационную смертность – по разности между количеством мест имплантаций и количеством живых плодов. Извлеченные плоды взвешивались, определялись их краниокаудальные размеры. Затем проводилась декапитация и висцеральное исследование органов плодов по Стейплсу. После исследования состояния внутренних органов проводилось изучение скелетов плодов модифицированным методом Доусона путем окрашивания ализарином (Онищенко Г.Г., 2007). Изучение репродуктивной функции самок и постнатального развития потомства первой генерации под влиянием УНМ «Таунит». Репродуктивную функцию самок оценивали по количеству мышат в приплоде (плодовитость), доли неродивших самок, числу живых и мертвых детенышей, гибели молодняка (в течение 21 суток постнатального развития) и половому составу потомства. Оценка постнатального развития потомства осуществлялась на мышатах, родившихся от самок обеих групп (не раньше 24 ч. после рождения). Проводилось общее наблюдение за физическим развитием (динамика массы и длины тела с 5 по 23 сутки), биологическим созреванием (срок отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов и открытие глаз); изучение созревания сенсорно-двигательных рефлексов и эмоциональнодвигательного поведения (переворачивание в свободном падении, реакция на акустический стимул, обонятельная реакция, избегание обрыва, переворачивание на плоскости, маятниковый рефлекс, отрицательный геотаксис), ориентировочных и координационных движений (тест «открытое поле» и спонтанная двигательная активность). 54 В обеих группах потомства проводили тесты на различных сроках постнатального развития, соответствующих среднему времени проявления рефлексов. Отрицательный геотаксис. На 7 сутки после рождения мышат помещали на наклонную поверхность (25о) головой вниз. Регистрировали время до разворота животного на 180о. Продолжительность теста – до 1 мин. Маятниковый рефлекс. Тест проводили на 7 сутки после рождения. Определяли количество изменений направления головы и туловища приблизительно на 90о за счет перемещения передних лап, когда задние конечности поджаты и неподвижны. Количество поворотов на 90о и реверсий (изменений направления на обратное) измеряли в течение 1 мин. Переворачивание на плоскости. На 8 сутки после рождения мышат клали на спину на плоской поверхности, быстро отпускали и измеряли время, необходимое для возвращения в нормальное положение. Продолжительность опыта – 30 с. Избегание обрыва. На 9 сутки после рождения мышат клали на стол таким образом, чтобы передние лапы касались края стола. Исход теста считался положительным, если в течение 10 с животное отползало от края стола. Обонятельная реакция. Тест проводили на 11 сутки после рождения. Животное помещали по середине рейки шириной 6 см с делениями, которую клали на клетки. Расстояние между клетками можно было измерять с шагом в 2,5 см. Определяли дистанцию, на которой мышонок правильно выбирал направление на клетку с сибсами и матерью, в которой он содержался перед опытом. Реакция на акустический стимул. На 13 сутки после рождения мышат помещали на небольшую площадку в звукоизолированной клетке. Оценивали наличие или отсутствие реакции животных на акустический стимул длительностью до 0,5 с. Переворачивание в свободном падении. Тест проводили на 20 сутки после рождения. Мышат держали спиной вниз на высоте 60 см над мягкой 55 поверхностью и быстро отпускали. Визуально регистрировали, переворачиваются ли животные в воздухе, чтобы упасть на все 4 лапы. Открытое поле. Тест проводили на 30 сутки после рождения. Мышат помещали на площадку размерами 30х30 см, на которой проведены линии, образующие 36 квадратов. Регистрировали: горизонтальную и вертикальную двигательную активность, груминг, исследовательское поведение (заглядывание в норки). Продолжительность теста – 3 мин. Спонтанная двигательная активность. Тест проводили на 30 сутки после рождения на актометре «Ugo basile» (Италия) в течение 3 минут. 3.4. Методы вариационно-статистического анализа полученных данных Биометрическая обработка полученных данных выполнена на персональном компьютере при помощи пакета программ STATISTICA for Windows 7,0. Использовали методы параметрической и непараметрической вариационной статистики. Методы описательной статистики включали в себя оценку среднего арифметического (М), ошибки среднего значения (m) - для признаков, имеющих непрерывное распределение, а также для частоты встречаемости признаков с дискретными значениями. Определение достоверности различий между качественными показателями сравниваемых групп проводили с помощью критерия χ2 (хи-квадрат) с учетом поправки Йетса для сравнения частот бинарного признака в двух несвязанных группах парных сравнений. Для оценки различий значений количественных показателей в разных группах применяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок и критерий Мана-Уитни (Плохинский, Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский – М.: Изд-во МГУ, 1970. – 367 с.; Коросов, А.В. Компьютерная обработка биологических данных / А.В. Коросов – Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2007 – 76 с.). 56 4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 4.1. Дозозависимые эффекты УНМ «Таунит» на организм самок белых мышей На первом этапе оценивалась динамика массы и длины тела, а также морфологические изменения внутренних органов мышей, в организм которых поступал УНМ «Таунит» в различных концентрациях. Были сформированы 4 экспериментальные группы (n=10), при этом использовали различные дозы УНМ «Таунит»: - группа № 1 – концентрация УНМ «Таунит» в воде для поения – 0,0008 %, что соответствует 1,2 мг/кг массы тела животного; - группа № 2 – концентрация УНМ «Таунит» в воде для поения – 0,004 %, что соответствует 6 мг/кг массы тела животного; - группа № 3 – концентрация УНМ «Таунит» в воде для поения – 0,02 %, что соответствует 30 мг/кг массы тела животного; - группа № 4 – концентрация УНМ «Таунит» в воде для поения – 0,1 %, что соответствует 150 мг/кг массы тела животного. Животные контрольной группы получали обычную питьевую воду. Продолжительность эксперимента составляла 65 суток, в течение которых экспериментальные животные потребляли с питьевой водой УНМ «Таунит». Сравнительная оценка динамики массы тела показала, что в группе с меньшей концентрацией УНМ «Таунит» (1,2 мг/кг) уровень данного показателя был ниже, чем у контрольных и других подопытных животных, начиная с 7 суток и до конца эксперимента (рисунок 2). Масса тела, % 57 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 * * УНМ 1,2 мг/кг УНМ 6 мг/кг УНМ 30 мг/кг * 0 7 14 21 28 УНМ 150 мг/кг 35 42 49 56 63 Сроки эксперимента, сут. Рисунок 2 – Динамика среднегрупповых значений массы тела самок экспериментальных групп по сравнению с контрольной (в %) Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Однако достоверные отличия были зафиксированы только на 28 сутки, когда показатель уменьшился на 7,7 % по сравнению со значениями контрольной группы животных (p<0,05) (рисунок 2). УНМ «Таунит» в дозировке 6 мг/кг (группа № 2) при пероральном поступлении не вызывал значимых (р>0,05) отклонений динамики массы тела, в то же время наблюдалась тенденция к повышеню показателей до 35 суток, с последующим снижением к концу эксперимента (рисунок 2). Масса тела самок белых мышей в группе № 3 (УНМ «Таунит» 30 мг/кг) достоверно не отличалась от контроля (р>0,05), но имела следующую динамику: до 21-28 суток происходило повышение показателей, затем значения находились на уровне контрольных до конца эксперимента (рисунок 2). В экспериментальной группе № 4 (УНМ «Таунит» 150 мг/кг) масса тела самок превышала контрольные значения начиная с 7 суток и до конца эксперимента. На 28 и 63 сутки показатель был выше контроля на 6,0 и 6,2 % соответственно (р<0,05). (рисунок 2). 58 Таким образом, при поступлении в организм УНМ «Таунит» отмечаются дозозависимые изменения в динамике массы тела. Малые дозы УНМ «Таунит» (1,2 мг/кг) оказывают угнетающий эффект, который наиболее выраженно проявляется в снижении массы тела (на 7,7 %) на 28 сутки эксперимента. Увеличение дозы УНМ «Таунит» до 150 мг/кг приводит к интенсивному скачкообразному возрастанию массы тела, которая на 28 и 63 сутки эксперимента достигает максимальных значений (+6,0… +6,2 %) (р<0,05). Следует отметить, что 28-и суточная экспозиция является критической, что выражается в достоверном изменении показателей (р<0,05). Возможно к этому сроку УНМ «Таунит» аккумулируется в достаточном количестве в органах и тканях (рисунок 2). Динамика длины тела самок контрольной и экспериментальных групп представлена на рисунке 3. Длина тела, см 10 вода 9 * * * * * * УНМ 1,2 мг/кг УНМ 6 мг/кг 8 УНМ 30 мг/кг УНМ 150 мг/кг 7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 Сроки эксперимента, сут. Рисунок 3 - Динамика среднегрупповых значений длины тела самок экспериментальной и контрольной групп Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Оценка динамики длины тела выявила увеличение показателя, сходное у всех животных, при этом только в группе № 1 (УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг) длина 59 тела была ниже (-0,23…–0,34 см) (p<0,05), чем у других самок (УНМ 6; 30 и 150 мг/кг), начиная с 28 суток и до окончания эксперимента (рисунок 3). Осмотр экспериментальных животных после эвтаназии показал, что все они нормально упитаны, имеют правильное телосложение, опрятны, волосяной покров и естественные отверстия чисты, органы расположены правильно, свободная жидкость в грудной и брюшной полостях отсутствует. Выраженных визуальных изменений в органах и тканях не обнаружено, за исключением печени, цвет который был темнее у 35 % особей экспериментальной группы животных (рисунок 8). Мышцы сердца и клапаны не изменены. Просветы трахеи и крупных бронхов свободны. Ткань легких воздушная, розового цвета, без признаков отека. Слизистые оболочки желудка, 12-перстной кишки, тонкого и толстого кишечника без изъязвлений и кровоизлияний. Капсула почек снимается легко, на разрезе корковое и мозговое вещество хорошо различимы. Тимус серо-розового цвета, не увеличен. Щитовидная железа розового цвета, хорошо различима паращитовидная железай. Надпочечники без изменений. Оболочки головного мозга не напряжены, извилины хорошо выражены. Половые органы без какихлибо изменений. Для морфологических исследований были взяты от подопытных животных всех групп следующие органы: головной мозг, сердце, лимфатические узлы, селезенка, щитовидная и паращитовидная железы, тимус, надпочечники, гипофиз, желудок, тонкий и толстый кишечник, поджелудочная железа, печень, легкие, почки, яичники. Исследование показало ряд отличий массы внутренних органов животных разных групп. Так, из рисунка 4 видны различия среднегрупповых показателей массы сердца у самок белой мыши в условиях поступления в организм УНМ «Таунит» различных доз. Не смотря на выявление достоверных отличий только в группе № 4 (УНМ 150 мг/кг), значение показателя в которой было выше на 15,6 % (p<0,01), отчетливо прослеживается взаимосвязь дозы вводимого вещества с массой сердца. 60 20 15,61%* Масса сердца, % 15 10 5 0,68% 2,25% 0 -5 -10 -8,99% -15 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 4 – Среднегрупповые характеристики массы сердца мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) Примечание: * - различия достоверны (p<0,01) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Таким образом, при дозе УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг наблюдается тенденция к уменьшению массы сердца на 8,99 %, а дозировка 150 мг/кг вызывает достоверный рост показателя (на 15,6 %) (р<0,01). Возможно, выявленное экспериментальной группы № 4 увеличение массы сердца у самок обусловлено гипертрофией миокарда, что связано с выявленным увеличением массы других внутренних органов (матка с яичниками, желудочно-кишечный тракт, почки), как показали дальнейшие исследования. Так, на рисунке 5 представлены среднегрупповые значения массы лѐгких у самок белой мыши в экспериментальных группах, по отношению к контрольной. 61 7,04 8 6,1 Масса легких, % 6 4 2 0 -2 -4 -3,52 -6 -8 -5,48 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 5 – Среднегрупповые характеристики массы легких мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) В условиях поступления концентраций отклонений в организм УНМ «Таунит» различных в массе легких не выявлено (р>0,05), хотя у экспериментальных животных наблюдалась похожая тенденция: снижение показателя под действием низких доз наноматериала (1,2 мг/кг), с последующей нормализацией (УНМ 6 мг/кг) и увеличением значений (УНМ 30 и 150 мг/кг). На рисунке 6 представлены среднегрупповые значения массы желудочнокишечного тракта (ЖКТ) у самок белой мыши в экспериментальных группах, по отношению к контрольной. При поступлении в организм УНМ «Таунит» в дозировках 30 и 150 мг/кг наблюдается увеличение массы ЖКТ на 16,5 и 15,9 % соответственно (р<0,05). В то же время увеличение массы отмечалось и у особей в группах № 1 и 2, но данные изменения не являлись достоверными (р>0,05). При извлечении ЖКТ у самок экспериментальной группы отмечался выраженный специфический запах, который, возможно, свидетельствует о протекающих бродильных процессах и нарушении микрофлоры толстого кишечника в результате перорального поступления УНМ «Таунит». 62 18 16,5* Масса ЖКТ, % 16 14 15,9* 12,7 12 10 8 6 4,6 4 2 0 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 6 – Среднегрупповые характеристики массы ЖКТ мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Очевидно, что влияние многостенных углеродных нанотрубок проявляется в гипертрофии не только тканей ЖКТ, но и других органов, снабженных гладкой мускулатурой. На рисунке 7 представлены среднегрупповые показатели массы печени самок мышей в условиях поступления в организм УНМ «Таунит» различных доз. В подопытной группе с дозой УНМ 1,2 мг/кг наблюдалось снижение массы данного органа на 13,9 % по сравнению с контрольной (р<0,05). Более высокие концентрации наноматериала вызывали обратный эффект, что проявлялось тенденцией к увеличению массы печени в группах № 2 и 3, соответственно на 1,9 и 2,0 %, однако данные различия не были достоверны. Возможно, некоторое увеличение органа обусловлено возрастанием массы соединительной ткани, либо происходит за счет увеличения ткани паренхимы. Масса печени, % 63 4 2 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 -16 1,93 2 -5,49 -13,9* 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 7 - Среднегрупповые характеристики массы печени мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. У 35% особей экспериментальных групп цвет печени был несколько темнее, чем у животных контрольной группы, что в свою очередь может быть следствием замедления венозного оттока в данном органе (рисунок 8). На рисунке 9 показаны среднегрупповые значения массы почки у самок белой мыши экспериментальных и контрольной групп. При концентрации УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг выявлено снижение массы данного органа на 14,0 % (р<0,05). При дозе УНМ 6 и 30 мг/кг отмечается разнонаправленные сдвиги показателей (р>0,05). В первом случае наблюдается тенденция к увеличению массы на 8,05 %, во втором – к снижению на 4,9 %. Максимальная доза (УНМ 150 мг/кг) вещества оказывает стимулирующий эффект, вызывая повышение значений на 10 % (р<0,05). 64 А Б Рисунок 8 – Печень самки белой мыши при поступлении УНМ «Таунит» Примечание: А – контрольная группа; Б – экспериментальная группа. Основное свойство наноматериалов – это способность к аккумуляции и тропность к различным органам и тканям организма. Так как почки представляют собой основной отдел выделительной системы, возможно, наблюдаемые отличия являются следствием гипо- и гипертрофии, которая в свою очередь развивается за 65 счет изменений в клубочках и извитых канальцах из-за поступления и накопления УНМ «Таунит». 15 Масса почки, % 10,0* 8,05 10 5 0 -5 -4,9 -10 -15 -20 -14,0* 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 9 – Среднегрупповые характеристики массы почки мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. На рисунке 10 представлены среднегрупповые значения массы селезѐнки у самок белой мыши в условиях поступления в организм УНМ «Таунит» различных концентраций. Во всех экспериментальных группах отмечена тенденция к снижению показателей данного органа, по мере увеличения дозы наноматериала. Таким образом, в группах № 1 (УНМ 1,2 мг/кг), № 2 (УНМ 6 мг/кг) и № 3 (УНМ 30 мг/кг) отмечались не достоверное изменение массы селезенки (-6,81…10,25 %) (р>0,05), тогда как концентрация УНМ 150 мг/кг приводила к уменьшению показателей этого органа на 19,45 % (p<0,01), что, возможно, связано с гипотрофией вследствие истощения иммунной системы при ее перенапряжении в ходе адаптационных процессов. 66 Масса селезенки,% 0 -5 -10 -6,81 -10,25 -9,23 -15 -20 -19,45* -25 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 10 - Среднегрупповые характеристики массы селезѐнки мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) Примечание: * - различия достоверны (p<0,01) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. На рисунке 11 представлены среднегрупповые значения массы тимуса в экспериментальных группах. У всех подопытных животных этот показатель имел тенденцию к увеличению, но его динамика не зависела от концентрации УНМ Масса тимуса, % «Таунит» в растворе. 8 7 6 5 4 3 2 1 0 6,7 5,3 5,1 4,2 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 11 - Среднегрупповые характеристики массы тимуса мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) 67 Возможно, некоторое увеличение массы тимуса в экспериментальных группах обусловлено разрастанием соединительной и жировой ткани, которое происходит при поступлении в организм УНМ «Таунит» или является результатом активации иммунной системы. На рисунке 12 приведены среднегрупповые показатели массы щитовидной железы в условиях поступления в организм УНМ «Таунит» различных концентраций. Масса тимуса, % 10 8 6,7 7,7 7,6 5.6 6 4 2 0 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 12 - Среднегрупповые характеристики массы щитовидной железы мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) У подопытных животных всех групп наблюдалась тенденция к увеличению массы данного органа, но полученные результаты не являлись статистически значимыми (р>0,05) и не отражали зависимости от дозы вводимого вещества. Однако мы можем утверждать, что данный орган является щитовидной железой лишь по анатомическому расположению и внешнему строению (рисунок 13), так как реакция с крахмалом не дала должного окрашивания. По-видимому, при поступлении в организм животных МУНТ происходят не только морфологические, но и функциональные изменения тиреоцитов, в результате чего клетки щитовидной железы не усваивают йод, поступающий в организм животного с кормом и питьевой водой. 68 При этом также наблюдалась гипертрофия лимфатических сосудов и узлов, окружающих щитовидную железу. Гипертрофия лимфатических сосудов обусловлена в основном развитием в них пучков гладкой мускулатуры, что наблюдается при застое лимфы и является приспособительной гипертрофией стенок лимфатической системы в условиях ее перегрузки. Рисунок 13 – Щитовидная железа (отмечена стрелкой) самки экспериментальной группы на момент окончания эксперимента Сравнительная оценка среднегрупповых значений массы матки и яичников у самок белых мышей в экспериментальных и контрольной группах показала выраженные отклонения этого показателя от контрольных значений (p<0,001) (рисунок 14). Поступление УНМ «Таунит» вызывает увеличение массы матки с яичниками во всех подопытных группах. При концентрации УНМ 6 мг/кг наблюдается повышение на 63,21 % (p<0,05); УНМ 30 мг/кг - на 65,49 % (р<0,01); УНМ 150 мг/кг – на 56,7 % (р<0,01). 69 70 63,21* 65,49** 56,7** Масса матки с яичниками, % 60 50 40 30 27,5 20 10 0 1,2 6 30 150 Концентрации УНМ "Таунит", мг/кг Рисунок 14 - Среднегрупповые характеристики массы репродуктивных органов (матки с яичниками) мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной Примечание: * - различия достоверны p<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Таким образом, в результате поступления в организм УНМ «Таунит» в различных концентрациях у самок белой мыши наблюдается дозозависимое изменение показателей массы сердца, ЖКТ, печени, почек, в виде снижения при низких и увеличении - при высоких дозах вещества. Обратная зависимость наблюдается в отношении селезенки, масса которой уменьшается, по мере возрастания концентрации УНМ «Таунит» до 150 мг/кг. 70 4.2. Анатомо-морфологические изменения у белых мышей при воздействии УНМ «Таунит» 4.2.1. Морфометрические показатели тела Для дальнейшего исследования эффектов УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в организм самок белых мышей нами использовалась дозировка 450 мг/кг, исходя из предварительных экспериментов на других тест-объектах, результатов, полученных на 1 этапе работы и литературных данных о подобных опытах (Гусев, А.А. Влияние углеродных нанотрубок на ранние стадии онтогенеза мышей (Mus Domestica Linnaeus, 1758) / А.А. Гусев, А.В. Емельянов, С.В. Шутова и др. // Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред / Материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Тамбов, 2009. - С. 78-79; Горшенѐва, Е.Б. Углеродный наноструктурный материал – перспективный вектор доставки лекарственных препаратов меняет некоторые функциональные показатели самок Mus musculus L. при пероральном введении / Е.Б. Горшенѐва, А.А. Гусев, С.В. Шутова и др. // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. Т. 16, № 1 - Тамбов, 2011.- С. 273-277; Убогов, А.Ю. Углеродные нанотрубки как фактор развития воспалительного процесса в печени мышей / А.Ю. Убогов, И.А. Полякова, А.А. Гусев и др. // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. Т. 16, № 5- Тамбов, 2011.- С. 1338-1343). Исследование показало, что суточное потребление сухого корма и воды подопытными животными при поступлении в организм УНМ «Таунит» (450 мг/кг) не отличалось от показателей контрольной группы (р>0,05). На рисунке 15 представлены среднегрупповые значения метрических характеристик самок белых мышей. 71 90 82,2 87,3 88,4 89,0 Длина, мм 80 59,3 60,0 70 60 50 28,7 28,8 40 16,2 16,3 30 20 10 0 хвост туловище вода Рисунок 15 – голова тело задняя правая лапа УНМ "Таунит" 450 мг/кг Метрические характеристики белых мышей экспериментальной и контрольной групп на 45 сутки исследования Таким образом, на момент окончания эксперимента у подопытных животных показатели длины хвоста (87,3±1,42 мм), туловища (60±2,5 мм), головы (28,9±1,2 мм), тела (89±3,7 мм) и задней правой лапы (16,3±0,3) не отличались от соответствующих характеристик (хвост - 82,2±0,7 мм; туловище - 59,3±1,4 мм; голова - 28,7±0,4 мм; тело - 88,4±1,5 мм; задняя правая лапа - 16,2±0,1 мм) контрольных животных (p>0,05). В то же время, среднегрупповые значения массы тела самок белых мышей в момент окончания эксперимента имели межгрупповые отличия: в экспериментальной группе она составили 26,73±1,16 г., а в контрольной группе были ниже - 23,99±0,63 г. (p<0,05) (рисунок 16). Таким образом, отмечено значимое (на 2,7 г.) увеличение массы тела самок белых мышей в условиях поступления в организм УНМ «Таунит» (450 мг/кг), которое, как показали дальнейшие исследования, обусловлено увеличением массы внутренних органов экспериментальных животных. 72 29 26,7* 27 25 24,0 вода 23 21 УНМ "Таунит" 450 мг/кг 19 17 15 Масса тела, г Рисунок 16 – Масса тела мышей экспериментальной и контрольной групп Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе На рисунке 17 представлены среднегрупповые значения массы внутренних органов (в %) мышей экспериментальной группы по отношению к контрольной. Показано, что в подопытной группе выше, чем в контрольной масса тела (+12,8 %, p<0,05), сердца (+28,6 %, p<0,01), ЖКТ (+31,2 %, p<0,05), почек (+20 %, p<0,05) и репродуктивных органов (матки с яичниками) (+65,7 %, p<0,001). Однако, масса селезѐнки в экспериментальной группе была значительно снижена (на 45,8 %) (р<0,01). 73 80% 65,70*** 60% тело 40% 20% 28,60** 12,80* сердце 31,20* легкие 20,00** 12,50 8,70 4,00 6,50 ЖКТ селезенка матка с яичниками 0% печень -20% почка тимус -40% щитовид.железа -45,80** -60% Рисунок 17 – Среднегрупповые характеристики (в %) массы тела и внутренних органов мышей экспериментальной группы по отношению к контрольной Примечание: * - различия достоверны p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. 4.2.2. Гистологическая картина паренхиматозных органов По завершении эксперимента было проведено гистологическое исследование паренхиматозных органов животных. Материал фиксировали в 10% забуференном формалине, осуществляли обработку в процессоре Tissue-Tek японской фирмы «Sakura», заливали в парафин для приготовления блоков, из которых производили по 4-5 срезов толщиной 5-7 мкм. При микроскопическом исследовании внутренних органов мышей, которые получали МУНТ, наибольшие изменения были обнаружены в ткани печени 74 (рисунок 18). У всех мышей получавших УНМ «Таунит» (450 мг/кг) с питьевой водой отмечалась инфильтрация печѐночной паренхимы, чего не наблюдалось в контрольной группе животных. Так, при дозировке УНМ «Таунит» 450 мг/кг была отмечена очаговая инфильтрация портальных трактов лимфоидными клетками в количестве до 200250 клеток (рисунок 18). А Б Рисунок 18 – Микропрепарат печени самки белой мыши при поступлении УНМ «Таунит» Примечание: А – экспериментальная группа; Б – контрольная группа 12 человек 75 Происходило разрушение пограничной пластинки, вследствие чего границы инфильтрата становились размытыми. В гепатоцитах отмечены значительные изменения с появлением вакуолей в цитоплазме. Учитывая высокие компенсаторные возможности печени, можно сделать вывод о достаточно выраженном эффекте УНМ «Таунита» в отношении ткани данного органа. Проведенные гистологические исследования так же показали следующее. В экспериментальной группе: - головной мозг, мозжечок, гипофиз – венозное полнокровие соответственно у 1, 2 и 2 животных; - лимфоузел – фолликулы с реактивными центрами, макрофагальная реакция синусов, фолликулов у всех мышей; - тимус – макрофагальная реакция у 4 мышей, у 2 - стертость границ между корковым и мозговым слоем; - щитовидная железа и сердце – незначительные изменения в строме у 4 и 1 животных; - легкие – умеренное полнокровие; - желудок – очаговая лимфоидная инфильтрация слизистой оболочки у 2 животных; - поджелудочная железа – изменения отсутствуют; - почка – незначительныелокальные изменения в интерстициальной ткани у 2 мышей; - надпочечник – умеренное венозное полнокровие мозгового слоя в 1 случае; - селезенка – размытость контуров фолликулов у 3 мышей (рисунок 19). В контрольной группе обнаружено умеренное полнокровие ткани легкого у 3 мышей. Строение остальных внутренних органов не изменялось. 76 А Б Рисунок 19 – Микропрепарат селезенки самки белой мыши при поступлении УНМ «Таунит» (стрелкой обозначен лимфатический фолликул с реактивным центром, окраска гематоксилином и эозином. х 60) Примечание: А – экспериментальная группа; Б – контрольная группа. Микроскопическое исследование яичников показало у 2 самок экспериментальной группы слабое венозное полнокровие, у контрольных животных изменений данного органа не было выявлено. У всех самок в контрольной и экспериментальной группах в корковом веществе яичников хорошо визуализируются группы примордиальных фолликулов, многочисленные растущие фолликулы, а также единичные граафовы пузырьки и атретические 77 тела. Тека-клетки крупные, со светлой цитоплазмой, формируют скопления с нечеткими очертаниями (рисунок 20). А Б Рисунок 20 – Микропрепарат яичника самки белой мыши при поступлении УНМ «Таунит» Примечание: А – экспериментальная группа; Б – контрольная группа. Покзано, что поступление УНМ в организм подопытных животных не приводило к значительным изменениям в гаметогенезе. Таким образом, у самок опытной группы наблюдались умеренные или слабо выраженные изменения в виде венозного полнокровия. У всех мышей экспериментальной группы отмечены реактивные изменения иммунных органов (макрофагальная реакция фолликулов и синусов лимфоузлов, селезенки (рисунок 78 19) и коркового слоя тимуса, стертость границ между корковым и мозговым слоями в тимусе, размытость контуров фолликулов селезенки). 4.3. Состояние периферической крови и печени мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит» При поступлении в организм экспериментальных животных УНМ «Таунит» в периферической крови мышей не изменялось большинство оцениваемых показателей - количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина (таблица 1). Таблица 1 – Показатели крови белых мышей при поступлении УНМ «Таунит» в организм в течение 45 суток (М±m) Гемоглобин, Эритроци- Тромбоци- Лейкоциты Группа г/л ты, x1012/л ты, x109/л x109/л животных Экспериментальная 134,6±5,0 6,6±0,9 423,6±13,7 15,8±1,8 (n=15) УНМ 450 мг/кг Контрольная 130,8±4,9 6,1±0,8 428,2±15,9 14,0±2,1 (n=15) Отмечались изменения в лейкоцитарной формуле в сторону повышения уровня лимфоцитов на 5,9 % (p<0,01) и нейтрофильный сдвиг в сторону снижения количества сегментоядерных форм на 5,1 % (p<0,01) в экспериментальной группе мышей по сравнению с соответствующими показателями в контроле (таблица 2). Полученные данные могут свидетельствовать о возможной при пероральном введении УНМ «Таунит» (450 мг/кг) активации иммунной системы 79 мышей, что также подтверждают результаты макро- и микроскопических исследований иммунных органов, как показано далее. Таблица 2 – Показатели лейкоцитарной формулы при поступлении в организм мышей УНМ «Таунит» (через 45 суток) (М±m) Группа животных Нейтрофилы, % п/я с/я Лимфоциты Моноциты Эозино% % филы, % Экспериментальная (n=15) 5,2±0,08 0,3±0,13 0 30,9±3,72* 63,6±4,22* УНМ «Таунит» 450 мг/кг Контрольная 5,3±0,09 35,0±3,10 57,7±3,48 0,2±0,03 0 (n=15) Примечание: * - различия достоверны (p<0,01) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Исследование функции печени подопытных мышей с помощью пробы с бромсульфалеином (БСФ) показало, что поступление УНМ «Таунит» (450мг/кг) в организм не влияло на выделительно-поглотительную и белоксинтезирующую функции печени экспериментальных животных (таблицы 3 и 4). Таблица 3 – Состояние поглотительной и выделительной функции печени белых мышей при воздействии УНМ «Таунит» (М ± m) Группа животных Экспериментальная (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (n=15) Контрольная (n=15) Ретенция БСФ в крови, (%) Через 45 суток Через 14 суток 6,15±0,37 5,93±0,32 5,80±0,29 5,74±0,29 80 Таблица 4 – Влияние поступления в организм мышей УНМ «Таунит» на концентрацию общего белка (г/л) в пуле сывороток крови (М ± m) Группа животных Экспериментальная (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (n=15) До начала эксперимента 72,08±3,22 Через 14 суток Через 45 суток 70,38±3,26 73,60±4,39 Контрольная 72,65±4,3 71,51±2,86 72,60±2,51 (n=15) Бромсульфалеиновая проба также является универсальным методом по оценке состояния паренхимы печени. Как видно из таблиц 3 и 4, показатели ретенции БСФ не отличаются в исследуемых группах самок (p>0,05), что свидетельствует об отсутствие каких-либо изменений в функционировании печени мышей. Одним из параметров при оценке состояния поджелудочной железы является уровень глюкозы в пуле сыворотки крови. Полученные результаты свидетельствуют, что данный показатель не отличался у контрольных и экспериментальных самок (p>0,05). Тем не менее, наблюдалась тенденция к повышению уровня глюкозы у мышей подопытной группы на 14 сутки и к концу эксперимента (таблица 5). Таблица 5 – Влияние поступления в организм мышей УНМ «Таунит» на концентрацию глюкозы (ммоль/л) в пуле сывороток крови (М ± m) Группа животных Экспериментальная (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (n=15) Контрольная (n=15) До начала Через 14 суток эксперимента 5,24±0,31 5,41±0,35 5,27±0,32 5,22±0,22 Через 45 суток 5,44±0,36 5,31±0,33 81 4.4. Влияние УНМ «Таунит» на поведенческие реакции белых мышей Изучение функционального состояния нервной системы подопытных животных оценивалось по поведенческим реакциям, а именно: спонтанной двигательной активности, отражающей уровень тревожного состояния; порогу эмоциональных реакций, который характеризует соотношение процессов возбуждения и торможения в нервной системы, а также тесту «открытое поле», раскрывающему двигательную, ориентировочную и эмоциональную составляющие поведения. Полученные результаты свидетельствуют о том, что поступление УНМ «Таунит» в течение 2 недель в организм мышей приводит к повышению спонтанной двигательной активности, что проявляется в увеличении количества локомоций в экспериментальной группе самок на 32,6 % (p<0,01) по сравнению с животными контрольной группы (таблица 6). Таблица 6 – Влияние поступления в организм мышей УНМ «Таунит» на спонтанную двигательную активность животных (М ± m) Группа животных Количество локомоций, усл.ед. До начала эксперимента 222,4±11,0 Через 14 суток Через 45 суток Экспериментальная 204,7±12,8 298,1±10,4* (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (n=15) Контрольная 206,7±13,4 201,1±9,6 212,5±8,3 (n=15) Примечание: * - различия достоверны (p<0,01) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. В то же время, отмечалось снижение порога эмоциональных реакций на 26,4 % (p<0,05), что потенциирует процессы возбуждения в нервной системе 82 подопытных мышей (таблица 7). Таблица 7 – Влияние поступления в организм мышей УНМ «Таунит» на порог эмоциональных реакций (М ± m) Группа животных Порог эмоциональных реакций, вольт До начала Через 14 суток эксперимента 12,4±0,8 8,9±0,4* Через 45 суток Экспериментальная 13,7±0,4 (УМН «Таунит» 450 мг/кг) (n=15) Контрольная 13,9±0,9 12,1±0,5 12,0±0,9 (n=15) Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. К концу 45 суток поступления УНМ «Таунит» количество локомоций и порог эмоциональных реакций у мышей подопытной группы не отличались от контроля (р>0,05), но прослеживалась тенденция к их изменению в сторону угнетения спонтанной двигательной активности и возбудимости. Как известно, поведение животных в тесте «открытое поле» характеризует их двигательную ориентировочную активность, исследовательское поведение и эмоциональное состояние. Проведенные исследования через 45 суток от начала эксперимента показали отсутствие значимых отличий по большинству показателей теста, за исключением параметра общей двигательной активности, уровень которой был ниже у мышей экспериментальной группы (таблица 8). Ориентировочно-исследовательское поведение мышей в тесте «открытое поле» по показателю «вертикальные стойки» раскрывает мотивационную составляющую. Установлено, что поступление в организм УНМ «Таунит» не влияет на вертикальную и горизонтальную двигательную активность, а соответственно и мотивацию животных. Разновидностью ориентировочно-исследовательского поведения мышей является показатель норкового рефлекса, который свидетельствует о способности животного исследовать «открытое поле», в частности, заглядывать в норки. 83 Исследование показало, что потребление мышами УНМ «Таунит» не изменяет проявления норкового рефлекса относительно показателя контрольной группы животных. Таблица 8 – Влияние поступления в организм мышей УНМ «Таунит» на поведенческие показатели мышей в тесте «открытое поле» через 45 суток от начала эксперимента (М ± m) Поведенческий показатель Контрольная группа (n=15) Экспериментальная группа (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (n=15) 31,4 ± 4,7 Пересеченные квадраты 36,5 ± 4,6 (горизонтальная активность), усл.ед. Стойки (вертикальная активность), 7,7 ± 1,2 6,4 ± 0,6 усл.ед. Груминг, усл.ед. 5,1 ± 1,2 4,0 ± 0,8 Норки, усл.ед. 3,5 ± 0,9 2,4 ± 0,4 Общая двигательная активность, 53,0 ± 6,8 44,0 ± 6,4* усл.ед. Дефекации, количество болюсов 0,9 ± 0,1 1,4 ± 0,3 Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Груминг (косметическое поведение) мышей является важной характеристикой поведения животных в «открытом поле», тесно коррелируя с двигательной активностью. Результаты свидетельствуют о том, что в условиях поступления УНМ «Таунит» в организм мышей данный показатель не изменяется. Не выявлено достоверных различий и по количеству дефекаций, что отражает отсутствие существенных изменений эмоционального состояния и вегетативных функций подопытных животных. Однако следует отметить, что, несмотря на отсутствие достоверных отличий, в целом параметры теста «открытое поле» в экспериментальной группе были несколько ниже, а уровень общей двигательной активности оказался 84 меньше на 16 % (p<0,05) у мышей, в организм которых поступал УНМ «Таунит», по сравнению с соответствующим показателем контрольной группы животных. Таким образом, при перорально введении УНМ «Таунит» существенно не изменяет поведение мышей в «открытом поле», однако через 45 суток его потребления наблюдается снижение общей двигательной активности на 16 % (р<0,05) и тенденция к снижению показателей исследовательского поведения. 4.5. Особенности репродуктивной функции самок белых мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит» Влияние поступления в организм УНМ «Таунит» на репродуктивную систему самок белой мыши представлено на рисунке 21. При оценке плодовитости самок, было установлено, что в контрольной группе количество молодняка в помете (6,0±0,15 шт.) было меньше, чем в экспериментальной (9,3±0,14 шт.) (p<0,05). Таким образом, при поступлении в организм углеродного наноматериала «Таунит» у самок мышей наблюдается повышение плодовитости. Так же, обращал на себя внимание низкий уровень смертности в потомстве подопотных животных. Из рисунка 22 видно, что доля гибели молодняка в помете экспериментальных самок оказалась ниже (15 %), чем в контроле (27 %) (p<0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что при поступлении в организм самок мышей УНМ «Таунит» во время беременности и периода молочного вскармливания наблюдается снижение смертности молодняка в течение первых 21 суток постнатального развития. 85 9,3±0,14* 10 9 вода 8 6,0±0,15 7 6 УНМ "Таунит" 450 мг/кг 5 4 3 Плодовитость самок, шт. Рисунок 21 – Среднегрупповые характеристики плодовитости самок белых мышей экспериментальной и контрольной групп Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. 45 40±1,9 40 33±1,5 35 30 27±1,1 вода 25 20 УНМ "Таунит" 450 мг/кг 15±0,9* 15 10 5 0 гибель молодняка доля неродивших самок Рисунок 22 – Доля (%) неродивших самок и погибшего молодняка (%) в течение 21 суток постнатального развития в экспериментальной и контрольной группах мышей Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) соответствующим показателем в контрольной группе. по сравнению с 86 На рисунке 22 также приведена доля неродивших самок белых мышей, которая в контрольной группе составляет 40 %, в экспериментальной – 33 %. Таким образом, можно предположить, что в условиях поступления УНМ «Таунит» в организм самок имеет место тенденция к повышениею частоты наступления беременности. На рисунке 23 представлен половой состав потомства первого поколения самок мышей экспериментальной и контрольной групп. 41 %* Самцы 59 %* Самки А Самцы 40% 60% Самки …..Б Рисунок 23 – Распределение потомства белых мышей по полу Примечание: А – экспериментальная группа; Б – контрольная группа; * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. 87 Доля самцов в приплоде экспериментальной группы оказалась ниже (41 %), чем в контрольной (60 %) (p<0,05). Таким образом, УНМ «Таунит», поступающий в организм самок во время беременности, вызывает уменьшение доли самцов в потомстве первой генерации, что согласно теории В.А. Геодакяна свидетельствует об экстремальных и неблагоприятных условиях окружающей среды (Геодакян, В. А. Дифференциальная смертность и норма реакции мужского и женского пола / В.А. Геодакян // Журн. общ. биологии, - 1974. - Т. 35. - № 3 – С. 376-385). В целом результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что под воздействием УНМ «Таунит» у белых мышей уменьшается количество неродивших самок, снижается смертность молодняка, также возрастает количество особей в приплоде, их весоростовые показатели. Кроме того, видимо, влияние УНМ «Таунит» на репродуктивную функцию мышей, проявляющееся увеличением в потомстве доли самок, является индикатором воздействия среды обитания (Геодакян, В. А. Дифференциальная смертность и норма реакции мужского и женского пола / В.А. Геодакян // Журн. общ. Биологии. - 1974. - Т. 35. - № 3 – С. 376-385). В условиях поступления многостенных углеродных нанотрубок у самок белых мышей не выявлено значимых отличий в эмбриогенезе в сравнении с контрольной группой (таблица 9). Пред- и постимплантационная смертность у экспериментальных и контрольных особей не отличалась (р>0,05). Однако в подопытной группе можно отметить тенденцию к увеличению количества живых плодов (7,9±0,3), по сравнению с контролем (6,9±0,2) (таблица 9), что согласуется с полученными ранее данными при изучении плодовитости самок (9,3±0,14*) (рисунок 21). Внешне плоды выглядели одинаково, у всех имелись правильно сформированные голова, туловище, конечности и хвост. Грудная клетка и передняя брюшная стенка имели обычную форму. Сердце располагалось в обычном месте, все камеры и перегородки его были сформированы; однако при вскрытии в правой половине определялись сгустки крови. Отчетливо была видна 88 аорта, подключичные артерии, общая сонная и легочная артерии. Легкие белого цвета, спавшиеся. Трахея сформирована, с четко выраженным просветом. Пищевод проходим. Диафрагма сформирована. Печень занимала весь верхней этаж брюшной полости, больше справа, имела красно-коричневый цвет, мягкоэластической консистенции. На разрезе отмечалось полнокровие. Таблица 9 – Показатели эмбриогенеза при поступлении в организм мышей УНМ «Таунит» (M±m) Группа животных Предимплантационная смертность Экспериментальная (УНМ «Таунит» 450 3,0±0,2 мг/кг) (n=10) Контрольная 4,2±0,2 (n=10) Постимплантационная смертность Кол-во Краниоживых каудальный плодов размер, см Масса плодов, г 2,0±0,2 7,9±0,3 1,0±0,03 0,7±0,04 2,4±0,2 6,9±0,2 1,2±0,04 0,8±0,04 Кишечник сформирован. Петли толстого и тонкого кишечника лежали отдельно, белого цвета. Поджелудочная железа сформирована, белого цвета, мягко-рыхлой консистенции. Почки определялись в забрюшинном пространстве, бобовидной формы, эластической консистенции. Чашечно-лоханочная система на разрезе сформирована. Мочеточники и мочевой пузырь сформированы. Половые органы не сформированы. При изучении состояния окрашенных ализарином скелетов плодов видимых изменений развития и различий между группами животных, родившихся от мышей различных групп, не обнаружено. Кости лицевого и мозгового черепа сформированы симметрично, типичной формы. Между костями черепа четко наблюдаются большой и малый роднички. Шов между теменными костями не сформирован, поэтому визуально роднички сливаются в единое пространство. Зачатки носовых костей и верхней челюсти сформированы симметрично, зачатки нижней челюсти представлены в виде симметричных трубчатых костей, глазницы правильной формы. Позвоночник представлен в виде тяжа симметрично расположенных зачатков окостенения 89 отростков позвонков по сторонам спинномозгового канала. Зачатки окостенения тел позвонков наблюдаются в виде отдельных ядер. Ребра представлены в виде симметрично расположенных участков окостенения с типичными местами отхождения от позвоночника, изменений развития не выявлено. Пояс верхних конечностей представлен симметрично расположенными зачатками лопаток и ключиц. Пояс нижних конечностей выглядит в виде зачатков тазовых костей в типичном для них месте. Кости плеча, предплечья, бедра и голени представлены окостенения костей зачатками запястья и окостенения плюсны трубчатых видны в костей. виде Точки симметрично расположенных ядер, в количестве 9,26±1,4 у плодов контрольной группы и 10,0±1,6 – экспериментальной группы (р>0,05). Таким образом, можно констатировать, что УНМ «Таунит» не влияет на эмбриогенез; не вызывает постимплантационной гибели, задержки развития плодов, анатомических изменений, в том числе костной системы. 4.6. Постнатальное развитие потомства первой генерации белых мышей, подвергшихся воздействию УНМ «Таунит» Изучение влияний УНМ «Таунит» на постнатальное развитие потомства F1 генерации проводили на мышатах, родившихся от самок контрольной и экспериментальной групп. Результаты исследований представлены в таблице 10. Наблюдения за физическим развитием потомства мышей обеих групп в течение 21 суток позволило заключить, что по числу живых и мертвых новорожденных, срокам отлипания ушей, прорезывания резцов, открытия глаз и появления первичного волосяного покрова достоверных различий между экспериментальной и контрольной группами не наблюдалось. В то же время, 90 обнаружены отличия по среднему размеру помета, гибели молодняка, количеству самок и самцов в потомстве (p<0,05). Таблица 10 – Физическое развитие потомства мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит» (M±m) Показатель Контрольная группа (n=38) Экспериментальная группа (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (n=64) 64 100 0 9,3±0,14* Всего мышат в группе, шт. 38 Число живых новорожденных, % 100 Число мертвых новорожденных, % 0 Средний размер помета, шт. 6,0±0,15 Средний срок отлипания ушей, 2,17±0,28 2,14±0,24 сут. Средний срок появления первичного волосяного покрова, 5,17±0,56 5,29±0,61 сут. Средний срок прорезывания 10,50±0,50 10,57±0,61 резцов, сут. Средний срок открытия глаз, сут. 14,83±0,83 14,29±0,61 Постнатальная гибель молодняка 27 15* (в течение 21 сут.), % Кол-во самок в 35 59* потомстве, % Кол-во самцов в потомстве, % 65 41* Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) относительно показателя контрольной группы Анализ результатов тестов «отрицательный геотаксис» и «маятниковый рефлекс» показал отсутствие различий между контрольной и экспериментальной группами (p>0,05) (таблица 11). Не выявлено разницы и в тесте «переворачивание на плоскости» у мышат родившихся от экспериментальных и контрольных самок, что свидетельствует о своевременном формировании у них данного рефлекса. 91 Такие «качественные» тесты, как «избегание обрыва», «реакция на акустический стимул» и «переворачивание продемонстрировали, что в обеих группах в свободном падении» потомства данные рефлексы сформировались у всех мышат вовремя, на 9, 13 и 20 сутки соответственно, различий между группами животных не наблюдалось. Таблица 11 двигательное Сенсорно-двигательные рефлексы и эмоционально- поведение потомства мышей экспериментальной и контрольной групп (M±m) Показатели Маятниковый рефлекс, кол-во реверсий Отрицательный геотаксис, с. Переворачивание на плоскости, с. Обонятельный рефлекс, см. Спонтанная двигательная активность, усл.ед. Контрольная группа (n=38) 30,75±2,92 Экспериментальная группа (n=64) 32,78±3,01 20,15±1,92 6,50±0,97 17,25±1,58 235,6±10,3 18,98±2,51 5,70±0,91 16,50±1,65 249,8±9,7 Результаты тестов «обонятельная рефлекс» и «спонтанная двигательная активность» также свидетельствуют об отсутствии значимых различий между показателями групп животных (таблица 11). Согласно тесту «открытое поле», потомство от экспериментальных самок не отличалось по двигательной активности от потомства контрольных особей (таблица 12). Таким образом, наноматериал «Таунит» самок белых мышей во время при поступлении в организм беременности и в период молочного вскармливания приплода не влиял отрицательно на физическое развитие, сроки созревания сенсорно-двигательных рефлексов и эмоционально-двигательное поведение потомства первой генерации. 92 Таблица 12 – Результаты оценки развития потомства мышей экспериментальной и контрольной групп по показателям теста «открытое поле» (M±m) Поведенческий показатель Контрольная группа (n=38) Пересеченные квадраты (горизонтальная активность), усл.ед. Стойки (вертикальная активность), усл.ед. Груминг, усл.ед. Норки, усл.ед. 42,6 ± 2,1 Экспериментальная группа (УНМ «Таунит» 450 мг/кг) (n=64) 47,4 ± 4,0 7,7 ± 1,2 6,9 ± 0,9 8,7 ± 1,3 2,9 ± 0,5 9,4 ± 1,8 3,4 ± 1,0 Динамика массы тела потомства самок контрольной и экспериментальной групп представлена на рисунке 24. 8 7,2* 7 6,5* 5,8* Масса тела, г. 6 5 4,0* 4 3 2 4,5* 4,8* 5,1* 5,3* 4,5 4,7 3,5* 3,0* 3,6 2,8 3,2 3,6 3,7 3,8 УНМ "Таунит" 450 мг/кг 4,1 вода 2,3 1 0 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 Сроки эксперимента, сут. Рисунок 24 - Среднегрупповые характеристики динамики массы тела у потомства первой генерации самок контрольной и экспериментальной групп Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. 93 Можно отметить, что масса тела мышат экспериментальной группы с 5 по 23 сутки постнатального развития превышала аналогичный показатель в контроле (р<0,05). Все мышата быстро набирали массу. Возможно, присутствие в среде УНМ «Таунит» влияет на развитие белой мыши на ранних этапах онтогенеза, что проявляется увеличением массы тела и ее выраженной динамикой. Межгрупповые различия в первые сутки постнатального развития обусловлены внутриутробным влиянием УНМ «Таунит» в результате его беспрепятственного прохождения через ткани плаценты. Кривые динамики изменения массы тела до 11 суток идут практически параллельно, а затем заметно расходятся. Это связано с тем, что примерно на 11 сутки развития мышата начинают самостоятельно передвигаться, и, соответственно, имеют доступ к коллоидному раствору УНМ «Таунит», который используется для поения экспериментальных самок. К концу 3 недели постнатального развития метрические показатели потомства экспериментальных животных (длина хвоста - 59,8±1,5 мм.; туловища 37,9±2,0мм.; головы - 22,5±1,1 мм. и задней правой лапы - 16,5±0,4 мм. не отличались от параметров в контроле (хвост - 53,9±2,8 мм.; туловище - 30,9±1,9 мм.; голова - 21,1±1,3 мм.; задняя правая лапа - 14,5±1,0 мм.). Однако показатель общей длины тела у потомства подопытной группы (60,4±1,3 мм.) по сравнению с контрольной (52,0±1,5 мм.) был выше (р<0,05) (рисунок 25). В целом наблюдалась тенденция к увеличению всех метрических характеристик у животных экспериментальной группы, что, видимо, вызвано поступлением в организм УНМ «Таунит» в течение внутриутробного и постнатального развития мышей. 94 70 60 60,4* 59,8 53,9 52,0 Длина, мм 50 37,9 40 30,9 30 22,5 21,1 16,5 14,5 20 10 0 хвост туловище голова УНМ "Таунит" 450 мг/кг тело задняя правая лапа вода Рисунок 25 - Метрические характеристики потомства первого поколения самок белой мыши контрольной и экспериментальной групп (21 сутки постнатального развития) Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. По достижению половозрелого возраста мышат умерщвляли, после чего проводилось морфологическое исследование внутренних органов. У всех животных экспериментальной группы определяли массу сердца, легких, ЖКТ, селезенки, печени, почек, тимуса, семенников и матки с яичниками, с последующим сравнением данных показателей с контрольными (рисунок 26). В потомстве самок экспериментальной группы показано увеличение массы тела (на 37,3 %) и всех исследуемых органов, а именно: сердца (на 30,1 %), легких (на 53,2 %), ЖКТ (на 33,3 %), селезѐнки (на 20,0 %), печени (на 29,0 %), почек (на 40,3 %), тимуса (на 57,3 %), семенников (на 53,8 %), матки с яичниками (на 61,9 95 %) по сравнению с аналогичными показателями потомства контрольной группы самок (р<0,05…0,01). 61,9** 65 53,8* 53,2* 55 Масса, % 40,3* 37,3** 25 тело сердце 45 35 57,3* 30,1* легкие ЖКТ 33,3* 29,0* 20,0* 15 5 селезенка семенники матка с яичниками печень почки тимус -5 Рисунок 26 - Среднегрупповые характеристики массы тела и внутренних органов у мышей экспериментальной группы (%) по отношению к контрольной Примечание: * - различия достоверны p<0,05; ** - р˂0,01 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. Таким образом, УНМ «Таунит» (450 мг/кг), поступая в организм на стадии его формирования и развития, приводит к увеличению массы и длины тела, а также внутренних органов. К тому же, морфофункциональные изменения у потомства экспериментальной группы оказались более выраженными, по сравнению с эффектами у самок, в организм которых УНМ «Таунит» поступал уже в половозрелом возрасте, как показано ранее (рисунок 17). 96 4.7. Сравнительная оценка биоэффектов УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала другой структуры Для сравнения эффектов перорального поступления УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала, имеющего другую структуру, мы использовали суспензию сажи. Для поения особей в группе № 1 был взят УНМ «Таунит» в концентрации 0,02 % по массе в дистиллированной воде. Концентрация сажи в приготовленной суспензии составляла 0,02 % (группа № 2). Для поения контрольной группы использовали питьевую воду. Первоначально оценивали динамику массы тела у исследуемых групп самок (рисунок 27). 27,5 Масса тела, г. 27 * 26,5 * 26 ∞ ∞ вода 25,5 УНМ "Таунит" УНМ сажа 25 24,5 24 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 Сроки эксперимента, сут. Рисунок 27 - Динамика среднегрупповых значений массы тела самок белых мышей в контрольной и экспериментальных группах Примечание: * - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе; ∞ - различия достоверны (p<0,05) по сравнению с соответствующим показателем в группе № 1 (УНМ «Таунит»). 97 Как показано на рисунке 27, до 35 суток эксперимента масса тела у исследуемых групп самок изменялась однонаправленно. В более поздние сроки наблюдались разнонаправленные сдвиги. В подопытной группе № 1 (УНМ «Таунит») отмечалась тенденция к снижению величины показателей относительно уровня контроля, однако достоверные отличия отсутствовали. В группе № 2 на 56-е и 63-е сутки эксперимента масса тела увеличилась на 1,15 и 1,23 г. относительно контроля и на 1,55 и 2,28 г. по отношению к группе № 1 (УНМ «Таунит») (р<0,05). Таким образом, можно сделать вывод, что УНМ (сажа) оказывает более выраженный эффект в отношении массы тела и ее динамики по сравнению с УНМ «Таунит». При оценке длины тела, достоверных отличий между группами животных не обнаружено. При изучении показателей массы внутренних органов у животных группы № 1 показано увеличение массы ЖКТ (p<0,05) и матки с яичниками (p<0,01) на 16,5 и 65,5 % соответственно. Также наблюдалась тенденция к повышению массы тела, легких, печени и сердца (рисунок 28). 70 65,5** УНМ "Таунит" тело 60 матка с яичниками 50 сердце Масса, % 40 легкие 30 10 ЖКТ 16,5* 20 1,52 2,3 7,1 селезенка 1,9 печень 0 -4,7 -10 -20 -11,93%* -4,9 почка(лев) почка(прав.) Рисунок 28 – Среднегрупповые характеристики массы тела и внутренних органов мышей экспериментальной группы № 1 по отношению к контрольной группе (%) Примечание: * - различия достоверны p<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. 98 В то же время данные показатели для селезенки в экспериментальной группе на 11,93 % снизились (p<0,05). Оценка изменений в группе № 2 (УНМ сажа) показала повышение массы тела (на 8,94 %) и всех внутренних органов, наиболее выраженное в отношении легких (на 17,18 %), ЖКТ (на 13,21 %), матки с яичниками (на 26,78 %) (p<0,05…0,01), по сравнению с контрольной группой животных (рисунок 29). Это свидетельствует о большем эффекте наночастиц сажи на экспериментальных животных, по сравнению с УНМ «Таунит», вводимым в аналогичной дозировке (рисунок 28). 30 тело УНМ сажа 26,78* матка с яичниками сердце 25 Масса, % 20 17,18* 15 легкие 16,13 ЖКТ 13,21* 11,86 10 8,94** 7,85 8,88 7,18 5 0 селезенка печень почка(лев) почка(прав.) Рисунок 29 – Среднегрупповые характеристики массы тела и внутренних органов мышей экспериментальной группы № 2 по отношению к контрольной группе (%) Примечание: * - различия достоверны p<0,05; ** - р<0,01 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе. 99 5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ Общепризнано, что наночастицы, наноматериалы и технологии их производства существенно отличаются по комплексу физических, химических и биологических свойств, а также биоэффектам от веществ в форме макроскопических дисперсий и сплошных фаз. Между тем, для большинства наноматериалов до настоящего времени не изученными остаются механизмы поступления в организм, особенности биотрансформации, транслокации в органах и тканях, элиминации, токсичности и патогенеза их воздействия на организм. В России, США, странах Евросоюза, Канаде, Японии, Китае и других ведутся обширные исследования по оценке биологических эффектов производимых наноматериалов (Rockville, M. Challenge and opportnunity on the critical path to new medical products. The origins and uses of mouse outbread stocks / M. Rockville, R. Chia, F. Achilli et al. // Nature Genetics. – 2005. – Vol. 37. – P. 1181-1186). В нашей стране разработана и в 2007 г. утверждена Постановлением Госсанэпиднадзора «Концепция методов идентификации и количественного определения наноматериалов» (http:// stroy.dbases.ru/Data1/52/52003/index. htm). Однако отсутствие единой шкалы приоритетов для оценки биоэффектов всего многообразия наноматериалов и низкая информативность, а, зачастую, неприменимость традиционных гигиенических характеристик к наноразмерным структурам, делает необходимым поиск и использование новых подходов к их оценке. Вышеизложенное подтверждает высокую актуальность представленной работы, целью которой явилась оценка степени и характера влияния углеродного наноструктурного материала «Таунит» (МУНТ) на морфофункциональные показатели, поведенческие реакции, состояние репродуктивной функции и потомства первой генерации белых мышей. 100 На первом этапе исследования были изучены макроскопические показатели при поступлении в организм самок белых мышей УНМ «Таунит» в различных концентрациях. Низкие дозы вещества (УНМ 1,2 мг/кг) оказывают угнетающий эффект, который наиболее выраженно проявляется в снижении массы тела (на 7,7 %) на 28 сутки эксперимента. Увеличение дозы УНМ «Таунит» до 150 мг/кг приводит к скачкообразному возрастанию данного показателя, который на 28 и 63 сутки эксперимента достигает максимальных значений (+6,0… +6,2 %) (р<0,05). Следует отметить, что 28-и суточная экспозиция является критической, что выражается в достоверном изменении показателей (р<0,05). Возможно к этому сроку УНМ «Таунит» аккумулируется в достаточном количестве в органах и тканях. Оценка динамики длины тела выявила увеличение показателя, сходное у всех исследуемых самок, при этом только у животных группы № 1 (УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг) длина тела была ниже на 0,23-0,34 см (p<0,05), чем в других группах (УНМ 6; 30 и 150 мг/кг), начиная с 28 суток и до окончания эксперимента. При минимальной (1,2 мг/кг) дозе вещества наблюдается также тенденция к уменьшению массы сердца, с последующим достоверным ростом показателя на 15,6 % (р<0,01) по мере возрастания концентрации УНМ «Таунит» до 150 мг/кг. Возможно, это обусловлено гипертрофией миокарда, что связано с выявленным увеличением массы других внутренних органов (лѐгкие, желудочно-кишечный тракт, печень, почки, тимус, щитовидная железа). В условиях поступления концентраций отклонений в организм УНМ «Таунит» различных в массе легких не выявлено (р>0,05), хотя у экспериментальных животных наблюдалась похожая тенденция: снижение показателя под действием низких доз наноматериала (1,2 мг/кг), с последующей нормализацией (УНМ 6 мг/кг) и увеличением значений (УНМ 30 и 150 мг/кг). УНМ в дозировках 30 и 150 мг/кг вызывает повышение массы ЖКТ на 16,5 и 15,9 % соответственно (р<0,05). Очевидно, что влияние многостенных 101 углеродных нанотрубок проявляется в гипертрофии не только тканей ЖКТ, но и других органов, снабженных гладкой мускулатурой. В группе № 1 (УНМ 1,2 мг/кг) наблюдалось снижение массы печени на 13,9 % по сравнению с контрольной (р<0,05). Более высокие концентрации наноматериала вызывали обратный эффект, что проявлялось тенденцией к увеличению массы данного органа в группах № 2 и 3, соответственно на 1,9 и 2,0 %, однако данные различия не были достоверны. Возможно, некоторое увеличение органа обусловлено преобладанием массы соединительной ткани, либо происходит за счет возрастания ткани паренхимы. При концентрации УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг выявлено также снижение массы почек на 14,0 % (р<0,05). При дозе УНМ 6 и 30 мг/кг отмечается разнонаправленные сдвиги показателей (р>0,05). В первом случае наблюдается тенденция к увеличению массы на 8,05 %, во втором – к снижению на 4,9 %. Максимальная доза (УНМ 150 мг/кг) вещества оказывает стимулирующий эффект, вызывая повышение значений на 10 % (р<0,05). Основное свойство наноматериалов – это способность к аккумуляции и тропность к различным органам и тканям организма. Так как почки представляют собой основной отдел выделительной системы, возможно, наблюдаемые отличия являются следствием гипо- и гипертрофии, которая в свою очередь развивается за счет изменений в клубочках и извитых канальцах из-за поступления и накопления УНМ «Таунит». Во всех экспериментальных группах отмечено снижение массы селезенки, по мере увеличения концентрации наноматериала в растворе. Дозировка УНМ 150 мг/кг приводила к уменьшению показателей данного органа на 19,45 % (p<0,01), что, возможно, связано с гипотрофией вследствие истощения иммунной системы при ее перенапряжении в ходе адаптационных процессов. Поступление УНМ «Таунит» вызывает повышение массы матки с яичниками во всех подопытных группах. При дозировке УНМ 6 мг/кг наблюдается увеличение показателей на 63,21 % (p<0,05); УНМ 30 мг/кг - на 65,49 % (р<0,01); УНМ 150 мг/кг – на 56,7 % (р<0,01). 102 В результате поступления в организм МУНТ в различных концентрациях у самок белой мыши наблюдается дозозависимое изменение показателей массы сердца, ЖКТ, печени, почек, в виде снижения при низких, и увеличения при максимальных дозах вещества. Обратная зависимость наблюдается в отношении селезенки, масса которой уменьшается, по мере возрастания концентрации УНМ «Таунит». У всех мышей независимо от дозы вводимого наноматериала было отмечено стойкое увеличение массы ЖКТ, матки с яичниками и снижение массы селезѐнки. На втором этапе была выполнена оценка анатомо-морфологических показателей белых мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит» в дозировке 450 предварительных мг/кг. Данная экспериментов концентрация на других была выбрана тест-объектах, исходя из результатов, полученных на 1 этапе работы и литературных данных о подобных опытах (Гусев, А.А. Предварительные результаты комплексного биотестирования углеродного наноматериала – перспективного носителя лекарственных препаратов / А.А. Гусев, О.Н. Зайцева, И.А. Полякова, Е.Б. Горшенѐва // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. - Тамбов, 2010. - Т. 15. № 5. - С. 1538-1541; Горшенѐва, Е.Б. Углеродный наноструктурный материал – перспективный вектор доставки лекарственных препаратов меняет некоторые функциональные показатели самок Mus musculus L. при пероральном введении / Е.Б. Горшенѐва, А.А. Гусев, С.В. Шутова и др. // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. - Тамбов, 2011. - Т. 16. № 1. - С. 273-277). Установлено отсутствие различий в суточном потреблении сухого корма и воды животными, а также по показателям общей длины тела, длины лап, хвоста, туловища, головы на момент окончания эксперимента (45 сутки) по сравнению с контрольной группой (р>0.05). Однако масса тела в целом была выше на 2,74 г. (р<0,05) у мышей экспериментальной группы, что связано с увеличением массы внутренних органов подопытных животных. Состояние периферической крови белых мышей экспериментальной группы не отличалось от контроля по количеству эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов 103 и уровню гемоглобина (р>0.05). При этом лимфоцитов (на 5,9 %) (р<0,01) достоверно повышался уровень и снижалось количество сегментоядерных нейтрофилов (на 5,1 %) (р<0,01), что, по-видимому, связано с активацией иммунной системы мышей, в организм которых поступал исследуемый наноматериал. В то же время, при исследовании функций печени с помощью бромсульфалеиновой пробы не выявлено достоверных отличий по исследуемым показателям. Это свидетельствует о том, что УНМ «Таунит», попадая в организм животных с питьевой водой, не влияет на выделительно-поглотительную и белоксинтезирующую функции этого органа. Следует отметить, что у экспериентальных самок отмечалась тенденция к увеличению концентрации глюкозы в пуле сывороток крови на 14 и 45 сутки потребления УНМ «Таунит». Несмотря на противоречивость полученных к настоящему времени данных по физиологической активности наноматериалов, следует отметить отдельные сообщения, где в частности, показано, что фуллеренол (30 нмоль) предохраняет ткани ЦНС от повреждения, вызванного оксидантным стрессом; нормализует поведенческие реакции, устраняя явления энцефалопатии (Tykhomyrov, A.A. Nanostructures of hydrated C60 fullerene (C60HyFn) protect rat brain against alcohol impact and attenuate behavioral impairments of alcoholized animals / A.A. Tykhomyrov, V.S. Nedzvetsky, V.K. Klochkov, G.V. Andrievsky // Toxicology. – 2008. - Vol. 246, N 2-3. – P. 158-165). В определенной степени с этими данными согласуются полученные нами результаты об отсутствии угнетающего влияния УНМ на функциональное состояние нервной системы белых мышей, которое оценивалось по поведенческим реакциям. В частности, установлено, что через 2 недели после начала поступления УНМ «Таунит» в организм животных экспериментальной группы возрастает количество локомоций на 32,6 % (p<0,01), а также снижается порог эмоциональных реакций на 26,4 % (p<0,05). При этом пероральное введение УНМ не влияет на все виды двигательных реакций. К окончанию эксперимента показатели активности и эмоционального 104 состояния были сопоставимы в обеих группах животных (р>0,05). Не выявлено значимых отличий по большинству показателей теста безусловнорефлекторного поведения («открытое поле»), за исключением параметра общей двигательной активности, уровень которой был ниже у мышей экспериментальной группы на 16 % (р<0,05). В то же время, поступление в организм белых мышей УНМ «Таунит» не приводило к сдвигам в их горизонтальной двигательной активности. Не изменялась также величина показателя «вертикальные стойки», свидетельствующего о выраженности мотивационной составляющей поведенческих реакций подопытных животных. Проявление норкового рефлекса, показатели груминга (косметического поведения), количество дефекаций белых мышей, также находились на уровне значений контрольной существенных изменений группы, в что свидетельствовало эмоциональном состоянии об отсутствии животных при поступлении в их организм УНМ. Таким образом, наноматериал «Таунит» при пероральном введении не изменяет безусловную составляющую рефлекторного поведения мышей в «открытом поле» (р>0,05), однако через 45 суток его поступления в организм наблюдалось снижение общей двигательной активности (р<0,05) и тенденция к снижению исследовательского поведения. Отсутствие функциональных сдвигов в состоянии белых мышей при поступлении в организм выраженных структурных наноматериала сдвигов, о сопровождалось чем и отсутствием свидетельствовали данные морфологических исследований. За время проведения эксперимента гибели мышей не наблюдалось. При эвтаназии их осмотр показал, что все они нормально упитаны, имеют правильное телосложение, опрятны, волосяной покров и естественные отверстия чистые. Органы располагались правильно, свободной жидкости в грудной и брюшной полостях не выявлялось. В экспериментальной группе визуальных признаков изменений органов и тканей не обнаружено. Выявлены некоторые отличия массы внутренних органов частности, среднегрупповых показателей массы сердца: мышей, в у самок при 105 поступления в организм наноматериала «Таунит» значение этого параметра было выше, чем в контроле на 28,6 % (р<0,01). Мы объясняем такое повышение массы сердца физиологической гипертрофией миокарда. На фоне поступления в организм УНМ «Таунит» в дозировке 450 мг/кг обнаруживалось увеличение массы ЖКТ подопытных животных на 31,2 % (p<0,05). Пищеварительный тракт, по-видимому, является одним из важнейших путей проникновения наночастиц. Показано прохождение наночастиц размером от 10 до 100 нм через стенки желудочно-кишечного тракта при обычном и принудительном кормлении через зонд. Имеются данные, свидетельствующие, что, например, фуллерены при пероральном введении не всасываются и экскретируются прежде всего с калом (Holsapple, M.P. Toxicological and safety evaluation of nanomaterials / M.P. Holsapple, H.W. Farland // Toxicol. Science. 2005. - Vol. 88, N 1. - P. 12-17). В то же время, нельзя отрицать способность наночастиц преодолевать гистогематический барьер в стенках желудка и кишечника, о чем свидетельствуют полученные нами данные, в частности, увеличение массы ЖКТ и ряда внутренних органов. В условиях поступления в организм УНМ «Таунит» (450 мг/кг) у белых мышей наблюдалась тенденция к незначительному увеличению массы печени (р>0,05). У 35 % особей экспериментальной группы цвет органа был несколько темнее, чем у животных контрольной группы, что, в свою очередь, может быть следствием замедления венозного оттока. Масса почек подопытных животных была выше на 20 % (p<0,01), по сравнению с контрольными значениями. Возможно, выявленные отличия являются следствием гипертрофии, в первую очередь клубочков почки, и расширения извитых канальцев. Обращало на себя внимание выраженное снижение массы селезѐнки - на 45,8 % (p<0,01) у самок мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит» (450 мг/кг), что наблюдалось и в группах с меньшей концентрацией наноматериала и, видимо, было обусловлено предшествующей длительной активацией иммунной системы, и развитием в дальнейшем гипотрофии этого органа. 106 Ряд исследователей предполагают, что мишенями для наночастиц, в том числе углеродных, являются биологические макромолекулы (ДНК, РНК, белки), биологические мембраны, в том числе гистогематические, гематоэнцефалические барьеры, системы окисления-восстановления, в том числе перекисного. К настоящему времени продемонстрирована вероятность того, что агрегаты наночастиц могут быть объектом макрофагового клиренса. Показано, что при последующих внутритрахеальных вливаниях ультрачистых частиц TiO2, они фагоцитировались альвеолярными макрофагами, которые предотвращали как реакцию воспаления легких, так и проникновение частиц в промежуточные ткани (Oberdorster, G. Ultrafine particles in the urban air: To the respiratory tract- and beyond? / G. Oberdorster, M.J. Utell // Environ. Health Perspect. – 2002. – Vol. 110. – P. 440-441). В последние годы происходит активное изучение наноиммунных процессов, осуществляется активный поиск новых альтернативных моделей. В частности, оценены отклики дендритных клеток с лигандами Toll-like рецепторов до или в процессе воздействия наночастиц для определения возможного эффекта молекул нановещества синергетически усиливать рецепторы дендритных клеток или цитокиновую экспрессию. При этом предполагается, что индуцированные наночастицами отклики могут быть синергетически усилены стимулированием Toll-like рецепторов. Проводившиеся исследования (COLIPA, Sens-it-iv Framework VI integrated project) направлены на изучение механизмов возможной активации наночастицами дендритных клеток. Продемонстрировано, что первичная пролиферация Т-клеток, как отклик на воздействие наноматериалов, является индикатором иммуногенности этих субстанций, хотя однозначные данные до настоящего времени не получены. Исследователи признают, что реальные показатели биоактивности свободных наноматериалов в стенках ЖКТ, альвеолах, коже зависят от уровня метаболизма, адсорбции тканей и понимания механизмов происходящих процессов (Maxvell, G. Assuring consumer safety without animal testing: a feasibility case study for skin sensitization / G. Maxvell, M. Aleksic, A. Aptula et al. // ATLA. – 2008. – Vol. 36. – P. 557-568). 107 При контакте возбудителя инфекции, иммунного комплекса или пылевой частицы с мембраной фагоцита интенсивно повышается уровень потребления кислорода – так называемый «дыхательный взрыв». Предполагают, повышение наноразмерностью цитотоксичности частиц, что обусловлено в определенной степени механизмом активации фагоцитов, главным образом, макрофагов и дендритных клеток. Для активации указанных клеточных элементов необходим одновременный контакт частиц с поверхностью клетки, чему в определенной степени способствуют наноразмеры частиц. В ходе исследования установлено, что у мышей экспериментальной группы масса щитовидной железы имела тенденцию к увеличению. Мы предположили, что при поступлении в организм животных УНМ происходят не только морфологические, но и функциональные изменения тиреоцитов, в результате чего клетки щитовидной железы не усваивают йод, поступающий в организм животного с питьевой водой и кормом. Отмечалась также гипертрофия лимфатических сосудов и узлов, окружающих щитовидную железу, что обусловлено в основном развитием в них пучков гладкой мускулатуры. Данные изменения могут наблюдаться в ряде случаев при застое лимфы и могут представлять приспособительную гипертрофию стенок лимфатической системы в условиях ее перегрузки. Оценка массы матки с яичниками у подопытных мышей также позволила вывить выраженные различия этого показателя в исследуемых группах. Наблюдалось увеличение массы репродуктивных органов у самок экспериментальной группы (УНМ 450 мг/кг) - на 65,7 % (p<0,001). В целом показано, что масса тела, сердца, матки с яичниками, ЖКТ и почек была выше у мышей получавших МУНТ в дозировке 450 мг/кг (p<0,05…0,001). В то же время, в контрольной группе масса селезѐнки превышала таковую у животных экспериментальной группы (p<0,01). При микроскопическом исследовании внутренних органов мышей экспериментальной группы (УНМ 450 мг/кг) наибольшие изменения обнаружены в ткани печени. У всех мышей отмечалась инфильтрация печѐночной паренхимы. 108 Гистологическое исследование также показало, что в отдельных случаях при поступлении в организм мышей УНМ «Таунит» отмечались: венозное полнокровие; в лимфоузлах – фолликулы с реактивными центрами, макрофагальная реакция синусов, фолликулов у всех мышей; в тимусе макрофагальная реакция, стертость границ между корковым и мозговым слоем. При исследовании селезенки наблюдалась размытость контуров фолликулов, в щитовидной железе и сердце – увеличение объема стромы. В легких выявлялось умеренное полнокровие; в желудке – очаговая лимфоидная инфильтрация слизистой оболочки. У отдельных животных в ряде случаев были выявлены: в поджелудочной железе – незначительное увеличение объема стромы, в надпочечнике и яичнике – умеренное венозное полнокровие, в том числе мозгового слоя. В целом полученные данные свидетельствовали о том, что у мышей экспериментальной группы при поступлении в организм УНМ «Таунит» в дозировке 450 мг/кг наблюдаются умеренные или слабые изменения в виде венозного полнокровия, увеличения объема стромы органов. У всех мышей отмечены реактивные изменения иммунных органов (макрофагальная реакция фолликулов и синусов лимфоузлов, селезенки и коркового слоя тимуса, стертость границ между корковым и мозговым слоями в тимусе, размытость контуров фолликулов селезенки). Микроскопическое исследование яичников показало отсутствие видимых отличий в их строении у контрольных особей и мышей, получавших наноматериал «Таунит». В корковом веществе яичников выявлены группы примордиальных фолликулов, многочисленные растущие фолликулы, а также единичные граафовы пузырьки и атретические тела. Тека-клетки были крупными, со светлой цитоплазмой, формировали скопления с нечеткими очертаниями. Таким образом, поступление наноматериала в организм подопытных животных не влияло на гаметогенез. 109 На следующем этапе работы изучалось влияние наноматериала «Таунит» на репродуктивную функцию самок мышей и развитие потомства первого поколения. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что под воздействием УНМ «Таунит» у белых мышей уменьшается количество неродивших самок на 7 %, снижается смертность молодняка (в течение первых 21 суток) на 12 % (р<0,05), также возрастает количество особей в приплоде на 34 % (р<0,05), их весоростовые показатели. Кроме того, возможно, влияние УНМ «Таунит» на репродуктивную функцию мышей, проявляющееся увеличением в потомстве доли самок на 19 % (р<0,05), является индикатором воздействия среды обитания (Геодакян, В. А. Дифференциальная смертность и норма реакции мужского и женского пола / В.А. Геодакян // Журн. общ. Биологии. - 1974. - Т. 35. - № 3 – С. 376-385). УНМ «Таунит» постимплантационной не гибели, влияет задержки на эмбриогенез, развития плодов, не вызывает анатомических изменений, в том числе костной системы. Наблюдения за физическим развитием потомства мышей обеих групп в течение 21 суток позволило заключить, что по числу живых и мертвых новорожденных, срокам отлипания ушей, прорезывания резцов, открытия глаз и появления первичного волосяного покрова достоверных различий между экспериментальной и контрольной группами не наблюдалось. Поступление УНМ «Таунит» в организм самок белых мышей во время беременности и в период молочного вскармливания приплода не повлияло отрицательно на сроки созревания сенсорно-двигательных рефлексов и эмоционально-двигательное поведение потомства первой генерации. В то же время, можно отметить, что масса тела мышат экспериментальной группы с 5 по 23 сутки постнатального развития превышала аналогичный показатель в контроле (р<0,05). Возможно, присутствие в среде наноматериала влияет на развитие белой мыши на ранних этапах онтогенеза, что проявляется увеличением массы тела и ее выраженной динамикой. 110 В приплоде самок экспериментальной группы показано увеличение массы тела (на 37,3 %) и всех исследуемых органов, а именно: сердца (на 30,1 %), легких (на 53,2 %), ЖКТ (на 33,3 %), селезѐнки (на 20,0 %), печени (на 29,0 %), почек (на 40,3 %), тимуса (на 57,3 %), семенников (на 53,8 %), матки с яичниками (на 61,9 %) по сравнению с аналогичными показателями потомства контрольной группы самок (р<0,05…0,01). Таким образом, УНМ «Таунит» (450 мг/кг), поступая в организм на стадии его формирования и развития, приводит к увеличению массы и длины тела, а также внутренних органов. К тому же, морфофункциональные изменения у потомства экспериментальной группы оказались более выраженными, по сравнению с эффектами у самок, в организм которых УНМ «Таунит» поступал уже в половозрелом возрасте, как показали результаты исследования. На заключительном этапе работы проводилась сравнительная оценка эффектов УНМ «Таунит» и УНМ (сажа). Было установлено, что в последней группе наблюдалось повышение массы тела (на 8,94 %), легких (на 17,18 %), репродуктивных органов (на 26,78 %) и ЖКТ (на 13,21 %) (p<0,05…0,01) по отношению к контрольной, в то время как данные показатели у группы № 1 (УНМ «Таунит») превышали контрольные лишь по массе репродуктивных органов (на 65,49 %) и ЖКТ (на 16,50 %) (р<0,05…0,01). Это свидетельствует о более выраженном эффекте частиц сажи на самок белых мышей по сравнению с УНМ «Таунит», вводимым в аналогичной дозировке. Результаты наших исследований согласуются с данными ряда авторов, и в совокупности свидетельствуют об отсутствии выраженного действия углеродных наноматериалов и некоторые их производных в условиях in vivo. В то же время, некоторые исследователи полагают, что, например, в отношении фуллеренов, это утверждение справедливо только когда не проявляются фотодинамические свойства и не образуются при действии света активные формы кислорода. Высокий биологический эффект также достигается за счет объединения в одной молекуле и действующего начала (фуллерена как «генератора» синглетного 111 кислорода), и системы его направленной доставки к молекуле-мишени (катионные группы связываются с анионными группами ДНК). Вышеизложенное подтверждает необходимость разработки новых подходов в постановке экспериментов по оценке влияния наноматериалов на животных (Festing, M.F.W. Fifty years after Russell and Burch, toxicologists continue to ignore genetic variation in their test animals / M.F.W. Festing // ATLA. – 2009. – Vol. 37. – P. 1-5). Результаты собственных исследований и данные литературы позволяют констатировать, что наночастицы и наноматериалы, несмотря на их структурную уникальность и особенности квантовых механизмов, не являются экзотичными для биологической системы. Однако, крайне важно для оценки биоэффектов предлагать и использовать корректные подходы и биомодели, разработанные на основе современных принципов доказательной гигиенической и экологической оценки наноматериалов. биологии биологического и медицины, действия новых 112 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нами выполнены исследования по изучению физиологических аспектов влияния УНМ «Таунит» на организм самок белых мышей и развитие их потомства первого поколения. Цель достигнута, поставленные задачи решены, по итогам можно сделать следующие выводы: 1. Поступление в организм белых мышей УНМ «Таунит» сопровождается дозозависимым эффектом, проявляющимся снижением массы сердца (на 8,9 %), печени (на 13,9 %) и почек (на 14,0 %) (р<0,05) при поступлении малых доз УНМ «Таунит» (1,2 мг/кг) и увеличением массы тела (на 12,8 %), желудочно-кишечного тракта (на 31,2 %), почек (на 20,0 %), матки с яичниками (на 65,7 %) и сердца (на 28,6 %) (p<0,05…0,001) у животных получавших наноматериал в дозировке 450 мг/кг. В то же время, обратная зависимость наблюдается в отношении селезѐнки, масса которой уменьшается по мере увеличения дозировки УНМ «Таунит» (на 45,8 %) (р<0,01 %) что, видимо, обусловлено предшествующей длительной активацией иммунной системы и развитием в дальнейшем гипотрофии органа. 2. У мышей, получавших УНМ «Таунит» в дозировке 450 мг/кг в течение 45 суток наблюдается инфильтрация печѐночной паренхимы, а также умеренная или слабая формы венозного полнокровия. У всех подопытных мышей отмечаются реактивные изменения в иммунных органах. 3. В условиях поступления УНМ «Таунит» в организм самок белых мышей увеличивается количества лимфоцитов (на 5,9 %) и снижается содержание сегментоядерных нейтрофилов (на 5,1 %) (p<0,01). 4. При поступлении в организм самок белых мышей УНМ «Таунит» в дозировке 450 мг/кг в течение 14 суток происходит увеличение показателей спонтанной двигательной активности на 32,6 % (р<0,01), снижение порога эмоциональных реакций на 26,4 % (р<0,05), что косвенно потенциирует процессы возбуждения в нервной системе подопытных животных. На 45 сутки введения 113 наноматериала поведенческие реакции возвращаются к исходному уровню. Более того, тенденция нарастает и происходит угнетение общей двигательной активности самок на 16 % (р<0,05). 5. УНМ «Таунит» влияет на репродуктивную систему мышей, а именно, уменьшаются количество неродивших самок на 7 %, смертность молодняка на 12 % (р<0,05) и доля самцов в потомстве первой генерации на 19 % (р<0,05); возрастают количество особей в приплоде (плодовитость) на 34,4 % (р<0,05) и величины их морфометрических показателей. 6. МУНТ не влияет на гамето- и эмбриогенез (на постимплантационную гибель, формирование анатомических структур, в том числе костной системы, у плодов первого поколения). 7. УНМ «Таунит» при поступлении в организм самок мышей во время беременности не влияет на физическое развитие (средний срок отлипания ушей, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз), сроки созревания сенсорно-двигательных рефлексов (отрицательный геотаксис, маятниковый рефлекс, переворачивание на плоскости, обонятельный рефлекс, избегание обрыва, реакция на акустический стимул и переворачивание в свободном падении) и поведенческие реакции (спонтанная двигательная активность, горизонтальная и вертикальная активность, груминг, норки) потомства первого поколения. 8. УНМ «Таунит» оказывают менее выраженный эффект на организм белых мышей по сравнению с УНМ (сажа), имеющим другую наноструктуру и вызывающим значительное возрастание массы тела (на 8,9 %), легких (на 17,2 %), ЖКТ (на 13,2 %), матки с яичниками (на 26,8 %) (p<0,05…0,01). 114 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Данные о влиянии УНМ «Таунит» целесообразно использовать при разработке норм содержания углеродных наноматериалов в средах, контактирующих с животными и человеком, а также при создании на основе многостенных углеродных нанотрубок лекарственных препаратов нового поколения. 2. С учѐтом представленного экспериментального материала, рекомендуется разработать систему мероприятий по контролю за состоянием здоровья женских особей репродуктивного возраста, материалами на основе углеродных нанотрубок. контактирующих с 115 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БСФ – бромсульфалеин ЖКТ – желудочно-кишечный тракт МУНТ – многостенные углеродные нанотрубки НЧ - наночастицы СРО – свободнорадикальное окисление УНМ - углеродный наноструктурный материал УНТ - углеродные нанотрубки 116 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. чл.-корр. РАМН проф. Р.У. Хабриева. – 2-изд., перераб. и доп. – М. : Медицина, 2005. – 832 с. 2. ГОСТ Р. 53434-2009 Принципы надлежащей лабораторной практики //М.: Стандартинформ. – 2010. 3. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. №708н «Правила лабораторной практики». Зарегистрирован в Минюсте РФ 13 октября 2010 г. Регистрационный №18713. 4. Айламазян, Э.К. Репродуктивное здоровье женщины как критерий биоэкологической оценки окружающей среды / Э.К. Айламазян, Т.В. Беляева, Е.Г. Виноградова, И.А. Шутова // Вестн. Рос. ассоц. акушеров-гинекологов. - 1997. № 3. - С. 72-78. 5. Алиева, Н.А. Особенности репродуктивного здоровья девушек- подростков с ожирением различного генеза: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук / Н.А. Алиева - Волгоград, 2007. - 22 с. 6. Алферов, Ж.И. За нанотехнологиями будущее. И это не обсуждается / Ж. И. Алферов // Нанотехнологии. Экология. Производство. – 2009. – № 1. – С. 10–14. 7. Бабкин, В. И. Государственная значимость нанотехнологий / В. И. Бабкин // Нанотехнологии. Экология. Производство. – 2009. – № 1. – С. 32–36. 8. Буреш, Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Джозеф П.Хьюстон. – М.: Высш.шк., 1991. – 399 с. 117 9. Геодакян, В. А. Дифференциальная смертность и норма реакции мужского и женского пола / В.А. Геодакян // Журн. общ. Биологии. - 1974. – Т.35, №3 - С. 376-385. 10. Григорьева, Е.Е. Резервы оптимизации репродуктивного здоровья в современных социально-экономических условиях крупного промышленного города: Автореф. дисс. ... доктора мед. наук / Е.Е. Григорьева. - М., 2007. - 38 с. 11. Горшенѐва, Е.Б. Углеродный наноструктурный материал – перспективный вектор доставки лекарственных препаратов меняет некоторые функциональные показатели самок Mus musculus L. при пероральном введении / Е.Б. Горшенѐва, А.А. Гусев, С.В. Шутова, А.В. Емельянов, А.Г. Ткачев // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. - Тамбов, 2011. - Т. 16. - № 1. - С. 273-277. 12. Гусев, А.А. Влияние углеродного наноструктурного материала на мышей / А.А. Гусев, С.В. Шутова, А.П. Поздняков, Э.М. Османов, А.Г. Ткачев, А.В. Емельянов, А.В. Зрютина, Е.Б. Панина, И.А. Полякова // Биология-наука XXI века / Материалы 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2010.- С. 24 13. Гусев, А.А. Влияние углеродных нанотрубок на ранние стадии онтогенеза мышей (Mus Domestica Linnaeus, 1758) / А.А. Гусев, А.В. Емельянов, С.В. Шутова, А.Г. Ткачев, А.П. Поздняков, Э.М. Османов, А.В. Зрютина, Е.Б. Панина // Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред / Материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Тамбов, 2009.- С. 78-79 14. Гусев, А.А. Нанобезопасность – новое направление экологических исследований / А.А. Гусев, А.В. Емельянов // Проблемы экологии в современном мире. - Тамбов, 2008. - С. 39-41. 15. Гусев, А.А. Оценка воздействия наносодержащего материала «Таунит» на живые системы / А.А.Гусев, А.В. Емельянов, А.Г. Ткачев и др. // Сборник материалов 8-й Международной научно-практической конференции «Экология и безопасность жизнедеятельности». – Пенза, 2008. – С. 28-29. 118 16. Гусев, углеродного А.А. Половые наноструктурного различия материала – физиологического эффекта перспективного носителя лекарственных препаратов в эксперименте на лабораторных мышах / А.А. Гусев, И.А. Полякова, Е.Б. Горшенѐва, А.Г. Ткачев, А.В. Емельянов, С.В. Шутова, О.Н. Зайцева, А.В. Федоров, Т.В. Васильева // Научные ведомости Белогородского государственного университета. Серия: Естественные науки. - Белгород, 2010. - Т. 21. - № 13 - С. 107-112. 17. Гусев, биотестирования А.А. Предварительные углеродного наноматериала результаты – комплексного перспективного носителя лекарственных препаратов / А.А. Гусев, О.Н. Зайцева, И.А. Полякова, Е.Б. Горшенѐва // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. - Тамбов, 2010. - Т. 15, № 5 - С. 1538-1541. 18. Джатдоева, Ф.А. Проблемы репродуктивного здоровья россиян / Ф.А. Джатдоева // Мать и Дитя: Материалы VIII Рос. форума. - М., 2006. - С. 624325. 19. Жолдакова, З.И. Общие и специфические аспекты токсических свойств наночастиц и других химических веществ с позиций классической токсикологии / З.И. Жолдакова, О.О. Синицына, Н.В. Харчевникова // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 12–16. 20. Жорник, Е.В. Роль ТNFα и NFкВ в трансдукции генотоксического сигнала в лимфоцитах человека в ответ на действие углеродных наночастиц / Е.В. Жорник, Л.А. Баранова // Матер. конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». – Пущино, 2007. - С. 306-308. 21. Израйлет, Л. И. Модификация бромсульфалеиновой пробы для изучения функционального состояния печени у крыс / Л.И. Израйлет, В.Н. Соминский, Т.Н. Шибаева // Гигиена и санитария. – 1976. – №. 3. – С. 59-61. 22. Иншаков, О.В. Государственная политика развития нанотехнологий: российский и зарубежный опыт / О.В. Иншаков, А.В. Фесюн. – Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2009. – 48 с. 119 23. Иншаков, О.В. Нанотрансформация товаров / О.В. Иншаков, А.Р. Яковлев. – Волгоград : Изд-во ВолГУ, 2009. – 32 с. 24. Кац, Е.А. Фуллерены, углеродные нанотрубки и нанокластеры: Родословная форм и идей / Е.А. Кац. – М. : Изд-во ЛКИ, 2008. – 296 с. 25. Коломейцев, М.Г. Проблемы и перспективы развития репродуктивного образования в системе здоровьесбережения молодежи в России / М.Г. Коломейцев // Репродуктивное здоровье детей и подростков. - 2009. - № 2. - С. 83-92. 26. Коросов, А.В. Компьютерная обработка биологических данных / А.В. Коросов – Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2007 – 76 с. 27. Крутько, В.Н. Проблема оценки рисков нанотехнологий: методологические аспекты. / В.Н. Крутько, Е.В. Пуцилло // Вестник РУДН. Сер. Экол. и. безопас. жизнедеят. - 2008. - № 4. - C. 55-61. 28. Кулаков, В.И. Репродуктивное здоровье населения России / В.И. Кулаков. // Гинекология. – 2007 – Т. 9 - № 1 – С. 7-9. 29. Курляндский, Б.А. Обшая токсикология / Б.А. Курляндский, В.А. Филова. – М.: Медицина, 2002. – 608 с. 30. Кэттайл, В. М. Патофизиология эндокринной системы / В.М. Кэттайл, Р.А. Арки. – СПб.: Невский диалект, 2001. – 336 с. 31. Малышева, А.Г. Проблемы химико-аналитических исследований при гигиенической оценке наноматериалов и нанотехнологий / А. Г. Малышева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 16–20. 32. Медведева, И.Б. Оценка репродуктивного потенциала девочек- подростков / И.Б. Медведева // Проблемы репродукции. Специальный выпуск. 2009. - С. 153-154. 33. Меньшиков, В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / В.В. Меньшиков. - М.: Медицина, 1987. — 368 с. 34. Навасардян-Самыкина, Е.В. Репродуктивное здоровье и состояние фетоплацентарной системы женщин крупного промышленного города: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук / Е.В. Навасардян-Самыкина. - М., 2003. - 26 с. 120 35. Насибуллаев, Ш.К. Фуллерены, их производные и нанотрубки [Электронный ресурс]. URL: (дата обращения: токсикологических исследований, http://originweb.info/education/chemistry/fullerenes6.html 22.02.2011) 36. Онищенко методологии оценки Г.Г. Концепция риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов /Г.Г. Онищенко, Б.Г.Битько, В.И.Покровский, А.И.Потапов [2007 Электронный ресурс]: http://www. nanonewsnet.ru/ blog/nikst/kontseptsiya-toksikologicheskikh-issledovanii-nanomaterialov. 37. Онищенко, Г.Г. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 23 июля 2007 г. N 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы» [Электронный ресурс]. URL: http://www.rospotrebnadzor.ru/documents/postanov/1209/. 38. Онищенко, Г.Г. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 31 октября 2007 г. N 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов» [Электронный ресурс]. URL: http://www.infosait.ru/norma_doc/51/51942/index.htm. 39. Онищенко, благополучия Г.Г. населения Обеспечение в условиях санитарно-эпидемиологического расширенного использования наноматериалов и нанотехнологий / Г. Г. Онищенко // Гигиена и санитария. – 2010. – № 2. – С. 4–7. 40. Пиотровский, Л.Б. Будьте осторожны — следующая остановка «НАНО ЭРА» или проблема токсичности наночастиц / Л.Б. Пиотровский // Экологический вестник России. - 2008. - № 11. - С. 31. 41. Плохинский, Н.А. Биометрия / Н.А. Плохинский – М.: Издательство МГУ, 1970. – 367 с. 121 42. Покропивный, В.В. Новые наноформы углерода и нитрида бора / В.В. Покропивный, А.Л. Ивановский // Успехи химии. - 2008. – Т.77, № 10. - С.897-992. 43. Проданчук, Н.Г. Нанотоксикология: состояние и перспективы исследования [Электронный ресурс] / Н.Г. Проданчук, Г.М. Балан // URL: http://www.medved.kiev.ua/Web_journals/Arhiv/Toxicology/2009/3-4_09/str04.pdf. 44. Пузырь, А.П. Воздействие детонационных наноалмазов in vitro и in vivo на биологические объекты / А.П. Пузырь, В.С. Бондарь // Сложные системы в экстремальных условиях: Материалы 12 Международного симпозиума – Красноярск, 2005. - С. 229-240. 45. Пузырь, А.П. Адсорбция афлатоксина В1 наноалмазами детонационного синтеза / А.П. Пузырь, К.В. Пуртов, О.А. Шендерова // Докл. РАН. - 2007. – Т.417, № 1. - С. 117-120. 46. Радилов, А.С. Экспериментальная оценка токсичности и опасности наноразмерных материалов / А.С. Радилов, А.В. Глушкова, С.А. Дулов // Нанотехнологии. Экология. Производство. – 2009. – № 1. – С. 86–89. 47. Рахманин, Ю.А. Влияние квантовых состояний нанообъектов на биологические системы / Ю.А. Рахманин, А.А. Стехин, Г.В. Яковлева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 4–12. 48. Решение Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Актуализирование проблемы здоровья человека и среды его обитания и пути их решения» [Электронный ресурс] / Ю.А. Рахманин. – Москва. – 2011 – URL: http://www.sysin.ru/assets/files/plenum2011.pdf. 49. Решение Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Методологические проблемы изучения и оценки био- и нанотехнологий (нановолны, частицы, структуры, процессы, биообъекты) в экологии человека и гигиене окружающей среды» // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 88. 122 50. Русаков, Н. В. Эколого-гигиенические проблемы отходов наноматериалов / Н. В. Русаков // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 20–21. 51. Сернов, Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии/ Л.Н. Сернов, В.В.Гацура. – М.: ВНЦ БАВ, 2000. – 352 с. 52. Сивочалова, О.В. Медико-экологические аспекты проблемы охраны репродуктивного здоровья работающих России / О.В.Сивочалова, Г.К. Радионова // Медицина труда и промышленная экология. - 1999. - № 3. - С.1-5. 53. при Сперанский, С. В. Определение суммационно-порогового показателя различных формах токсикологического эксперимента: методические рекомендации / С.В. Сперанский. - Новосибирск, 1975. - 25 с. 54. Степанова, О.И. Метод взятия крови из малой подкожной вены голени у мышей / О.И. Степанова// Биомедицина. – 2006. - №2. – С. 137-139. 55. Сычева, Л. П. Оценка мутагенных свойств наноматериалов / Л.П. Сычева // Гигиена и санитария. – 2008. – № 6. – С. 26–28. 56. Ткачев, А.Г. Аппаратура и методы синтеза твердотельных наноструктур: монография / А.Г. Ткачев, И.В. Золотухин. – М.: Машиностроение, 2007. – 316 с. 57. Ткачук, В.А., Конструирование наночастиц для адресной доставки терапевтических средств в клетки и их органеллы [Электронный ресурс] / В.А. Ткачук, В.П. Ширинский, Е.В. Парфенова. - URL: http: //rusnanotech08. rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/10/14.pdf. 58. Трусов, Л.А. Поведение углеродных нанотрубок в живых клетках [Электронный ресурс] /Л.А. Трусов // URL: http: //www.nanometer.ru /2007/12/04/ carbon_nanotube_5319.html. 59. Тутельян, безопасности В.А. наноматериалов, Токсиколого-гигиенические используемых при аспекты производстве оценки пищевой продукции [Электронный ресурс]. / В.А. Тутельян // ГУ НИИ питания РАМН. – М., 2010. - URL: http://rusnanotech08.rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/10/15.pdf (дата обращения: 12.03.2010). 123 60. Убогов, А.Ю. Углеродные нанотрубки как фактор развития воспалительного процесса в печени мышей / А.Ю. Убогов, И.А. Полякова, А.А. Гусев, Е.Б. Горшенѐва, А.Г. Ткачев // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. Т. 16, № 5- Тамбов, 2011.- С. 1338-1343. 61. Уйба, В.В. Разработка медико-биологического обеспечения безопасности в области нанотехнологий [Электронный ресурс] /В.В.Уйба // URL: http:// rusnanotech08. rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/1/7/14.pdf (дата обращения: 10.03.2010). 62. Фостер, Л. Нанотехнологии. Наука, инновации, возможности / Л. Фостер. – М.: Техносфера, 2008. – 352 с. 63. Холоденко, В.П. Биобезопасность наноматериалов и нанотехнологий [Электронный ресурс] / В.П. Холоденко, В.А. Чугунов, Е.Н. Кобзев, И.А. Дятлов // URL: http://rusnanotech08.rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/2/10/10%20(56).pdf (дата обращения: 11.03.2010). 64. Чекман, І.С., Карбонові нанотрубки: методи отримання та перспективи застосування в медицині / І.С. Чекман, О.В. Швець, О.О. Нагорна // Український медичний часопис. - 2008. - № 3/65. - С. 86-93. 65. Шварц, С.С. Метод морфофизиологических индикаторов в экологии наземных позвоночных / С.С. Шварц, В.С. Смирнов, Л.Н. Добринский // Тр. Ин-та экологии растений и животных. УФАН СССР. - 1968. - Вып. 58. – С. 386 -390. 66. Alt, V. An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement / V. Alt, T. Bechert, P. Steinrucke // Biomaterials. - 2004. – Vol. 25. - P. 4383-4391. 67. Barlow, P.Y. Serum exposed to nanoparticle carbon black displays increased potential to induce macrophage migration / P.Y. Barlow, K. Donaldson // Toxicol. Lett. - 2005. - Vol.155, N 3. - P.397-401. 68. Barua, S. Non-hazardous anticancerous and antibacterial colloidal 'green' silver nanoparticles / S. Barua, R. Konwarh, S. Bhattacharya et al. // Colloids Surf. B Biointerfaces. – 2013. – Vol.105. – P. 37-42. 124 69. Bermudez, E. Pulmonary responses of mice, rats, and hamsters to subchronic inhalation of ultrafine titanium dioxide particles / E. Bermudez, J.B. Mangum, B.A. Wong // Toxicol. Sci. - 2004. – Vol.77. - P. 347-357. 70. Blum, J.L. Cadmium associated with inhaled cadmium oxide nanoparticles impacts fetal and neonatal development and growth / J.L. Blum, J.Q. Xiong, C. Hoffman, J.T. Zelikoff // Toxicol. Sci. - 2012. – Vol.126 (2). – P.478486. 71. Boisen, A.M. NanoTIO(2) (UV-Titan) does not induce ESTR mutations in the germline of prenatally exposed female mice / A.M.Boisen, T. Shipley, P. Jackson et al. // Part. Fibre Toxicol. – 2012. – Vol. 9. – P.9-19. 72. Borm, P.J.A. Toxicological hazards of inhaled nanoparticles potential implications for drug de livery / P.J.A Borm, W. Kreylin // J. Nanosci. Nanotech. 2004. – Vol. 4, N 6. - P.1-11. 73. Bottini, M. Biomedical platforms based on composite nanomaterials and cellular toxicity / M. Bottini, A. Magrini // J. Phys. Conf. Ser. - 2007. - Vol.61. - P. 95-98. 74. Boxall Alistair, B.A. Assessing environmental exposure to engineered nanoparticles / B.A. Alistai Boxall // ICP Inf. Newslett. - 2007. – Vol. 32, N 2. P.1262-1264. 75. Braydich Stolle, L. In vitro toxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells / L. Braydich Stolle, Saber Hussain // Toxicol. Sci. - 2005. – Vol. 88, N 2. - P.412-419. 76. Campagnolo, L. Physico-chemical properties mediating reproductive and developmental toxicity of engineered nanomaterials / L. Campagnolo, M. Massimiani, A. Magrini et al. // Curr. Med. Chem. – 2012. – Vol.19 (26). – P.4488-4494. 77. Cedervall, T. Detailed identification of plasma proteins adsorbed on copolymer nanoparticles / T. Cedervall, I. Lynch, T. Berggard // Angew Chem. Int. Ed. Engl. - 2007. – Vol.46 (30). - P.5754-5756. 125 78. Chen, H.W. Titanium dioxide nanoparticles induse emphysema like lung injury in mice / H.W. Chen, S.F. Su, C.T Chien, W.H. Lin // FASEB J. - 2006. – Vol. 20. - P.2393-2395. 79. Chen, Z. Acute toxicological affects of copper nanoparticles in vivo / Z. Chen, H. Meng, G. Hing // J. Phys. Chem. Toxicol. Lett. - 2006. – Vol. 163. - P.109120. 80. Chin, Wing Lam. Pulmonary toxicity of single wall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation / ChinWing Lam, J.T. James, R. McCluskey // Toxicol. Science. - 2006. – Vol.77. - P.126-134. 81. Chlopek, J. In vitro studies of carbon nanotubes biocompatibility / J. Chlopek, B. Czajkowska // Carbon. - 2006. – Vol. 44, N 6. - P. 1106-1111. 82. Donaldson, K. Carbon nanotubes: A review of their properties in relation to pulmonary toxicology and workplace safety / K. Donaldson, R. Aitken // Toxicol. Science. - 2006. – Vol. 92, N 1. - P. 5-22. 83. Dreher Kevin, L. Health and environmental impact of nanotechnology: Toxicological assessment of manufactured nanoparticles / Kevin L. Dreher // Toxicol. Science. - 2004. – Vol. 77, № 1. - P.3-5. 84. Driscoll, K.E. Pulmonary response to silica or titanium dioxide: inflammatory cells, alveolar macrophage-derived cytokines, and histopathology / K.E. Driscoll, R.C. Lindenschmidt, J.K. Maurer // AM. J. Repair. Cell Mol. Вio. - 1990. Vol.2. - P. 381-390. 85. Dutta, D. Adsorbed proteins influence biological activity and moleculer targeting of nanomaterials / D. Dutta, S.K. Sundaram, J.G. Teeguarden, B.J. Riley // Toxicol Sci. - 2007. – Vol.100 (1). - P. 303-315. 86. Elder, A.C.P. Pulmonary inflammatory response to inhaled ultrafine particles is modified by age, ozone exposure, and bacterial toxin / A.C.P Elder, R. Gelein, J.N. Finkelstein et al. // Inhal Toxicol. - 2000. - Vol. 12, N 4. - P. 227-246. 87. Ema, M. Reproductive and developmental toxicity studies of manufactured nanomaterials / M. Ema, N. Kobayashi, M. Naya et al. // Reprod. Toxicol. – 2010. – Vol.30, N 3. – P. 343-352. 126 88. Festing, M.F.W. Fifty years after Russell and Burch, toxicologists continue to ignore genetic variation in their test animals / M.F.W. Festing // ATLA. – 2009. – Vol. 37. – P. 1-5. 89. Fischer, H.C. Nanotoxicity: the growing need for in vivo study / H.C. Fischer, W.C. Chan // Curr. Opin. Biotechnol. - 2007. – Vol.18(6). - P.565-571. 90. Flahaut, E. Study nanocytotoxicity of CCVD carbon nanotubes / E. Flahaut, M.C. Durriu // J. Mater. Sci. - 2006. - Vol. 41, N 8. – P. 2411-2416. 91. Gao, G. Titanium dioxide nanoparticle-induced testicular damage, spermatogenesis suppression, and gene expression alterations in male mice / G. Gao, Y. Ze, X. Zhao et al. // J. Hazard Mater. – 2013. – Vol.15. – P. 258-259. 92. Gao, G. Toxicity of Silver and Titanium Dioxide Nanoparticle Suspensions to the Aquatic Invertebrate, Daphnia magna / G. Gao, Y. Ze, X. Zhao et al. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. - 2013. – Vol.91, N1. – P. 76-82. 93. Gao, G. Ovarian dysfunction and gene-expressed characteristics of female mice caused by long-term exposure to titanium dioxide nanoparticles / G. Gao, Y. Ze, B. Li et al. // J. Hazard Mater. – 2012. – Vol.243. – P. 19-27. 94. Gao, J. Polyhydroxy fullerenes (fullerols or fullerenols): beneficial effects on growth and lifespan in diverse biological models / J. Gao, Y. Wang, K. Folta et al. // PLoS One. - 2011. – Vol.6, N 5. – P. 19976. 95. Gao, X. Effects of developmental exposure to TiO2 nanoparticles on synaptic plasticity in hippocampal dentate gyrus area: an in vivo study in anesthetized rats / X. Gao, S. Yin, M. Tang et al. // Biol. Trace Elem. Res. – 2011. – Vol. 143, N 3 – P.1616-1628. 96. Garcon, G. Dunkerque City air pollution particulate matter — induced cytotoxicity, oxidative stress and inflammation in human epithelial lung cells / G. Garcon, Z. Dagher // Toxicol. in vitro. - 2006. - Vol. 20, N 4. – P. 519-529. 97. Gatti, A.M. Detection of micro and nanosized biocompatible particles in blood / A.M. Gatti, M. Montana // J. Mat. Sci. Mat in Med. - 2004. - Vol.15, N 4. P. 469-472. 127 98. Gatti, A.M. Risk assessment of micro and nanoaprticles and the human health / A.M. Gatti // Chapter of Handbook of Nanostructured biomaterials and their applications ed American Scientific Publisher USA. - 2005. - Vol. 12. - P. 347-369. 99. Gomes, S.I. Mechanisms of response to silver nanoparticles on Enchytraeus albidus (Oligochaeta): Survival, reproduction and gene expression profile / S.I. Gomes, A.M. Soares, J.J. Scott-Fordsmand, M.J. Amorim // Hazard Mater. – 2013. – Vol. 15. – P. 254-255 100. Gras, S.L. Functionalized amyloid fibrils for bionanotechnology / S.L Gras, A.M. Squires, C.M. Dobson // Australian Research Council Nanotechnology Network International Conference on Nanoscience and Nanotechnology. - Brisbane, 2006. - Vol.11, N 4. - P. 369-372 101. Gromadzka-Ostrowska, J. Silver nanoparticles effects on epididymal sperm in rats / J. Gromadzka-Ostrowska, K. Dziendzikowska, A. Lankoff et al. // Toxicol. Lett. – 2012. – Vol.214, N 3. – P. 251-258. 102. Hofmann, H. Supraparamagnetic nanoparticles, a multifunctional tool for medical imaging, drug and gene delivery and cancer treatment / H. Hofmann // Australian Research Council Nanotechnology Network International Conference on Nanoscience and Nanotechnology. - Brisbane, 2006. 103. Holsapple, M.P. Toxicological and safety evaluation of nanomaterials / M.P. Holsapple, H.W. Farland // Toxicol. Science. - 2005. - Vol. 88, № 1. - P.1217. 104. Hong, silver nanoparticles with J.S. Combined repeated-dose toxicity study of thereproduction/developmental toxicity screening test [Электронный ресурс] / J.S. Hong, S. Kim, S.H. Lee et al. // URL: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.3109/17435390.2013.857734). 105. Hooper, H.L. Comparative chronic toxicity of nanoparticulate and ionic zinc to the earthworm Eisenia veneta in a soil matrix / L.H. Hooper, K. Jurkschat, A.J. Morgan et al. // Environ. Int. – 2011. – Vol.37, N 6. – P. 1111-1117. 128 106. Hsu, P.C. Quantum dot nanoparticles affect the reproductive system of Caenorhabditis elegans / P.C. Hsu, M. O'Callaghan, N. Al-Salim, M.R. Hurst // Environ. Toxicol. Chem. - 2012. – Vol.31, N 10. – P. 2366-2374. 107. Huczko, A. Pulmonary toxicity of 1D nanocarbon nanomaterials / A. Huczko, H. Lange, M. Bystzzejewski // Fuller Nanotub. Car. - 2005. – Vol. 13. - P. 141-145. 108. Huczko, A. Carbon nanotubes: experimental evidence for a null risk of skin irritation and allergy / A. Huczko, A. Lange // Fullerene Sci. Tech. - 2001. - Vol. 9 (2). - P.247-250. 109. Hussain, S.M. The interaction of manganese nanoparticles with PC12 cells induces dopamine depletion / S.M. Hussain, A.K. Jovorina // Toxicol. Science. - 2006. – Vol. 92, N 2. - P. 456-463. 110. Hussain, S.M. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL3A rat liver cells / S.M. Hussain, K.L. Hess // Toxicol. in vitro. - 2005. – Vol.19, № 7. - P. 975-983. 111. Injac, R. Protective effects of fullerenol C60(OH)24 against doxorubicininduced cardiotoxicity and hepatotoxicity in rats with colorectal cancer / R. Injac, M. Perse, N. Cerne et al. // Biomaterials. – 2009. – Vol. 30, N 6. – P. 1184-1196. 112. Jia, G. Cytotoxicity of carbon nanoma terials: singlewall nanotube, and fullerene / G. Jia, H. Wang, L Yan // Environ. Sci. Technol. - 2005. - Vol. 39. - P. 1378-1380. 113. Jiang, Wen. Nanoparticles - mediated cellular response in size - dependent / Wen Jiang, B.Y.S Kim // Nanotechnol. - 2008. - Vol. 3. - P. 145-150. 114. Juch, H. Nanomaterial interference with early human placenta: Sophisticated matter meets sophisticated tissues // H. Juch, L. Nikitina, P. Debbage et al. // Reprod. Toxicol. - 2013. - Jun 7. (Epub ahead of print) 115. Kabanov, A.V. Polymer genomics: an insight into pharmacology and toxicology of nanomedicines / A.V. Kabanov // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2006. Vol.58 (15). - P.1597- 1621. 116. Kadar, E. The influence of engineered Fe(2)O(3) nanoparticles and soluble (FeCl(3)) iron on the developmental toxicity caused by CO(2)-induced seawater 129 acidification / E. Kadar, F. Simmance, O. Martin // Environ. Pollut. – 2010. – Vol.158 (12). - P. 3490-3497. 117. Kagan, V.E. Nanomedicine and nanotoхicology: two sides of the same coin / V.E. Kagan, H. Bayir, A.A. Shvedova // Nanomedicine: nanotechnology, biology and medicine. - 2005. – Vol.1. - P. 313-316. 118. Kane Ravi, S. Nanobiotechnology: Protein - nanomaterial interactions / Ravi S. Kane, Abraham D. Strook // Biotechnol. Progr. - 2007. – Vol. 23, N 2. - P. 316-319. 119. Karluss, T. Research strategies for safety evaluation for safety evaluation for nanomaterials /T. Karluss, P. Aquar // Toxicol. Science. - 2006. - Vol. 92, N 1. P. 23-32. 120. Kashiwada, Shosaku. Distribution of nanoparticles in the seethrough medaka / Shosaku Kashiwada // Environ. Health Perspect. - 2006. – Vol. 11. - P. 1697-1702. 121. Keelan, J.A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta / J.A. Keelan // Nat. Nanotechnol. – 2011. – Vol.6, N 5. – P. 263-264. 122. Kim, J.E. Magnetic nanoparticles: an update of application for drug delivery and possible toxic effects // J.E. Kim, J.Y. Shin, M.H. Cho // Arch. Toxicol. – 2012. –Vol. 86, N 5. –P. 685-700. 123. Knirsch, W. Nanoparticulate vanadium oxide potentiated vanadium toxicity in human lung cells / W. Knirsch, K. Kern, C. Schleh, C. Adelhelm // Environ. Sci Technol. - 2006. - Vol. 41 (1). - P. 331-336. 124. Kool, P.L. Chronic toxicity of ZnO nanoparticles, non-nano ZnO and ZnCl2 to Folsomia candida (Collembola) in relation to bioavailability in soil // P.L. Kool, M.D. Ortiz, C.A. Van Gestel // Environ. Pollut. – 2011. – Vol.159 (10). – P. 2713-2719. 125. Kostarelos, K. The long and short of carbon nanotube toxicity // Nature Biotechnology. – 2008. – Vol. 26. - P. 774-776. 130 126. Kumar, V. Evaluating the toxicity of selected types of nanochemicals / V. Kumar, A. Kumari, P. Guleria, S. Yadav // Rev. Environ. Contam. Toxicol. – 2012. – Vol.215 (39). – P. 21. 127. Kulvietis, V. Transport of nanoparticles through the placental barrier /V. Kulvietis, V. Zalgeviciene, J. Didziapetriene, R. Rotomskis // Tohoku J. Exp. Med. 2011. – Vol. 225 (4). – P. 225-234. 128. Lacerda, L. Carbon nanotubes as Nanomedicines: from toxicology to pharmacology / L. Lacerda, A. Bianco, M. Prato // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2006. Vol. 58 (14). - P. 1460-1470. 129. Leroux, J.C. Injectable nanocarriers for biodetoxification // J. C. Leroux // Nature Nanotechnol. - 2007. – Vol.2, N11. - P. 679-684. 130. Li, J. Comparative study on the acute pulmonary toxicity induced by 3 and 20 nm Ti02 primary particles in mice / J. Li, Q. Li, J. Xu, J. Li // Environ. Toxicol. Pharmacol. - 2007. – Vol. 24. - P. 239-244. 131. Li, N. Ultrafine particulate pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage / N. Li, C. Sioutas, A. Cho, D. Schmitz // Environ. Health Perspec. - 2003. - Vol. 111. - P. 455-459. 132. Li, Y. Molecular control of TiO2-NPs toxicity formation at predicted environmental relevant concentrations by Mn-SODs proteins / Y. Li, W. Wang, Q. Wu et al. // PLoS One. – 2012. – Vol. 7 (9). – P. 44688. 133. Lipin, D.L. Processing and in vitro assembly of virus like particles / D.L. Lipin, Y.P. Chuan, M. Neibert et al. // Australian Research Council Nanotechnology Network International Conference on Nanoscience and Nanotechnology. – Brisbane, 2006. 134. Lim, D. Oxidative stress-related PMK-1 P38 MAPK activation as a mechanism for toxicity of silvernanoparticles to reproduction in the nematode Caenorhabditis elegans / D. Lim, J.Y. Roh, H.J. Eom et al. // Environ. Toxicol. Chem. – 2012. – Vol. 31 (3). – P. 585-592. 135. Lok, C.N. Silver nanoparticles partial oxidation and antibacterial activities / C.N. Lok, C.M. Ho // J. Biol. Inorg. Chem. - 2007. - Vol. 12 (4).- P. 527-534. 131 136. Lynch, I. The nanoparticle-protein complex as a biological entity; a complex f1uids surface science challenge for the 21 st century / I. Lynch, T. Cedervall, M. Lundqvist // Adv Colloid Interface Sci. - 2007. – Vol. 31. - P. 167-174. 137. Lynch, I. Protein - nanoparticle interactions / I. Lynch, K.A. Dawson // Nanotoday. - 2008. - Vol. 3 (1-2). - P. 40-48. 138. Magrez, A. Cellular toxicity of carbon — based nanomaterials / A. Magrez, S. Kasas // Nano Lett. - 2005. - Vol. 6. - P. 1112-1125. 139. Maxvell, G. Assuring consumer safety without animal testing: a feasibility case study for skin sensitization / G. Maxvell, M. Aleksic, A. Aptula et al. // ATLA. – 2008. – Vol. 36. – P. 557-568. 140. Menezes, V. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure // V. Menezes, A. Malek, J.A. Keelan // Curr. Pharm. Biotechnol. – 2011. –Vol.12 (5). – P. 731-742. 141. Meng, H. Ultrahigh reactivity provokes nanotoxicity: Explanation of oral toxicity of nanocopper particles / H. Meng, Z. Chen, G. Xing, C. Yuan et al. // Toxicology Letters. - 2007. - Vol. 175. - P. 102-110. 142. Miyawaki, J. Toxicity of Single-Walled Carbon Nanohorns / J. Miyawaki, M. Yudasaka, T. Azami et al. // Acsnano. - 2008. – Vol. 2. - P. 213–226. 143. Monteiro R. Challenges for assessing carbon nanomaterial toxicity to the skin / R. . Monteiro, A.O. Inman // Carbon. - 2006. - Vol. 44, N 6. - P. 1070-1078. 144. Muller, R.H. Drug delivery to the brainrealization by novel drug carriers / R.H. Muller, C.M. Keck // J. Nanosci. Nanotech. - 2004. – Vol. 4. – P. 471-483. 145. Musee, N. The effects of engineered nanoparticles on survival, reproduction, and behaviour of freshwater snail, Physa acuta (Draparnaud, 1805) / N. Musee, P.J. Oberholster, L. Sikhwivhilu, A. Botha // Chemosphere. – 2010. – Vol.81 (10). – P. 1196-1203. 146. Nemmar, A. Passage of inhaled particles into the blood circulation in humans / A. Nemmar, P.H. Hoet, B. Vanquickenborne // Circulation. - 2002. Vol.105. - P. 411-414. - 132 147. Nemmar, A. Ultrafine particles affect experimental thrombosis in an in vivo hamster model / A. Nemmar, M.F. Hoylaerts, P.H. Hoet // Am J Respi Crit Care Med. - 2002. - Vol. 166. - P. 998-1004. 148. Nighswonger, G. A Medical Device Link MD & DI column: New polymers and nanotubes add muscle to prothetic limbs (on line). Available From URL: http://www.devicelink.com/mddi/ archive /99/08/004. html (Assessed 2006 Jan 25). 149. Oberdorster, G. Ultrafine particles in the urban air: To the respiratory tractand beyond? / G. Oberdorster, M.J. Utell // Environ. Health Perspect. – 2002. – Vol. 110. – P. 440-441. 150. Oberdorster, G. Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environmental Health Perspectives. - 2005. - Vol.7, N 13. - P. 823-839. 151. Oberdorster, G. Systemic effects of inhaled ultrafine particles in two compromised, aged rat strains / G. Oberdorster // Inhal Toxicol. - 2004. - Vol.16 (6/7). - P. 461-471. 152. Oberdorster, G. Toxicology of airborn particles (on line). Available from URL: environment and occupational http:// www.envmed. Rochester. Edu. / envmed/tox/faculty/oberdoerster.htm [assessed 2006 Jan 25]. 153. Peek, L.J. Nanotechnology in vaccine de livery / L.J. Peek, C.R. Middaugh // Adv. Drug. Deliv. Rew. - 2008. - Vol. 60 (8). – P. 915-928. 154. Powers, C.M. Silver nanoparticles alter zebrafish development and larval behavior: distinct roles for particle size, coating and composition / C.M. Powers, T.A. Slotkin, F.J. Seidler et al. // Neurotoxicol. Teratol. – 2011. – Vol.33 (6). – P. 708-714. 155. Powers, K.W. Characterization of nanoscale particles for toxicological evaluation / K.W. Powers, S.C. Brown // Toxicol. Science. - 2006. – Vol. 90, N 2. P. 296-303. 156. Rockville, M. Challenge and opportnunity on the critical path to new medical products. The origins and uses of mouse outbread stocks / M. Rockville, R. Chia, F. Achilli et al. // Nature Genetics. – 2005. – Vol. 37. – P. 1181-1186. 133 157. Roy, I. Optical tracking of organically modified silica nanoparticles as DNA carriers: a nonviral, nanomedicine approach for gene delivery / I. Roy, T.Y. Ohulchanskyy, D.J. Bharali et al. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 2005. - Vol. 102. P. 279-284. 158. Ryan, J. Fullerene nanomaterials inhibit the allergic response / J. Ryan, H. Bateman // J. Immunolol. - 2007. - Vol. 179, N 1. - P. 665-672. 159. Sahoo, S.K. The present and future of nanotechnology in human health care / S.K. Sahoo, S. Parveen, J.J. Panda // Nanomedicine: Nanotechnology in human health care. - 2007. - Vol. 3. - P. 20-31. 160. Sayes, C.M. Functionalization density dependence of single walled carbon nanotubes cytotoxicity in vitro / C.M. Sayes, F. Liang, J.L. Hudson // Toxicol. Lett. 2006. - Vol. 161. - P. 135-138. 161. Shvedova, A.A. Cytotoxic and genotoxic effects of single wall carbon nanotube exposure on human keratinocytes and bronchial epithelial cells / A.A. Shvedova, E. Kisin, N. Keshava // 227 American Chemical Society National Meeting. 2004. - P. 130-135. 162. Takeda, K. Health effects of nanomaterials on next generation / K. Takeda, Y. Shinkai, K. Suzuki et al. // Yakugaku Zasshi. – 2011. – Vol. 131 (2). – P. 229-236. 163. Tao, T.Y. The copper toxicosis gene product Murr 1 directly interacts with the Wilson disease protein / T.Y. Tao, F.L. Liu, L Klomp // Biol. Chem. - 2004. – Vol. 278. - P. 41593-41596. 164. Tykhomyrov, A.A. Nanostructures of hydrated C60 fullerene (C60HyFn) protect rat brain against alcohol impact and attenuate behavioral impairments of alcoholized animals / A.A. Tykhomyrov, V.S. Nedzvetsky, V.K. Klochkov, G.V. Andrievsky // Toxicology. – 2008. - Vol. 246 (2-3). – P. 158-165. 165. Vallhov, H. Mesoporous silica particles induce size dependent effects on human dendritic cells / H. Vallhov, S. Gabrielsson // Nano Lett. - 2007. - Vol.7, N 12. - P. 3576-3582. 134 166. Wang, J. Acute toxicity and biodistribution of different sized titanium dioxide particles in mice after oral administration / J. Wang, G. Zhou, C. Chan // J. Physical Chemistry. - 2007. - Vol. 168. - P. 176-185. 167. Wang, J. Disruption of zebrafish (Danio rerio) reproduction upon chronic exposure to TiO Nanoparticles / J. Wang, X. Zhu, X. Zhang et al. // Chemosphere. – 2011. – Vol. 83 (4). – P. 461-467. 168. Warheit, D.B. Pulmonary toxicity studies with Ti02 particles containing various commercial coatings / D.B. Warheit, T.R. Webb, K.L. Reed // Toxicologist. 2003. - Vol. 72 (1). - P. 298-300. 169. Warheit, D.B. Pulmonary bioassay studies with nanoscale and fine quarts particles in rats: Toxicity is not dependent upon particle size but on surface characteristics / D.B. Warheit, T.R. Webb // Toxicol. Sci. - 2007. - Vol. 95, N 1. - P. 86-97. 170. Warheit, D.B. Pulmonary toxicity study in rats with three forms of ultrafine TiO2 particles: differential responses related to surface properties / D.B. Warheit, T.R. Webb, K.L. Reed // Toxicology. - 2007. – Vol. 230. - P. 90-104. 171. Williams, A.J. Assessing and interpreting arterial blood gases and acid base balance / A.J. Williams // BMJ. - 2005. - Vol. 317. - P. 1213-1216. 172. Zhou, Y.M. Oxidative stress and NFkB activation in the lungs of rats: a synergistic interaction between soot and iron particles / Y.M. Zhou, C.Y. Zhong, I.M. Kennedy et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2003. – Vol. 190. - P. 157-169. 173. Zhu, Lin. DNA damage induced by multiwalled carbon nanotubes in mouse embryonic stem cells / Lin Zhu, Dong Chang // Nano Lett. - 2007. - Vol. 7, N 12. - P. 3592-3597. 174. Zhu, X. Toxicity assessment of iron oxide nanoparticles in zebrafish (Danio rerio) early life stages / X. Zhu, S. Tian, Z. Cai // PLoS One. – 2012. – Vol. 7 (9). – P. 462-478.
