Характеристика клеток Лейдига у потомства самок крыс с

Характеристика клеток Лейдига у потомства самок крыс
с хроническим поражением печени различного генеза при действии
иммобилизационного стресса
Д.м.н., проф. Г.В. БРЮХИН, к.м.н., доц. М.Л. СИЗОНЕНКО, асп. Е.В. КУСТАВИНОВА
ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, Челябинск, Россия, 454092
Цель исследования — анализ морфофункционального состояния клеток Лейдига семенников у половозрелого потомства
самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени различного генеза.
Материал и методы. Объектом исследования явилось половозрелое (70-дневное) потомство самок крыс с экспериментальным
поражением гепатобилиарной системы различного генеза. С целью изучения особенностей антистрессорной резистентности
клеток Лейдига семенников у потомства экспериментальных животных создавался стресс путем иммобилизации животных в
камере Когана.
Результаты. Содержание сперматозоидов в 1 мл эпидидимальной взвеси изменено по сравнению с интактными животными
(44,2±3,88·106), у животных алкогольной группы данный показатель составил 51,2±1,18·106 и соответственно 17,15±1,49·106 —
у животных мезенхимальной группы. Иммобилизационный стресс обусловливает у всех экспериментальных животных
существенное снижение концентрации сперматозоидов. Стрессовый фактор обусловил у интактных животных увеличение
относительного количества активных клеток Лейдига, в то же время у подопытных крысят алкогольной и мезенхимальной
групп иммобилизационный стресс вызывает снижение количества активных эндокриноцитов и увеличение числа фракции
неактивных клеток.
Выводы. Установлено, что у самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза в условиях воздействия
иммобилизационного стресса рождается потомство со сниженной антистрессорной резистентностью клеток Лейдига, что
нашло отражение в снижении как суммарного количества интерстициальных эндокриноцитов, так и их активных фракций,
происходящее на фоне увеличения количества неактивных эндокриноцитов. В то же время действие иммобилизационного
стресса на интактных животных, напротив, обусловило увеличение количества активных клеток Лейдига в гонадах потомства.
Ключевые слова: стресс, экспериментальное поражение печени, потомство, семенники, клетки Лейдига.
Characteristics of Leydig cells in offspring in female rats with chronic liver injury
and immobilization stress
G.V. BRYUKHIN, M.L. SIZONENKO, E.V. KUSTAVINOVA
South-Ural State medical University, Chelyabinsk, Russia, 454092
Objective. To analyse the morphofunctional state of Leydig cells of adult posterity from female rats with experimental chronic liver
injury of various genesis.
Material and methods. Sexually mature (70-day) posterity of female rats with experimental injury of the hepatobiliary system of
various genesis were investigated.
Results. Immobilization stress causes a significant decrease in sperm concentration.
Conclusion. Female rats with experimental liver injury of various genesis in conditions of immobilization stress born the posterity
with low antistress resistance of Leydig cells leading to the reduction in the total amount of interstitial endocrine cells and their active
fractions. The effect of immobilization stress in intact animals , by contrast, caused an increase in the number of active Leydig cells
in the posterity’s gonads.
Key words: stress, experimental liver injury, posterity, testes, Leydig cells.
Согласно многочисленным клиническим наблюдениям, в настоящее время имеет место повсеместное увеличение числа инфертильных состояний
у мужчин [4, 15, 18, 21, 22]. Не вызывает сомнений,
что рост значимости мужского фактора в патогенезе
супружеского бесплодия может быть обусловлен как
органической патологией репродуктивной системы,
так и неблагоприятными воздействиями эндогенного и экзогенного характера [8, 12]. Вместе с тем роль
стрессорной составляющей в механизмах нарушения
мужской фертильности изучена крайне недостаточно [2, 5, 23]. Общепризнано, что в системе регуляции
22
функции яичек, в том числе генеративной, особое
место занимают клетки Лейдига, секретирующие тестостерон, необходимый для регуляции сперматогенеза [17].
Цель настоящего исследования — анализ морфофункционального состояния клеток Лейдига семенников у половозрелого потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени
различного генеза.
Для корреспонденции:
e-mail: maximus_74.79@mail.ru
Проблемы репродукции, 5, 2014
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования проведены на белых лабораторных крысах самках Вистар и их половозрелом
(70-дневном) потомстве. Для достижения поставленной цели у самок крыс моделировалось хроническое поражение печени различного генеза.
Хроническая алкогольная интоксикация с преимущественным поражением печени создавалась путем поения животных в течение 3 мес 15% раствором
этилового спирта (условия свободного доступа) [3].
Мезенхимальное поражение печени у самок
крыс воспроизводили путем введения им 20 ЕД активности щелочной фосфатазы [11].
Хроническое поражение печени у животных верифицировали на основании морфологических (некробиотические изменения гепатоцитов, носящие
очаговый характер, дискомплексация гепатоцитов,
гиперплазия печеночных макрофагов, расширение
синусоидных капилляров, массивная лимфогистиоцитарная периваскулярная инфильтрация портальных трактов, распространяющаяся на периферию
долек), иммунологических (высокий титр противопеченочных аутоантител 1:160, 1:320), биохимических (гипергаммаглобулинемия, увеличение активности аланин-, аспартатаминотрансферазы, содержания билирубина) критериев.
Через 7 дней после моделирования хронического
поражения печени к самкам подсаживали интактных
самцов. Объектом исследования служили семенники
половозрелого (70-дневного) потомства от самок
крыс с хроническим алкогольным (алкогольная
группа 12 крысят из 12 пометов) и мезенхимальным
(мезенхимальная группа 10 крысят из 10 пометов)
поражением печени. Группу сравнения составили
14 крысят из 14 пометов (контрольная группа). Зрелые сперматозоиды получали из придатка семенника, разрезая его вдоль в среде дозированного количества 5% раствора глюкозы (в объеме 1 мл) при 37 °С.
Затем отрезком отмытой резиновой трубки эпидидимис активно перемещали в течение 2 мин для освобождения от части сперматозоидов [10]. С помощью
камеры Горяева подсчитывали количество сперматозоидов в единице объема (1 мл).
Функциональное состояние клеток Лейдига
оценивали на серийных гистологических срезах,
окрашенных гематоксилином и эозином, с определением с помощью морфометрической установки
Motic BA 400 (фирма «Motic», Германия) площади
интерстициальной ткани, суммарного количества
клеток Лейдига, в том числе фракции активных и
неактивных эндокриноцитов, их диаметра. Кроме
того, определяли индекс активности клеток Лейдига, представляющий собой отношение числа активных эндокриноцитов к числу неактивных. Вместе с тем определяли коэффициент, отражающий
отношение суммарного количества клеток Лейди-
га на 1 семенной извитой каналец к таковому клеток Сертоли.
С целью изучения особенностей антистрессорной резистентности клеток Лейдига семенников у
потомства экспериментальных животных нами моделировался иммобилизационный стресс. Стресс
вызывали иммобилизацией животных на спине в камере Когана. Первоначально иммобилизация продолжалась с 10:00 до 15:00. Затем после 2 ч отдыха
животных вновь помещали в камеру на ночь. На следующее утро иммобилизацию прекращали до вечера.
В 17:00 того же дня животных вновь подвергали иммобилизации до утра [9].
Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения
работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №755 от 12.08.77 МЗ СССР).
Полученные результаты обрабатывали на компьютере с использованием программы Statistica v.6.0
(«Statsoft Inc.»). Учитывая небольшую выборку животных, достоверность полученных результатов
определяли при помощи непараметрического метода — критерия Манна—Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Первоначально нами было установлено, что содержание сперматозоидов в 1 мл эпидидимальной
взвеси
у подопытных животных алкогольной
(51,2±1,18·106) и мезенхимальной (17,15±1,49·106)
групп отличалось от такового у интактных крысят
(44,2±3,88·106). Под влиянием стресса содержание
сперматозоидов у всех экспериментальных животных
как интактной, так и подопытных групп снижается.
Так, если исследуемый показатель у интактных крысят, подвергшихся воздействию стресса, составил
13,25±0,02·106, то у крысят алкогольной и мезенхимальной групп он был намного ниже (3,20±0,154·106 и
0,29±0,03·106 соответственно).
Известно, что сперматогенез является одним из
наиболее динамичных процессов в организме млекопитающих и человека, связанных с клеточной
пролиферацией и дифференцировкой, протекающих под влиянием разнообразных гормонов, цитокинов и факторов роста [6, 24]. Среди регуляторных
факторов особое место занимает тестостерон, вырабатываемый клетками Лейдига.
Нами установлено, что изменение суммарного
количества сперматозоидов у подопытных животных
сопровождается снижением суммарного количества
интерстициальных клеток. При этом, как видно из
таблицы, у подопытных животных имеет место снижение числа неактивных и увеличение числа активных клеток Лейдига по сравнению с контролем. Эти
изменения обусловили увеличение индекса активности клеток Лейдига. Выявленная гиперплазия клеток
Лейдига, по-видимому, у подопытных животных
23
Клетки Лейдига у потомства крыс с поражением печени
Характеристика клеток Лейдига семенников у подопытных животных
Параметр
Суммарное количество клеток
Лейдига
Количество активных клеток
Лейдига, %
Количество неактивных
клеток Лейдига, %
Индекс активности клеток
Лейдига
Контрольная Алкогольная Мезенхимальная
группа
группа
группа
Иммобилизационный стресс
контрольный
алкогольный
мезенхимальный
27,95±0,60
9,64±0,908*
16,98±0,934*
8,84±0,307**
5,22±0,386* **
7,72±0,434**
70,77±1,025
79,74±2,162*
76,97±1,162*
82,37±0,263**
50,39±1,323* **
64,17±3,993**
29,03±1,025
20,26±2,161*
23,03±1,163*
17,63±0,115**
49,61±1,324* **
35,83±3,994**
2,42±0,186
2,59±0,026
3,40±0,206*
4,63±0,037**
1,01±0,053* **
1,92±0,286**
Примечание. Результаты статистически достоверны (р≤0,05): * — по сравнению с контролем; ** — по сравнению с исходным уровнем.
должна обеспечить сперматогенез достаточным количеством стероидов.
Рядом исследователей [4, 5, 7, 16, 20] установлено, что сперматозоиды проявляют высокую чувствительность к действию разнообразных экзогенных повреждающих факторов, в том числе стрессорных. Эти данные находятся в полном соответствии с результатами наших исследований. Так,
нами установлено, что иммобилизационный стресс
обусловливает у всех экспериментальных животных
существенное снижение концентрации сперматозоидов. Если у интактных животных, подвергшихся
иммобилизационному стрессу, концентрация сперматозоидов составила 13,25±0,02·106, то у подопытных крысят алкогольной и мезенхимальной групп
она оказалась существенно ниже (3,20±0,15·106 и
0,29±0,03·106 соответственно). Обращает на себя
внимание, что у подопытных крысят концентрация
сперматозоидов под влиянием стрессорных факторов снижается до более низких величин, чем в
группе сравнения. При этом у всех экспериментальных животных содержание интерстициальных
клеток снижается. Как видно из таблицы, у подопытных животных обеих групп суммарное количество клеток Лейдига также снижается до уровня более низкого, чем в контроле.
Анализ содержания субпопуляционного состава
клеток Лейдига у экспериментальных животных
выявил следующую закономерность. Как видно из
таблицы, стрессорный фактор обусловил у интактных животных увеличение относительного количества активных клеток Лейдига. В то же время у подопытных крысят обеих групп иммобилизационный
стресс вызывает, напротив, снижение количества
активных эндокриноцитов и увеличение числа
фракции неактивных клеток. Эти изменения обусловливают и снижение индекса активности клеток Лейдига у животных мезенхимальной и особенно алкогольной групп до уровня более низкого, чем
в группе сравнения.
В настоящее время не вызывает сомнений, что
количественные и качественные изменения половых и эндокринных клеток семенников могут в
определенной мере служить своеобразным индикатором адаптационных и дезадаптационных процессов, протекающих под влиянием стрессорных факторов [7, 14].
Таким образом, полученные результаты убедительно свидетельствуют, что клетки Лейдига семенников у потомства самок крыс обладают сниженной
антистрессорной резистентностью. Известно, что
кортикостероиды, выработка которых резко увеличивается при стрессе, угнетают активность клеток
Лейдига, секретирующих тестостерон [17]. В клетках
Сертоли тестостерон превращается в более активную форму — дигидротестостерон, который участвует в регуляции сперматогенеза и спермиогенеза. Логично предположить, что под влиянием стрессорного фактора у потомства самок крыс с хронической
патологией печени активность клеток Лейдига еще
больше угнетается под влиянием кортикостероидов
[19], что обусловливает изменения оптимальной
концентрации тестостерона, необходимого для регуляции сперматогенеза. В свою очередь нарушения
гормонального гомеостаза внутри семенных извитых канальцев приводят к снижению концентрации
сперматозоидов и их функционального состояния
[1, 13], в том числе их двигательной активности.
ЛИТЕРАТУРА
1.
24
Брюхин Г.В., Ласьков Д.С., Сизоненко М.Л. Влияние иммобилизационного стресса на двигательную активность сперматозоидов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени. Пробл репрод 2013; 1: 17—20.
2.
Булыгина В.И., Амстиславская Т.Г., Маслова Л.Н. Влияние
хронического стресса в пубертатном периоде на проявление
половой активности у взрослых самцов крыс. Рос физиол
журн им. И.М. Сеченова 2001; 87: 7: 945—952.
Проблемы репродукции, 5, 2014
3.
Буров Ю.В. Изменение гонадотропной функции гипофиза
крыс при развитии экспериментального алкоголизма. Бюл
эксперм биол и мед 1986; 12: 6: 675—676.
4.
Быков В.Л. Сперматогенез у мужчин в конце XX века. Пробл
репрод 2000; 1: 6—13.
5.
Золотарева Т.А., Настуллин Б.А., Ярошенко Н.А. Современное
представление о механизмах стрессобусловленных изменениях активности сперматогенеза. Свiт медицини ma бiологi
2011; 4: 134—137.
6.
Зоркин С.Н., Чеботаев И.Л. Этапы формирования репродуктивной системы у мальчиков. Мед науч и учебно-метод журн
2006; 35: 3—18.
7.
Кузьмина В.Е. Функциональное состояние мужских половых
гонад и развитие стресс-реакции. Вестн СамГУ (естественнонаучная серия) 2007; 8: 58: 129—135.
8.
9.
Кулаков В.И., Леонова В.В., Кузьмичева Л.Н. Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогательные репродуктивные
технологии. М: МИА 2005.
Лобанова Н.Н., Панушева Н.И., Белова Т.И. Изменения содержания катехоламинов в структурах мозга крыс, перенесших
иммобилизационный стресс. Бюл эксперим биол и мед 1986;
11: 526—527.
10. Луцкий Д.Л., Николаев А.А. Морфологическое исследование
эякулята: метод пособие. Астрахань: Изд-во АГМА 1999.
11. Маянский Д.Н., Иопкер А.И., Коудстоал Яю, Кардонк М.Дж.
Индукция гранулематозного воспаления печени неинфекционными частицами. Патол физиол и экспер терап 1990; 5:
45—49.
12. Никитин А.И. Факторы среды и репродуктивная система человека. Морфология 1998; 6: 7—16.
13. Потемкина Т.Е. Нарушение сперматогенеза в условиях стресса у самцов белых крыс. Бюл экспер биол и мед 2008; 6: 645—
649.
14. Потемкина Т.Е., Кузнецова Т.В., Ляляев В.А. Изменение параметров семенной жидкости самцов белых крыс при различных видах экспериментального стресса. Соврем технол мед
2009; 2: 23—26.
15. Федорова И.Д., Кузнецова Т.В. Генетические факторы мужского бесплодия. Журн акуш и жен бол 2007; 1: 64—72.
16. Филаретов А.А. Функциональное значение многозвенного
построения гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринных
систем. Усп физиол наук 1996; 3: 3—12.
17. Шевлюк Н.Н., Стадников А.А. Клетки Лейдига семенников
позвоночных (онтогенез, ультраструктура, цитофизиология,
факторы и механизмы регуляции). Оренбург: Изд-во ОрГМА
2010.
18. Carlsen E., Petersen J.N., Andersson A.M. Effects of ejaculatory and
season on variations in semen guality. Fertil Steril 2004; 82: 358—
366.
19. Cologero A., Bagdy G., Aguta R. Mechanisms of stress on reproduction Evidence for a complex intra-hypothalamic circuit. Ann NY
Acad Sci 1998; 851: 364—370.
20. Fenster L., Katz D.F., Wyrobek A.J. et al Effects of psychological
stress on human semen guality. Androl 1997; 18: 194—202.
21. Kretser D.M. Are sperm counts really falling? Reprod Fertil Dev
1998; 10: 93—95.
22. Kretser D.M., Loveland K.L., Meinhardt A. et al. Spermatogenesis.
Hum Reprod 1998; 13: 1—8.
23. Orth J.M., Gunsalus G.L., Lamperti A.A. Evidence from the Sertoli
cell depleted rats indicates that spermatid number in adults depends
on numbers of Sertoli cells produced during the perinatal development. Endocrinology 1998; 122: 787—794.
24. Smith E.P., Conti M. Growth factors and testicular function: relevance to disorders of spermatogenesis in humans. Semin Reprod
Endocrinol 1996; 14: 209—218.
25