ИНТРОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ rs324011 ГЕНА БЕЛКА STAT6 У

Казанский медицинский журнал, 2010 г., том 91, № 1
УДК 616.248—07:575.113
ИНТРОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ rs324011 ГЕНА БЕЛКА STAT6
У ПАЦИЕНТОВ С РАЗЛИЧНОЙ ТЯЖЕСТЬЮ ТЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ
АСТМЫ
Валерий Николаевич Минеев, Лада Николаевна Сорокина, Михаил Александрович Нёма,
Михаил Владимирович Дубина, Елена Дмитриевна Янчина
Кафедра госпитальной терапии (зав. — проф. В.И. Трофимов), отдел молекулярно-генетических
технологий НИЦ (зав. — чл.-корр. РАН М.В. Дубина) Санкт-Петербургского государственного
медицинского университета, e-mail: minvn@spmu.rssi.ru
Реферат
Выявлена
связь
полиморфного
варианта
rs324011 гена белка STAT6 с тяжестью течения бронхиальной астмы, причем наличие в генотипе данного
полиморфизма обладает, по-видимому, протективным
эффектом в отношении тяжести заболевания.
Ключевые слова: полиморфизм rs324011, STAT6,
бронхиальная астма.
Бронхиальная астма (БА) относится
к полигенным заболеваниям. К настоящему времени опубликованы результаты
исследований ассоциаций БА и других
атопических заболеваний примерно с
80 генами-кандидатами [5]. Полагают,
что исследование гена белка STAT6 представляет собой одно из перспективных
направлений в изучении генов-кандидатов при БА [10]. Речь идет о белке STAT6
системы JAK-STAT (Janus Kinases — Signal
Transducer and Activator of Transcription) —
сигнальной системы, реализующей цитокиновую сигнализацию при БА и других
аллергических заболеваниях. К настоящему времени имеются данные литературы
[1—3], которые позволяют предполагать,
что белок STAT6 играет ключевую роль в
развитии аллергической БА и может представлять большой интерес как мишень
для воздействия на патогенез аллергических реакций [7]. Однако к настоящему
времени остается много невыясненного в
особенностях функционирования STAT6
при БА, в том числе возможная роль полиморфизма гена этого белка в развитии
полигенного заболевания. Белок STAT6
активирует транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку клетки в
сторону лимфоцитов Тh2 типа. Для гена,
кодирующего этот белок, был найден ряд
полиморфных вариантов (SNP), которые,
возможно, влияют на активность элементов данной сигнальной системы [9]. Од12
нако при более детальном анализе лишь
немногие полиморфизмы показали связь
с фенотипами БА [14]. В частности, в немецкой популяции для варианта rs324011
гена STAT6 была обнаружена значимая
связь с уровнями сывороточного IgE [14].
Данный полиморфизм заключается в замене цитозина на тимин (С6613Т) во 2-м
интроне, и таким образом эта замена не
сказывается на кодировании аминокислоты и не должна отражаться на первичной структуре белка.
Подчеркнем, что исследований, касающихся полиморфизма гена белка STAT6
при БА в мировой литературе крайне
мало [4].
Целью нашей работы было оценка связи полиморфного варианта rs324011 гена
белка STAT6 с фенотипами БА, характеризующими тяжесть заболевания в славянской популяции Санкт-Петербурга.
Были обследованы 67 больных БА славянской популяции Санкт-Петербурга, не
связанных узами родства и находившихся в клинике в связи с обострением БА
(смешанный клинико-патогенетический
вариант с преобладанием аллергического) различной тяжести течения. Для
идентификации полиморфного варианта
rs324011 гена была использована полимеразная цепная реакция с ДНК, выделенной из клеток периферической крови,
последующей рестрикцией и анализом
количества и длины получившихся отрезков ДНК с помощью электрофореза в
полиакриламидном геле. Праймеры для
фрагмента 2 интрона гена STAT6 были
разработаны на основе известной последовательности 12-й хромосомы AC018673
(GenBank). Продукт амплификации размером 216 нуклеотидов обрабатывался
эндонуклеазой Ava II (Есо47I, Fermentas).
Казанский медицинский журнал, 2010 г., том 91, № 1
Рис. 1. Идентификация замены С/Т (rs324011) в гене
STAT6.
В результате у носителей аллеля С амплификат расщеплялся на 3 фрагмента длиной 121, 27 и 68 нуклеотидов, у носителей
аллеля Т — на 2 фрагмента 121 и 95 нуклеотидов (рис. 1).
ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для ПЦР
(67 мМ Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ
(NH4)2SO4, 0,1% Triton X-100), 2,5 мM
MgCl2, 200 мкМ dNTP, по 50 пмоль каждого праймера, 1u Taq ДНК полимеразы и
1 мкг геномной ДНК. Термоциклирование
выполняли в следующем температурном
режиме: предварительная денатурация —
5 мин 94°С; 30 циклов: денатурация —
1 мин 94°С, отжиг праймеров — 1 мин
58°С, синтез — 1 мин 72°С; досинтез —
5 мин 72°С.
Продукт амплификации размером 216
нуклеотидов обрабатывался 1u эндонуклеазой Ava II (Есо47I, Fermentas) в однократном буфере R+ (1 мМ Tris-HCl pH 8,5,
1 мM MgCl2, 10мM KCl) при 37°С в течение 24 часов. Продукты рестрикционного
анализа разделяли в 8% ПААГ.
Аллель С гена STAT6 содержит сайт
рестрикции, в этом случае на электрофореграмме присутствуют фрагменты размером 27 и 68 нуклеотидов. При наличии
аллеля Т данный сайт пропадает. Кроме
того, полученный фрагмент (216 нуклеотидов) содержит постоянный сайт рестрикции для эндонуклеазы AvaII, и после
реакции наблюдается фрагмент размером
121 нуклеотид. Схема рестрикции представлена на рис. 1.
Распределение больных БА по генотипам
и тяжести заболевания показано на рис. 2.
Как видно из рис. 2, среди гомозигот
по тимину (ТТ) не было ни одного больного с тяжелым течением и меньше всего с
течением средней тяжести. Большинство
пациентов со среднетяжелым и тяжёлым
Рис. 2. Распределение генотипов в зависимости от тяжести БА.
течением БА были гетерозиготами (СТ).
У больных с легким течением БА распределение по гомозиготности и гетерозиготности было примерно одинаковым.
На рис. 3 представлена частота встречаемости аллеля Т в зависимости от тяжести БА. Из рис. 3 хорошо видно, что
полиморфизм rs324011 у больных со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания встречался реже, чем у больных с
легкой формой БА.
Тяжелое
течение
Средней
тяжести
Легкое
течение
Частота встречаемости
Рис. 3. Частота встречаемости аллеля Т в зависимости
от тяжести течения БА.
Таким образом, можно предположить,
что наличие полиморфизма гена белка
STAT6 C6613T предрасполагает к более
легкому течению БА.
Нами проведен корреляционный анализ частоты встречаемости аллеля Т и
ряда показателей, характеризующих некоторые патогенетические механизмы
БА (табл. 1).
Как видно из табл. 1, частота встречаемости аллеля Т (р=0,005) положительно
коррелирует с содержанием моноцитов
в мокроте. С тем же положительным
знаком выявлена корреляция частоты
встречаемости аллеля Т с макрофагами в
смыве из бронхов.
Отметим, что выявлена отрицательная
корреляция (хотя и статистически недостоверная) частоты встречаемости аллеля Т с такими показателями, характеризующими патогенетические механизмы,
13
Казанский медицинский журнал, 2010 г., том 91, № 1
Таблица 1
Значения коэффициента корреляции Спирмена (r)
аллеля Т с некоторыми клинико-лабораторными
показателями у больных БА
r
n; p
Тяжесть течения БА (легкое,
средней тяжести, тяжелое)
Показатели
-0,138
n=67;
р=0,266
Кортизол крови, нмоль/л
-0,454
n=15;
р=0,08
Содержание моноцитов в мокроте, %
0,429
n=42;
р=0,005
Содержание макрофагов в смыве
из бронхов, %
0,407
n=9;
р=0,277
Содержание эозинофилов в
мокроте, %
-0,038
n=42;
р=0,813
Содержание эозинофилов в смыве из бронхов, %
-0,535
n=9;
р=0,138
Содержание лимфоцитов в смыве из бронхов, %
-0,327
n=9;
р=0,391
ОФВ1 в % от должного
-0,007
n=53;
р=0,962
Отношение ОФВ1 к ЖЕЛ в % к
должному (индекс Тиффно)
-0,042
n=53;
р=0,767
как количество эозинофилов и лимфоцитов в смыве из бронхов. Подобная корреляция может отражать тот факт, что
аллель Т встречался у тех больных БА, у
которых локальный воспалительный процесс (на уровне бронхов) выражен в меньшей степени.
Любопытно, что корреляция (хотя и
невыраженная) частоты встречаемости
аллеля Т и тяжести БА у обследованных
имеет отрицательный знак. Более выраженная связь выявлена с уровнем кортизола (функция коры надпочечников), и
обратный ее характер достаточно прямо
также отражает определенную закономерность — присутствие аллеля Т в генотипе
чаще выявляется у больных БА, страдающих заболеванием с менее выраженной
тяжестью течения.
И еще один вывод, вытекающий из
анализа таблицы, — это отсутствие во всей
обследованной группе больных БА корреляции частоты встречаемости аллеля Т
со скоростными показателями функции
внешнего дыхания (ОФВ1), в частности с индексом Тиффно. Этот же вывод
можно сделать и при отдельном анализе
в группе больных БА с гомозиготным вариантом генотипа (ТТ) — значение коэффициента корреляции r=0,104 (Спирмен),
р=0,791 (n=9). Вместе с тем при таком же
отдельном анализе в группе больных БА с
14
гомозиготным вариантом генотипа (СС)
выявлена существенная обратная корреляция частоты встречаемости аллеля C со
значениями индекса Тиффно (-0,754 по
Спирмену, р=0,005, n=12).
С этими данными согласуются результаты отдельного корреляционного анализа частоты аллеля Т в группе больных
БА с тяжёлым течением заболевания.
Так, установлена существенная прямая
корреляция со значениями индекса Тиффно (0,642 по Спирмену, р=0,024, n=12).
Подчеркнем, что в этой группе больных
также выявлена существенная прямая
корреляция с содержанием моноцитов в
мокроте (r=0,695, р=0,018, n=11).
Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить, что наличие полиморфизма С6613Т (rs324011) гена
белка STAT6, возможно, имеет протективное значение для течения БА, предрасполагая к более легкой форме заболевания.
Обратим внимание на то, что наиболее
выраженная и достоверная корреляция
аллеля Т выявлена нами с содержанием
моноцитов в мокроте. Как известно, моноциты из кровотока закономерно мигрируют в ткани, в частности в легкие. Моноциты входят в так называемую “систему
мононуклеарных фагоцитов” [6], клетки
которой обеспечивают неспецифическую
антибактериальную защиту за счет как
своей фагоцитарной функции, так и секретируемых провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Велика
роль мононуклеарных фагоцитов, в частности в обеспечении преимущественной
дифференцировки Тh0-клеток в Th1-клетки, ответственные за клеточный специфический иммунный ответ, причем нельзя не отметить, что при распознавании
антигена Th1-лимфоциты отдают четкое
предпочтение взаимодействию с макрофагальными клетками [6].
Участие мононуклеарных фагоцитов
в эффекторной фазе специфического иммунного ответа проявляется их мобилизацией в очаг иммунного воспаления и
активацией под влиянием лимфоцитарных цитокинов, в частности INFγ. Подчеркнем, что INFγ ингибирует активацию
STAT6 в моноцитах, индуцированную IL4
[8].
Исходя из указанных фактов, можно
предположить, что обнаруженная нами
Казанский медицинский журнал, 2010 г., том 91, № 1
прямая корреляция между частотой встречаемости аллеля Т и уровнем моноцитов
в мокроте может отражать, по-видимому,
склонность больных БА с исследуемым
полиморфизмом к фенотипическим проявлениям, связанным со сдвигом цитокинового профиля в сторону Th1-ответа. Выявленный нами феномен протективного
значения для течения БА полиморфизма
гена белка STAT6 не является уникальным в отношении белка STAT6, так как
аналогичный феномен описан в отношении полиморфизма гена белка STAT1.
Так, было показано, что частота встречаемости интронного (интрон 24) полиморфизма C39134A гена белка STAT1 обратно
коррелирует с атопическим состоянием,
выявляемым с помощью pric-теста и общего и уровней общего и специфического
IgE у детей, больных БА и другими аллергическими заболеваниями [11].
Добавим, что протективная роль полиморфизмов целого ряда генов, наряду с их
патогенетической ролью, уже установлена
при онкологических заболеваниях, сахарном диабете, ИБС и других заболеваниях,
включая исследования по распределению
ВИЧ-протективных аллелей. Изучаемый
полиморфизм находится не в кодирующем районе гена белка STAT6 и, как
предполагается [14], может иметь функциональное значение. Полиморфизм локализован в том же районе (интроне 2),
где на близком расстоянии обнаружены
2 сайта для транскрипционного фактора
NFκB, что может указывать на регулирующую функцию этого района в транскрипции STAT6.
Можно предположить, что при полиморфизме rs324011 нарушается связывание NFκB с соответствующими транскрипционными сайтами. Это тем более
важно, что имеются данные, свидетельствующие о том, что транскрипционный
фактор NFκB взаимодействует, возможно,
синергично, со STAT6 [12, 13]. Следовательно, близкое присутствие двух сайтов
для NFκB и гена STAT6 может указывать
на то, что, существует механизм обратной
отрицательной регуляции между активацией NFκB и STAT6.
Таким образом, нами выявлена связь
полиморфного варианта rs324011 гена белка STAT6 с тяжестью течения БА, причем
наличие в генотипе данного полиморфиз-
ма, обладает, по-видимому, протективным
эффектом в отношении тяжести заболевания. Этот вывод следует учитывать при
анализе исследований роли в патогенезе
БА такой сигнальной системы, реализующей цитокиновую сигнализацию, как
JAK-STAT-система, и прежде всего роли
ключевого белка STAT6.
Работа поддержана грантами правительства Санкт-Петербурга 28-04/17 (диплом № ПСП
080591) и грантом для молодых ученых СПбГМУ
им. акад. И.П. Павлова за 2008 год.
ЛИТЕРАТУРА
1. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о Jak-Stat системе как новой сигнальной системе
и ее нарушениях при иммунной патологии. Часть I.
// Аллергология. — 2005. — № 4. — С. 38—44.
2. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о Jak-Stat системе как новой сигнальной
системе и ее нарушениях при иммунной патологии:
механизмы негативной регуляции. Часть II. // Аллергология. — 2006. — № 1. — С. 49—55.
3. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Экспрессия STAT6 в
лимфоцитах периферической крови больных аллергической бронхиальной астмой // Мед. иммунол. — 2007. —
Т.9, № 4—5. — С.405—410.
4. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А. Полиморфизм гена белка STAT6 и бронхиальная астма. // Казанский мед. ж. — 2009. — № 1. — С. 102—109.
5. Фрейдин М.Б., Брагина Е.Ю., Огородова Л.М., Пузырев В.П. Генетика атопии: современное состояние//Вестник ВОГиС. — 2006. — Том 10. — № 3. — C. 492—503.
6. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Иммунологические
механизмы аллергических реакций. / Общая аллергология. Т.1. Под ред. Г.Б.Федосеева. — СПб.: НордмедИздат, 2001. — С.169—381.
7. Chen W., Hershey G. K.K. Signal transducer and
activator of transcription signals in allergic disease // J.
Allergy Clin. Immunol. — 2007. — Vol.119. — P.529—541.
8. Dickensheets H. L., Venkataraman C., Schindler U.,
Donnelly R. P. Interferons inhibit activation of STAT6 by
interleukin 4 in human monocytes by inducing SOCS-1
gene expression // PNAS USA. — 1999. — Vol. 96. —
P. 10800—10805.
9. Duetsch G., Illig T., Loesgen S. et al. STAT6 as
an asthma candidate gene: polymorphism-screening,
association and haplotype analysis in a Caucasian sibpair study // Hum. Mol. Genet. — 2002. — Vol. 11, № 6. —
P. 613—621.
10. Holgate S.T., Davies D.E., Powell R.M. et al. Local
genetic and environmental factors in asthma disease
pathogenesis: chronicity and persistence mechanisms //
Eur.Respir. J. — 2007. — Vol. 29, № 4. — P.793—803.
11. Pinto L.A., Steudemann L., Depner M. Et al. STAT1
gene variations, IgE regulation and atopy // Allergy. — 2007. —
Vol.62, № 12. — P.1456—1461.
15
Казанский медицинский журнал, 2010 г., том 91, № 1
12. Shen C.H., Stavnezer J. Interaction of Stat6 and
NF-kappaB: direct association and synergistic activation
of interleukin-4-induced transcription // Mol. Cell. Biol. —
1998. — Vol.18. — P.3395—3404.
13. Stütz A.M., Woisetschlager M. Functional synergism
of STAT6 with either NF- kappa B or PU.1 to mediate IL-4induced activation of IgE germline gene transcription // J.
Immunol. — 1999. — Vol.163. — P. 4383—4391.
14. Weidinger S., Klopp N., Wagenpfeil S. et al.
Association of a STAT6 haplotype with elevated serum IgE
levels in a population based cohort of white adults // J.
Med. Genet. — 2004. — Vol.41. — P.658—663.
Поступила 28.02.09.
INTRON POLYMORPHISM OF THE RS324011 GENE
OF STAT6 PROTEIN IN PATIENTS WITH VARYING
SEVERITY OF BRONCHIAL ASTHMA
V.N. Mineev, L.N. Sorokina, M.A. Nema, M.V. Dubina,
E.D. Yanchina
Summary
Revealed was the relationship of the polymorphic
variant of rs324011gene of STAT6 protein with the
severity of bronchial asthma course. The presence of this
polymorphism in the genotype apparently could induce a
protective effect on the severity of the disease.
Key words: polymorphism, rs324011, STAT6, bronchial
asthma.
УДК 616.24—002.2—008.8—036.12—085.356:577.152.34.042.2].015.2:615.33].032.24—036.8—07
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕРИНАТА В ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ
БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ
Наиля Исхаковна Кубышева1, Лариса Борисовна Постникова2,
Рамиль Зинурович Миндубаев2, Виктор Владимирович Новиков1
НИИ молекулярной биологии и региональной экологии (директор — докт. биол. наук В.В. Новиков)
Нижегородского государственного университета, 2Городской центр для больных ХОБЛ
(руководитель — Л.Б. Постникова), Нижегородская городская больница №28, e-mail:aibolit70@mail.ru
1
Реферат
Изучена эффективность небулайзерных ингаляций
иммуномодулятора дерината у некурящих больных с
обострением хронической обструктивной болезни легких II стадии. Установлены достоверное увеличение
показателя функции внешнего дыхания — емкости
вдоха, снижение уровня молекул адгезии ICAM-1 и
ICAM-3, метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха и снижение концентрации ИЛ-8 в
циркуляции у больных, получавших ингаляционную
форму дерината.
Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь
легких, иммунитет, оксидативный стресс, деринат.
В последние годы во всем мире наблюдается неуклонный рост распространенности хронической обструктивной
болезни легких (ХОБЛ) и смертности
от данного заболевания. Согласно современной концепции патогенеза ХОБЛ,
данная патология — это аномальная воспалительная реакция легочной ткани в
ответ на воздействие патогенных частиц
и газов, результатом которой является
частично обратимое ограничение скорости воздушного потока [6]. Ключевая
роль в повреждении и ремоделировании
бронхолегочной ткани при ХОБЛ принадлежит дисрегуляции системного и местного иммунитета, оксидативного стресса
и др. Дисбаланс про- и антиоксидантной
16
систем при ХОБЛ характеризуется повышением выработки активных форм кислорода (АФК), продуктов перекисного
окисления, ростом уровня оксида азота и
его метаболитов как на общеорганизменном, так и на местном уровнях [5].
Развитие воспалительного процесса
при ХОБЛ во многом обусловлено увеличением количества эндобронхиальных
нейтрофилов, макрофагов и Т-лимфоцитов [6]. Этот феномен объясняется усилением рекрутирования клеток в очаг
воспаления. Важная роль в реализации
данных реакций принадлежит антигенам адгезии и различным хемокинам, в
том числе ИЛ-8, патогенетически значимому медиатору ХОБЛ. В исследованиях
последних лет продемонстрирован подъем уровня растворимых форм молекул адгезии ICAM-1, ICAM-3 и содержания ИЛ-8
у больных с обострением ХОБЛ [3, 4].
Недостаточная эффективность современной терапии требует поиска препаратов, обладающих противовоспалительной
активностью. С этих позиций рациональным в лечении обострения ХОБЛ может
быть дополнительное применение препаратов, обладающих иммумодулирующим
и антиоксидантным действием, что, вероятно, позволит повысить эффективность