кимельфельд екатерина игоревна

На правах рукописи
КИМЕЛЬФЕЛЬД ЕКАТЕРИНА ИГОРЕВНА
КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИШЕМИЧЕСКОГО
ИНСУЛЬТА У ПАЦИЕНТОВ В ВОЗРАСТЕ ДО 50 ЛЕТ
14.01.11 – Нервные болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2014
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Российский
национальный исследовательский медицинский университет имени
Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
член-корреспондент РАМН
доктор медицинских наук,
профессор
Скворцова Вероника Игоревна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, Котов Сергей Викторович
заведующий кафедрой неврологии факультета усовершенствования врачей
Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московской
области «Московский областной научно-исследовательский клинический
институт им. М.Ф. Владимирского»
доктор медицинских наук,
Савин Алексей Алексеевич
профессор
кафедры
нервных
болезней
лечебного
факультета
Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Московский государственный медикостоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Ведущая организация:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
профессионального образования Первый Московский государственный
медицинский университет имени И. М. Сеченова Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится « 15 » декабря 2014 года в 14.00 часов на заседании
диссертационного
совета
Д
208.072.09
на
базе ГБОУ
ВПО
РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва,
ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте
http://rsmu.ru ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по
адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
Автореферат разослан «..........» ............................ 20__ года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Л.В. Губский
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Проблема сосудистых поражений нервной системы является одной из
самых важных в клинической неврологии [Гусев Е.И. и Скворцова В.И.,
2001]. По данным различных исследований частота инсульта в молодом
возрасте колеблется от 2,5 до 10%. Этиология и патогенез нарушений
мозгового кровообращения у лиц молодого возраста отличаются от таковых в
старшей возрастной группе и часто при рутинном обследовании остаются
неизвестными (до 40%) [Деев А.С. и Захарушкина И.В., 2000]. Отсутствие
четких данных о природе сосудистого поражения затрудняет проведение
адекватной вторичной профилактики ишемического инсульта.
Для улучшения качества диагностики, лечения и профилактики
ишемического инсульта требуется расширение алгоритма обследования
молодых пациентов и введение в повседневную практику новых методов.
В настоящее время активно проводятся исследования, направленные на
поиск генов-кандидатов в развитие многофакторной сосудистой патологии
во всех возрастных группах. Гены, принимающие участие в развитие
ишемического инсульта, можно разделить на следующие категории: гены
факторов риска развития ишемического инсульта, гены, влияющие на
сосудистую реактивность, гены, определяющие устойчивость вещества мозга
к ишемии. Эти категории не являются взаимоисключающими [Hassan A.,
Marcus H.,2000].
Кроме изучения молекулярно-генетических основ факторов риска
ишемического инсульта ведутся поиски генов, вовлеченных в комплекс
генетических реакций, запускаемых фокальной ишемией, непосредственно
определяющих тканевой ответ на ишемическое повреждение и участвующих
в
формировании
морфологического
чувствительности головного мозга к ишемии).
дефекта
(индивидуальной
4
В
связи
исследования,
с
вышесказанным
посвященные
особую
изучению
актуальность
возможностей
приобретают
молекулярно-
генетического прогнозирования индивидуального риска инсульта, особенно у
пациентов молодого трудоспособного возраста.
Одним из возможных подходов к решению данной проблемы является
выделение и изучение групп генов, потенциально вовлеченных в патогенез
заболевания, изучение взаимосвязи не только с ишемическим инсультом как
таковым, но и с отдельными его патогенетическими вариантами, с учетом
возрастных и половых различий.
Цель и задачи исследования
Цель работы: Изучение влияния полиморфных вариантов генов
системы гемостаза, обмена гомоцистеина, ренин-ангиотензиновой системы и
генов, регулирующих процессы программированной клеточной смерти на
риск развития и особенности течения ишемического инсульта у пациентов в
возрасте до 50 лет
Задачи исследования
1. Проанализировать особенности течения и основные факторы риска
ишемического инсульта у больных в возрасте до 50 лет.
2. Провести анализ полиморфных вариантов генов системы гемостаза (F2,
F5, GP1BA) у пациентов с атеротромботическим, лакунарным и
«криптогенным» инсультом у пациентов в возрасте до 50 лет.
3. Провести анализ С677Т полиморфизма гена MTHFR у пациентов
данной группы.
4. Провести анализ гена ангиотензинпревращающего фермента по I/D
полиморфизму у пациентов этой возрастной категории.
5. Провести анализ аллельных вариантов генов, регулирующих процессы
программированной клеточной смерти: PARP1 и HIF1A по изученным
полиморфным локусам, оценить их влияние на тяжесть течения
5
данного заболевания у пациентов с ишемическим инсультом в возрасте
до 50 лет.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное клинико-генетическое обследование
пациентов с ишемическим инсультом в возрасте до 50 лет с определением
основных факторов риска сосудистой патологии в данной возрастной группе.
Впервые проведен анализ вклада генов F2, F5, GP1BA, MTHFR, ACE в
развитие ишемического инсульта у лиц в возрасте до 50 лет при
атеротромботическом, лакунарном и «криптогенном» вариантах.
Установлена ассоциация аллеля -5С и связанных с ним генотипов
-5С/С и -5Т/С по -5Т/С полиморфизму гена GP1BA с риском развития
ишемического инсульта у мужчин молодого возраста. Выявлено, что аллель
-5С и связанные с ним генотипы -5С/С и -5Т/С также являются фактором
повышенного риска лакунарного ишемического инсульта (ЛИ) у мужчин.
Кроме того, данные генотипы ассоциированы с развитием ишемического
инсульта, вызванного тромбозом брахиоцефальных артерий (БЦА), у
пациентов в возрасте до 50 лет. Показано, что G20210A полиморфизм гена F2
ассоциирован с риском развития тромбоза БЦА, а 1691A аллель по G1691A
полиморфизму гена F5 чаще встречается при ЛИ. В отношении генов
MTHFR и ACE ассоциации с ИИ в данной возрастной группе выявлено не
было.
Впервые проведен анализ вклада генов PARP1 и HIF1А в развитие и
течение ишемического инсульта у пациентов молодого возраста. Выявлено,
что эти гены не влияют на риск развития инсульта. Однако, у мужчин
выявлена ассоциация генотипов G/A и G/G по G/A полиморфному локусу 1го
интрона
(rs3219023)
гена
PARP1
с
более
тяжелым
течением
атеротромботического инсульта, как на первые, так и двадцать первые сутки
инсульта. Полученные результаты подтверждают гипотезу о различии
6
апоптотической программы и молекулярных механизмов реакции головного
мозга на ишемию у мужчин и женщин [McCullough L.D. et al., 2005].
Практическое значение работы
Выявление
генетических
заболеваний
расширяет
ишемического
инсульта,
диспансеризации
маркеров
возможности
позволяет
практически
целенаправленным
и
цереброваскулярных
первичной
разработать
здоровых
комплексным
риска
лиц
профилактики
новые
из
подходы
к
риска
с
групп
обследованием
и
превентивным
лечением.
Диагностика
-5Т/С
полиморфизма
гена
GP1BA,
G20210A
полиморфизма гена F2 и G1691A полиморфизма гена F5 позволит применять
анализ данных генотипов для определения необходимости проведения
первичной профилактики у лиц с отягощенным наследственным анамнезом.
Выявленная
полиморфному
ассоциация
локусу
гена
генотипов
PARP1
G/A
с
и
более
по
rs3219023
тяжелым
течением
G/G
атеротромботического инсульта (АТ) у мужчин позволит применять анализ
данного полиморфизма в качестве критерия прогнозирования течения и
исхода заболевания.
Изучение генетических основ индивидуальной чувствительности мозга
к ишемии с учетом гендерных различий позволяет определять новые мишени
для лечения инсульта в виде необходимости и возможности применения
селективных ингибиторов фермента PARP1 с учетом половых различий, для
чего необходима разработка концепции клинического исследования таких
препаратов.
Положения, выносимые на защиту
1. -5Т/С
полиморфизм
гена
GP1BA
ассоциирован
с
развитием
ишемического инсульта у мужчин в возрасте до 50 лет.
2. G1691A полиморфизм гена F5 ассоциирован с развитием лакунарного
ишемического инсульта у пациентов в возрасте до 50 лет.
7
3. G20210A полиморфизм гена F2 ассоциирован с повышенным риском
развития
ишемического
инсульта
в
результате
тромбоза
брахиоцефальных артерий, и не влияет на риск развития других
патогенетических вариантов инсульта.
4. rs3219023 полиморфизм гена PARP1 ассоциирован с выраженностью
неврологического дефицита на первые сутки заболевания у мужчин, а
при атеротромботическом патогенетическом варианте, как на первые,
так и на 21 сутки.
Внедрение результатов исследования
Результаты настоящего исследования используются в лечебной работе
отделений неврологии, нейрореанимации ГКБ №31 г. Москвы, стационарных
отделений Центра патологии речи и нейрореабилитации г. Москвы,
неврологического отделения для больных с НМК БСМП им. Н.А. Семашко г.
Орла.
Апробация работы
Апробация
практической
диссертации
конференции
состоялась
коллектива
на
совместной
сотрудников
научнокафедры
фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РНИМУ им.
Н.И. Пирогова и сотрудников неврологического отделения и отделения
нейрореанимации ГКБ №31 (протокол №8 от 22 апреля 2014 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 в
журналах рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста,
состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, материалы и методы,
результаты
генетического
клинического
исследования,
исследования,
заключения),
результаты
молекулярно-
выводов,
практических
8
рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 19 рисунками и
41 таблицей. Список литературы включает 22 отечественных и 208
иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Общая характеристика больных и методы исследования
В основу работы положены результаты исследования 126 пациентов
(славян из Московской популяции) с ишемическим инсультом или
транзиторной ишемической атакой, поступивших в неврологические клиники
Российского национального исследовательского медицинского университета
им. Н.И. Пирогова (ГКБ №20 и ГКБ №31 г. Москвы) за период 2007-2009 гг.основная группа. В исследование включены 31 женщина и 95 мужчин в
возрасте от 18 до 50 лет (средний возраст больных – 41,3±7,0 года).
Контрольную группу составили 90 здоровых добровольцев молодого
возраста – славян из московской популяции (45 мужчин, 45 женщин, средний
возраст – 26,2±3,9 лет).
У всех пациентов проводили тщательное изучение симптомов развития
заболевания, анализ семейного и индивидуального анамнеза с уточнением
всех возможных факторов риска.
Исследование соматического и неврологического статусов у пациентов
проводили
по
общепринятой
методике.
Степень
выраженности
неврологического дефицита оценивали по шкале инсульта NIH на 1-е и 21-е
сутки [Brott T., Adams H.P. Jr., 1989].
Ишемический
характер
инсульта
подтверждался
результатами
нейровизуализации (КТ или МРТ головного мозга).
Для уточнения патогенетического варианта ишемического инсульта
согласно критериям TOAST [Adams H.P. et al., 1993] были применены
следующие методы обследования.
9
При поступлении на 1 – 2-е сутки заболевания исследовали:
биохимический
анализ
крови
с
определением
уровня
холестерина,
триглицеридов, липопротеидов высокой, низкой и очень низкой плотности с
целью выявления дислипидемии; определение глюкозы крови; развернутая
коагулограмма и агрегатограмма для оценки состояния реологических
свойств крови; дуплексное сканирование брахиоцефальных артерий и
транскраниальное дуплексное сканирование артерий основания головного
мозга для выявления патологии экстра- и интракраниальных артерий.
За время пребывания в стационаре, в плановом порядке проводили
обследования: оральный глюкозотолерантный тест, для выявления сахарного
диабета или нарушения толерантности к углеводам; обследование на
антифосфолипидный синдром, на наличие системных заболеваний, анализ
крови на гомоцистеин; трансторакальная эхокардиография, по показаниям,
для
исключения
парадоксальной
эмболии
–
трансэзофагальная
эхокардиография.
Генетический анализ был проведен на базе Отдела Молекулярных
Основ
Генетики
Человека
ИМГ
РАН.
Молекулярно-генетическое
исследование проводили пациентам с атеротромботическим, лакунарным и
«криптогенным» инсультом. Для типирования полиморфных вариантов
изучаемых
генов-кандидатов
были
использованы
препараты
ДНК,
полученные из 5 мл венозной крови пациентов. ДНК выделяли стандартным
методом с использованием фенолхлороформа и протеиназы К [Milligan,
1998]. Анализ полиморфизма проводили методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) и рестрикционного анализа с последующим проведением
вертикального электрофореза в полиакриламидном геле и визуализацией
полученных фрагментов под ультрафиолетовым светом, а также методом
полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (технология
TaqMan).
10
Для молекулярно-генетического исследования были выбраны 7
описанных в литературе полиморфизмов генов-кандидатов, 5 из которых с
теоретической точки зрения, могут иметь отношение к формированию риска
ишемических НМК: -5Т/С полиморфизм гена GP1BA; G20210A полиморфизм
гена F2; G1691A полиморфизм гена F5; C677T полиморфизм гена MTHFR;
I/D полиморфизм гена ACE; а два полиморфных локуса могут влиять на
тяжесть течения данного заболевания: IVS9-675C>A полиморфизм гена
HIF1A; rs 3219023 полиморфизм гена PARP1.
Статистическую
обработку
полученных
данных
проводили
с
использованием пакета программ “IBM SPSS Statistics version 19”,
компьютерной программы RxC (Rows and Columns) [Roff D.A., Bentzen
P.,1989].
С
помощью
программы
RxC
проводили
анализ
соответствия
наблюдаемого распределения частот генотипов теоретически ожидаемому
равновесному распределению Харди-Вайнберга по модифицированному
критерию
2
, определяемому по алгоритму, описанному D.Roff и P.Bentzen.
Статистически значимыми считали значения р<0,05. Силу ассоциаций
оценивали в значениях показателя относительного риска. Рассчитывали 95%
доверительные интервалы для относительных частот.
Для
анализа
данных
лабораторно-инструментальных
методов
исследования по группам использовали однофакторный дисперсионный
анализ (ANOVA). Для анализа ассоциаций полиморфных вариантов
изучаемых
генов
с
клиническими
признаками
создавали
таблицы
сопряженности и были использованы критерий χ2 Пирсона и точный
критерий Фишера. Различия считались статистически значимыми при уровне
не менее 95% (p<0,05).
11
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Клиническая характеристика пациентов, факторы риска,
патогенетические варианты ИИ
В исследование были включены (основная группа) 126 пациентов,
поступивших в неврологические клиники университета (ГКБ № 20 и ГКБ №
31 г. Москвы) за период 2007-2009 гг. Возраст больных колебался от 18 до 50
лет (средний возраст 41,3±7,0). В исследование вошло 31 женщина и 95
мужчин.
Установлено, что в этом возрасте мужчины болели ишемическим
инсультом в три раза чаще, чем женщины. Такая ситуация объясняется, как
протекторным действием женских половых гормонов, так и более низкой
частотой встречаемости таких факторов риска у женщин, как курение и
злоупотребление алкоголем.
Сто двадцать три пациента перенесли ишемический инсульт. У 58
больных (47,2%) ишемический инсульт развился в левом каротидном
бассейне,
у
39
(31,7%)
–
в
правом
каротидном
бассейне.
В
вертебробазилярной системе ишемический инсульт был выявлен у 26 (21,1%)
пациентов. Трое больных перенесли транзиторную ишемическую атаку, двое
- в бассейне левой средней мозговой артерии, один - в вертебробазилярном
бассейне.
Выявлено, что в данной возрастной группе важную роль играли такие
модифицируемые
факторы риска, как артериальная гипертония (АГ)
(58,7%),
(57,1%),
курение
нарушения
углеводного
обмена
(32,5%),
злоупотребление алкоголем (26,2%). Более чем у половины пациентов
отмечено наличие 2 и более модифицируемых факторов риска (61,1%).
Однако, роль этих факторов не являлась решающей. С наибольшей частотой
была
выявлена
наследственная
предрасположенность
сосудистой патологии (85% больных).
по
сердечно-
12
При анализе патогенетических вариантов ИИ установлено, что у 24,6%
пациентов
имел
место
атеротромботический,
у
15,1%
больных
-
кардиоэмболический, у 21,4% - лакунарный, у 11,9% - ишемический инсульт
другой известной этиологии, а в 27% случаев инсульт неустановленной
этиологии. В связи с отсутствием возможных причин развития инсульта, эти
пациенты были отнесены к группе «криптогенный» инсульт.
При
проведении
исследования
получены
однофакторного
лабораторно-инструментальных
следующие
дисперсионного
данные.
анализа
для
При
сравнения
методов
проведении
показателей
липидограммы, коагулограммы, агрегатограммы у пациентов с разными
патогенетическими вариантами ишемического инсульта статистически
достоверных различий не получено (р>0,05).
У 77,9% пациентов уровень гомоцистеина превышал верхнюю границу
нормы (11,0 мкмоль/мл). У пациентов с АТ инсультом средний уровень
гомоцистеина составил 18,7±5,2 мкмоль/мл, у больных с лакунарным
вариантом ИИ – 12,1±2,9 мкмоль/мл, в группе пациентов с «криптогенным»
инсультом
12,9±4,0мкмоль/мл.
Таким
образом,
были
выявлены,
статистически достоверные различия среднего уровня гомоцистеина у
пациентов с АТ вариантом ИИ (ANOVA, p<0,001).
Ультразвуковое исследование БЦА было проведено 92 пациентам.
Атеросклеротические
Стенозирующий
изменения
выявлены
атеросклеротический
процесс
у
77,2%
обнаружен
больных.
у
56,5%
пациентов. Стенозы малых градаций (до 50%) выявлены у 32,6 % больных,
средних (50-69%) – у 13,0% пациентов, больших (70-99%) – у 10,9% человек.
Осложненные атеросклеротические бляшки диагностированы у 36,96%
пациентов.
При ультразвуковом исследовании БЦА на 1-3 сутки у 23 пациентов
был выявлен тромбоз БЦА (21,5%) больных. Среди этих пациентов 14
больных с атеротромботическим инсультом, 7 – с «криптогенным»
13
инсультом (причина тромбоза при обследовании осталась неустановленной),
одна
пациентки
с
кардиоэмболическим
инсультом
(с
дефектом
межпредсердной перегородки) и одна больная с диссекцией ВСА. При
анализе показателей коагулограммы у пациентов с тромбозами БЦА и без
них статистически достоверных различий получено не было (p>0,05,
ANOVA).
У пациентов в возрасте до 50 лет было отмечено благоприятное
течение
инсульта.
Так,
при
поступлении
в
стационар,
легкий
неврологический дефицит был выявлен у 51,6% больных, средний – у 39,7%,
а тяжелый – всего у 7,9%. На момент выписки из стационара, легкий
неврологический дефицит сохранялся у 68,2% пациентов, средний – у 12,7%,
а тяжелый – у 2,4%. Полное восстановление неврологического дефицита при
выписке отмечалось у 21 больного и составило 16,7 %.
Результаты молекулярно-генетического исследования
Для изучения влияния генов-кандидатов ССЗ на развитие ИИ был
проведен анализ полиморфных локусов генов GP1BA, F2, F5, MTHFR, ACE,
PARP1, HIF1A у пациентов с атеротромботическим, лакунарным инсультом,
а
так
же
у
больных
с
инсультом
неустановленной
этиологии
(«криптогенным» инсультом), из молекулярно-генетического исследования
были исключены пациенты с кардиоэмболическим вариантом и с инсультом
другой известной этиологии. Кроме того, исследование генов системы
гемостаза было проведено пациентам с выявленным тромбозом БЦА.
Распределение генотипов и аллелей по всем изученным полиморфным
локусам соответствовало уравнению Харди-Вайнберга как в группах
больных, так и в контрольной группе (p>0,05).
14
Анализ вклада -5Т/С полиморфизма гена GP1BA в развитие
ишемического инсульта у пациентов молодого возраста
Гликопротеин Ib (GPIb) – тромбоцитарный белок, экспрессирующийся
на поверхности клеточной мембраны. Гликопротеин Ib входит в состав
гликопротеинового комплекса GPIb/IX/V, который функционирует как
рецептор для фактора фон Виллебранда (ФВ). -5Т/С полиморфизм гена
GP1BA приводит к нарушению регуляторной последовательности (элемент
Козак) [Kaski S., et al., 1996], что оказывает влияние на эффективность
трансляции и приводит к увеличению плотности рецепторного комплекса
GPIb/IX/V, обнаруживаемого на мембранах тромбоцитов [Croft SA, Hampton
KK, et al., 2000, Afshar-Kharghan V, et al., 1998], что в свою очередь может
способствовать развитию тромбообразования.
Впервые в нашей стране был проведен анализ -5Т/С полиморфизма
гена GP1BA у пациентов молодого возраста (Таблица 1).
Таблица 1. Распределение частот генотипов и аллелей
-5Т/С
полиморфизма гена GP1BA в группах пациентов молодого возраста и
контрольной группе (%).
GP1BA
МИ
Варианты генотипов
GP1BA (ТТ) 62
GP1BA (CT) 33,7
GP1BA(СС) 4,3
Варианты аллелей
GP1BA (Т)
78,8
GP1BA(С)
21,2
Контроль МИ
(М)
Контроль МИ
(М)
(Ж)
Контроль
(Ж)
76,4
23,6
0
58,9
37
4,1
79,5
20,5
0
73,7
21,1
5,3
73,3
26,7
0
88,2
11,8
77,4
22,6
89,8
10,2
84,2
15,8
86,7
13,3
В связи с низкой численностью гомозигот по редкому аллелю С гена
GP1BA пациенты с генотипами С/С и С/Т были объединены в одну группу.
15
Показано статистически достоверное различие в распределении частот
генотипов между больными и контрольной группой у мужчин. Отмечалось
увеличение риска развития ишемического инсульта у мужчин молодого
возраста с генотипами С/С и С/Т (p=0,03, ОР=2,7, ДИ[1,1; 6,5]). Также имело
место статистически достоверное повышение частоты встречаемости аллеля
С у мужчин данной возрастной группы по сравнению с контролем (p=0,02,
ОР=2,6, ДИ[1,2; 5,7]). Достоверных различий в частоте встречаемости
аллелей и генотипов между больными и контролем у женщин получено не
было (р>0,1).
Таким образом, на следующем этапе анализировали распределение
генотипов GP1BA при различных патогенетических вариантах ИИ у мужчин
(Таблица 2).
Таблица 2. Распределение частот генотипов и аллелей
-5Т/С
полиморфизма гена GP1BA в группах пациентов мужчин молодого возраста
и контрольной группе (%) в зависимости от патогенетического варианта
МИ
контроль
ЛИ «криптогенный»
АТИ
GP1BA
Варианты генотипов
GP1BA (ТТ) 66,7
52,2
GP1BA (СT) 29,1
43,5
GP1BA(СС)
4,2
Варианты аллелей
GP1BA (T)
81,6
GP1BA(C)
18,4
57,7
38,5
79,5
20,5
4,3
3,8
0
73,9
26,1
76,9
23,1
89,8
10,2
При сравнении мужчин с атеротромботическим инсультом (АТИ) с
контрольной группой мужчин, статистически достоверных различий в
распределении частот генотипов (p=0,3) и аллелей (p=0,2) не получено. При
сравнении пациентов с лакунарным инсультом (ЛИ) со здоровым контролем
наблюдалось статистически достоверное различие в распределении частот
16
генотипов (p=0,03) и аллелей (p=0,02). Риск развития инсульта у лиц с
генотипами С/С и С/Т повышен (OР=3,6, ДИ[1,2; 10,7]). При анализе
«криптогенного» инсульта выявлено, что в данной группе больных
отмечалось наличие выраженной тенденции в виде увеличения частоты
встречаемсти аллеля С и связанных с ним генотипов C/C и C/T (для аллеля
p=0,051, OР=2,6, ДИ[1,0 – 6,8], для генотипов p=0,053, OР=3,2, ДИ[1,0; 6,8]).
Отдельно была проанализирована группа пациентов с ишемическим
инсультом, вызванным тромбозом каротидных или позвоночных артерий.
Группа пациентов с тромбозом БЦА составила 21 человек (14 пациентов с
атеротромботическим инсультом и 7 – с «криптогенным»), из них 18 мужчин
(85,7%) и 3 женщины (14,3%). Получено следующее распределение частот
генотипов: Т/Т генотип встречался у 8 пациентов (38,1%), Т/С – 11 (52,4%),
С/С- 2 (9,5%). Показано, что в группе больных достоверно чаще встречались
генотипы С/С и С/Т по сравнению с контрольной группой (OР=5,3, p=0,0013,
ДИ [1,9; 14,4]).
Анализ вклада G20210A полиморфизма гена F2 в развитие
ишемического инсульта у пациентов молодого возраста
Ген F2 кодирует коагулирующий фактор II – протромбин, который
входит в состав сложного комплекса белков, образующих свертывающую
систему крови, и является одним из ее главных компонентов. В ходе
протеолиза протромбина образуется тромбин. Был описан полиморфный
локус G20210A, расположенный в 3'-фланкирующей области гена F2 [Poort
S.R.et al., 1996]. В нашей стране была выявлена ассоциация гена F2 с риском
развития
ишемического
инсульта
у
пациентов
молодого
возраста
[Иллариошкин С.Н., Суслина З.А. и др., 2006].
Достоверных различий в частоте встречаемости генотипов и аллелей у
пациентов с ИИ и в контрольной группе не выявлено. При сравнении мужчин
и женщин с ИИ с контрольной группой также не получено достоверных
17
различий во встречаемости генотипов и аллелей. При анализе возможной
ассоциации гена F2 с патогенетическими вариантами ишемического
инсульта в молодом возрасте достоверных различий в распределении частот
генотипов гена F2 не получено. При сравнении пациентов с инсультом в
результате тромбоза БЦА с контролем получено следующее распределение
частот генотипов: G/G генотип встречался у 16 пациентов (80%), G/A – у 4
(20%), в контрольной группе G/G генотип у 87 человек (97,8%), G/A – у 2
(2,2%). Частота встречаемости G аллеля у пациентов составила 90%, A аллеля
– 10%, в контрольной группе частота встречаемости G аллеля была 98,9%, A
аллеля - 1,1%.Таким образом, выявлено статистически достоверное различие
в распределении частот генотипов G/A и G/G (OР=10,9, p=0,01, ДИ [1,8;
64,5]) и аллелей (OР=9,8, p=0,01, ДИ [1,7; 55,4]) между группами.
Анализ вклада G1691A полиморфизма гена F5 в развитие
ишемического инсульта у пациентов молодого возраста
Коагулирующий фактор V (FV) секретируется в результате активации
тромбоцитов. В гене F5 был обнаружен полиморфный локус G1691A
(мутация Лейдена). Мутация Лейдена ассоциирована с устойчивостью к
активированному протеину С, и является причиной гиперкоагуляционной
активности фактора V, что может приводить к развитию тромбозов. Только
несколько исследований случай – контроль обнаружили ассоциацию между
мутацией и риском развития ишемического инсульта или транзиторной
ишемической атакой [ De Lucia D, et al 1998, Szolnoki Z, et al., 2001, Зорилова
И.В.,2006], в то время как в других случаях данной ассоциации не выявлено
[Catto A, et al., 1995, Rosendaal F.R, et al., 1998].
При анализе частоты встречаемости мутации Лейдена в группе
пациентов с ИИ и в контрольной группе достоверных различий в частоте
встречаемости генотипов и аллелей между группами не выявлено. При
сравнении мужчин и женщин с ИИ с контрольной группой также не
18
получено достоверных различий во встречаемости генотипов и аллелей. При
анализе
возможной
ассоциации
G1691A
полиморфизма
гена
F5
с
патогенетическими вариантами ИИ в молодом возрасте, выявлено, что при
ЛИ отмечалось достоверное увеличение встречаемости генотипа G/A и
аллеля А по сравнению с контрольной группой (p=0,04, OР=11,1, ДИ=[1,1;
111,9]). Получено следующее распределение встречаемости частот генотипов
и аллелей в группах. У больных с ЛИ: G/G генотип встречался у 24 больных
(88,9%), G/A – у 3 человек (11,1%), частота встречаемости G аллеля
составила 94,4%, A аллеля – 5,6%. В контрольной группе: генотип G/G был
выявлен у 89 (98,9%) человек, G/A – у 1 (1,1%), частота встречаемости G
аллеля составила 99,5%, A аллеля – 0,5%. С другими патогенетическими
вариантами ИИ, как и с инсультом в результате тромбоза БЦА статистически
достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей получено
не было.
Учитывая данные результаты, можно сделать предположение, что
прокоагуляционная активность фактора V, которая возникает при наличии
данной мутации реализуется на уровне микроциркуляторного русла на фоне
артериальной гипертонии и нарушений углеводного обмена.
Анализ вклада C677T полиморфизма гена MTHFR в развитие
ишемического инсульта у пациентов молодого возраста
Одной из причин активации коагуляционного каскада является
накопление гомоцистеина в организме, к чему могут приводить изменения в
гене, кодирующем синтез 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы. Frosst P.
et al. в 1995 г. был обнаружен полиморфизм в 4 экзоне гена (замена
нуклеотидов цитозина на тимин в 677 положении – С677Т), который
приводит к замене аминокислот аланина на валин в 222 положении белковой
молекулы (A222V). У пациентов с Т/Т генотипом уровень гомоцистеина в
крови на 25% выше, чем у лиц с С/С генотипом [Wotherspoon F, et al 2003].
19
Однако,
что
касается
исследований
по
изучению
вклада
С677Т
полиморфного варианта гена MTHFR в риск развития инсульта, то их
результаты остаются достаточно противоречивыми [Kelly P.J., et al 2002,
Pezzini A., et al 2002].
При анализе C677T полиморфизма гена MTHFR как во всей выборке,
так и при различных патогенетических вариантах ишемического инсульта,
статистически достоверных ассоциаций выявлено не было.
Кроме того, при сопоставлении подгрупп больных с разными
генотипами по C677T полиморфному локусу гена MTHFR, различий в
среднем уровне гомоцистеина выявлено не было. Средний уровень
гомоцистеина у пациентов с С/С генотипом составил 14,19±4,8 мкмоль/мл, с
генотипом С/T – 14,28±4,6 мкмоль/мл, с T/T генотипом – 19,3±8,2 мкмоль/мл
(ANOVA, p = 0,099).
Анализ вклада I/D полиморфизма гена ACE в развитие
ишемического инсульта у пациентов молодого возраста
Одной из важнейших причин эндотелиальной дисфункции является
хроническая гиперактивация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы,
одним из главных компонентов которой является ангиотензинпревращающий
фермент (ACE). В ряде исследований была найдена ассоциация между D/D
полиморфным вариантом гена ACE и высоким риском лакунарных инсультов
[Markus H., Barley J. et al., 1995], а также ассоциация данного генотипа с
риском развития гемодинамически значимых стенозов сонных артерий
[Скворцова В.И., Кольцова Е.А. и др., 2001].
В результате исследования выявлено отсутствие ассоциации I/D
полиморфизма гена ACE с ИИ у пациентов данной возрастной группы, а
также с отдельными патогенетическими вариантами инсульта. Кроме того,
статистически достоверных различий в частоте встречаемости генотипов по
I/D
полиморфизму
гена
ACE
как
при
наличии
стенозирующего
20
атеросклероза, так и при наличии гемодинамически значимого стеноза
получено не было (p>0,05).
Анализ вклада IVS9-675C A полиморфизма гена HIF1A и rs3219023
полиморфизма гена PARP1 в развитие ишемического инсульта у
пациентов молодого возраста
Особый интерес представляет изучение наследственных факторов
индивидуальной чувствительности вещества мозга к ишемии, среди которых
большое значение имеют гены-регуляторы апоптоза и антиапоптозной
защиты. В этом отношении интересны гены PARP1 и HIF1A. В нашей стране
было проведено исследование, в котором выявлена ассоциация rs3219023
полиморфизма гена PARP1 с объемом очага поражения и тяжестью
состояния пациентов [Скворцова В.И., Лимборская С.А. и др., 2005], а в
отношении
гена
HIF1A
была
выявлена
ассоциация
IVS9-675C A
полиморфизма данного гена с атеротромботическим инсультом [Лимборская
С.А., Тупицына Т.В., 2006].
Нами было проведено исследование IVS9-675C A полиморфизма гена
HIF1А, которое показало, что данный полиморфизм не влияет на риск
развития ишемического инсульта в возрасте до 50 лет, а также на тяжесть
заболевания и степень функционального восстановления пациентов.
При анализе rs3219023 полиморфизма гена PARP1, также не выявлено
ассоциации
с
риском
развития
ишемического
инсульта
и
его
патогенетическими вариантами в молодом возрасте.
Учитывая данные литературы [McCullough LD., 2005], согласно
которым клеточные механизмы повреждения и нейропротекции не являются
универсальными,
а
зависят
от
пола,
на
следующем
этапе
было
проанализировано влияние полиморфных вариантов гена PARP1 на тяжесть
ишемического инсульта в зависимости от пола на первые и двадцать первые
сутки (пациенты с полным восстановлением были проанализированы
21
совместно с пациентами с легкой степенью неврологического дефицита по
шкале NIH) (Таблица 3).
Таблица
3.
Распределение
частот
генотипов
по
rs3219023
полиморфному локусу гена PARP1 с учетом тяжести состояния у мужчин и
женщин на первые и двадцать первые сутки ИИ (%)
Первые сутки
PARP1
PARP1
Степень
тяжести по NIH Мужчины Женщины
GA+
GA+
AA GG
AA
GG
Легкая+полное 47,2 9,7
21
26,3
восстановление
Средняя
Тяжелая
ТКФ
(p)
Двадцать первые сутки
PARP1
Мужчины
GA+
AA
GG
65,3 16,7
PARP1
Женщины
GA+
AA
GG
47,1 47,1
25
9,7
26,3
15,8
8,3
5,5
5,9
0
2,8
5,6
5,3
5,3
1,4
2,8
0
0
6,31
(0,038)*
0,83
(0,81)
4,62
(0,07)
0,94
(1,0)
Примечание: * - различия между группами достоверны (p<0,05)
У
мужчин
отмечалась
статистически
достоверная
ассоциация
генотипов G/A и G/G с выраженностью неврологического дефицита на
первые и наличие тенденции на двадцать первые сутки пребывания в
стационаре, в то время как у женщин данной тенденции выявлено не было. В
связи с чем, у мужчин была проанализирована ассоциация данного
полиморфного
локуса
с
тяжестью
состояния
в
зависимости
от
патогенетического варианта (пациенты с полным восстановлением были
проанализированы
совместно
с
пациентами
с
неврологического дефицита по шкале NIH) (Таблица 4).
легкой
степенью
22
Таблица
4.
Распределение
частот
генотипов
по
rs3219023
полиморфному локусу гена PARP1 с учетом тяжести состояния у мужчин на
первые и двадцать первые сутки в зависимости от патогенетического
варианта инсульта (%)
Патогенетический Атеротромботичес
вариант
кий вариант
Лакунарный
вариант
NIH 1 сутки
AA
GA+GG
PARP1
AA
GA+GG
AA
Легкая+полное
восстановление
41,7
4,2
47,8
52,0 8,0
Средняя
Тяжелая
ТКФ/χ2 (p)
33,3
0
ТКФ
(0,002)*
AA
58,3
NIH 21 сутки
Легкая+полное
восстановление
Средняя
Тяжелая
ТКФ/χ2 (p)
17,4
"Криптогенный"
GA+GG
4,2
17,4 17,4
24,0 8,0
16,7
0
0
8,0 0
11,299 χ2 - 1,252 (0,371) ТКФ-0,995 (0,71)
GA+GG
8,3
16,7
8,3
0
8,3
ТКФ - 6,2 (0,03)*
AA
65,2
GA+GG
26,1
0
8,7
0
0
χ2 – 4,1 (0,11)
AA
72
GA+GG
16
8,0 0
4,0 0
χ2 – 4,1 (0,11)
Примечание: * - различия между группами достоверны (p<0,05)
Выявлено, что при атеротромботическом патогенетическом варианте у
мужчин, как на первые, так и на двадцать первые сутки у носителей
генотипов G/A и G/G гена PARP1 отмечалось более тяжелое течение
ишемического инсульта.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что из 126 пациентов в возрасте до 50 лет ишемический
инсульт в 3 раза чаще встречался у мужчин. В развитии ишемического
инсульта в данной возрастной группе важную роль играли такие
23
модифицируемые факторы риска, как АГ (58,7%), курение (57,1%),
нарушение углеводного обмена (32,5%), злоупотребление алкоголем
(26,2%). С наибольшей частотой была выявлена наследственная
предрасположенность
больных).
У
по
сердечно-сосудистой
24,6%
пациентов
атеротромботический, у 15,1% -
патологии
был
(85%
диагностирован
кардиоэмболический, у 21,4% -
лакунарный патогенетический вариант, у 11,9% - ишемический
инсульт другой известной этиологии, а в 27% случаев инсульт
неустановленной этиологии. У большинства больных отмечался
благоприятный исход заболевания (16,7% пациентов были выписаны с
полным восстановлением неврологического дефицита, а 68,2% - с
легким неврологическим дефицитом).
2. Клиническое
исследование
выявило,
что
у
пациентов
с
атеротромботическим инсультом в возрасте до 50 лет статистически
достоверно увеличен уровень гомоцистеина по сравнению с другими
патогенетическими вариантами (p < 0,001). Однако, в нашем
исследовании не установлено статистически достоверных различий
среднего уровня гомоцистеина при различных генотипах по C677T
полиморфному локусу гена MTHFR (p = 0,099). Кроме того, анализ
полиморфного локуса C677T гена MTHFR показал, что данный
полиморфизм не влияет на риск развития ишемического инсульта у
пациентов в возрасте до 50 лет.
3. Анализ -5Т/С полиморфного локуса гена GP1BA показал, что данный
полиморфизм ассоциирован с развитием ишемического инсульта у
мужчин молодого возраста. Фактором повышенного риска развития
инсульта являлся аллель -5С и генотипы, его содержащие:-5Т/С и -5С/С
(p = 0,04; ОР = 2,0; ДИ [1,04; 3,8]). Также у мужчин аллель -5С и
генотипы -5Т/С и -5С/С являлись фактором повышенного риска
лакунарного подтипа ишемического инсульта (p = 0,02; OР = 3,6; ДИ
24
[1,2; 10,7]). Кроме того, у пациентов в возрасте до 50 лет генотипы
-5С/С и -5С/Т ассоциированы с развитием ишемического инсульта,
вызванного тромбозом брахиоцефальных артерий (p = 0,001; OР = 5,3;
ДИ [1,9; 14,4]).
4. Анализ полиморфных локусов G1691A гена F5 и G20210A гена F2
показал, что 1691A аллель и G1691A генотип гена F5 ассоциированы с
развитием лакунарного ишемического инсульта у пациентов молодого
возраста (p = 0,038, ОР = 11,1, ДИ [1,11; 111,88]), а 20210A аллель и
генотип G20210A гена F2 ассоциированы с повышенным риском
развития
ишемического
инсульта
в
результате
тромбоза
брахиоцефальных артерий (p = 0,01, OР = 10,9, ДИ [1,8; 64,5]), и не
влияют на риск развития других патогенетических вариантов инсульта
(p>0,05).
5. Анализ rs3219023 полиморфного локуса гена PARP1 установил,
статистически достоверную ассоциацию генотипов G/A и G/G с
выраженностью неврологического дефицита на первые сутки и
наличие тенденции на двадцать первые сутки заболевания у мужчин, в
то время как у женщин данной зависимости не отмечалось. Кроме того,
при атеротромботическом патогенетическом варианте у мужчин, как на
первые (p = 0,002), так и на 21 сутки (p = 0,034) отмечалось наличие
статистически
достоверной
ассоциации
между
носительством
генотипов G/A и G/G гена PARP1 и тяжестью неврологического
дефицита. При этом было показано, что rs3219023 полиморфизм гена
PARP1
и
IVS9-675C A
полиморфный
локус
гена
HIF1A
не
ассоциированы с риском развития ишемического инсульта у пациентов
в возрасте до 50 лет. Кроме того, не выявлено ассоциации IVS9-675C A
полиморфного локуса гена HIF1A с тяжестью заболевания и степенью
функционального восстановления пациентов.
25
6. В нашем исследовании не выявлено статистически достоверной
ассоциации между I/D полиморфизмом гена ACE и развитием
ишемического инсульта, а также наличием гемодинамически значимых
стенозов у пациентов в возрасте до 50 лет.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Рекомендуется использовать молекулярно-генетическую диагностику для
определения полиморфных вариантов генов GP1BA, F2, F5, как
дополнительных факторов риска инсульта, у людей с отягощенным
семейным анамнезом с целью проведения превентивных мероприятий, а
также для уточнения патогенетического варианта инсульта у пациентов
перенесших ИИ.
2. Рекомендуется
включить
G/A
и
G/G
генотипы
по
rs3219023
полиморфному локусу гена PARP1 у молодых мужчин с ишемическим
инсультом
в
качестве
молекулярно-генетического
маркера
неблагоприятного течения заболевания с целью проведения адекватной
нейропротекторной и метаболической терапии.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ
1. Кимельфельд, Е.И. Ишемический инсульт у больных молодого возрастат /
В.И.Скворцова, Е.А.Кольцова, Е.И.Кимельфельд // Журнал неврологии и
психиатрии им. С.С. Корсакова. Инсульт. - 2009. Т.109. - № 10. - С. 3 – 14.
2.
Кимельфельд,
Е.И.
Сравнительный
анализ
факторов
риска
и
патогенетических вариантов ишемического инсульта в молодом и пожилом
возрасте / В.И.Скворцова, Е.А.Кольцова, Е.И.Кимельфельд // Курский
научно-практический вестник "Человек и его здоровье". - 2012. - №3. С. 81-87.
3. Кимельфельд, Е.И. Анализ вклада -5Т/С полиморфизма гена GP1BA в
развитие ишемического инсульта у пациентов молодого возраста /
26
В.И.Скворцова,
Е.А.Кольцова,
П.А.Сломинский,
Е.И.Кимельфельд,
Т.В.Тупицына
//
С.А.Лимборская,
Журнал
"Неврология,
нейропсихиатрия, психосоматика". - 2012. - №4. - С. 39-44.
4. Дробязгина, Е.И. Анализ факторов риска ишемического инсульта у
пациентов
молодого
возраста
/
В.И.Скворцова,
Е.А.Кольцова,
Е.И.
Дробязгина // Материалы X международной конференции «Актуальнi
питання неврологi». - Судак 2008. – С. 49
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ – артериальная гипертония
АТИ – атеротромботический инсульт
БЦА – брахиоцефальные артерии
ДС БЦА– дуплексное сканирование брахиоцефальных артерий
ИИ – ишемический инсульт
ЛИ – лакунарный инсульт
МИ – молодой инсульт
ССЗ – сердечно-сосудистые заболевания