полиморфизм днк и накопление каннабиноидов у культурной и

УДК: 581.5;581.19; 577.15;633.88
К.Н.САРСЕНБАЕВ, Л.С. КОЖАМЖАРОВА, А.С. КОЖАМЖАРОВА
ЕНУ им. Л.Н.Гумилѐва, ТарГУ им. М.Х.Дулати,
КазНМУ им. С.Д.Асфендиярова
ПОЛИМОРФИЗМ ДНК И НАКОПЛЕНИЕ КАННАБИНОИДОВ У КУЛЬТУРНОЙ И ДИКОРАСТУЩЕЙ КОНОПЛИ В
ШУЙСКОЙ ДОЛИНЕ
С помощью RAPD-анализа изучался полиморфизм ДНК у культурных сортов, расщепляющегося потомства и различных популяций
шуйской конопли. С помощью 10 специфичных праймеров выявлены достоверные генетические различия между сортами, популяциями и
гибридами. Показано, что способность к накоплению наркотического тетрагидроканнабинола не является доминантным признаком, а
преимущественный синтез ненаркотического каннабидиола связан с высокой активностью каннабидиолсинтазы.
Ключевые слова: RAPD-анализ, полиморфизм ДНК, шуйская конопля, генетические различия, популяция, гибрид, высокий активность
каннабидиолсинтазы, наркотический тетрагидроканнабинол.
В природе больше половины видов растений являются
перекрѐстноопыляемыми. Такое размножение обусловливает
непрерывную рекомбинацию генов. Динамика популяции
выражается в изменении частот встречаемости каждого аллеля
данного гена. Для определения популяционной структуры
проводят анализ по различным генетическим маркерам [1].
С помощью нескольких десятков биохимических маркеров
выявлен генетический полиморфизм у более чем 200 видов
живых организмов и разработаны основные теоретические
положения популяционной генетики (1, 43). Однако
использованные
маркѐры
опосредовано
определяют
генетические различия между таксонами. Например, анализ
белков позволяет исследовать полиморфизм только белоккодирующих
последовательностей
и
только
у
экспрессирующихся генов.
Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР,
Polymerase chain reaction, PCR) стало одним из наиболее
выдающихся событий в области молекулярной биологии за
последние 20 лет. Использование молекулярных ДНК-маркеров
[2] позволило идентифицировать гены и выявить генетический
полиморфизм различных организмов [3] непосредственно на
уровне генов, а не на уровне их продуктов. Одним из 4
модификаций ПЦР является RAPD-метод, преимуществом,
которого является простота и скорость проведения анализа [4-6].
В Казахстане, где дикорастущая наркотическая конопля только в
Шуйской долине занимает площадь более 1,2 млн.га,
ненаркотическая произрастает в половине областей особую
актуальность приобретают исследование по популяционному
полиморфизму. Это связано с необходимостью как
использования еѐ в промышленном производстве, так и
разработке методов уничтожения. Исходя из этого, целью нашей
работы было изучение полиморфизма популяций и влияния
перекрѐстного опыления культурной конопли (Cannabis sativa)
дикорастущей
(Cannabis ruderalis) на генетический
полиморфизм потомства
Материалы и методы. Объектом исследования являлись сорт
Fedora 17 и его расщепляющееся в Шуйской долине гибридное
потомство F1 и F2, а также дикие популяции конопли,
произраставшие
на
территории
Меркенского
района
Жамбылской области и Уйгурского района Алматинской
области.
Для анализа брали созревшие и отлежавшиеся более 30 дней
семена и
выделяли ДНК цетилтриметил аммониум бромидом (СТАВ) с 20
мМ 2-меркаптоэтанолом по общепринятой методике [7].
Чистоту
полученных
препаратов
ДНК
проверяли
электрофоретическим разделением в агарозном геле.
Для PCR-амплификации использовали девять праймеров.
3.CCGAATTCGC, 4.CTGACCAGCC, 5. ATCTGGTGGT, 6.
GGACCCCGCC, 7.TCAGGACGCTAC, C, 12CCTTGACGCA,14.
AGCAGCGTCG, 15GTGTGCCCCA, 16.GGGGTGACGA .
Шесть из них были наиболее специфичными. Реакционная
смесь объемом 20 мкл содержала 50 мМ KCl, 20 мМ трис-HCl,
рН 8,4, 3 мМ MgCl2, 0,01% Tween-20, 0,15 мМ каждого dNTP,
0,2 мкМ праймера, 20 нг ДНК и 1 ед. Tag-полимеразы. В
пробирки наслаивали 40 мкл минерального масла. PCRамплификацию проводили в следующем режиме: первые четыре
цикла – 1 мин. При 930С, 1,5 мин. При 430С и 2 мин. При 720С; в
последующих циклах отжиг вели при 47-550С (всего 35 циклов).
Последняя элонгация длилась 10 мин. Продукты амплификации
разделяли электрофорезом в 10% ПААГ и гели просматривали в
GelDoc при длине волны от 260 до 360 нм.
Для определения генетической дистанции по полиморфизму
RAPD-спектров и получения матрицы состояния бинарных
признаков были использованы алгоритмы Нея и Ли [8]. По
матрице состояния были построены дендрограммы генетических
дистанции с помощью невзвешенного парногруппового метода с
арифметическим усреднением – UPGMA (unweighted pair-group
mathematical averige).
Определение содержания каннабиноидов проводили на
газожидкостном
хроматографе-масс-спектрографе GCMS
фирмы “Shimadzu”. Листья для анализа брали на X-XI (фаза
молочной – молочно-восковой спелости) и XI-XII (фаза
молочно-восковой – восковой спелости) этапах органогенеза.
Размельченные листья обычно экстрагировали этанолом или
метанолом (100 мг образца доводим до 10 мл, для конечной
концентрации каннабиноидов 1мг/мл) в течение 1 часа при 700С
или 24 часа при комнатной температуре. Затем надосадочную
жидкость декантировали и использовали для нанесения в
плазменно-ионизационный детектор (1мкл).
Результаты и их обсуждение. Использованные в работе
праймеры
обеспечили
синтез
специфических
и
воспроизводимых наборов ампликонов. Выявлен полиморфизм
исследуемых образцов. Все шесть исследованных образцов
конопли имели специфические RAPD-спектры, которые
отличались числом, размерами ампликонов (от 90 до 1700 п.н.) и
степенью их выраженности на электрофореграмме. Общее число
ампликонов в зависимости от праймера колеблется от 56 до 95.
Электрофоретические спектры (рис.1 - 4) свидетельствуют о
том, что наряду с общими ампликонами, характерными для всех
образцов, существуют специфичные фрагменты ДНК.
На рис.1 приведѐн RAPD-спектр 6 образцов, полученный при
использовании праймеров 3 и 12. С помощью праймера 3
амплифицирован всего 71 фрагмент. Из них 6 являются общими
для всех образцов и имеют размер от 170 до 800 н.п. С
помощью данного праймера выявлен полиморфизм ДНК у
анализируемых образцов конопли: у образца 3 (потомство F2
сорта Fedora 17) обнаружены специфичные фрагменты длинной
340 и более 1700 н.п., но отсутствуют 4 фрагмента ДНК,
длинной около 350, 500, 580 и 1600 н.п., присутствующие у всех
остальных образцов. По степени выраженности спектра образец
3 отличается четкими зонами с ампликонами длинной около
110, 240, 250, 610 и 670 п.н. Они присутствуют или отсутствуют
в спектре у других образцов. Менее выражена у него зона в 460
н.п., которая у всех остальных является четкой. Дикорастущие
популяции из Меркенского – образцы 4 и 6 и Уйгурского
(образец 5) районов также отличаются друг от друга по составу
ампликонов. Так образец 5 имеет в спектре фрагменты размерм
280 и 610 п.н., отсутствующие у образцов из шуйских
популяции, но присутствующие в спектре культурного сорта и
его потомства F2. Сходство между уйгурской популяцией и
культурным сортом заключается в наличии в спектре фрагмента
ДНК в 1050 н.п., который отсутствует у остальных образцов. У
дикорастущих популяций в спектре отсутствует ампликон
размером 330 н.п., который обычно проявляется у сорта и его F2
потомства.
В RAPD-спектре праймера 12 выявлено 10 общих для всех
образцов ампликонов размером от 170 до 1000 н.п. Для образца
3 характерно наличие 710, 520, 340 и 240 н.п. фрагментов,
отсутствующих у других образцов. Фрагменты длиной около
280, 470, 1100 и 1310 н.п. у него выражены более чѐтко, чем у
исходного сорта. Популяции дикорастущей конопли отличаются
между собой в основном лишь по степени выраженности тех
или иных фрагментов ДНК в спектре. У них отсутствует
фрагмент размером 320 н.п., обычный для культурного сорта и
его расщепляющегося в F1 и F2 потомства. Фрагмент размером
1600 н.п. не проявляется в спектре ДНК конопли из
Меркенского района с зелѐными листьями, в то время как у этой
1
2
3
4
5
же популяции, но с фиолетовыми листьями, у уйгурской
популяции и потомства F1 исходного сорта он присутствует.
6
M
1
2
3
4
5
6
500
400
300
200
100
Olig 3
Olig 12
Рисунок 1 - Электрофоретические спектры продуктов RAPD-амплификации ДНК с праймерами 3 и 12 сорта Fedora 17 (1), его
расщепляющегося потомства F1 (2) и F2 (3) и диких популяций конопли Меркенского (4 – фиолетовые; 6 – зелѐные листья) и Уйгурского (5)
районов
С помощью праймера 4 (рис. 2) амплифицировано два
фрагмента ДНК длиной около 90 и 260 н.п., которые являются
общими для всех образцов. У сорта Fedora 17 (образец 1) с
помощью этого праймера амплифицирован фрагмент ДНК в
1600 н.п., отсутствующий у других образцов. У 3 образца в
спектре не отсутствует фрагмент в 720 н.п., присутствующий у
других и обнаружен специфичный только для этого образца
ампликон в 420 н.п. Специфичный фрагмент в 1500 н.п. выявлен
у образца 2. Только у 5 образца в спектре проявляются
специфичные фрагменты размером 370 и 460 н.п. В спектре у
дикорастущих образцов также присутствуют специфичные
фрагменты ДНК длиной 350 н.п., отсутствующие у сорта и его
потомства.
1
2
3
4 5
6 М
М
1
2
3
4
5
На рисунке 3 видно, что праймер 14 обуславливает
амплификацию 95 фрагментов. 9 из них размером от 90 до 680
н.п. являются общими для всех образцов. В RAPD-спектре
потомства F2 исходного сорта обнаружены специфичные
фрагменты размером 180, 270 и 900 н.п., которые не характерны
для остальных образцов. Однако у этого образца отсутствуют
280, 320 и 360 н.п. фрагменты присутствующие в спектре у
других образцов. Для меркенской конопли (4 и 6 образцы) и
потомства F1 сорта Fedora 17 характерно наличие фрагментов в
220 и 720 н.п. В спектре меркенского образца, фиолетовые
листья и F2 потомства исходного сорта выявлен специфичный
фрагмент в 120 н.п.
6
400
400
300
300
200
200
100
100
Рисунок 2.
Рисунок 3.
Электрофоретические
спектры продуктов RAPD-амп
лификации ДНК с праймером 4.
Обозначения те же, что на рис.1
Электрофоретические спектры
продуктов RAPD-амплификации ДНК
с праймером 14. Обозначения те же, что на рис.1
Полиморфизм ДНК у анализируемых образцов конопли выявлен
и при использовании праймеров 15 и 16 (рис.4). С помощью
праймера 15 у 3-го образца амплифицированы фрагменты ДНК в
150 и 320 н.п., которые не синтезировались у других образцов. В
ДНК-спектре образца из Меркенского района, зелѐные листья
(6-й образец) отсутствовал фрагмент в 370 н.п., характерный для
двух других образцов дикой конопли (4, 5 образцы).
При использовании же праймера 16 синтезировано 56
ампликонов. Фрагменты размером в 180 и 270 н.п. выявлены у
всех образцов. У 3 образца обнаружены специфичные
фрагменты длиной около 200 и 1400 н.п., а также отсутствует,
имеющийся у других образцов, фрагмент в 700 н.п. Сходство
диких популяции заключается в наличии у них в спектре
фрагмента в 1000 н.п., который отсутствует у культурного сорта
и его потомства F1 и F2.
400
300
200
100
Olig15
Olig16
Рисунок 4 - Электрофоретические спектры продуктов RAPD-амплификации ДНК с праймерами 15 и 16. Обозначения те же, что на рис.1
В целом, можно сказать, что присутствие в RAPD-спектре у
сорта Fedora 17 отдельных фрагментов ДНК и отсутствие их у
его потомства F1 и F2 свидетельствует о гетерогенности по
данному локусу.
Данные по полиморфизму электрофоретических спектров
продуктов RAPD-амплификации ДНК позволили провести
кластерный анализ различных образцов конопли с помощью
программы UPGMA (рисунок5-8).
Рисунок 5 - Дендрограмма генетической взаимосвязи между различными образцами дикой и культурной конопли, рассчитанным по
данным RAPD-анализа с праймером 3 методом UPGMA
Рисунок 6 - Дендрограмма генетической взаимосвязи между различными образцами дикой и культурной конопли, рассчитанным по
данным RAPD-анализа с праймером 14 методом UPGMA
Рисунок 7 - Дендрограмма генетической взаимосвязи между различными образцами дикой и культурной конопли, рассчитанным по
данным RAPD-анализа с праймером 15 методом UPGMA
Рисунок 8 - Дендрограмма генетической взаимосвязи между различными образцами дикой и культурной конопли, рассчитанным по
данным RAPD-анализа с праймером 16 методом UPGMA
Из данных дендрограмм (рис. 5-8) видно, что шуйская
популяция (6 образец) и потомство F1 сорта Fedora 17 образуют
отдельный кластер. Это может свидетельствовать об их
генетическом сходстве. Наиболее близко к ним находится сам
сорт Fedora 17, а также 4-й шуйский образец. Из дендрограммы,
составленной на основе RAPD-анализа с праймером 15, видно,
что дикие популяции из Меркенского и Уйгурского районов (4 и
5 образцы) образуют одну генетическую группу. Самым
отдаленным по генетическому родству является потомство F2
сорта Fedora 17.
Таким образом, можно сказать, что генетическая близость
шуйской конопли и потомства F1 возможно является
результатом перекрестного опыления исходного сорта пыльцой
дикой конопли. В то время как наибольшая отдаленность
потомства F2 сорта Fedora 17 объясняется расщеплением его
гетерогенных (гетерозиготных) родителей. Наличие разницы в
генетической дистанции между популяциями Cannabis ruderalis
может быть обусловлено гетерогенной структурой данных
популяций.
Одним из маркѐров популяций у конопли являются
каннабиноиды. Одни из них не обладают наркотическим – КБН
(каннабинол) и КБД (каннабидиол), а другие - ТГК
(тетрагидроканнабинол), ТГКА обладают наркотическим
эффектом. Мы попытались изучить наследование этого
признака у потомства культурного сорта. В таблице приведены
результаты определения содержания каннабиноидов у сорта
Fedora 17, его потомства F1 и F2, популяциях Cannabis ruderalis.
Таблица 1 - Содержание каннабиноидов у европейского сорта, его потомства F1 и популяций дикой конопли
№
1.
2.
3.
4.
Сорт/экотип
Fedora 17 F1
F2 Fedora 17
F2 Fedora 17
F2 Fedora 17
5.
Cannabis ruderalis
6.
Cannabis ruderalis
7.
8.
Cannabis ruderalis
Cannabis ruderalis
Этап органогенеза
X-XI
X-XI (Меркенский р-н)
XI-XII (Меркенский р-н)
XI-XII (растение внешне сходное с Cannabis ruderalis;
Меркенский р-н)
XI-XII (растение с фиолетовыми листьями, Меркенский р-н,
переправа)
XI-XII (растение с зелеными листьями, Меркенский р-н,
переправа)
XI-XII (Уйгурский р-н, 1 крупное растение)
XI-XII (Уйгурский р-н, среднее растение)
Из приведенных данных видно, что у потомства F1 исходного
сорта не наблюдается накопления наркотического соединения тетрагидроканнабинола (ТГК), хотя несколько возрастает
содержание каннабидиола (КБД). У исходного сорта в условиях
Европы содержание ТГК не превышало 0,15%, а КБД
находилось примерно на том же уровне. Т.е. накопление ТГК
является генетически детерминированным признаком и
экологические условия
(Шуйская долина) не влияют на
накопление наркотического вещества. У дикорастущих шуйских
популяций его содержание в сентябре-октябре в прицветниках
достигает 8%, а КБД и КБН -0,12 – 2% [9]. Это, по нашему
мнению, связано с гомозиготностью дикорастущих популяций
по признаку накопления ТГК.
ТГК, %
0,12
0,18
0,07
0,06
КБД, %
0,82
1,08
1,43
1,01
1,25
0,48
1,32
0,14
1,5
1,0
1,0
0,66
Таким образом, сорт культурной конопли Cannabis sativa, его
расшепляющееся потомство F1 и F2, дикорастущие популяции
Cannabis ruderalis отличаются друг от друга по структуре ДНК
и накоплению каннабиноидов (т.е. генетически неоднородны).
Уровень накопления каннабиноидов у конопли, в частности
содержание ТГК, по всей видимости, является генетически
детерминированным признаком. Можно ожидать, что посевы
волокнистых ненаркотических сортов будут изменять
генетическую структуру шуйских популяций в сторону низкого
содержания ТГК. Различия в уровне накопления ТГК и КБД
связаны
с
неодинаковой
активностью
их
синтаз.
Аминокислотная последовательность изоферментов у ТГКАсинтазы, КБД-синтазы неодинакова, что и определяет их
каталитические свойства.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Сарсенбаев К.Н., Беков А.А.-Х., Рахимбаев И.Р. Изоферменты в хемосистематике высших растений. Алматы: 1982, - 145 с.
2. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucler Acids Res., - 1990, - №18. - Р.7213-7218
3. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений// Генетика. 1994. Т.
35. №11. С. 1538-1549
4. Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD-анализа растительных геномов// Генетика. - 1996. - №33: - С.476-480
5. Оганесян А.С., Кочнева Е.З., Рысков А.П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD PCR// Генетика. - 1996.
№32. - С.448-451
6. Кочнева Е.З., Оганесян А.С., Рысков А.П. RAPD-маркеры генома картофеля: клонирование и использование для определения
межвидовых и межсортовых различий// Молекулярная биология. 1999. - Т.33. - №5. - С.893-897
7. Jhingan A.R. A novel technology for DNA isolation// Methods of Mol. Cell. Biol. 1992. - №3. - P.15-22
8. Nei M., Li W. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. - №76.
- P.5269-5273
9. Сарсенбаев К.Н., Кожамжарова Л.С., Айдосова С.С., Ережепов А.Е. Особености волосков конопли (Cannabis L.) и состав
каннабиноидов.// Вестник КазНУ им.Аль-Фараби, сер.биол., - №1(22), - 18 – 20, - 2004. – 235 с.
К.Н. САРСЕНБАЕВ, Л.С. ҚОЖАМЖАРОВА, А.С. ҚОЖАМЖАРОВА
Л.Н.Гумилѐв ЕҰУ, М.Х.Дулати ТарМУ, С.Ж.Асфендияров ҚазҰМУ
ШУ АҢҒАРЫНДАҒЫ МӘДЕНИ ЖӘНЕ ЖАБАЙЫ ҚАРАСОРА КАННАБИНОИДТАРЫН ЖИНАҚТАУШЫ ЖӘНЕ ДНК
ПОЛИМОРФИЗМІ
Түйін: RAPD -талдау көмегімен, Шу қарасорасының түрлі популяциясы мәдени сортының бөлшектеме ұрпақтары және ДНҚ
полиморфизмі зерттелінді.
10 арнайыландырылған праймерлар көмегімен, популяциялармен будандар арасындағы елеулі генетикалық айырмашылықтарды бірге
анықтады. Наркотикалық тетрагидроканнабинолдың жинақталуына қабілеттілігінің басым ерекшелігі емес, наркотикалық каннабидиолдың
синтез артықшылықтары каннабидиолсинтаздың жоғары белсенділігімен байланыстылығы көрсетілді.
Түйінді сөздер: RAPD-анализ, ДНҚ полиморфизмі, шу қарасорасы, генетикалық айырмашылықтар, популяция, гибрид, высокий
активность каннабидиолсинтазаның жоғары белсенділігі, наркотикалық тетрагидроканнабинол.
K.N. SARSENBAEV, L.S. KOZHAMZHAROVA, A.S. KOZHAMZHAROVA
ENU. L.N.Gumilev, TarSU M.H.Dulati,
KazNMU S.D.Asfendiyarov
DNA POLYMORPHISM AND THE ACCUMULATION OF CANNABINOIDS IN CULTIVATED AND WILD
HEMP SHUISKYS THE VALLEY
Resume: Using RAPD-analysis studied the DNA polymorphism in cultivated varieties of fissile offspring and different populations Shuyskaya
cannabis. With 10 specific primers revealed significant genetic differences between varieties and hybrids populations. It has been shown that the
ability to accumulate drug tetrahydrocannabinol is not dominant trait, preferably the synthesis and narcotic cannabidiol associated with high activity
cannabidiol synthase.
Keywords: RAPD-analysis, DNA polymorphism, Chu hemp, genetic variation, population, hybrid, high activity kannabidiolsintazy, narcotic
tetrahydrocannabinol.