М.К. Иванов - Распространенность генотипов ВПЧ высокого

!
Распространенность!генотипов!ВПЧ!высокого!
онкогенного!риска!среди!пациентов!крупных!
клинико9диагностических!лабораторий:!
двухлетний!опыт!
!
!
!
Иванов!М.К.1,!Дзюбенко!В.В.1,!Гасилова!Н.А.2,!Кандрушин!Е.В.1,!
Кандрушин!В.Е.1,!Чеботарев!А.А.3,!Столярова!С.В.3,!Силкина!Т.А.4!!
!
!
1Вектор9Бест,!Кольцово,!Россия;!
2Независимая!лаборатория!ИНВИТРО,!Москва,!Россия;!
3KDL,!Москва,!Россия;!
4Гемотест,!Москва,!Россия!
!
Москва,!2!октября!2014!г.!
ВПЧ!высокого!онкогенного!(канцерогенного)!риска!
!
!
•  Передача!только!от!человека!к!человеку,!преимущественно!половым!
путем,!большинство!женщин!инфицируется!в!первые!годы!половой!
жизни!
•  Из!>200!известных!типов!для!некоторых!показана!онкогенность!–!
инфицирование!может!являться!причиной!злокачественных!
новообразований!
•  Инфицирование!ВПЧ!является!причиной!рака!шейки!матки!(РШМ)!
•  У!большинства!инфицированных!вирус!элиминируется!под!давлением!
иммунной!системы!и!не!развиваются!клинические!проявления!
•  Развитие!поздних!стадий!РШМ!может!быть!предотвращено!при!условии!
своевременной!диагностики,!основанной!на!выявлении!ранних!
клинических!проявлений!(цитология,!гистология)!
•  Рациональным!основанием!для!направления!на!обследование!может!
являться!выявление!ВПЧ!высокого!онкогенного!риска!(ВПЧ!ВКР)!
!
!!
Инфицирование!ВПЧ!ВКР!в!России!
!
!
•  Уровень!инфицированности!населения!и!заболеваемости!РШМ!(по!
данным!ВОЗ)!является!относительно!высоким!
•  Национальная!скрининговая!программа!отсутствует,!
региональные!скрининговые!программы!основаны!на!
цитологических!методах!и!не!демонстрируют!эффективности!
•  Вакцинация!не!является!обязательной,!население!ей!не!охвачено!
и!имеет!против!нее!предубеждения!
•  Большая!часть!обследований!на!наличие!ВПЧ!производится!
методом!ПЦР!и!производится!в!частных!диагностических!
лабораториях!
•  Принципы!использования!ВПЧYтестов!и!трактовки!получаемых!
результатов!!не!основаны!на!едином!консенсусе!
Крупнейшие!сетевые!диагностические!лаборатории!России!
ИНВИТРО,!Гемотест,!KDL,!СитиЛаб!и!др.!
!
•  Активно!используют!ПЦР!для!выявления!ВПЧ!ВКР!
•  Выполняют!до!10000!ПЦРYтестов!в!день!(в!основном!ПЦР!в!
реальном!времени)!!
•  Образцы,!собранные!в!локальных!офисах,!анализируются!в!
крупных!центрах,!в!которых!аккумулируются!большие!пулы!
единообразных!данных!
•  Сеть!локальных!офисов!каждой!лаборатории!покрывает!
территорию,!на!которой!проживает!до!80%!населения!
страны!
•  Как!правило,!результат!тестирования!готов!в!течение!одних!
суток
!
Цели!
!
!
!
!Начиная!с!2011!г:!
3!крупных!коммерческих!сетевых!лабораторий!в!России!
(ИНВИТРО,!KDL!и!Гемотест)!выполняли!значительное!число!
анализов!пациентов!на!наличие!ВПЧ!ВКР!и!вирусную!нагрузку!!
!
•  используя!одни%и%те%же%наборы%для%ПЦР%в%реальном%времени%
•  используя!одно%и%то%же%программное%обеспечение!для!обработки!
результатов!ПЦРYанализа!
!
!
!Цели!работы:!
•  Проанализировать!весь!массив!данных!и!выявить!
закономерности,!связанные!с!вирусными!нагрузками,!полом!
и!возрастом!
•  Оценить!общую!воспроизводимость!результатов!и!их!
единообразие!
Пробы!!
Собраны!в!период!с!начала!2011!г.!по!весну!2013!г.!
Участники:!ИНВИТРО!(~50%),!KDL!(~30%),!Гемотест!(~20%)!
!
Всего!проанализировано!на!ВПЧ!ВКР:!
160888!эндоцервикальных!соскобов,!33057!образцов!от!мужчин!(соскобы,!
моча)!
!
•  Набор!данных!включал:!дата!забора,!название!набора,!возраст,!пол,!
значение!порогового!цикла!(Ct)!
•  Все!данные!анонимны!
•  Данные!из!трех!лабораторий!объединены!на!одном!сервере!и!
проанализированы!с!использованием!собственного!программного!
обеспечения!
!
Место!сбора!пробы!и!основания!для!назначения!анализа!не!были!предоставлены,!
но,!как!минимум,!подавляющее!большинство!обследовалось!не!на!предмет!
новообразований!шейки!матки!
Методы!(1)!!
Наборы!для!ПЦР!с!детекцией!в!реальном!времени:!
!
!
ВПЧ!высокого!канцерогенного!риска!
РеалБест!ДНК!ВПЧ!ВКР!Генотип!
Мишени:!гены!E6/E1!двенадцати!наиболее!распространенных!типов!ВПЧ!ВКР!
(16,!18,!31,!33,!35,!39,!45,!51,!52,!56,!58,!59),!ген!бетаHактина!человека!
• 
!
Валидация!забора!материала!
РеалБест!Валидация!образца!
!!!!!!!!!!!!Мишень:!ген!HMBS!человека!
• 
!
!
Все!наборы!включают:!
•  Готовые!к!использованию!лиофилизованные!мастермиксы!с!ферментами,!
праймерами!и!зондами!!
•  Внутренний!контрольный!образец!(неконкурентный,!проходит!процедуру!
выделения!ДНК)!
•  Дезоксиурацил!и!урацилДНК!гликозилазу!
Методы!(2)!!
Выделение!ДНК!из!урогенитальных!соскобов!и!мазков:!
!
РеалБест!ДНК!Экспресс!(щелочной!лизис!с!помощью!SDS
+центрифугирование)!
!
Критерии!ингибирования:!ΔCt!для!ВКО>2!для!анализируемой!пробы!в!сравнении!с!референсными!
пробами.!Перевыделение!всех!проб,!для!которых!показано!ингибирование,!набором!РеалБест!
ДНКYЭкстракция!3!(связывание!на!магнитных!частицах,!покрытых!силикагелем)!
Средний!%!случаев!ингибирования!в!течение!2!лет:!~1%!
!
Качество!взятия!материала!оценивалось!с!помощью!учета!количества!копий!
гена!HMBS!человека:!
РеалБест!Валидация!образца!(мишень:!ген!HMBS!человека)!
!
Критерий!валидности!пробы:!≥250!копий!HMBS/проба!!
Повторный!забор!пробы!в!случае!невалидности!
Средний!%!невалидных!образцов!в!течение!2!лет:!~3.5%!
Сильно%зависит%от%исполнителя!!
Воспроизводимость!анализа:!ВКО,!ПКО,!HMBS!
Внутренний!контроль,!!
распределение!!значений!Ct!
50!
%!валидных/невалидных!проб,!2!
лаборатории,!по!неделям!(середина!2012)!
30!
45!
%!от!общей!
выборки!
40!
35!
Положительный!контроль,!
распределение!значений!Ct*!
!
12!
25!
ВКО!
%!от!общей!
выборки!
ПКО!
20!
10!
8!
Лаб.!1,невалидные!
6!
4!
30!
Лаб.!2,невалидные!
2!
25!
15!
0!
10!
распределение!значений!Ct!HMBS,!2!
лаборатории,!весь!период!
1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! 8! 9! 10!11!12!13!
20!
15!
10!
Ct!
5!
Ct!
5!
30!
Ct!HMBS,!Лаб.!1!
25!
0!
1! 4! 7! 10! 13! 16! 19! 22! 25! 28! 31! 34! 37! 40!
Ct!HMBS,!Лаб.!2!
20!
0!
1! 4! 7! 10!13!16!19!22!25!28!31!34!37!40!43!
15!
10!
5!
*Значения!Ct!для!ПКО!могут!различаться!между!сериями%
0!
2!
6! 10! 14! 18! 22! 26! 30! 34! 38! 42! 48! 52!
Результаты!(1)!!
ВПЧ!ВКР,!распределение!пациентов!по!возрасту/полу!(общая!выборка!193945)!
Всего:!женщины!160888,!мужчины!33057!! ВПЧ!ВКР!>104/мл:!женщины!35258!(21.9%),!мужчины!2942!(8.9%)!
20!
18!
16!
Мужчины%!
14!
12!
Женщины%!
10!
16!
Мужчины%!
14!
Женщины%!
12!
10!
8!
Возраст,!лет!
6!
4!
8!
Возраст,!лет!
6!
4!
2!
2!
0!
0!
18
26
34
42
50
58
18
26
34
42
50
58
Нагрузка!ВПЧ!ВКР!>104!копий/мл!в!19%!проб!по!крайней!мере!по!одному!генотипу!из!группы!16,!18,!31,!33,!
35,!39,!45,!51,!52,!56,!58,!59!!
!
Результаты!(2)!
ВПЧ!ВКР,!встречаемость!генотипов!(весь!массив)%
%!от!общей!выборки!
Мужчины!
Женщины!
%!от!общей!выборки!
7!
6!
6!
5!
5!
4!
4!
3!
3!
2!
2!
1!
1!
0!
0!
Cut9off:!>104копий/мл!пробы!
Cut9off:!>105копий/мл!пробы!
Результаты!(3)%
Воспроизводимость!выявления!различных!генотипов!ВПЧ!ВКР!во!времени!
(Независимая!лаборатория!ИНВИТРО,!Cut9off:!>104!копий/мл!пробы,!шаг!1!мес.,!старт!–!янв.!2012)!
8!
7!
HPV16!
6!
HPV31!
HPV18!
HPV33!
5!
HPV35!
Женщины!
4!
HPV39!
HPV45!
3!
HPV51!
2!
HPV56!
HPV52!
HPV58!
1!
HPV59!
0!
1!
2!
3!
4!
5!
6!
7!
8!
9!
10!
11!
12!
13!
3!
2,5!
2!
1,5!
Мужчины!
1!
0,5!
0!
1!
2!
3!
4!
5!
6!
7!
8!
9!
10!
11!
12!
13!
Результаты!(4)!
6!
%!от!общей!выборки!
9!
%!от!общей!выборки!
8!
5!
7!
4!
Женщины!
6!
5!
3!
Мужчины!
2!
Никаких!
закономерностей!
внутри!этих!
подгрупп!
<26!лет!
26930!лет!
31935!лет!
>35!лет!
4!
3!
2!
1!
0!
1!
0!
0! 2! 4! 6! 8! 10! 12! 14! 16! 18! 20! 22! 24! 26! 28! 30! 32! 34! 36! 38! 40!
ВПЧ!ВКР,!распределение!значений!Ct!(для!
любого!из!12!генотипов,!присутствующих!в!
пробе)!
0! 2! 4! 6! 8! 10! 12! 14! 16! 18! 20! 22! 24! 26! 28! 30! 32! 34! 36! 38! 40!
ВПЧ!ВКР!распределение!значений!Ct!в!
разных!возрастных!группах,!женщины!!
(для!любого!из!12!генотипов,!
присутствующих!в!пробе)!
Результаты!(5)!
ВПЧ!ВКР:!%!положительных!проб!в!зависимости!от!возрастной!категории!в!
период!201192012!(независимо!от!нагрузки)!!
Мужчины!
Женщины!
45!
Любой!из!12!типов!ВПЧ!ВКР!
ВПЧ!16!
40!
20!
18!
35!
16!
30!
14!
12!
25!
10!
20!
8!
15!
6!
10!
4!
5!
2!
>70!
65Y70!
60Y65!
46Y60!
42Y46!
40Y42!
38Y40!
36Y38!
34Y36!
32Y34!
30Y32!
28Y30!
26Y28!
24Y26!
22Y24!
20Y22!
18Y20!
16Y18!
0!
<16!
0!
?!
<18! 18Y22!22Y26!26Y30!30Y34!34Y38!38Y51!51Y65! >65!
Для!сравнения!–!классическая!ИППП!
ДНК!C.!trachomaks:!%!положительных!проб!в!разных!
возрастных!категориях!(те!же!лаборатории,!n~700000,!
201192012)! Мужчины!
16!
Женщины!
14!
12!
10!
8!
6!
4!
2!
0!
<16! 16Y17! 17Y18! 18Y19! 19Y20! 20Y21! 21Y22! 22Y23! 23Y24! 24Y25! 25Y26! 26Y27! 27Y28! 28Y29! 29Y30! 30Y31! 31Y32! 32Y33! 33Y34! 34Y35! >35!
Возраст,!лет!
Результаты!(6)!
ВПЧ!ВКР,!распределение!значений!Ct!в!зависимости!от!пола:!пример!для!генотипов!16,18,31,51!
1,4!
%!от!общей!выборки!
1,2!
ВПЧ16!
ВПЧ18!
ВПЧ31!
ВПЧ51!
Женщины!–!
сплошные!линии!
Мужчины!Y!пунктир!
1!
0,8!
0,6!
0,4!
0,2!
Значение!Ct!
0!
2!
4!
6!
8!
10!
12!
14!
16!
18!
20!
22!
24!
26!
28!
30!
32!
34!
36!
38!
40!
42!
44!
46!
48!
Воспроизводимость!распределения!Ct!для!наиболее!распространенных!генотипов!ВПЧ!ВКР!по!
кварталам!2012!г.!(%!от!общей!выборки,!Независимая!лаборатория!ИНВИТРО,!женщины)!
1,4!
ВПЧ16!
0,8!
1,2!
0,7!
1!
0,6!
0,5!
0,8!
0,4!
0,6!
0,3!
0,4!
0,2!
0!
ВПЧ51!
Значение!Ct!
0,2!
40!
0,1!
Значение!Ct!
40!
50!
Заключение!
Впервые!в!России!~200000!результатов!генотипирования!и!
количественной!оценки!ВПЧ!ВКР,!полученных!крупными!сетевыми!ISO9
сертифицированными!лабораториями,!объединены!и!
проанализированы!
!
Оценены!встречаемость!и!нагрузки!вирусной!ДНК,!полученные!из!
“сырых”!значений!Ct,!и!выявлены!некоторые!закономерности,!
связанные!с!генотипом!ВПЧ,!полом!и!возрастом!
!
Наблюдаемые!величины!являются!стабильными!во!времени!и!
сходными!между!различными!лабораториями!!
!
Процент!инфицированных!мужчин!с!относительно!высокой!вирусной!
нагрузкой!является!достаточно!высоким!
Спасибо!за!внимание!!
Вопросы?!
Иванов!М.К.,!к.б.н.!
Заведующий!лабораторией!ПЦР9диагностики!
ЗАО!“Вектор9Бест”,!Кольцово,!Россия!
ivanovmk@vector9best.ru!