Диагностика наследственной предрасположенности к развитию

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННОЙ
ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ
амилоидоза У ПАЦИЕНТОВ
С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
Инструкция по применению
Минск
2011
1
Содержание
Учреждения-разработчики:
УО «Белорусский государственный медицинский университет»1
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»2
Авторы:
А.К. Тушина1,
канд. мед. наук К.А. Чиж1,
д-р мед. наук, профессор Н.Ф. Сорока1,
канд. биол. наук Н.Г. Даниленко2,
канд. биол. наук Л.Н. Сивицкая2
Диагностика наследственной предрасположенности
к развитию амилоидоза у пациентов
с ревматоидным артритом.................................................................................... 4
Приложение 1.
Обоснование целесообразности
практического использования........................................................................... 13
Приложение 2.
Отчет о предварительном клиническом
испытании нового способа.................................................................................. 15
Тушина, А.К.
Диагностика наследственной предрасположенности к развитию амилоидоза у пациентов с ревматоидным артритом :
инструкция по применению / А.К. Тушина [и др.]. – Минск,
2011. – 16 с.
2
3
Определение связи генотипа с риском развития амилоидоза у пациентов с ревматоидным артритом в Республике Беларусь ранее не
проводилось. Поэтому данная инструкция разработана с целью информирования врачей-ревматологов Республики Беларусь о возможности определения генетической предрасположенности к развитию
вторичного амилоидоза при ревматоидном артрите.
Перечень необходимого оборудования, реактивов
Перечень необходимого лабораторного оборудования
Программируемый термостат (амплификатор), мини-центрифуга
(вортекс), холодильник с морозильной камерой, прибор для горизонтального электрофореза ДНК-фрагментов в агарозном геле, прибор
для вертикального электрофореза ДНК-фрагментов в полиакриламидном геле, СВЧ-печь или водяная баня, источник питания, аппарат для
визуализации электрофоретических спектров в ультрафиолете (трансиллюминатор), цифровая камера для съемки, микропипетки на разные
объемы с одноразовыми сменными наконечниками (до 10, 200, 1000
мкл), пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл и ПЦР-пробирки объемом
0,2 мл, штативы для пробирок, стеклянная химическая посуда.
Биологический материал
Метод ДНК-диагностики мутаций гена SAA1 основан на выделении микроколичеств ДНК из лейкоцитов периферической крови и последующем ПЦР-ПДРФ анализе. Для проведения анализа достаточно
50 мкл периферической крови, взятой из пальца пациента.
Реактивы:
• 10-кратный буфер для ПЦР (состав: 750 ммоль/л трис-HCl pH 8,8,
200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% Тритон X-100, 10 моль/л. Тартразин
и 5% Фикол 400);
• раствор 25мМ MgCl2;
• смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ);
• ДНК-полимераза Taq;
• две пары специфических праймеров (последовательность праймеров приведена в табл. 1);
• рестриктазы BclI и BanI и соответствующий 10-кратный буфер для
рестрикции (Y+/Tango);
• 40% раствор акриламида и бис-акриламида в соотношении 19:1;
• 20% раствор персульфата аммония (ПСА);
• темед как инициатор полимеризации;
• маркеры молекулярного веса pUC19/MspI или 100 п.н. + 1,5 тыс.
п.н. (НПО «Fermentas», Вильнюс);
4
• раствор краски бромфеноловый синий для нанесения образцов;
• 10-кратный раствор трис-боратного буфера;
• бидистиллированная деионизированная вода.
Таблица 1
Последовательности праймеров
к полиморфным участкам гена SAA1
Полиморфизм
-13Т/С
2995С/Т,
3010С/Т
Прямой праймер, 5`-3`
Aca tct tgt tcc ctc agg
ttg
Gcc aat tac atc ggc ctc
ag
Обратный праймер, 5`-3`
Gct gta gct gag ctg cgg
Tgg cca aag aat ctc tgg at
Рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов гена
SAA1
Материалы и оборудование: программируемый термостат, миницентрифуга, микропипетки с одноразовыми сменными наконечниками, пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл и пробирки для ПЦР объемом
0,2 мл.
Реактивы: рестриктазы AciI, BanI и BclI и соответствующий 10кратный буфер для рестрикции, бидистиллированная деионизированная вода.
Элекрофоретическое разделение рестриктных фрагментов
Материалы и оборудование: камера для электрофореза, набор
стекол, спейсеров и гребенок для электрофореза, источник питания,
микропипетки с одноразовыми сменными наконечниками, химическая посуда.
Реактивы: 40% раствор акриламида и бис-акриламида в соотношении 1:19, 20% ПСА, темед как инициатор полимеризации, маркер молекулярного веса pUC19/MspI или 100 п.н. + 1,5 тыс. п.н. (НПО
«Fermentas», Вильнюс), раствор краски бромфеноловый синий для нанесения образцов, 10-кратный раствор трис-боратного буфера.
Визуализация рестриктных фрагментов в УФ-свете
Материалы и оборудование: трансиллюминатор, цифровая камера для съемки, емкость для окрашивания, микропипетки с одноразовыми сменными наконечниками.
Реактивы: раствор бромистого этидия (0,0001%).
5
Методика определения полиморфных аллелей гена SAA1
Проведение полимеразной цепной реакции для идентификации
2995С/Т и 3010С/Т мутаций гена SAA1
1. Приготовить амплификационную смесь из расчета 15 мкл на один
образец ДНК. Смесь должна содержать конечные концентрации:
10–20 нг геномной ДНК, однократный буфер для амплификации,
50 нмоль MgCl2, 2 нмоль каждого дезоксинуклеотидтрифосфата
(дНТФ), 2,5 единицы ДНК-полимеразы Taq (НПО «Ферментас»,
Вильнюс), по 10 пмоль каждого праймера. Амплификационная
смесь готовится в пробирке Eppendorf (1,5 мл).
2. В пробирки для ПЦР внести по 14 мкл амплификационной смеси и 1 мкл образца ДНК. Пробирки поместить в амплификатор с
заданной программой: денатурация 94 °С – 5 мин [94 °С – 1 мин,
отжиг 62 °С – 1 мин, синтез 72 °С – 1 мин ] × 30 циклов, досинтез 72 °С – 7 мин. В ходе ПЦР синтезируется фрагмент длиной
518 п.н.
3. По окончании ПЦР пробирки поместить в холодильник (4 °С).
Проведение полимеразной цепной реакции для идентификации
-13Т/С мутации гена SAA1
Полимеразная цепная реакция для идентификации -13Т/С мутации выполняется аналогичным образом, но с соответствующими праймерами и программой: денатурация 94 °С – 5 мин, [94 °С – 45 с, отжиг
60 °С – 60 с, синтез 72 °С – 60 с] × 35 циклов, досинтез 72 °С – 7 мин.
В ходе ПЦР синтезируется фрагмент длиной 229 п.н. По окончании
ПЦР пробирки поместить в холодильник (4 °С).
Проведение рестрикционного анализа для идентификации
2995С/Т и 3010С/Т мутаций гена SAA1
1. Приготовить реакционную смесь из расчета 3 мкл на образец амплифицированного фрагмента ДНК (518 п. н.). В объеме 3 мкл
смесь должна содержать:
• для определения 2995С/Т аллелей – 0,3 единицы рестриктазы
BanI, однократного буфера (НПО «Fermentas», Вильнюс);
• для определения 3010С/Т аллелей – 0,3 единицы рестриктазы
BclI, однократного буфера (НПО «Fermentas», Вильнюс).
2. Добавить по 3 мкл реакционной смеси в образцы ДНК после проведения ПЦР. Тщательно перемешать и отцентрифугировать на
микроцентрифуге.
3. Поместить пробирки в термостат с оптимальной температурой для
работы рестриктаз BanI, а также BclI – 37 °С. Выдержать пробы в
течение 5–12 часов.
6
Проведение рестрикционного анализа для идентификации
-13Т/С мутации
Рестрикционный анализ на наличие -13Т/С выполняется аналогично с использованием рестриктазы AciI (НПО «Fermentas», Вильнюс). Пробы выдерживаются в термостате при 37 °С в течение 5–12
часов.
После окончания рестрикции пробы поместить в холодильник.
Проведение элекрофоретического разделения рестриктных
фрагментов
Разделение BanI-фрагментов для идентификации 2995С/Т полиморфных аллелей следует проводить в 6% полиакриламидном геле в
однократном трис-боратном буфере при напряжении 1В/см в течение
5 часов.
Схематическое изображение ПДРФ-анализа полиморфного локуса 2995С/Т гена SAA1 показано на рис. 1.
Рис. 1. Схематическое изображение пдрф-анализа полиморфного
локуса 2995С/Т гена SAA1
Основными фрагментами для генотипирования являются 72, 244
и 316 п.н. Все возможные комбинации длин рестриктных фрагментов
после обработки рестриктазой BanI и их соответствие генотипам представлены в табл. 2.
Таблица 2
Полиморфизм гена SAA1
по точечной замене 2995С/Т
Длина фрагментов, п.н.
244 + 177 + 72 + 25
316 + 244 + 177 + 72 + 25
316 + 177 + 25
Генотип
СС
СТ
ТТ
7
Возможные варианты длин рестриктных фрагментов после обработки рестриктазой AciI и их соответствие генотипам представлены в
табл. 4.
Указаны размеры фрагментов рестрикции, слева – маркер длин 1,5 + 100 п.н.,
снизу – генотипы
Рис. 3. Схематическое изображение пдрф-анализа полиморфного
локуса -13Т/С гена SAA1
Рис. 2. Электрофореграмма
BanI фрагментов 2995С/Т локуса
Детекцию результатов электрофоретического разделения фрагментов для идентификации 3010Т/С полиморфных аллелей следует осуществлять в 2% агарозном геле. В случае однонуклеотидной
замены в положении 3010 гена SAA1 рестриктаза BclI разрезает
амплифицированный фрагмент (518 п.н.) на 427 и 91 п.н. (рис. 2).
Возможные варианты длин рестриктных фрагментов после обработки рестриктазой и их соответствие генотипам представлены в
табл. 3.
Таблица 4
Полиморфизм гена SAA1 по точечной замене -13T/C
Длина фрагментов, п.н.
212 + 17
212 + 190 + 22 + 17
190 + 22 + 17
Генотип
ТТ
ТC
CC
Таблица 3
Полиморфизм гена SAA1
по точечной замене 3010С/Т
Длина фрагментов, п.н.
518
518 + 427 + 91
427 + 91
Генотип
СС
СТ
ТТ
Детекцию результатов электрофоретического разделения фрагментов для идентификации -13С/Т полиморфных аллелей следует
осуществлять в 8% полиакриламидном геле.
Схематическое изображение ПДРФ-анализа полиморфного локуса -13Т/С гена SAA1 показано на рис. 3.
8
Указаны размеры фрагментов рестрикции, слева – маркер длин 1,5 + 50 п.н.,
внизу – генотипы
Рис. 4. Электрофореграмма AciI фрагментов -13T/C локуса
9
Фрагменты длиной 17 и 22 п.н. в геле не обнаруживаются из-за
низкой молекулярной массы и суммарного заряда. Генотипы устанавливаются по тяжелым фрагментам – 212 и 190 п.н. (рис. 4).
Возможные генотипы по сочетанию аллельного полиморфизма в
позициях 2995 и 3010 гена SAA1 представлены в табл. 5.
Таблица 5
Возможные генотипы по сочетанию аллельного полиморфизма
в позициях 2995 и 3010 гена SAA1
Генотипы по SAA1
2995
ТТ
ТС
ТС
СС
СС
СС
3010
СС
СТ
СС
ТТ
ТС
СС
α, β, γ
α/α
α/β
α/γ
β/β
β/γ
γ/γ
Перечень возможных осложнений или ошибок при определении
мутаций и пути их устранения
Учитывая крайне высокую чувствительность метода ПЦР, необходимо избегать загрязнения исследуемых образцов инородным биологическим материалом. Во избежание диагностических ошибок рекомендуется соблюдать следующие правила:
• использовать исключительно химически чистую и стерильную посуду;
• после работы с каждым объектом используемые поверхности лабораторных столов протирать этанолом;
• использовать одноразовые пробирки и наконечники для микропипеток;
• стерилизовать используемые растворы (если допустима их стерилизация) и хранить их разлитыми в стерильную посуду небольшими порциями, при возможности в замороженном состоянии;
• перед открыванием крышек пробирок осаждать растворы со стенок центрифугированием;
• в каждую серию проб включать отрицательный контроль – пробирку со всеми применяемыми растворами, но без ДНК;
10
• при выделении ДНК и постановке ПЦР лицо сотрудника должно
быть защищено экраном или маской, либо работа может выполняться в ламинаре; работать следует в одноразовых перчатках, которые в случае попадания на них материала меняют.
В молекулярно-генетической лаборатории необходимо выделять
несколько зон:
• зона выделения ДНК – в ней осуществляют все этапы обработки
биологического материала и выделения геномной ДНК;
• зона проведения ПЦР – в ней выполняется внесение в ПЦРпробирки очищенной ДНК и всех компонентов амплификационной смеси. В зонах экстрагирования ДНК и проведения ПЦР
(первой и второй) не следует открывать пробирки с продуктами
амплификации, эту процедуру осуществляют в изолированной
третьей зоне;
• зона анализа продуктов ПЦР – в ней проводят рестрикцию, подготовку образцов для внесения в гель, электрофоретическое разделение ПЦР-ПДРФ продуктов и регистрацию результатов.
Показания к применению
Наличие у пациентов ревматоидного артрита.
Противопоказания
Противопоказаний для использования описываемых методов исследования не установлено.
Область применения и уровень внедрения
Инструкция предназначена для организации ДНК-типирования
больных с ревматоидным артритом по гену белка сывороточного
амилоида А (SAA1). Определение у пациентов генотипа α/α (полиморфные локусы 2995С/Т и 3010С/Т гена SAA1) является генетическим фактором риска развития амилоидоза как осложнения
ревматоидного артрита в белорусской популяции. При разработке
и внедрении способа оценки риска прогрессирования патологии почек при ревматических заболеваниях данные по аллельному состоянию SAA1 гена у пациентов являются объективной информацией,
позволяющей рассчитать увеличение риска развития амилоидоза в
зависимости от генетической предрасположенности. В настоящее
время возможность выполнения данного анализа в Республике Беларусь существует на базе ГНУ «Институт генетики и цитологии
НАН Беларуси» в качестве платной медицинской услуги. Ориен11
тировочная стоимость одного исследование (требуется однократное
выполнение у любого пациента с ревматоидным артритом в течение
всей жизни) составляет приблизительно 30 000 белорусских рублей.
Приложение 1
Обоснование целесообразности
практического использования
В настоящее время достигнуты значительные успехи в понимании
механизмов патогенеза ревматоидного артрита (РА) и разработке методов его лечения. За счет этого заметно увеличилась продолжительность жизни пациентов с данной патологией. Однако до сегодняшнего
дня наиболее угрожающим и неблагоприятным осложнением РА является вторичный, или АА (Acquired Amyloidosis) амилоидоз. По оценкам различных авторов, амилоидоз развивается у 10–15% пациентов с
РА. Этот патологический процесс практически не поддается терапевтическому контролю и неуклонно ведет к прогрессивному снижению
функции почек. Поэтому на первый план решения проблемы развития
вторичного амилоидоза выходит разработка методов профилактики
возникновения данного осложнения, а также выделения возможных
факторов риска его развития. До настоящего времени точная причина
развития амилоидоза при ревматоидном артрите неизвестна. Было выдвинуто предположение, что развитие вторичного амилоидоза в значительной степени обусловлено особенностями генотипа.
Механизм образования и отложения амилоида на данный момент
до конца не изучен. Известно, что на коротком плече 11 хромосомы
кодируется белок-предшественник амилоидного протеина А (Serum
Amyloid A – SAA) – острофазовый белок, близкий по своим свойствам
к С-реактивному белку и продуцируемый печенью в ответ на воспаление, при котором его концентрация в крови многократно повышается.
В гене SAA1 описан ряд полиморфизмов, однако особое внимание исследователей приковано к двум однонуклеотидным заменам в третьем
экзоне этого гена – 2995С/Т и 3010С/Т. Комбинации аллелей этих полиморфных вариантов определяют три SAA1 гаплотипа – α, b и g. Группа японских исследователей во главе с Baba и соавт. (1995) выявила
ассоциацию генотипа γ/γ с риском развития амилоидоза. Было показано, что японские пациенты с РА, являющиеся носителями генотипа
γ/γ, имеют более высокий риск развития у них амилоидоза по сравнению с пациентами, не несущими в своем генотипе γ-аллеля. Следовательно, генотип γ/γ у японцев является генетическим фактором риска
развития амилоидоза. Кроме того, выявлена особая закономерность –
продолжительность РА у больного до постановки дополнительного
диагноза «амилоидоз» уменьшается с увеличением числа γ-аллелей по
гену SAA1.
12
13
В отличие от данных, полученных японскими исследователями, в
работе Faulkers и соавт. (1994) при анализе небольшой выборки здоровых европейцев (21 человек) не обнаружено ни одного носителя
аллеля γ; частоты аллелей α и β распределились как 62% и 38% соответственно. А в исследовании Booth и соавт. (1998) частота встречаемости аллеля γ в европейской популяции составила лишь 5,3%.
Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что разные изоформы белка SAA1, а именно α и γ, являются генетическими факторами риска развития амилоидоза в разных этнических группах: у
япон­цев – SAAγ, а в немногочисленных исследованиях в европейской
популяции – SAAα.
Описанный недавно однонуклеотидный полиморфизм в 5’фланкирующей области гена SAA1 (-13Т/С) продемонстрировал положительную ассоциацию с развитием АА-амилоидоза у больных
РА как у японских, так и у некоторых групп европейских пациентов.
Фактором риска в случае данного полиморфизма считают носительство аллеля -13Т. В работе Yamada и соавт. (2003) доля этого аллеля
у японцев, страдающих РА с амилоидозом и без него, составила 70,8
и 52,1% соответственно; у американцев (европейского происхождения) – 53,6% (группа РА) и 19,6% (группа РА + амилоидоз). Некоторые исследователи предполагают, что именно -13Т – основополагающий генетический фактор развития амилоидоза у человека, а разница
во встречаемости АА-амилоидоза в разных этнических группах является как следствием различий в частотах -13Т аллеля, так и, отчасти,
гаплотипов по полиморфизмам 2995С/Т и 3010С/Т.
14
Приложение 2
Отчет о предварительном клиническом
испытании нового способа
Нами было обследовано 104 пациента с ревматоидным артритом
(РА), разделенные на две группы. Отбор пациентов и взятие образцов
крови осуществляли на базе отделения ревматологии УЗ «9-я ГКБ» г.
Минска. Первую группу составили 45 пациентов с РА, осложненным
амилоидозом почек. Во вторую группу были включены 59 пациентов
без наличия данного осложнения. Пациенты обеих групп были сопоставимы по возрасту, полу и длительности основного заболевания. Во
всех случаях диагноз «ревматоидный артрит» был установлен на основании критериев ARA (1987). Диагноз «амилоидоза почек у пациентов
первой группы был подтвержден морфологически. Методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом из
крови исследуемых лиц после выделения нативной ДНК с последующей амплификацией было проведено генотипирование на носительство генотипов риска гена SAA1 по двум полиморфным сайтам гена
SAA1: 2995С/Т и 3010С/Т. В результате проведенного исследования
определены генотипы пациентов по двум полиморфным локусам гена
SAA1. Сравнение опытных групп проводилось методом хи-квадрат
(χ2) по значениям частот генотипов, а также по частотам двух аллелей.
Обнаружены статистически достоверные различия между выборкой
больных РА и больных РА, отягощенным амилоидозом. Наибольшее
значение χ2 получено при сравнении этих выборок по генотипу α/α –
χ2 = 39,97; p < 0,00001. При вычислении показателя «отношение шансов» (ОШ) по числу носителей генотипа α/α получено значение ОШ =
45,26; ДИ 9,9062–206,8153; то есть риск развития амилоидоза у пациентов с РА, являющихся носителями генотипа α/α, возрастает в 45 раз.
Обнаружение генетической предрасположенности к развитию амилоидоза у больного с РА позволяет провести соответствующие профилактические мероприятия (более агрессивная терапия РА, тщательный
контроль общего анализа мочи с целью выявления протеинурии, контроль показателей функции почек в биохимическом анализе крови).
Результаты статистического анализа говорят в пользу того, что аллель
α, а особенно генотип α/α (полиморфные локусы 2995С/Т и 3010С/Т)
является генетическим фактором риска развития амилоидоза почек
как осложнения ревматоидного артрита в исследуемой популяции белорусских пациентов.
15
Производственно-практическое издание
Диагностика наследственной предрасположенности к развитию
амилоидоза у пациентов с ревматоидным артритом
Инструкция по применению
Подписано в печать 00.00.2011. Формат 84х108 1/32.
Бумага офсетная. Ризография.
Усл. печ. л. Уч.-изд. л. Тираж экз.
16