Молекулярная биология Скоблов Михаил Юрьевич Лекция 7

Молекулярная биология
Лекция 7. Репликация и репарация.
Скоблов Михаил Юрьевич
Часть 1. Репликация ДНК
Эксперимент Мезельсона и Сталя
1958 год
ДНК-полимераза
• В 1956 г. Корнберг выделил из клеток
бактерии Е. coli фермент ДНК-полимеразу
(ДНК-полимераза I).
•
Этот фермент осуществлял синтез ДНК при
наличии в реакционной смеси всех
четырех
дезоксинуклеозидтрифосфатов:
АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и молекулы ДНК
• В 1959 г. получил нобелевскую премию «За
открытие механизмов биологического
синтеза
рибонуклеиновой
и
дезоксирибонуклеиновой кислот».
Артур Корнберг
Репликация ДНК
Репликация ДНК — процесс синтеза
дочерней молекулы
дезоксирибонуклеиновой кислоты на
матрице родительской молекулы ДНК.
«Каждая цепь двуцепочечной ДНК служит
матрицей при синтезе комплементарной
цепи и в результате образуются две пары
цепей, в каждой из которых только одна
является родительской» – Уотсон и Крик.
Основные этапы репликации:
1. Инициация
2. Элонгация
3. Терминация
Основные ферменты репликации
• ДНК-полимераза - фермент катализирующий полимеризацию
дезоксирибонуклеотидов на матрице ДНК по принципу
комплементарности
• ДНК-лигаза
–
фермент
катализирующий
образование
фосфодиэфирных связей между 5'-фосфорильной и 3'гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах
разрыва двуцепочечной ДНК
• ДНК-хеликаза – фермент разделяющий цепи двухцепочечной ДНК
на одинарные.
• ДНК-топоизомераза
фермент
изменяющий
степень
сверхспиральности ДНК, путем внесения одноцепочечных разрывов
в ДНК.
• ДНК-праймаза — это фермент РНК-полимераза, синтезирующий
короткий
фрагмент
РНК,
называемый
праймером,
комплементарный одноцепочечной матрице ДНК.
Ориентация цепей
в ДНК
Репликация ДНК у E.coli
STEP1:
DnaB helicase(blue) separates a dsDNA into two ssDNAs, as cutting the hydrogen bands between base pairs. Topoisomerase(lime green) has a role in
rewinding the twist of double helices which was generated by the dsDNA separation.
STEP2:
The separated ssDNA has a tendency of annealing. For preventing annealing, Single-Stranded DNA Binding Protein: SSB bind to separated ssDNA.
STEP3:
DnaG primase(purple) is activated by binding to DnaB helicase, and synthesizes a short RNA primer approximately 10 nucleotides long using a ssDNA as a
template.
STEP4:
DNA polymerase III elongates a new ssDNA strand by adding a deoxyribonucleotide at a time in the 5'-3' direction to the RNA primer, using a ssDNA as a
template.
Репликация ДНК у E.coli
• Лидирующая цепь
удлиняется ДНКполимеразой в
направлении 3’-конца
• Отстающая цепь
удлиняется по иному
механизму:
Репликация ДНК у E.coli
Репликации у прокариот
Инициация репликации
• Репликация ДНК начинается в специфических местах называемых точками начала
репликации (origin).
• Чем больше размер генома организма, тем большее количество точек репликации
ему необходимо: у E.coli, бактериофага лямбда, вируса SV40 – один origin, в
эукариотических клетках – множественные начала репликации расположеные на
расстоянии 20 т.п.н..
Элонгация
• Скорость репликации у бактерий порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту, у
эукариот - 500—5000.
• Репликация E.coli
занимает около 40 минут,
в то же время клетки
делятся примерно
каждые 20 минут –
репликация ДНК
инициируется при не
законченной
предыдущей.
Репликации у прокариот
Терминация репликации
Топоизомераза II также принимает участие в
рахсождении двух дочерних кольцевых ДНК конкатамеров
Репликация ДНК по принципу катящегося кольца
Одноцепочечная ДНК
Двухцепочечная ДНК
Репликации у эукариот
Ori - AT-богатые, легкоплавкие участки длинной
~200 пн, расположенные, как правило, между
генами в промоторных областях.
Репликация теломер
Теломе́ры (от др.-греч. τέλος — конец и
μέρος — часть) — концевые участки
хромосом
Нобелевская премия по физиологии и медицине 2009
года американских учёных Элизабет Блэкбёрн
(Elizabeth H. Blackburn), Кэрол Грейдер (Carol W.
Greider) и Джек Шостак (Jack W. Szostak) «за открытие
того, как теломеры и фермент теломераза защищают
хромосомы»
Репликация теломер
Теломераза — фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности
ДНК (TTAGGG у позвоночных) к 3'-концу цепи ДНК на участках теломер, которые
располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках.
Клеточный цикл и его регуляция
• Период существования клетки от
одного
деления
до
другого
называется
митотическим
или
клеточным циклом.
• У высших организмов он занимает
от 10 до 30 часов, у человека 24 часа
• У бактерий – менее часа, около 20
минут
Разница в репликации у прокариот и эукариот
Часть 2. Репарация
Источники повреждения ДНК
• У бактерии кишечной палочки E.coli известно более 50 генов, контролирующих
процессы репарации.
• В среднем в процессе репликации генома млекопитающего длинной 3 млрд
нуклеотидов возникает не более 3 ошибок
• Ежедневно в молекулах ДНК каждой клетки человеческого тела около 100000
звеньев повреждаются за счет разнообразных эндогенных процессов и
экзогенных генотоксичных воздействий.
• Менее 1 повреждения ДНК из 1000 превращается в мутацию.
Репарация ДНК
• Репарация генетических повреждений – свойство живых
организмов восстанавливать нарушения и повреждения,
возникшие в ДНК в результате ошибок репликации, а также
при воздействии разнообразных эндогенных и внешних
мутагенных факторов.
• Повреждение ДНК – это не мутация.
• Мутация – это наследственное (фиксированное) изменение
в нуклеотидной последовательности генома организма.
Основные повреждения ДНК
Наследственные заболевания
•
•
•
•
Частота генетических заболеваний варьируется от 1:10 000 до 1:1 000 000
Бывают и уникальные заболевания, 1 на 6 000 000 000
Общая частота генетических заболеваний в популяции составляет около 3%
В арабских странах около 6% (за счет близкородственных браков)
Генетический груз популяции
каждый человек является носителем в среднем трех
аутосомно-рецессивных аллелей
Болезни ассоциированые с дефектами системы
репарации
Репарация ДНК
1. Репарация неспаренных оснований.
2. Восстановление исходной структуры.
3. Эксцизионная репарация
• Вырезание оснований
• Вырезание нуклеотидов.
4. Пострепликативная репарация
• Рекомбинационная репарация
• SOS-репарация – мутагенный или
«ошибочный» путь репарации.
Прямая репарация
• В следствии УФ-излучения возникают пиримидиновые димеры (часто
тиминовые димеры) или 6-4-фотопродукт
• В основном они блокируют транскрипцию, и только небольшая часть
приводит к мутациям.
Тиминовый димер
6-4-фотопродукт
Фотореактивация
• В фотореактивации участвует фермент фотолиаза, мономерный флавинзависимый фермент, и кофакторы : FADH- и 5,10-метенилтетрагидрофолат
(5,10-MTHF)
• Фотолиаза связывается в темноте с димерами ТТ
• На свету кофактор абсорбирует фотон
• Используя эту энергию фотолиаза расщепляет ТТ димер
• Фотолиаза освобождает ДНК
Фотолиазы
• Принадлежат
большому семейству
фотолиазкриптохромов.
• Представители этого
семейства широко
распространены во
всех царствах
• У растений
криптохромы
регулируют рост,
регулируемый синим
светом, а у животных
– циркадные ритмы.
Эксцизионная репарация
Mismatch repair
Base excision repair (BER)
Nucleotide excision repair (NER)
Mismatch
repair (MMR)
Мисматч
репарация:
выявляет
некомплементарн
ую пару только на
дочерней цепи
ДНК и производит
замену
неправильного
основания только
на дочерней цепи.
Mismatch repair (MMR)
Перед репликацией ДНК находится в метилированной
форме, вновь синтезированная цепь неметилирована
Mismatch
repair (MMR)
Основные белки метил-направляемой
MMR в E. Coli:
• Mut S и Mut L узнают ММ
• Mut H • Узнает полуметилированный
• сайт GATC и делает надрез
• MutU (UvrD) –геликаза II
раскручивает дуплекс и
освобождает надрезанную область
Mismatch repair у человека
Mismatch repair у человека
• Система MMR у эукариот организована сложнее
функционирует эффективнее по сравнению с бактериями.
• У эукариот MMR исправляет все некомплементарные пары
оснований и, кроме того, репарирует делеции или инсерции в
рекомбинационных гетеродуплексах размером до 12 н.
• У бактерий MMR неспособна исправлять пары С*С и
репарирует делеции/инсерции не более 3 н. в
рекомбинационных гетеродуплексах.
• Ключевые белки MMR – MutL и MutS высококонсервативны,
их гомологи обнаружены у всех организмов от E.coli до
человека.
• Если у E.coli эти белки (и кодирующие их гены) уникальны, то у
эукариот имеется по несколько их гомологов (паралогов).
Например, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружены 3
гомолога MutL и 6 гомологов MutS, у человека – 11 гомологов
MutL и 4 MutS.
Эксцизионная репарация
Base excision repair - BER
• ДНК
гликозилазы,
распознают
аномальные
основания
ДНК
и
катализируют
гидролитическое
расщепление N-glycosyl связи, между
основанием и сахаром.
• Образуется AP-сайт (apurinic/apyrimidinic)
• АП-сайт распознается АП-эндонуклеазой,
которая вводит в нить ДНК разрыв.
• Фосфодиэстераза отщепляет от ДНК
сахарофосфатную группу, к которой не
присоединено основание.
• Брешь размеров в 1 н. застраивается
ДНК-полимеразой I и концы ДНК
соединяются ДНК-лигазой.
В каждой клетке млекопитающих за одну 20-ти часовую генерацию спонтанно
возникает около 10000 апуриновых сайтов и около 500 – апиримидиновых.
Эксцизионная репарация
Nucleotide excision repair - NER
• Узнавание повреждений
• Связывание
мультисубъединичного
комплекса с поврежденным
сайтом
• Двойное надрезание
поврежденной цепи на
несколько нуклеотидов от
поврежденного сайта в обоих
направлениях 5' и 3'
• Освобождение олигонуклеотида,
содержащего повреждение
между двумя надрезами
• Заполнение образовавшейся
бреши ДНК полимеразой
• Лигирование
Эксцизионная репарация
• У эукариот система эксцизионной репарации
нуклеотидов функционирует по той же схеме,
что и у бактерий, но организована сложнее и
работает эффективнее, по сравнению с
бактериями.
• Эукариотическая эксцинуклеаза включает, по
крайней мере 17 белков, и при эксцизии
вырезаются 29 н.
Пострепликативная репарация
• Этот способ восстановления
целостности ДНК заключается в
репарации
пробелов,
образующихся в дочерних цепях
напротив не удаленных в ходе
репликации димеров.
• Основная часть таких пробелов
репарируется
путем
рекомбинационных
обменов
между двумя сестринскими
цепями.
В
процессе
используются ферменты ДНКполимераза I и лигаза, и белок
RecA.
SOS-репарация
• Ключевая роль в SOS-индукции принадлежит белку RecA. Он
связывается с белком SSB и с однонитевой ДНК и образует ДНКбелковые филламенты, представляющие собой активную форму белка,
обозначаемую как RecA*.
• RecA* является сигналом, запускающим индукцию SOS-регулона (около
30 генов), продукты которых необходимы для выживания клетки при
массовых повреждениях ДНК.
• В SOS-регулон входят гены UmuD, UmuC и DinB, продукты которых
необходимы для «обходной» (translesion) репликации.
• Обходная репликация является неточной, склонной к ошибкам. В
результате повышается частота мутаций.