Роль микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных
advertisement
Иммунопатология, аллергология, инфектология Immunopathology, allergology, infectology 2012, №4:7082 ИНФЕКТОЛОГИЯ Роль микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе В.К. Окулич, Ф.В. Плотников, А.А. Кабанова Витебский государственный медицинский университет, Витебск, Беларусь Biofilm’s role in the pathogenesis of infectious process at the present stage V.K. Okulich, P.V. Plotnikov, A.A. Kabanova Vitebsk State Medical University, Vitebsk, Belarus Аннотация Summary Большинство микроорганизмов в естественных и искус ственно созданных окружающих средах существует в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сооб ществ – биопленок. Характерное свойство всех биопленок – их поразительная устойчивость к физическим и биохи мическим воздействиям, включающим АБрезистент ность. Причины развития повышенной резистентности микроорганизмов, способных формировать биоплёнки: нарушение проникновения антибиотиков через матрикс биоплёнки, экспрессия генов стрессового ответа, вариа ция фаз роста, персистирующие микроорганизмы, недо статок питательных веществ. С использованием электрон ной микроскопии установлено, что биопленки имеют сложную трехмерную структуру. Наиболее важные поли сахариды, которые играют ведущую роль в формирова нии матрикса биоплёнок большого числа видов бактерий: целлюлоза, PNAG/PIA, PEL, PSL и VPS. Мультимерные клеточные выросты – флагеллы, фимбрии, пили – уча ствуют в прикреплении клеток к поверхности и их взаи модействии в составе биопленок. Бактерии в составе био пленки взаимодействуют с участием сигнальных молекул, таких как 3oxoC12HSL, AHL, AIP. На сегодняшний день образование биоплёнок госпитальными штаммами бакте рий является серьезной угрозой для практического здра воохранения. The majority of microorganisms in the natural and artificially created environments exists in the form of the structured communities attached to a surface – biofilms. Characteristic property of all biofilms – their amazing stability to the physical and biochemical impacts which are including resistance to antibiotic. The reasons of development of the increased resistance of the microorganisms, capable to form a biofilm: violation of penetration of antibiotics through matrix of biofilms, an expression of genes of the stress responce, a variation of growth phases, persisters, shortage of nutrients. With use of the confocal microscopy it is established that biofilms have difficult threedimensional structure. The most important polysaccharides which play the leading role in formation biofilms matrix of a large number of species of bacteria: cellulose, PNAG/PIA, PEL, PSL and VPS. Multimeasured cellular outgrowths – flagella, fimbriya, pili – participate in an attachment of bacteria to a surface and their interaction as a part of biofilms. Intercellular interactions of bacteria as a part of a biofilm occur to participation of Quorum Sensing. To date, the formation of biofilms by the hospital strains is a serious problem to public health practice. Ключевые слова Keywords Инфекция, биопленка, матрикс, сигнальные молекулы. Infection, biofilm, matrix, Quorum Sensing. Проблема профилактики и лечения инфек ционных заболеваний является одной из при оритетных в практическом здравоохранении. В общей структуре хирургической заболеваемос ти гнойновоспалительные процессы занимают одно из ведущих мест, они наблюдаются у 40 60% всех хирургических больных [1, 2]. Отмечено изменение клинической симпто матики и течения хирургической инфекции на современном этапе, что проявляется в увеличе 70 Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°4 Инфектология: Роль микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе нии числа тяжело протекающих и не поддаю щихся стандартному лечению осложненных форм гнойных заболеваний; удлинении сроков лечения, особенно на госпитальном этапе; уча щении случаев стертых форм и атипичного те чения хирургической инфекции [3]. Недостаточная эффективность проводимо го лечения хирургической инфекции в опреде ленной мере объясняется наличием у микроор ганизмов действенных механизмов защиты от внешних повреждающих факторов. Повсемес тное применение антибактериальных (АБ) пре паратов широкого спектра действия в меди цинской практике способствует селекции рези стентной флоры. В последнее десятилетие изуче нию механизмов выживания бактерий придает ся особое значение [4]. В настоящее время основной частью микро биологов признано, что большинство микро организмов в естественных и искусственно со зданных окружающих средах существует в виде структурированных, прикрепленных к поверх ности сообществ – биопленок (БП) [5]. Био пленка – микробное сообщество, характеризую щееся клетками, которые прикреплены к поверх ности или друг к другу, заключены в матрикс син тезированных ими внеклеточных полимерных ве ществ, и демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов [6]. Характерное свойство всех биопленок – их поразительная устойчивость к физическим и биохимическим воздействиям, включающим АБрезистентность [7]. Несмотря на то, что эта устойчивость признана много лет, ее биологи ческое обоснование до сих пор до конца не объяснено. Фактор, который частично объяс няет устойчивость фенотипа, включает высо кую клеточную плотность и физическое вытес нение АБ. В пределах биопленки могут проис ходить физиологические изменения, включаю щие реакцию общего стресса, закрытие ключе вых метаболических процессов и индукцию за щитных механизмов [8]. Популяция клеток в составе биопленки гетерогенна, содержит быст ро и медленнорастущие бактерии. Ряд из них устойчивы к АБ за счет экспрессии инактивиру ющих ферментов, другие – не экспрессируют подобные системы. Общая резистентность за висит от взаимодействия между целой популя цией клеток и терапии, направленной против мультиклеточного сообщества [7]. Образование биопленок – комплексный процесс, состоящий из нескольких этапов: адге зии клеток на поверхности и перераспределения клеточной массы; активного деления клеток для создания клеточных кластеров; образова ния экзополимерного слизистого матрикса; распространение клеток биоплёнки в окружаю щей среде. Изначальное прикрепление микроб ной клетки к поверхности субстрата осуществ ляется за счет действия электростатических, гид рофобных сил, сил Ван дер Вальса, неспецифичес кой адгезии. У грамотрицательных микроорга низмов важную роль в адгезии и клеточной агре гации играют жгутики и фимбрии [9]. Установ лено, что степень адгезии с последующим фор мированием биопленок наиболее выражена к таким материалам, как латекс, силикон, поливи нилхлорид. Адгезия к тефлону, полиуретану, не ржавеющей стали и титану проявляется в мень шей степени. Все вышеперечисленные материа лы широко применяются в медицинской прак тике, что является дополнительным фактором формирования биопленок, что приводит к раз витию инфекций с клинической резистентнос тью к антибактериальной терапии [10]. С использованием лазерной конфокальной микроскопии, сканирующей электронной мик роскопии установлено, что биопленки имеют сложную трехмерную структуру. После адгезии микроорганизмы начинают интенсивно проли ферировать с образованием многоклеточных слоев и обильно синтезировать компоненты эк зополимерного матрикса [11] (Рис.1). В химическом отношении матрикс неодно роден и различается у разных микроорганиз мов [12, 13, 14]. Экстрацеллюлярный слой со держит до 40–95% полисахаридов [15,16]. Кон центрация других химических компонентов очень сильно варьирует. Доля белков может со ставлять до 60%, липидов до 40% и нуклеино вых кислот 1–20%. Данные соединения находят ся в гидратированном состоянии, так как 80– 90% объема биопленки занимает вода [17]. Клетки в матриксе располагаются определен ным образом. Структура многоклеточных кла стеров представлена в виде образований, напо минающих столбы, «цементированных» в экзо полисахаридный слой, что позволяет поддержи вать концентрацию питательных веществ, необ ходимых для роста популяции, а также служит защитой клеток [5]. Матрикс разделен канала ми, наполненными водой, а также имеет полос ти и пустоты. Через каналы транспортируются питательные вещества и кислород от внешних к внутренним частям биопленки, одновременно с этим выводятся метаболиты клеток [13]. Клет Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°4 71 В.К. Окулич, Ф.В. Плотников, А.А. Кабанова Рис. 1. P.aeruginosa: микропрепаратs – А планктонной формы; Б – биопленки P.aeruginosa. Окраска Конго красный и фуксин (1бактерии, 2матрикс). Объектив 100, увеличение х1000, цифровая фотокамера Leica DFC 295 c программным обеспечением LASV.3.6.0. ки бактерий в биопленке имеют сложную поли морфную организацию с определенной цито архитектоникой, выявляются клетки с сильно измененной морфологией, мертвые клетки [18]. Многослойная топография влияет на метабо лизм и физиологическую активность клеток. Периферические слои более аэрированы по сравнению с центральными частями, где обра зуется благоприятные условия для анаэробов [19]. Сниженный метаболизм микроорганиз мов в биопленке ведет к появлению антибиоти 72 корезистентности, т.к. антибактериальные пре параты наиболее эффективны в отношении ме таболически активных клеток [20]. Полисахариды экстрацеллюлярного матрикса биоплёнок Химический состав и физические свойства полисахаридов матрикса могут значительно варьировать в зависимости от типа мономеров, способа их связи (b1,4, b1,3 или a1,6), а так же наличия различных органических и неорга Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°4 Инфектология: Роль микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе нических субстанций. Наиболее важные полиса хариды, которые играют ведущую роль в форми ровании биоплёнок большого числа видов бакте рий: целлюлоза, PNAG/PIA, PEL, PSL и VPS. Целлюлоза – наиболее широко распростра нённый полисахарид в природе, продуцируется как растениями, так и бактериями. Выработка бактериальной целлюлозы описана у большого количества бактерий, таких как Gluconacteo bacter xylinus (Acetobacter xylinum) Sarcina ventriculi, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium leguminosarum, Escherichia coli, Salmonella spp. и Pseudomonas fluorescence. Исследования пока зывают, что возможностью образовывать цел люлозу обладают и другие бактерии: Vibrio, Yersinia и штаммы Burkholderia [18, 19]. У целлюлозасинтезирующих бактерий гене тическая информация, ответственная за синтез целлюлозы, находится в опероне, состоящем из четырех генов: bcsA, bcsB, bcsC, bcsD (bacterial cellulose synthesis). Полимеризация мономеров уридиндифосфатглюкозы в целлюлозу катали зируется целлюлозной синтазой BcsA. Несколь ко трансмембранных доменов удерживают цел люлозную синтазу BcsA в цитоплазматической мембране. Непосредственно возле BcsA можно обнаружить BcsBпротеин. Он регулирует ак тивность целлюлозной синтазы посредством связывания вторичного медиатора cdiGMP. Предполагается, что контролируемый переход cdiGMP с BcsB на BcsA может активировать целлюлозную синтазу аллостерически. Недав ние исследования показали наличие на Ско нечном участке BcsA участка для связывания с cdiGMP, названного PilZдомен. Функцио нальное значение BcsC и BcsD до сих пор не описано. Некоторые авторы полагают, что BcsC может участвовать в формировании пор в кле точной стенке, а BcsD может влиять на процесс кристаллизации целлюлозы [21]. При исследовании P. fluorescens был обнару жен фенотип с высокой способностью к агрега ции. Эта способность была связанна с продук цией данным штаммом ацетилированной фор мы целлюлозы и белковых фимбрий, как фак торов агрегации. Эксперименты показали, что целлюлозные волокна могут взаимодейство вать с липополисахаридами (LPS) клеточной стенки бактерий, находящихся в непосред ственной близости от P. fluorescens. Роль полиNацетилглюкозамина, как ком понента матрикса биоплёнки, была изучена на Грам(+) микроорганизмах: S. epidermidis, кото рый синтезирует полисахаридный межклеточ ный адгезин (PIA), и S.aureus, который синтези рует полиNацетилглюкозамин (PNAG). Так же обнаружено, что PNAG/PIA подобные поли сахариды синтезируются некоторыми Грам() бактериями, такими как E.coli, Y. pestis и Actinobacillus spp. Сравнительный анализ гено мов показал наличие генов, гомологичных от ветственным за синтез полиNацетилглюкоза мина, у многих других бактерий, таких как Pseudomonas fluorescence, Bordetella pertussis, Ralstonia solanacearum, и Lactococcus lactis. Фор мирование биоплёнки стафилококками явля ется мультифакторным процессом. Множество внеклеточных или прикреплённых к поверхно сти клетки полимеров принимают участие в прикреплении клетки к биотической или абио тической поверхности. Однако PNAG/PIA явля ется наиболее важным компонентом матрикса биоплёнки стафилококков [22, 23]. Полисахариды PIA и PNAG, синтезируемые S.epidermidis и S.aureus соответственно, тесно связаны между собой химически и иммунологи чески. Оба они являются гомополисахаридами, состоящими из неразветвленных длинных поли мерных цепочек Dглюкозамина, равномерно соединённых между собой через a1,6глюко зидные связи. Однако они отличаются длинной цепи и модификацией [24]. Генетические элементы, кодирующие био синтез полиNацетилглюкозамина находятся в опероне, состоящем из четырех генов: icaA, icaB, icaC, icaD (intercellular adhesin) [25]. IcaA, IcaC и IcaD находятся в клеточной мембране, в то время как IcaB обнаруживается внеклеточно. Полимеризация мономеров уридиндифосфат Nацетилглюкозамина в полимерные цепи b 1,6Nацетилглюкозамина катализируется N ацетилглюкозаминтрансферазой IcaA. Одно временная экспрессия icaA и icaD значимо уве личивает ферментативную активность, что указывает на поддерживающую функцию IcaD по отношению к IcaA. Олигомеры Nацетилг люкозамина, продуцируемые только посред ством IcaAD, достигают максимальной длинны в 20 остатков. Для создания более длинных це пей необходимо соэкспрессия icaAD с icaC. SarA (staphylococcal accessory regulator A), глобаль ный регулятор экспрессии факторов вирулент ности S.aureus, влияет на транскрипцию icaADBC, как у S.aureus, так и S.epidermidis. Об наружено, что клетки стафилококков, лишён ные SarA, в меньшей степени прикрепляются к абиотическим поверхностям, таким как поли стирол или стекло, как в статических системах, Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°4 73 В.К. Окулич, Ф.В. Плотников, А.А. Кабанова так и в системах с непрерывным движением жидкости [26]. P.aeruginosa в зависимости от штамма и усло вий роста может продуцировать по крайней мере три различных полисахарида: альгинат, PEL и PSL. Кроме этого, в геноме эталонного штамма P.aeruginosa PAO1 были обнаружены два дополнительных генных кластера, вовлечён ных в биосинтез полисахаридов (PA1381 PA1398 и PA3552PA3558). Мукоидные формы P.aeruginosa, которые экспрессируют alg гены (alginate biosynthesis, PA3540PA3551), обнару живаются преимущественно у пациентов, пора жённых муковисцидозом лёгких [27]. Мукоидный фенотип бактерий возникает изза перепроизводства альгината, фактора ви рулентности, который даёт ряд преимуществ P.aeruginosa. Альгинат – высокомолекулярный, ацетилированный полимер, состоящий из не повторяющихся мономеров b 1,4 соединён ных Lгулуроновой и Dманнуроновой кислот. Альгинат продуцирующие штаммы in vivo по являются всё чаще изза мутации негативного регулятора mucA. Существует четкая корре ляция между появлением мукоидного фено типа P. aeruginosa и ухудшением прогноза для пациента поражённого муковисцедозом. Ин фекция вызывает миграцию клеток воспале ния в очаг инфекции (макрофагов, лейкоци тов, лимфоцитов), высвобождаются радика лы кислорода, что ведёт к повреждению тка ней. Как оказалось, альгинат защищает P.aeruginosа от последствий воспаления: он связывает свободные радикалы, освобождён ные активированными макрофагами in vitro, и защищает бактерии от фагоцитоза. Результаты нескольких независимых лабораторий показа ли, что гиперпродукция ацетилированного альгината ведёт к значительным архитектур ным и морфологическим изменениям в био плёнке. Это проявляется в увеличении резис тентности к антимикробным препаратам. В исследованиях выявлено, что биоплёнка обра зуется как при наличии альгината, так и у штаммов, лишённых альгината. Увеличенная его продукция, связанная с мутацией mucA, ведет к увеличению резистентности бактерий в составе биопленки к антибактериальным препа ратам. Соответственно, у немукоидных штам мов альгинат не является основным компонен том внеклеточного матрикса [28]. PEL и PSL являются разветвлёнными гетеро полисахаридами, однако основным компонен том PEL является глюкоза, в то время как PSL 74 состоит в основном из маннозы. Высокий уро вень экспрессии PEL и PSL у P.aeruginosa ведёт к формированию колоний Rтипа на агаре. Син тез PEL позволяет P.aeruginosa формировать биоплёнку на поверхности жидкой питательной среды. Исследования показали, что PSL необхо дим на ранних стадиях формирования био плёнки P.aeruginosa, в то время как PEL играет важную роль на поздних стадиях. В исследова ниях биоплёнки в системах с током жидкости штаммы, испытывающее дефицит в образова нии PSL, замедленно формировали биоплёнку, что указывает на роль PSL именно на ранних стадиях формирования биоплёнки. Генетичес кие элементы, кодирующие биосинтез PEL, объединены в генный кластер, состоящий из семи открытых для считывания участков, на званных pelAG (pellicle formation; PA3058 PA3064). Точная функция продуктов экспрес сии генов до конца не определена. Однако изу чение последовательности показало, что в этих белках есть домены, которые вовлечены в синтез полисахаридов у других организмов. Напри мер, PelF гомологичен IV группе гликозил трансферазы, PelE содержит домены, похожие на таковые у синтазы сукрозы. К тому же, пола гают, что PelG является белком семейства PST, которое вовлечено в перемещение гликолипид ных прекурсоров через мембрану [29]. Генный кластер psl (polysaccharide synthesis locus) состоит из 15 участков pslAO (PA2231 PA2245). Анализ последовательностей первых 11 белков показал, что они вовлечены в биосинтез полисахаридов. PslF, PslH и PslI имеют гомоло гичные участки с I группой семейства гликозил трансфераз. Так как PslA, PslJ и PslK содержат 6, 11 и 12 трансмембранных доменов, соответ ственно, то они вероятнее всего локализуются в клеточной мембране [30]. Поверхностные белки как фактор формирования биопленки Генетические и микроскопические методы исследования подтверждают информацию о наличии протеинов, которые выступают в каче стве межклеточных коннекторов во время фор мирования биопленки различными штаммами бактерий. Объёмные клеточные выросты – флагеллы, фимбрии, пили – обычно состоят из множества ведущих структурных компонентов и нескольких вспомогательных белков. Движение, обусловлен ное флагеллами, может обеспечить инициацию формирования биопленки за счет перемещения Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°4 Инфектология: Роль микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе бактерии, флагеллы могут выступать в роли адгезина клеткаклетка и клеткаповерхность [31]. Также они могут играть роль в более поздней стадии структурного развития биопленки[32]. Пили IV типа используются многими бакте риям для обеспечения поверхностьассоцииро ванной подвижности. Кроме того пили IV типа участвуют в адгезии как к абиотическим, так и биотическим поверхностям [33]. Исследования in vitro выявили, что пили IV типа P. аeruginosa специфичны к asialoGM1 и asialoGM2 на по верхности клеткихозяина [34]. Показано, что пили IV типа N. gonorrhoeae и P. aeruginosa вы сокоафинны к ДНК, и, т.к. экстрацеллюлярная ДНК является частью внеклеточного матрикса биопленки P. aeruginosa [35], пили IV типа мо гут участвовать в качестве связки между клет кой и экстрацеллюлярным матриксом. Sauer и Camper (2001) представили доказательства того, что экспрессия главных структурных компонентов пилей IV типа (PilA) осуществля ет подавление начальной стадии формирования биопленки и активизацию последних стадий развития биопленки [36]. Тип I фимброподобных органелл кодирован у многих энтеробактерий, они играют важную роль в жизнедеятельности этих организмов. Некоторые бактериальные клетки имеют 100 500 фимбрий I типа на своей поверхности. Фимбрии I типа содержат в основном струк турный протеин FimA, при этом ряд дополни тельных белков необходим для транспортиров ки и компоновки структурных протеинов. Ком понент фимбрии I типа – маннозаспецифичес кий адгезин FimH – ответственен за связывание фимбрий I типа с эукариотической клеткой. Представлены доказательства, что фимбрии I типа играют роль в формировании биопленки E. coli на поверхности жидкой питательной сре ды. Фимбрии I типа ассоциированы с повыше нием образования биопленки E.coli в системах с током жидкости. Есть свидетельства, что фим брии I типа, кроме того, что участвуют в при креплении к поверхности эукариотических клеток, могут также выступать в роли компо нента матрикса биопленки [37]. Наличие конъюгирующих пилей может обеспечить формирование биопленки E. coli. Было показано, что в системах с током жидко сти конъюгирующие пили являются основным компонентом матрикса E. coli, в то время как другие известные факторы образования био пленки, такие как Ag43 и фимбрии I типа, мало значимы. Даже незначительные изменения структуры конъюгирующих пилей, например, вызванные делецией гена traX, ведут к образова нию биопленки с повреждением ее простран ственной структуры, либо угнетают формиро вание биопленки в целом [38]. «Curly» жгутики были впервые обнаружены у E.coli, но дальнейшие исследования показали, что они также присутствуют у штаммов Salmonella, Citrobacter и Enterobacter spp. [39]. «Curly» жгутики – тонкие амилоидоподобные структуры, выступающие на поверхности клет ки в виде спутанного аморфного матрикса, они могут функционировать как адгезины клетка клетка и клеткаповерхность [40]. Протеин CsgA – ведущий структурный компонент «curly» жгутиков, а протеин CsgB – важная ма лая структурная единица. Полимеризация «curly» жгутиков происходит на поверхности клетки в процессе так называемой внеклеточ ной «нуклеации». Эта «нуклеация» зависит от протеина CsgB, исследование мутаций показа ло, что смешивание мутантов Csga и Csgb мо жет привести к осаждению субъединиц «curly» жгутиков на поверхности мутанта Csga. В до полнение к связыванию с поверхностью АБ и стимулированию формирования биопленки путем увеличения адгезии клеткаклетка, «curly» жгутики демонстрируют взаимодей ствие с экзополимером клеткихозяина, таким как фибронектин. Приведены доказательства того, что «curly» жгутики вместе с целлюлозой играют роль в формировании биопленки энте робактериями, такими как E. coli, Enterobacter spp. и Citrobacter spp. У E. coli и S. enterica было показано, что координация экспрессии «curly» жгутиков и целлюлозы регулируется через транскрипцию регулятора CsgD и домена GGDEF протеина AdrA [41]. У E. coli обнаружена группа поверхностных белков (Ag43, AIDA и TibA), названых самораспоз нающими аутотранспортерами (self associating autotransporters, SAAT). Эти белки имеют ряд сходств и общих черт, таких как стимулирование клеточной агрегации и формирования биоплен ки. Межклеточное взаимодействие, которому способствуют эти белки, возможно в силу их спо собности к самоидентификации [42]. Белок TasA Bacillus subtilis был выявлен в ка честве главного компонента внеклеточного матрикса, окружающего бактерии в период об разования биопленки на поверхности жидкой питательной среды [43]. Базируясь на генети ческих и биохимических фактах, доказано, что для образования биопленки кроме белка TasA Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°4 75 В.К. Окулич, Ф.В. Плотников, А.А. Кабанова требуется экзополисахарид, кодируемый оперо ном epsAO. Отсутствие обоих этих компонен тов приводит к нарушению образования био пленки B. subtilis. Выявлено, что гены eps и tasA ре гулируются SinR B. subtilis [44]. Точная функция TasA во внеклеточном матриксе B. subtilis остает ся неизвестной, в то же время обнаружена его роль в сборке и созревании оболочки спор [45]. Лектины характеризуются сродством к карбогидрату, находящемуся на поверхности клеткихозяина. Представлены доказатель ства того, что некоторые лектины узнают кар богидраты в экстрацеллюлярном матриксе биопленки и тем самым обеспечивают взаи модействие между клетками. Фукозаспеци фичный лектин LecB P. aeruginosa необходим для развития биопленки, растущей при нали чии тока жидкости [46]. Экспериментальное разделение клеток показало, что LecB экспор тируется и связывается с наружной мембра ной путем взаимодействия с лигандами, со держащими фукозу. Окрашивание биопленки P. aeruginosa с флюоресцентно помеченным протеином LecB подтвердило наличие лектин связывающих участков в их структуре [47]. Поиски факторов, влияющих на формиро вание биопленки, выявили широко распростра ненную группу поверхностных белков с высо кой молекулярной массой, которые характери зуются большим количеством повторяющихся структур. Семейство протеинов включает био пленкаассоциированный протеин (Bap) S. aureus, адгезионный протеин (LapA) P. fuorescens и P. putida, биопленкаассоциированный проте ин (BapA) S. enterica, поверхностный белок энте рококков (Esp) E. faecalis, адгезин AdhA B. cenocepacia. В дополнение к этому большая груп па подобных белков обнаружена в геномных базах бактерий окружающей среды и бактерий, значимых для медицины [48]. Белок Вар был впервые описан у S. aureus [49]. Вар демонстрировал стимулирование пер вичного прикрепления к абиотическим повер хностям и межклеточной адгезии. Были пред ставлены сведения о том, что делеция гена bap привела к снижению накопления главного экзо полисахарида стафилококка PIA. У Грам(+) бактерий описана большая груп па белков, получивших название MSCRAMM протеины (микробные поверхностные компо ненты, которые распознают адгезивные молеку лы матрикса). Большая группа MSCRAMM протеинов имеет общие свойства с семейством белков Bapтипа, но функционально описыва 76 ются в связи с адгезией к структурным элемен там организмахозяина, таким как фибронек тин, фибриноген, коллаген, гепаринсвязанные полисахариды, однако это не исключает их фун кцию в матриксе биопленки [50]. Внеклеточная ДНК как компонент матрикса биопленки Так как большинство, если не все, популяции бактерий окружены экстрацеллюлярной ДНК [51], экстрацеллюлярная ДНК может высту пать в качестве субстанции, поддерживающей межклеточное взаимодействие во множестве различных биопленок. В результате исходного высвобождения ДНК множество бактерий по лучают специфические программы ДНКсинте за. Связь между синтезом внеклеточной ДНК и способностью к развитию биоплёнки описана у многих бактерий, включая Streptococcus pneumoniae [52], Bacillus subtilis [53], Acinetobacter calcoaceticus [54], Neisseria gonorrhoeae [55], и Pseudomonas stutzeri [56]. Существуют доказательства участия внекле точной ДНК в качестве межклеточного посред ника, как для эталонного штамма P. aeruginosa PAO1, так и для клинических изолятов. Образо вание биоплёнки P.aeruginosa PAO1 в лунках иммунологического планшета было ослаблено в присутствии ДНКазы I, а в системах с током жидкости образование биоплёнки практически отсутствовало при добавлении бульона с ДНКа зой I. Так же было обнаружено, что незрелая биоплёнка быстро разрушается при обработке раствором ДНКазы I, в то время как сформи ровавшаяся биоплёнка остаётся стабильной. Данный факт указывает на то, что в зрелом со стоянии биоплёнку стабилизируют другие ком поненты, отличные от ДНК. Matsukawa и Greenberg исследовали состав зрелой биоплён ки PAO1 и обнаружили, что ДНК является наи более распространённым полимером, однако наиболее важным оказался полисахарид, коди руемый генами psl. Есть данные о том, что зре лые биоплёнки некоторых штаммов поддаются разрушению под воздействием ДНКазы. Так же представлены доказательства того, что внекле точная ДНК может иметь ведущее значение в распространении биоплёнки [31]. Концентрация внеклеточной ДНК различна в разных частях биоплёнки. Так, в 4х дневной биоплёнке, состоящей из грибоподобных струк тур, внеклеточная ДНК преимущественно лока лизовалась в «ножках» грибоподобных струк тур с наибольшей концентрацией во внешней Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°4 Инфектология: Роль микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе части «ножек» на границе между «ножкой» и «шляпкой». Формирование грибоподобной формы биоплёнки является стадийным процес сом. Сначала субпопуляция неподвижных кле ток растёт в определённом направлении, фор мируя «ножку». Затем мигрирующая субпопу ляция формирует «шляпку» посредством про цесса, для которого необходимы пили IV типа. Ещё до конца не известно, каким образом пере движение клеток приводит к формированию «шляпки», однако существует мнение, что при чиной скопления клеток на вершине «ножки» является сродство пилей IV типа к ДНК [57]. Сигнальные молекулы Одним из видов межклеточной сигнализа ции является quorom sensing (QS) форма бак териального межклеточного взаимодействия при котором бактерии секретируют и воспри нимают сигнальные молекулы, известные как аутоиндукторы. Понятие «ощущение кворума» (quorom sensing) было предложено в 1994 году. Обнаружено несколько циклов QS, при этом некоторые из бактерий используют сразу не сколько циклов QS для мониторинга окружаю щей среды [58]. Бактерии используют несколько классов мо лекул для межклеточной коммуникации. Неко торые Грам(+) бактерии используют пептиды, в то время как для Грам() бактерий характерно использование ацилгомосерин лактона (извес тного как AHL или AI1) для межклеточных взаимодействий. Другие молекулы, такие как і бутиролактон, хинолоны и гидроксикетоны, также используются для внутривидового взаи модействия у Streptomyces spp, P. aeruginosa и V. cholerae, соответственно. AI2 семейство преоб разованных циклических лактолов) также ис пользуется для внутривидового взаимодействи я. Не смотря на то, что фермент, участвующий в образовании AI2, известный как LuxS, обна ружен у около 70 видов бактерий, только не многие из них обладают рецепторами для их обнаружения: LuxP рецептор у V.harveyi и LsrB у E.coli/Salmonella связываются с различными формами AI2; LuxP связывается с фуранозил борированным диэфиром, тогда как LsrB свя зывается с (2R,4S)2метил2,3,3,4тетрагидрок ситетрагидрофураном (RTHMF), в котором нет бора. Другой белок, связывающийся с «модифицированным» AI2 – LsrR транскрип ционный регулятор у E.coli/Salmonella, который присоединяется к фосфорилированному AI 2. Несмотря на недостаток идентификации bona fide AI2 рецепторов у бактерий, на сегод няшний день установлена роль этой молекулы в межклеточных взаимодействиях и медиации факторов вирулентности,например, у V. vulnifcus, S.marcescens и C. perfringens . У других бактерий LuxS (синтаза для AI2) может играть дополнительную, ещё не изученную роль. Также возможно LuxS независимое формирование AI2 из рибулоза – 5 – фосфата. Значение аль тернативного способа синтеза AI2 в QS ещё следует полностью изучить [59]. Бактерии могут определять молекулы, син тезированные эукариотическими клетками макроорганизма и регулировать экспрессию генов в зависимости от молекул, продуцирован ных макроорганизмом. Например, энтероге моррагический серотип E.coli (EHEC) O157:H7, который ответственен за вспышки кровавой диареи и уремического синдрома, зависит от эукариотического гормона эпинефрина. Было показано снижение бактериального ответа на этот гормон при использовании b a –адренер гических антагонистов. EHEC и некоторые дру гие бактерии также продуцируют аутоиндук тор, известный как AI3, чьё строение до сих пор не изучено. Сигнальные молекулы некоторых патогенов человека Система QS P. aeruginosa, S. aureus, V. cholerae, S. typhimurium и E. coli является предме том изучения ряда учёных по причине много численных заболеваний, возникающих по вине этих бактерий. QS P.aeruginosa изучен наиболее тщательно. P.aeruginosa может вызывать раз личные инфекции респираторного, мочевого тракта, а так же и инфекцию хронических ран или бактериемию. Существует две основные системы QS синегнойной палочки: las и rhl сис темы [61]. Эти системы состоят из регуляторов транскрипции, которые взаимодействуют с аутоиндукторами, произведёнными LasI и RhlI синтазами. LasI продуцирует 3oxoC12 HSL, который определяется Las рецептором (LasR), тогда как RhlI продуцирует C4HSL, ко торый определяется Rhl рецептором (RhlR). Las и rhl QS системы организованы в иерархи ческой манере. LasR : 3oxoC12HSL комплекс регулирует экспрессию rhl системы. Также, опре делено, что lasсистема посттрансляционно регулирует rhl систему. Это достигается через конкурентоспособное прикрепление 3oxoC12 HSL к RhlR при низкой концентрации C4HSL. Транскрипционный регулятор QscR репресси Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°4 77 В.К. Окулич, Ф.В. Плотников, А.А. Кабанова рует транскрипцию lasI и rhlI. P.aeruginosa также производит третью QS сигнальную молекулу, известную как Pseudomonas хинолонсигнал (2 гептил3гидрокси4хинолон). Точечный ана лиз показал, что несколько сотен генов нахо дятся под QS контролем у P.aeruginosa. Эти гены регулируют различные токсические факторы, такие как эластазу (lasB), LasAпротеазу (lasA), щелочную протеазу (apr). Четвёртый класс мо лекул, обнаруженных у P.aeruginosa дипептид ный пиперазин. P.aeruginosa может использо вать пиперазины для коммуникации с другими бактериями, такими как P.mirabilis, C.freundii, и E.agglomerans [60]. Дополнительные исследо вания покажут, является ли данный класс мо лекул QS сигнальным. S.aureus патоген, ответственный за воз никновение большинства послеоперацион ных осложнений, а так же пневмоний, остро го эндокардита и гнойновоспалительных за болеваний кожи и мягких тканей. Добавоч ный регуляторный ген (agr) системы QS S. aureus и других стафилококков играет веду щую роль в регуляции факторов вирулентно сти в патогенезе стафилококковой инфекции. Agr локус состоит из P2 оперона (agrACDB) и P3 оперона, чей транскрипт кодирует ±ток син (hld), в дополнение к регуляции экспрес сии agr. В agr QSсистеме аутоиндукторный пептид (AIP) синтезирован из AgrD протеина посредством AgrBассоциированного образо вания тиолактонового кольца между сохра нённым центральным цистеином и Cконеч ной карбоксильной группой. Вероятно, что и другие протеины, кроме связанного с мемб ранной AgrB, могут быть вовлечены в мета болизм AgrD [62]. Секретированный AIP рас познаётся мембрансвязанным AgrC и вызы вает передачу фосфатной группы между AgrC и AgrA. AgrA совместно с другими про теинами, такими как регулятор транскрип ции SarA, активируют транскрипцию оперо нов P2 и P3. Система agr регулирует факторы вирулентности, такие как энтеротоксины B и C, протеазы (splA, B, D, F и V8). Интересно, что AIP, продуцированный одной из 4 различ ных Agr групп, ингибирует сигнальные моле кулы другого стафилококка, который исполь зует Agrгруппу. Ингибирование происходит посредством конку рентного связывания с AgrCрецептором. Например, AIP S. epidermidis, блокирует все Agrгруппы S. aureus, кроме четвёртой. Также недавние ис следования показали, что agr экспрессия 78 in vivo более комплексная, чем это считалось ра нее и может зависеть от нескольких факторов окружающей среды [61]. Причины развития повышенной резистентности микроорганизмов, способных формировать биоплёнки Антибактериальные химиопрепараты ве щества, избирательно угнетающие жизнедея тельность микроорганизмов. Под избиратель ным действием понимают активность только в отношении возбудителей инфекции, при сохра нении жизнеспособности клеток хозяина, и действие не на все, а на определенные роды и виды микроорганизмов и паразитов. Антибио тики эффективны в отношении живых, особен но быстрорастущих форм микроорганизмов и оказывают слабое воздействие на медленнорас тущие формы или споры. Все антибактериаль ные препараты, несмотря на различия хими ческой структуры и механизма действия, объе диняет ряд уникальных качеств. Вопервых, в отличие от большинства других лекарственных средств, мишень (рецептор) антибактериаль ных препаратов находится не в тканях челове ка, а в клетке микроорганизма. Вовторых, ак тивность препаратов не является постоянной, а снижается со временем, что обусловлено фор мированием лекарственной устойчивости (рези стентности). Резистентность неизбежное био логическое явление и предотвратить ее практи чески невозможно. Втретьих, резистентные возбудители представляют опасность не только для пациента, у которого они были выделены, но и для многих других людей, даже разделен ных временем и пространством. Поэтому борь ба с лекарственной устойчивостью в настоящее время приобрела глобальные масштабы [62]. Нарушение проникновения антибиотиков через матрикс биоплёнки Диффузию антибиотиков в матриксе био плёнки изучали методами измерения концент рации препаратов, а также визуализации бакте рицидного эффекта в толще биоплёнки. В це лом, проникновение АБ через БП не является лимитирующим фактором, кроме нескольких исключений. bлактамные антибиотики деак тивируются в поверхностных слоях значитель но быстрее, чем проникают через матрикс био плёнок, сформированных bлактамазпозитив ными K. pneumoniae. Положительно заряжен ные молекулы аминогликозидов притягивают ся к негативно заряженным полимерам мат Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°4 Инфектология: Роль микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе рикса, снижая скорость их проникновения, что даёт время бактериям выработать адаптивный стрессовый ответ. Исследования показали, что скорость проникновения аминогликозидов че рез матрикс биоплёнок P.aeruginosa значитель но снижалась изза связи с внеклеточным альги натом, однако значимо восстанавливалась при добавлении альгинатлиазы. Отмечено, что вне клеточная слизь, полученная из БП, значимо снижает активность гликопептидов, даже по от ношению к планктонным формам [63]. Гены стрессового ответа Под воздействием неблагоприятных факто ров окружающей среды, повреждения или нехват ки питательных веществ, бактерии начинают эк спрессировать гены стрессового ответа, включая некоторые sфакторы. Эти гены защищают бакте рию от действия антибиотиков, иммунной системы, токсинов. Например, сальмонелла лишённая аль тернативного sфактора оказывается значитель но более чувствительной к оксидативному стрес су. Другой sфактор – RpoS, экспрессируемый Грам() бактериями в стационарной фазе роста, был обнаружен как в биоплёнке P.aeruginosa, так и в мокроте пациентов с муковисцедозом [64]. Вариация фаз роста В то время как контроль большинства генов постепенен, изменение фазы роста происходит по механизму «всё или ничего». Способность менять фазы роста была обнаружена у многих бактерий, включая P.aeruginosa и S.aureus. Изме нение фенотипа по типу «маленьких колоний» под действием антибиотиков происходит как in vitro, так и при развитии заболевания. Интерес но, что «маленькие колонии» проявляют высо кий уровень образования биоплёнок и резис тентности к АБ. Однако, влияние способности формировать биоплёнки на изменение фаз ро ста до конца ещё не изучено [65]. Персистирующие микроорганизмы Концепция «персистеров» основывается на предположении, что антибиотики не убивают, а повреждают бактериальные клетки, что приво дит к запуску клеточного апоптоза. Развитие резистентности следует изза ингибирования запрограммированной клеточной смерти в субпопуляциях бактерий, находящихся в фазе отсутствия роста. Регуляторные механизмы ста дии персистенции до конца не описаны, однако могут состоять из генов стрессового ответа или смены фазы роста [66]. Недостаток питательных веществ Дефицит питательных веществ в толще мат рикса биоплёнок была обнаружена с помощью меченых радиоизотопами аминокислот. Как кислород, так и глюкоза концентрируются в поверхностных слоях биоплёнки, что ведёт к образованию анаэробных нишей в толще БП. Зоны активного синтеза протеинов, напри мер, зеленого флюоресцирующего пигмента, находятся в поверхностных слоях, где в дос таточном количестве есть кислород и нутри енты. Этот биологически активный слой мо жет иметь размеры от 2 мкм до 46 мкм (при культивировании с азотом и кислородом, со ответственно). Поскольку поверхностные слои БП являются метаболитически активны ми, то они должны быть подвержены воздей ствию антибиотиков. В таком случае, БП должна быть разрушена слой за слоем обыч ными АБ. Однако АБтерапия может только повредить, но не уничтожить эти клетки. В результате продолжающийся расход пита тельных веществ защищает нижележащие слои от воздействия нутриентов, тем самым ос тавляя их в резистентной стадии покоя [67]. Резистентность, как активный адаптивный процесс Изменение экспрессии генов в растущей биоплёнке приводит к скоординированному формированию особенной структуры и по вышению антимикробной толерантности. Эта гипотеза подтверждается наличием повы шенной антибиотикорезистентности у био плёнок слишком тонких, чтобы препятство вать проникновению антибиотиков к клет кам. Концепция специфического «биоплёноч ного» фенотипа интересна ещё и тем, что по имеющимся данным, экспрессия генов регу лируется межклеточными сигнальными моле кулами. Определение у бактерией пороговых концентраций сигнальных молекул приводит к активации/супрессии генов, ответственных за экспрессию факторов вирулентности, фор мирование биоплёнки, резистентность к анти биотикам [68]. Современный подход к лечению инфекций ассоциированных с возбудителями, формирующими биоплёнки Наряду с традиционным использованием антибактериальных препаратов в терапии бак териальных инфекций, на сегодняшний день целесообразно применять методы лечения, на Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°4 79 В.К. Окулич, Ф.В. Плотников, А.А. Кабанова правленные на нарушение функционирования микробных сообществ. Среди точек воздей ствия на биоплёнки можно выделить следую щие: нарушение формирования сообщества микроорганизмов за счёт препятствия к при креплению бактерий к поверхности, наруше ние функционирования биоплёнки за счёт ингибирования QS сигнализации между бак териями посредством действия так называе мых «маленьких молекул», разрушение мат рикса биоплёнки муколитиками, фермента ми. Новым направлением является изучение иммунного ответа макроорганизма на ин фекции, ассоциированные с биоплёнками. На сегодняшний день обнаружены иммуногло булины с ферментными свойствами абзимы (от английской аббревиатуры antibody enzyme) или каталитически активные антите ла, которые, в том числе, обладают способно стью разрушать матрикс биоплёнок [69]. Заключение Таким образом, современное понимание биологии существования микроорганизмов позволяет иначе рассматривать процессы, ле жащие в основе течения инфекции. Форма су ществования микроорганизмов в виде биопле нок – это выгодный способ организации пато генных, условнопатогенных прокариот при па разитировании макроорганизма. На сегодняш ний день образование биоплёнок госпитальны ми штаммами бактерий является серьезной уг розой для практического здравоохранения. В связи с этим разрабатываются новые подходы для идентификации и изучения биопленок, ре акции иммунного ответа на инфекции связан ные с биоплёнками, ведется разработка новых антибиотиков, изменение тактики антибиоти котерапии, а также поиск ингибиторов межкле точной сигнализации, ферментов и других ме тодов разрушения биоплёнок. Литература 1. Скала Л.3., Сидоренко C.B., Нехорошева А.Г. и соавт. Практические аспекты современной клинической микро биологии. Москва, 2004: 1578. 2. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Изучение цефепима в Рос сии. Антибиотики и химиотерапия. 2004; 49 (10): 3038. 3. Оболенский В.Н., Аронов Л.С., Родошан Г.В. и соавт. Антибиотикопрофилактика, антибиотикотерапия и мик робиологическая ситуация в хирургическом стационаре. Антибиотики и химиотерапия. 2004;49(10): 1319. 14. Xavier JB. Picioreanu C, Abdul Rani S et. al. Biofilmcontrol strategies based on enzymic disruption of the extracellular polymeric substance matrix – a modelling study. Microbiology.2005;151: 3817–3832. 15. Qiu D, Eisinger VM, Rowen DW et. al. ClpXP proteases positively regulate alginate overexpression and mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 2008;154:2119–2130. 4. Palmer RJ Jr, Stoodley P. Biofilms 2007: broadened horizons and new emphases. J Bacteriol. 2007; 189(22):79487960. 16. Tomaras AP, Flagler MJ, Dorsey CW et. al. Characterization of a twocomponent regulatory system from Acinetobacter baumannii that controls biofilm formation and cellular morphology. Microbiology.2008;154: 3398–3409. 5. Davey ME, O’Toole GA. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000; 64(4): 847867. 17. Pace JL, Rupp ME, Finch RG. Biofilms, Infection, and Antimicrobial Therapy. Boca Raton: Taylor & Francis Group. 2006:495. 6. Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms Clinical Microbiology Reviews. 2002; 15(2):167193. 18. Moons P, Michiels CW, Aertsen A. Bacterial interactions in biofilms. Crit. Rev. Microbiol. 2009; 35(3):157–168. 7. Stewart PS, Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in bioыlms. Lancet. 2001; 358: 135–8. 19. Hunter RC, Adam PH, James JD et. al. Mapping the speciation of iron in Pseudomonas aeruginosa biofilms using scanning transmission Xray microscopy. Environ. Sci.Technol. 2008;42(23):8766–8772. 8. Mah TFC, OToole GA. Mechanisms of bioыlm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 2001;9:34–9. 9. Blango MG, Mulvey MA. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54(5):855–1863. 10. Darouiche RO. Deviceassociated infections: a macroproblem that starts with microadherence. Clin. Infect. Dis. 2001; 33(9):1567–1572. 11. Manos J. Transcriptome analyses and biofilmforming characteristics of a clonal Pseudomonas aeruginosa from the cystic fibrosis lung. J. of Med. Microb.2008; 57:1454–1465. 12. Mohamed JA, Huang DB. Biofilm formation by enterococci. J. of Med. Microb. 2007;56:1581–1588. 13. Moons P. Bacterial interactions in biofilms. Crit. Rev. Microbiol.2009; 35(3): 157–168. 80 20. Hassett DJ, Mark DS, Michael JS et. al. Pseudomonas aeruginosa hypoxic or anaerobic biofilm infections within cystic fibrosis airways. Trends. Microbiol.2009;17(3):130–138. 21. Jian L, Lomovskaya O. Bacterial Resistance to Antimicrobials: Mechanisms, Genetics, Medical Practice and Public Healt. Biot. Let.2002; 24(10): 801–805. 22. Saxena IM, Kudlicka K, Okada K et. al. Charsequence of A. xylinum that is the core region of the acterization of genes on the cellulosesynthesizing operon (acs operon) of Acetobacter xylinum: implications for cellulose crystallization. J. Bacteriol. 1994;176: 57355752. 23. Caiazza NC, O’toole А. Sadb is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by pseudomonas aeruginosa pa14. J. of Bacteriology. 2004;186(14): 44764485. Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°4 Инфектология: Роль микробных биоплёнок в патогенезе инфекционных процессов на современном этапе 24. Gotz F. Staphylococcus and biofilms. Mol. Microbiol. 2002; 43: 1367–1378. 25. MairaLitran T, Kropec A, Abeygunawardana C et. al. Immunochemical properties of the staphylococcal polyN acetylglucosamine surface polysaccharide. Infect. Immun. 200; 270: 4433–40. 26. Jeferson KK, Pier DB, Goldmann DA. et. al. Te teicoplaninassociated locus regulator (TcaR) and the intercellular adhesion locus regulator (IcaR) are transcriptional inhibitors of the ica locus in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 2004;186: 2449–56. 27. Tormo MA, Marti M, Valle J et. al. SarA is an essential positive regulator of Staphylococcus epidermidis bioflm development. J. Bacteriol. 2005;187:2348–56. 28. Wozniak DJ, Wyckof TJ, Starkey M et. al. Alginate is not a signifcant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa bioflms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003;100: 7907–12. 29. Friedman L, Kolter R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 bioflms. Mol. Microbiol. 2004; 51: 675–90. 44. Klemm P, Hjerrild L, Gjermansen M et. al. Structure function analysis of the selfrecognizing Antigen 43 autotransporter protein from Escherichia coli. Mol. Microbiol. 2004; 51: 283–296. 45. Branda SS, Chu F, Kearns DB et. al. A major protein component of the Bacillus subtilis bioflm matrix. Mol. Microbiol.2006; 59: 1229–1238. 46. Chu F, Kearns DB, Randa SS et. al. Targets of the master regulator of bioflm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 2006; 59: 1216–1228. 47. Serrano M, Zilhao R, Ricca E et. al. A Bacillus subtilis secreted protein with a role in endospore coat assembly and function. J. Bacteriol. 1999; 181: 3632–3643. 48. Tielker D, Hacker S, Loris R et. al. Pseudomonas aeruginosa lectin LecB is located in the outer membrane and is involved in bioflm formation. Microbiology.2005;151:1313–1323. 49. Diggle SP, Stacey RE, Dodd C et. al. Te galactophilic lectin, LecA, contributes to bioflm development in Pseudomonas aeruginosa. Environ. Microbiol. 2006; 8:1095–1104. 50. Lasa I, Penadйs. Bap, a family of surface proteins involved in bioflm formation. Res. Microbiol. 2005;157: 99–107. 30. Vasseur P, ValletGely I, Soscia C et. al. Te pel genes of the Pseudomonas aeruginosa PAK strain are involved at early and late stages of bioflm formation. Microbiology. 2005;15: 985– 97. 51. Cucarella C, Solano C, Valle J et. al. Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in bioflm formation. J. Bacteriol. 2001;183: 2888–2896. 31. Matsukawa M, Greenberg EP. Putative exopolysaccharide synthesis genes infuence Pseudomonas aeruginosa bioflm development J. Bacteriol. 2004; 186:4449–4456. 52. Patti JM, Allen BL, McGavin MJ et. al. MSCRAMM mediated adherence of microorganisms to host tissues. Annu. Rev. Microbiol. 1994;48: 585–617. 32. Klausen M, Heydorn A, Ragas P et. al. Bioflm formation by Pseudomonas aeruginosa wildtype, fagella, and type IV pili mutants. Mol. Microbiol. 2003;48:1511–1524. 53. Dubnau D. DNA uptake in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 1999; 53: 217–244. 33. Yamada M, Ikegami A, Kuramitsu HK. Synergistic bioflm formation by Treponema denticola and Porphyromonas gingivalis. FEMS Microbiol. Lett. 2005: 250; 271–277. 34. Giltner CL, van Schaik EJ, Audette GF et. al. Te Pseudomonas aeruginosa type IV pilin receptor binding domain functions as an adhesin for both biotic and abiotic surfaces. Mol. Microbiol. 2006;59:1083–1096. 35. Van Schaik EJ, Giltner CL, Audette GF et. al. DNA Binding, a novel function of Pseudomonas aeruginosa type IV pili. J. Bacteriol. 2005;187:1455–1464. 54. Steinmoen H, Knutsen E, Hеvarstein LS. Induction of natural competence in Streptococcus pneumoniae triggers lysis and DNA release from a subfraction of the cell population. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 7681–7686. 55. Lorenz MG, Wackernagel W. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol. Rev.1994; 58: 563–602. 56. Palmen R, Hellingwerf KJ. Acinetobacter calcoaceticus liberates chromosomal DNA during induction of competence by cell lysis. Curr. Microbiol.1995; 30: 7–10. 36. Hahn E, Wild P, Hermanns U et. al. Exploring the 3D molecular architecture of Escherichia coli type 1 pili. J. Mol. Biol. 2002; 323:845–857. 57. Dillard JP. A variable genetic island specifc for Neisseria gonorrhoeae is involved in providing DNA for natural transformation and is found more often in disseminated infection isolates. Mol. Microbiol. 2001; 41: 263–77. 37. Nemoto K, Hirota K, Murakami K et. al. Efect of Varidase (streptodornase) on bioflm formed by Pseudomonas aeruginosa. Chemotherapy. 2003;49:121–125. 58. Stewart GJ, Carlson CA, Ingraham JL. Evidence for an active role of donor cells in natural transformation of Pseudomonas stutzeri. J. Bacteriol. 1983;156: 30–35. 38. Pratt LA, Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli bioflm formation, roles of fagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol. Microbiol. 1998; 30: 285–293. 59. AllesenHolm M, Barken B, Yang L. A characterization of DNArelease in Pseudomonas aeruginosa cultures and bioflms. Mol. Microbiol. 2006; 59:1114–1128. 39. Reisner A, Haagensen JA, Schembri MA et. al. Development and maturation of Escherichia coli K12 bioflms. Mol. Microbiol. 2003;48: 933–946. 60. Popat R, Crusz SA, Messina M. Quorumsensing and cheating in bacterial biofilms. The Royal Society 2012; Vol. 279 (1748): 476571. 40. Zogaj X, Bokranz W, Nimtz M et. al. Production of cellulose and curli fmbriae by members of the family Enterobacteriaceae isolated from the human gastrointestinal tract. Infect. Immun.2003;71: 4151–4158. 61. Costa JC, Espeschit Ide F, Pieri F. Increased production of biofilms by Escherichia coli in the presence of enrofloxacin. Veterinary Microbiology 2012; Vol. 160 (34): 48890. 41. PrigentCombaret C, Prensier G, Le Ti TT et. al. Developmental pathway for bioflm formation in curli producing Escherichia coli strains, role of fagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2000; 2: 450–464. 42. Kader A, Simm R, Gerstel U et. al. Hierarchical involvement of various GGDEF domain proteins in rdar morphotype development of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Mol. Microbiol. 2006; 60: 602–616. 43. Austin JW, Sanders G, Kay WW et. al. Tin aggregative fmbriae enhance Salmonella enteritidis bioflm formation. FEMS Microbiol. Lett. 1998; 162: 295–301. 62. Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Современная антимик робная химиотерапия. Руководство для врачей, 2002: 432 с. 63. Shanahan CA, Strobel SA. The bacterial second messenger cdiGMP: probing interactions with protein and RNA binding partners using cyclic dinucleotide analogs. Org. Biomol. Chem. 2012; Vol. 10 (46): 911329. 64. Whiteley M, Bangera MG, Bumgarner RE. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms. 2001; 413: 860–864. 65. Massey RC, Buckling A, Peacock SJ. Phenotypic switching of antibiotic resistance circumvents permanent costs in Staphylococcus aureus. Curr. Biol. 2001; 11:1810–1814. Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°4 81 В.К. Окулич, Ф.В. Плотников, А.А. Кабанова 66. Lewis K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 2001; 45: 999–1007. 67. Zambrano MM, Kolter R. GASPing for life in stationary phase. Cell86. 1996: 181–184. 68. Smith RS, Iglewski BH. P. aeruginosa quorumsensing systems and virulence. Curr. Opin. Microbiol. 2003;6:56–60. 69. Плотников Ф.В., Окулич В.К., Сенькович С.А., Кабанова А.А. Оценка способности иммуноглобули нов пациентов с хирургической инфекцией к разру шению экзополисахаридного матрикса биопленок. Современные проблемы инфекционной патологии человека. Минск. 2012:.294297. Сведения об авторах: Окулич Виталий Константинович 8 доцент кафедры клинической микробиологии УО ВГМУ. г. Витебск, ул Короткевича д20 кв 122 Тел. д. 8 (0212) 436068, Тел. МТС +375297103489, vokul@mail.ru Поступила 12.10.2012 г. 82 Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°4