На правах рукописи ЛИЗУНОВА Екатерина Юрьевна

На правах рукописи
ЛИЗУНОВА
Екатерина Юрьевна
ИЗМЕНЕНИЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
В ПОКОЛЕНИЯХ ОБЛУЧЕННЫХ КЛЕТОК
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
03.00.01- радиобиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики и экологии
Учреждения Российской Академии Наук Института химической физики
им.Н.Н. Семенова РАН
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Осипов Андреян Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Мазурик Виктор Константинович
доктор биологических наук, профессор
Сынзыныс Борис Иванович
Ведущая организация:
ФГУ Российский Научный центр
рентгенорадиологии Росмедтехнологий
Защита состоится «9» апреля 2009 г. в «
» часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете
им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ,
биологический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.
Автореферат разослан «
»_____________2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
Т.В.Веселова
2
Актуальность проблемы. Открытие таких эффектов воздействия ионизирующего излучения как снижение чувствительности к последующему облучению
(адаптивный ответ) или повышение радиочувствительности (гиперчувствительность к облучению) заставило пересмотреть патофизиологические механизмы
формирования отдалённых эффектов радиационного воздействия (Mothersill,
Seymour, 2000; Пелевина и др., 2003). Предполагается, что облучение изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза (Пелевина и др., 2000; Серебряный и др., 2004). Многие исследователи считают, что механизмы изменения клеточной радиочувствительности тесно взаимосвязаны с механизмами индукции и
реализации другого эффекта облучения - радиационно-индуцированной нестабильности генома (Пелевина и др., 2003; Okada et al., 2007; Schwartz et al., 2007: Seoane
et al., 2007). Этот радиобиологический феномен проявляется в том, что часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой на протяжении многих поколений возникают
de поvо аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза (Мазурик и Михайлов 2001,
2004). Как и всякое биологическое явление, нестабильность генома может иметь
как негативное (амплификация генов, мутации, дестабилизация хромосом, неопластическая трансформация и др.), так и позитивное значение для биологической
системы (формирование гипервариабельных участков паратопа антител, появление
альтернативных путей адаптации к меняющимся условиям среды благодаря изменениям в геноме и т.д.). Известно, что физико-химические изменения молекул после действия ионизирующей радиации осуществляются в течение короткого промежутка времени, тогда как индуцируемые ими вышеописанные изменения могут
быть обнаружены спустя длительное время после воздействия (дни, месяцы и, возможно, годы). Исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в
основе отдаленных эффектов облучения, является одной из ключевых и наиболее
актуальных задач радиационной биологии.
В формировании эффектов облучения участвуют различные сигнальные пути,
в которые вовлечены целый ряд белков, в частности, поли (АДФ-рибозо) полимераза, р53, протеинкиназа С (PКС), р38 митоген активирующая протеинкиназа
(р38МАРК), фосфолипаза δ1, кластерин и др. (Matsumoto et al., 2007). Однако, до
сих пор нет единого мнения о том, в ответ на какие клеточные повреждения активируются системы клеточного отклика на облучение. Среди повреждений ДНК,
вызываемых ионизирующим излучением, особое внимание исследователей привлекают двунитевые разрывы (ДР) ДНК. ДР, не устраненные в ходе репарации
3
ДНК, приводят к цитогенетическим нарушениям и гибели клеток. Возможно, что
именно ДР ДНК являются основным триггером, запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения. Однако, исследования роли
ДР ДНК в формировании отдаленных последствий облучения сравнительно немногочисленны. Неясно, за счет каких основных механизмов изменяется чувствительность потомков облученных клеток к тестирующему облучению: предотвращение
образования ДР ДНК или активизация процессов репарации ДНК от них? В течение скольких поколений облученных клеток сохраняется чувствительносить/резистентность к индукции ДР ДНК ионизирующим излучением и как она меняется?
Исходя из вышеизложенного, представлялось весьма актуальным изучить изменения степени поврежденности ДНК за счет ДР и чувствительности клеток к
образованию ДР ДНК при дополнительном, тестирующем облучении в различных
поколениях облученных клеток млекопитающих.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в изучении изменений клеточной радиочувствительности, оцененной по образованию ДР ДНК, индуцированных тестирующим (проявляющим) облучением, в поколениях остро и хронически облученных клеток млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- Исследовать изменения выхода и эффективности репарации ДНК от ДР, индуцированных тестирующим облучением в проявляющей дозе в адаптированных
облучением в малой дозе и контрольных делящихся лимфоцитах в различное время
после стимуляции клеток к делению.
- Оценить изменения степени поврежденности генома и радиочувствительности, оцененной по выходу ДР ДНК при тестирующем облучении, в 30-40 поколениях остро облученных клеток яичника китайского хомячка линии СНО.
- Изучить изменения выхода двунитевых разрывов ДНК, индуцированных облучением в проявляющей дозе, в клетках селезенки и крови мышей, подвергавшихся хроническому облучению, в зависимости от времени облучения и дозы.
Научная новизна. Впервые с помощью метода ДНК-комет были проведены
исследования изменений чувствительности адаптированных облучением в малой
дозе лимфоцитов периферической крови человека к индукции ДР ДНК облучением
в тестирующей дозе, а также эффективности их репарации в течение 72 ч (время ~
трех митозов) после индукции адаптивного ответа. Впервые исследованы изменения степени поврежденности генома и чувствительности к дополнительному облучению в 37-42-х поколениях, облученных в дозе 1 Гр, клеток яичника китайского
хомячка линии СНО. Получены новые результаты, свидетельствующие в пользу
4
гипотезы о том, что нестабильность генома может создавать условия для активизации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных
клеточных клонов. Впервые изучено влияние хронического радиационного воздействия на фрагментацию ДНК клеток крови и селезенки мышей, подвергавшихся в
течение 40, 80 и 120 суток облучению с мощностью дозы 0.36 сГр/сутки. Впервые
показано, что при хроническом воздействии γ-излучения на клетки млекопитающих, в зависимости от времени облучения и от накопленной дозы, реализуются
различные системы защиты клеток от облучения, не связанные и связанные с изменением степени фрагментации ДНК в клеточной популяции.
Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы в радиационной биологии при изучении механизмов возникновения и
поддержания нестабильности генома, изменения радиочувствительности клеточных популяций в пострадиационном периоде, эффектов формирования отдаленных
последствий облучения на клеточном уровне. Результаты исследований хронически облученных мышей будут весьма полезны при проведении радиоэкологического мониторинга окружающей среды, а в космической биологии и в медицине
для оценки эффектов хронического облучения в малых дозах.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008) и 36-м ежегодном съезде Европейского общества по радиационным исследованиям (Tours, France, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том
числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
описания материалов и методов исследований, использованных в работе, 3-х глав
результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста и содержит ___
таблиц и __ рисунков. Список литературы включает ____ источников, из них ____
на иностранном языке.
5
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Лимфоциты крови человека: выделение, условия культивирования и облучения. Выделение лимфоцитов из гепаринизированной крови человека проводили
путем центрифугирования в градиенте плотности фикол-верографин («Histopaque»,
Sigma). После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в среде для
культивирования клеток RPMI-1640 (фирма «Панэко», Россия) до конечной концентрации 1-2 x 106 клеток/мл.
Стимулированные к пролиферации фитогемоагглютинином (ФГА, 7 мкг/мл)
лимфоциты культивировали в течение 24 – 96 ч в термостате при 37 °С в полной
культуральной среде RPMI 1640 содержащей 20 % сыворотки крупного рогатого
скота и антибиотики (все реактивы фирмы «Панэко», Россия).
Облучение клеток проводили на установке «Алтай» (Россия, источник
γ-излучения 60Co) при мощности дозы 1 Гр/мин и температуре 4 ˚C. Для определения непосредственной поврежденности ДНК в результате образования ДР, индуцированных проявляющим облучением в дозе 10 Гр, облучали агарозные слайды с
иммобилизированными в них клетками. Этот методический подход позволяет сократить время между окончанием облучения и лизисом клеток до 30-60 сек.
Культура клеток: условия культивирования и облучения. В работе использовали культуру эпителиальных клеток яичников китайского хомячка (линия
CHO). Время удвоения клеточной популяции - 16-18 ч.
Для культивирования клеток применяли стандартную полную среду DMEM,
содержащую 10 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1 % Lглютамина и антибиотики (пенициллин со стрептомицином). Выращивание клеток
проводили в стандартном CO2-инкубаторе при 37 °C в атмосфере с 5 % содержанием CO2. Пересев клеток проводили каждые 2-3 суток в фазе экспоненциального
роста.
Клетки подвергали воздействию γ-излучения 60Co в дозах 1 Гр и 10 Гр (в зависимости от условий эксперимента) при мощности поглощенной дозы 1 Гр/мин (облучательная установка«Алтай», Россия).
Экспериментальные животные: облучение, отбор биоматериала. Эксперименты проводили на мышах-самцах линии СВА/lac исходной массой 14–16 г,
полученных из питомника «Столбовая» РАМН (Московская обл.) В течение эксперимента мышей содержали на стандартном рационе вивария (сухой гранулированный корм и вода ad libitum). Состав рациона не менялся. Распределение животных
на группы проводили путем случайной выборки.
Мыши подвергались воздействию γ-излучения 137Сs круглосуточно в течение
6
40, 80 и 120 суток при мощности поглощенной дозы 0,36 сГр/сут. Суммарная поглощенная доза, полученная животными, составила 14,4, 28,8 и 43,2 сГр соответственно.
Животных умерщвляли путем цервикальной дислокации. Периферическую
кровь отбирали в пробирки с гепарином (20 МЕ на 1 мл крови). Селезенку гомогенизировали в охлажденном до 4 ºС фосфатно-солевым буфере (137 ммоль/л NaCl,
2.7 ммоль/л KCl, 10 ммоль/л Na2HPO4, 2 ммоль/л K2HPO4, рН 7.4) (1 мл буфера на
10 мг ткани лимфоидного органа). Суспензию клеток фильтровали через нейлоновую сетку. Концентрацию клеток определяли в камере Горяева с помощью микроскопа типа SK-14 фирмы "PZO" (Польша). Суспензию лимфоцитов (20 мкл) смешивали со 100 мкл 0.5 % раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатносолевом буфере (рН 7,4) при температуре 37 ˚С и наносили на предварительно покрытые слоем 1 % нормоплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и выдерживали 5 мин при 4 ˚С на предварительно охлажденной металлической пластине. После солидификации агарозы удаляли покровные стекла и
полученные сайды помещали в охлажденный (4 ˚С) боратный буфер.
Облучение иммобилизированных в агарозу клеток проводили в боратном буфере при 4 ˚С на γ-установке 60Co «Луч» («Изотоп», Россия) в дозе 4 Гр при мощности дозы 0.35 сГр/мин. Контрольные препараты выдерживали в течение времени
облучения в боратном буфере при 4˚С.
Оценка фрагментированности ДНК, обусловленной образованием ДР.
Фрагментированность ДНК под влиянием ДР в клетках непосредственно (через 3060 с, 4 ˚C) и через 1 ч после облучения (1-часовая инкубация клеток при 37 ºС в
полной культуральной среде RPMI 1640) определяли модифицированным методом
электрофореза ДНК единичных клеток (метод ДНК-комет) при нейтральном значении рН (основные условия электрофореза: 1 В/см, 4 ˚С, 20 мин) (Воробьева и др.
2007). Степень фрагментированности ДНК, определяемая этим методом, оценивается после проведения электрофореза ДНК единичных клеток, иммобилизованных
в агарозу, по количеству двунитевой ДНК, мигрировавшей из ядерной области, и
расстоянию ее миграции из «ядра» ДНК-кометы» в «хвост».
Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый («Sigma», США)
(2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью микроскопа «Люмам P-8» («ЛОМО», Россия) с использованием
системы визуализации микрофотоизображений «Микмед-1600-3ф» («ОМО», Россия). ДНК-кометы клеток в каждой пробе подвергали анализу, используя программу СometScore v. 1.5 (TriTek Corp. http://tritekcorp.com). Программа оценивает момент хвоста ДНК-комет в усл. ед. (момент хвоста по Оливе) равный произведению
7
расстояния от центра «ядра» до центра плотности ДНК «хвоста» ДНК-кометы в
пикселях на % ДНК в «хвосте». Вычисляли среднее арифметическое момента хвоста 100 ДНК-комет для пробы и варианты значений показателя по каждой пробе
включали в сводную выборку по всем пробам для последующей статистической
обработки.
Статистический анализ полученных данных. Статистическую обработку
результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0. Результаты исследований представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка. Для оценки
различий использовали t-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Индукция двунитевых разрывов ДНК и репарация ДНК от них в
делящихся лимфоцитах крови человека, облученных в адаптирующей дозе
В настоящей главе представлены результаты исследований изменений чувствительности делящихся лимфоцитов крови человека, облученных в адаптирующей
дозе, к образованию ДР ДНК тестирующим облучением в различное время после
индукции адаптивного ответа. Было поставлено две основных задачи: а) изучить,
приводит ли облучение делящихся лимфоцитов в адаптирующей дозе к активизации механизмов, снижающих количество индуцированных радиацией ДР ДНК или
механизмов репарации ДНК от них; б) оценить, в течение какого времени после его
индукции сохраняется АО. Для оценки изменений относительного количества ДР
ДНК использовали метод ДНК-комет. Считается, что именно ДР ДНК отвечают за
фрагментацию ДНК, определяемую методом ДНК-комет при проведении электрофореза при нейтральном рН (Calini et al., 2002). В наших предварительных исследованиях было показано, что значения момента хвоста ДНК-комет статистически
достоверно (r>0.9, р<0.01) коррелируют с количеством фосфолирированного гистона Н2AX (γ-Н2AX), то есть с количеством распознанных ДР ДНК.
Полагают, что АО не является универсальным клеточным ответом на облучение в малых дозах, так как его проявление зависит от индивидуальных генетических особенностей организма, возраста и может быть модифицировано воздействиями, связанными с образом жизни, профессией, окружающей средой (Пелевина и
др., 2007). Поэтому, для того, чтобы избежать неопределенности, связанной с индивидуальной вариабельностью проявления АО, в наших исследованиях использовалась кровь только от тех здоровых доноров, для лимфоцитов которых было ранее, с помощью стандартных цитогенетических тестов, показано наличие досто8
верного АО. Крайне важно было также выбрать оптимальную адаптирующую дозу
и стадию клеточного цикла, на которой будет проведено облучение в этой дозе.
Анализ данных литературы и результатов собственных исследований показал, что
хотя диапазон адаптирующих доз довольно широк (от 1 до 50 сГр), наиболее часто
для индукции АО в лимфоцитах используют дозы 2-5 сГр (Пелевина и др., 2007;
Stoilov et al., 2007). С другой стороны, наиболее выраженный АО наблюдается, как
правило, при облучении лимфоцитов через 20-24 ч после их стимуляции к делению, то есть в стадии G1 клеточного цикла (Пелевина и др., 2007; Stoilov et al.,
2007). Основываясь на этих данных, для индукции АО мы выбрали адаптирующую
дозу 5 сГр с облучением клеток через 24 ч после их стимуляции к делению ФГА.
Результаты наших исследований, представленные на рис. 1, свидетельствуют
о том, что облучение культивируемых лимфоцитов в дозе 5 сГр через 24 ч после
добавления ФГА приводит к статистически достоверному (р<0.05) снижению выхода ДР ДНК, индуцированных тестирующим облучением в дозе 10 Гр, через 24,
48 и 72 ч после адаптирующего облучения (48, 72 и 96 ч после стимуляции клеток к
делению ФГА соответственно). Через 24 ч после адаптирующего облучения в облученных в малой дозе клетках относительное количество индуцированных тестирующим облучением ДР ДНК было меньше на ~ 24 % по сравнению с контролем.
Через 48 ч после адаптирующего облучения этот показатель увеличивается до ~ 35
%, а через 72 ч опять снижается до ~ 29 %.
Проведенный в параллельных экспериментах анализ распределения делящихся лимфоцитов в 1-ом – 4-ом митозах через разное время после стимуляции ФГА
показал, что пики 1-х митозов наблюдаются через 48 ч, 2-х – через 72 ч, 3-х – через
96 ч (Пелевина и др., 2008). По времени вступления в цикл и скорости движения по
циклу популяция лимфоцитов неоднородна, что уже отмечалось и другими авторами (Wojcik et al., 1996).
Таким образом, полученные нами данные свидетельствует о том, что АО, связанный с уменьшением чувствительности ДНК клеток к образованию ДР, при последующем тестирующем облучении сохраняется в дочерних клетках, возникающих, по крайней мере, в течение 72 ч после его индукции (время ~ трех митозов). В
пользу этого свидетельствует тот факт, что выраженность АО в наших экспериментах не уменьшается с увеличением времени после его инициации вплоть до 72 ч
после облучения в адаптирующей дозе (96 ч после добавления ФГА).
9
Рис. 1. Показатель поврежденности ДНК, обусловленной ДР ее молекул (момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.) в лимфоцитах крови человека (контрольных и
подвергнутых адаптирующему воздействию γ-излучения в дозе 5 сГр через 24 ч
после стимуляции к делению) непосредственно после тестирующего облучения в
дозе 10 Гр, проводимого в различное время от момента стимуляции клеток к делению ФГА. * – различие эффекта тестирующего облучения в дозе 10 Гр в клетках,
подвергавшихся адаптирующему облучению, от наблюдавшегося в контрольных
клетках достоверно, p < 0.05.
Для изучения эффективности репарации ДНК от ДР в поколениях адаптированных и контрольных клеток, лимфоциты после тестирующего облучения в дозе
10 Гр инкубировали в течение одного часа. Согласно данным литературы, полученным с помощью метода ДНК-комет, за это время в лимфоцитах происходит репарация ДНК от ДР путем негомологичного воссоединения концов ее нитей в местах ДР (Wojewodzka et al., 2004). Полученные нами результаты свидетельствуют о
том, что развитие АО в делящихся лимфоцитах в течение 24-72 ч после облучения
в адаптирующей дозе (48-96 ч после добавления ФГА) не сопровождается статистически достоверным увеличением эффективности репарации ДНК от ДР путем
негомологичного воссоединения концов ее нитей по местам ДР. Возможно, что
инициация АО приводит в основном к активизации более медленной, но корректной репарации ДР ДНК путем гомологичной рекомбинации. Однако, проверить эту
гипотезу в этих опытах на лимфоцитах крови пока не представляется возможным,
так как через 4-6 ч после облучения в дозах, индуцирующих достаточное для анализа количество ДР ДНК, начинается апоптотическая межнуклеосомная деграда10
ция ДНК, то есть процесс глубокой фрагментации ДНК, мешающий анализу репарации ДНК от ДР.
Исследований изменений чувствительности по показателям индукции ДР
ДНК и эффективности репарации ДНК от них к последующему облучению лимфоцитов крови, подвергнутых радиационному воздействию в адаптирующей дозе и
стимулированных к делению ФГА, до настоящего времени никем не проводились.
Cramers et al. (2005), исследовавшие АО с помощью метода ДНК-комет, иммунофлуоресцентного анализа гистона γ-H2AX (специфичный маркер ДР ДНК) и метода
принудительной конденсации хромосом в неделящихся лимфоцитах (cтадия G0),
применяя облучение по схеме 5 (10) сГр + 2-8 Гр через 4 ч, показали, что в лимфоцитах, подвергнутых адаптирующему облучению, выход разрывов ДНК, индуцированных тестирующим облучением, достоверно ниже, чем в контроле. Причем
эффективность репарации ДНК от разрывов достоверно не менялась. По всей видимости, основную роль в формировании АО по этому показателю в лимфоцитах
играют процессы, предотвращающие образование радиоиндуцированных ДР ДНК
(активизация систем антиоксидантной защиты, изменения конформации хроматина
и т.д.), но не систем негомологичного воссоединения концов нитей ДНК по местам
ДР.
Резюмируя вышеизложенное, мы можем сделать следующее заключение. Облучение в малой дозе делящихся лимфоцитов в стадии G1 индуцирует АО, проявляющийся в снижении чувствительности клеток к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении. Индуцированный АО сохраняется, по крайней мере, в течение
72 ч (время ~ трех митозов). В формировании АО главную роль играет активизация
клеточных систем, предотвращающих образование ДР в ДНК, но не активизация ее
репарации от указанных разрывов путем негомологичного воссоединения концов
нитей ДНК по местам разрывов.
2. Изменения поврежденности генома и чувствительности к образованию
ДР ДНК при тестирующем облучении в поколениях облученных клеток
линии СНО
В главе представлены результаты исследования изменений поврежденности
генома и чувствительности к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении в
поколениях культуры клеток яичника китайского хомяка линии СНО, облученных
в дозе 1 Гр. Задача этих исследований состояла в том, чтобы выяснить закономерности изменений вышеупомянутых показателей в отдаленных потомках облученных клеток. Для оценки степени поврежденности генома, обусловленной ДР ДНК,
11
использовали метод ДНК-комет при нейтральном рН.
Усредненные результаты исследования степени фрагментации ДНК клеток
линии СНО в различное время после облучения в условиях нейтрального рН, позволяющих оценивать наблюдаемые изменения как результат возникновения ДР
ДНК, представлены на рис.2. Как и ожидалось, непосредственно после облучения
клеток в дозе 1 Гр отмечается увеличение фрагментированности ДНК, вызванной
ДР ДНК, в 1.5-2.0 раза. Известно, что клетки линии СНО характеризуются периодом удвоения клеточной популяции 16-18 ч, поэтому уже через 2-е суток после облучения мы исследуем потомков облученных ранее клеток (ориентировочно второго поколения) и т.д. Результаты наших экспериментов показали, что через 4 суток
(5-6 поколение) после облучения степень фрагментации ДНК потомков облученных клеток не отличалась от соответствующих контрольных значений (рис. 2).
Рис. 2. Изменения степени фрагментации ДНК, обусловленной образованием
в ней ДР, наблюдавшиеся в клетках линии СНО в различное время после облучения в дозе 1 Гр. * - отличие от контроля достоверно, p <0.05; ** - отличие от контроля достоверно, p <0.01.
Однако, начиная с 7-х суток после облучения (9–10 поколение), регистрировалось статистически достоверное увеличение степени фрагментации ДНК de novo,
что, по всей видимости, является проявлением радиационно-индуцированной нестабильности генома. Понятие «радиационно-индуцированная нестабильность генома» определяется как увеличение в потомстве облученных клеток частоты обра12
зующихся de novo генетических нарушений (мутации, хромосомные аберрации,
дестабилизация хромосом, онкотрансформация и апоптоз) спонтанно, в отсутствие
дополнительных радиационных воздействий (Seoane et al., 2007; Morgan et al.,
2007). Основной особенностью генетической нестабильности такого рода является
ее проявление на протяжении многих клеточных поколений после воздействия ионизирующего излучения без образования клеточных клонов с указанными выше
нарушениями в геноме. В наших экспериментах повышение степени фрагментации
ДНК регистрировалось вплоть до 21-х суток после облучения, с максимумом на 11
и 18-е сутки (рис. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что на 23-и и 28-е сутки
после облучения степень фрагментации ДНК потомков облученных клеток снижалась и не отличалась от контроля (рис. 2).
По всей видимости, увеличение степени фрагментации ДНК, регистрируемое
с помощью метода ДНК-комет, в этих опытах обусловлено преимущественно вкладом апоптотических клеток с высоко фрагментированной ДНК. Однако, не стоит
забывать и о том факте, что в потомках облученных клеток при нестабильности генома наблюдается повышенный уровень активных форм кислорода (Кim et al.,
2006), которые также вызывают различные повреждения ДНК, в том числе и двунитевые разрывы.
Наиболее интересные результаты были получены при исследовании изменений радиоповреждаемости ДНК потомков облученных клеток (рис. 3). Было показано, что на 7, 11, и 18-е сутки после облучения отмечается статистически достоверное увеличение чувствительности ДНК клеток к дополнительному (тестирующему) облучению в дозе 10 Гр, что, по всей видимости, обусловлено тем, что облучение накладывалось на эндогенную гиперпродукцию свободных радикалов и,
возможно, на ситуацию истощения системы антиоксидантной защиты клеток от
повреждений. Но на 23-е и 28-е сутки экспериментов наблюдался обратный эффект: устойчивость к дополнительному облучению возрастала.
В целом же, описанные здесь результаты исследования показали, что облучение клеток линии СНО в дозе 1 Гр проявляется в потомстве следующими эффектами: на 7-21-е сутки (9-31-е поколения) – увеличением поврежденности генома и
чувствительности клеток к дополнительному облучению; на 23-28-е сутки (30-42
поколения) – возвращением поврежденности генома к контрольным значениям;
причем, в этих поколениях потомки облученных клеток становятся более устойчивыми к дополнительному облучению.
На основании анализа результатов исследования степени фрагментации ДНК,
наблюдавшейся в клетках линии СНО в различное время после облучения в дозе
1 Гр и обусловленной образованием в ней ДР, можно высказать два предположения
13
о причинах снижения ее выраженности в 30-34-м и 37-42-м пострадиационных поколениях клеток. Это может быть переход нестабильности генома в скрытое (латентное) состояние, либо это – завершение селекционного процесса элиминации
клеток с нестабильным геномом, чувствительных к оксидативному стрессу.
Результаты изучения изменений чувствительности потомства облученных
клеток к тестирующему облучения по тому же критерию указывают на вероятную
реальность второго предположения.
Рис. 3. Изменения повреждаемости ДНК клеток линии СНО при повторном
(тестирующем) облучении в дозе 10 Гр в различное время после облучения в дозе
1 Гр. Данные представлены как разница значений (инкремент) момента хвоста
ДНК-комет после дополнительного облучения в дозе 10 Гр и значений момента
хвоста ДНК-комет без дополнительного облучения. * - различия по отношению к
контролю достоверны, p <0.05.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о
том, что нестабильность генома может создавать условия для функционирования
селективного механизма, обеспечивающего формирование радиорезистентных клеточных клонов путем элиминации клеток с нестабильным геномом, чувствительных к оксидативному стрессу.
14
3. Изменения радиочувствительности ДНК лейкоцитов крови и
клеток селезенки мышей в течение хронического облучения
Задача этого раздела наших исследований состояла в том, чтобы выяснить закономерности изменени чувствительности ДНК к образованию ДР, индуцированных тестирующим облучением, в клеточных популяциях, подвергаемых длительному (в течение нескольких месяцев) постоянному низкоинтенсивному воздействию ионизирующего излучения in vivo. Для ее решения были поставлены опыты на
мышах линии СВА/lac. Изменения поврежденности ДНК и ее чувствительности к
индукции ДР тестирующим облучением в клетках системы крови хронически облучаемых и контрольных животных оценивали с помощью метода ДНК-комет при
нейтральном рН.
Результаты исследования изменений поврежденности ДНК, обусловленной
образованием ДР ДНК (фрагментации ДНК) в клетках системы крови мышей, подвергающихся хроническому облучению, показали, что на 40-е сутки от его начала
(доза 14,4 сГр) происходит некоторое ее увеличение в лейкоцитах крови (рис. 4) и
в клетках селезенки (рис. 5) по сравнению с контролем. Однако, уже к 80-м суткам
облучения (28,8 сГр) отмечается статистически достоверное (p<0.01) уменьшение
поврежденности ДНК, обусловленной образованием ДР, как в лейкоцитах, так и в
клетках селезенки (рис. 4 и рис. 5, соответственно). К 120-м суткам облучения (43,2
сГр) выраженность поврежденности ДНК исследуемого рода в названных выше
клетках мышей остается практически такой же, что и на 80-е сутки.
Исследования изменений уровня поврежденности ДНК, обусловленной образованием ДР у мышей при хроническом облучении, ранее никем не проводились.
Однако, в опытах на мышах линии С57Bl/6, подвергавшихся воздействию низкоинтенсивного γ-излучения, показано, что у животных отмечается достоверное уменьшение количества однонитевых разрывов ДНК в клетках селезенки, регистрируемое методом контролируемой щелочной денатурации ДНК (Осипов и др., 2000).
Одновременно в тех же клетках у тех же животных отмечалось увеличение количества ДНК-белковых сшивок. Предполагалось, что увеличение количества прочных
связей ДНК-белок препятствует щелочной денатурации ДНК и тем самым уменьшает регистрируемое количество однонитевых разрывов ДНК (Осипов и др., 2000).
Однако, природа увеличения количества прочных связей ДНК-белок при воздействии ионизирующих излучений в малых дозах до сих пор не ясна. Не исключено,
что увеличение количества прочных связей ДНК-белок одновременно с уменьшением количества разрывов ДНК является отражением компактизации хроматина
15
исследуемых клеток. Известно, что степень компактизации хроматина является одним из основных факторов, определяющих клеточную радиочувствительность
(Roos et al., 2002). Белки хроматина лимитируют доступ свободных радикалов к
ДНК, уменьшая тем самым количество индуцируемых свободными радикалами повреждений ДНК. В работе Алипова и др. (2004) было показано, что радиорезистентные потомки облученных фибробластов джунгарского хомячка линии DH-TK
характеризуются более компактной структурой хроматина по сравнению с материнскими клетками.
Рис. 4. Изменения степени фрагментации ДНК лейкоцитов крови мышей в разные
сроки от начала хронического облучения с мощностью дозы 0,36 сГр/сут.
** - различия по отношению к контролю достоверны, p <0.01.
16
Рис.5. Изменения степени фрагментации ДНК клеток селезенки мышей в разные
сроки от начала хронического облучения с мощностью дозы 0,36 сГр/сут. Различия
по отношению к контролю достоверны: * - p <0.05, ** – p <0.01.
В качестве альтернативной гипотезы можно предположить, что хроническое
облучение приводит к изменению качественного соотношения клеток в исследуемых клеточных системах в сторону увеличения доли клеток с меньшим количеством ДР ДНК. Возможно, что именно изменения структуры клеточной популяции
являются основой изменения радиочувствительности тканей и органов.
Результаты исследования изменений выхода индуцированных острым облучением в дозе 4 Гр in vitro ДР ДНК (инкремент момента хвоста, усл. ед.) в лейкоцитах крови (рис. 6) и клетках селезенки (рис. 7) контрольных мышей и мышей, подвергавшихся хроническому облучению, показали, что у хронически облученных
мышей наблюдается статистически достоверное снижение радиоповреждаемости
ДНК клеток системы крови. Поскольку мы исследовали этот процесс по показателю, отражающему количество ДР ДНК в условиях ингибирования систем их репарации (боратный буфер и 4 oC), то снижение значений этого показателя при облучении in vitro, по всей видимости, обусловлено механизмами, предотвращающими
образование ДР ДНК. Причем, если на 40-е сутки (доза облучения 14,4 сГр) клеточная защита не обеспечивает снижение количества ДР ДНК в клетках системы
крови хронически облучаемых мышей, то начиная с 80-х суток (28,8 сГр) увеличению клеточной резистентности к острому облучению сопутствует снижение уровня
ДР ДНК в этих клетках.
17
Рис. 6. Изменения инкремента хвоста ДНК-комет (усл. ед.), отражающего выход
индуцированных острым облучением в дозе 4 Гр in vitro двунитевых разрывов
ДНК в лейкоцитах крови контрольных мышей и мышей, подвергавшихся хроническому облучению в дозе 0,36 сГр/сут. * – отличие от контроля достоверно, p <0.05.
Рис. 7. Изменения инкремента хвоста ДНК-комет (усл. ед.), отражающего выход
индуцированных острым облучением в дозе 4 Гр in vitro двунитевых разрывов
ДНК в клетках селезенки контрольных мышей и мышей, подвергавшихся хроническому облучению в дозе 0,36 сГр/сут. * – отличие от контроля достоверно,
p <0.05.
18
Таким образом, результаты изучения радиочувствительности ДНК клеток системы крови мышей свидетельствуют о том, что при хроническом низкоинтенсивном воздействии γ-излучения в зависимости от длительности облучения и от накопленной дозы реализуются разные механизмы благоприобретенной радиорезистентности (адаптивного ответа). Можно предположить, что в начальный период
хронического облучения, когда дозы относительно невелики, в клетках активируется первой система детоксикации свободных радикалов (система антиоксидантной
защиты). С накоплением дозы и усилением воздействия включаются новые защитные механизмы. При помощи механизмов апоптоза обеспечивается элиминация
неспособных к восстановлению от повреждений радиочувствительных клеток, в
результате чего, оставшаяся часть клеток становится относительно резистентной к
воздействию излучения в повреждающей острой дозе.
ВЫВОДЫ
1. Облучение культивируемых лимфоцитов в дозе 5 сГр через 24 ч после стимуляции их к делению ФГА приводит к статистически достоверному понижению
поврежденности ДНК, регистрируемой методом ДНК-комет и отражающей образование ДР в ее структуре при последующем облучении в дозе 10 Гр через 24, 48 и
72 ч после облучения в указанной выше малой дозе.
2. Адаптивный ответ, выраженный в уменьшении чувствительности клеток к
образованию ДР ДНК тестирующим облучением, сохраняется, по крайней мере, в
течение 72 ч (время ~ трех митозов) после его индукции.
3. Основную роль в формировании адаптивного ответа в лимфоцитах крови по
показателю поврежденности двунитевой структуры ДНК играют процессы, предотвращающие образование радиационно-индуцированных ДР ДНК (активизация
систем антиоксидантной защиты, изменение конформации хроматина), но не активизация процессов их быстрой (в течение 1 ч) репарации.
4. Облучение клеток линии СНО в дозе 1 Гр индуцирует у потомков облученных клеток нестабильность генома, проявляющуюся в увеличении на 7-21-е сутки
поврежденности генома и чувствительности ДНК к дополнительному облучению.
5. Увеличение радиорезистентности потомков клеток СНО на 23-28-е сутки
после облучения в дозе 1 Гр свидетельствует о том, что нестабильность генома
создает условия для активации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных клеточных популяций.
6. Хроническое облучение мышей (мощность дозы 0,36 сГр/сут) ведет к сни19
жению степени фрагментации ДНК (лейкоцитов крови и клеток селезенки) на 80-е
и 120-е сутки от начала облучения.
7. Благоприобретенная клеточная резистентность (адаптивный ответ) клеток
системы крови хронически облучаемых мышей к тестирующему облучению по показателю поврежденности ДНК, обусловленной ДР, в ранние (40-е сутки, доза
14,4 сГр) и более поздние (80-е и 120-е сутки, дозы 28,8 и 43,2 сГр соответственно)
сроки облучения реализуется с помощью разных механизмов, не связанных и связанных со снижением степени фрагментации ДНК в клеточных популяциях.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Е.Ю. Лизунова, Н.Ю. Воробьева, А.Н. Осипов Влияние хронического
воздействия γ-излучения и 90Sr в малых дозах на уровень разрывов ДНК и
чувствительность клеток селезенки мышей к перекиси водорода. // Известия
РАН. Серия биологическая. -2008. -Т.35. - № 4. С. 409-413.
2. А.Н. Осипов, Е.Ю. Лизунова, Н.Ю. Воробьева, И.И. Пелевина Индукция и
репарация двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах крови человека,
облученных в адаптирующей дозе. // Радиац. биология. Радиоэкология. 2009.
Т. 49. № 1. С. 42-45.
3. Пелевина И.И., Алещенко А.В., Антощина М.М., Боева О.В., Готлиб В.Я.,
Кудряшова О.В., Лизунова Е.Ю., Осипов А.Н., Рябченко Н.И., Семенова Л.П.,
Серебряный А.М. Адаптивный ответ в разных митотических циклах после
облучения. // Цитология. 2009. Т. 51. № 1. С. 78-83.
4. Воробьева Н.Ю., Лизунова Е.Ю., Осипов А.Н., Сыпин В.Д. Изменения
радиоповреждаемости ДНК лейкоцитов периферической крови мышей,
подвергавшихся
длительному воздействию низкоинтенсивного гаммаизлучения. // V съезд по радиационным исследованиям (10-14 апреля 2006,
Москва): Тез. докл. – Изд. «Фотон-век», Пущино. - 2006. - Т. I. - С. 22.
5. Д.В. Гурьев, А.Н. Осипов, Е.Ю. Лизунова, Н.Ю. Воробьева, О.В. Боева
Отдаленные молекулярно-клеточные эффекты в поколениях облученных клеток
линии СНО. // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008 №3
(23). Приложение 1. С. 124.
6. N. Vorobyeva, E. Lizunova, D. Guryev and A. Osipov Molecular and Cellular Late
Radiation Effects in Generations of CHO Line Cells // Radioprotection. -2008. – V.
43 (5). – P. 114.
20