66 предобработка незрелых зародышей гибридов
advertisement
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г. ПРЕДОБРАБОТКА НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ГИБРИДОВ РАПСА ЯРОВОГО И ГОРЧИЦЫ БЕЛОЙ НА ЭТАПЕ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO Горягина Е.Б. 398020, Липецк, ул. Ленина, 42 ГОУ ВПО «Липецкий государственный педагогический университет» rector@pedinst.lipetsk.su Проводили предобработку незрелых зародышей гибридов рапса ярового (Brassica napus L.) и горчицы белой (Sinapis alba L.) различными растворами в течение суток. Наилучшие результаты были получены при замачивании гибридных семян в электрохимически активированной воде (католит и анолит в соотношении 1:1 и с силой тока, равной 3) и в растворе гетероауксина с концентрацией 0,00001 %. Отдаленная гибридизация в семействе Brassicaceae дает возможность получать формы, устойчивые к вредителям и болезням, с повышенной урожайностью, измененным соотношением жирных кислот в масле и другими ценными характеристиками. Однако в результате отдаленной гибридизации в большинстве случаев получается недостаточное количество гибридных семян, а те, что удается получить, отличаются недоразвитостью зародыша или эндосперма. Изолированные зародыши в условиях нарушенных коррелятивных связей требуют присутствия экзогенных регуляторов роста для образования новых структур. В связи с этим для преодоления постгамной несовместимости, вследствие которой наблюдается недоразвитость гибридных семян, в селекции ярового рапса перспективно применение эмбриокультуры, или культуры незрелых зародышей in vitro. При ограниченном числе семян особенно важно получение большого числа регенерантов, поэтому незрелые зародыши нуждаются в дополнительной стимуляции развития. Для повышения регенерации в культуре in vitro используется предобработка эксплантов низкими положительными температурами или регуляторами роста. Важнейшими гормонами, применяемыми перед введением в культуру in vitro, являются ауксины, которые активируют деление и растяжение клеток. Природные ауксины (ИУК - индолилуксусная кислота) вырабатываются и накапливаются в высоких концентрациях в верхушечных меристемах (конусах нарастания побега и корня). Известно, что ИУК увеличивает энергетическую эффективность дыхания растений. Положительные сдвиги в энергетическом обмене вызывают усиление передвижения питательных веществ и воды, что является одной из причин усиления роста растений [1]. Общим моментом в действии ауксинов на деление клеток является предварительное усиление синтеза и накопление РНК. Под их влиянием также уменьшается продолжительность различных периодов митотического цикла [2]. Другим приемом, регулирующим активность различных этапов роста и развития растений без значительных изменений морфологических признаков, является использование электрохимически активированной воды. Положительной стороной ее применения является то, что электрохимически активированная вода является экологически чистым, дешевым и доступным стимулятором роста [3]. Вода, активированная на катоде (католит), обладает свойствами стимулировать многие биологические процессы жизнедеятельности живых организмов и растений. Вода, активированная на аноде (анолит), наоборот, обладает свойством ингибировать биологические процессы и убивать микроорганизмы. В растениеводстве предпосевная обработка католитом выводит из состояния глубокого покоя те 66 VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г. семена, срок хранения которых истек или период прорастания не соответствует вегетационному периоду данного вида. Католит применяют в основном как стимулятор роста и развития растений, а анолит – как антисептик и консервант. В связи с этим целью работы являлось определение влияния предобработки гибридных семян рапса ярового на регенерацию в культуре незрелых зародышей in vitro. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Выявить оптимальную концентрацию гетероауксина и соотношение католита и анолита для предобработки гибридных семян. 2. Изучить влияние предобработки гибридных семян от скрещивания ярового рапса и горчицы белой на регенерацию растений в эмбриокультуре. Материал и методы. Исследования проводились в лаборатории физиологии растений ГОУ ВПО ЛГПУ и в селекционно-семеноводческом севообороте отдела селекции рапса ГНУ ВНИИ рапса в 2009-2010 гг. С целью получения отдаленных гибридов в полевых условиях отдела селекции ГНУ ВНИИ рапса были проведены реципрокные межвидовые скрещивания образцов рапса ярового (Brassica napus L.) коллекции лаборатории генетики и иммунитета растений (№ 47, 54, 55), имеющих желтую окраску семенной оболочки, с горчицей белой (Sinapis alba L.) сортов Рапсодия и Litember). Объектами исследования служили гибридные семена, изолированные из стручков на 13-14 день после опыления и незрелые зародыши, выделенные из них для введения в культуру in vitro. Предобработку гибридных семян (яровой рапс × горчица белая) проводили замачиванием гибридных семян в течение суток электрохимически активированной водой и растворами гетероауксина различной концентрации (всего 13 вариантов опыта). Приготовление анолита и католита производилось на установке СТЭЛ-4Н60-02 путем электрохимической обработки раствора хлорида натрия в питьевой воде во ВНИИ сахарной свеклы и сахара (пос. Рамонь, Воронежская обл.). Для получения разного уровня рН и окислительно-восстановительного потенциала раствора использовали регулировку силы тока на источнике питания. Для культивирования незрелых зародышей in vitro применялась безгормональная агаризованная питательная среда Мурасиге-Скуга (MS) [4]. На 7 день измерялись длина корня и проростков. Наблюдения за морфологическим и физиологическим состоянием незрелых зародышей и полученных новообразований проводили через каждые два дня в течение всего периода культивирования. Все опыты проводили в трехкратной повторности. При обработке экспериментальных данных использовали однофакторный дисперсионный анализ [5]. Результаты и обсуждение. Максимальное число регенерантов и достоверное отличие по сравнению с контролем отмечались в вариантах опыта № 7 с одинаковыми объемами католита и анолита и с силой тока (J) равной 3 и № 13 с наименьшей концентрацией гетероауксина (83 % и 85 % соответственно). При этом длина их корешков и проростков также была наибольшей и составляла 2,1 см и 1,2 см в варианте № 7 и 2,8 и 3,2 см в варианте № 13 (табл. 1). Длина проростков и корней, полученных из незрелых зародышей, обработанных чистым католитом с рН=5 и силой тока (J), равной 3 (вариант № 4), также превышала контроль на 5%-ном уровне значимости и составляла соответственно 1,1 и 1,8 см. Данные показатели в вариантах № 9 и № 12 аналогично превышали контрольные (рис.). Однако частота регенерации в варианте № 4 (81 %) находилась на одном уровне с контролем (80 %), а в вариантах № 9 (75 %) и № 12 (70 %) значительно уступала ему. 67 VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г. Таблица 1 – Воздействие гетероауксина и электрохимически активированной воды на регенерацию незрелых зародышей гибридов рапса ярового и горчицы белой № 1 2 4 5 3 6 7 8 9 10 11 12 13 Растворы веществ Вода (контроль) Католит (К) Анолит (А) К:А=50:50 К:А=70:30 Гетероауксин НСР05 Вариант Получено регенерантов, % Длина проростков, см Длина корня, см - 80 0,9 1,2 рН=9, J*=7 рН=5, J=3 рН=5, J=3 рН=6, J=7 J=7 J=3 J=7 J=3 0,01 % 0,001 % 0,0001 % 0,00001 % 80 81 4 0 10 83 25 75 60 75 70 85 0,9 1,1 0 0 0,6 1,2 0,4 1,0 0,6 1,0 3,0 3,2 1,5 1,8 0,7 0 0,5 2,1 0,9 1,7 0,4 0,5 1,7 2,8 2,8 0,04 0,06 *J – сила тока Анализ результатов опыта позволил установить, что предобработка незрелых зародышей раствором с высокой концентрацией гетероауксина (0,01 %) уменьшает рост корней и проростков и задерживает их развитие (частота регенерации 60 %), а наиболее разбавленный раствор гетероауксина (0,00001 %) стимулирует рост регенерантов в культуре in vitro (вариант опыта № 13). Рисунок 1 – Прорастание незрелых зародышей гибридов рапса ярового и горчицы белой, обработанных раствором гетероауксина с концентрацией 0,00001 % (13 вариант опыта, фото автора) 68 VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г. Результаты исследований свидетельствуют о том, что католит выступает в роли регулятора роста при силе тока, равной 3, как в чистом виде, так и совместно с анолитом, ее повышение до 7 действовало отрицательно на регенерацию зародышей. Тот факт, что смесь анолита с католитом в равном соотношении и силой тока, равной 3, оказала стимулирующее действие на регенерацию в условиях культуры in vitro, согласуется с данными, полученными ранее другими исследователями [3, 6]. Зародыши, прошедшие предобработку чистым анолитом (рН=6, J=7), не проросли в культуре in vitro, а при рН=5 и J=3 была получена минимальная частота регенерации (4 %). Следовательно, анолит, обладая хорошим дезинфицирующим эффектом, является токсичным для растительных тканей и угнетает рост эксплантов. Заключение. Таким образом, предобработку гибридных семян и незрелых зародышей следует проводить замачиванием гибридных семян в течение суток в электрохимически активированной воде (католит и анолит в равных соотношениях и с силой тока, равной 3) или в растворе гетероауксина с концентрацией 0,00001 %. Предобработка семян гибридов рапса ярового и горчицы белой растворами, указанными выше, повышает регенерацию растений в эмбриокультуре, а именно активизирует процесс физического набухания, обеспечивает интенсивное поглощение воды зародышами, повышает энергию их прорастания и ускоряет ростовые процессы. Подобные свойства позволяют преодолевать глубокий органический покой при старении семян, а также получить большее число растений отдаленных гибридов, что имеет важное значение в селекционной работе по яровому рапсу. Литература 1. Якушкина Н.И. Физиология растений. – М.: Просвещение, 1993. – 351 с. 2. Полевой В.В. Физиология растений. - М: ВШ, 1989. – 464 с. 3. Васильченко Е.Н., Жужжалова Т.П. Преодоление старения семян активированной водой // Сахарная свекла. – 2004. – № 2. – С. 24–25. 4. Murashige T., Skoo F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Plant Physiol. – 1962. – Vol. 15. – P. 473–497. 5. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). – М.: Агропромиздат, 1985. – 351с. 6. Фоменко Н.Р. Эффективность влияния дезинфицирующих препаратов на семена сахарной свеклы при введении в культуру in vitro // Достижения молодых ученых – будущее в развитии АПК: материалы межрегиональной научнопрактической конференции молодых ученых. – Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ, 2007. – Ч. 1. – С. 287–290. PRETREATMENT OF IMMATURE EMBRYOS OF HYBRIDS OF SPRING RAPESEED AND WHITE MUSTARD DURING IN VITRO INRODUCTION Goryagina E.B. Pretreatment of immature embryos of hybrids of spring rapeseed ( Brassica napus L.) and white mustard (Sinapis alba L.) was carried out with various solutions with- in a day. The best results were obtained by soaking the hybrid seeds in the electrochemically activated water (catholyte and anolyte in proportion 1:1 and with an amperage equal to 3) and in heteroauxin solution with a concentration 0.0000 1%. 69
