МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА ПЕРВИЧНЫХ ПОВРЕЖДЕНИ ДНК, ВЫЯВЛЯЕМЫХ В АЛЬФА-ТЕСТЕ A. Жук 1,2, A. Ширяева 1, Ю. Андрейчук 1, E. Степченкова 1,2, С. Инге-Вечтомов 1,2 1 2 Санкт-Петербургский государственный университет, Россия Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Н.И. Вавилова, РАН, Россия Большинство наследуемых изменений генетического материала является следствием ошибочной репарации спонтанных и индуцированных первичных повреждений ДНК. Показано, что первичные повреждения ДНК, которые закрепились в виде генных или геномных мутаций, приводят к изменению фенотипических признаков клеток, что может служить причиной рака и наследственных заболеваний [1]. Тем не менее, мало известно о том, могут ли первичных повреждений ДНК влиять на фенотип, еще до их превращения в генные и геномные мутации. В этой работе мы изучили фенотипическое проявление первичных повреждений ДНК и их судьбу после репарации с использованием альфа-теста. Материалы и методы Альфа-тест основан на «незаконном» спариваний α на α гетероталличных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Гаплоидные штаммы дрожжей имеют один из двух типов спаривания α или а. В норме только гаплойдные клетки противоположных типов спаривания могут скрещиваться, образуются диплоидные клетки [2]. Клеточный тип гаплойдных клеток (a или α) контролируется локусом типа спаривания MAT, имеющим два идиоморфа МАТа и МАТα, расположенным в хромосоме III [2]. Помимо локуса МАТ в хромосоме III расположены еще два локуса HMRа и HMLα, содержащих неэкспрессируемую генетическую информацию о типе спаривания а и α соответственно [2]. При определенных условиях может происходить однонаправленная конверсия между одной из молчащих кассет и локусом МАТ, в результате чего происходит переключение типа спаривания [2]. У гетероталличных дрожжей переключение типов спаривания происходит с очень низкой частотой (10-6), которая повышается при воздействии генотоксических агентов, благодаря нарушению экспрессии локуса MAT. При нарушении экспрессии МАТα гетероталличные гаплоидные клетки переключают тип спаривания α →а, и могут скрещиваться с клетками α типа спаривания. В альфа-тесте используют два штамм одинакового типа спаривания α с комплементарными селективными маркерами. Один из штаммов подвергают генотоксическому воздействию и скрещивают со вторым на селективной среде, где вырастают только гибриды, не родительские штаммы [3]. Согласно нашей модели в клетках, подвергшихся генотоксическому воздействию, первичные повреждения ДНК нарушают экспрессию локуса MATα, что приводит к временному или постоянному переключение типа спаривания α →а, и делает возможным незаконное скрещивание α× α. После скрещивания значительная часть первичных повреждений устраняется системами репарации безошибочно. Однако за время своего существования эти первичные повреждения успевают повлиять на фенотип дрожжевых клеток, инициируя временное переключение типа спаривания α → а. Другая часть первичных повреждений в ходе репарации закрепляется в виде наследуемых изменений генетического материала: мутаций или хромосомных аберраций, а также провоцирует конверсию и рекомбинацию [3]. Результаты и обсуждение Для того чтобы определить молекулярную природу первичных повреждений ДНК, способных проявляться фенотипически, мы исследовали действие эталонных мутагенов в комбинации с дефектами систем репарации в альфа-тесте. Для изучения возможности фенотипического проявления двунитевых разрывов мы оценили эффект камптотецина в альфа-тесте. Мы показали, что двунитевые разрывы, индуцированные камптотецином, приводят к значительному повышению частоты наследуемых и ненаследуемых изменений в альфа-тесте (Рис 1). Для определения возможности фенотипического проявления неспаренностей оснований изучили эффект инактивации репарации ДНК с неспаренными основаниями (дизрупция по гену PMS1) в альфа-тесте. Неспаренности оснований повышают частоту незаконного скрещивания только за счет наследуемых генетических изменений, но не индуцируют временные повреждения (Рис 1). Возможность фенотипического проявления модификаций оснований в альфа-тесте мы изучали на примере двух аналогов оснований 6 пуриновых оснований гидроксиламинопурина (ГАП) и 8-оксогуанина (8-ОГ). ГАП в большей степени увеличивают частоту точечных мутаций примерно в 139 раз, а также частоту безошибочно устраненных первичных повреждений (Рис 1). Накопление 8-ОГ, вызванное мутацией в гене ДНК-гликозилазы (ogg1), повышает частоту временных повреждений, а из всех наследуемых изменений индуцирует только конверсию (Рис 1). Заключение На основе полученных данных, можно сделать вывод о том, что модификации оснований и двунитевые разрывы ДНК могут проявляться фенотипически в альфатесте до их устранения системами репарации и превращения в наследуемые изменения генетического материала. Неспаренности нуклеотидов в альфа-тесте в основном проявляются уже в виде наследуемых изменений. Таким образом, альфа-тест является эффективным подходом для выявления фенотипического проявления первичных повреждений различных типов при условии грамотного подбора мутагенных факторов и генетических блоков путей репарации. Acknowledgements Эта работа поддержана грантом РФФИ № 15-04-08625. References 1.Jan H., 2009. DNA Damage, Aging, and Cancer. The new England journal of medicine. 361: 1475-1485 2. Haber J. E., 2012. Mating – type genes and MAT switching in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 191(1): 33-64 3.Inge-Vechtomov S.G., Repnevskaya M.V., 1989. Phenotypic expression of primary lesions of genetic material in Saccharomyces yeast. Genome. 31: 497-502