Генная терапия при гемофилии

Генная терапия при гемофилии
Серия монография «Лечение гемофилии», №18, Всемирная федерация гемофилии 1999
Артур Р. Томпсон
Вашингтонский Университет и центр крови Пьюджет Саунд, Сиэтл, США
Gene Therapy for the Hemophilias
Treatment of Hemophilia Monograph Series, Number 18. World Federation of Hemophilia: 1999.
Arthur R. Thompson, MD, PhD
Резюме. Исследуется ряд подходов передачи генов факторов VIII и IX. Наиболее
совершенная методика пока не выработана, но значительный прогресс был сделан в
отношении экспрессии фактора после in vivo внедрения векторов подопытным животным,
что привело к значительному развитию клинических испытаний для обоих факторов. В
последнее десятилетие различным лабораториям удалось достичь определенных результатов
в области генной терапии при гемофилии. При ранних попытках кодированные ДНК (кДНК)
факторов IX или VIII встраивались в клетки, выращиваемые в культуре, а затем измененные
клетки возвращались животному-донору. К сожалению, измененные клетки лучше
вырабатывали фактор в культуре (ex vivo) чем в организме животного (in vivo). Это привело к
попыткам передачи кДНК путём внедрения их в векторы, которые затем напрямую
вводились животным, путем внутривенной или внутримышечной инъекции. Имелся
некоторый успех с выработкой субтерапевтического количества белка в течение
продолжительного времени или даже нормального количества – в течение нескольких
месяцев. Однако подобное наблюдалось только в пределах последнего года. Последние
результаты, которые, вероятно, позволят проводить клинические испытания на людях,
приведены в этой монографии.
Введение
Для больных гемофилией, генная терапия позволила бы непрерывно синтезировать
нормальный белок, чтобы восполнить его дефицит in vivo. Синтез белка в результате, можно
сравнить с «исцелением», которое наблюдается у больных редкими формами гемофилии,
которые подверглись трансплантации печени. Различие с трансплантацией органа – то, что
при генной терапии, переносятся собственные клетки; с добавленным функциональным
геном. Следовательно, отпадает необходимость в токсичной иммуносупрессии, применяемой
при пересадке органов во избежание отторжения. Основные элементы генной передачи
(векторы и клетки-реципиенты) – тема нескольких обзорных статей.
Следует проводить различие между генной терапией, направленной на изменение
соматических клеток и экспериментальными подходами по выведению трансгенных
животных. Такие животные способны передавать генетические модификации следующим
поколениям, поскольку все их клетки, включая, половые (яйцеклетки и сперматозоиды)
подвергаются модификации.
Для
создания
трансгенной
овцы,
синтезирующей человеческий
фактор
IX,
окультуренные зародышевые фибробласты были трансфецированы кДНК человеческого
фактора IX и ядра были перенесены в яйцеклетку; после оплодотворения и роста в матке, на
свет появилась овца, содержащая человеческий фактор IX во всех тканях. В отношении
взрослой самки это означает, что фактор IX будет содержаться в ее молоке. Второе отличие
от генной передачи – восстановление гена. Химерные олигонуклеотиды ДНК-РНК,
разработанные для проведения выборочной мутации гена фактора IX у крыс, частично
изменили гены фактора IX, имитируя гемофилию В. Это означает, что in vivo восстановление
ДНК путем специфических мутаций может исправлять генетические нарушения, в том числе
гемофилию. Поскольку существует множество различных мутаций вызывающих гемофилию
в различных семьях, и ряд мутаций более сложны, чем единичное основное изменение
(только одного из тысяч стандартных блоков ДНК в гене) кодирующей ДНК, введение
нормального гена передачей гена соматической клетки имела бы намного более широкую
применимость у пациентов. Кроме того, недавние удачные опыты по передаче лабораторным
животным векторов полученных из вирусов указывает, что эти системы наиболее надежны в
обеспечении устойчивых терапевтических норм факторов свертывания крови.
Векторы для переноса гена
Перенос ДНК в клетку для проведения генной терапии выполняется путем
трансдукции, контролируемым процессом в котором передаточным звеном служат векторы,
прикрепляющиеся к клеточной стенке и облегчающие проникновение внутрь клетки. В этом
состоит ее отличие от трансфекции, при которой производится разрыв клеточной мембраны,
и внедрение ДНК происходит с помощью физических или электролитических методов.
Векторы для передачи обычно получают из основных цепей нуклеиновой кислоты вируса,
поскольку они более эффективны, чем невирусные препараты. Часть вирусной нуклеиновой
кислоты, которая управляет прикреплением и проникновением в клетку, сохраняется.
Векторные системы с доклиническими испытаниями на животных, относящиеся к генной
терапии для больных гемофилией, приведены в Таблице 1. Заключительный раздел этого
обзора отражает соображения по их использованию в клинических испытаниях.
Таб.1 Векторы, используемые при генной терапии, гемофилии А и В
Вектор
Нуклеиновая
Преимущества
Недостатки
Фактор,
кислота
Ссылка
способ
введения,
лабораторное
животное
Ретровирус
РНК
(РВ)
Эффективная
Образование
IX,
воротная
передача,
онкогена,
вена,
геномная
нерегулярное
собака
интеграция,
внедрения,
в/в, кролик
стойкая
зависимость
экспрессия
от
ГВ
Кай, 1993,
Грингард 1998
VIII,
деления
клетки
Аденовирус
ДНК
(AВ)
Перенос клеток
Иммунные
с
реакции
высоким
на
IX, ГВ собака,
Кай, 1994
в/в VIII, в/в,
Кеннели 1998
уровнем ДНК
проводимые
эффективность
действия
Интеграция
Ограниченный
IX,
ассоциирован
стойкой
размер
мышь, собаки
ный
экспрессии
возможных
ГВ,
перестановок
воротная вена,
Адено-
(ААВ)
ДНК
вирус
ГИ мышь
в/м,
ГИ
Херцог, 1999
Снайдер, 1999
IX,
ДНК
в/в – внутривенное (введение), в/м – внутримышечное (введение), ГИ – генетически
измененная мышь, больная гемофилией, ГВ – гемофилия В.
Ретровирусные векторы
В прошлом методика генной терапии состояла в том, чтобы использовать
ретровирусные векторы для передачи делящихся клеток в тканевую культуру, и возвратить
уже преобразованную клетку ее изначальному хозяину. Уровень экспрессии был
значительно выше в культуре, чем после пересадки. Экспрессия в преобразованных клетках
была зачастую in vivo. Данные проблемы привели к попыткам по улучшению методов
введения векторов напрямую в подопытное животное и преобразованию клеток in vivo.
Принцип долгосрочной экспрессии, в результате введения in vivo ретровирусного
вектора был установлен, когда подопытные собаки, больные гемофилией B, вырабатывали
нормальный фактор IX в течение двух лет, хотя его уровня и не хватало, чтобы полностью
устранить склонность к кровотечениям. Кроме того, из-за потребности ретровирусного
вектора в делении клеток, эти собаки подверглись гепатэктомии (удалению до двух третей
печени) с тем, чтобы увеличить число делящихся клеток во время инъекции вирусных
компонентов.
Изучение фактора VIII показало замедленное увеличение в экспрессии человеческого
фактора VIII у кроликов, с удаленным B-доменом. кДНК вводилась внутривенно в
ретровирусном векторе. Экспрессия сохранялась, по меньшей мере, несколько недель.
Однако измерить ее активность не представлялось возможным из-за присутствия у кроликов
нейтрализующих антител к человеческому фактору VIII. Были предоставлены дальнейшие
доказательства того, что фактор VIII действует как иммунный комплекс. Поскольку размер
ретровирусного вектора, который может быть вставлен в РНК, ограничен, фактор VIII с
удаленным B-доменом, использовался, только будучи не более двух третей от размера
нормального фактора VIII. В клинических испытаниях, фактор VIII с удаленным B-доменом
(полученный из культуры трансфецированных клеток) сопоставим по способности к
восстановлению, выживанию, и предотвращению кровотечений с фактором VIII полной
длины (с B-доменом). Реальный уровень фактора VIII, производимый кроликами, не может
быть измерен точно. Его следует оценивать с учетом иммунной реакции данного
генетически измененного вида животных (например, мышиный фактор VIII у мышей или
собачий фактор VIII у собак). Как бы то ни было, подобные эксперименты потребовали бы
установления оптимального удаления последовательности B-домена для каждого вида
подопытных животных.
Различные типы ретровирусных векторов воздействуют на различные типы клеток.
Более старые ретровирусы могут встраиваться только в делящуюся клетку, но
лентиретровирусы, типа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), способны инфицировать
также и клетки в состоянии покоя. Человеческие лентивирусные векторы способны
преобразовывать клетки печени или мышц в состоянии покоя. Векторы, преобразующие и
делящиеся и неделящиеся клетки, более эффективны и должны обеспечивать лучшие
результаты экспрессии.
Изучение гемофилических генов и безопасности векторов, содержащих некоторые
ВИЧ-подобные элементы, находится на стадии разработки, но опыт по лентивирусным
векторам ограничен. Напротив, имеется значительное количество данных по больным раком,
принимавших нелентиретровирусные векторы с рядом различных кДНК. Изучения показали,
что эти ретровирусные векторы безопасны и могут быть допущены для использования, по
крайней мере, в ближайшем будущем. Однако, главное ограничение не лентиретровирусных
векторов – то, что клетки должны находиться в процессе деления для интеграции вектора.
Аденовирусные векторы
Аденовирусные векторы имеют замечательную способность включать большие
фрагменты ДНК в последовательность вирусной ДНК, приведенной в непатогенное
состояние, частичным исключением вирусного генома. Они также могут преобразовывать
клетки с большим числом вирусных частиц и инфицируют спокойные или делящиеся клетки.
Однако, кроме того они вырабатывают ряд аллергенных вирусных белков, приводящих к
более скорому возвращению преобразованной клетки в исходное состояние. При чем,
повторный перенос обычно безуспешен, поскольку первое воздействие уже вызвало
иммунную реакцию на подавление аденовирусного капсида (покрывающего белка).
Повторный перенос особенно важен, так как аденовирус или аденовирусный векторы
остаются эписомальны (внехромосомны) и не интегрируются в геномную ДНК (в ядро)
клетки-мишени. Продолжительная экспрессия фактора VIII или фактора IX была успешно
достигнута у лабораторных животных. Особенно когда несколько аденовирусных генов
разорваны, и когда вектор введен животному, иммунная реакция которого была подавлена.
Дальнейший успех был достигнут с вектором «мини-Ad», который включает ДНК полной
длины человеческого фактора VIII в структуру, лишенную выраженных аденовирусных
генов. Такая структура должна сохраняться в течение более длительного периода, поскольку
иммунной реакции на вирусный белок последовать не должно. Многочисленные введения,
без подавления иммунных реакций реципиента из-за потребности белка капсида, созданного
аденовирусом. Поскольку все еще не имеется никакой векторной интеграции, эписомные
уровни экспрессии будут уменьшаться в течение нескольких недель (возможно, нескольких
месяцев), делая повторное введение аденовирусного вектора необходимым.
Адено-ассоциированные вирусные (ААВ) векторы
Изначально считалось, что ААВ векторы внедряются в клетки лишь в присутствии
аденовируса и что уровень интеграции достаточно низок, более современные структуры
ААВ в состоянии самостоятельно преобразовывать соматические клетки. Интеграция
происходит медленно, однако, приходит к максимальному результату после 2-6 недель.
После введения специально выведенной породе мышей (с ослабленной способностью к
выработке антител к человеческому белку), скрещенной с мышами со специально
нарушенным геном фактора IX, выработка терапевтического уровня человеческого фактора
IX было устойчивым в течение нескольких месяцев. Фенотипическая коррекция (отсутствие
кровотечений) и экспрессия фактора IX у данных мышей находилась на уровне 15% в
течение года; кроме того, при повышением векторной дозы, уровень фактора IX, достигал
100%. Клетки печени возможно преобразовывать инъекцией векторов ААВ в периферийные
вены, хотя воротная вена, которая тянется прямо от желудочно-кишечной области до печени,
обеспечивает более эффективную передачу. Введение вектора ААВ переносящего кДНК IX
собачий фактор, путем нескольких внутримышечных инъекций, или инъекций в воротную
вену, у собак с тяжелой формой гемофилия B, привело к длительной экспрессии
терапевтических уровней фактора IX. Необходимая доза ААВ векторов человеческого
фактора IX, необходимых при гемофилия B должна стать доступна в течение следующего
года. Оптимальные дозировки и пути введения остаются в стадии определения.
Внутримышечные инъекции относительно просты, хотя внутривенное введение в целях
достижения печеночной экспрессии может быть менее аллергизирующим. Благодаря успеху
опытов на лабораторных животных, первые клинические испытания генной терапии у
больных гемофилией пройдут, скорей всего с применением ААВ векторов фактора IX.
кДНК фактора VIII с удаленным B-доменом, достаточно велик, поэтому, когда она
помещается в ААВ вектор, титр вектора низок. Рядом ученых производились попытки
создать гибрид ААВ-аденовирусного вектора, который может сохранить способность
вектора ААВ интегрировать большой кДНК фактора VIII.
Будущее клинических исследований
Поскольку векторные системы, способные к доставке кДНК фактора IX или VIII к
клеткам-хозяевам будут оптимизированы, чтобы отразить достаточное количество in vivo для
больных гемофилией, разработка клинических испытаний над пациентами-людьми
становится важной задачей. Вопросы безопасности первостепенны в оценке потенциального
риска
против
возможности
сделать
гемофилию
менее
тяжелым
заболеванием
с
возможностью долговременного излечения. В этом разделе, рассматривается потенциальная
безопасность для каждой векторной системы, на основе чего из пациентов выбирают
подходящих кандидатов для начальных клинических испытаний над людьми.
Ретровирусные
векторы
подготавливают
вместе
с
вирусом-помощником,
с
необходимыми предостережениями, чтобы гарантировать, отсутствие рекомбинации в
соответствующем векторе (особенно это важно для лентивирусных векторов). Внедрение в
геном клетки-хозяина случайно, повышая вероятность, что вектор будет вставлен возле
онкогена, что может увеличить риск рака. Поскольку вектор имеет свой собственный сигнал,
это событие может предрасположить клетку и её потомство к экспрессии неопластических,
т. е. раковых образований. Рассматривая размер целого генома, это — очень маловероятная
проблема, даже если объединение не полностью случайно. Ясно, что невирусные векторы
были бы предпочтительны во избежание даже подобного риска; однако, невирусные векторы
намного менее эффективны при вводе и преобразовании клеток, так как доставка и
устойчивость должны быть значительно улучшены, прежде чем они могут рассматриваться
потенциально терапевтическими.
Аденовирусные векторы безопасны в том смысле, что они не интегрируются в геном.
Несколько копий могут преобразовать одну и ту же клетку, и число копий должно
сохраняться на достаточно низком уровне, чтобы предотвратить отравление клетки и её
смерть. Поскольку аденовирусные векторы – причина обычной простуды, возможно, что
некоторые люди будут иметь достаточно высокие уровни антител против исходного типа
аденовирусного вектора, что затруднит его попадание в клетку. Из-за свойства избегать
иммунных реакций на белки аденовируса, векторы мини-Ad особенно привлекательны;
однако, их способность сохраняться достаточно долго для обеспечения необходимым
уровнем фактора практически мало изучена, и им потребуется дальнейшая модификация
чтобы позволить повторное введение.
Адено-ассоциированныевирусные
векторы
интегрируются
в
геном,
вероятно,
случайным образом, хотя некоторые нестабильные вирусы интегрируются преимущественно
в определенное место в хромосоме. Поэтому опасения, связанные с активацией онкогенов,
относится к ним, как и к ретровирусным векторам. При генной терапии печени это может
быть проблемой для больных, гепатитом C, поскольку этот вирус вызывает увеличенный
оборот клеток. Хотя вероятность рака, к которой приводит введение онкогена, повышается, в
целом он остается необычайно низок. При введении в мышцу исключается риск заражения
гепатитом C, но данный способ более аллергенен. Лишь одна из нескольких собак с
гемофилией B, после внутримышечного введения ДНК-ААВ вектора собачьего фактора IX,
выработали временные антитела; однако, количество подобных случаев у людей могло быть
значительно большим. У участвовавшей в эксперименте колонии собак была единственная
миссенс-мутация (вызывающая изменение смысла кодона и приводящая к остановке
биосинтеза белка) с неопределяемым антигеном к фактору IX. Тем не менее, присутствие
транскрипта информационной РНК фактора IX позволяет предположить, что следы данного
белка присутствовали. Грубая генная альтерация и беспорядочные мутации чаще связаны с
аллоиммунизацией при гемофилии А и В.
Решения по отбору пациентов
Общепринято, что клинические испытания должны проводиться с согласия взрослого
(совершеннолетнего) больного гемофилией. Можно ли привлекать ВИЧ инфицированных
пациентов – вопрос спорный. Если да, то в этом случае средства против ретровирусов могут
помешать ретровирусным векторам. С другой стороны, имеется ряд людей, больных
гемофилией, проживших с ВИЧ инфекцией длительное время. Большинство из них были
инфицированы более чем 15 лет назад и остаются здоровыми даже без лечения
ингибиторами протеазы. Любое привлечение ВИЧ положительных пациентов подразумевает
их текущую асимптоматичность, низкое содержание вирусов, приемлемое количество
лимфоцитов CD4. Дополнительное повод для беспокойства — возможная герминальная
трансдукция. Хотя это очень маловероятно для большинства векторов, предназначаемых для
клинических целей, кажется благоразумным, первоначально выбрать пациентов, у которых
не будет детей. Последующий мониторинг, с PCR-амплификацией, для нахождения следов
векторной ДНК, в образцах спермы, например, должно помочь определить вероятность
герминальной интеграции.
После определения круга участников эксперимента, следует получить разрешение
одобрение со стороны наблюдательного совета медицинского учреждения и Министерства
здравоохранения, которые должны утвердить протоколы исследований, как это происходит
при клинических испытаниях лекарственных препаратов. В Соединенных Штатах этим
занимается национальный комитет рекомбинантого консультативного совета (RAC),
отвечающий также за исследования в области генной терапии. Строгие правила
безопасности должны на местах гарантировать безопасное изготовление вирусных векторов.
Даже притом, что генная терапия при гемофилии может нести скрытые и, возможно,
непредсказуемые риски, исследования на животных говорят о том, что она может быть
эффективна и безопасна. Результаты генной терапии и ее безопасность в отношении других
пациентов, например, больных раком или редкими врожденными заболеваниями,
поддерживают строгие нормы клинических исследований, чтобы определить способность
генной терапии уменьшить тяжесть нарушения свертываемости крови, и по возможности
полностью устранить дефицит фактора IX или VIII у больных с гемофилией B или A.
Использованная литература
1 Brownlee GG. Prospects for gene therapy of гемофилия A and B. Br Med Bull, 1995;
51: 91-105.
2 Chuah MK, Collen D, VandenDriessche T. Gene therapy for hemophilia: hopes and
hurdles. Crit Rev Oncol Hematol, 1998; 28: 153-71.
3 Connelly S, Kaleko M. Gene therapy for hemophilia A. Throntb Haemost, 1997; 78: 31-6.
4 Eisensmith RC, Woo SL. Viral vector-mediated gene therapy for hemophilia B. Thromb
Haemost, 1997; 78: 24-30.
5 Herzog RW, High KA. Problems and prospects in gene therapy for hemophilia. Curr
Opin Hematol, 1998; 5: 321-6.
6 Kurachi K, Yao SN. Gene therapy of hemophilia B. Thromb Haemost, 1993; 70: 193-7.
7 Miller AD. Putting muscle to work for gene therapy. Nat Med, 1997; 3: 278-9.
8 Thompson AR. Progress towards gene therapy for the hemophilias. Thromb Haemost,
1995; 74: 45-51.
9 Verma IM. Gene therapy. Set Am, 1990; 263(68-72): 81-4.
10 Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA et al. Human factor IX transgenic sheep produced by
transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science, 1997; 278: 2130-3.
11 Kren BT, Bandyopadhyay P, Steer CJ. In vivo site-directed mutagenesis of the factor IX
gene by chimeric РНК/ДНК oligonucleotides. Nature Med, 1998; 4: 285-90.
12 Greengard JS, Bodner M, McCormack J et al. Intravenous ретровирусный vectors
expressing human factor VIII results in longterm expression in rabbits of various age groups. Blood,
1998; 92(Suppl. 1): 296a (Abstract).
13 Kessler CM, Spira J, Magill M. Safety and efficacy of a second generation, B-domain
deleted recombinant factor VIII (r-VIII SQ) in previously treated patients (PTPs). A four year update.
Blood, 1998; 92(SuppI. 1): 555a (Abstract).
14 Lusher JM, Spira J, Magill M. A four-year update of safety and efficacy of a second
generation B-domain deleted factor VIII (R-VIII SQ) in previously untreated hemophilia A
patients. Blood, 1998; 92(Suppl. 1): 555a (Abstract).
15 Kafri T, Blomer U, Peterson DA, Gage FH, Verma IM. Sustained expression of genes
delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors. Nat Genet, 1997; 17: 314-7.
16 Connclly S, Andrews JL, Gallo AM et al. Sustained phenotypic correction of murine
hemophilia A by in vivo gene therapy. Blood, 1998; 91: 3273-81.
17 Alemany R, Dai Y, Lou YC et al. Complementation of helper-dependent adenoviral
vectors: size effects and titer fluctuations. / Virol Methods, 1997; 68: 147-59.
18 Snyder RO, Miao CH, Meuse L et al. Correction of hemophilia B in canine and murine
models using recombinant adeno-associated viral vectors. Nat Med, 1999; 5: 64-70.
19 Herzog RW, Yang EY, Couto LB et al. Long-term correction of canine hemophilia B
by gene transfer of blood coagulation factor IX mediated by adeno-associated viral vector. Nat
Med, 1999; 5: 56-63.
20 Gnatenko D, Hearing P, Jesty J, Bahou W. An adeno-associated/adenovirus hybrid
vector generates high-level human factor VIII in vitro. Blood, 1998; 92(Suppl. 1): 146a.