Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Министерства здравоохранения Российской Федерации
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области «Институт медицинских клеточных технологий» На правах рукописи ДРУЙ АЛЕКСАНДР ЕВГЕНЬЕВИЧ ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ У ПАЦИЕНТОВ С НЕЙРОБЛАСТОМОЙ 14.01.12 – Онкология 14.03.10 – Клиническая лабораторная диагностика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: кандидат медицинских наук Л.Г. Фечина; доктор медицинских наук, профессор С.В. Цвиренко Екатеринбург – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………....... 5 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….... 7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………... 16 1.1. Клинические характеристики нейробластомы…………….......... 16 1.2. Стратификация больных нейробластомой на группы риска….... 17 1.3. Молекулярно-генетические факторы, не включенные в схемы стратификации……………………………………………………......... 29 1.4. Молекулярно-генетические методы, используемые для идентификации прогностических биологических маркеров ……….. 33 1.5. Выявление поражения КМ и оценка минимальной остаточной болезни при нейробластоме.................................................................... 35 1.6. Прогностическое значение выявления инициального поражения КМ и мониторинга минимальной остаточной болезни.... 41 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ........................ 45 2.1. Характеристика пациентов, включенных в исследование............ 45 2.2. Исследование генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов.... 46 2.3. Исследование прогностической значимости генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов......................................................... 57 2.4. Исследование инициального поражения КМ и оценка МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов.................... 58 2.5. Сравнение применения ПЦР-РВ и проточной цитометрии для выявления поражения КМ и оценки МОБ............................................ 61 2.6. Исследование поражения КМ и оценка МОБ с помощью молекулярного маркера, основанного на анализе метилирования геномной ДНК.......................................................................................... 63 3 2.7. Исследование прогностической значимости инициального поражения КМ и оценки МОБ у больных нейробластомой................ 64 2.8. Качественная и количественная оценка РНК, используемой для выявления поражения КМ и оценки МОБ............................................ 66 2.9. Статистическая обработка данных................................................. 71 ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ АБЕРРАЦИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ИЗМЕНЕНИЕМ КОЛИЧЕСТВА КОПИЙ ГЕНОВ ИЛИ ХРОМОСОМНЫХ РЕГИОНОВ............................................... 72 3.1. Результаты определения количества копий гена MYCN и аберраций короткого плеча хромосомы 2 ............................................. 72 3.2. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 1............................................................................................. 83 3.3. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 3............................................................................................. 92 3.4. Результаты определения аберраций хромосомы 4........................ 96 3.5. Результаты определения аберраций хромосомы 7........................ 100 3.6. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 9............................................................................................. 105 3.7. Результаты определения аберраций хромосомы 11...................... 112 3.8. Результаты определения аберраций хромосомы 12...................... 119 3.9. Результаты определения аберраций хромосомы 14...................... 124 3.10. Результаты определения аберраций хромосомы 17.................... 129 3.11. Результаты определения генетических аберраций в парах первичная опухоль-рецидив (прогрессия)............................................. 137 ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНИЦИАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА И ОЦЕНКИ МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ........................................................................................................... 140 4.1. Исследование инициального поражения КМ и оценка МОБ на 4 основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов.................... 140 4.2. Прогностическое значение выявления поражения КМ и МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов............... 151 4.3. Выявление контаминации препаратов АГСК и МОБ на момент проведения лейкафереза на основании экспрессии опухольассоциированных генов........................................................................... 157 4.4. Сравнение результатов выявления поражения КМ при помощи экспрессии опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрии............................................................................................... 159 4.5. Исследование поражения КМ и оценка МОБ на основании выявления метилированной формы гена RASSF1a и определение его прогностической значимости........................................................... 162 4.6. Сопоставление результатов выявления поражения КМ с помощью метилированной формы гена RASSF1a с определением экспрессии опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрией............................................................................................. 165 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................. 170 ВЫВОДЫ............................................................................................................ 180 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................... 182 ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ........................... 182 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................. 183 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГСК Аутологичные гемопоэтические стволовые клетки АРМС Альвеолярная рабдомиосаркома АТФ Аденозинтрифосфорная кислота БСВ Бессобытийная выживаемость ВС Величина соотношения ГН Ганглионеврома ГНБ Ганглионейробластома ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота ДЧ Диагностическая чувствительность ДЭТ Диагностическая эффективность теста кДНК Комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота КМ Костный мозг МкАт Моноклональное антитело микроРНК Малая некодирующая рибонуклеиновая кислота МОБ Минимальная остаточная болезнь мРНК Матричная рибонуклеиновая кислота НБ Нейробластома ОВ Общая выживаемость ОЛЛ Острый лимфобластный лейкоз ОМЛ Острый миелобластный лейкоз ОР Относительный риск ПК Периферическая кровь ПНЭО Примитивная нейроэктодермальная опухоль ППК Площадь под кривой ПУ Пороговый уровень ПЦОР Прогностическая ценность отрицательного результата ПЦПР Прогностическая ценность положительного результата 6 ПЦР Полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени РБ Ретинобластома РНК Рибонуклеиновая кислота Сп Специфичность ТГСК Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток ХМЛ Хронический миелолейкоз ЭРМС Эмбриональная рабдомиосаркома BHQ Гаситель флуоресценции «черная дыра» CD Кластер дифференцировки COG Группа детской онкологии, США FAM Флуоресцеин амидит FISH Флуоресцентная in situ гибридизация GPOH Общество детской онкологии и гематологии, Германия INRG Система предоперационной стратификации больных нейробластомой на группы риска INSS Международная система стадирования нейробластомы K3ЭДТА Трикалиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты miR Малая некодирующая рибонуклеиновая кислота MLPA Множественная лигазно-зависимая амплификация зондов NB2004 Схема программного лечения нейробластомы 2004 года R6G Родамин 6G RIN Показатель целостности рибонуклеиновой кислоты ROC-кривые Характеристические кривые ROX 6-карбоксил-X-родамин RTQ Гаситель флуоресценции для ПЦР в реальном времени SIOPEN VNTR Европейский исследовательский проект по нейробластоме Международного общества детской онкологии Анализ вариабельного числа тандемных повторов 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Нейробластома – наиболее часто встречающаяся у детей солидная опухоль экстракраниальной локализации. Клиническое течение заболевания и, соответственно, прогноз варьируют в широких пределах от относительно доброкачественных форм, склонных к спонтанной регрессии (у детей раннего возраста) или созреванию (у детей более старших возрастных групп) до агрессивных опухолей, характеризующихся быстрым локорегионарным распространением, ранним появлением отдаленных метастазов, плохим ответом на проводимую мультимодальную терапию и высокой частотой рецидивов [35,52]. Гетерогенность биологическими клинических форм нейробластомы обусловлена свойствами опухолевых клеток, включающих изменение количества копий отдельных генов или хромосомных регионов, мутации в онкогенах и генах-супрессорах опухолевого роста, а также аберрантную экспрессию ряда генов [10,19,32]. Клинические данные, в первую очередь, возраст и масса опухоли в организме (локальная стадия и наличие отдаленных метастазов), имеют определенное прогностическое значение [150,204]. Современные схемы стратификации больных нейробластомой на группы риска, основанные на совокупности клинических и молекулярно-биологических данных, позволяют проводить селективную риск-адаптированную терапию, однако они не дают полной возможности прогнозировать эффективность терапии, вероятность развития рецидива необходимость и исход дальнейшего заболевания поиска [54,107]. прогностических Этим продиктована маркеров, введение которых в современные схемы стратификации позволило бы более точно определять степень риска индивидуализированное у пациентов противоопухолевое с нейробластомой, лечение, эффективности и избегая избыточной токсичности. добиваясь проводить высокой 8 Диссеминация опухоли в организме значительно усугубляет течение заболевания и увеличивает риск неудачи терапии. При этом значение имеют не только визуализируемые метастатические очаги, но и пул циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови и инфильтрация ими костного мозга (КМ). Предполагается, что совокупность клеток опухоли в КМ, не выявляемая методами стандартного цитологического исследования, может иметь важное прогностическое значение [170]. Ответ опухоли на проводимую терапию является независимым прогностическим фактором при различных онкологических и гематологических заболеваниях [147,172]. Наличие остаточных опухолевых клеток в организме – минимальной остаточной болезни (МОБ) – во время проведения химиотерапии, после индукционной химиотерапии или перед проведением трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (АГСК) значимо снижает показатели выживаемости больных нейробластомой [49,76,183]. Это определяет необходимость поиска высокочувствительных методов, служащих для обнаружения оккультных опухолевых клеток как в момент диагностики нейробластомы для корректного стадирования заболевания, так и в процессе лечения для оценки наличия и кинетики МОБ. Также необходим анализ прогностической значимости полученных результатов. Степень разработанности темы исследования На сегодняшний день в схемы стратификации больных нейробластомой на группы риска включены такие молекулярно-биологические характеристики опухоли, как амплификация гена MYCN, делеция короткого плеча хромосомы 1 и длинного плеча хромосомы 11, неблагоприятная роль которых была показана в большом количестве исследований [19,54,107]. В то же время патогенетическое и прогностическое значение ряда генетических аберраций (аномалии хромосом 4,7,12,14) остается невыясненным, а литературные данные о влиянии структурных аберраций хромосом 3 и 9 на выживаемость пациентов являются противоречивыми [73,142,179]. Кроме того, отсутствуют данные об изменении 9 спектра молекулярно-генетических аномалий в ткани опухоли при развитии рецидива заболевания по сравнению с клетками первичной опухоли. Не подвергается сомнению факт ухудшения прогноза нейробластомы при наличии диссеминированной опухоли [52]. Однако способы выявления отдаленных метастазов и, в частности, поражения опухолевыми клетками костного мозга в последнее время претерпели существенные изменения. Внедрены современные (мультиспиральная томография, а методы компьютерная также визуализационной томография, сцинтиграфия с диагностики магнитно-резонансная использованием 131-I метайодбензилгуанидина). Для оценки поражения КМ в рутинной практике продолжает применяться цитологический метод, чувствительность которого невелика [170]. Вместе с тем различными исследовательскими группами предлагается использовать молекулярной биологии с и этой целью высокочувствительные иммунофенотипирование [37,170]. методы Однако стандартизованный подход к использованию данных методов для определения опухолевых клеток в КМ отсутствует. Таким образом, целью исследования является определение прогностической значимости молекулярно-генетических аберраций в клетках нейробластомы и поражения КМ, выявляемого методами молекулярной биологии. Задачи исследования 1. Изучить возможность применения полимеразной цепной реакции (ПЦР), множественной лигазно-зависимой амплификации зондов (MLPA) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для определения изменений числа копий отдельных генов и хромосомных регионов, а также проанализировать качественную сходимость результатов, полученных различными методами. 2. Установить частоту выявления и связь с клиническими характеристиками аберраций короткого плеча хромосомы 1, короткого плеча хромосомы 2 (а также гена MYCN), короткого плеча хромосомы 3, короткого плеча хромосомы 4, хромосомы 7, короткого плеча хромосомы 9, длинного плеча хромосомы 11, 10 длинного плеча хромосомы 12 (а также гена MDM2), длинного плеча хромосомы 14, длинного плеча хромосомы 17. 3. Определить прогностическое значение указанных аберраций во всей исследуемой группе пациентов, а также в подгруппах: больные младше 1 года, с локализованной опухолью, отсутствием амплификации гена MYCN. 4. Провести сравнение различных молекулярных маркеров поражения КМ и наличия МОБ на основе экспрессии опухоль-ассоциированных генов, а также оценить прогностическое значение их выявления при первичной диагностике и в ходе терапии. 5. Оценить возможность применения маркера поражения КМ на основе исследования геномной ДНК. 6. Провести сравнительный анализ методов ПЦР и проточной цитометрии для выявления поражения КМ и определения остаточных опухолевых клеток. Научная новизна Впервые установлено, что обнаружение экспрессии генов PHOX2B и TH является оптимальным тестом для оценки инициального поражения КМ и контроля МОБ (диагностическая эффективность теста (ДЭТ) 0,994 и 0,952, соответственно). Показано негативное прогностическое значение поражения КМ, выявленного с помощью анализа экспрессии генов PHOX2B и TH на момент первичной диагностики нейробластомы (снижение БСВ на 26%, ОВ – на 23%). Впервые выявлено снижение выживаемости пациентов (БСВ на 59%, ОВ – на 75%) при наличии экспрессии генов PHOX2B и TH в КМ перед процедурой афереза АГСК, несмотря на отсутствие экспрессии данных генов в аутотрансплантате. Установлена неполная качественная сходимость результатов выявления поражения КМ методами ПЦР-РВ и проточной цитометрии (78,8%). Продемонстрирована эффективность применения и прогностическое значение (снижение БСВ на 39%) метилированной формы гена RASSF1a в качестве маркера поражения КМ, основанного на исследовании геномной ДНК. 11 Получены высокие показатели качественной сходимости результатов выявления делеции короткого плеча хромосомы 1 (95%) и амплификации гена MYCN (100%) методами ПЦР, FISH и MLPA. Определено прогностическое значение генетических аберраций, клиническая значимость которых ранее оставалась неизвестной, в том числе увеличения генетического материала короткого плеча хромосомы 4, увеличения материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 и делеции короткого плеча хромосомы 9. В группе больных с прогностически благоприятными формами нейробластомы выявлены генетические аберрации, имеющие негативное прогностическое значение: увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, увеличение материала длинного и короткого плеч хромосомы 7, делеция короткого плеча хромосомы 9 и увеличение материала длинного плеча хромосомы 17. Впервые обнаружено, что при возникновении рецидива или прогрессии нейробластомы спектр выявляемых генетических аберраций в ткани первичной опухоли и в ткани рецидива (после прогрессии) может различаться, причем как в сторону приобретения новых аномалий, так и в сторону исчезновения имеющихся и нормализации кариотипа. Теоретическая и практическая значимость Показано, что методы ПЦР, FISH и MLPA могут быть использованы для выявления генетических аберраций, связанных с изменением числа копий отдельных генов или хромосомных регионов в клетках нейробластомы. При этом технология MLPA является универсальной и позволяет в условиях одной постановки определять множество аберраций в локусах, наиболее часто вовлекаемых в перестройки при нейробластоме. Выявленное негативное прогностическое значение аномалий хромосом 1, 2, 4, 7, 9, 17 позволяет использовать их для определения степени риска, в том числе, в группе с прогностически благоприятной нейробластомой, пациентам которой в ряде случаев проведение химиотерапии не показано. Обосновано комплексное использование всех трех методик для выявления прогностически-значимых 12 генетических аберраций, как при первичной верификации диагноза, так и при возникновении прогрессии или рецидива опухоли. Показано, что нормализованная величина экспрессии генов PHOX2B и TH в КМ является наиболее информативным маркером инициального поражения КМ и наличия остаточных опухолевых клеток перед проведением аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ДЭТ 0,994 и 0,952). Установлено, что для наиболее точной оценки поражения КМ необходимо дополнительное применение маркера, основанного на геномной ДНК – метилированной формы RASSF1a или проточной цитометрии. На основе технологии капиллярного электрофореза на микроструйных чипах установлен предельный уровень деградации РНК, используемой для анализа экспрессии генов (RIN=4,2). Методология и методы исследования Диссертационное исследование проведено в соответствии с мировым опытом проведения научно-исследовательских работ, в основе которого лежат принципы медицинской этики и доказательной медицины. Методология работы включала создание дизайна исследования, установление объема выборки и критериев включения и исключения пациентов, а также подбор оптимального математического аппарата для статистической обработки результатов. При осуществлении настоящего исследования были применены клинические, морфологические, инструментальные и лабораторные методы, среди которых молекулярно-генетические и цитогенетические. Положения, выносимые на защиту 1. Технология MLPA позволяет достоверно выявлять многочисленные генетические аберрации у больных нейробластомой. 2. Наличие делеций короткого плеча хромосомы 1, короткого плеча хромосомы 9, а также увеличения генетического материала короткого плеча хромосомы 2, короткого плеча хромосомы 4, длинного и короткого плеч 13 хромосомы 7 и длинного плеча хромосомы 17 связаны с неблагоприятным прогнозом нейробластомы. 3. Экспрессия генов PHOX2B и TH обладает наибольшей диагностической ценностью при выявлении поражения КМ и МОБ среди транскриптов опухольассоциированных генов (ДЭТ 0,994 и 0,952). Наличие экспрессии PHOX2B и/или TH в КМ во время инициальной диагностики ассоциировано со снижением выживаемости пациентов (БСВ на 26%, ОВ – на 23%). Выявление экспрессии данных генов в КМ пациентов перед аферезом АГСК связано с развитием посттрансплантационных рецидивов нейробластомы. 4. Выявление метилированной формы гена RASSF1a является эффективным методом выявления поражения КМ у пациентов с нейробластомой. Обнаружение метилированной формы RASSF1a в КМ при первичной диагностике связано с более низкими значениями бессобытийной выживаемости пациентов (БСВ 0,28±0,13). Внедрение в практику Определение прогностически значимых генетических аберраций в клетках нейробластомы методами ПЦР, FISH и MLPA, а также выявление поражения КМ и оценка МОБ с помощью молекулярных маркеров PHOX2B, TH, RASSF1a и проточной цитометрии успешно внедрены в практику Лаборатории молекулярной биологии Отдела детской онкологии и гематологии Областной детской клинической больницы №1 (ОДКБ№1, г. Екатеринбург) и применяются для всех больных нейробластомой. В лаборатории исследуются образцы пациентов из детских онкологических клиник Перми, Челябинска и Новосибирска. Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе на кафедре клинической лабораторной диагностики и бактериологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Степень достоверности и апробация работы 14 Для обеспечения достоверности результатов исследуемая когорта включала 122 пациента с верифицированным диагнозом нейробластома. С целью доказательной аргументации выводов данные, полученные в процессе исследования, подвергались статистической обработке с помощью программ Statistica 8.0 и Analyze-it. Основные положения диссертации были доложены на IV Съезде детских онкологов России (Москва, 2008); IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); Конференциях «Достижения в исследовании нейробластомы – 2010, 2012 и 2014» (Стокгольм, 2010, Торонто, 2012, Кёльн, 2014); IV и V Митингах по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, посвященных памяти Р.М.Горбачевой (Санкт-Петербург, 2010, 2011); 42-46 Конгрессах Международного общества детских онкологов (Бостон, 2010, Окленд, 2011, Лондон, 2012, Гонконг, 2013, Торонто, 2014); 8 Азиатском Конгрессе Международного общества детских онкологов (Сеул, 2014); 14 и 16 Российских национальных онкологических конгрессах (Москва, 2010, 2012), Европейском мультидисциплинарном онкологическом конгрессе (Стокгольм, 2011), Конференции «Современные достижения и перспективы в клиническом и фундаментальном исследовании нейробластомы» (Екатеринбург, 2013), Конференции Американского общества клинической онкологии (Чикаго, 2013) и исследования рака (Сан-Диего 2014). По материалам исследования опубликовано 30 печатных работ, из них 6 статей в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК. Личный вклад автора в получение результатов При выполнении диссертационной работы автор лично участвовал в создании ее дизайна, формировал исследуемую когорту больных, осуществлял обработку и молекулярно-генетическое исследование клинического материала, сбор, систематизацию и анализ полученных результатов и данных дополнительных методов исследования. Автором выполнены обзор мировой 15 литературы по теме диссертации, статистическая обработка результатов, формирование выводов и практических рекомендаций. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 206 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов. Библиография включает 205 источников, из них 9 отечественных и 196 иностранных. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 49 рисунками. 16 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Клинические характеристики нейробластомы Нейробластома – обобщающее понятие, включающее ряд опухолей нейрогенной природы различной степени злокачественности. Все они объединены общностью гистогенеза из клеток нервного гребня эмбриональной нейроэктодермы, которые в норме дифференцируются в клетки симпатических ганглиев и хромаффинной ткани надпочечников [27,133]. В результате гиперэкспрессии генов hASH1, MYCN, PHOX2a, PHOX2b, ELAVL4, TrkB, TrkC клетки теряют способность реагировать на дифференцировочные сигналы, а также утрачивают активность генов-супрессоров опухолевого роста Rb, p53, p73 что является молекулярной основой формирования опухолевого клона [4,5,12,34,94,98,100,108,133,163]. Морфологическая системы основана на классификация соотношении опухолей между симпатической клетками нервной нейрального типа (нейробласты, ганглиозные клетки) и шванновской стромой и включает нейробластому, ганглионейробластому и ганглионеврому [13,156]. Нейробластома является наиболее частой детской солидной опухолью экстракраниальной онкологической локализации патологии 8-10% и составляет [87]. в структуре Заболеваемость детской нейробластомой составляет 1 на 8000 новорожденных или 10,5 случаев на 1 миллион детей в возрасте до 15 лет. Максимум заболеваемости приходится на возраст от 0 до 4 лет, медиана 23 месяца [169]. Локализация нейробластомы определяется расположением элементов симпатической нервной системы в организме. Наиболее частой локализацией опухоли является надпочечник, несколько реже поражаются вегетативные ганглии забрюшинного пространства, средостения, шеи и полости малого таза [3,6]. На момент постановки диагноза около 40% пациентов имеют IV стадию 17 заболевания, которая характеризуется наличием диссеминированной опухоли [91]. Распространение опухоли происходит путем лимфогенного и гематогенного метастазирования в отдаленные лимфатические узлы, КМ, кости скелета, печень и кожу. Вариантом стадии IV нейробластомы является стадия IVN, при которой происходит метастатическое поражение только отдаленных лимфатических узлов без вовлечения других органов, что ассоциировано с более благоприятным прогнозом [128]. Среди пациентов с диссеминированными опухолями выделяется специфическая группа больных в возрасте младше 1 года с метастатическим поражением кожи, печени и КМ (до 10% опухолевых клеток) – стадия IVS нейробластомы. Данные пациенты имеют хороший прогноз, поскольку опухоль склонна к спонтанной регрессии без проведения специфического лечения [52]. 1.2. Стратификация больных нейробластомой на группы риска Нейробластома характеризуется разнообразием клинических и морфологических форм, которые имеют различный прогноз в отношении развития рецидивов заболевания и общей выживаемости (ОВ) пациентов. Часть опухолей склонны к спонтанной регрессии или созреванию, в результате чего они трансформируются в доброкачественную опухоль – ганглионеврому. Другие, напротив, характеризуются агрессивным поведением. При этом отмечается большая опухолевая масса, раннее появление отдаленных метастазов и часто наблюдается прогрессивное клиническое течение, несмотря на многокомпонентную противоопухолевую терапию. Одновременно с описанием феномена клинической гетерогенности нейробластомы [66,72] стали появляться попытки идентифицировать маркеры, ассоциированные как с благоприятным, так и с неблагоприятным поведением опухоли и, следовательно, прогнозом заболевания. Первыми факторами, прогностическое значение которых было доказано, являлись возраст ребенка на 18 момент постановки диагноза и распространенность опухолевого процесса (стадия заболевания). Было показано, что прогноз в группе больных младше 1 года значительно лучше, чем в возрасте старше 1 года, поскольку в данной группе достоверно чаще встречались случаи спонтанной дифференцировки опухолевых клеток. При этом местное распространение процесса и появление отдаленных метастазов существенно ухудшало результаты лечения [72]. Однако практически сразу стало очевидно, что одних клинических характеристик недостаточно для корректного определения прогноза заболевания. В качестве потенциальных прогностических маркеров исследовались гистологическое строение опухоли и содержание ДНК в клетках опухоли (плоидность). Прогностическое значение данных характеристик было подтверждено на большом количестве пациентов в ретроспективных и проспективных исследованиях. Низкая дифференцировка клеток, малое количество Шванновской стромы, а также диплоидный и тетраплоидный наборы хромосом в опухолевых клетках являются неблагоприятными прогностическими факторами [45,106,116,157]. С развитием молекулярной биологии стали анализироваться генетические факторы прогноза нейробластомы. Было выявлено, что наличие амплификации гена MYCN в клетках опухоли ассоциировано с агрессивным течением заболевания [32,154]. В дальнейшем появились данные о влиянии различных аномалий структуры нейробластомой. Были и числа описаны хромосом как на выживаемость прогностически больных неблагоприятные хромосомные перестройки, так и аберрации, характеризующие относительно доброкачественное течение заболевания. К первым относятся делеция короткого плеча хромосомы 1 (локус 1p36), [31,53,81], делеция длинного плеча хромосомы 11 (локус 11q23) [88,194], несбалансированное увеличение материала длинного плеча хромосомы 17 (локус 17q21) [29,109], делеция короткого плеча хромосомы 3 (локус 3p22), а также делеции хромосом 4, 9 и 12. Ко вторым – полное умножение хромосомы 17, которое часто является маркером околотриплоидного кариотипа [201] и делеция короткого плеча хромосомы 9 (локусы 9p22-24) [82]. 19 Показано, что использование клинических, морфологических и молекулярных критериев позволяет разделить пациентов на группы риска, долгосрочная выживаемость в которых значительно различается. При отсутствии неблагоприятных факторов прогноза выживаемость больных достигает 95% [139], а при сочетании нескольких (распространенная опухоль, амплификация гена MYCN, делеция короткого плеча хромосомы 1) – не превышает 40%, несмотря на мультимодальную терапию, включающую высокодозную химиотерапию с аутологичной трансплантацией костного мозга [123,162]. Все современные протоколы программного лечения нейробластомы включают стратификацию пациентов на группы риска с целью выбора оптимальной интенсивности терапии. При этом критерии, лежащие в основе стратификации, в разных схемах различаются. В большинстве детских онкологических клиник России лечение пациентов с нейробластомой проводится в соответствии со схемой программной терапии NB2004, разработанной немецкой группой детской онкологии и гематологии (GPOH, Group for Pediatric Oncology and Hematology, Германия). Для определения группы риска в данной схеме используются следующие критерии: стадия заболевания, наличие амплификации гена MYCN, делеции короткого плеча хромосомы 1 и возраст на момент постановки диагноза (учитывается при III или IV стадии нейробластомы без амплификации MYCN) (рисунок 1). При этом количество копий гена MYCN имеет решающее значение: при наличии амплификации пациенты относятся к группе высокого риска, независимо от стадии заболевания и наличия других прогностических факторов. Наличие делеции короткого плеча хромосомы 1 имеет значение в случаях II и III стадий при отсутствии амплификации MYCN [150]. 20 Рисунок 1. Схема стратификации больных нейробластомой на группы риска, используемая в протоколе NB2004. В протоколе кооперативной группы детской онкологии (COG, Children’s Oncology Group, США) в основе определения группы риска помимо стадии заболевания лежат возраст пациента на момент постановки диагноза, наличие амплификации гена MYCN, гистологическое строение опухоли (согласно классификации H.Shimada) и плоидность опухолевых клеток (имеет значение только для определения риска у пациентов IVS стадии). Единственный молекулярно-генетический фактор, используемый в данной схеме стратификации, амплификация гена MYCN не является решающим. Пациенты с I или II (младше 1 года) стадией нейробластомы, имеющие амплификацию MYCN относятся к группе низкого риска [158,204]. Европейская группа по изучению нейробластомы (SIOPEN, International Society of Pediatric Oncology European Neuroblastoma Group, Европейский Союз) 21 для определения риска у больных нейробластомой предлагает использовать такие параметры, как стадию заболевания (INSS), возраст и количество копий гена MYCN. При этом в случае наличия амплификации MYCN пациент сразу попадает в группу высокого риска [107]. Система стратификации больных нейробластомой на группы риска – INRG объединила различные клинические, морфологические и молекулярно-биологические характеристики. К первым относятся распространенность опухоли и возраст больного на момент постановки диагноза. Ко вторым – гистологическая категория и степень дифференцировки опухолевых клеток согласно классификации H.Shimada. К третьим – наличие амплификации гена MYCN и делеции длинного плеча хромосомы 11. Наличие аберраций длинного плеча хромосомы 11 учитывается при локорегионарном распространении опухоли с наличием факторов риска, выявляемых при использовании визуализационных методов исследования (стадия L2 по системе INRG), а также при диссеминированной опухоли с поражением кожи, печени и/или костного мозга у больных не старше 18 месяцев (стадия MS, INRG). Кроме того, при диссеминированной нейробластоме (стадия M, INRG) у детей младше 18 месяцев имеет значение плоидность опухолевых клеток [54]. Таким образом, из большого количества аберраций структуры и числа хромосом в клетках нейробластомы, выявляемых методами молекулярной биологии, три включены в различные протоколы для стратификации пациентов на группы риска: амплификация гена MYCN, делеция короткого плеча хромосомы 1 (1p) и делеция длинного плеча хромосомы 11 (11q). Патогенетическая роль данных аномалий, также как их прогностическая значимость, различна. Амплификация гена MYCN выявляется в 20-25% случаев нейробластомы [32,154], однако в ряде популяций частота ее выявления несколько ниже – около 16% [188]. Амплификация MYCN часто сочетается с другими прогностически неблагоприятными факторами (диплоидный набор хромосом, неблагоприятная гистологическая категория, делеция 1p36) [32,154]. При этом опухоль характеризуется незрелым фенотипом, высокой скоростью пролиферации клеток, 22 быстрым локорегионарным распространением и ранним появлением отдаленных метастазов. Ген MYCN экспрессируется во втором триместре беременности в клетках герминального слоя головного мозга и примордиальной коры. Матричная РНК MYCN была выявлена во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток примитивной сетчатки, а также, в значительно меньшей степени, в легких плода и плаценте [85]. В постнатальном онтогенезе экспрессия гена MYCN в норме отсутствует. Матричная РНК гена MYCN связывается с белком ELAVL4, что увеличивает ее стабильность и способствует увеличению скорости пролиферации клеток [119]. МикроРНК mir34a, напротив, специфически инактивирует мРНК MYCN [199]. Кодирующая последовательность ДНК данной микроРНК локализуются в локусе 1p36, который может подвергаться делеции в клетках нейробластомы. Экспериментальные данные показали, что искусственное введение mir34a в клетки с исходно высоким уровнем экспрессии MYCN (клеточные линии IMR32 и LAN5) значительно снижает его, уменьшает скорость пролиферации, индуцирует апоптоз клеток. При наличии делеции короткого плеча хромосомы 1 обнаружено снижение экспрессии mir34a и увеличение уровня мРНК MYCN [199]. Ген MYCN, локализуется на коротком плече хромосомы 2 (локус 2p24.1). Гены DDX1, NAG и ALK, картированные в данном или смежных локусах, также могут вовлекаться в амплификацию [119,198]. Данный феномен получил название коамплификации. Отмечено, что продукт гена DDX1, являясь АТФ-зависимой РНК-хеликазой, принимает участие в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. При коамплификации гена DDX1 увеличивается его экспрессия, что может быть связано с повышенной агрессивностью нейробластомы [119]. A.Weber et al., напротив, указывают на более благоприятный прогноз у пациентов с диссеминированной нейробластомой, имеющих амплификацию MYCN, при наличии коамплификации DDX1 [198]. Прогностическое и патогенетическое 23 значение коамплификации генов MYCN и NAG, NSE1, LPIN1 или ALK остается предметом дискуссий [79,80,167,198]. Делеция короткого плеча хромосомы 1 встречается в 30-40% случаев нейробластомы и часто сочетается с амплификацией гена MYCN. При возникновении данной аберрации происходит потеря гетерозиготности в локусе 1p36 [75]. В зависимости от локализации были выделены интерстициальная (внутрихромосомная) прилежащими и терминальная (потеря теломерного региона с участками) делеции. K.Ohtsu et al. показали, что при наличии терминальной делеции опухоль имела злокачественный фенотип, а общая выживаемость пациентов составила 33,3%. Крайне неблагоприятным фактором было признано сочетание терминальной делеции 1p и амплификации MYCN. В то же время, между группами больных с интерстициальной делецией и отсутствием делеции 1p выживаемость достоверно не отличалась и составила 100% и 90,7% соответственно. При этом размер удаленного участка не имел прогностического значения в случае интерстициальной делеции, тогда как потеря даже небольших терминальных фрагментов хромосомы 1 (локус 1p36.3) приводила к развитию рецидива и отдаленных метастазов [135]. Прогностическое значение делеции короткого плеча хромосомы 1 может объясняться двумя патогенетическими механизмами. Первый заключается в наличии в локусе 1p36.3 гена CHD5, который является геном-супрессором опухолевого роста. Его продукт относится к группе SWI/SNF белков, которые обладают хеликазной активностью и способностью к АТФ-зависимому разрушению нуклеосом, что приводит к усилению транскрипции регулируемых ими генов. Экспрессия гена CHD5 обнаруживается только в клетках головного мозга и надпочечников [186]. A.Bagchi et. al установили, что ген CHD5 вовлечен в регуляцию процессов пролиферации клеток и апоптоза через сигнальный путь p19(ARF)/p53 [21]. Второй путь связан с локализацией кодирующей последовательности микроРНК mir34a в локусе 1p36. Она специфически инактивирует мРНК MYCN, что выражается в посттранскрипционном снижении 24 экспрессии данного гена и сопровождается замедлением пролиферации клеток и индукцией апоптоза. При наличии делеции короткого плеча хромосомы 1, обнаружено снижение экспрессии mir34a и увеличение уровня мРНК MYCN [199]. Делеция длинного плеча хромосомы 11 описана у 15-20% больных нейробластомой [19,88]. В отличие от делеции 1p она редко встречается в опухолях с амплификацией гена MYCN. Благодаря этому делеция 11q может служить прогностическим маркером в группе больных без амплификации MYCN: она ассоциирована с неблагоприятным гистологическим строением опухоли, распространенной стадией заболевания и более низкой общей выживаемостью пациентов [19]. В то же время, в общей когорте пациентов прогностическое влияние делеции 11q отмечено не было. [88]. Однако в более поздних исследованиях прогностическая значимость делеции 11q в отношении как общей, так и бессобытийной выживаемости пациентов была доказана независимо от наличия амплификации MYCN [16,54]. Механизм прогрессии нейробластомы при делеции 11q связан с двумя путями. Первый состоит в выключении гена-супрессора опухолевого роста TSLC1, который картирован в локусе 11q23.2, наиболее часто вовлекающемся в делецию. Экспрессия данного гена снижена в клетках многих злокачественных опухолей в результате гиперметилирования промоторного региона, чего не происходит в клетках нейробластомы, где к инактивации TSLC1 приводит делеция 11q. Это, в свою очередь, проявляется в виде ускоренной пролиферации клеток [18]. Второй путь связан с образованием химерных генов с участием FOXR1. В результате интерстициальной делеции в регионе 11q23 происходит образование химерных генов MLL-FOXR1 и PAFAH1B2-FOXR1. Ген FOXR1 в норме экспрессирован только на ранних этапах эмбриогенеза, а его активация в составе химерного гена приводит к неконтролируемому делению клеток и блокированию апоптоза, что способствует опухолевому росту [148]. Для определения прогностической значимости описанных генетических аберраций (амплификация гена MYCN, делеции 1p и 11q) был проведен 25 ретроспективный анализ результатов клинических исследований, опубликованных в период с 1994 по 2009 год [16,19,42,54,88,121,135,141,145,188]. Источником литературных данных послужила международная база медицинской литературы PubMed. В исследование включались работы, в которых описывалось влияние каждого из анализируемых нарушений на долгосрочную выживаемость пациентов с нейробластомой. Анализ выживаемости проводился в общей группе больных без разделения по какому-либо признаку (стадия, биохимические показатели, наличие генетических изменений и т.д.). При этом размер исследуемой когорты и метод выявления аберраций значения не имел. В качестве критерия, разделяющего больных на группы «с неблагоприятным исходом» и «без неблагоприятного исхода», использовалась пятилетняя общая выживаемость пациентов. С использованием четырехпольной таблицы сопряженности был вычислен относительный риск (ОР) смерти от любой причины в зависимости от наличия анализируемой мутации [9] (таблица 1). 26 Таблица 1 Характеристика исследований, включенных в анализ влияния амплификации MYCN, делеций 1p и 11q на выживаемость пациентов с нейробластомой и оценка относительного риска в отношении пятилетней общей выживаемости пациентов при наличии данных аберраций Исследователь, год публикации Pession, 1994 Амплификация MYCN Количе ство пациент ов Способ детекци и ОР 235 SB 2,31 (+) Делеция 1p Количе ство 95% ДИ пациент ов 2,242,37 Способ детекци и ОР Maris, 1995 156 PCR 2,80 (+) Caron, 1996 89 SB 6,70 (+) Ohtsu, 1997 58 PCR 4,11 (+) Tonini 1997 295 SB 3,38 (+) Делеция 11q Количе ство 95% ДИ пациент ов 2,722,88 3,4013,30 3,984,24 64 SB 4,87 (+) Ambros, 2009 6820 3,61 (+) 95% ДИ 89 SB 1,20 (-) 0,502,70 295 PCR 1,37 (-) 0,812,30 909 PCR 1,98 (+) 1,952,02 1029 FISH, PCR, aCGH, 1,98 (+) 1,952,01 1,8917,12 Attiyeh, 2005 FISH, PCR, aCGH, ОР 2,225,16 Guo, 1999 Raschella, 1999 Способ детекци и 3,593,62 915 PCR 1029 aCGH, SNP array, 2,39 (+) 2,364,22 1,98 (+) 1,952,01 27 Cohn, 2009 7102 MLPA FISH, PCR, aCGH, MLPA 3,66 (+) 3,653,67 2152 MLPA aCGH, SNP array, MLPA 3,05 (+) 3,033,08 1064 MLPA FISH, PCR, aCGH, MLPA 2,06 (+) 2,032,09 ОР – относительный риск, ДИ – доверительный интервал, SB – гибридизация по Саузерну, FISH – флуоресцентная in situ гибридизация, PCR – полимеразная цепная реакция, aCGH – сравнительная геномная гибридизация, MLPA – множественная лигазно-зависимая амплификация зондов, SNP array – исследование однонуклеотидных полиморфизмов. Знак (+) означает наличие достоверно значимых различий уровней долгосрочной выживаемости пациентов в зависимости от наличия анализируемой аберрации в данном исследовании, знак (-) означает отсутствие различий в выживаемости больных. 28 Во всех проанализированных исследованиях было доказано неблагоприятное влияние амплификации гена MYCN и делеции короткого плеча хромосомы 1 на пятилетнюю ОВ пациентов. Данная закономерность была отмечена как в небольших исследованиях с ограниченным количеством включенных пациентов и одним методом выявления аберрации, так и в крупных мультицентровых исследованиях на большой когорте пациентов и с использованием большого количества диагностических методик. Благодаря этому оба данных маркера могут быть применены для определения риска у больных нейробластомой. Отмечено, что при наличии амплификации MYCN риск возникновения неблагоприятного события выше, чем при наличии делеции 1p [54]. Поскольку данные аберрации часто обнаруживаются совместно, то делеция короткого плеча хромосомы 1 приобретает высокую прогностическую ценность в случаях отсутствия амплификации MYCN, независимо от стадии заболевания, возраста пациента и других факторов. В процессе формирования системы стратификации INRG было отмечено, что наличие делеции 1p достоверно снижает уровень бессобытийной выживаемости пациентов с I стадией нейробластомы, не влияя при этом на общую выживаемость данных больных [54]. Прогностическое значение делеции 11q было подтверждено только в рамках крупных мультицентровых исследований [16,19,54]. Учитывая тот факт, что делеция 11q крайне редко сочетается с амплификацией MYCN, она также может быть применена для определения риска у пациентов с нормальным числом копий гена MYCN. S. Cohn et al. показали прогностическое значение несбалансированной делеции 11q в отношении общей и бессобытийной выживаемости пациентов с II, III и IVS стадиями нейробластомы без амплификации MYCN. При этом наиболее драматичное снижение выживаемости было отмечено в группе больных со стадией IVS [54]. 29 1.3. Молекулярно-генетические факторы, не включенные в схемы стратификации К молекулярно-генетическим маркерам, не включенным в схемы стратификации пациентов, относятся аберрации хромосом 3,4,7,9,12,14,17 и другие аномалии, при этом прогностическое значение многих из них остается не выясненным. Делеция короткого плеча хромосомы 3 описана в половине случаев нейробластомы с наличием делеции длинного плеча хромосомы 11 и отсутствием амплификации гена MYCN. Потеря генетического материала хромосомы 3 рассматривается как вторичное событие по отношению к аберрации хромосомы 11 и чаще встречается у больных старшей возрастной группы [30,166,194,195]. R.Spitz et al. показали негативное влияние делеции 3p на бессобытийную выживаемость (БСВ) пациентов как в группе больных со стадиями I-III и IVS без амплификации MYCN, так и во всей когорте исследованных пациентов [166]. Патогенетическая роль данной аберрации заключается в том, что на коротком плече хромосомы 3 располагаются генысупрессоры опухолевого роста VHL, SEMA3B, RASSF1a. Инактивирующие мутации или делеции гена VHL приводят к развитию синдрома фон ХиппеляЛиндау, сопровождающегося образованием гемангиобластом сетчатки, мозжечка, спинного мозга, а также почечно-клеточного рака [62,63]. Ген SEMA3B участвует в развитии симпатических нейронов (направленном росте аксонов) и в апоптозе нефункциональных нейронов в процессе эмбриогенеза [46,159]. Экспрессия SEMA3B ассоциирована с дифференцированным фенотипом нейрогенных опухолей: она отсутствует в клетках нейробластомы, но в высокой степени выявляется в клетках ганглионевромы. В то же время злокачественных увеличение опухолей экспрессии (аденокарцинома SEMA3B легкого, в клетках рак ряда яичников) приводит к их апоптозу [124,192,203]. Ген RASSF1a блокирует клеточный 30 цикл на этапе перехода из G1 в S фазу через ингибирование трансляции циклина D1. Инактивация RASSF1a, вызванная его метилированием, наблюдается при различных солидных опухолях. При этом происходит аномальное накопление циклина D1 в цитоплазме клетки без увеличения уровня его мРНК [160]. S.L. Fenton et al. показали механизм задержки клеточного цикла в G1 фазе через взаимодействие RASSF1a с фосфопротеином E4F1, а M.S. Song et.al – через усиление протеасомной деградации комплекса APC/C – циклосомы [73,164]. Делеция короткого плеча хромосомы 4 встречается в 20-29% случаев нейробластомы вне зависимости от наличия аберраций хромосомы 1 и амплификации MYCN [41,140]. H.Caron et al. и P.Perri et al. указывают на возможное нахождение в регионе 4p16 генов, обладающих свойствами супрессоров опухолевого роста [41,140]. Вероятно, данными свойствами обладает ген SPON2, расположенный в регионе 4p16, экспрессия которого подавлена в клетках аденокарциномы легкого, однако его основная функция заключается в продукции провоспалительных цитокинов макрофагами [92,118]. C.Crona et al рассматривают делецию 4p с потерей гена PHOX2B как одно из ранних событий онкогенеза нейробластомы наряду с увеличением материала длинного плеча хромосомы 17 [104]. A.Pezzolo et al. показали, что увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 7 является благоприятным прогностическим признаком в группе пациентов с локализованной резектабельной нейробластомой. При увеличении материала регионов 7p11.2 – 7p22 неблагоприятные события у пациентов наступали достоверно реже, а уровень достижения полной ремиссии был выше [142]. Амплификация региона 7q21 была обнаружена в клеточных линиях нейробластомы, резистентной к доксорубицину, в то время как в клетках линии SH-SY5Y выявлялось полное умножение хромосомы 7 [68,74]. R.L. Stallings et al. обнаружили увеличение материала всей хромосомы 7 в 40% опухолей, а увеличение материала 7q – 31 только в 12%. Первая аберрация встречалась вне зависимости от стадии заболевания и молекулярного подтипа опухоли (имеющие амплификацию MYCN или делецию 11q), вторая - преимущественно была ассоциирована со стадиями III и IV [168]. Делеция короткого плеча хромосомы 9 встречается при различных солидных опухолях (меланома, плоскоклеточный рак головы и шеи), а также выявляется в 16-17% случаев нейробластомы [122,127]. Патогенетическая роль данной аберрации объясняется локализацией в регионе 9p21.3 генасупрессора опухолевого роста CDKN2A/p16. CDKN2A дикого типа, взаимодействуя с белком Rb, инактивирует циклин-зависимую киназу 4 и останавливает клеточный цикл в поздней фазе G1. Потеря гетерозиготности или инактивирующие мутации данного гена рассматриваются как пусковое событие онкогенеза рака пищевода, мочевого пузыря и злокачественной мезотелиомы [101,103,117]. Данные о прогностическом значении делеции 9p у пациентов с нейробластомой неоднозначны. L.Giordani et al. указывают на большую частоту встречаемости делеции 9p у пациентов с благоприятной нейробластомой [82]. J.Mora et al. продемонстрировали лучшие показатели общей и беспрогрессивной выживаемости у пациентов с IV стадией нейробластомы при наличии делеции 9p [127]. B.Marshall et al. не обнаружили влияния данной аберрации на показатели выживаемости пациентов [122]. В то же время, J.Takita et al. доказали связь делеции 9p с неблагоприятным клиническим исходом [179,180]. Амплификация длинного плеча хромосомы 12 также описана при различных злокачественных опухолях (саркомы, злокачественные глиомы), в том числе, нейробластоме [58,59,60,70,83,146,193]. W.T. Su et al. выявили гиперэкспрессию генов, картированных в регионе 12q13-12q15 в 5 из 95 образцов нейробластомы, при этом амплификация данного региона методом FISH была выявлена у 4 больных, в одном случае амплификация 12q13-15 не сопровождалась гиперэкспрессией соответствующих генов. Клиническое 32 значение данной аберрации остается неопределенным, поскольку у трех пациентов с амплификацией 12q13-15 произошла фатальная прогрессия заболевания, тогда как три другие пациента (2 с амплификацией и гиперэкспрессией генов 12q13-15, один – только с амплификацией) находятся в полной продолжающейся ремиссии [174]. Роль амплификации региона 12q13-15 в патогенезе злокачественных опухолей, скорее всего, связана с локализацией в данном локусе онкогенов, осуществляющих положительную регуляцию клеточного цикла: OS4 и OS9 (стимуляция пролиферации), PIKE (увеличение активности циклина D1), CDK4 (реализация функции циклина D1), RAP1B (участник сигнального пути RAS) и MDM2 (специфический антагонист p53) [174]. Аберрации короткого плеча хромосомы 12 ассоциированы с семейными формами нейробластомы [115]. Делеция длинного плеча хромосомы 14 отмечена в 20-25% случаев нейробластомы, при этом происходит потеря участка 14q23-14q32. Данная аберрация ассоциирована с делецией 11q и, напротив, редко встречается в опухолях с амплификацией MYCN [185]. C.H. Gattolliat et al. обнаружили в образцах нейробластомы высокого риска значительное снижение уровней экспрессии 15 микроРНК, кодирующие последовательности которых картированы в локусе 14q32.31. Уровни экспрессии микроРНК mir487b и mir410 наиболее значимо отличались между образцами нейробластом высокого и низкого риска, при этом снижение их экспрессии приводило к снижению показателей общей и безболезненной выживаемости пациентов. Однако исследователи не выявили изменения числа копий длинного плеча хромосомы 14 в образцах опухолей высокого риска и объяснили уменьшение величины экспрессии микроРНК факторами транскрипционной и посттранскрипционной регуляции [78]. В то же время, патогенетическая роль делеции 14q может быть объяснена расположением в локусе 14q32.12 гена MOAP4, который проявляет антионкогенную активность через индукцию апоптоза. MOAP1 активируется продуктом RASSF1a и, в свою очередь, 33 приводит к конформационным изменениям BAX, делая его способным встраиваться в наружную мембрану митохондрий [22,181]. Увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 17 является наиболее частой генетической аберрацией при нейробластоме, ее частота составляет 50-70% [55]. Увеличение материала 17q происходит в обширном регионе 17q21-qter. Наиболее часто аберрация определяется у пациентов старше 1 года с распространенной опухолью и ассоциирована с наличием амплификации гена MYCN и делеции 1p [28,55]. Она является независимым прогностическим фактором и связана с неблагоприятным клиническим течением и сниженными показателями ОВ и БСВ пациентов [28,149]. Влияние увеличения материала 17q на патогенез нейробластомы реализуется через увеличение экспрессии генов, картированных в вовлеченных локусах. Ген TOP2A (17q21.2) кодирует фермент топоизомеразу II, который участвует в транскрипции генов на нуклеосомной ДНК и расцеплении сестринских хроматид при переходе от G2 к М фазе клеточного цикла [24,69,126]. BIRC5 (Survivin, 17q25.3) является онкогеном и гиперэкспрессирован в клетках меланомы, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, мягкотканных сарком [11,86,202]. Survivin соединяется с микротрубочками веретена деления, блокирует апоптоз через ингибирование каспазы 3 в G2/M фазе клеточного цикла, а также гибель клетки в митозе, вызванную несостоятельностью веретена деления [113,165]. 1.4. Молекулярно-генетические методы, используемые для идентификации прогностических биологических маркеров Для выявления мутаций, связанных с изменением количества копий генов и хромосомных регионов (делеции и амплификации) предложены различные методики: гибридизация по Саузерну, ПЦР, ПЦР-РВ, FISH, MLPA, сравнительная геномная гибридизация, исследование 34 однонуклеотидных полиморфизмов [1,2,16,19,42,54,88,121,135,141,145,188]. Гибридизация по Саузерну является относительно трудоемкой методикой и требует использования большого количества ДНК, что бывает затруднительно при проведении игольной биопсии [17]. Метод FISH в настоящее время является «золотым стандартом» определения аберраций, ассоциированных с изменением числа копий различных хромосомных локусов [14,16,153]. Он позволяет оценить архитектонику опухоли, дифференцировать опухолевые клетки от нормальных и одновременно исследовать интересующие хромосомные аберрации и плоидность изучаемых клеток [16,153]. Использование метода FISH дает возможность выявить гетерогенность клеток опухоли по анализируемым аберрациям, так разнородность по количеству копий гена MYCN определяется, по данным различных авторов, в 8-21% случаев нейробластомы с амплификацией MYCN [14,15,184]. Применение ПЦР позволяет быстро и точно определять количество копий анализируемого гена или локуса [17,19]. Особенностью метода является идентификация небольшого фрагмента (до 1000 п.н.) интересующего региона с последующей экстраполяцией результатов на весь регион. Поэтому для увеличения точности исследования создаются отдельные ПЦР-системы для нескольких фрагментов анализируемого локуса. Данные, полученные с помощью FISH и ПЦР, имеют высокую качественную сходимость, кроме того, обе методики могут применяться для анализа образцов тканей, выделенных из парафиновых блоков [17,110]. Множественная лигазно-зависимая амплификация зондов (MLPA) является универсальной технологией, позволяющей выявлять генетические аномалии, связанные с изменением числа копий анализируемых хромосомных локусов. Она основана на многократном копировании лигированных анализируемого олигонуклеотидных региона зондов создается зонд, с помощью ПЦР. Для состоящий из двух 35 олигонуклеотидов, которые примыкают друг к другу, присоединяясь к ДНКматрице. Они состоят из двух или трех частей: комплементарной исследуемому региону, сайта присоединения праймера и балластной последовательности. В процессе лигирования олигонуклеотидов образуется единая молекула, служащая матрицей в последующей ПЦР. Размер ПЦРпродукта определяется балластной последовательностью олигонуклеотида. Детекция осуществляется методом капиллярного электрофореза. В одной реакционной смеси возможно использование до 50 зондов к различным хромосомным регионам. Анализ результатов основывается на сопоставлении количества амплифицированных зондов в исследуемом образце ДНК и образце референсной неопухолевой ДНК [14,132]. При этом количество амплифицированных зондов (ПЦР-продукта) пропорционально количеству анализируемой последовательности в образце ДНК. Технология MLPA является универсальной и может быть применена для выявления аберраций, связанных с изменением числа копий отдельных генов или хромосомных регионов (делеций и амплификаций) при различных онкологических, гематологических, наследственных и других заболеваниях. I.Ambros et al. показали высокую качественную сходимость данных (95,5%), полученных методом MLPA с результатами, полученными с помощью FISH, сравнительной геномной гибридизации и исследования однонуклеотидных полиморфизмов [14]. 1.5. Выявление поражения КМ и оценка минимальной остаточной болезни при нейробластоме Прогрессия нейробластомы происходит путем гематогенной и лимфогенной диссеминации опухолевых клеток. При этом наиболее частыми объектами метастазирования являются лимфатические узлы, КМ, кости скелета, печень, кожа, головной мозг. Около 40% больных на момент 36 постановки диагноза имеют отдаленные метастазы (стадия IV INSS), что негативно влияет на показатели долгосрочной выживаемости данных пациентов. Наличие опухолевых клеток в КМ у пациентов старше 1 года определяет высокий риск заболевания, в то время как у больных младше 1 года присутствие в КМ менее 10% клеток опухоли не приводит к увеличению риска (стадия IVS INSS) [6,35,52]. КМ, наряду с периферической кровью, является наиболее доступным материалом для обнаружения метастатических клеток. Таким образом, инициальное определение поражения КМ клетками нейробластомы необходимо для корректного стадирования заболевания и стратификации пациентов на группы риска [125]. В ряде исследований было показано, что наличие остаточных опухолевых клеток в КМ во время лечения, характеризующее ответ опухоли на терапию, может являться прогностическим фактором [61,90]. В настоящее время для выявления опухолевых клеток в КМ наиболее широко применяется цитологическое и гистологическое исследование аспиратов и трепанобиоптатов КМ. Биопсия КМ проводится из двух гребней подвздошных костей, аспирация – из четырех подвздошных остей. Заключение о наличии поражения КМ выносится в случае обнаружения опухолевых клеток хотя бы в одном гистологическом препарате из 20 (по 10 срезов двух биопсийных образцов) или в случае присутствия атипичных клеток или их агрегатов (розеток Хомера-Райта) в цитологических препаратах КМ. В рутинной практике чувствительность морфологического исследования редко превышает 1×10-2 [33,47,48]. Для определения клеток нейробластомы во многих случаях необходимо использование более чувствительных методов, таких как иммуноцитологическое цитофлуориметрия, исследование ПЦР. препаратов Аналитическая КМ, проточная чувствительность использовании данных методов может достигать 1×10-4-1×10-5 [47,119]. при 37 Для проведения иммуноцитологического исследования наиболее часто применяются моноклональные антитела к дисиалоганглиозиду GD2. Данная методика позволяет проводить морфологическую оценку анализируемых клеток, при этом аналитическая чувствительность достигает 1×10-5. Метод иммуноцитологии стандартизован для выявления поражения КМ и оценки остаточных опухолевых клеток при нейробластоме. Однако ряд клеток, в первую очередь макрофаги, способны захватывать GD2 антиген, что приводит к связыванию с ними анти-GD2 антител. Этим обусловлено появление ложно-позитивных образцов [51,175]. Метод проточной цитометрии для оценки поражения КМ основан на выявлении клеток, имеющих опухоль-ассоциированный иммунофенотип, среди клеток КМ. Для создания диагностической панели используются моноклональные антитела как к маркерам гемопоэтических клеток, так и к специфическим антигенам опухоли. Клетки нейробластомы имеют иммунофенотип CD45-CD9+CD56+CD81+CD84+aGD2+. В ряде случаев нейробласты экспрессируют маркеры CD57, CD138, CD166. Аналитическая чувствительность метода достигает 1×10-5. [39,40,71]. Молекулярно-генетическое исследование КМ с целью выявления опухолевых клеток подразумевает использование специфических маркеров, позволяющих отличить их от нормальных гемопоэтических клеток. Наиболее распространенной методикой является количественная полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ). В ее основе лежит технология TaqMan, включающая внесение в ПЦР-систему деградируемых флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов, специфичных к исследуемым генам. Разрушение зонда в процессе амплификации целевого фрагмента ДНК приводит к освобождению флуорохрома из пространственной близости с гасителем флуоресценции в составе зонда, что детектируется как нарастание величины флуоресцентного сигнала реакционной системы. Зависимость нарастания сигнала 38 пропорциональна кинетике ПЦР, что позволяет использовать данную технологию для количественной оценки матрицы в исследуемом образце. Применение различных флуорохромов позволяет создавать мультиплексные ПЦР-системы для детекции нескольких маркеров, в том числе с включением в исследование контрольных генов, необходимых для нормализации полученных результатов [8,96,155]. На уровне РНК исследуются транскрипты генов, специфичных для клеток нейральной дифференцировки. Экспрессия гена, применяемого для выявления клеток нейробластомы в КМ, должна отсутствовать в клетках нормального КМ, либо величина ее в опухолевых клетках должна быть многократно выше. Для оценки поражения КМ при нейробластоме чаще всего используется определение экспрессии генов, характерных для клеток нейроэктодермальной природы. Различными авторами было предложено большое количество потенциальных маркеров для выявления поражения КМ методом ПЦР, среди которых гены PGP9.5, DDC, CHG, CCND1, TH, GD2, CHRNA3, GAP43, GAGE, MAGE, PHOX2B, ELAVL4 [36,48,170,171,176,189]. Экспрессия гена PGP9.5 является специфичной для нейронов, клеток АПУД-системы и опухолей нейроэндокринной природы. Функция данного белка связана с регуляцией убиквитин-зависимых сигнальных путей через повышение стабильности убиквитина в клетке [187]. Возможность использования мРНК PGP9.5 для выявления поражения КМ остается предметом дискуссий. Ряд исследователей включают его в панель маркеров использующихся для мониторинга эффективности терапии нейробластомы [136,197], в то время как другие указывают на невысокую чувствительность применения данного маркера для диагностики поражения КМ [171]. ДОФА-декарбоксилаза (DDC) – фермент, участвующий в биосинтезе нейротрансмиттеров дофамина и серотонина. Ген DDC экспрессирован в клетках базальных ядер, симпатических адренергических структур и мозгового вещества надпочечников. Имеются данные о возможности 39 применения DDC для выявления клеток нейробластомы в КМ и периферической крови в качестве одного из молекулярных маркеров, использующихся в составе диагностической панели [171]. Тирозингидроксилаза (TH) – фермент, катализирующий синтез дофамина из фенилаланина. TH играет ведущую роль в физиологии адренергических нейронов, так как данная реакция является ключевой в биосинтезе катехоламинов. Выявление экспрессии гена TH уже в течение длительного времени используется для выявления клеток нейробластомы в КМ, периферической крови, лейкаферезных продуктах [36, 136,189]. Однако в последнее время появились работы, свидетельствующие о том, что данный ген не столь специфичен, как это было принято считать ранее [170,171]. Ген PHOX2B в норме экспрессирован в клетках чувствительных ганглиев трех черепных нервов (тройничного, языкоглоточного, блуждающего) и во всех ганглиях вегетативной нервной системы с момента их закладки до середины гестации [138]. В 2004 году D.Trochet et al. описали мутации в гене PHOX2B в случаях семейной нейробластомы, а также нейробластомы, ассоциированной с синдромом врожденной центральной гиповентиляции [191]. Позднее было показано, что экспрессия PHOX2B является чувствительным и высокоспецифичным маркером поражения КМ при нейробластоме, который может использоваться как отдельно от остальных [170], так и в составе панели молекулярных маркеров [171]. Ген GD2, кодирует фермент GD2-синтазу, который ответственен за синтез GD2-ганглиозида, участвующего в передаче нервного импульса и межнейронных взаимодействиях. Моноклональное антитело к GD2- ганглиозиду используется для выявления поражения КМ при нейробластоме с помощью иммуноцитохимии и проточной цитометрии [57,61,102]. Экспрессия гена ELAVL4 впервые была обнаружена в нейронах и клетках мелкоклеточного рака легкого. Данный ген оказался гомологичным гену ELAV (embryonic lethal abnormal vision), участвующем в созревании 40 нейронов Drosophila melanogaster, в связи с чем, получил свое название [177]. Было показано, что белок ELAVL4 обладает специфичностью к нетранслируемым регионам мРНК факторов роста и регуляторных транскрипционных факторов, вовлеченных в процесс развития нейронов. Связываясь с мРНК, белок ELAVL4 увеличивает ее стабильность и время нахождения в цитоплазме [112]. Обнаружено, что экспрессия ELAVL4 в клетках нейробластомы ассоциирована с повышенной экспрессией гена MYCN и агрессивным течением заболевания [44]. Описано использование мРНК ELAVL4 в качестве молекулярного маркера поражения КМ при нейробластоме, однако, для увеличения специфичности исследования, рекомендуется использовать его в комбинации с TH [176]. В настоящее время не существует стандартизованных подходов к определению поражения КМ при нейробластоме методом ПЦР. Разные исследовательские группы предлагают для этих целей использовать различные маркеры и их комбинации. Наиболее применимым молекулярным маркером поражения КМ при нейробластоме считается PHOX2B [170,171], в то время как возможность использования других молекулярных маркеров до конца не выяснена [36,48,176]. Клетки нейробластомы отличаются значительной генетической вариабельностью, поэтому поиск универсального молекулярного маркера при использовании в качестве исходного материала геномной ДНК затруднен. В то же время маркер поражения КМ, основанный на анализе ДНК, обладает рядом преимуществ. Он является более стабильным и, в отличие от транскрипта опухоль-ассоциированного гена, не зависит от уровня экспрессии в ткани первичной опухоли и не подвергается изменениям экспрессии в ходе терапии. Таким образом, ДНК-маркер является более точным инструментом для выявления поражения КМ и мониторинга остаточных опухолевых клеток [173]. 41 Несмотря на то, что до настоящего времени общая генетическая аберрация, которая отличала бы нейробластому, не описана, эпигенетические характеристики, в том числе, профиль метилирования генов, различается в нормальных и опухолевых клетках. Ген RASSF1a, являющийся супрессором опухолевого роста, часто инактивирован за счет метилирования промоторного региона в различных опухолях, в том числе нейробластоме, раке молочной железы, колоректальной аденокарциноме [23,95,111]. J. Stutterheim at al. продемонстрировали высокие показатели чувствительности и специфичности выявления метилированной формы гена RASSF1a в качестве маркера для мониторинга минимальной остаточной болезни при нейробластоме. Они не уступали показателям, полученным при исследовании экспрессии гена PHOX2B [173]. 1.6. Прогностическое значение выявления инициального поражения КМ и мониторинга минимальной остаточной болезни Использование высокочувствительных методов для диагностики поражения КМ при нейробластоме позволяет выявить опухолевые клетки в чрезвычайно низких количествах. Так, например, теоретическая чувствительность ПЦР-РВ позволяет обнаружить 1 опухолевую клетку на 1 миллион нормальных гемопоэтических клеток. При этом клиническая значимость данного исследования остается предметом дискуссий [48,152,170]. Пациенты с локализованной стадией при выявлении поражения КМ с помощью иммуноцитологии или ПЦР, возможно, имеют худший прогноз по сравнению с теми, у кого поражение КМ не было обнаружено, что связано с наличием диссеминированной опухоли. При этом количество опухолевых клеток в КМ находится ниже предела чувствительности цитологического метода исследования. K.Shono et al. связали развитие рецидивов у пациентов 42 с локализованной нейробластомой с наличием мРНК TH в КМ [161]. M.V.Corrias et al. показали достоверное увеличение частоты рецидивов у пациентов с локализованной опухолью при наличии GD2-позитивных клеток в КМ по данным иммуноцитологии [57]. У пациентов с IV стадией нейробластомы предпринимались попытки связать уровень инфильтрации КМ опухолевыми клетками с показателями долгосрочной выживаемости. C.Trager et al. разделили пациентов на две группы в зависимости от уровня транскрипта TH в КМ, при этом больные, у которых уровень транскрипта был ниже медианы имели лучший прогноз [190]. Одновременно J.Stutterheim et al. было показано, что для оценки прогностического значения поражения КМ важен сам факт наличия опухолевых клеток, а не их количественное значение [170,171]. Мониторинг остаточных опухолевых клеток в КМ в процессе лечения позволяет разделить пациентов по скорости ответа на терапию. При этом у больных с ранней санацией КМ прогноз лучше [76,172,183]. Напротив, сохранение опухолевых клеток в КМ после окончания индукционной химиотерапии является строгим неблагоприятным прогностическим фактором. В ряде исследований было показано, что пациенты с наличием минимальной остаточной болезни имеют высокий риск развития рецидива, несмотря на проведение высокодозной химиотерапии, использование антиGD2 моноклональных антител и дифференцировочную терапию ретиноидами [49,50]. Высокочувствительные методы выявления остаточных опухолевых клеток могут быть применены для оценки контаминации препаратов АГСК опухолевыми клетками. периферической крови Было показано, опухолевые что клетки циркулирующие обладают в клоногенным потенциалом и могут быть причиной развития рецидива заболевания при их реинфузии [130]. Во избежание этого при заготовке АГСК проводится их иммуномагнитная CD34+ селекция [182]. Прогностическое значение 43 выявления контаминации АГСК клетками нейробластомы остается предметом дискуссий. В большинстве исследований приводятся данные о снижении выживаемости и увеличении частоты развития рецидива заболевания в случае обнаружения трансткриптов опухоль-ассоциированных генов или GD2-позитивных клеток в препаратах АГСК [20,37,183]. В то же время M.V.Corrias et al. указывают на отсутствие различий в выживаемости пациентов, которым была проведена реинфузия АГСК с наличием или отсутствием экспрессии гена TH [56]. При этом R.Handgretinger et al. показали, что наличие GD2-позитивных клеток в препаратах АГСК после CD34+ селекции имеет положительное влияние на долгосрочную выживаемость больных. Они предположили, что данный феномен может быть связан с переносом клеток, способных стимулировать противоопухолевый иммунный ответ после проведения высокодозной химиотерапии [89]. Больные нейробластомой высокого риска после завершения программы терапии и достижения полной ремиссии сохраняют риск развития рецидива заболевания. По прошествии 5 лет после постановки диагноза показатели БСВ данных пациентов выходят на постоянный уровень (около 35%), однако возможно развитие рецидива в более поздний период [34,35,52]. Выявление персистирующей минимальной остаточной болезни в КМ после завершения поддерживающей терапии представляет собой полезный инструмент для прогнозирования рецидива. Было показано, что обнаружение мРНК GD2 в КМ по прошествии 24 месяцев с момента диагноза ассоциировано со снижением выживаемости пациентов, а выявление TH в периферической крови через 6 месяцев после окончания терапии напрямую коррелирует с развитием рецидива [48,137]. S.Burchill et al. показали, что появление детектируемой мРНК TH в периферической крови предшествует клиническому развитию рецидива нейробластомы на 4 месяца (диапазон 1-11 месяцев) [38]. 44 На сегодняшний день, несмотря на проведение многокомпонентного лечения, включающего химиотерапию с трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, лучевую и дифференцировочную терапию, результаты лечения больных нейробластомой группы высокого риска остаются неудовлетворительными: пятилетняя ОВ составляет около 30% [25,26]. терапевтических Это и диктует необходимость диагностических подходов, совершенствования в том числе схем стратификации пациентов, в первую очередь, за счет использования прогностических биологических маркеров. Их использование приведет к более точному разделению пациентов на группы риска и создаст возможность для проведения индивидуализированной терапии. 45 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Характеристика пациентов, включенных в исследование Определение прогностической значимости генетических аберраций в клетках нейробластомы, а также поражения КМ с использованием методов молекулярной биологии осуществлялось с помощью ретроспективного когортного исследования. Наблюдение осуществлялось за 122 пациентами, находившимся на лечении в Областной детской клинической больнице №1 (г. Екатеринбург) в период с декабря 1999 года по декабрь 2012 года. У всех больных был морфологически верифицирован диагноз нейробластомы различной степени дифференцировки (нейробластома – 101 пациент, ганглионейробластома – 12 пациентов) и ганглионевромы (9 пациентов). Соотношение девочек и мальчиков составило 1,4:1 (71 и 51 пациентов соответственно), медиана возраста – 16,5 месяцев (диапазон 6 дней – 15 лет), 54 (44,3%) пациента были младше 1 года. У 30,3% (37 больных) была диагностирована I стадия заболевания, у 8,1% (10) – II стадия, у 18,9% (23) – III стадия, у 34,6% (42) – IV стадия, у 8,1% (10) – стадия IVS. Медиана времени наблюдения составила 28 месяцев (диапазон 1 – 166 месяцев). Схема распределения пациентов в зависимости от проведения им различных молекулярно-генетических исследований представлена на рисунке 2. 46 Рисунок 2. Схема распределения пациентов в зависимости от проведения различных молекулярно-генетических исследований 2.2. Исследование генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов Определение аберраций хромосом 1 и 2 методом MLPA и числа копий гена MYCN с помощью ПЦР-РВ было выполнено всем 122 пациентам. Выявление делеции 1p с помощью ПЦР (анализ вариабельного числа 47 тандемных повторов в теломерном регионе короткого плеча хромосомы 1, VNTR) было выполнено 70 пациентам (75 образцов), из них 25 (35,7%) с I стадией нейробластомы, 3 (4,3%) – co II стадией, 12 (17,1%) – с III стадией, 24 (34,3%) – с IV стадией, 6 (8,6%) – со стадией IVS. Пятерым пациентам молекулярно-генетическое исследование проводилось при первичной диагностике нейробластомы и при развитии рецидива или прогрессии опухоли. Выявление генетических аберраций хромосом 3,11,17 было выполнено 108 пациентам. Среди них 90 имели гистологический диагноз нейробластома, 10 – ганглионейробластома, 8 – ганглионеврома. Медиана возраста составила – 14,1 месяца, соотношение девочек и мальчиков – 1,2:1 (59 и 49 пациентов соответственно). У 25,0% пациентов (27 больных) была выявлена I стадия опухоли, у 9,3% (10) – II стадия, у 22,2% (24) – III стадия, у 33,3% (36) – IV стадия, у 10,2% (11) – стадия IVS. Обнаружение аберраций хромосом 4,7,9,12,14 методом MLPA было выполнено 100 пациентам, из них 81 с морфологическим диагнозом нейробластома, 11 – ганглионейробластома, 8 – ганглионеврома. Медиана возраста – 16,9 месяцев, распределение по стадиям заболевания: I стадия – 27,0% (27 пациентов), II стадия – 10,0% (10), III стадия – 20,0% (20), IV стадия – 34,0% (34), стадия IVS – 9,0% (9). Для оценки возможности использования ДНК, выделенной из образцов ткани, фиксированной в формалине и залитой в парафиновый блок, было проанализировано 20 образцов, у 15 больных была диагностирована нейробластома, у 3 – ганглионейробластома, у 2 – ганглионеврома. Распределение по стадиям заболевания было следующим: I стадия – 12 пациентов, II стадия – 2, III стадия – 2, IV стадия – 4 пациента. Трем пациентам был проведен анализ делеции 1p с вариабельного числа тандемных повторов методом ПЦР. помощью анализа 48 Исследовалась нативная опухолевая ткань, полученная в ходе оперативного вмешательства (127 образцов), а также парафиновые блоки (20 образцов) с гистологически подтвержденным диагнозом. Также были исследованы клеточные линии нейробластомы IMR-32 (c амплификацией гена MYCN), Kelly (с амплификацией MYCN и делецией 1p) и SH-SY5Y (с нормальным количеством копий MYCN, без делеции 1p). В качестве контрольных образцов ткани, не имеющей исследуемых аберраций, были использованы лейкоциты периферической крови 10 здоровых доноров (для ПЦР-РВ и MLPA), лейкоциты периферической крови или цитологически интактного костного мозга обследуемых больных нейробластомой (n=73, для ПЦР VNTR) и 5 парафиновых блоков с образцами ткани аденокарциномы легкого с верифицированным лечебным патоморфозом (для MLPA). Выделение геномной ДНК из клеточных линий, лейкоцитов и нативных образцов ткани (n=66) осуществляли либо методом фенол-хлороформной экстракции, либо с использованием коммерческого набора Wizard genomic DNA purification kit (Promega, США) (n=61) в соответствии с инструкцией производителя. Для опухолевого материала из парафиновых блоков использовался набор RecoverAll Total nucleic acid isolation (Ambion, США) с предварительной депарафинизацией о-ксилолом. Концентрация выделенной ДНК измерялась с помощью спектрофотометрии, в последующие реакции MLPA и ПЦР вносили 100 нг геномной ДНК. Для определения количества копий гена MYCN использовался метод мультиплексной одновременная количественной амплификация ПЦР-РВ. фрагмента При гена нем MYCN и происходит одного из референсных генов POLR2D (2q21) или NAGK (2p13.3). Известно, что данные гены не вовлечены в патогенез нейробластомы, они не вовлекаются в амплификацию совместно с MYCN и их количество остается стабильным [17,84]. Количество копий гена MYCN рассчитывали по следующей формуле: N=2- (Ct MYCN - Ct РГ) ×2, 49 где N – количество копий гена MYCN в диплоидном наборе хромосом клетки, Ct MYCN —величина порогового цикла MYCN, Ct РГ – величина порогового цикла референсного гена. ПЦР-РВ проводилась с использованием химически-инактивированной TaqF полимеразы (ЦНИИЭ, Россия) на детектирующих амплификаторах IQ5 (BioRad, США) или Stratagene MX3005P (Agilent, Германия). При амплификации гена MYCN величина количества копий, рассчитанная по формуле, превышает 10. О наличии нормального количества копий гена MYCN свидетельствуют близкие величины пороговых циклов анализируемого и референсного генов (рисунок 3 в,г). При этом их разность находится в диапазоне от -1,11 до 2,88 (медиана = 0,14). В период с 1997 по 2008 год определение числа копий MYCN осуществлялось методом конкурентной ПЦР (рисунок 3 а,б), которая основана на коамплификации специфической последовательности ДНК гена MYCN вместе с известными концентрациями внутреннего стандарта в одной реакционной пробирке. В реакции использовались серийные разведения ДНК внутреннего стандарта и постоянное количество анализируемой ДНК пациента либо контрольного образца с известным количеством копий гена MYCN, которые добавлялись в каждую пробирку. Внутренний стандарт и амплифицируемый фрагмент гена MYCN имели идентичные участки присоединения праймеров и амплифицировались с приблизительно равной эффективностью, при этом размер ПЦР продуктов различался [43]. Продукты ПЦР разделялись методом электрофореза в 2% агарозном геле и окрашивались бромистым этидием. Документирование полученных результатов проводилось с использованием системы Gel DocXR (BioRad, США), денситометрия ПЦР-продуктов – в программе Quantity One (BioRad, США). Оценивалось соотношение величин интенсивности свечения ПЦРпродуктов, соответствующих внутреннему стандарту и фрагменту гена MYCN в образце ДНК. При наличии амплификации интенсивность свечения 50 ПЦР-продукта гена MYCN соответствовала разведению ДНК внутреннего стандарта, равного 2×10-5. При нормальном числе копий интенсивность свечения ПЦР-продукта гена MYCN была идентичной разведению ДНК внутреннего стандарта 1×10-6. Аналогичное соотношение выявлялось при использовании ДНК из лейкоцитов здоровых доноров в качестве исследуемого образца. Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР, а также праймеров и зондов для ПЦР-РВ приведены в таблице 2. Таблица 2 Нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов, использованных для определения количества копий гена MYCN Ген MYCN POLR2D NAGK MYCN для конкурентной ПЦР Образцы исследованные Прямой праймер Обратный праймер Зонд FAM-agc-cttcct-tcg-gtc-cag- ttg-gcg-gcc-ttcgtg-cag-tggctt-tct-ca tca-ttc-t cag-cca-gtBHQ1 ROX-agc-cttccc-agg-tga-cat- gca-gag-gcagtg-cag-tgggga-atc-ttg cgt-tca-gga-a cag-cca-gtBHQ2 ROX-tgt-tgctgg-gca-gaccac-ctt-cac-tccccg-aga-ttg-accaca-tcg-tag-ca cac-ctc-aac cgg-t-BHQ2 cat-cca-ccacca-gag-gctgca-gca-caaccc-aac-cgt-cac cta-tg пациентов, методом получавших конкурентной лечение ПЦР, до были 2008 Источник [17] [17] [84] года и дополнительно проанализированы в ретроспективном режиме, используя метод ПЦР-РВ. Таким образом, исследование амплификации гена MYCN обеими методиками было выполнено 82 больным, что позволило сравнить диагностические возможности методов. 51 Рисунок 3. Методы определения количества копий гена MYCN: а,б. – конкурентная ПЦР; в,г. – ПЦР в режиме реального времени, красная кривая соответствует гену MYCN, синяя – референсному гену NAGK; д,е. – FISH с использованием флуоресцентного зонда N-MYC Amplification LPS 009 (а,в,д. – нормальное число копий MYCN; б,г,е. – амплификация гена MYCN). 52 Обнаружение делеции 1p осуществлялись с помощью анализа вариабельного числа тандемных повторов в области короткого плеча хромосомы 1 (ПЦР VNTR). Для этого ДНК из ткани опухоли вносилась в 6 моноплексных ПЦР с использованием праймеров, специфичных к двум минисателлитным локусам (D1S76 и D1S80) и четырем микросателлитным локусам (D1S214, D1S436, D1S2663 и D1S2697). В качестве контроля проводилась ПЦР с использованием ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови или цитологически интактного костного мозга того же пациента. ПЦР проводилась с использованием TaqF полимеразы (ЦНИИЭ, Россия) в амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Детекция результатов ПЦР осуществлялась с помощью вертикального электрофореза в 10% полиакриламидном геле. При обнаружении делеции, а также в спорных случаях проводился электрофорез флуоресцентно-меченных ПЦР-продуктов на микроструйных ДНК-чипах (Caliper Technologies, США) с помощью прибора Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Германия). Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР приведены в таблице 3. Таблица 3 Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для выявления делеции 1p с помощью ПЦР VNTR Локус D1S2697 D1S436 Прямой праймер agg-tgg-gag-gat-tgc-cta-agc-cta aat-att-gaa-tgt-gtc-tcc-agt-gttagc-a D1S214 cca-ctg-cac-ttc-agc-ccg-aat-g D1S2663 D1S80 D1S76 tct-ctg-ttt-tag-gaa-cct-gcg-tgt ccg-gtc-ctg-cgt-gtg-aat-gac-tca ggt-gtc-agc-gga-tga-agg-ttt-ttg-t Обратный праймер ctc-acg-gca-acc-ctg-gga-gta-a ctg-tag-agc-aat-ctg-gca-ata-tgt aat-gtt-gtt-tcc-aaa-gtg-gct-gtagca-t cct-ctc-gga-gtc-ttt-ctt-ctc-aac-ta ttg-ttg-gag-atg-cac-gtg-ccc-ctt gaa-cgt-gtg-cac-tga-tgt-agc-ggt-t При интерпретации электрофореграмм имели место три варианта результатов (рисунок 4). I. В ходе амплификации как опухолевой, так и 53 неопухолевой ДНК получены два ПЦР-продукта с различной молекулярной массой, соответствующие двум аллелям анализируемого локуса: выявлено гетерозиготное состояние, делеция данного локуса хромосомы 1 отсутствует. II. В случае использования ДНК из ткани опухоли получен один ПЦРпродукт, тогда как при использовании ДНК из лейкоцитов - два: в клетках опухоли обнаружена потеря гетерозиготности по исследуемому локусу, указывающая на наличие делеции 1p. III. В обоих случаях получен один ПЦР-продукт – имеет место гомозиготное состояние и анализ данного локуса неинформативен. С учетом расположения потерянных локусов в составе хромосомы 1, была поведена идентификация интерстициальной и терминальной делеции 1p [19,135]. Рисунок 4. Электрофореграммы ПЦР-продуктов при определении делеции 1p с помощью анализа вариабельного числа тандемных повторов. Стрелками отмечены анализируемые аллели в ДНК из ткани опухоли и лейкоцитов периферической крови, используемой для сравнения. 54 Для анализа аберраций в клетках нейробластомы методом MLPA использовались три панели зондов: SALSA P251, содержащая 34 зонда для хромосом 1, 3 и 11; SALSA P252 (33 зонда для хромосом 2 и 17); SALSA P253 (33 зонда для хромосом 4, 7, 9, 12 и 14) (MRC-Holland, Нидерланды). Исследуемые регионы были выбраны для детекции аберраций, являющихся доказанными (амплификация MYCN, делеции 1p и 11q, увеличение материала 17q), или потенциальными (делеции 3p, 4p, увеличение материала 1p, 2p) факторами прогноза при нейробластоме. Каждая панель содержит 10 контрольных зондов, специфичных для регионов, в которых редко возникают делеции и амплификации при нейробластоме (регионы 5p, 6p, 15q, 16p, 16q, 19q, 20q, 21q). Для выявления делеции 1p и амплификации гена MYCN с помощью технологии MLPA использовались наборы SALSA P251 и SALSA P252, содержащие олигонуклеотидные зонды для соответствующих хромосомных регионов. В каждой постановке MLPA использовались 27 образцов ДНК из ткани опухоли пациентов и 5 образцов контрольной (неопухолевой) ДНК, выделенной тем же способом, что и исследуемая ДНК опухоли. На первом этапе осуществлялась денатурация ДНК-матрицы и присоединение двух частей олигонуклеотидных зондов. Далее проводилась лигазная реакция, в результате которой части зондов соединялись, образуя единую молекулу. Продукты лигазной реакции переносили в ПЦР-смесь, содержащую праймеры, меченные флуорохромом FAM, являющиеся универсальными для амплификации всех лигированных зондов. Таким образом, в результате MLPA происходит многократное копирование олигонуклеотидных зондов, а не ДНК матрицы. Размер ампликонов различается за счет включения балластной последовательности в амплифицируемый зонд. Этапы MLPA (присоединение, лигирование и амплификация зондов) осуществлялись с использованием набора реагентов SALSA MLPA EK1-FAM (MRC-Holland, Нидерланды) и амплификатора GeneAmp System 9700 (Applied Biosystems, 55 США). Для детекции результатов применялся капиллярный электрофорез с помощью генетического анализатора ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Обработка полученных результатов проводилась с использованием программы GeneMapper (Applied Biosystems, США), анализ данных – в программе Coffalyser (MRC-Holland, Нидерланды). Анализ результатов MLPA основывается на расчете соотношения количества амплифицированного зонда в исследуемом образце ДНК к количеству того же зонда в образцах референсной ДНК. Этому предшествует процесс нормализации данных внутри каждой постановки MLPA (на основании 10 контрольных зондов, включенных в набор) и между отдельными постановками внутри эксперимента (на основании референсных образцов ДНК) [132]. В результате рассчитывается величина соотношения (ВС) количества каждого амплифицированного зонда в исследуемом образце к усредненному количеству аналогичного зонда в референсных образцах того же эксперимента. Европейская группа по исследованию нейробластомы SIOPEN сформулировала критерии для интерпретации результатов MLPA. При отсутствии аберраций, связанных с изменением числа копий анализируемого региона значение ВС составляет от 0,75 до 1,25. Оно одинаково для зондов специфичных к обоим плечам исследуемой хромосомы, а также для контрольных зондов. При увеличении плоидности клеток нейробластомы значительного роста ВС не происходит за счет нормализации увеличение внутри постановки: отношения сигналов имеет место контрольных пропорциональное зондов. В случае гетерозиготной делеции происходит снижение ВС как минимум для двух смежных зондов до значений 0,5-0,75. При гомозиготной делеции сигнал от зондов исследуемого региона отсутствует. Увеличение ВС сигналов от более чем двух смежных зондов до значений 1,25-3,0 расценивается как увеличение генетического материала анализируемого региона, а при выявлении значения более 3,0 делается вывод о наличии амплификации. В то же время, 56 увеличение или уменьшение ВС сигналов от одного зонда, при условии нормальных значений ВС для рядом расположенных зондов, игнорируется. [14,16]. Определение амплификации гена MYCN и делеции 1p методом FISH было выполнено 22 больным с верифицированным диагнозом нейробластома. Анализировались мазки-отпечатки ткани, сделанные из двух и более участков опухоли. Для проведения исследования количества копий MYCN использовались наборы флуоресцентных зондов Vysis LSI N-MYC (2p24) SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange Probe (Abbott Molecular, США) и N-MYC Amplification LPS 009 (Cytocell, Великобритания) в соответствии с инструкцией производителя. В каждом наборе один из зондов связывается с локусом 2p24, содержащим ген MYCN и позволяет определить количество его копий в клетке. Второй зонд специфичен к центромерной или перицентромерной области хромосомы 2 и дает возможность оценить плоидность клеток (рисунок 3 д,е). Для выявления делеции 1p применялся набор флуоресцентных зондов Vysis 1p36 Microdeletion Region Probe – LSI p58 (1p36) (SpectrumOrange)/TelVysion 1p (SpectrumGreen)/LSI 1q25 (SpectrumAqua). В каждый набор входит три зонда, два из которых (TelVysion 1p и LSI p58 (1p36)) специфичны к региону короткого плеча хромосомы 1, вовлекаемому в делецию, третий, являющийся контрольным, связывается с регионом 1q25 длинного плеча хромосомы 1 (рисунок 5). 57 а б 3x1q 3x1p 4x1q 2x1p Рисунок 5. Выявление делеции 1p методом FISH с использованием флуоресцентного зонда TelVysion 1p (a. – отсутствие делеции 1p, б. – делеция 1p). Во всех 127 образцах (122 образца первичной опухоли и 5 образцов ткани опухоли после прогрессии или рецидива), в которых исследовалась амплификация MYCN и делеция 1p с помощью MLPA, количество копий гена MYCN было определено с использованием ПЦР-РВ, в 73 из них осуществлялся анализ делеции 1p методом ПЦР VNTR. Кроме того, в 22 образцах поиск исследуемых аберраций проспективно был осуществлен методом FISH. Применение нескольких методик позволило оценить качественную сходимость результатов используемых технологий. 2.3. Исследование прогностической значимости генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов Оценка прогностической значимости выявленных генетических аберраций проводилась на основании расчета 5-летней ОВ и БСВ пациентов. Для определения влияния аберраций хромосом 1,2,3,11,17 на показатели выживаемости больных использовались данные о долгосрочном наблюдении 58 за 108 пациентами. На основании показателей выживаемости данных больных был сделан вывод о влиянии клинических факторов риска на прогноз нейробластомы. Данные о наблюдении за 19 пациентами, которым был выполнен анализ генетических аберраций хромосом 1 и 2, отсутствовали, и они не были включены в расчет ОВ и БСВ. Среди 108 пациентов, включенных в исследование, 90 имели гистологический диагноз нейробластома, 10 – ганглионейробластома, 8 – ганглионеврома. Медиана возраста составила – 14,1 месяца, соотношение девочек и мальчиков – 1,2:1 (59 и 49 пациентов соответственно). У 25,0% пациентов (27 больных) была выявлена I стадия опухоли, у 9,3% (10) – II стадия, у 22,2% (24) – III стадия, у 33,3% (36) – IV стадия, у 10,2% (11) – стадия IVS. Все 100 пациентов, которым был выполнен поиск аберраций хромосом 4,7,9,12 и 14, были включены в исследование влияния соответствующих генетических маркеров на ОВ и БСВ. 2.4. Исследование инициального поражения КМ и оценка МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов Для выявления поражения КМ и оценки МОБ была сформирована панель, состоящая из широко применяемых для выявления поражения КМ при нейробластоме маркеров PHOX2B, TH и GD2 [36,48,170,171,176,189], которая была дополнена обладающим высокой чувствительностью, по данным литературы, ELAVL4 [176]. Экспрессия генов была исследована в 331 образце КМ, полученном от 57 пациентов с верифицированным диагнозом нейробластомы на разных этапах терапии. Все пациенты получали терапию в Областной детской клинической больнице №1 (г. Екатеринбург) по протоколу NB2004 в период с 2005 по 2010 годы. Распределение пациентов по стадиям заболевания было следующим: I стадия – 17 (29,8%) пациентов, II 59 стадия – 4 (7,0%), III стадия – 13 (22,8%), IV стадия – 18 (31,6%), стадия IVS – 5 (8,8%). 116 образцов было взято на момент первичной диагностики, 181 образец – в ходе терапии, 34 – при диагностике рецидива. Для выявления экспрессии исследуемых генов клетками нормального КМ были исследованы 26 образцов от 21 пациента без злокачественных опухолей. В качестве позитивного контроля были использованы клеточные линии нейробластомы IMR-32 и Kelly. В каждом образце общая РНК была выделена из 2×106 ядросодержащих клеток с использованием TRI-reagent (Molecular Research Center, США) с последующей обработкой ДНКазой I (Fermentas, США). Концентрация выделенной РНК измерялась спектрофотометрически, качественная и количественная оценка РНК проводилась с использованием микроструйных чипов (Caliper Technologies, США) на приборе Agilent 2100 (Agilent, Германия). В дальнейшую работу брались образцы, в которых показатель целостности РНК (RIN) превышал 4,2. Реакция обратной транскрипции проводилась с использованием MMLV-обратной транскриптазы (ЦНИИЭ, Россия) и смеси случайных пентадекамеров (Синтол, Россия). Комплементарная ДНК (кДНК) в количестве, эквивалентном 100 нг РНК, служила матрицей в мультиплексной ПЦР-РВ. В качестве референсного гена был выбран ген ABL. ПЦР-РВ проводилась в конечном объеме 25 мкл с использованием TaqF ДНК-полимеразы (ЦНИИЭ, Россия). Нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов приведены в таблице 4. Нормализованная величина экспрессии рассчитывалась как разность пороговых циклов гена ABL и гена-маркера (∆Ct = CtABL-Ctмаркера). 60 Таблица 4 Нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов, использованных для оценки экспрессии опухоль-ассоциированных генов Ген Прямой праймер Обратный праймер PHOX2B ggc-acc-ctc-agggac-ca ctg-cgc-gct-cctgct-t TH att-gct-gag-atcgcc-ttc-ca aat-ctc-ctc-ggcggt-gta-ctc GD2 agc-cga-agc-taccag-acc-aa gga-tag-tga-aagcag- cct-cat-gt ELAVL4 aat-gga-ctc-agactc-cag-acc-aa cat-aga-ggt-tagcat-ccc-tga-ttg-a ABL agc-tcc-ggg-tcttag-gct-at tag-ttg-ctt-gggacc-cag-cc Аналитическая чувствительность Зонд Источник ROX-cca-gaaccg-ccg-cgc-caaRTQ2 TAMRA-aca-ggcacg-gcg-acc-cgattc-BHQ2 ROX-aca-gcagac-aca-gtc-cggttc-tcc-acc-BHQ2 R6G-cca-taa-aggtct-cat-acg-cccgtc-cga-BHQ1 FAM-cca-ttt-ttggtt-tgg-gct-tcacac-cat-t-BHQ1 методики оценивалась [170] [176] [176] [176] [7] с использованием 10-кратных разведений РНК, выделенной из клеток линии IMR-32, а также смеси РНК из ткани опухоли 10 пациентов с верифицированных диагнозом нейробластомы. С этой целью РНК разводили в РНК, выделенной из ядросодержащих клеток периферической крови 5 здоровых доноров. Образцы КМ также исследовали цитологически с окрашиванием препаратов по Романовскому-Гимзе. Обнаружение экспрессии РНОХ2В наряду с выявлением опухолевых клеток при микроскопии цитологических препаратов было выбрано в качестве критерия наличия поражения костного мозга клетками нейробластомы. С целью оценки специфичности для клеток нейробластомы генов, отобранных в качестве потенциальных маркеров поражения КМ, была 61 проанализирована их экспрессия в образцах КМ пациентов с другими негемопоэтическими солидными опухолями. В исследование вошли по одному пациенту со злокачественной депигментированной меланомой (стадия IV), ретинобластомой (стадия IV), эмбриональной рабдомиосаркомой (стадия III), злокачественной феохромоцитомой, эпендимомой, а также 5 больных альвеолярной рабдомиосаркомой (3 со стадией IV и 2 со стадией III) и 8 пациентов с саркомой Юинга или примитивной нейроэктодермальной опухолью (ПНЭО): 2 со стадией II, 2 со стадией III и 4 со стадией IV. Всего было исследовано 75 образцов КМ, полученных как во время первичной диагностики, так и во время лечения. Образцы КМ были разделены на позитивные и негативные. Позитивным образцы признавались в том случае, если при любой нозологической форме в цитологических препаратах КМ определялись атипичные клетки. Кроме того, в случае выявления транслокаций t(11:22) EWS-FLI1, t(21:22) EWS-ERG и/или экспрессии гена NKX2-2 при саркоме Юинга/ПНЭО, а также t(2:13) PAX3-FKHR или t(1:13) PAX7-FKHR при альвеолярной рабдомиосаркоме. В образцах КМ анализировалась нормализованная величина экспрессии генов PHOX2B, TH, ELAVL4 и GD2, которая сравнивалась с пороговым уровнем экспрессии каждого маркера, определенным с помощью ROC-анализа. Образцы считались позитивными по данному маркеру, если величина его экспрессии превышала пороговый уровень (ПУ). 2.5. Сравнение применения ПЦР-РВ и проточной цитометрии для выявления поражения КМ и оценки МОБ Для оценки качественной сходимости результатов определения поражения КМ с помощью выявления экспрессии опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрии были проанализированы 326 образцов КМ 52 больных с верифицированным диагнозом нейробластома. 108 из них были 62 получены на момент первичной диагностики опухоли, 168 – в процессе лечения и 51 при диагностике рецидива. В образцах КМ оценивалось наличие экспрессии генов PHOX2B и/или TH с помощью ПЦР-РВ, а также наличие опухолевых клеток методом проточной цитометрии. Иммунофенотипирование опухолевых клеток в костном мозге производились методом 2-6-цветной проточной цитометрии на двухлазерных проточных цитометрах “FACS Canto” и “FACS Canto II” (Becton & Dickinson (BD), США). Настройка приборов производилась с использованием калибровочной системы “7-color Setup Beads” (BD). Мониторинг стабильности работы приборов осуществлялся при помощи калибровочных частиц “Cytometer Setup and Tracking” (BD). Использовались моноклональные антитела (МкАТ), меченные флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), R-фикоэритрином (PE), перидининхлорофилл-протеином (PerCP), аллофикоцианином (АРС), а также тандемными конъюгатами PE и АРС с цианином 7 (Cy7). Для определения клеток нейробластомы применялись моноклональные антитела, представленные в таблице 5. Окрашивание первичномеченными МкАТ производилось согласно инструкции производителя. После инкубации суспензии костномозговых клеток с МкАТ взвесь обрабатывалась лизирующим раствором («FACS Lysing solution» BD), а затем отмывалась фосфатно-солевым буфером иммунофенотипирования («Cell оценивались Wash», при BD). помощи Результаты программного обеспечения FACS Diva 4.0-6.1 (BD). Анализировали не менее 100000 ядросодержащих клеток. Опухолевые клетки выделяли на точечных графиках по отсутствию экспрессии CD45 (в качестве отличия от гемопоэтических клеток), экспрессии остальных маркеров (NB84, GD2, CD81, CD56, CD9), а также значениям параметров прямого и бокового светорассеяния (FSC и SSC), соответствующим клеткам нейробластомы. Образцы считали позитивными при обнаружении не опухолевых клеток среди всех ядросодержащих клеток КМ. менее 0,01% 63 Таблица 5 Моноклональные антитела, применявшиеся для выявления клеток нейробластомы Флуорохром Моноклональные антитела FITC CD81, NB84* PE GD2, CD45, CD81 PerCP CD9, CD45 PE-Cy7 CD56 APC CD81, CD56 APC-Cy7 CD45 Примечание: * антитела производства Novocastra (США), остальные антитела произведены Becton & Dickinson (США). 2.6. Исследование поражения КМ и оценка МОБ с помощью молекулярного маркера, основанного на анализе метилирования геномной ДНК В качестве молекулярного маркера поражения КМ был выбран ген RASSF1a, промоторный регион которого гиперметилирован в клетках нейробластомы, тогда как в неопухолевых клетках он остается неметилированным [173]. Анализ метилирования гена RASSF1a был осуществлен в 217 образцах КМ 42 больных нейробластомой. 39 пациентов имели гистологический диагноз нейробластома, 3 – ганглионейробластома. Медиана возраста – 12,8 месяцев. У 7,1% (3 пациента) была выявлена I стадия заболевания, у 26,2% (11) – III стадия, у 50,0% (21) – IV стадия, у 16,7% (7) – стадия IVS. 101 образец КМ был получены при первичной диагностике нейробластомы, 91 – в ходе терапии, 25 – при диагностике рецидива или прогрессии опухоли. В качестве негативного контроля использовались 5 образцов КМ от 5 пациентов без злокачественных опухолей, в качестве позитивного контроля – образцы клеточных линий нейробластомы IMR-32, Kelly и SH-SY5Y. Из каждого образца была выделена геномная ДНК с использованием набора QiaAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с 64 инструкцией производителя. Концентрация выделенной ДНК оценивалась спектрофотометрически. 1500 нг геномной ДНК вносились в реакцию бисульфитной конверсии. Бисульфитная конверсия ДНК и дальнейшая очистка проводились с использованием набора EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Германия). Конвертированная ДНК использовалась в двух ПЦР-РВ с комбинациями праймеров и зондов, специфичных к метилированной и неметилированной формам гена Нуклеотидные RASSF1a. последовательности праймеров и зондов приведены в таблице 6. Таблица 6 Нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов, использованных для исследования метилирования гена RASSF1a Ген Прямой праймер Обратный праймер RASSF1a метилированный gcg-ttg-aagtcg-ggg-ttc aaa-ccc-gtactt-cgc-taactt-taa-ac RASSF1a неметилированный tgt-gtt-tgt-tagtgt-tta-aag-ttagtg-aag-tat-g aca-ctc-caacca-aat-acaacc-ctt Зонд FAM-aca-aacgcg-aac-cgaacg-aaa-ccaTAMRA FAM-cac-acccaa-caa-atacca-act-cccaca-actTAMRA Источник [173] [173] ПЦР-РВ осуществлялась с использованием TaqF ДНК полимеразы (ЦНИИЭ, Россия) на приборе Stratagene MX3005P (Agilent, Германия). Образцы КМ расценивались как позитивные в случае обнаружения метилированного гена RASSF1a. 2.7. Исследование прогностической значимости инициального поражения КМ и оценки МОБ у больных нейробластомой Оценка прогностической значимости выявления поражения КМ с помощью молекулярных маркеров основывалась на анализе показателей 5- 65 летней ОВ и БСВ пациентов. Для определения прогностической значимости обнаружения экспрессии опухоль-ассоциированных генов в КМ оценивалось наличие экспрессии генов PHOX2B и/или TH выше рассчитанного с помощью ROC-анализа порогового уровня. Для оценки прогностической значимости поражения КМ анализировались образцы, полученные на момент первичной диагностики опухоли. В случае если образцы, полученные при первичной диагностике, отсутствовали, а в образцах, полученных в процессе лечения, выявлялась экспрессия PHOX2B и/или TH, пациент расценивался как имеющий поражение КМ. В том случае, если образцы, полученные в процессе лечения, были негативны – пациент исключался из исследования. Для оценки прогностической значимости наличия МОБ анализировались образцы КМ, полученные после проведения индукционной терапии (6 блоков химиотерапии), а также перед аферезом АГСК, у пациентов, имеющих поражение КМ при первичной диагностике. В исследование было включено 75 пациентов с морфологическим диагнозом нейробластома (63 пациента), ганглионейробластома (7 пациентов) и ганглионеврома (5 пациентов). Медиана возраста – 11,2 месяцев. У 34,7% (26 пациентов) была выявлена I стадия заболевания, у 5,3% (4) – II стадия, у 22,7% (17) – III стадия, у 26,7% (20) – IV стадия, 10,6% (8) – стадия IVS. В исследование прогностической значимости выявления метилированного гена RASSF1a в КМ были включены все пациенты, которым проводилось определение данного маркера, за исключением двух пациентов с IV стадией нейробластомы, у которых отсутствовали данные об инициальном поражении КМ. Экспрессия генов PHOX2B и TH анализировалась в 18 препаратах АГСК с целью выявления их контаминации опухолевыми клетками. В 14 случаях проводилась CD34+ иммуномагнитная селекция. Также учитывалось наличие поражения КМ, выявляемое на основании экспрессии опухольассоциированных генов, перед проведением лейкафереза. 66 2.8. Качественная и количественная оценка РНК, используемой для выявления поражения КМ и оценки МОБ Использование интактной РНК является основой для получения адекватных результатов при исследовании экспрессии генов методами ПЦР или с использованием биологических чипов. В настоящее время для качественной и количественной оценки РНК используются несколько методик, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки [114]. Измерение поглощения ультрафиолетового света с длиной волны 260 нм на УФ-спектрофотометре не предполагает дополнительных стадий после выделения РНК и отличается относительно высокой воспроизводимостью данных. Однако недостатком этого метода является искажение результатов при контаминации геномной ДНК или фенолом, которые также поглощают свет в аналогичном с РНК диапазоне длины волны. Методики, основанные на использовании интеркалирующих флуоресцентных красителей, таких как Ribogreen, характеризуются относительно высокой чувствительностью и специфичностью в отношении РНК, но воспроизводимость результатов из-за длительных манипуляций с исследуемыми образцами РНК невысока [114,131]. Биоанализатор Agilent 2100 (Agilent, Германия) и наборы RNA LabChip (Caliper Technologies, США) являются инструментом для количественной и качественной оценки РНК. Принцип работы биоанализатора основан на разделении флуоресцентно меченых образцов РНК методом капиллярного электрофореза с одновременной детекцией интенсивности флуоресценции [105]. В ходе измерения определяются такие показатели, как концентрация РНК в образце, соотношение между 18S и 28S субъединицами рибосомальной РНК и показатель целостности РНК (RNA integrity number – RIN) [105,143]. Деградация РНК является процессом постепенным, в ходе которого 67 происходит нарастание числа короткоцепочечных фрагментов, что отражается на электрофореграмме в виде прогредиентного уменьшения соотношения рибосомальных пиков 18S к 28S и увеличения фонового сигнала между рибосомальными пиками и нижним маркером. Программное обеспечение биоанализатора вычисляет соотношение между рибосомальными субъединицами 18S и 28S, которое является одним из критериев степени деградации РНК. Параллельно с этим рассчитывается RIN, который классифицируется по шкале от 1 до 10, где 1 – соответствует максимально деградированному профилю, а 10 – полностью интактному [77,105,114,131,143,151]. Применение частично или полностью разрушенной РНК может привести к искажению результатов, поэтому важно оценивать качество РНК, вносимой в реакцию обратной транскрипции и, в дальнейшем, в ПЦР. В качестве исходного материала использовались 496 образцов КМ, полученных от 174 пациентов и 124 образца периферической крови (ПК) от 124 пациентов, находившихся на лечении в Отделе детской онкологии и гематологии ОДКБ№1 (Екатеринбург), а также других лечебно- профилактических учреждениях Российской Федерации. Исследовались образцы больных с различными онкологическими и онкогематологическими заболеваниями, а также пациенты без злокачественных новообразований. Распределение количества пациентов и образцов по нозологическим формам представлено в таблице 7. Таблица 7 Количество пациентов с различными нозологическими формами и образцов КМ и крови, использованных для оценки РНК Костный мозг Диагноз Нейробластома Опухоли семейства Периферическая кровь Количество Количество Количество Количество образцов пациентов образцов пациентов 331 59 — — 59 9 — — 68 саркомы Юинга Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) Острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) Пациенты без онкологических заболеваний Всего Взятие материала 45 45 12 12 18 18 16 16 20 20 85 85 23 23 11 11 496 174 124 124 для проведения молекулярно-генетического исследования (ПК и аспираты КМ) осуществлялось в вакуумные пробирки, в которых в качестве антикоагулянта использовалась калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (К3ЭДТА). Срок доставки материала в лабораторию варьировал от 0 до 24 часов. Ядросодержащие клетки КМ и ПК выделяли путем двукратного лизиса эритроцитов в 0,84% растворе хлорида аммония. Количество лейкоцитов подсчитывалось на гематологическом счетчике KX-21 (Sysmex, Япония). Общую РНК выделяли из 2×106 ядросодержащих клеток КМ или ПК по методу Хомчинского с использованием TRI-reagent (MRC, США). На последнем этапе выделения РНК образцы обрабатывалась ДНКазой I (Fermentas, США). Концентрация РНК измерялась на спектрофотометре SmartSpec (Bio-Rad, США), а также с использованием комплекта реагентов RNA 6000 Nano Reagents (Agilent, Литва) и чипов RNA LabChip 6000 Nano (Caliper Technologies, США) на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent, Германия) согласно инструкции производителя. Анализ электрофореграмм проводился при помощи программного обеспечения Agilent 2100 Expert. РНК высокого качества имеет следующие характеристики: 1. Четкие и высокие пики 18S и 28S; 2. Отсутствие дополнительных пиков между рибосомальными пиками; 3. Ровная базовая линия; 4 Соотношение между пиками 18S и 28S более 2. При 69 разрушении РНК происходит смещение 18S и 28S пиков влево (в сторону меньшего времени), отмечаются осцилляции базовой линии, снижается высота пиков рибосомальной РНК, увеличивается сигнал в области малых РНК. После оценки качества на микроструйных биочипах 1 мкг РНК переводили в кДНК в присутствии MMLV обратной транскриптазы (ЦНИИЭ, Россия) и смеси случайных пентадекамеров или наномеров (Синтол, Россия). Комплементарная ДНК в количестве эквивалентном 100 нг РНК использовалась в качестве матрицы для проведения ПЦР-РВ с использованием ДиаТак-полимеразы (ЦНИИЭ, Россия). Все образцы тестировались в двух повторах. Определяли экспрессию гена ABL. Исходя из рекомендаций Europe Against Cancer, при оценке экспрессии гена ABL в качестве значения, взятого для разделения на образцы удовлетворительного и неудовлетворительного качества, был принят пороговый цикл равный 30 [77]. В том случае, если величина порогового цикла превышала 30, образец расценивался как имеющий неудовлетворительное качество выделения РНК, исходя из чего делался вывод о критическом уровне деградации РНК. При анализе результатов исследования не было получено достоверных различий при оценке образцов КМ и ПК. Медиана RIN в образцах КМ составила 7,1 (диапазон 2,2-8,6), в ПК – 6,9 (диапазон 2,5-8,0) (p=0,087). Также не выявлено статистически достоверных различий при сравнении показателя целостности РНК в группах пациентов с различными нозологическими формами. Так, в образцах пациентов с нейробластомой медиана RIN составила 7,0 (диапазон 2,3-8,5), с опухолями семейства саркомы Юинга - 7,1 (диапазон 2,7-7,8), с ОЛЛ - 6,8 (диапазон 2,1-7,0), с ОМЛ - 6,6 (диапазон 2,4-7,2), с ХМЛ - 6,8 (диапазон 3,0-7,4), в образцах пациентов без злокачественных новообразований 7,0 (диапазон 2,4-8,3), p=0,356. 70 Для оценки воспроизводимости измерения концентрации РНК, а также величины RIN при разных концентрациях, было проведено исследование исходной РНК, а также её разведений. Из каждого образца была однократно выделена РНК, которая затем разводилась в 5 и 10 раз. Каждое измерение проводилось в 10 повторах. Результаты измерений представлены в таблице 8. Таблица 8 Оценка воспроизводимости измерения концентрации РНК и RIN Среднее Стандартное значение отклонение Измерение концентрации Исходная РНК, n=10 301,0 нг/мкл 4,58 нг/мкл РНК, разведенная в 5 раз, 68,0 нг/мкл 5,29 нг/мкл n=10 РНК, разведенная в 10 раз, 34,2 нг/мкл 4,75 нг/мкл n=10 Измерение показателя целостности РНК Исходная РНК, n=10 6,5 0,1 РНК, разведенная в 5 раз, 6,4 0,0 n=10 РНК, разведенная в 10 раз, 6,4 0,1 n=10 Коэффициент вариации, % 1,5 7,8 13,9 1,7 0,0 1,6 Также оценивалось влияние обработки ДНКазой I на сохранность РНК. С этой целью было измерено значение RIN до и после обработки ДНКазой I в 36 образцах пациентов с ОЛЛ. Медиана величины RIN до обработки ДНКазой составила 6,7 (диапазон 2,8-8,4) после обработки — 6,5 (диапазон 2,8-8,2), p=0,314. В ходе проведения ПЦР-РВ было выявлено 442 (71,3%) образца удовлетворительного качества (пороговый цикл до 30) с величиной RIN от 3,3 до 8,6 и 178 – неудовлетворительного качества, в которых значение RIN колебалось от 2,1 до 4,2. С использованием ROC-анализа был определен ПУ RIN, который достоверно подразделял образцы удовлетворительного и неудовлетворительного качества. Величина ПУ составила 4,2, площадь под кривой – 0,96 (p<0,001). 71 Таким образом, тип исходного материала или (ПК КМ) и нозологическая форма не оказывали значимого влияния на целостность РНК при её выделении методом Хомчинского. Микроструйные лабораторные чипы дают высокую степень воспроизводимости при измерении RIN и концентрации РНК, как в области высоких, так и в области низких значений концентраций. В ходе исследований было определено минимальное значение RIN равное 4,2, при котором достигается достаточная эффективность ПЦРРВ. 2.9. Статистическая обработка данных Для статистической обработки результатов использовались программы «Statistica 8.0», «Analyze-it» и «BioStat». Для сравнения количественных параметров в группах применялись критерии Манна-Уитни и КрускалаУоллиса. Для сравнения качественных параметров использовался критерий χ2 с поправкой Йетса. Анализ ОВ и БСВ пациентов проводился с помощью LogRank теста. Различия считались статистически достоверными при p<0,05. Значимость определения экспрессии исследуемых генов была проанализирована методом характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-кривых) [134,205]. Площади под кривыми (ППК) сравнивались по методу E.R. DeLong et al. [67]. Также были определены пороговые уровни показателей, характеризующиеся наибольшей диагностической эффективностью при разделении образцов, содержащих и не содержащих опухолевые клетки. С учетом ПУ для каждого теста были рассчитаны диагностическая чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, а также общая диагностическая эффективность теста [99,200]. 72 ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ АБЕРРАЦИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ИЗМЕНЕНИЕМ КОЛИЧЕСТВА КОПИЙ ГЕНОВ ИЛИ ХРОМОСОМНЫХ РЕГИОНОВ Прогностическое значение молекулярно-генетических аберраций в клетках нейробластомы оценивалось на основании наблюдения за 108 пациентами. Медиана времени наблюдения за больными составила 42 месяца (диапазон от 1 месяца до 13 лет). Пятилетняя БСВ составила 0,58±0,05, ОВ – 0,66±0,05. Данные выживаемости указывают на значительную долю неудач в лечении, особенно среди пациентов группы высокого риска, несмотря на проведение мультимодальной терапии. Применение молекулярно- биологических прогностических маркеров позволило бы осуществлять индивидуализированное риск-адаптированное лечение, добиваясь оптимальной эффективности и избегая избыточной токсичности. 3.1. Результаты определения количества копий гена MYCN и аберраций короткого плеча хромосомы 2 Амплификация гена MYCN является наиболее значимым неблагоприятным молекулярным фактором прогноза при нейробластоме [32,54,154]. При анализе образцов клеточных линий, амплификация MYCN была выявлена в клетках IMR-32 и Kelly, как конкурентной ПЦР, так и ПЦРРВ. В первом случае было определено более 40 копий конкурентной ПЦР и 56 копий ПЦР-РВ, во втором – более 50 и 588 копий соответственно. В клетках SH-SY5Y, а также в образцах лейкоцитов периферической крови здоровых доноров было обнаружено нормальное количество копий MYCN равное 2. При сравнении результатов определения амплификации гена MYCN в ткани опухоли 82 пациентов конкурентной ПЦР и ПЦР-РВ общая 73 сходимость составила 92,7%. Было выявлено 6 дискордантных результатов, в которых методом конкурентной ПЦР была выявлена амплификация, а ПЦРРВ показала нормальное количество копий MYCN. Амплификация гена MYCN была выявлена у 21 (17,2%) из 122 пациентов, обследованных методом ПЦР-РВ, при этом количество копий находилось в диапазоне от 10 до 216 (медиана 46). Метод MLPA позволил разделить обследованных пациентов на несколько групп в зависимости от количества копий гена MYCN и генов, картированных в данном (2p24.3) и смежных локусах. В случае если значение ВС соответствующих зондов в исследуемом образце составляло более 3, делался вывод о наличии амплификации гена MYCN самостоятельно или совместно с генами NAG, DDX1, ALK. Из 122 обследованных больных амплификация гена MYCN была выявлена у 21 (17,2%). При этом у 9 (7,4%) больных определялась амплификация только гена MYCN, у 5 (4,1%) – MYCN и DDX1, у 4 (3,3%) – MYCN, NAG и DDX1, у 2 (1,6%) – MYCN и ALK, у 1 (0,8%) – MYCN, DDX1 и ALK. У 28 пациентов методом MLPA было обнаружено увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, не достигающее порога амплификации (значения ВС от 1,25 до 3,0). Выделено два типа увеличения генетического материала анализируемого региона. При типе 1 происходит увеличение числа копий крупного региона короткого плеча хромосомы 2 от локуса 2p23.2 до теломерной области, что выражается в увеличении ВС для зондов, специфичных для генов ALK, MYCN, DDX1, NAG, TPO и TMEM18. При типе 2 происходит увеличение ВС для зондов, связывающихся с геном MYCN и генами, подвергающимися коамплификации с ним. Увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2 первого типа была отмечено у 13 пациентов (10,7%), второго типа – у 15 (12,3%). 74 В клетках линии Kelly с помощью MLPA была выявлена амплификация гена MYCN, в клетках IMR-32 – коамплификация генов MYCN, DDX1 и NAG, а в образце SH-SY5Y – нормальное количество копий MYCN. Значения ВС в случае нормального количества копий гена MYCN, амплификации MYCN, коамплификации MYCN с генами NAG, DDX1, ALK, а также наличия увеличения генетического приведены на рисунке 6 и в таблице 9. материала хромосомы 2, 75 Рисунок 6. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 2. А. – отсутствие аберраций хромосомы 2; Б. – амплификация гена MYCN и генов, картированных в регионе 2p24; В. – увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, тип 1; Г.- увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, тип 2. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню увеличения генетического материала (ВС=1,25). 76 Методы ПЦР-РВ и MLPA дали возможность обнаружить амплификацию гена MYCN у 21 пациента, однако метод ПЦР-РВ не позволил выявить наличие увеличения материала короткого плеча хромосомы 2, не достигающего порога амплификации. Во всех случаях увеличения материала 2p, детектированного MLPA, было определено нормальное количество копий гена MYCN методом ПЦР-РВ. Сопоставление результатов определения количества копий гена MYCN с помощью MLPA и ПЦР-РВ приведено в таблице 10. При определении количества копий гена MYCN методом FISH, амплификация была выявлена у 6 из 22 обследованных пациентов. При этом у данных больных амплификация гена MYCN была выявлена как с помощью ПЦР-РВ, так и с помощью MLPA. 77 Таблица 9 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 2, при различных аберрациях и нормальном состоянии хромосомы 2. Медиана (диапазон) Короткое плечо хромосомы 2 Зонд• Теломера TMEM18 TPO -2 -7 1,04 1,04 (0,41(0,851,65) 1,41) NAG24 1,05 (0,502,09) DDX1 -7 1,18 (0,721,99) DDX1 -15 1,12 (0,721,91) MYCN -3 1,05 (0,531,93) MYCN -3 1,05 (0,362,06) Амплификаци 0,99 я MYCN (0,571,74) 0,95 0,89 0,90 (0,84- (0,66- (0,781,11) 1,43) 1,41) 1,19 (0,741,78) 1,11 (0,821,79) 13,12 (5,1438,72) 13,71 (5,2632,66) Амплификаци 1,05 я MYCN и (0,24DDX1* 1,19) 1,04 1,09 (0,25- (1,091,93) 1,09) 11,53 (1,324,16) 19,12 (3,8425,29) 19,12 (4,4524,21) 21,16 (4,5163,92) Норма Амплификаци 1,17 я MYCN, (1,06DDX1 и NAG 1,21) Амплификаци я MYCN и ALK (DDX1)* Увеличение материала 2p, тип 1 0,95 (0,940,95) 1,45 (1,122,26) 0,79 Увеличение материала 2p, (0,55тип 2* 1,10) • NAG51 1,09 (0,471,70) 1,11 10,09 (0,82- (6,241,34) 10,79 ) 0,96 (0,851,07) 1,43 1,32 (1,22- (1,211,83) 1,73) 9,67 (8,8710,47 ) 1,10 (0,841,95) 1,38 (0,763,12) 12,79 (8,6235,72) 11,90 (8,2935,00) 16,18 (9,1466,75) 17,99 (6,8265,71) 1,19 (0,9911,99) 1,58 (1,192,30) 1,04 (0,8810,50) 1,40 (0,812,49) 18,64 (14,6025,20) 1,55 1,283,18) 14,12 (13,4617,21) 1,41 (1,092,67) 0,79 0,94 (0,62- (0,691,18) 1,19) 1,39 (1,021,77) 1,14 (0,861,64) 2,15 (1,452,83) 2,00 (1,442,43) Длинное плечо хромосомы 2 ALK27 1,06 (0,31 2,39) 1,22 (0,57 2,65) 0,92 (0,30 1,09) 1,18 (0,63 1,39) 4,97 (4,1817,96) 1,17 (1,00 1,50) 1,06 (0,58 1,40) ALK2 1,01 (0,72 1,30) 0,88 (0,69 1,23) 1,20 (0,72 1,32) 1,47 (1,04 1,77) Центромера RTN4 DYSF RPIA -6 -58 -2 1,10 1,00 1,04 (0,73- (0,35- (0,622,03) 1,33) 1,46) CFLAR -3 1,04 (0,722,50) CASP8 -3 1,07 (0,561,61) BMPR2 -1 1,06 (0,602,28) BMPR2 -10 1,09 (0,391,86) 1,04 0,95 0,87 0,97 (0,79- (0,55- (0,49- (0,501,19) 1,86) 1,08) 1,88) 0,96 (0,771,28) 0,96 (0,761,58) 1,03 (0,861,74) 0,99 (0,722,12) 0,63 0,94 0,96 1,08 (0,18- (0,28- (0,22- (0,281,01) 1,16) 1,16) 1,32) 0,88 (0,220,98) 0,77 (0,770,77) 0,98 (0,171,34) 0,95 (0,681,27) 1,20 1,06 0,98 0,84 (0,94- (0,86- (0,74- (0,502,39) 1,26) 1,17) 1,04) 1,08 (0,741,16) 0,96 (0,611,23) 1,05 (0,761,31) 1,16 (0,973,43) 0,94 (0,910,96) 1,24 (0,691,78) 1,04 (1,021,04) 1,08 (0,861,87) 1,01 (0,971,03) 1,08 (0,701,25) 1,05 (0,921,18) 1,18 (0,961,52) 1,13 (1,121,47) 1,23 (0,942,27) 1,39 (1,083,41) 1,10 (0,622,34) 1,25 0,92 0,73 1,59 (0,98- (0,61- (0,55- (0,991,61) 1,16) 1,03) 2,29) 0,95 (0,852,20) 1,17 (0,911,53) 1,28 (0,961,74) 2,06 (0,942,52) 0,80 (0,780,95) 1,14 (0,742,33) 1,06 (0,971,07) 1,06 (0,892,75) SCN1A -22 1,02 (0,651,60) - названия зондов состоят из наименования гена и номера экзона, к которому присоединяется зонд * - исследование проведено с использованием набора олигонуклеотидных зондов SALSA P252 (лот 1008), в котором зонды TPO-7 и ALK-2 отсутствуют 78 Таблица 10 Сопоставление результатов определения количества копий гена MYCN с помощью MLPA и ПЦР-РВ MLPA Увеличение Амплификация материала 2p (тип 1 и 2) Амплификация 21 0 Нормальное ПЦР-РВ количество 0 28 копий Достоверность различий p<0,001 Нормальное количество копий 0 73 Наибольшее количество пациентов с амплификацией гена MYCN и увеличением генетического материала 2p было отмечено среди больных с IV стадией нейробластомы – 22 из 42 (таблица 11). В то же время данные аберрации были обнаружены и у пациентов с наиболее благоприятными стадиями заболевания – I и IVS (14 из 33). Во всех случаях, где была выявлена амплификация гена MYCN, гистологическим вариантом опухоли являлась нейробластома. В образцах, морфологически интерпретированных как ганглионеврома и ганглионейробластома, амплификация MYCN отсутствовала, однако у 6 пациентов было обнаружено увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2. Также распределение больных по количеству копий гена MYCN достоверно различалось в зависимости от возраста пациентов на момент постановки диагноза. Только у трех из 54 обследованных пациентов младше 12 месяцев была выявлена опухоль, состоящая из клеток с амплификацией гена MYCN (таблица 11). 79 Таблица 11 Распределение больных в соответствии с количеством копий MYCN в зависимости от стадии заболевания, морфологического диагноза и возраста на момент постановки диагноза Амплифика ция Стадия I II III IV IVS 2 1 5 12 1 Увеличение материала 2p Нормальное количество копий Тип 1 Тип 2 3 2 1 7 0 6 0 4 3 2 26 7 13 20 7 1 4 10 7 8 58 9 6 36 37 p=0,002 Диагноз ГН ГНБ НБ 0 0 21 1 0 12 p=0,024 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 3 18 6 7 p=0,025 ГН – ганглионеврома, ГНБ – ганглионейробластома, НБ - нейробластома Медиана времени наблюдения за больными составила 42 месяца (диапазон от 1 месяца до 13 лет). БСВ в группе пациентов с амплификацией MYCN была достоверно ниже, чем у пациентов с нормальным количеством копий гена MYCN (0,20±0,11 и 0,69±0,06 соответственно, p<0,001) (рисунок 7,А.). ОВ в группе с амплификацией гена MYCN также была ниже, по сравнению с больными, имеющими опухоль с нормальным количеством копий исследуемого гена: 0,27±0,12 и 0,77±0,06 соответственно (p<0,001; рисунок 7,Б.). БСВ и ОВ пациентов, имеющих амплификацию только гена MYCN, и коамплификацию MYCN с одним или несколькими генами региона 2p24, между собой достоверно не отличалась (БСВ: 0,29±0,22 и 0,19±0,12, 80 p=0,979; ОВ: 0,21±0,19 и 0,29±0,13, p=0,805, соответственно). Также не было отмечено достоверных различий уровней БСВ и ОВ в группах больных с увеличением генетического материала 1 типа (БСВ: 0,39±0,16, ОВ: 0,50±0,15), 2 типа (БСВ: 0,59±0,16, ОВ: 0,74±0,17) и не имеющих аберраций короткого плеча хромосомы 2 (БСВ: 0,62±0,08, ОВ: 0,72±0,07). Рисунок 7. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с наличием амплификации гена MYCN (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 2 (сплошная кривая). В то же время, увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, прогностическое не достигающее значение у порога амплификации, пациентов, имеющих приобретает благоприятные клинические факторы. Увеличение материала 2p первого типа значимо влияет на показатель ОВ у пациентов со стадиями заболевания I-III и IVS: 0,53±0,25, при отсутствии аберраций короткого плеча хромосомы 2 - 0,92±0,05, p=0,026 (рисунок 8,А.). Одновременно с этим, увеличение материала 2p второго типа снижает БСВ у больных младше 1 года 0,53±0,25, по сравнению с 0,96±0,04 при отсутствии аберраций, p=0,047 (рисунок 8,Б.). 81 Рисунок 8. А. – Общая выживаемость больных нейробластомой стадий I-III и IVS с наличием увеличения генетического материала 2p первого типа (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 2 (сплошная кривая); Б. – Бессобытийная выживаемость больных младше 1 года с наличием увеличения генетического материала 2p второго типа (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 2 (сплошная кривая) Таким образом, все проанализированные методики показали высокую эффективность при выявлении амплификации MYCN. В клеточных линиях, имеющих амплификацию, она была обнаружена как методами, основанными на технологии ПЦР, так и MLPA, а в донорских лейкоцитах и клетках SHSY5Y было определено нормальное количество копий гена MYCN. При анализе образцов пациентов в 21 случае была определена амплификация MYCN, при этом результаты MLPA, ПЦР-РВ и FISH подтверждали друг друга. Результаты MLPA показали, что только в 9 случаях ген MYCN был амплифицирован самостоятельно, тогда как в 12 происходила коамплификация MYCN с генами NAG, DDX1 или ALK. Амплификация MYCN сочеталась с другими неблагоприятными прогностическими признаками: наиболее часто она выявлялась у пациентов с IV стадией заболевания и неблагоприятным гистологическим строением опухоли. В образцах ганглионевромы и ганглионейробластомы она не была выявлена ни в одном случае. У больных, старше 12 месяцев, имеющих худший прогноз по 82 сравнению с пациентами, младше 12 месяцев [72], амплификация MYCN выявлялась достоверно чаще. В то же время метод MLPA позволил выявить 28 пациентов, у которых количество копий гена MYCN было увеличенным, но не достигало порога амплификации. У данных больных с помощью ПЦР-РВ было определено нормальное количество копий MYCN. Описаны два типа увеличения генетического материала короткого плеча хромосомы 2, выявляемые с помощью MLPA. При первом типе происходит увеличение копий большого участка плеча, что рассматривается как сегментарная хромосомная аберрация, не влияющая на прогноз нейробластомы. При втором – происходит увеличение подвергающихся числа копий коамплификации с гена ним. MYCN Этот и/или тип генов, обусловлен гетерогенностью клеток внутри опухоли или разведением неопухолевой ДНК при наличии клеток, несущих амплификацию MYCN, что может ухудшать прогноз заболевания [14]. Тип 1 увеличения материала 2p был выявлен у 13 больных, тип 2 – у 15. При анализе ОВ и БСВ пациентов были выявлены достоверные различия между больными с наличием и отсутствием амплификации MYCN. Пациенты с нормальным количеством копий гена имели более высокие значения долгосрочной выживаемости, тогда как неблагоприятные события встречались у них значительно реже, чем у больных с амплификацией MYCN. Наличие коамплификации гена MYCN с генами NAG, DDX1 или ALK не оказывало влияния на показатели выживаемости по сравнению с наличием амплификации только MYCN. Было показано, что увеличение генетического материала короткого амплификации, плеча негативно хромосомы 2, влияет выживаемость на не достигающее порога пациентов с нейробластомой групп низкого и промежуточного риска (стадии I-III, возраст младше 1 года). При этом патогенетическая роль данной аберрации, вероятно, связана с увеличением экспрессии гена MYCN. 83 3.2. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 1 Выявление делеции короткого плеча хромосомы 1 методом MLPA основано на обнаружении уменьшения ВС зондов, специфичных к регионам 1p35-1p36, что позволяет различать интерстициальные и терминальные делеции. Делеция 1p была обнаружена у 28 из 122 обследованных пациентов (23,0%) и только в одном случае (0,8%) являлась интерстициальной. В 7 случаях в зону терминальной делеции попадал также локус 1p35. Значения ВС при наличии либо отсутствии делеции короткого плеча хромосомы 1 приведены на рисунке 9 и в таблице 12. В образцах клеточной линии IMR-32 была выявлена терминальная делеция локуса 1p36, в клетках Kelly терминальная делеция включала локусы 1p32-1p36 и наблюдалась на фоне трисомии хромосомы 1. В клеточной линии SH-SY5Y делеция 1p не определялась. Таблица 12 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 1, при наличии и отсутствии делеции 1p. Медиана (диапазон) Короткое плечо хромосомы 1 Зонд Нор ма Деле ция 1p Теломера GAB TP73-1 RD-2 0,85 0,90 (0,50- (0,462,38) 3,93) 0,51 (0,200,72) 0,58 (0,121,11) CHD 5-2 0,84 (0,20 2,39) 0,60 (0,23 1,07) Длинное плечо хромосомы 1 PARK 7-5 1,02 (0,652,10) KIF1 B-47 0,97 (0,411,68) PTAF R-4 0,98 (0,343,02) Центромера PPAP NTN 2B-1 G1-3 1,03 0,99 (0,76- (0,711,66) 1,67) 0,82 (0,401,25) 0,80 (0,471,10) 0,99 (0,502,18) 1,01 (0,561,25) 0,96 (0,711,63) PDE4D IP-10 1,02 (0,761,70) LHX4 -3 0,93 (0,631,59) LIN99 1,19 (0,552,09) 1,00 (0,761,44) 0,96 (0,591,30) 1,36 (0,871,85) AKT 3-4 1,16 (0,43 1,98) 1,33 (0,92 2,43) 84 Рисунок 9. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 1. А. – отсутствие аберраций хромосомы 1; Б. – делеция короткого плеча хромосомы 1. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню делеции (ВС=0,75). С целью изучения возможности использования ДНК, выделенной из ткани, фиксированной в формалине и залитой в парафиновый блок, для последующего исследования методом MLPA, были проанализированы 20 образцов с использованием набора зондов SALSA P251 (включающего зонды 85 к локусам хромосомы 1). Из них 7 образцов оказались непригодными для проведения анализа, что было связано с высокой степенью фрагментации выделенной ДНК. В 3 из 13 проанализированных образцов была выявлена терминальная делеция 1p. Исследование делеции 1p с помощью анализа вариабельности тандемных повторов (VNTR) в теломерном регионе короткого плеча хромосомы 1 было проведено 73 пациентам. Делеция была обнаружена у 9 (12,3%) больных и во всех случаях являлась терминальной. У трех пациентов исходным материалом служила ткань опухоли в парафиновом блоке, качество выделенной ДНК при этом было достаточным для проведения исследования методом ПЦР VNTR. Все больные, исследованные с помощью данной методики, были тестированы с использованием MLPA, что дало возможность сравнить результаты двух технологий (таблица 13). В двух случаях, когда методом MLPA была выявлена делеция 1p, ПЦР VNTR выявила наличие гомозиготного состояния в двух терминальных минисателлитных локусах, наиболее часто вовлекаемых в делецию, что сделало невозможным корректную интерпретацию результатов. Данным пациентам исследование методом FISH не проводилось. Метод FISH позволил обнаружить делецию 1p у трех из 22 пациентов, у двух из них результат был подтвержден с помощью MLPA и ПЦР VNTR (таблица 13). Один пациент был негативен по данным FISH и MLPA, однако у него была обнаружена делеция 1p методом ПЦР. Таблица 13 Сопоставление результатов определения делеции 1p помощью MLPA, FISH и ПЦР VNTR FISH Делеция 1p Норма ПЦР Делеция 1p MLPA Делеция 1p Норма 2 1 0 19 p=0,008 9 1 ПЦР VNTR Делеция 1p Норма 2 1 1 18 p=0,048 86 VNTR Норма 2 59 p<0,001 Сходимость данных выявления делеции 1p ПЦР и MLPA составила 95,8%, MLPA и FISH – 95,5%, ПЦР и FISH – 90,9%. В дальнейшем, решение в пользу наличия у пациента делеции 1p принималось в том случае, если она была выявлена хотя бы одним из трех методов. Таким образом, из 135 обследованных пациентов делеция была выявлена у 33 (24,4%). Большая часть больных, у которых была обнаружена делеция 1p, имели IV стадию нейробластомы (таблица морфологических 14). вариантах Делеция опухоли 1p вне выявлялась зависимости при от всех степени злокачественности. Она обнаруживалась как в образцах доброкачественных ганглионевром, так и в случаях злокачественных нейробластом. Большинство пациентов, имеющих делецию 1p, были старше 12 месяцев (таблица 14). Таблица 14 Распределение больных в соответствии с наличием делеции 1p в зависимости от стадии заболевания, морфологического диагноза и возраста на момент постановки диагноза Стадия I II III IV IVS Делеция 1p Норма 6 4 5 17 1 38 8 18 29 9 p=0,077 Диагноз ГН ГНБ НБ 3 1 29 8 14 80 p=0,236 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 9 24 50 52 p=0,047 87 БСВ в группе пациентов с наличием делеции 1p была ниже, чем у пациентов без делеции (0,33±0,10 и 0,67±0,06 соответственно, p=0,002) (рисунок 10,А.). ОВ в группе с делецией 1p также была ниже, по сравнению с больными, не имеющими данной аберрации: 0,46±0,10 и 0,73±0,06 соответственно (p=0,003; рисунок 10, Б.). Рисунок 10. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с наличием делеции 1p (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 1 (сплошная кривая). Присутствие делеции 1p сохраняет прогностическое значение у пациентов со стадиями нейробластомы I-III и IVS. При этом БСВ в случае наличия делеции 1p составила 0,53±0,15, ОВ – 0,64±0,13; в случае отсутствия аберраций короткого плеча хромосомы 1 БСВ и ОВ достигли 0,81±0,06 (p=0,039) и 0,87±0,05 (p=0,028) соответственно (рисунок 11, А., Б.). 88 Рисунок 11. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость больных нейробластомой стадий I-III и IVS с наличием делеции 1p (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 1 (сплошная кривая). Наличие делеции 1p приобретает важное прогностическое значение в случаях отсутствия амплификации гена MYCN [121,162]. В настоящем исследовании из 122 обследованных было выявлено 15 таких пациентов, еще в 15 случаях обе анализируемые аберрации сочетались (таблица 15). Таблица 15 Распределение больных по результатам выявления делеции 1p и амплификации гена MYCN Делеция 1p Обнаружена Не обнаружена Количество копий MYCN Амплификация Норма 15 15 6 85 p<0,001 При анализе БСВ и ОВ среди пациентов с отсутствием амплификации гена MYCN в группе пациентов с делецией 1p оба показателя были достоверно ниже по сравнению с группой больных, у которых делеция 1p выявлена не была (БСВ: 0,40±0,14 и 0,71±0,06, p=0,029; ОВ: 0,55±0,14 и 0,78±0,06 p=0,039), рисунок 12, А., Б. В группе больных с амплификацией гена MYCN наличие делеции 1p не оказывало влияния на выживаемость пациентов. БСВ и ОВ при наличии делеции 1p составили 0,25±0,14 (p=0,501) 89 и 0,38±0,14 (p=0,436), тогда как при отсутствии делеции 1p БСВ и ОВ составили 0,00. Рисунок 12. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость больных нейробластомой без амплификации гена MYCN с наличием делеции 1p (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 1 (сплошная кривая). Таким образом, делеция короткого плеча хромосомы 1 была выявлена у 33 пациентов, при этом у одного больного она определялась только с помощью ПЦР, а еще у одного – только с помощью FISH. Качественная сходимость методов MLPA и ПЦР составила 95,8%, а MLPA и FISH – 95,5%. Только в одном случае выявленная делеция являлась интерстициальной. Гомозиготное состояние локусов, анализируемых методом VNTR, является ограничением для применения данного метода. У двух пациентов гомозиготное состояние двух терминально расположенных минисателлитных локусов (D1S76 и D1S80) не позволило выявить делецию 1p, обнаруженную только с помощью MLPA. Частота выявления делеции 1p не зависела от стадии нейробластомы и гистологического варианта строения опухоли. Она была обнаружена в трех образцах доброкачественной ганглионевромы. В то же время у пациентов старше 12 месяцев делеция 1p выявлялась достоверно чаще. Показатели БСВ 90 и ОВ пациентов при наличии делеции 1p были значительно ниже, чем при ее отсутствии, что подтверждает значение данной аберрации как независимого неблагоприятного фактора. Прогностическое значение данной аберрации сохраняется в группе пациентов со стадиями нейробластомы I-III и IVS. Наличие делеции 1p приобретает важное клиническое значение для стратификации пациентов в случае отсутствия амплификации MYCN, что было выявлено у 15 пациентов. Величины БСВ и ОВ у таких пациентов были достоверно ниже по сравнению с больными, у которых делеция 1p и амплификация гена MYCN обнаружены не были. Данные выживаемости больных свидетельствуют о неблагоприятном прогностическом значении амплификации гена MYCN и делеции короткого плеча хромосомы 1, что согласуется с данными литературы [19,42,54,121,123]. Этим обусловлена необходимость своевременного и корректного определения данных аберраций до начала лечения для выбора оптимальной интенсивности терапии. Наиболее широко используемая в нашей стране схема программной химиотерапии нейробластомы NB2004 классифицирует больных с наличием амплификации MYCN как пациентов группы высокого риска вне зависимости от стадии заболевания и возраста. Наличие делеции 1p учитывается при стратификации больных локализованной нейробластомой (II, III стадии) и увеличивает риск у данных пациентов с низкого до среднего. Исследования аберраций хромосом 1 и 2, проведенные с помощью ПЦР, MLPA возможности и FISH данных дали возможность сравнить диагностические молекулярно-биологических методик. Проанализированные методы, служащие для выявления амплификации MYCN и делеции 1p, продемонстрировали ряд достоинств и недостатков. Методики, основанные на технологии ПЦР, просты в использовании, они позволяют быстро (в течение 3-4 часов) и точно определить наличие аберраций, результаты обладают высокой воспроизводимостью. Однако 91 метод ПЦР не позволяет выявить увеличения количества копий гена MYCN, не достигающего порога амплификации. Определение делеции 1p с помощью ПЦР требует наличия ДНК, выделенной из неопухолевого материала того же пациента. Метод FISH на сегодняшний день признан «золотым стандартом» для диагностики аберраций, ассоциированных с изменением числа копий отдельных регионов. Он также дает возможность получить точный результат за короткое время наряду с оценкой плоидности опухолевых клеток. Для анализа как методом FISH, так и ПЦР может быть применена ткань опухоли, фиксированная в формалине и залитая в парафиновый блок, что имеет значение для ретроспективного анализа архивных образцов, а также облегчает транспортировку материала для исследования из других городов. Метод MLPA позволяет одновременно определять большое количество аберраций, связанных с изменением числа копий отдельных генов или хромосомных регионов, включая делецию 1p и различные варианты изменения количества копий MYCN. Так же, как и ПЦР, данный метод требует использования небольшого количества опухолевой ДНК – не более 100 нг. Результаты, полученные с помощью MLPA, обладают высокой воспроизводимостью. В то же время, метод MLPA может быть применен в рутинной клинической практике ограниченно, так как исследование единичного образца данным методом не имеет диагностической значимости. Решающее значение приобретает расчет ВС сигнала для каждого зонда в анализируемом образце к усредненной величине сигнала аналогичного зонда в референсных образцах. Это требует включения в одну постановку нескольких исследуемых и референсных образцов. Кроме того, использование материала из парафинового блока возможно, но крайне нежелательно из-за высокой степени фрагментации выделенной ДНК. По полученным данным, только 13 из 20 включенных образцов были приемлемы для анализа. 92 3.3. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 3 Для выявления делеции короткого плеча хромосомы 3 методом MLPA используются зонды, специфичные к регионам 3p12-3p25, при этом патогенетическое значение имеют аберрации региона 3p21. Делеция 3p была выявлена у 30 из 108 обследованных больных (27,8%) и локализовалась в регионе 3p21 у 25 пациентов (23,1%), у 5 больных (4,6%) захватывала регионы 3p21-3p25. У одного пациента (0,9%) была выявлена моносомия 3. В клеточных линиях IMR-32, Kelly и SH-SY5Y аберраций хромосомы 3 выявлено не было. Значения ВС при наличии либо отсутствии делеции короткого плеча хромосомы 3 приведены на рисунке 13 и в таблице 16. Таблица 16 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 3, при наличии и отсутствии делеции 3p. Медиана (диапазон) Короткое плечо хромосомы 3 Зонд Нор ма Деле ция 3p Теломера VHL- TGFBR 3 2-02 1,05 0,86 (0,54- (0,522,11) 1,23) 0,85 0,85 (0,52- (0,351,43) 1,13) CTNNB1 -1 0,96 (0,411,77) 0,95 (0,611,21) SEMA3B2 0,84 (0,472,51) 0,57 (0,391,07) RASS F1 0,92 (0,202,1) 0,58 (0,190,72) Длинное плечо хромосомы 3 Центромера ZMYND ROBO2-2 10 0,81 1,12 (0,52(0,672,03) 1,77) 0,61 1,27 (0,37(0,600,76) 1,55) CASR-07 ZIC1-3 PIK3CA 0,84 (0,472,42) 0,79 (0,461,25) 1,07 (0,602,17) 1,13 (0,691,66) 0,90 (0,301,45) 1,04 (0,671,38) 93 Рисунок 13. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 3. А. – отсутствие аберраций хромосомы 3; Б. – делеция короткого плеча хромосомы 3. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню делеции (ВС=0,75). При анализе распределения частоты встречаемости делеции 3p не было отмечено связи с клиническими (стадия, гистологический вариант, возраст) и молекулярно-биологическими факторами риска (амплификация гена MYCN, делеции 1p и 11q), таблица 17. нейробластомы 94 Таблица 17 Распределение больных в соответствии с наличием делеции 3p в зависимости от клинических и молекулярно-биологических факторов риска Стадия I II III IV IVS Делеция 3p Норма 4 2 10 12 2 22 8 14 24 9 p=0,229 Диагноз ГН ГНБ НБ 1 2 27 7 8 62 p=0,470 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 11 19 33 44 p=0,714 Количество копий MYCN Амплификация Норма 5 25 14 63 p=0,922 Делеция 1p Делеция Норма 9 21 20 57 p=0,656 Делеция 11q Делеция Норма 6 20 19 58 p=0,920 Анализ показателей БСВ и ОВ не выявил прогностической значимости делеции 3p. В общей когорте пациентов 5-летняя БСВ при наличии делеции 3p составила 0,54±0,10, при отсутствии делеции – 0,60±0,06 (p=0,881), значения 5-летней ОВ достигли 0,56±0,10 и 0,71±0,06 и также достоверно не различались (p=0,450). Также не было отмечено влияния делеции 3p на 95 выживаемость пациентов младше 1 года: БСВ при наличии делеции 3p – 1,00, при отсутствии – 0,77±0,09 (p=0,080), ОВ – 1,00 и 0,79±0,09 (p=0,101), соответственно; и со стадиями нейробластомы I-III и IVS: БСВ при наличии делеции 3p – 0,70±0,11, при отсутствии – 0,78±0,06 (p=0,665), ОВ – 0,77±0,10 и 0,84±0,06 (p=0,554) соответственно. Описанное в литературе сочетание делеции 3p с аберрациями длинного плеча хромосомы 11 [30,166,194,195] не нашло подтверждения в настоящей работе. В то же время в приведенных литературных источниках указывается, что делеция 3p является вторичным событием в молекулярном патогенезе нейробластомы и редко встречается у пациентов раннего возраста. Соответственно она может иметь прогностическое значение в группе больных старшего возраста. Анализ БСВ в группе пациентов старше 3 лет выявил негативное прогностическое влияние данной аберрации (рисунок 14). При этом статистически значимого преобладания частоты встречаемости делеции 3p в данной группе пациентов отмечено не было (p=0,235). Рисунок 14. Бессобытийная выживаемость больных нейробластомой старше 3 лет с наличием делеции 3p (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 3 (сплошная кривая). 96 3.4. Результаты определения аберраций хромосомы 4 При исследовании наличия генетических аберраций хромосомы 4 у 100 пациентов с помощью MLPA были выявлены следующие типы нарушений – делеция короткого плеча хромосомы 4 – у 6 пациентов (6,0%), увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 4 – у 8 пациентов (8,0%), делеция длинного плеча хромосомы 4 – у 2 больных (2,0%). Делеция и увеличение материала 4p затрагивали регионы 4p15-4p16. Также были отмечены 3 случая (3,0%) трисомии 4 и 2 случая (2,0%) моносомии 4. Значения ВС при наличии и отсутствии аберраций короткого плеча хромосомы 4 приведены на рисунке 15 и в таблице 18. Таблица 18 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 4, при наличии увеличения генетического материала 4p, делеции 4p и при отсутствии аберраций хромосомы 4. Медиана (диапазон) Короткое плечо хромосомы 4 Длинное плечо хромосомы 4 Теломера Центромера Центромера Теломера Зонд Норма SPON2-3 1,02 (0,322,82) Увеличение материала 4p 1,65 (1,372,82) Делеция 4p 0,44 (0,300,69) KCNIP4 1,00 (0,631,93) 1,60 (1,421,93) 0,65 (0,581,13) OCIAD1 1,16 (0,701,61) GNRHR-1 0,94 (0,471,47) 1,15 (0,891,38) 0,63 0,79) (0,47- 1,10 (0,891,68) 1,00 1,12) (0,71- IL2 0,99 (0,541,67) 0,63 (0,540,74) 1,09 (0,861,69) GLRB-9 0,95 (0,621,55) 0,81 (0,620,90) 1,09 (0,781,85) KLKB-1 1,05 (0,691,62) 0,97 (0,821,27) 1,22 (0,961,40) 97 Рисунок 15. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 4. А. – отсутствие аберраций хромосомы 4; Б. – увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 4; В. – делеция короткого плеча хромосомы 4. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню увеличения генетического материала (ВС=1,25), cd – делеции (ВС=0,75). 98 Аберрации короткого плеча хромосомы 4 (делеция и увеличение генетического материала) одинаково часто встречались при всех стадиях заболевания, а также в группах пациентов младше и старше 12 месяцев. Обе аберрации отмечались только в ткани опухоли, верифицированной как нейробластома, однако различия не достигли статистической значимости (p=0,412). Не было показано связи аберраций 4p с наличием амплификации гена MYCN и делеции 1p. В то же время, увеличение генетического материала 4p достоверно чаще выявлялось у пациентов с делецией длинного плеча хромосомы 11 (таблица 19). Таблица 19 Распределение больных в соответствии с наличием аберраций 4p в зависимости от клинических и молекулярно-биологических факторов риска Увеличение материала 4p Делеция 4p Норма Стадия I II III IV IVS 2 0 2 3 1 1 1 2 2 0 p=0,587 21 9 14 28 7 Диагноз ГН ГНБ НБ 0 0 8 0 0 6 p=0,412 8 10 61 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 5 3 2 4 p=0,281 27 52 Количество копий MYCN Амплификация Норма 2 6 2 4 p=0,436 12 67 Делеция 1p Делеция 2 3 24 99 Норма 6 3 p=0,561 55 Делеция 11q Делеция Норма 7 0 1 5 p<0,001 10 66 В общей группе больных делеция 4p не показала прогностического значения: БСВ и ОВ при ее наличии были идентичными и составили 0,42±0,22, при отсутствии – 0,59±0,06 и 0,63±0,06 соответственно, p=0,477 и p=0,297. Увеличение генетического материала 4p было связано с заметным снижением показателей БСВ и ОВ, хотя в общей группе пациентов различия не достигли статистической значимости. При выявлении увеличения материала 4p величины БСВ и ОВ составили 0,00, при отсутствии аберраций хромосомы 4 – 0,58±0,06 и 0,66±0,06, соответственно, p=0,363 и p=0,617. Влияние увеличения материала 4p на БСВ достигло уровня достоверности в группе пациентов младше 1 года и приводило к драматичному снижению выживаемости: 0,00 и 0,88±0,06 (p=0,055), рисунок 16. ОВ при наличии данной аберрации также была равна 0,00, при отсутствии – 0,88±0,07 (p=0,414). Делеция 4p с потерей функции ряда генов SPON2 и PHOX2B рассматривается как раннее событие онкогенеза нейробластомы [41,104,140]. Снижение экспрессии в клетках опухоли гена PHOX2B, использующегося как маркер поражения КМ, может приводить к ложно отрицательным результатам и указывает на необходимость применения дополнительных маркеров [170,171]. Однако данные о прогностической значимости аберраций короткого плеча хромосомы 4 в литературе отсутствуют. Локализующиеся в регионе 4p15-16 гены WFS1 и KCNIP4 принимают участие в метаболизме нервных клеток и поддержании трансмембранного потенциала, однако онкогенных свойств указанных генов отмечено не было [97,129,178]. В то же время, увеличение генетического материала 4p может 100 быть полезным инструментом для выявления пациентов с нейробластомой высокого риска, особенно среди больных младше 12 месяцев. Рисунок 16. Бессобытийная выживаемость больных нейробластомой младше 12 месяцев с наличием увеличения генетического материала 4p (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 4 (сплошная кривая) 3.5. Результаты определения аберраций хромосомы 7 Анализ аберраций хромосомы 7 с помощью MLPA выявил увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 7 у 18 (18,0%), увеличение материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 у 6 (6,0%), делецию 7q – у 1 (1,0%) из 100 обследованных пациентов. В первом случае определялось увеличение ВС зондов, специфичных к регионам 7q11-7q36, во втором – зондов, локализующихся как на коротком плече хромосомы 7 (регионы 7p11 и 7p14), так и на длинном плече (7q11-36). Значения ВС при наличии и отсутствии аберраций хромосомы 7 приведены на рисунке 17 и в таблице 20. 101 Таблица 20 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 7, при наличии увеличения генетического материала 7q, трисомии 7 и отсутствии аберраций хромосомы 7. Медиана (диапазон) Короткое плечо хромосомы 7 Длинное плечо хромосомы 7 Центромера Зонд Норма Увеличение материала 7q Трисомия 7 GHRHR-12 0,98 (0,531,42) 1,08 (0,701,94) 1,43 (1,241,58) EGFR-15 1,10 (0,711,91) 1,16 (0,851,35) 1,41 (1,311,78) ELN-33 0,95 (0,49-1,82) 1,91 (0,84-2,69) 1,35 (1,28-1,46) Теломера KRIT1-11 1,14 (0,262,15) 1,41 (0,451,64) 1,78 (1,003,23) IMPDH1-14 1,01 (0,672,02) 1,68 (1,272,66) 1,52 (1,271,75) SHH-2 0,95 (0,561,47) 1,22 (0,661,81) 1,48 (1,091,65) Аберрации хромосомы 7 одинаково часто встречались при различных стадиях заболевания гистологическом и варианте несколько опухоли, чаще однако при нейробластоме, различия не как достигли статистической значимости. Увеличение генетического материала 7q достоверно чаще выявлялось у пациентов младше 12 месяцев, тогда как увеличения материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 у таких пациентов отмечено не было. Не было выявлено ассоциации аберраций хромосомы 7 с наличием амплификации гена MYCN и делеции 1p, однако увеличение материала 7q присутствовало у 9 из 21 пациента с делецией длинного плеча хромосомы 11 (таблица 21). 102 Рисунок 17. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 7. А. – отсутствие аберраций хромосомы 7; Б. – увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 7; В. – увеличение генетического материала длинного и короткого плеч хромосомы 7. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню увеличения генетического материала (ВС=1,25). 103 Таблица 21 Распределение больных в соответствии с наличием аберраций хромосомы 7 в зависимости от клинических и молекулярно-биологических факторов риска Увеличение материала 7q Увеличение материала 7p и 7q Норма Стадия I II III IV IVS 5 2 4 4 3 0 1 1 4 0 p=0,159 22 7 15 25 6 Диагноз ГН ГНБ НБ 0 2 16 0 0 6 p=0,455 8 8 59 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 12 6 0 6 p=0,007 27 48 Количество копий MYCN Амплификация Норма 3 15 1 5 p=0,997 13 62 Делеция 1p Делеция Норма 5 13 3 3 p=0,474 20 55 Делеция 11q Делеция Норма 9 8 2 4 p=0,002 10 61 Увеличение генетического материала 7q не оказывало значимого влияния на выживаемость пациентов. БСВ при наличии данной аберрации составила 0,71±0,13, ОВ – 0,76±0,12; при отсутствии аберраций хромосомы 7 БСВ – 0,56±0,06, ОВ – 0,64±0,06 (p=0,683 и p=0,681). Напротив, увеличение 104 генетического материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 снижало показатель БСВ - 0,33±0,19 и 0,56±0,06 при отсутствии аберраций, p=0,053 (рисунок 18, А.). При этом влияние на ОВ не достигло статистической значимости: 0,50±0,20 и 0,64±0,06, соответственно, p=0,154. Увеличение генетического материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 сохраняло свое прогностическое значение в группе пациентов без амплификации гена MYCN: БСВ 0,40±0,22 и 0,64±0,06, p=0,044 (рисунок 18, Б.). Рисунок 18. Бессобытийная выживаемость больных нейробластомой в общей группе (А.) и в подгруппе пациентов без амплификации гена MYCN (Б.) с наличием увеличения генетического материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 7 (сплошная кривая) Высокая частота увеличения количества копий хромосомы 7 в клетках нейробластомы, описанная в литературе [168] не нашла подтверждения в настоящей работе. Данная аберрация встречалась реже, чем увеличение материала 7q. Также не было отмечено ассоциации увеличения материала 7q со стадиями нейробластомы III и IV, в то же время она чаще выявлялась у больных младше 12 месяцев и была ассоциирована с делецией 11q. Вместе с этим, наличие увеличения материала 7q не снижало показатели выживаемости и не увеличивало риск наступления нежелательных событий. 105 Увеличение материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 было отмечено только у пациентов старше 12 месяцев. По данным литературы, количественные хромосомные аберрации являются маркерами набора хромосом, близкого к три- или пентаплоидному, что является благоприятным прогностическим фактором [201]. Несмотря на то, что увеличение материала хромосомы 7 относится к количественным аберрациям, было показано, что оно значимо снижает показатели БСВ как в общей группе пациентов, так и в подгруппе больных без амплификации гена MYCN. 3.6. Результаты определения аберраций короткого плеча хромосомы 9 Метод MLPA позволил выявить два типа генетических нарушений короткого плеча хромосомы 9: делецию у 8 из 100 обследованных пациентов (8,0%) и увеличение генетического материала у 9 больных (9,0%). В первом случае было отмечено снижение ВС зондов, локализующихся в локусах 9p219p23, при этом у трех пациентов (3,0%) в зону делеции попадал только регион 9p21.3, в котором картирован ген-супрессор опухолевого роста CDKN2A/p16. Во втором случае определялось увеличение ВС зондов, специфичных к регионам 9p13.3, 9p21.3 и в 5 случаях 9p25. У одного пациента было выявлено увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 9, локализующееся в регионе 9q34.13. Значения ВС при наличии делеции и увеличения генетического материала 9p и отсутствии аберраций хромосомы 9 приведены на рисунке 19 и в таблице 22. Таблица 22 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 9, при наличии делеции, увеличения материала 9p и отсутствии аберраций. Медиана (диапазон) Короткое плечо хромосомы 9 Зонд Теломера PTPRD PTPRD Норма 1,06 1,03 CDKN2 A-4 1,02 Центромера CDKN2A DNAI1-up 1 1,09 1,10 Длинное плечо хромосомы 9 TJP2 1,00 TGFBR 1-8 0,98 POMT1 -5 0,96 TSC116 0,96 106 Делеция 9p Увеличение материала 9p (0,751,46) 0,73 (0,601,15) 1,21 (0,621,45) (0,521,44) 0,55 (0,311,16) 1,46 (1,061,80) (0,701,37) 0,58 (0,500,74) 1,31 (1,111,61) (0,761,53) 0,71 (0,601,02) 1,56 (1,356,29) (0,772,28) 0,94 (0,611,70) 1,59 (1,103,97) (0,641,46) 0,98 (0,601,29) 1,07 (0,901,31) (0,511,27) 0,81 (0,521,15) 1,51 (1,032,11) (0,562,78) 1,09 (0,462,20) 0,87 (0,581,23) (0,541,31) 0,83 (0,571,30) 0,97 (0,721,65) Делеция и увеличение материала короткого плеча хромосомы 9 были выявлены с одинаковой частотой при всех стадиях нейробластомы, и их встречаемость не зависела от возраста пациентов. Обе аберрации не были обнаружены в образцах ганглионевромы и ганглионейробластомы, однако их связь с морфологическим диагнозом «нейробластома» статистически подтверждена не была. Также не было отмечено ассоциации делеции и увеличения материала 9p ни с одним молекулярно-генетическим прогностическим фактором, используемым для стратификации пациентов (таблица 23). 107 Рисунок 19. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 9. А. – отсутствие аберраций хромосомы 9; Б. – делеция короткого плеча хромосомы 9; В. – увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 9. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню увеличения генетического материала (ВС=1,25), cd – делеции (ВС=0,75) 108 Таблица 23 Распределение больных в соответствии с наличием аберраций короткого плеча хромосомы 9 в зависимости от клинических и молекулярнобиологических факторов риска Делеция 9p Увеличение материала 9p Норма Стадия I II III IV IVS 2 1 2 3 0 3 0 4 2 0 p=0,163 22 9 14 28 9 Диагноз ГН ГНБ НБ 0 0 8 0 0 9 p=0,335 8 10 64 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 2 6 4 5 p=0,665 33 49 Количество копий MYCN Амплификация Норма 3 5 0 9 p=0,123 14 68 Делеция 1p Делеция Норма 4 4 1 8 p=0,213 24 58 Делеция 11q Делеция Норма 3 5 4 5 p=0,113 14 63 В исследуемой группе пациентов делеция короткого плеча хромосомы 9 показала крайне негативное прогностическое значение в отношении как бессобытийной, так и общей выживаемости пациентов. БСВ и ОВ в группе 109 пациентов с делецией 9p составили 0,00, тогда как у больных без аберраций хромосомы 9 показатели достигли 0,60±0,06 и 0,68±0,06, соответственно, p=0,035 и p=0,014 (рисунок 20, А., Б.). Рисунок 20. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с наличием делеции короткого плеча хромосомы 9 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 9 (сплошная кривая). Делеция 9p сохраняла свое прогностическое значение в отношении ОВ в группе пациентов с локализованной нейробластомой (стадии I-III): 0,00 и 0,91±0,05, p=0,031, в то время как влияние на БСВ в данной группе находилось на границе статистической достоверности: 0,00 и 0,85±0,06, p=0,058 (рисунок 21, А.,Б.). 110 Рисунок 21. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с локализованной нейробластомой (стадии I-III) при наличии делеции короткого плеча хромосомы 9 (штриховая кривая) и отсутствии аберраций хромосомы 9 (сплошная кривая). Также в группе пациентов без амплификации гена MYCN делеция короткого плеча хромосомы 9 приводила к снижению показателей БСВ и ОВ. При наличии делеции 9p БСВ и ОВ были равны 0,00, при отсутствии аберраций хромосомы 9 – 0,68±0,06 и 0,75±0,06 соответственно, p=0,047 и p=0,017 (рисунок 22, А.,Б.). Рисунок 22. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов без амплификации гена MYCN при наличии делеции короткого плеча хромосомы 9 (штриховая кривая) и отсутствии аберраций хромосомы 9 (сплошная кривая). 111 Увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 9 не приводило к изменению показателей выживаемости в общей группе пациентов. БСВ и ОВ при наличии аберрации составили 0,50±0,19 и 0,59±0,25; при отсутствии – 0,60±0,06 и 0,68±0,06, p=0,938 и p=0,525 соответственно. Однако наличие данной аберрации оказывало значимое влияние на БСВ в наиболее благоприятной группе пациентов со стадиями нейробластомы I-III и IVS без амплификации гена MYCN: 0,48±0,23 и 0,88±0,05 при отсутствии аберраций 9p (p=0,039, рисунок 23). Рисунок 23. Бессобытийная выживаемость больных нейробластомой стадий I-III и IVS без амплификации гена MYCN с наличием увеличения генетического материала короткого плеча хромосомы 9 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 9 (сплошная кривая) Несмотря на очевидную патогенетическую роль делеции 9p в онкогенезе многих злокачественных опухолей – через инактивацию генасупрессора опухолевого роста CDKN2A/p16 – прогностическое значение ее присутствия в клетках нейробластомы остается предметом дискуссий. При этом приводятся противоречивые данные как о благоприятном влиянии делеции 9p на долгосрочную выживаемость пациентов [82], об отсутствии влияния [122,127], так и об отрицательном прогностическом значении 112 аберрации [179,180]. В настоящем исследовании полностью подтверждены результаты, представленные J.Takita et al., указывающие на связь делеции 9p с неблагоприятным клиническим исходом заболевания [179,180]. Из 8 пациентов, у которых была выявлена делеция 9p, 1 не ответил на проводимую терапию, у 2 развились фатальные токсические осложнения, у 2 – прогрессия заболевания, также оказавшаяся фатальной. Данная аберрация сохраняет свое прогностическое значение в группах пациентов с локализованной опухолью и при отсутствии амплификации MYCN, что позволяет рассматривать ее как потенциальный независимый прогностический признак. Данные, указывающие на прогностическое значение увеличения генетического материала 9p, в литературе найдены не были. При этом полученные результаты указывают на возможность использования данного маркера для прогноза наступления неблагоприятного события среди пациентов с нейробластомой группы низкого риска. 3.7. Результаты определения аберраций хромосомы 11 Метод MLPA позволил выявить три типа аберраций хромосомы 11: интерстициальную (внутрихромосомную) делецию длинного плеча у 16 из 108 пациентов (14,8%), терминальную делецию длинного плеча у 9 (8,3%) больных, а также потерю всей хромосомы 11 у 5 пациентов (4,6%). В первом случае было отмечено снижение ВС зондов, локализующихся в регионах 11q22.1-11q23.3 и специфичных для генов CNTN5, CASP1, ATM и CADM1, однако участок делеции не затрагивал ген MLL, находящийся в регионе 11q23.3. Во втором случае фрагмент длинного плеча хромосомы 11, подвергшийся делеции, находился в регионе 11q23.3-qter, включая ген MLL. При потере всей хромосомы 11 (моносомия 11) наблюдалось снижение ВС зондов, специфичных как к длинному, так и короткому плечу. В исследованных клеточных линиях IMR-32 и SH-SY5Y аберраций хромосомы 113 11 выявлено не было, в клеточной линии Kelly определялась интерстициальная делеция 11q. Значения ВС при наличии и отсутствии аберраций хромосомы 11 приведены на рисунке 24 и в таблице 24. 114 Рисунок 24. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 11. А. – отсутствие аберраций хромосомы 11; Б. – интерстициальная делеция длинного плеча хромосомы 11; В. – терминальная делеция длинного плеча хромосомы 11; Г. – потеря хромосомы 11. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню делеции (ВС=0,75). 115 Частота выявления аберраций хромосомы 11 зависела от стадии заболевания. Интерстициальная делеция 11q и потеря хромосомы 11 встречались при различных стадиях нейробластомы, тогда как терминальная делеция – только при стадиях III и IV. Оба типа делеции 11q отмечались преимущественно в образцах опухоли, классифицированной как нейробластома, но различия не достигли статистической значимости. Не удалось выявить связь аберраций хромосомы 11 с возрастом пациентов и обратную ассоциацию с амплификацией гена MYCN и делецией 1p, описанную в литературе [19,88], таблица 25. 116 Таблица 24 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 11, при наличии делеции 11q, моносомии 11 и отсутствии аберраций. Медиана (диапазон) Короткое плечо хромосомы 11 Зонд Норма Делеция 11q-И Делеция 11q-Т Моносомия 11 Теломера LMO1 LMO1 4 1 0,92 0,83 (0,58(0,281,27) 1,50) 0,79 1,13 (0,67(1,121,12) 1,14) 0,77 0,95 (0,51(0,891,04) 1,00) 0,69 0,84 (0,66(0,420,74) 0,89) ST5 - 4 0,93 (0,461,68) 0,96 (0,741,18) 0,86 (0,611,15) 0,75 (0,710,90) ABCC8 36 0,82 (0,481,26) 0,93 (0,641,37) 0,95 (0,831,18) 0,62 (0,551,34) Центромера CD44 PTPRJ 1 -7 0,93 0,91 (0,58(0,561,44) 1,60) 0,92 0,85 (0,71(0,651,39) 1,07) 0,72 0,92 (0,53(0,741,03) 1,92) 0,74 0,65 (0,65(0,600,99) 0,74) Длинное плечо хромосомы 11 Центромера GSTP1 CNTN5 4 21 0,95 0,89 (0,56(0,501,93) 1,44) 1,38 0,53 (0,95(0,471,92) 0,71) 0,76 0,83 (0,42(0,311,63) 1,56) 0,93 0,70 (0,60(0,571,01) 0,87) CASP1 5 0,90 (0,631,62) 0,60 (0,460,74) 0,65 (0,311,88) 0,63 (0,570,97) ATM 38 1,02 (0,541,48) 0,69 (0,510,91) 0,96 (0,381,35) 0,74 (0,600,97) CADM1 -1 0,84 (0,501,37) 0,77 (0,611,12) 0,90 (0,481,02) 0,63 (0,560,77) Делеция 11q-И – интерстициальная делеция 11q, Делеция 11q-Т – терминальная делеция 11q MLL - 4 1,03 (0,541,48) 0,88 (0,771,19) 0,67 (0,551,42) 0,80 (0,640,88) HMBS 7 0,91 (0,402,14) 1,07 (0,531,68) 0,61 (0,340,88) 0,77 (0,560,83) Теломера THY1 4 1,02 (0,342,09 0,93 (0,651,31) 0,48 (0,380,72) 0,81 (0,451,06) 117 Таблица 25 Распределение больных в соответствии с наличием аберраций хромосомы 11 в зависимости от клинических и молекулярно-биологических факторов риска Интерстициальная делеция 11q Терминальная Моносомия Норма делеция 11q 11 Стадия I II III IV IVS 3 0 3 8 2 0 0 4 5 0 p=0,004 2 0 0 2 1 22 10 17 21 8 Диагноз ГН ГНБ НБ 0 2 14 0 0 9 p=0,260 0 0 5 8 8 62 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 6 10 6 3 p=0,442 3 2 30 48 Количество копий MYCN Амплификация Норма 4 12 0 9 p=0,392 0 5 15 63 Делеция 1p Делеция Норма 5 11 0 9 p=0,355 2 3 22 56 При анализе выживаемости пациентов отмечалась тенденция к снижению показателей БСВ и ОВ в группе пациентов с интерстициальной делецией 11q, однако, уровня статистической значимости различия не достигли. БСВ составила 0,28±0,14, ОВ – 0,29±0,16 при наличии делеции и 0,60±0,06 и 0,68±0,06, соответственно, при отсутствии аберраций хромосомы 11, p=0,164 и p=0,133 (рисунок 25, А.,Б.). 118 Рисунок 25. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с наличием интерстициальной делеции длинного плеча хромосомы 11 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 11 (сплошная кривая). Присутствие терминальной делеции 11q не оказывало влияния на показатели БСВ и ОВ, которые достигли 0,78±0,14 и 0,86±0,13, тогда как при отсутствии аберраций хромосомы 11 составляли 0,60±0,06 и 0,68±0,06, соответственно, p=0,477 и p=0,317. Также потеря хромосомы 11 не приводила к изменению выживаемости пациентов в сравнении с отсутствием аберраций хромосомы 11, в этом случае БСВ и ОВ были идентичные и составили 0,67±0,27, p=0,467 и p=0,681. Патогенетическая роль делеции 11q обусловлена двумя механизмами. Первый заключается в инактивации гена-супрессора опухолевого роста TSLC1, который локализуется в регионе 11q23.2 [18]. Второй – в образовании химерных генов с участием MLL, FOXR1 и PAFAH1B2 [148]. Оба механизма реализуются в случае интерстициальной делеции, когда регион 11q23.2 (в котором находится ген TSLC1) удален, а регион 11q23.3 (в котором локализуется ген MLL) остается интактным. С этим связана тенденция к снижению показателей выживаемости при наличии интерстициальной делеции 11q. В случае терминальной делеции удаленный участок локализуется дистальнее региона 11q23.2, и, соответственно, не вовлекает 119 ген TSLC1 а, напротив, затрагивает ген MLL, препятствуя образованию химерных генов с его участием. Это объясняет отсутствие влияния данной аберрации на выживаемость пациентов. Прогностическое значение делеции 11q не было показано в условиях моноцентровых исследований с ограниченным количеством пациентов [42,88] и было подтверждено только в крупных многоцентровых исследованиях [16,19,54]. 3.8. Результаты определения аберраций хромосомы 12 При исследовании хромосомы 12 методом MLPA были выявлены два типа генетических нарушений: увеличение генетического материала длинного плеча и увеличение материала короткого плеча. Первая аберрация наблюдалась у 20 из 100 пациентов (20,0%). При этом во всех случаях происходило увеличение количества копий региона 12q14.3, содержащего нуклеотидную последовательность гена MDM2. Вторая – была выявлена у 16 больных (16,0%). В 5 случаях (5,0%) обнаруживалось увеличение ВС зондов, связывающихся с регионами 12p11.21-12p13.33, в 2 случаях (2,0%) – с регионом 12p13, в 9 случаях (9,0%) – происходило увеличение ВС зонда, специфичного к гену CDKN1B (регион 12p13.2). Значения ВС при наличии увеличения генетического материала длинного и короткого плеч, а также при отсутствии аберраций хромосомы 12 приведены на рисунке 26 и в таблице 26. Таблица 26 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 12, при наличии увеличения генетического материала длинного и короткого плеч и отсутствии аберраций. Медиана (диапазон) Короткое плечо хромосомы 12 Зонд Норма Увеличение материала Теломера ERC1 - 18 1,01 (0,391,43) 1,01 (0,521,23) CDKN1B 1,07 (0,641,36) 1,54 (0,842,12) Центромера PKP2 - 08 1,04 (0,601,45) 1,16 (0,941,40) Длинное плечо хромосомы 12 Центромера COL2A1 - 49 0,95 (0,611,21) 0,95 (0,501,22) MDM2 1,10 (0,751,41) 1,69 (1,377,98) Теломера TBX5 - 2 1,01 (0,491,40) 0,82 (0,471,37) 120 12q Увеличение материала 12p 1,04 3,04) (0,79- 1,57 3,24) (1,35- 1,08 1,66) (0,71- 0,87 1,55) (0,48- 1,33 1,66) (0,94- 0,95 1,52) (0,43- Исследование частоты встречаемости аберраций хромосомы 12 не выявило связи гистологическим со стадией типом заболевания, опухоли, хотя возрастом пациентов и в образцах, морфологически охарактеризованных как нейробластома, аберрации встречались несколько чаще. Также не было отмечено связи увеличения материала 12p и 12q с амплификацией гена MYCN и делецией 1p, однако обе аберрации достоверно чаще выявлялись в опухолях, имеющих делецию 11q (таблица 27). Таблица 27 Распределение больных в соответствии с наличием аберраций хромосомы 12 в зависимости от клинических и молекулярно-биологических факторов риска Увеличение материала 12q Увеличение материала 12p Норма Стадия I II III IV IVS 4 1 5 7 3 8 0 3 4 1 p=0,067 15 9 12 23 5 Диагноз ГН ГНБ НБ 0 2 18 0 2 14 p=0,292 8 6 50 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 11 9 8 8 p=0,101 20 44 Количество копий MYCN Амплификация Норма 4 16 2 14 11 53 121 p=0,836 Делеция 1p Делеция Норма 5 15 3 13 p=0,491 21 43 Делеция 11q Делеция Норма 11 9 5 10 p<0,001 5 55 122 Рисунок 26. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 12. А. – отсутствие аберраций хромосомы 12; Б. – увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 12 (гена MDM2); В. – увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 12. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню увеличения генетического материала (ВС=1,25). 123 Наличие увеличения генетического материала 12q (увеличение количества копий гена MDM2) не показало прогностической значимости. Показатели БСВ и ОВ пациентов с увеличением материала 12q не отличались от аналогичных показателей больных без аберраций хромосомы 12: 0,56±0,13 и 0,56±0,14; 0,55±0,06 и 0,63±0,06, соответственно, p=0,918 и p=0,500. При анализе влияния увеличения генетического материала 12p (увеличение количества копий гена CDKN1B) на выживаемость пациентов была выявлена тенденция к увеличению ОВ у пациентов с данной аберрацией: 0,92±0,08, p=0,089 (рисунок 27). Влияния увеличения материала 12p на БСВ обнаружено не было: 0,68±0,14, p=0,426. Рисунок 27. Общая выживаемость пациентов с наличием увеличения генетического материала короткого плеча хромосомы 12 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 12 (сплошная кривая). Роль увеличения генетического материала 12q в онкогенезе многих злокачественных опухолей объясняется увеличением экспрессии гена MDM2, являющегося антагонистом p53 [83,146]. Прогностическое значение данной генетической аномалии при нейробластоме неизвестно [174]. В настоящей работе была показана ассоциация увеличения материала 12q с молекулярным 124 подтипом опухоли, имеющей делецию 11q. Выявить прогностическое значение указанной аберрации не удалось. Увеличение генетического материала 12p описано в семейных случаях нейробластомы, однако, его связь с прогнозом заболевания не выяснена [115]. В настоящей работе была показана тенденция к увеличению ОВ пациентов при наличии увеличения материала 12p. Молекулярной основой феномена может служить увеличение экспрессии гена CDKN1B, который является геном-супрессором опухолевого роста. Он блокирует фосфорилирование гистона H1 комплексами циклин А-CDK2, циклин ECDK2 или циклин B1-CDK2, а также препятствует фосфорилированию Rb. Это приводит к остановке клеточного цикла в фазе G0/G1 [64,144]. 3.9. Результаты определения аберраций хромосомы 14 Перечень олигонуклеотидных зондов для выявления аберраций хромосомы 14, включенных в состав набора P253, содержит только зонды, специфичные к регионам длинного плеча. Соответственно, при увеличении или уменьшении ВС одновременно всех зондов невозможно судить о наличии увеличения генетического материала или делеции всей хромосомы 14 или только её длинного плеча. Поэтому при выявлении увеличения ВС условно признавалось наличие увеличения генетического материала 14q, при снижении ВС – делеция 14q. Делеция 14q была обнаружена у 9 из 100 пациентов (9,0%) и у всех являлась терминальной. У 6 больных было отмечено снижение ВС зондов, специфичных к локусам 14q13-qter, у трех пациентов в зону делеции вовлекались дистально расположенные локусы 14q22-14q32. Увеличение генетического материала 14q было выявлено у 5 больных (5,0%), в 3 случаях захватывало обширный регион 14q13-qter, в одном случае регионы 14q22-14q32 и еще в одном – локусы 14q24.3-14q32. Значения ВС при наличии делеции и увеличения генетического материала 125 14q, а также при отсутствии аберраций хромосомы 14 приведены на рисунке 28 и в таблице 28. Таблица 28 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 14, при наличии делеции и увеличения генетического материала длинного плеча и отсутствии аберраций. Медиана (диапазон) Длинное плечо хромосомы 14 Зонд Норма Делеция 14q Увеличение материала 14q Центромера NFKBIA - 1 0,93 (0,58-1,45) 0,63 (0,48-1,06) 1,26 (0,76-1,73) ATL1 - 2 1,09 (0,75-2,57) 1,06 (0,66-1,15) 1,33 (1,11-2,05) Теломера MOAP1 0,99 (0,58-1,40) 0,62 (0,34-0,74) 1,29 (1,16-2,01) TGFB3 - 1 1,01 (0,61-1,36) 0,65 (0,51-0,94) 1,41 (1,32-1,52) Делеция длинного плеча хромосомы 14 чаще выявлялась у пациентов младше 12 месяцев с локализованной нейробластомой. Увеличение материала 14q, напротив, отмечено у больных старше 12 месяцев с различными стадиями заболевания. Обе аберрации были выявлены в образцах опухоли, морфологически охарактеризованных как нейробластома, однако различия статистической значимости не достигли. Также не было показано взаимосвязи делеции и увеличения материала 14q ни с одним из молекулярно-генетических факторов риска, однако в опухолях с амплификацией гена MYCN делеция 14q не была обнаружена ни в одном случае (таблица 29). 126 Рисунок 28. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 14. А. – отсутствие аберраций хромосомы 14; Б. – делеция длинного плеча хромосомы 14; В. – увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 14. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню увеличения генетического материала (ВС=1,25), cd – делеции (ВС=0,75). 127 Таблица 29 Распределение больных в соответствии с наличием аберраций хромосомы 14 в зависимости от клинических и молекулярно-биологических факторов риска Делеция 14q Увеличение материала 14q Норма Стадия I II III IV IVS 5 2 2 0 0 2 0 1 2 0 p=0,037 20 8 17 32 9 Диагноз ГН ГНБ НБ 0 0 9 0 0 5 p=0,467 8 10 68 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 7 2 0 5 p=0,011 32 54 Количество копий MYCN Амплификация Норма 0 9 1 4 p=0,362 16 70 Делеция 1p Делеция Норма 2 7 2 3 p=0,781 25 61 Делеция 11q Делеция Норма 1 7 3 2 p=0,096 17 65 Наличие делеции или увеличения генетического материала 14q не оказывало влияния на выживаемость пациентов с нейробластомой. БСВ в случае делеции 14q составила 0,64±0,21, при увеличении генетического материала 14q – 0,25±0,22, а при отсутствии аберраций хромосомы 14 – 128 0,58±0,06 (p=0,760 и p=0,540). Показатели ОВ составили 0,64±0,21, 0,38±0,29 и 0,66±0,06, соответственно (p=0,989 и p=0,741). В то же время была отмечена тенденция к снижению ОВ в наиболее благоприятной группе пациентов со стадиями нейробластомы I-III и IVS без амплификации гена MYCN при наличии делеции 14q: 0,63±0,21, при отсутствии аберраций хромосомы 14 ОВ равнялась 0,93±0,04 (p=0,083) (рисунок 29). Рисунок 29. Общая выживаемость больных нейробластомой стадий I-III и IVS без амплификации гена MYCN с наличием делеции длинного плеча хромосомы 14 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 14 (сплошная кривая). Данные о прогностическом значении аберраций длинного плеча хромосомы 14 в литературных источниках найдены не были. C.H. Gattolliat et al. указывали на снижение показателей выживаемости при снижении уровней экспрессии ряда микроРНК, кодирующие последовательности которых расположены в области теломерного конца длинного плеча хромосомы 14. Однако было показано, что снижение экспрессии микроРНК не сопровождается структурными аберрациями и определяется факторами транскрипционной и посттранскрипционной регуляции [78]. Установлена функция гена MOAP1, картированного в локусе 14q32, как супрессора 129 опухолевого роста [22,181], но значение его делеции в клетках нейробластомы также не описано. В настоящем исследовании нашел подтверждение факт отсутствия делеции 14q в опухолях с амплификацией гена MYCN [185]. Было выявлено преобладание данной аберрации у пациентов с локализованной опухолью, а также при ее наличии показана тенденция к снижению ОВ в группе пациентов со стадиями нейробластомы IIII и IVS без амплификации гена MYCN. Прогностического значения увеличения генетического материала 14q обнаружено не было. 3.10. Результаты определения аберраций хромосомы 17 Увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 17 является наиболее частой аберрацией при нейробластоме. Из 108 пациентов, которым проводилось исследование аберраций хромосомы 17 методом MLPA, увеличение материала 17q было выявлено у 54 (50,0%). У 23 больных (21,3%) происходило увеличение генетического материала протяженного фрагмента длинного плеча хромосомы 17 – регионы 17q11.1-17q25.3. В 13 случаях (12,0%) определялось увеличение материала регионов 17q12-17q25.3, а у 18 пациентов (16,7%) – 17q21.2-17q25.3. При анализе образцов опухоли от пяти пациентов (4,6%) было выявлено увеличение ВС зондов, специфичных к локусам как длинного, так и короткого плеча хромосомы 17, из чего был сделан вывод о наличии увеличения материала всей хромосомы 17 (трисомия 17). В одном случае была выявлена моносомия 17, и в одном случае анализ хромосомы 17 был неинформативным. В образцах исследованных клеточных линий нейробластомы IMR-32, Kelly и SH-SY5Y было обнаружено увеличение генетического материала регионов 17q21-17q25. Значения ВС при наличии увеличения генетического материала 17q и при отсутствии аберраций хромосомы 17 приведены на рисунке 30 и в таблице 30. 130 Рисунок 30. Величины соотношения зондов, локализованных на хромосоме 17. А. – отсутствие аберраций хромосомы 17; Б. – увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 17. Маркер в виде горизонтальной линии соответствует медиане. Линия ab соответствует пороговому уровню увеличения генетического материала (ВС=1,25). Увеличение генетического материала 17q выявлялось при всех стадиях нейробластомы, тогда как трисомия 17 – только в случаях локализованной опухоли или при стадии IVS. Обе аберрации не были обнаружены в образцах ганглионевромы. Увеличение материала 17q выявлялось в половине случаев, морфологически интерпретированных как ганглионейробластома и нейробластома. Связи частоты выявления аномалий хромосомы 17 с возрастом пациентов, наличием амплификации гена MYCN и делеции 1p зафиксировано не было, однако в 20 из 54 образцов опухоли с увеличением 131 генетического материала 17q была выявлена делеция 11q (таблица 31), что не соответствует литературным данным, указывающим на преимущественную ассоциацию увеличения материала 17q с молекулярным подтипом нейробластомы, имеющей амплификацию MYCN и делецию 1p [28,55]. 132 Таблица 30 Значения величин соотношения зондов, локализующихся на хромосоме 17, при наличии увеличения генетического материала длинного плеча, трисомии 17 и отсутствии аберраций. Медиана (диапазон) Зонд Норма Короткое плечо хромосомы 17 Теломера Центромера PAFA TP53 TP53 TP53 H1B1 - 10 –8 -4 - 06 1,02 0,97 0,96 0,92 (0,74- (0,67- (0,69- (0,611,43) 1,52) 1,41) 1,58) Увеличение материала 17q 1,08 1,16 (0,60- (0,621,73) 4,25) Трисомия 17* 1,44 1,53 (1,36- (1,171,63) 7,05) * - исследование проведено отсутствует Длинное плечо хромосомы 17 Центромера WSB WSB1 WSB1 NF1 - NF1 - ERBB TOP2 SGC 1 17 34 2-7 A-1 A-9 1,06 0,94 1,01 1,05 1,13 0,94 0,85 0,94 (0,58 (0,63- (0,48- (0,75- (0,67- (0,64- (0,54- (0,611,66) 1,68) 1,55) 1,71) 2,56) 1,17) 1,44) 1,81) 1,08 1,15 1,18 1,22 1,18 1,01 1,04 1,28 1,00 1,41 (0,54- (0,40- (0,64 (0,14- (0,49- (0,64- (0,45- (0,68- (0,36- (0,592,97) 4,34) 3,20) 1,84) 2,13) 2,03) 2,66) 1,99) 3,16) 1,86) 1,61 1,34 1,43 1,41 1,41 1,17 1,54 0,95 1,59 (1,30- (1,17- (1,22 (1,19- (1,28(0,99- (1,34- (0,75- (1,262,83) 6,65) 1,95) 2,46) 1,91) 2,84) 1,45) 3,69) 2,45) с использованием набора олигонуклеотидных зондов SALSA P252 (лот Теломера TOB1 REC BIRC5 SEC TBC -1 QL5 TM1 D -4 18 1,08 0,95 0,85 0,68 0,90 (0,60- (0,32- (0,41- (0,40 (0,52 1,31) 1,38) 1,29) 1,06) 1,25) 1,40 1,55 1,46 1,02 1,10 (0,90- (0,62- (0,74- (0,36 (0,54 2,43) 3,48) 6,17) 2,42) 2,00) 1,55 1,51 1,51 0,59 1,47 (1,19- (1,36- (1,26- (0,46 (1,10 2,87) 4,67) 10,10) 1,76) 1,68) 1008), в котором зонд NF1-17 133 Таблица 31 Распределение больных в соответствии с наличием аберраций хромосомы 17 в зависимости от клинических и молекулярно-биологических факторов риска Увеличение материала 17q Трисомия 17 Норма Стадия I II III IV IVS 9 3 13 24 5 1 2 1 0 1 p=0,007 16 5 9 12 5 Диагноз ГН ГНБ НБ 0 5 49 0 0 5 p=0,036 7 5 35 Возраст Младше 12 мес. Старше 12 мес. 20 34 3 2 p=0,440 22 25 Количество копий MYCN Амплификация Норма 12 42 1 4 p=0,297 5 42 Делеция 1p Делеция Норма 15 39 3 2 p=0,118 9 38 Делеция 11q Делеция Норма 20 32 2 3 p=0,001 3 41 При анализе влияния аберраций хромосомы 17 на показатели выживаемости пациентов было выявлено негативное прогностическое значение увеличения генетического материала длинного плеча хромосомы 17. БСВ в этом случае составила 0,42±0,08, ОВ – 0,48±0,09, при отсутствии 134 аберраций хромосомы 17 показатели достигли 0,71±0,07 и 0,80±0,06, соответственно (p<0,001 и p=0,002) (рисунок 31, А., Б.). В группе пациентов с увеличением материала 17q были также отмечены два поздних рецидива опухоли, произошедшие спустя 8 лет после постановки диагноза. Рисунок 31. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с наличием увеличения генетического материала длинного плеча хромосомы 17 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 17 (сплошная кривая). Влияние увеличения генетического материала 17q на прогноз нейробластомы сохраняется среди пациентов со стадиями опухоли I-III и IVS, а также в группе больных без амплификации гена MYCN. В первом случае показатели БСВ и ОВ при увеличении материала 17q были равны и составили 0,57±0,15, при отсутствии аберраций хромосомы 17 – 0,85±0,06 и 0,94±0,04, соответственно, p=0,041 и p=0,008 (рисунок 32, А.,Б.). Во втором случае БСВ в группе пациентов с увеличением материала 17q равнялась 0,47±0,10, ОВ – 0,57±10, в группе больных без аберраций хромосомы 17 показатели достигли 0,77±0,07 и 0,84±0,06, соответственно, p=0,002 и p=0,006 (рисунок 33, А.,Б.). 135 Рисунок 32. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость больных нейробластомой стадий I-III и IVS с наличием увеличения генетического материала длинного плеча хромосомы 17 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 17 (сплошная кривая) Рисунок 33. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость больных нейробластомой без амплификации гена MYCN с наличием увеличения генетического материала длинного плеча хромосомы 17 (штриховая кривая) и отсутствием аберраций хромосомы 17 (сплошная кривая) Трисомия 17 не оказывала влияния на показатели выживаемости пациентов. Среди пяти пациентов с данной аберрацией БСВ и ОВ составили 0,80±0,18, тогда как в группе пациентов без выявленных генетических изменений хромосомы 17 достигли 0,71±0,07 и 0,80±0,06, соответственно, p=0,878 и p=0,623. 136 Увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 17 является наиболее частой аберрацией при нейробластоме. Она считается драйверной мутацией – пусковым механизмом в онкогенезе нейробластомы [28,55]. Среди обследованных пациентов 50,0% имели увеличение материала 17q, что полностью соответствует литературным данным [55]. В то же время ассоциация анализируемой аберрации с амплификацией гена MYCN и/или делецией 1p, описанная ранее [28,55], в настоящем исследовании подтверждения не нашла. Напротив, увеличение материала 17q более часто сочеталось с делецией длинного плеча хромосомы 11. Была выявлена связь аберрации с незрелым морфологическим фенотипом опухоли, а также неблагоприятное прогностическое значение в отношении БСВ и ОВ пациентов. Негативное влияние увеличения материала 17q сохранялось в группах пациентов со стадиями I-III и IVS, и с нормальным количеством копий гена MYCN, что позволяет рассматривать данную генетическую аномалию как надежный инструмент для определения прогноза у пациентов с нейробластомой. F. Westermann et al. указывают, что увеличение генетического материала всей хромосомы 17 имеет благоприятное прогностическое значение, поскольку является маркером набора хромосом близкого к триплоидному [201]. В настоящей работе были получены данные, свидетельствующие о преимущественной встречаемости умножения хромосомы 17 при локализованной опухоли или при стадии IVS. Однако, в силу малого количества пациентов с данной аберрацией, прогностическое значение трисомии 17 выявлено не было. 137 3.11. Результаты определения генетических аберраций в парах первичная опухоль-рецидив (прогрессия) У пяти пациентов, у которых произошел рецидив или прогрессия заболевания, было проведено сравнительное молекулярно-генетическое исследование ткани первичной опухоли, а также ткани опухоли при прогрессии (3 пациента) или рецидиве (2 пациента). Были использованы методы MLPA, ПЦР-РВ и ПЦР VNTR. В парах первичная опухоль-рецидив (прогрессия) были выявлены неидентичные результаты определения аберраций всех анализируемых хромосом (1,2,3,4,7,9,11,12,14,17). В одном случае в ткани первичной опухоли наблюдались множественные количественные аномалии хромосом, которые в ткани рецидивной опухоли выявлены не были. Еще в одном случае ткань опухоли после прогрессии характеризовалась меньшим количеством генетических аберраций по сравнению с образцом первичной опухоли. Это, возможно, определило благоприятный исход заболевания. У трех пациентов соотношение генетических аномалий в первичной опухоли и после развития рецидива (прогрессии) было приблизительно одинаковым, из них у одного больного не было выявлено аберраций во всех исследуемых локусах, как на момент первичной диагностики, так и после прогрессии. Во всех 5 случаях при выявлении делеции 1p и определении количества копий гена MYCN методы MLPA и ПЦР-РВ и ПЦР VNTR подтверждали друг друга. Подробная информация о данных пациентах приведена в таблице 32. Таким образом, были идентифицированы молекулярно-генетические нарушения в клетках нейробластомы, влияющие на прогноз заболевания. К ним, помимо аберраций с известным негативным прогностическим значением, таких как амплификация гена MYCN, делеция короткого плеча хромосомы 1 и увеличение генетического материала длинного плеча 138 хромосомы 17, относятся увеличение генетического материала короткого плеча хромосом 2 и 4, длинного и короткого плеч хромосомы 7, а также делеция короткого плеча хромосом 3 и 9. Были показаны высокие значения качественной сходимости результатов различных молекулярно- биологических методов, применяемых для выявления изменения числа генов или хромосомных регионов, а также возможность изменения спектра аберраций при возникновении рецидива или прогрессии опухоли. 139 С.С. Надп очечн ик З.Л. 22 Средо стени е Р.А. 60 Надп очечн ик Б.К. 14 Таз 1 НБ I Нет Рец ГН Б I Нет Рец НБ IV ЛУ Про гр 1 2 1 Дел Дел MN A 1p 1p 1 Н 2 1 Н Н 1 Н 2 Н 2 1 Н Н 2 Н 1 2 Н Н 1 УМ 12q Н Н УМ Н УМ Н УМ 4 7 9 Н Н Н УМ УМ УМ Н УМ 12q 12q 14q 17q Н Н Н Н Дел 1p Н Н Дел Дел Дел Н Н 3p 3p 4p Н Дел Дел Н Дел УМ УМ 9p 9p 11q 12q 12q 1 2 Н Н Н 1 Н Исход Хромосома 17 2 M NA Н 2 Н Хромосома 14 Хромосома 12 Хромосома 11 Хромосома 9 Хромосома 7 Хромосома 4 Хромосома 3 Хромосома 2 Хромосома 1 Событие Метастазы Стадия Диагноз Первичный очаг Возраст, мес. Пациент Таблица 32 Характеристика пациентов, подвергнутых молекулярно-генетическому исследованию при первичной диагностике опухоли и при развитии прогрессии или рецидива заболевания 2 Н СоЗ Н Жив Н УМ УМ СоЗ 17q 17q ГН III Нет Про Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Жив Б гр З.Т. 12 ЗП НБ IV Печ Про Дел Н УМ Н Н Дел Н Н Дел Н Н Н Н Н Н Н Н Н УМ Н Жив S ень гр 1p 2p(1) 3p 7q 17q Примечание. ЗП – забрюшинное пространство, НБ – нейробластома, ГНБ – ганглионейробластома, ЛУ – метастатическое поражение лимфоузлов забрюшинного пространства и средостения, Рец. – рецидив, Прогр. – прогрессия, Н. – норма, Дел. – делеция, MNA – амплификация гена MYCN, УМ – увеличение генетического материала, УМ2p(1) – увеличение генетического материала 2p, тип 1, СоЗ – смерть от заболевания. Цифра 1 соответствует первичной опухоли, 2 – рецидиву (прогрессии). 140 ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНИЦИАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА И ОЦЕНКИ МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ Определение инициального поражения КМ необходимо для корректного стадирования заболевания, а выявление остаточных опухолевых клеток в процессе лечения характеризует ответ опухоли на проводимую терапию [61,125]. При этом поражение КМ, выявляемое как при первичной диагностике нейробластомы, так и в процессе лечения, имеет негативное прогностическое значение [61,90,170]. В настоящее время отсутствует единый стандартизованный подход к определению поражения КМ с использованием высокочувствительных методов и в рутинной клинической практике стандартное цитологическое исследование занимает ведущее место. Однако аналитическая чувствительность данного метода невысока [33,47,48]. Соответственно, поиск чувствительного и специфичного метода выявления поражения КМ и оценки МОБ остается актуальным. 4.1. Исследование инициального поражения КМ и оценка МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов Экспрессия генов, выбранных в качестве маркеров поражения КМ, определялась с помощью ПЦР-РВ. Матричная РНК генов PHOX2B, TH, GD2 и ELAVL4 была выявлена во всех образцах исследованных клеточных линий нейробластомы. Ген GD2 был гомогенно экспрессирован в обеих клеточных линиях, в то время как экспрессия PHOX2B и ELAVL4 была достоверно ниже в культуре клеток Kelly, а экспрессия TH – в клетках IMR-32. Значения нормализованной величины экспрессии генов приведены в таблице 33. 141 Таблица 33 Нормализованная величина экспрессии генов PHOX2B, TH, GD2 и ELAVL4 в исследованных клеточных линиях. Медиана (диапазон) IMR-32 Kelly p PHOX2B -0,27 (-0,34 – 0,17) -0,67 (-0,95 – (-0,55)) 0,034 TH -0,59 (-2,57 – 0,96) 2,23 (0,82 – 2,61) 0,017 GD2 -0,20 (-4,53 – 2,11) -1,87 (-2,60 – 0,65) 0,594 ELAVL4 1,41 (0,54 – 1,98) -2,68 (-2,86 – (-2,24) 0,016 При анализе серийных разведений РНК, выделенной из клеток IMR-32, а также смеси РНК, выделенной из 10 образцов ткани нейробластомы, в РНК лейкоцитов периферической крови здоровых доноров аналитическая чувствительность определения экспрессии генов PHOX2B, TH, GD2 и ELAVL4 достигала 1×10-6. Ни в одном из 26 образцов КМ пациентов без онкологических заболеваний экспрессия PHOX2B и TH не была выявлена. Матричная РНК ELAVL4 обнаружена в 20 образцах из 26 (76,9%), а GD2 – в 15 из 26 образцов (57,7%). Среди исследованного 331 образца КМ больных нейробластомой было выявлено 107 (32,3%) образцов, удовлетворяющих критериям позитивности (обнаружение опухолевых клеток в цитологических препаратах КМ или наличие экспрессии гена PHOX2B). Из них 31 был получен на момент диагностики, 59 – во время терапии и 17 – при диагностике рецидива. Количество позитивных образцов, экспрессирующих исследуемые маркеры, представлено в таблице 34. Таблица 34 Количество образцов КМ больных нейробластомой, удовлетворяющих критериям позитивности, в которых была выявлена экспрессия исследуемых маркеров Перед началом PHOX2B 30 TH 30 ELAVL4 31 GD2 31 142 терапии В ходе терапии При диагностике рецидива Всего Нет экспрессии 58 52 59 59 17 14 17 17 105 2 96 11 107 0 107 0 Частоту выявления экспрессии исследуемых генов в позитивных образцах сравнивали с таковой в негативных образцах больных нейробластомой, а также в образцах пациентов контрольной группы (без онкологических заболеваний). Результаты качественного сравнения представлены в таблице 35. Таблица 35 Общее количество образцов КМ, где была выявлена экспрессия исследуемых маркеров Позитивные образцы Негативные образцы Контрольная группа р PHOX2B TH ELAVL4 GD2 105/107 96/107 107/107 107/107 0/224 5/224 209/224 197/224 0/26 0/26 20/26 15/26 < 0,001 < 0,001 0,717 0,288 Таким образом, экспрессия генов PHOX2B и TH в позитивных образцах определялась достоверно чаще, чем в негативных и контрольных, тогда как частота обнаружения экспрессии ELAVL4 и GD2 в позитивных, негативных и контрольных образцах достоверно не отличалась. Различий в частоте выявления экспрессии РНОХ2В, ТН, ELAVL4 и GD2 между негативными и контрольными образцами также выявлено не было (р=0,999, р=0,988, p=0,643 и р=0,277 соответственно). Количественно сравнивали образцы, в которых определялась экспрессия исследуемых маркеров (рисунок 34). Было выявлено, что экспрессия ТН в позитивных образцах была выше, чем в негативных 143 (р=0,002), а экспрессия ELAVL4 и GD2 в позитивных образцах была выше экспрессии этих маркеров как в негативных, так и в контрольных образцах (р<0,001 и р<0,001 для ELAVL4 и GD2, соответственно). Рисунок 34. Нормализованная величина экспрессии исследуемых маркеров (горизонтальная линия соответствует медиане) в позитивных и негативных образцах КМ больных нейробластомой, клеточных линиях IMR32 и Kelly, а также образцах КМ пациентов без нейробластомы (контрольная группа). Сравнение экспрессии генов РНОХ2В, ТН, ELAVL4 и GD2 в образцах, взятых на момент первичной диагностики, и образцах, полученных во время 144 терапии, показало, что экспрессия РНОХ2В, ТН и GD2 во время лечения оставалась стабильной (р=0,162, р=0,854 и р=0,200 соответственно), тогда как экспрессия ELAVL4 в ходе терапии достоверно снижалась (p=0,007) (рисунок 35). Рисунок 35. Сравнение нормализованной величины экспрессии исследуемых маркеров в образцах КМ больных нейробластомой, где таковая была выявлена, на этапе первичной диагностики и в ходе терапии. Так как мРНК части исследуемых маркеров была выявлена в негативных образцах и образцах пациентов контрольной группы, для 145 определения порогового значения величины экспрессии генов ТН, GD2 и ELAVL4 был проведен ROC-анализ, результаты которого представлены на рисунке 36. Рисунок 36. ROC-кривые экспрессии генов TH, GD2 и ELAVL4, пороговый уровень обозначен стрелкой, ППК – площадь под кривой. Выявлено, что все исследованные маркеры обладают статистически значимой диагностической ценностью при разделении позитивных и негативных образцов (во всех случаях р<0,001). Результаты сравнения ROCкривых представлены в таблице 36. Таблица 36 Результаты сравнения ROC-кривых TH (ППК=0,95) PHOX2B (ППК=0,99) TH (ППК=0,95) ELAVL4 (ППК=0,84) р=0,008 - ELAVL4 (ППК=0,84) р<0,001 р<0,001 - GD2 (ППК=0,75) р<0,001 р<0,001 р<0,001 На основании анализа ROC-кривых были определены ПУ экспрессии, которые для TH, ELAVL4, GD2 составили -16,535; -7,130; -8,495, соответственно. В таблице 37 представлены результаты исследования экспрессии исследованных генов в позитивных и негативных образцах КМ 146 больных нейробластомой с учетом ПУ, установленных с помощью ROCанализа. Таблица 37 Результаты определения экспрессии генов-маркеров в позитивных и негативных образцах КМ больных нейробластомой PHOX2B Выше Ниже ПУ ПУ Позитивные образцы Негативные образцы TH Выше Ниже ПУ ПУ ELAVL4 Выше Ниже ПУ ПУ GD2 Выше Ниже ПУ ПУ 105 2 96 11 63 44 50 57 0 224 5 219 13 211 20 204 В двух образцах КМ, в которых при цитологическом исследовании определялись опухолевые клетки, и отсутствовала экспрессия PHOX2B, была выявлена экспрессия TH. Подробная информация о данных образцах представлена в таблице 38. Обнаружение экспрессии гена TH при отсутствии экспрессии PHOX2B может свидетельствовать о целесообразности сочетанного использования двух маркеров для корректного выявления поражения КМ. Таблица 38 Характеристика образцов КМ, в которых определялись клетки нейробластомы при цитологическом исследовании, а экспрессия PHOX2B отсутствовала Пациент Этап лечения Б.Д. После 2 блока Б.Е. Экспрессия геновмаркеров TH ELAVL4 GD2 Выше Ниже Выше ПУ ПУ ПУ Инициальная Выше диагностика ПУ Ниже ПУ Ниже ПУ Количество копий гена Стадия MYCN Норма Средостение IV (2 копии) Амплификация Забрюшинное (более 20 IV пространство копий) Первичный очаг Учитывая пороговые значения экспрессии, были рассчитаны критерии диагностической значимости данных тестов, представленные в таблице 39. 147 Кроме того, был дополнительно проанализирован вариант оценки поражения КМ, при котором позитивными признавались образцы с наличием экспрессии PHOX2B и/или TH, превосходящей пороговый уровень. Таблица 39 Критерии оценки диагностической информативности определения геновмаркеров для выявления поражения КМ при нейробластоме Ген-маркер ПЦПР ПЦОР ДЧ Сп ДЭТ PHOX2B 1,000 0,991 0,981 1,000 0,994 TH 0,950 0,952 0,897 0,978 0,952 ELAVL4 0,829 0,827 0,589 0,942 0,828 GD2 0,714 0,782 0,467 0,911 0,767 PHOX2B 0,955 1,000 1,000 0,978 0,985 и/или TH ПЦПР – прогностическая ценность положительного результата, ПЦОР – прогностическая ценность отрицательного результата, ДЧ – диагностическая чувствительность, Сп – специфичность, ДЭТ – диагностическая эффективность теста. С целью оценки специфичности анализируемых маркеров для выявления поражения КМ при нейробластоме была исследована их экспрессия в КМ пациентов с различными солидными опухолями. Из 75 проанализированных образцов КМ пациентов с меланомой, ретинобластомой, рабдомиосаркомой, феохромоцитомой, эпендимомой и саркомой Юинга/ПНЭО 31 был признан позитивным, 37 – негативными, 7 образцов КМ классифицированы не были. Экспрессия гена PHOX2B была выявлена только в одном образце КМ от пациента с меланомой. Ген TH был экспрессирован в 1 из 3 образцов при меланоме, во всех трех образцах при злокачественной феохромоцитоме, в 1 из 33 образцов при саркоме Юинга/ПНЭО, а также во всех позитивных образцах при альвеолярной рабдомиосаркоме. Наличие экспрессии генов PHOX2B и TH в клетках меланомы объясняется общим с нейробластомой гистогенезом опухоли из производных нервного гребня [27,133]. Выявление высокой экспрессии гена TH в клетках злокачественной феохромоцитомы связано с его участием в 148 продукции катехоламинов. Экспрессия гена ELAVL4, превосходящая ПУ, была обнаружена в образцах КМ больных меланомой, саркомой Юинга/ПНЭО и альвеолярной рабдомиосаркомой, GD2 – также при ретинобластоме. В случае саркомы Юинга/ПНЭО и альвеолярной рабдомиосаркомы экспрессия генов ELAVL4 и GD2, превосходящая ПУ, определялась только в позитивных образцах КМ (таблица 40). Полученные результаты свидетельствуют о наибольшей специфичности гена PHOX2B для клеток нейробластомы. Таблица 40 Выявление экспрессии генов PHOX2B, TH, ELAVL4 и GD2 в КМ при различных солидных опухолях Количество образцов КМ Количество позитивных/ негативных образцов КМ PHOX2B Меланома 1 3 РБ 1 5 ЭРМС 1 1 АРМС 5 26 Фео. 1 3 Эпендимома 1 4 НД 1 (+) 4 (-) НД 12 (+) 14 (-) НД 1 (+) 3 (-) 17 (+) 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Опухоль Количество пациентов Количество образцов КМ с экспрессией генов выше ПУ TH 1 0 0 0 12 0 3 0 0 1 ELAVL4 GD2 2 0 0 0 4 0 0 0 0 4 3 1 0 0 4 0 0 0 0 8 Саркома Юинга/ 8 33 16 (-) 0 0 0 0 ПНЭО РБ – ретинобластома, ЭРМС – эмбриональная рабдомиосаркома, АРМС – альвеолярная рабдомиосаркома, Фео. – злокачественная феохромоцитома, НД – нет данных, (+) – позитивные образцы, (-) – негативные образцы. Экспрессия гена PHOX2B, по данным литературы, полностью отсутствует в клетках КМ, и в высокой степени выявляется в клетках 149 нейробластомы [170,171]. В настоящем исследовании были получены сходные результаты: мРНК PHOX2B выявлялась во всех образцах клеточных линий, тогда как в КМ пациентов без нейробластомы она отсутствовала. Данный факт послужил основой для выбора экспрессии PHOX2B как одного из критериев позитивности образцов КМ, наряду с цитологическим обнаружением опухолевых клеток. Аналитическая чувствительность определения экспрессии генов PHOX2B, TH, ELAVL4 и GD2 составила 1×10-6, что значительно превышает предел чувствительности цитологического исследования, являющегося на сегодняшний день основным методом оценки поражения КМ. Одним из первых молекулярных маркеров, который стал применяться для оценки поражения КМ при нейробластоме, был ген TH. По данным различных исследований, экспрессия данного гена специфична для клеток нейробластомы и позволяет с высокой чувствительностью выявлять опухолевые клетки в КМ [36,189]. Ген TH используется для стандартизации диагностических исследований по выявлению минимальной остаточной болезни при нейробластоме [196], а также для контроля контаминации продуктов афереза АГСК из периферических крови [120]. Однако в ряде работ было отмечено наличие мРНК TH в клетках КМ у пациентов без нейробластомы, но в значительно меньших количествах, чем в клетках опухоли [171, 197]. По результатам настоящего исследования, экспрессия данного маркера в образцах контрольной группы отсутствовала, а величина экспрессии TH в негативных образцах пациентов с нейробластомой была достоверно ниже, чем в позитивных. TH показала высокие значения всех критериев оценки диагностической эффективности исследования. При сравнении ROC-кривых было выявлено, что диагностическая эффективность ТН уступает PHOX2B, но значительно превосходит ELAVL4 и GD2. В то же время, в двух образцах КМ, в которых при цитологическом исследовании 150 определялись опухолевые клетки, а мРНК PHOX2B отсутствовала, была обнаружена экспрессия гена TH, превосходящая пороговый уровень. N.K. Cheung et al впервые показали, что выявление мРНК GD2 в КМ коррелирует с выявлением клеток GD2-позитивных методом иммуноцитохимии [48]. Однако в более поздних работах было показано наличие высокой экспрессии данного маркера в образцах нормальных клеток гемопоэтической природы, что, при введении пороговых значений, приводило к снижению чувствительности исследования [170,171,176]. В рамках данной работы в 15 из 26 образцов КМ пациентов без нейробластомы и в 197 из 224 негативных образцов определялась экспрессия гена GD2, что при проведении ROC-анализа и введении порогового уровня величины экспрессии привело к низкому значению диагностической чувствительности данного маркера. Несмотря на то, что использование GD2 обладает значимой диагностической ценностью при разделении позитивных и негативных образцов (рисунок 36), сравнение ROC-кривых показало, что диагностические возможности GD2 достоверно меньше, чем всех других исследованных маркеров. Ген ELAVL4 экспрессируется клетками опухолей нейроэктодермальной природы, в частности, нейробластомы [65,176]. Утверждение о крайне низкой экспрессии данного маркера в клетках КМ пациентов без злокачественных опухолей [176] в настоящем исследовании подтверждения не нашло. Матричная РНК ELAVL4 была обнаружена в 20 из 26 образцов КМ пациентов без нейробластомы, а также в 209 из 224 негативных образцов. При этом величина экспрессии ELAVL4, как и GD2, достоверно отличалась между позитивными и негативными образцами КМ больных нейробластомой, а также между позитивными образцами КМ больных нейробластомой и образцами контрольной группы. Кроме того, ELAVL4 является единственным из исследованных маркеров, экспрессия которого снижалась в процессе терапии нейробластомы в сравнении с этапом 151 первичной диагностики. По данным ROC-анализа, диагностические характеристики ELAVL4 были хуже, чем у PHOX2B и TH, в первую очередь, за счет более низкой величины диагностической чувствительности, но достоверно лучше, чем у GD2. J. Stutterheim et al. была предложена диагностическая панель молекулярных маркеров для выявления поражения КМ, куда вошли гены PHOX2B, TH, DDC, CHRNA3, GAP43, которая позволяет увеличить чувствительность метода по сравнению с использованием только PHOX2B в силу его неодинаковой экспрессии у разных пациентов [171]. Использование комбинации данных маркеров, по сравнению с применением только PHOX2B, позволяет дополнительно обнаружить около 6% позитивных образцов [171]. В связи с высокими значениями диагностической эффективности теста для гена TH, нами была исследована возможность мониторинга поражения КМ, когда позитивными признавались образцы с выявляемой экспрессией PHOX2B и/или экспрессией TH, превосходящей пороговый уровень. По сравнению с использованием только PHOX2B, добавление TH приводило к увеличению диагностической чувствительности, однако специфичность и диагностическая эффективность теста снижались. Таким образом, объединение PHOX2B и TH в диагностическую панель помогает выявлять поражение КМ в редких случаях при отсутствии экспрессии PHOX2B. 4.2. Прогностическое значение выявления поражения КМ и МОБ на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов При оценке диагностической эффективности молекулярных маркеров поражения КМ было выявлено, что определение экспрессии генов PHOX2B и TH обладает наиболее высокими показателями. Соответственно, выявляемая экспрессия одного из этих генов выше ПУ была принята в качестве критерия 152 наличия поражения КМ на момент первичной диагностики нейробластомы, а также персистенции опухолевых клеток после индукционной химиотерапии (наличия МОБ). Обнаружение экспрессии генов как минимум в одном образце КМ позволяло относить данного пациента в группу больных, имеющих инфильтрацию КМ клетками нейробластомы. Из 75 пациентов, включенных в исследование прогностической значимости поражения КМ, у 24 (32,0%) на момент первичной диагностики опухоли была зафиксирована экспрессия генов PHOX2B и/или TH. Из них в одном случае была выявлена экспрессия только PHOX2B, тогда как в остальных присутствовали оба гена. У 23 пациентов морфологическим вариантом опухоли являлась нейробластома, у 1 – ганглионейробластома. 12 больных были младше 12 месяцев. Распределение по стадиям было следующим: стадия I – 2 пациента, стадия III – 3, стадия IV – 15, стадия IVS – 4 больных. Наличие поражения КМ, выявленное на основании экспрессии генов PHOX2B и TH показало прогностическую значимость в отношении БСВ и ОВ пациентов. В том случае, если хотя бы в одном образце КМ, полученном на момент первичной диагностики нейробластомы, определялась экспрессия генов PHOX2B и/или TH, БСВ составила 0,49±0,12, ОВ – 0,57±0,12. При отсутствии экспрессии – 0,75±0,07 и 0,80±0,07, соответственно, p=0,014 и p=0,029 (рисунок 37, А.,Б.). 153 Рисунок 37. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с наличием экспрессии генов PHOX2B и/или TH в КМ на момент первичной диагностики (штриховая кривая) и при отсутствии экспрессии данных генов (сплошная кривая) Негативное прогностическое значение выявления экспрессии генов PHOX2B и TH в КМ при первичной диагностике нейробластомы сохраняется в группах пациентов с нормальным количеством копий гена MYCN и младше 12 месяцев. В первом случае при наличии экспрессии опухоль- ассоциированных генов показатели БСВ и ОВ составили 0,50±0,14 и 0,62±0,14. При отсутствии поражения КМ, выявленного молекулярным методом – 0,83±0,07 и 0,89±0,06, соответственно, p=0,011 и p=0,027 (рисунок 38, А.,Б.). Во втором случае – при выявлении экспрессии PHOX2B и/или TH в КМ БСВ составляла 0,58±0,17, ОВ – 0,66±0,17; если мРНК анализируемых генов не была выявлена, БСВ и ОВ достигли 0,93±0,07, p=0,014 и p=0,069 (рисунок 39, А.,Б.). 154 Рисунок 38. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость больных нейробластомой без амплификации гена MYCN с наличием экспрессии генов PHOX2B и/или TH в КМ на момент первичной диагностики (штриховая кривая) и при отсутствии экспрессии данных генов (сплошная кривая) Рисунок 39. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость больных нейробластомой младше 12 месяцев с наличием экспрессии генов PHOX2B и/или TH в КМ на момент первичной диагностики (штриховая кривая) и при отсутствии экспрессии данных генов (сплошная кривая) Из 24 пациентов, у которых на момент первичной диагностики нейробластомы в КМ была выявлена экспрессия генов PHOX2B и/или TH, у 13 она сохранялась в процессе лечения (после 2,4 или 6 блока 155 химиотерапии), а у 6 - после окончания индукционной терапии (после 6 блока). У 4 больных не было взято образцов КМ в процессе лечения, поскольку они не подходили под критерии группы высокого риска протокола NB2004 и не получали соответствующей терапии. Данные о наличии МОБ после индукционной химиотерапии 6 пациентов также отсутствовали. Указанные пациенты не вошли в исследование прогностической значимости выявления остаточных опухолевых клеток в процессе лечения. При анализе прогностической значимости выявления экспрессии генов PHOX2B и TH в ходе терапии не было показано его влияния на БСВ пациентов. Она составила 0,37±0,15 при наличии экспрессии и 0,43±0,22 при ее отсутствии, p=0,386. В то же время была выявлена тенденция к снижению ОВ при выявлении мРНК генов PHOX2B и TH в КМ в процессе лечения – 0,37±0,15 по сравнению с 0,80±0,18 при отсутствии, p=0,122 (рисунок 40, А.). Анализ экспрессии генов PHOX2B и TH в КМ после окончания индукционной химиотерапии выявил аналогичную тенденцию. При наличии экспрессии генов ОВ составила 0,22±0,19, при отсутствии – 0,70±0,18, p=0,121 (рисунок 40, Б.). Выявление мРНК опухоль-ассоциированных генов в КМ после индукционной терапии на БСВ влияния не оказывало: 0,22±0,19 и 0,38±0,20, p=0,206. 156 Рисунок 40. Общая выживаемость пациентов с наличием экспрессии генов PHOX2B и/или TH в КМ в процессе лечения (А.) и после окончания индукционной химиотерапии (Б.) (штриховая кривая) и при отсутствии экспрессии данных генов (сплошная кривая) Ранее было показано, что поражение КМ, выявляемое на момент инициальной диагностики, имеет негативное прогностическое значение в отношении выживаемости пациентов [57,161]. При этом количество опухолевых клеток, инфильтрирующих КМ, значения не имеет, важен лишь факт наличия диссеминированной опухоли, выявляемой на субмикроскопическом уровне [172]. В настоящем исследовании были получены результаты, свидетельствующие о снижении показателей БСВ и ОВ при наличии поражения КМ, выявленного на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов. Эта зависимость сохранялась в группе больных с нормальным количеством копий гена MYCN и среди пациентов младше 12 месяцев. При этом значение поражения КМ у пациентов с локализованной нейробластомой остается неясным. Среди пациентов с выявленной экспрессией генов PHOX2B и TH в КМ двое имели стадию I, трое – стадию III. Оба больных с I стадией и один с III попали в группу наблюдения и не получали химиотерапию. Неблагоприятных событий у них зафиксировано не было (время наблюдения составило 11, 43 и 7 месяцев, 157 соответственно). Двое пациентов со стадией III имели амплификацию гена MYCN и были включены в группу высокого риска. Один из них не ответил на индукционную терапию, второй получил трансплантацию АГСК и сейчас находится в полной продолжающейся ремиссии (25 месяцев). Преимущество отсутствия МОБ после индукционной химиотерапии и ранней санации КМ от опухолевых клеток при проведении лечения было показано в ряде исследований [76,172,183]. В настоящей работе пациенты, сохраняющие экспрессию опухоль-ассоциированных генов в КМ в процессе терапии, имели тенденцию к снижению ОВ, однако различия не достигли статистической значимости. В группе больных, сохраняющих МОБ после проведения индукционной химиотерапии, ОВ имела более низкие значения, но различия также не достигли статистической достоверности. 4.3. Выявление контаминации препаратов АГСК и МОБ на момент проведения лейкафереза на основании экспрессии опухоль-ассоциированных генов Экспрессия генов PHOX2B и TH исследовалась в 18 образцах АГСК для оценки возможности выявления их контаминации опухолевыми клетками. При этом экспрессия не была выявлена ни в одном случае, в том числе при наличии экспрессии PHOX2B и TH в КМ перед проведением процедуры лейкафереза (3 пациента) и при отсутствии CD34+ селекции (4 пациента). Таким образом, анализ экспрессии генов PHOX2B и TH в препаратах АГСК не был информативным для оценки прогноза после проведения трансплантации. Вместе с этим, выявление экспрессии PHOX2B и TH в КМ перед проведением лейкафереза показало негативное прогностическое значение в отношении как БСВ, так и ОВ, которые в этом случае составляли 0,00. При отсутствии экспрессии показатели БСВ и ОВ 158 достигли 0,59±0,14 и 0,75±0,13, соответственно, p=0,021 и p=0,016 (рисунок 41, А.,Б.). Рисунок 41. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с наличием экспрессии генов PHOX2B и/или TH в КМ перед проведением лейкафереза (штриховая кривая) и при отсутствии экспрессии данных генов (сплошная кривая) Большинство исследователей сходятся во мнении, что перенос опухолевых клеток при проведении аутологичной ТГСК сопряжен с увеличением риска развития рецидива опухоли. Высокочувствительные методы обнаружения остаточных опухолевых клеток позволяют выявить контаминацию препарата АГСК клетками нейробластомы и избежать их реинфузии [20,37,183]. С этой целью было предложено применять выявление транскрипта гена TH [20,37] или GD2-позитивные клетки методом иммуноцитологии [89]. В настоящем исследовании экспрессия генов PHOX2B и TH в препаратах АГСК не была выявлена, даже при наличии транскриптов в КМ перед аферезом АГСК и при отсутствии CD34+ селекции, а также при сочетании двух факторов у одного пациента. В то же время выявление экспрессии генов PHOX2B и TH в КМ перед проведением процедуры лейкафереза было связано со снижением показателей БСВ и ОВ пациентов после аутологичной ТГСК. Данный факт позволяет выбрать 159 наиболее оптимальное время для заготовки АГСК, стремясь к достижению молекулярной ремиссии. 4.4. Сравнение результатов выявления поражения КМ при помощи экспрессии опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрии Проточная цитометрия является чувствительным методом анализа популяций клеток КМ. Факт наличия поражение КМ с помощью проточной цитометрии устанавливался при выявлении клеток с одновременной экспрессией маркеров CD56, CD81 и GD2 и отсутствием экспрессии CD45 (рисунок 42). Рисунок 42. Пример экспрессии CD45, CD56, CD81, GD2 и CD9 клетками нейробластомы в костном мозге, а также расположение этих клеток на скатерограмме Аналитическая чувствительность выявления транскриптов генов PHOX2B и TH достигла 1×10-6, тогда как проточной цитометрии находилась в диапазоне от 1×10-3 до 1×10-5. В 193 случаях (59,2%) поражение КМ не было выявлено ни одним методом, 38 (11,7%) образцов были негативны по результатам проточной цитометрии, но в них выявлялась экспрессия генов PHOX2B и/или TH. В 31 образце (9,5%), напротив, опухолевые клетки были выявлены с помощью проточной цитометрии, а экспрессия генов PHOX2B и TH отсутствовала. В 64 образцах (19,6%) наличие поражения КМ было зафиксировано обоими методами. Таким образом, общая сходимость 160 результатов ПЦР-РВ и проточной цитометрии достигла 78,8%, рисунок 43, А. Поражение КМ данными методами выявлялось, в том числе, в образцах больных с локализованной нейробластомой. Это обусловлено тем, что чувствительность методов ПЦР-РВ и проточной цитометрии значительно превосходит чувствительность цитологического исследования КМ. Качественная сходимость результатов ПЦР-РВ и проточной цитометрии при локализованных стадиях нейробластомы составила 80,7% (рисунок 43, Б). В 16 образцах опухолевые клетки были обнаружены по результатам проточной цитометрии, однако экспрессия генов PHOX2B и TH в них не выявлялась, 5 образцов с выявленной экспрессией генов PHOX2B и/или TH были негативными по данным проточной цитометрии. Среди 189 образцов КМ пациентов с диссеминированной опухолью (стадия IV) было выявлено 38, в которых результаты выявления поражения КМ двумя методами не совпадали. Большинство из них (26) были позитивными по данным ПЦР-РВ и негативными по результатам проточной цитометрии, сходимость составила 79,9% (рисунок 43, В). Рисунок 43. Качественная сходимость результатов выявления поражения КМ методами ПЦР-РВ (выявление экспрессии генов PHOX2B и TH) и проточной цитометрии в зависимости от распространенности опухоли. А. – общая группа; Б. – образцы КМ пациентов с локализованной нейробластомой (стадии I-III); В. – образцы КМ пациентов с нейробластомой IV стадии 161 При анализе образцов КМ, полученных при первичной диагностике нейробластомы, качественная сходимость данных ПЦР-РВ и проточной цитометрии составила 75,0%. Количество образцов с несоответствующими результатами было приблизительно одинаковым в пользу того и другого метода (рисунок 44, А). Среди образцов с дискордантными результатами, взятых в процессе терапии, было выявлено преобладание позитивных по данным определения транскриптов PHOX2B и/или TH и негативных по данным проточной цитометрии. Это могло быть связано с более высокой аналитической чувствительностью ПЦР-РВ и, соответственно, большей частотой выявления малого количества опухолевых клеток, сохраняющихся в процессе лечения. Сходимость данных достигла 80,8%, рисунок 44, Б. В образцах КМ, полученных при диагностике рецидива опухоли, количество несоответствий также было приблизительно одинаковым в обе стороны, они обнаруживались в 10 образцах из 51. Сходимость результатов составила 80,4%, рисунок 44, В. Рисунок 44. Качественная сходимость результатов выявления поражения КМ методами ПЦР-РВ и проточной цитометрии в зависимости от времени получения образцов КМ. А. – образцы КМ, полученные при первичной диагностике; Б. – образцы КМ, взятые в процессе терапии; В. – образцы КМ, полученные при диагностике рецидива или прогрессии опухоли. 162 Качественная сходимость данных ПЦР-РВ и проточной цитометрии незначительно изменялась в зависимости от чувствительности проточной цитометрии. При чувствительности ниже 1×10-4 она составила 75,6%, выше указанного уровня – 81,1%, рисунок 45. Рисунок 45. Качественная сходимость результатов выявления поражения КМ методами ПЦР-РВ и проточной цитометрии в зависимости от чувствительности проточной цитометрии. А. – ниже 1×10-4; Б. – выше 1×10-4 Таким образом, качественная сходимость результатов выявления поражения КМ методами ПЦР-РВ и проточной цитометрии составила около 80,0% и не зависела от распространенности опухолевого процесса (p=0,981), времени получения образцов КМ (p=0,490) и чувствительности проточной цитометрии (p=0,292). 4.5. Исследование поражения КМ и оценка МОБ на основании выявления метилированной формы гена RASSF1a и определение его прогностической значимости Ген RASSF1a является геном-супрессором опухолевого роста, и его функция подавлена в клетках многих злокачественных опухолей. Инактивация гена происходит либо из-за делеции его кодирующей 163 последовательности промоторного (регион региона, либо 3p21.31), что происходит за в счет метилирования клетках нейробластомы [23,95,111,173]. Во всех образцах клеточных линий нейробластомы IMR-32, Kelly и SHSY5Y была выявлена метилированная форма гена RASSF1a, в то время как неметилированная злокачественных отсутствовала. новообразований, В образцах напротив, КМ пациентов определялся без только неметилированный ген RASSF1a. Среди исследованных 217 образцов КМ больных нейробластомой было выявлено 69, в которых определялись как метилированная, так и неметилированная порции гена RASSF1a, они были расценены как позитивные. Из них 27 были получены на момент первичной диагностики нейробластомы, 22 – во время терапии и 20 – при диагностике рецидива. В 148 негативных образцах КМ был обнаружен только неметилированный ген RASSF1a (таблица 41). Таблица 41 Частота выявления метилированной и неметилированной форм гена RASSF1a в образцах КМ больных нейробластомой, пациентов без злокачественных опухолей и клеточных линиях Образцы КМ при диагностике нейробластомы КМ во время терапии КМ при диагностике рецидива (прогрессии) КМ пациентов без злокачественных опухолей Клеточные линии нейробластомы Метилированный RASSF1a Неметилированный RASSF1a 27 65 22 71 20 12 0 5 3 0 В исследование влияния поражения КМ, определяемого с помощью выявления метилированного гена RASSF1a, на выживаемость пациентов 164 вошли 40 больных нейробластомой. У двух пациентов отсутствовали образцы КМ, полученные в момент первичной диагностики, и они не были включены в анализ. Было обнаружено негативное прогностическое значение наличия метилированной формы гена RASSF1a в КМ в отношении БСВ пациентов. В этом случае она составила 0,28±0,13, при отсутствии метилированной порции RASSF1a в КМ – 0,67±0,11, p=0,023 (рисунок 46, А.). Влияния присутствия метилированного гена RASSF1a в КМ на ОВ отмечено не было: 0,56±0,16 и 0,67±0,11, p=0,411 (рисунок 46, Б.) Рисунок 46. Бессобытийная (А.) и общая (Б.) выживаемость пациентов с наличием метилированной формы гена RASSF1a в КМ (штриховая кривая) и при её отсутствии (сплошная кривая) на момент первичной диагностики Выявление метилированного гена RASSF1a в КМ во время лечения не приводило к снижению показателей БСВ и ОВ по сравнению с его отсутствием: 0,19±0,17 и 0,49±0,23; 0,40±0,22 и 0,80±0,18, соответственно, p=0,205 и p=0,362. Метилированный ген RASSF1a преимущественно выявлялся в КМ пациентов с IV стадией нейробластомы: у 12 из 21 больного, однако он был выявлен у 1 пациента со стадией I и у 4 со стадией III. Примечательно, что в данном исследовании метилированный ген RASSF1a не был обнаружен в КМ ни у одного из 7 больных со стадией нейробластомы IVS, в том числе в 3 165 случаях, когда цитологического опухолевые клетки исследования. были Согласно выявлены с помощью литературным данным, метилирование промоторного региона гена RASSF1a происходит в 70-94%, случаев нейробластомы. Его частота увеличивается с увеличением агрессивности опухоли [23,95,111,173]. Выявление метилированного гена RASSF1a в КМ свидетельствует о наличии агрессивной метастатической нейробластомы. Отсутствие его в случае распространенной опухоли стадии IVS может быть связано с благоприятной биологией нейробластомы и, соответственно, хорошим прогнозом. Метилированный ген RASSF1a не является специфичным для клеток нейробластомы. Он выявляется в клетках рака легкого и молочной железы [93,173]. В то же время было показано, что выявление метилированного гена RASSF1a в КМ пациента с нейробластомой является надежным предиктором наступления неблагоприятного события. 4.6. Сопоставление результатов выявления поражения КМ с помощью метилированной формы гена RASSF1a с определением экспрессии опухольассоциированных генов и проточной цитометрией Метилированная форма гена RASSF1a является маркером поражения КМ, основанным на анализе геномной ДНК, что определяет его стабильность в клетках как первичной опухоли, так и метастазов. Экспрессия опухольассоциированных генов, таких как PHOX2B и TH может быть гетерогенной в различных образцах опухоли, а также снижаться в метастатических клетках или под воздействием химиотерапии, что затрудняет выявление поражения КМ и оценку МОБ. Кроме того, геномная ДНК более стабильна в условиях ex vivo, нежели РНК. Как метилированный ген RASSF1a, так и мРНК генов PHOX2B и TH не были выявлены в КМ пациентов без злокачественных опухолей. Для определения качественной сходимости результатов определения поражения 166 КМ и обнаружения остаточных опухолевых клеток с помощью двух методик, основанных на ПЦР-РВ, 217 образцов КМ больных нейробластомой были протестированы на наличие метилированной формы гена RASSF1a и экспрессии генов PHOX2B и/или TH. В 57 (26,3%) образцах выявлялись и метилированная форма гена RASSF1a, и экспрессия генов PHOX2B и/или TH, в 12 (5,5%) образцах – только метилированный ген RASSF1a, в 34 (15,7%) – только экспрессия генов PHOX2B и/или TH, 114 (52,5%) были негативны по результатам обоих методов. Таким образом, качественная сходимость данных выявления поражения КМ составила 78,8%. Среди образцов, полученных при первичной диагностике, сходимость составила 80,4%, в образцах, взятых в ходе лечения – 79,6%, при диагностике рецидива – 71,9%. В первом случае большинство образцов с несоответствующими результатами двух методик, были позитивны по экспрессии PHOX2B и/или TH и негативны по наличию метилированного гена RASSF1a. В двух других – число образцов, где была выявлена только экспрессия PHOX2B и/или TH, и обнаружен только метилированный ген RASSF1a, было приблизительно одинаковым (рисунок 47). Данный факт может быть связан со снижением экспрессии опухоль-ассоциированных генов в процессе химиотерапии и в опухолевых клетках при рецидиве заболевания. 167 Рисунок 47. Качественная сходимость результатов выявления поражения КМ с помощью метилированного гена RASSF1a и экспрессии генов PHOX2B и TH в зависимости от времени получения образцов КМ. А. – образцы КМ, полученные при первичной диагностике; Б. – образцы КМ, взятые в процессе терапии; В. – образцы КМ, полученные при диагностике рецидива или прогрессии опухоли. Выявление поражения КМ с помощью определения метилированного гена RASSF1a и проточной цитометрии было выполнено в 127 образцах, при этом качественная сходимость результатов составила 73,2%. Среди образцов, полученных при первичной диагностике, она достигла 62,3%, во время терапии – 91,2%, а при диагностике рецидива или прогрессии опухоли – 47,1%. Количество образцов, позитивных только по данным проточной цитометрии, во всех случаях было приблизительно сходным с количеством образцов, в которых выявлялся только метилированный ген RASSF1a (рисунок 48). 168 Рисунок 48. Качественная сходимость результатов выявления поражения КМ с помощью метилированного гена RASSF1a и проточной цитометрии в зависимости от времени получения образцов КМ. А. – образцы КМ, полученные при первичной диагностике; Б. – образцы КМ, взятые в процессе терапии; В. – образцы КМ, полученные при диагностике рецидива или прогрессии опухоли. Общая качественная сходимость результатов выявления поражения КМ с помощью обнаружения метилированного гена RASSF1a и экспрессии генов PHOX2B и TH, а также проточной цитометрии представлена на рисунке 49. Рисунок 49. Качественная сходимость результатов выявления поражения КМ с помощью анализа метилированной формы гена RASSF1a, экспрессии генов PHOX2B и TH (А.), а также проточной цитометрии (Б.). 169 Таким образом, было выявлено, что оптимальными молекулярными маркерами поражения КМ являются транскрипты генов PHOX2B и TH, а также метилированная форма гена RASSF1a. Наличие инициального поражения КМ и персистенция МОБ до момента афереза АГСК негативно влияют на выживаемость пациентов. При этом прогностическое значение поражения КМ, выявленного с помощью анализа экспрессии опухольассоциированных генов, сохраняется в подгруппах пациентов без амплификации гена MYCN и младше 1 года. При проведении качественного сопоставления данных молекулярных методов определения поражения КМ, основанных на исследовании РНК и ДНК, а также проточной цитометрии были выявлены дискордантные результаты, что свидетельствует о целесообразности сочетанного применения различных технологий для наиболее корректного обнаружения опухолевых клеток в КМ. 170 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нейробластома является уникальной опухолью за счет высокой гетерогенности морфологических форм, вариабельности клинического течения, ответа на проводимую терапию и, соответственно, прогноза заболевания. Для нейробластомы были впервые описаны феномены спонтанной регрессии и дифференцировки опухолевых клеток, определяющие благоприятный исход заболевания, в том числе, при диссеминированной опухоли. Часть опухолей, напротив, характеризуется высокой агрессивностью, большой опухолевой массой с быстрой пролиферацией клеток и ранним появлением отдаленных метастазов. Они были вынесены в группу нейробластомы «ультра-высокого риска». Попытки связать течение заболевания с клиническими данными имели лишь частичный успех, и стал актуальным поиск потенциальных прогностических маркеров среди биологических свойств опухоли. Удалось идентифицировать неблагоприятные молекулярно-генетические характеристики, среди которых наиболее значимыми являются амплификация гена MYCN и делеция короткого плеча хромосомы 1, а также ди- или тетраплоидный набор хромосом. Клинические и молекулярные факторы риска были включены в различные схемы стратификации пациентов для проведения риск- адаптированного лечения. Несмотря на это, пятилетняя общая выживаемость пациентов группы высокого риска не превышает 30%, а неблагоприятные события даже в группе низкого риска происходят у 20% больных. Все вышесказанное диктует необходимость дальнейшего совершенствования схем, определяющих степень риска пациентов с нейробластомой, в том числе, за счет внедрения новых молекулярно-генетических маркеров. Это послужило целью настоящей работы. Наиболее частыми генетическими аберрациями, связанными с прогнозом заболевания, являются аномалии числа копий отдельных генов и 171 хромосомных регионов. К ним, в частности, относятся амплификация гена MYCN и делеция короткого плеча хромосомы 1. Во многих исследованиях было показано, что наличие делеций или увеличения генетического материала определенных хромосомных локусов связано с агрессивным фенотипом опухоли. Это объясняется либо инактивацией генов-супрессоров опухолевого роста, либо активацией онкогенов, соответственно. Моносомии или трисомии одной или нескольких хромосом, напротив, рассматриваются как маркер набора хромосом, близкого к триплоидному, имеющего благоприятное прогностическое значение. Для выявления данных аберраций применяются различные молекулярно-генетические методы, среди которых FISH, ПЦР и MLPA. Метод MLPA позволяет определять большое количество генетических аномалий в условиях одной постановки и, благодаря этому, одновременно анализировать большинство аберраций, вовлеченных в молекулярный патогенез нейробластомы. В то же время данная технология в настоящий момент является исследовательской и представляется перспективной для включения в перечень методик, рекомендованных для выявления генетический аномалий в клинической практике. Сопоставление результатов определения молекулярно-генетических факторов прогноза методами MLPA, FISH и ПЦР составило одну из задач данного исследования. Результаты выявления амплификации гена MYCN с помощью MLPA, ПЦР и FISH совпадали полностью, тогда как качественная сходимость результатов определения делеции 1p методами MLPA и ПЦР составила 95,8%, MLPA и FISH – 95,5%. Таким образом, все проанализированные методики, применяемые для выявления изменений числа копий хромосомных регионов, показали высокую степень качественной сходимости результатов, что обосновывает возможность их использования в клинической практике для определения прогностических биологических маркеров у пациентов с нейробластомой. Однако использование метода MLPA для анализа образцов, 172 фиксированных в формалине и залитых в парафиновый блок, оказалось затруднительным по сравнению с технологией ПЦР, в силу высокой степени фрагментации выделенной ДНК. Использование метода MLPA позволило выявить большое количество генетических аберраций в различных хромосомных регионах и определить частоту их встречаемости, связь с клиническими факторами риска и прогностическое значение. Амплификация гена MYCN наиболее часто выявлялась у пациентов с IV стадией нейробластомы, сочетались с другими неблагоприятными прогностическими факторами (возраст более 12 месяцев, неблагоприятная гистологическая форма) и снижала показатели БСВ и ОВ. В половине случаев амплификации гена MYCN обнаруживалась коамплификация генов NAG, DDX1 или ALK, которая не имела самостоятельного прогностического значения. С помощью метода MLPA было обнаружено увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, не достигающее порога амплификации. В общей когорте пациентов данная аберрация не имела прогностического значения. В то же время, увеличение материала обширного фрагмента 2p (тип 1) приводило к снижению ОВ в группе пациентов со стадиями I-III и IVS. А в том случае, если происходило увеличение материала локусов 2p23-24 (тип 2), наблюдалось снижение БСВ пациентов младше 12 месяцев. Делеция короткого плеча хромосомы 1 наиболее часто выявлялась у больных старше 12 месяцев и снижала показатели БСВ и ОВ. Данная аберрация сохраняла прогностическое значение в группе пациентов с локализованной нейробластомой и стадией IVS. При этом было выявлено влияние делеции 1p на уровень выживаемости у больных с нормальным числом копий MYCN, что важно для определения степени риска у таких пациентов. 173 Делеции короткого плеча хромосомы 3 и короткого плеча хромосомы 4 не были ассоциированы ни с одним из клинических или молекулярногенетических факторов риска нейробластомы. Первая аберрация описывается как вторичное событие в молекулярном патогенезе опухоли, наблюдаемое чаще у старших пациентов. Ее негативное прогностическое значение в отношении БСВ было подтверждено только в группе больных старше 3 лет. Прогностического значения второй аберрации обнаружено не было. В то же время, увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 4 было отмечено только у пациентов с выявленной делецией длинного плеча хромосомы 11 и резко снижало БСВ в группе больных младше 12 месяцев. Среди аберраций хромосомы 7 были выявлены увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 7 и увеличение материала обоих плеч хромосомы (трисомия 7). Первая чаще встречалась у больных младше 12 месяцев, была ассоциирована с делецией 11q, но ее наличие не сказывалось на показателях выживаемости. Вторая, напротив, определялась только у пациентов старше 12 месяцев и снижала БСВ в общей группе больных и в группе пациентов без амплификации гена MYCN. Результаты наших исследований не подтверждают данные литературы, указывающие на то, что трисомия 7 является маркером набора хромосом, близкого к триплоидному, и ассоциирована с благоприятным прогнозом. Напротив, увеличение генетического материала хромосомы 7 являлось предиктором наступления неблагоприятного события. Наличие аберраций короткого плеча хромосомы 9 – делеции и увеличения генетического материала не было связано с какими-либо клиническими или молекулярно-биологическими факторами риска нейробластомы. Однако делеция 9p сама по себе являлась прогностически крайне неблагоприятной. Она значительно снижала показатели БСВ и ОВ в общей когорте пациентов, в группе больных с локализованной опухолью, а также без амплификации гена MYCN. Увеличение генетического материала 174 9p проявляло негативное влияние на БСВ в наиболее благоприятной группе пациентов со стадиями нейробластомы I-III, IVS без амплификации гена MYCN. Прогностическое значение делеции 11q по результатам наших исследований не достигло статистической значимости. В то же время методом MLPA были выявлены два типа делеции 11q – интерстициальная и терминальная, роль которых в молекулярном патогенезе нейробластомы принципиально отличается. В первом случае происходит инактивация генасупрессора опухолевого роста TSLC1, а также формирование химерных генов с участием гена MLL. Во втором случае данных молекулярных событий не происходит, что определяет интерстициальную делецию 11q как один из этапов онкогенеза нейробластомы и неблагоприятный прогностический маркер. Оба типа делеции 11q чаще встречались у пациентов с III и IV стадиями нейробластомы, а при наличии интерстициального типа делеции наблюдалась тенденция к снижению БСВ и ОВ больных. Несмотря на патогенетическую роль увеличения генетического материала 12q (или увеличения числа копий гена MDM2) в онкогенезе многих злокачественных опухолей, влияния данной аберрации на выживаемость больных нейробластомой нами отмечено не было. Увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 12 приводило к увеличению ОВ пациентов, однако различия не достигли статистической достоверности. Объяснением данного наблюдения может быть увеличение количества копий гена CDKN1B который является геном-супрессором опухолевого роста и останавливает клеточный цикл в фазе G0/G1. Обе аберрации хромосомы 12 в проанализированной группе больных сочетались с делецией 11q. Делеция длинного плеча хромосомы 14 преобладала среди пациентов с локализованной опухолью и младше 12 месяцев. В группе больных нейробластомой стадий I-III, IVS без амплификации гена MYCN была 175 выявлена тенденция к снижению ОВ при обнаружении данной аберрации. Это может быть связано с локализацией в локусе 14q32 гена MOAP1, обладающего антионкогенной активностью. Увеличение генетического материала 14q определялось только у пациентов старше 12 месяцев, но прогностического значения не имело. Увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 17 является наиболее частой генетической аберрацией при нейробластоме и рассматривается рядом авторов как драйверная мутация в онкогенезе. В настоящей работе увеличение материала 17q было обнаружено у половины пациентов, причем чаще у больных со стадией III и IV и морфологическим вариантом опухоли – нейробластома. При этом увеличение материала 17q сочеталось с наличием делеции 11q. Данная аберрация имела негативный прогностический эффект в отношении как БСВ, так и ОВ в общей когорте пациентов, среди больных со стадиями заболевания I-III и IVS, а также без амплификации гена MYCN. Трисомия 17 как признак набора хромосом близкого к триплоидному связана с благоприятным течением опухоли. В данной работе трисомия 17 чаще выявлялась у пациентов с локализованной опухолью или со стадией IVS, однако, в силу малого количества наблюдений, ее прогностическое значение отмечено не было. Исследование генетических аберраций у пациентов с нейробластомой стадий I-III и IVS, младше 12 месяцев и без амплификации гена MYCN позволило оценить их прогностическую значимость в данных группах больных. У пациентов с локализованной опухолью и стадией IVS делеции 1p, 9p и увеличение генетического материала 17q снижали показатели БСВ и ОВ, а наличие увеличения материала 2p (тип 1) приводило к снижению ОВ. Среди пациентов младше 12 месяцев негативное прогностическое значение в отношении БСВ имели увеличение генетического материала 2p (тип 2) и 4p. При отсутствии амплификации гена MYCN обнаружение делеций 1p, 9p и увеличения генетического материала 17q приводило к снижению как БСВ, 176 так и ОВ, а трисомии 7 – только БСВ. В наиболее благоприятной группе пациентов со стадиями нейробластомы I-III, IVS без амплификации MYCN, увеличение генетического материала 9p сокращало БСВ, а при выявлении делеции 14q определялась тенденция к снижению ОВ. При сравнении генетических аберраций в 5 парах первичная опухольрецидив/прогрессия в двух случаях выявленные изменения оказались идентичными. В одном произошла замена кариотипа опухоли с большим числом количественных аномалий хромосом на нормальный кариотип. В одном – замена части структурных аномалий (делеции 4p на делеции 1p и 11q) и персистенция других (делеция 9p, увеличение материала 12q и 17q) и еще в одном – потеря ряда аберраций, в том числе делеций 1p,7q и увеличения материала 2p (тип 1) и 17q с восстановлением нормального кариотипа. При этом сохранение или восстановление нормальных количества и структуры хромосом приводило к благоприятному клиническому исходу. Распространенность опухоли в организме является неблагоприятным прогностическим признаком, при этом наиболее частыми объектами метастазирования при нейробластоме являются КМ, кости скелета, печень и кожа. В связи с этим точная инициальная диагностика поражения КМ крайне важна для корректного стадирования заболевания, а выявление персистенции опухолевых клеток в процессе лечения и после него является маркером, характеризующим ответ опухоли на проводимую терапию. Применение таких методов, как выявление молекулярных маркеров, специфичных для нейробластов, с помощью ПЦР или опухолевых клеток с использованием проточной цитометрии позволяет обнаружить поражение КМ в крайне малых количествах, и по чувствительности значительно превосходит цитологическое исследование, являющееся наиболее распространенной методикой определения поражения КМ. Однако прогностическая роль выявления диссеминации опухоли на субмикроскопическом уровне остается предметом дискуссий. 177 Для выявления поражения КМ и оценки МОБ с помощью ПЦР приняты два различных подхода. Один из них заключается в обнаружении мРНК генов, экспрессируемых клетками нейробластомы, в КМ, где их экспрессия в норме либо многократно ниже, либо отсутствует полностью. Второй – в выявлении генетического маркера опухолевых клеток в геномной ДНК. При анализе использования экспрессии опухоль-ассоциированных генов в качестве маркера поражения КМ было показано, что определение экспрессии гена TH обладает высокой эффективностью, лишь незначительно уступающей PHOX2B. Экспрессия данных маркеров остается стабильной в ходе терапии нейробластомы. GD2 и ELAVL4 обладают меньшей диагностической эффективностью, и поэтому их применение для выявления поражения КМ нецелесообразно. Выявление экспрессии генов PHOX2B и/или TH в КМ в момент инициальной диагностики приводило к снижению показателей БСВ и ОВ в общей когорте больных, а также среди пациентов без амплификации гена MYCN и в группе больных младше 12 месяцев. При выявлении мРНК данных генов в процессе лечения, а также после окончания индукционной химиотерапии была отмечена тенденция к снижению ОВ, но различия статистической значимости не достигли. В то же время крайне неблагоприятным прогностическим признаком было признано обнаружение экспрессии генов PHOX2B и/или TH перед аферезом АГСК вне зависимости от проведения CD34+ селекции и наличия экспрессии данных генов в препаратах АГСК. Таким образом, определение экспрессии генов PHOX2B и TH в КМ позволяет выбрать наиболее оптимальное время для заготовки АГСК. Маркер поражения КМ, основанный на анализе геномной ДНК, обладает рядом преимуществ перед использованием экспрессии опухольассоциированных генов. Во-первых, он не зависит от уровня экспрессии в клетках первичной опухоли и метастазов. Во-вторых, его уровень не может изменяться под воздействием химиотерапии. В-третьих, геномная ДНК более 178 стабильна в условиях ex vivo, чем РНК. Однако, в силу высокой генетической вариабельности нейробластомы, единый геномный маркер, подходящий для всех пациентов не идентифицирован. В то же время было показано, что промоторный регион гена RASSF1a подвергается метилированию в клетках опухоли, а в нормальных клетках остается неметилированным. Соответственно, выявление метилированного гена RASSF1a в КМ может служить маркером инфильтрации его опухолевыми клетками. Обнаружение данного маркера в КМ больных нейробластомой приводило к снижению БСВ. Важной особенностью гена RASSF1a является его метилирование только в клетках агрессивных опухолей, поэтому выявление поражения КМ с его помощью возможно только у соответствующих пациентов. У больных с благоприятной нейробластомой (стадия IVS) метилированный ген RASSF1a в КМ не определялся, даже при наличии поражения КМ, выявленного с использованием цитологического исследования. Качественная сходимость результатов выявления поражения КМ с помощью определения экспрессии опухоль-ассоциированных генов и метилированного гена RASSF1a достигла 78,8%. Соответствие результатов выявления поражения КМ с помощью экспрессии опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрии составило около 80% и не зависело от распространенности опухоли, этапа терапии, на котором чувствительности было произведено взятие образца проточной цитометрии. Сходимость КМ, и результатов определения метилированного гена RASSF1a и проточной цитометрии достигла 73,2%, при этом наибольшее значение было отмечено при анализе образцов, полученных в ходе лечения нейробластомы (91,2%). Таким образом, проведенное исследование позволило уточнить роль молекулярно-генетических исследований в диагностике нейробластомы. Был выявлен ряд новых прогностических биологических маркеров, использование которых позволит более точно оценивать степень риска у 179 данных пациентов. Были выявлены оптимальные маркеры поражения КМ опухолевыми чувствительности клетками, и обладающие специфичности и высокими доказано значениями неблагоприятное прогностическое значение субмикроскопического поражения КМ. 180 ВЫВОДЫ 1. Сопоставление результатов обнаружения амплификации гена MYCN и делеции 1p методами MLPA, FISH и ПЦР продемонстрировало высокую степень качественной сходимости (95,5% при выявлении делеции 1p и 100% при обнаружении амплификации гена MYCN). При этом ДНК, выделенная из гистологических препаратов, подходит для определения генетических аберраций методом ПЦР, тогда как для MLPA она не пригодна. 2. Амплификация гена MYCN, делеции короткого плеча хромосомы 1, короткого плеча хромосомы 9 и увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 17 приводят к достоверному снижению показателей БСВ и ОВ в общей группе больных нейробластомой. Коамплификация гена MYCN с генами NAG, DDX1 или ALK не показала прогностического значения по сравнению с амплификацией только гена MYCN. 3. У пациентов без клинических факторов риска нейробластомы и амплификации гена MYCN делеции короткого плеча хромосомы 1, короткого плеча хромосомы 9, увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, короткого плеча хромосомы 4, длинного плеча хромосомы 17, а также трисомия 7 показали негативное прогностическое значение. 4. Экспрессия генов PHOX2B и/или TH в КМ является наиболее чувствительным и специфичным тестом для выявления поражения КМ клетками нейробластомы и оценки МОБ (ДЭТ 0,994 и 0,952, соответственно). Исследование экспрессии генов GD2 и ELAVL4 для оценки поражения КМ обладает меньшей диагностической ценностью (ДЭТ 0,828 и 0,767, соответственно). 5. Обнаружение экспрессии генов PHOX2B и/или TH в КМ при первичной диагностике нейробластомы ассоциировано с достоверным снижением показателей БСВ и ОВ пациентов на 26 и 23%, соответственно. 181 Наличие экспрессии данных генов в КМ перед проведением афереза АГСК связано с увеличением частоты посттрансплантационных рецидивов опухоли на 59%, несмотря на отсутствие экспрессии в аутотрансплантатах. 6. Выявление метилированной формы гена RASSF1a в ДНК, выделенной из КМ при первичной диагностике нейробластомы, ассоциировано с достоверно более низкими значениями БСВ (на 39%) в общей группе пациентов. 7. Качественная сходимость результатов определения поражения КМ с помощью анализа опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрии составляет 78,8%. Сходимость результатов выявления метилированной формы гена RASSF1a с обнаружением экспрессии генов PHOX2B/TH достигает 78,8%, а с проточной цитометрией – 73,2%. 182 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. У пациентов с нейробластомой целесообразно сочетание методов MLPA, FISH и ПЦР для корректного выявления аберраций, ассоциированных с изменением числа копий генов или хромосомных регионов в опухолевых клетках. 2. Для определения степени риска у пациентов с нейробластомой рекомендуется выявление амплификации гена MYCN, делеций 1p, 9p, а также увеличения генетического материала 17q. 3. При отсутствии клинических факторов риска нейробластомы и амплификации гена MYCN для оценки прогноза важно определение увеличения генетического материала 2p, 4p, а также трисомии 7. 4. Для наиболее точного выявления поражения КМ и оценки МОБ рекомендуется сочетанное применение молекулярных маркеров PHOX2B, TH и RASSF1a. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ Перспективы в области изучения молекулярно-генетических прогностических маркеров нейробластомы заключаются в валидации выявленных факторов риска в рамках крупных многоцентровых исследований с возможным последующим их включением в схемы стратификации больных с целью улучшения результатов терапии. Исследование генетических аномалий, связанных с агрессивным течением опухоли, является перспективным с точки зрения изучения молекулярных основ канцерогенеза. 183 ЛИТЕРАТУРА 1. Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины. / Под ред. В.С. Баранова – СПб.: Издательство Н-Л, 2009. – 54 с. 2. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик, Д. Пастернак. – М.: Мир, 2002. – 589 с. 3. Клинические лекции по детской онкологии. / Под ред. Л.А. Дурнова. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 145 с. 4. Жимулев, И.Ф. Общая и молекулярная генетика. / И.Ф. Жимулев. – Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2007. – 400 с. 5. Иванов, В.И. Геномика – медицине. / В.И. Иванов, Л.Л. Киселев. – М.: Академкнига, 2005. – 245 с. 6. Ланцковский, Ф. Детская гематология и онкология / Ф. Ланцковский. – М.: Лори, 2005. – 484 с. 7. Мисюрин, А.В. Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза / А.В. Мисюрин, Е.В. Аксенова, А.А. Крутов и др. // Гематология и трансфузиология. – 2007. – №2. – С. 35-40. 8. ПЦР в реальном времени. / Под ред. Д.В. Ребрикова. – М.: Бином, 2009. – 114 с. 9. Фейгин, В.Л. Основы мета-анализа: теория и практика / В.Л. Фейгин // Международный журнал медицинской практики. – 1999. – № 7. – С. 7-13. 10. Abel, F. A 6-gene signature identifies four molecular subgroups of neuroblastoma / F. Abel, D. Dalevi, M. Nethander et al // Cancer Cell Int. – 2011. – Vol. 11. – P. 9-24. 11. Adida, C. Prognostic significance of survivin expression in diffuse large B-cell lymphomas / C. Adida, C. Haioun, P. Gaulard et al // Blood. – 2000. – Vol. 96. – P. 1921-1925. 12. Aloyz, R.S. p53 is essential for developmental neuron death as regulated by the TrkA and p75 neurotrophin receptors / R.S. Aloyz, S.X. Bamji, C.D. Pozniak et al // J. Cell Biol. – 1998. – Vol. 143. – P. 1691–1703. 184 13. Ambros, I.M. Morphologic features of neuroblastoma (Schwannian stroma-poor tumors) in clinically favorable and unfavorable groups / I.M. Ambros, J. Hata, V.V. Joshi et al // Cancer. – 2002. – Vol. 94. – P. 1574-1583. 14. Ambros, I.M. A Multilocus technique for risk evaluation of patients with neuroblastoma / I.M. Ambros, B. Brunner, G. Aigner et al // Clin Cancer Res. – 2011. – Vol. 17. – P. 792-804. 15. Ambros, P.F. Intratumoural heterogeneity of 1p deletions and MYCN amplification in neuroblastomas / P.F. Ambros, I.M. Ambros, R. Kerbl et al. // Med. Pediatr. Oncol. – 2001. – Vol. 36. – P. 1–4. 16. Ambros, P.F. International consensus for neuroblastoma molecular diagnostics: report from the International Neuroblastoma Risk Group (INRG) Biology Committee / P.F. Ambros, I.M. Ambros, G.M. Brodeur et al // Br. J. Cancer. – 2009. – Vol. 100. – P. 1471-1482. 17. Anderson, J. Rapid and accurate determination of MYCN copy number and 1p deletion in neuroblastoma by quantitative PCR / J. Anderson, S. Gibson, D. Williamson et al // Pediatr. Blood Cancer. – 2006. – Vol. 46. – P. 820-824. 18. Ando, K. Expression of TSLC1, a candidate tumor suppressor gene mapped to chromosome 11q23, is downregulated in unfavorable neuroblastoma without promoter hypermethylation / K. Ando, M. Ohira, T. Ozaki et al // Int. J. Cancer. – 2008. – Vol. 123. – P. 2087-2094. 19. Attiyeh, E.F. Chromosome 1p and 11q deletions and outcome in neuroblastoma / E.F. Attiyeh, W.B. London, Y.P. Mossé et al // N. Engl. J. Med. – 2005. – Vol. 353. – P. 2243-2253. 20. Avigad, S. Minimal residual disease in peripheral blood stem cell harvests from high-risk neuroblastoma patients / S. Avigad, G. FeinbergGorenshtein, D. Luria et al // J. Pediatr. Hematol. Oncol. – 2009. – Vol. 31. – P. 22-26. 21. Bagchi, A. CHD5 is a tumor suppressor at human 1p36 / A. Bagchi, C. Papazoglu, Y. Wu et al // Cell. – 2007. – Vol. 128. – P. 459-475. 185 22. Baksh, S. The tumor suppressor RASSF1A and MAP-1 link death receptor signaling to Bax conformational change and cell death / S. Baksh, S. Tommasi, S. Fenton et al // Molec. Cell. – 2005. – Vol. 18. – P. 637-650. 23. Banelli, B. Distinct CpG methylation profiles characterize different clinical groups of neuroblastic tumors / B. Banelli, I. Gelvi, A. Di Vinci et al // Oncogene. – 2005. – Vol. 24. – P. 5619-5628. 24. Baxter, J. Positive supercoiling of mitotic DNA drives decatenation by topoisomerase II in eukaryotes / J. Baxter, N. Sen, V. Lopez Martinez et al // Science. – 2011. – Vol. 331. – P. 1328-1332. 25. Berthold, F. Neuroblastoma: current drug therapy recommendations as part of the total treatment approach / F. Berthold, B. Hero // Drugs. – 2000. – Vol. 59. – P. 1261-1277. 26. Berthold, F. Long-term results and risk profiles of patients in five consecutive trials (1979-1997) with stage 4 neuroblastoma over 1 year of age / F. Berthold, B. Hero, B. Kremens et al // Cancer Lett. – 2003. – Vol. 197. – P. 11-17. 27. Bolande, R.P. The neurocristopathies: a unifying concept of disease arising in neural crest maldevelopment / R.P. Bolande // Human Pathol. – 1974. – Vol. 5. – P. 409–429. 28. Bown, N. Gain of chromosome arm 17q and adverse outcome in patients with neuroblastoma / N. Bown, S. Cotterill , M. Lastowska et al // N. Engl. J. Med. – 1999. – Vol. 340. – P. 1954-1961. 29. Bown, N. 17q gain in neuroblastoma predicts adverse clinical outcome. U.K. Cancer Cytogenetics Group and the U.K. Children's Cancer Study Group / N. Bown, M. Lastowska, S. Cotterill et al // Med. Pediatr. Oncol. – 2001. – Vol. 36. – P. 14-19. 30. Breen, C.J. Coordinate deletion of chromosome 3p and 11q in neuroblastoma detected by comparative genomic hybridization / C.J. Breen, A. O’Meara, M. McDermott et al // Cancer. Genet. Cytogenet. – 2000. – Vol. 120. – P. 44-49. 186 31. Brodeur, G.M. Cytogenetic features of human neuroblastomas and cell lines / G.M. Brodeur, A.A. Green, F.A. Hayes et al // Cancer Res. – 1981. – Vol. 41. – P. 4678-4686. 32. Brodeur, G.M. Amplification of N-myc in untreated human neuroblastomas correlates with advanced disease stage / G.M. Brodeur, R.C. Seeger, M. Schwab et al // Science. – 1984. – Vol. 224. – P. 1121-1124. 33. Brodeur, G.M. Revisions of the international criteria for neuroblastoma diagnosis, staging, and response to treatment / G.M. Brodeur, J. Pritchard, F. Berthold et al // J. Clin. Oncol. – 1993. – Vol. 11. – P. 1466-1477. 34. Brodeur, G.M. Molecular basis for heterogeneity in human neuroblastomas / G.M. Brodeur // Eur. J. Cancer. – 1995. – Vol. 31. – P. 505–510. 35. Brodeur, G.M. Neuroblastoma. / G.M. Brodeur, T. Sawada, Y. Tsuchida. – New York: Elsevier Science, 2000. – 21 p. 36. Burchill, S.A. Neuroblastoma cell detection by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR) for tyrosine hydroxylase mRNA / S.A. Burchill, F.M. Bradbury, B.M. Smith et al // Int. J. Cancer. – 1994. – Vol. 57. – P. 671-675. 37. Burchill, S.A. Minimal residual disease at the time of peripheral blood stem cell harvest in patients with advanced neuroblastoma / S.A. Burchill, S.E. Kinsey, S. Picton et al // Med. Pediatr. Oncol. – 2001. – Vol. 36. – P. 213-219. 38. Burchill, S.A. Circulating neuroblastoma cells detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction for tyrosine hydroxylase mRNA are an independent poor prognostic indicator in stage 4 neuroblastoma in children over 1 year / S.A. Burchill, I.J. Lewis, K.R. Abrams et al // J. Clin. Oncol. – 2001. – Vol. 19. – P. 1795-1801. 39. Cai, J.Y. Prognostic influence of minimal residual disease detected by flow cytometry and peripheral blood stem cell transplantation by CD34+ selection in childhood advanced neuroblastoma / J.Y. Cai, Y.J. Tang, L.M. Jiang et al // Pediatr. Blood Cancer. – 2007. – Vol. 49. – P. 952-957. 187 40. Cai, J.Y. Minimal residual disease is a prognostic marker for neuroblastoma with bone marrow infiltration / J.Y. Cai, C. Pan, J.Y. Tang et al // Am. J. Clin. Oncol. – 2012. – Vol. 35. – P. 275-278. 41. Caron, H Allelic loss of the short arm of chromosome 4 in neuroblastoma suggests a novel tumour suppressor gene locus / H. Caron, P. van Sluis, R. Buschman et al // Hum. Genet. – 1996. – Vol. 97. – P. 834-837. 42. Caron, H. Allelic loss of chromosome 1p as a predictor of unfavorable outcome in patients with neuroblastoma / H. Caron, P. van Sluis, J. de Kraker et al // N. Engl. J. Med. – 1996. – Vol. 334. – P. 225-230. 43. Celi, F.S. A rapid and versatile method to synthesize internal standards for competitive PCR / F.S. Celi, M.E. Zenilman, A.R. Shuldiner // Nucleic Acids Research. – 1993. – Vol. 21. – 1047 P. 44. Chagnovich, D. Binding of a 40-kDa protein to the N-myc 3'untranslated region correlates with enhanced N-myc expression in human neuroblastoma / D. Chagnovich, S.L.Cohn // J. Biol. Chem. – 1996. – Vol. 271. – P. 33580-33586. 45. Chatten, J. Prognostic value of histopathology in advanced neuroblastoma: a report from the Childrens Cancer Study Group / J. Chatten, H. Shimada, H.N. Sather et al // Hum. Pathol. – 1988. – Vol. 19. – P. 1187-1198. 46. Chen, H. Semaphorin-neuropilin interactions underlying sympathetic axon responses to class 3 semaphorins / H. Chen, Z. He, A. Bagri, M. TessierLavigne // Neuron. – 1998. – Vol. 21. – P. 1283-1290. 47. Cheung, I.Y. Detection of microscopic neuroblastoma in marrow by histology, immunocytology, and reverse transcription-PCR of multiple molecular markers / I.Y. Cheung, D. Barber, N.K. Cheung // Clin. Cancer Res. – 1998. – Vol. 4. – P. 2801-2805. 48. Cheung, I.Y. Quantification of marrow disease in neuroblastoma by realtime reverse transcription-PCR / I.Y. Cheung, N.K.V. Cheung // Clin. Cancer Res. – 2001. – Vol. 7. – P. 1698-1705. 188 49. Cheung, I.Y. Early molecular response of marrow disease to biologic therapy is highly prognostic in neuroblastoma // I.Y. Cheung, M.S. Lo Piccolo, B.H. Kushner, N.K. Cheung // J. Clin. Oncol. – 2003. – Vol. 20. – P. 3853-3858. 50. Cheung, I.Y. Quantitation of GD2 synthase mRNA by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction: clinical utility in evaluating adjuvant therapy in neuroblastoma / I.Y. Cheung, M.S. Lo Piccolo, B.H. Kushner et al // J. Clin. Oncol. – 2003. – Vol. 6. – P. 1087-1093. 51. Cheung, N.K. Detection of neuroblastoma cells in bone marrow using GD2 specific monoclonal antibodies / N.K. Cheung, D.D. Von Hoff, S.E. Strandjord, P.F. Coccia // J. Clin. Oncol. -1986. – Vol. 3. – P. 363-369. 52. Cheung N.K.V. Neuroblastoma. / N.K.V. Cheung, S.L. Cohn. – New York: Springer, 2005. – 189 p. 53. Christiansen, H. Tumour karyotype discriminates between good and bad prognostic outcome in neuroblastoma // H. Christiansen, F. Lampert // Br. J. Cancer. – 1988. – Vol. 57. – P. 121-126. 54. Cohn, S.L. The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report / S.L. Cohn, A.D. Pearson, W.B. London et al // J. Clin. Oncol. – 2009. – Vol. 2. – P. 289-297. 55. Combaret, V. Determination of 17q Gain in Patients With Neuroblastoma by Analysis of Circulating DNA / V. Combaret, S. Brejon, I. Iacono et al // Pediatr. Blood Cancer. – 2011. – Vol. 56. – P. 757–761. 56. Corrias, M.V. Peripheral blood stem cell tumor cell contamination and survival of neuroblastoma patients / M.V. Corrias, R. Haupt, B. Carlini et al // Clin. Cancer Res. – 2006. – Vol. 19. – P. 5680-5685. 57. Corrias, M.V. Detection of GD2-positive cells in bone marrow samples and survival of patients with localised neuroblastoma / M.V. Corrias, S. Parodi, R. Haupt R. et al et al // Br. J. Cancer. – 2008. – Vol. 2. – P. 263–269. 189 58. Corvi, R. Cytogenetic evolution of MYCN and MDM2 amplification in the neuroblastoma LS tumour and its cell line / R. Corvi, L. Savelyeva, L. Amler et al // Eur. J. Cancer. – 1995. – Vol. 31. – P. 520-523. 59. Corvi, R. Non-syntenic amplification of MDM2 and MYCN in human neuroblastoma / R. Corvi, L. Savelyeva, S. Breit et al // Oncogene. – 1995. – Vol. 10. – P. 1081-1086. 60. Corvi, R. Patterns of oncogene activation in human neuroblastoma cells / R. Corvi, L. Savelyeva, M. Schwab // J. Neurooncol. – 1997. – Vol. 31. – P. 25– 31. 61. Cotterill, S.J. Clinical prognostic factors in 1277 patients with neuroblastoma: results of the European Neuroblastoma Study Group ‘Survey’ 1982-1992 / S.J. Cotterill, A.D.J. Pearson, J. Pritchard et al // Eur. J. Cancer. – 2000. – Vol. 36. – P. 901-908. 62. Crossey, P.A. Molecular genetic investigations of the mechanism of tumourigenesis in von Hippel-Lindau disease: analysis of allele loss in VHL tumours / P.A. Crossey, K. Foster, F.M. Richards et al // Hum. Genet. – 1994. – Vol. 93. – P. 53-58. 63. Crossey, P.A. Identification of intragenic mutations in the von HippelLindau disease tumour suppressor gene and correlation with disease phenotype / P.A. Crossey, F.M. Richards, K. Foster et al // Hum. Molec. Genet. – 1994. – Vol. 3. – P. 1303-1308. 64. Cuesta, R. miR-181a regulates cap-dependent translation of p27(kip1) mRNA in myeloid cells / R. Cuesta, A. Martinez-Sanchez, F. Gebauer // Molec. Cell. Biol. – 2009. – Vol. 29. – P. 2841-2851. 65. Dalmau, J. The expression of the Hu (paraneoplastic encephalomyelitis / sensory neuronopathy) antigen in human normal and tumor tissues / J. Dalmau, H.M. Furneaux, C. Cordon-Cardo et al // Am. J. Pathol. – 1992. – Vol. 141. – P. 881-886. 190 66. D'Angio, G.J. Special pattern of widespread neuroblastoma with a favourable prognosis / G.J. D'Angio, A.E. Evans, C.E. Koop // Lancet. – 1971. – Vol. 22. – P. 1046-1049. 67. DeLong, E.R. Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach / E.R. DeLong, D.M. DeLong, D.L. Clarke-Pearson // Biometrics. – 1988. – Vol. 44. – Р. 837-845. 68. Do, J.H. Genome-wide examination of chromosomal aberrations in neuroblastoma SH-SY5Y cells by array-based comparative genomic hybridization / J.H. Do, I.S. Kim, T.K. Park, D.K. Choi // Mol. Cells. – 2007. – Vol. 24. – P. 105-112. 69. Dykhuizen, E.C. BAF complexes facilitate decatenation of DNA by topoisomerase II-alpha / E.C. Dykhuizen, D.C. Hargreaves, E.L. Miller et al // Nature. – 2013. – Vol. 497. – P. 624-627. 70. Elkahloun, A.G. Molecular cytogenetic characterization and physical mapping of 12q13- q15 amplification in human cancers / A.G. Elkahloun, M. Bittner, K. Hoskins et al // Genes Chromosomes Cancer. – 1996. – Vol. 17. – P. 205-214. 71. Esser, R. Detection of neuroblastoma cells during clinical follow up: advanced flow cytometry and rt-PCR for tyrosine hydroxylase using both conventional and real-time PCR / R. Esser, W. Glienke, K. Bochennek et al // Klin. Padiatr. – 2011. – Vol. 6. – P. 326-331. 72. Evans, A.E. Spontaneous regression of neuroblastoma / A.E. Evans, J. Gerson, L. Schnaufer // Natl. Cancer Inst. Monogr. – 1976. – Vol. 44. – P. 49-54. 73. Fenton, S.L. Identification of the E1A-regulated transcription factor p120(E4F) as an interacting partner of the RASSF1A candidate tumor suppressor gene / S.L. Fenton, A. Dallol, A. Agathanggelou et al // Cancer Res. – 2004. – Vol. 64. – P. 102-107. 74. Flahaut, M. Molecular cytogenetic characterization of doxorubicinresistant neuroblastoma cell lines: evidence that acquired multidrug resistance 191 results from a unique large amplification of the 7q21 region / M. Flahaut, A. Mühlethaler-Mottet, D. Martinet et al // Genes Chromosomes Cancer. – 2006. – Vol. 5. – P. 495-508. 75. Fong, C.T. Loss of heterozygosity for the short arm of chromosome 1 in human neuroblastomas: correlation with N-myc amplification / C.T. Fong, N.C. Dracopoli, P.S. White et al // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1989. – Vol. 86. – P. 3753-3757. 76. Fukuda, M. Disease outcome may be predicted by molecular detection of minimal residual disease in bone marrow in advanced neuroblastoma: a pilot study / M. Fukuda, Y. Miyajima, Y. Miyashita, K. Horibe // J. Pediatr. Hematol. Oncol. – 2001. – Vol. 1. – P. 10-13. 77. Gabert, J. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – A Europe Against Cancer Program / J. Gabert, E. Beillard, V. van der Velden et al // Leukemia. – 2003. – Vol. 17. – P. 2318–2357. 78. Gattolliat, C.H. Expression of miR-487b and miR-410 encoded by 14q32.31 locus is a prognostic marker in neuroblastoma / C.H. Gattolliat, L. Thomas, S.A. Ciafrè et al // Br. J. Cancer. – 2011. – Vol. 9. – P. 1352-1361. 79. George, R.E. Investigation of co-amplification of the candidate genes ornithine decarboxylase, ribonucleotide reductase, syndecan-1 and a DEAD box gene, DDX1, with N-myc in neuroblastoma. United Kingdom Children's Cancer Study Group // R.E. George, R.M. Kenyon, A.G. McGuckin et al // Oncogene. – 1996. – Vol. 12. – P. 1583-1587. 80. George, R.E. Analysis of candidate gene co-amplification with MYCN in neuroblastoma / R.E. George, R. Kenyon, A.G. McGuckin et al // Eur. J. Cancer. – 1997. – Vol. 33. – P. 2037-2042. 192 81. Gilbert, F. Human neuroblastomas and abnormalities of chromosomes 1 and 17 / F. Gilbert, M. Feder, G. Balaban et al // Cancer Res. – 1984. – Vol. 44. – P. 5444-5449. 82. Giordani, L. Two regions of deletion in 9p22- p24 in neuroblastoma are frequently observed in favorable tumors / L. Giordani, A. Iolascon, V. Servedio et al // Cancer Genet. Cytogenet. – 2002. – Vol. 1. – P. 42-47. 83. Gisselsson, D. Differentially amplified chromosome 12 sequences in low- and high-grade osteosarcoma / D. Gisselsson, E. Palsson, M. Hoglund // Genes Chromosomes Cancer. – 2002. – Vol. 33. – P. 133-140. 84. Gotoh, T. Prediction of MYCN amplification in neuroblastoma using serum DNA and real-time quantitative polymerase chain reaction / T. Gotoh, H. Hosoi, T. Iehara et al // J. Clin. Oncol. – 2005. – Vol. 23. – P. 5205-5210. 85. Grady, E.F. Expression of N-myc and c-src during the development of fetal human brain / E.F. Grady, M. Schwab, W. Rosenau // Cancer Res. – 1987. – Vol. 47. – P. 2931-2936. 86. Grossman, D. Inhibition of melanoma tumor growth in vivo by survivin targeting / D. Grossman, P.J. Kim, J.S. Schechner, D.C. Altieri // Proc. Nat. Acad. Sci. – 2001. – Vol. 98. – P. 635-640. 87. Grovas, A. The National Cancer Data Base report on patterns of childhood cancers in the United States / A. Grovas, A. Fremgen, A. Rauck et al // Cancer. – 1997. – Vol. 12. – P. 2321-2332. 88. Guo, C. Allelic deletion at 11q23 is common in MYCN single copy neuroblastomas / C. Guo, P.S. White, M.J. Weiss et al // Oncogene. – 1999. – Vol. 35. – P. 4948-4957. 89. Handgretinger, R. Tumour cell contamination of autologous stem cells grafts in high-risk neuroblastoma: the good news? / R. Handgretinger, W. Leung, K. Ihm et al // Br. J. Cancer. – 2003. – Vol. 12. – P. 1874-1877. 90. Hartmann, O. Prognostic factors in metastatic neuroblastoma in patients over 1 year of age treated with high-dose chemotherapy a stem cell transplantation: 193 a multivariate analysis in 218 patients treated in a single institution / O. Hartmann, D. Valteau-Couanet, G. Vassal et al // Bone Marrow Transplant. – 1999. – Vol. 23. – P. 789-795. 91. Hayat, M.A. Neuroblastoma (Pediatric Cancer: Diagnosis, Therapy, and Prognosis, Vol. 1). / M.A. Hayat . – New York: Springer, 2011. – 47 p. 92. He, Y.W. The extracellular matrix protein mindin is a patternrecognition molecule for microbial pathogens / Y.W. He, H. Li, J. Zhang et al // Nature Immun. – 2004. – Vol. 5. – P. 88-97. 93. Hesson, L.B. The role of RASSF1A methylation in cancer / L.B. Hesson, W.N. Cooper, F. Latif // Dis. Markers. – 2007. – Vol. 23. – P. 73-87. 94. Hirsch, M.R. Control of noradrenergic differentiation and Phox2a expression by MASH1 in the central and peripheral nervous system / M.R. Hirsch, M.C. Tiveron, F. Guillemot et al // Development. – 1998. – Vol. 125. – P. 599-608. 95. Hoebeeck, J. Aberrant methylation of candidate tumor suppressor genes in neuroblastoma / J. Hoebeeck, E. Michels, F. Pattyn et al // Cancer Lett. – 2009. – Vol. 2. – P. 336-346. 96. Holland, P.M. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase / P.M. Holland, R.D. Abramson, R. Watson, D.H. Gelfand // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991. – Vol. 88. – P. 7276–7280. 97. Holmqvist, M.H. Elimination of fast inactivation in Kv4 A-type potassium channels by an auxiliary subunit domain / M.H. Holmqvist, J. Cao, R. Hernandez-Pineda et al // Proc. Nat. Acad. Sci. – 2002. – Vol. 99. – P. 1035-1040. 98. Ichimiya, S. Downregulation of hASH1 is associated with the retinoic acid-induced differentiation of human neuroblastoma cell lines / S. Ichimiya, Y. Nimura, N. Seki et al // Med. Pediatr. Oncol. – 2001. – Vol. 36. – P. 132-134. 99. Jarvik, J.G. The research framework / J.G. Jarvik // Am J Roentgenol. – 2001. – Vol. 176. – Р. 873-877. 194 100. Kaghad, M. Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers / M. Kaghad, H. Bonnet, A. Yang et al // Cell. – 1997. – Vol. 90. – P. 809-819. 101. Koh, J. Tumour-derived p16 alleles encoding proteins defective in cellcycle inhibition / J. Koh, G.H. Enders, B.D. Dynlacht, E. Harlow // Nature. – 1995. – Vol. 375. – P. 506-510. 102. Komada, Y. Flow cytometric analysis of peripheral blood and bone marrow for tumor cells in patients with neuroblastoma / Y. Komada, X.L. Zhang, Y.W. Zhou et al // Cancer. – 1998. – Vol. 82. – P. 591-599. 103. Kratzke, R.A. Immunohistochemical analysis of the p16(INK4) cyclindependent kinase inhibitor in malignant mesothelioma / R.A. Kratzke, G.A. Otterson, C.E. Lincoln et al // J. Nat. Cancer Inst. – 1995. – Vol. 87. – P. 18701875. 104. Krona, C. Analysis of neuroblastoma tumour progression; loss of PHOX2B on 4p13 and 17q gain are early events in neuroblastoma tumourigenesis / C. Krona, H. Caren, R.M. Sjoberg // International Journal of Oncology. – 2008. – Vol. 32. – P. 575-583. 105. Krupp, G. Stringent RNA quality control using the Agilent 2100 bioanalyzer. / G. Krupp. –Agilent Technologies, 2005.- P. 4-5. 106. Ladenstein, R. Prognostic significance of DNA di-tetraploidy in neuroblastoma / R. Ladenstein, I.M. Ambros, U. Pötschger et al // Med. Pediatr. Oncol. – 2001. – Vol. 36. – P. 83-92. 107. Ladenstein, R. Randomized Trial of prophylactic granulocyte colonystimulating factor during rapid COJEC induction in pediatric patients with highrisk neuroblastoma: the European HR-NBL1/SIOPEN study // R. Ladenstein, D. Valteau-Couanet, P. Brock et al // J. Clin. Oncol. – 2010. – Vol. 28. – P. 35163524. 195 108. Lasorella, A. Id2 is a retinoblastoma protein target and mediates signalling by Myc oncoproteins / A. Lasorella, M. Noseda, M. Beyna, A. Iavarone // Nature. – 2000. – Vol. 407. – P. 592–598. 109. Lastowska, M. Gain of chromosome arm 17q predicts unfavourable outcome in neuroblastoma patients. U.K. Children's Cancer Study Group and the U.K. Cancer Cytogenetics Group / M. Lastowska, S. Cotterill, A.D. Pearson et al // Eur. J. Cancer. – 1997. – Vol. 33. – P. 1627-1633. 110. Layfield, L.J. Assessment of NMYC amplification: a comparison of FISH, quantitative PCR monoplexing and traditional blotting methods used with formalin-fixed, paraffin-embedded neuroblastomas / L.J. Layfield, C. WillmorePayne, H. Shimada, J.A. Holden // Anal. Quant. Cytol. Histol. – 2005. – Vol. 1. – P. 5-14. 111. Lazcoz, P. Frequent promoter hypermethylation of RASSF1A and CASP8 in neuroblastoma / P. Lazcoz, J. Muñoz, M. Nistal et al // BMC Cancer. – 2006. – Vol. 6. – P. 254. 112. Levine, T.D. Hel-N1: an autoimmune RNA-binding protein with specificity for 3' uridylate-rich untranslated regions of growth factor mRNAs / T.D. Levine, F. Gao, P.H. King et al // Mol. Cell. Biol. – 1993. – Vol. 13. – P. 3494-3504. 113. Li, F. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by surviving / F. Li, G. Ambrosini, E. Chu et al // Nature. – 1998. – Vol. 396. – P. 580-584. 114. Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, Ribogreen analysis and UV spectrometry. / S. Lightfoot. – Agilent Technologies, 2002. – P. 2-3. 115. Longo, L. Genetic predisposition to familial neuroblastoma: identification of two novel genomic regions at 2p and 12p / L. Longo. E. Panza, F. Schena et al // Hum. Hered. – 2007. – Vol. 63. – P. 205-211. 116. Look, A.T. Clinical relevance of tumor cell ploidy and N-myc gene amplification in childhood neuroblastoma: a Pediatric Oncology Group study / 196 A.T. Look, F.A. Hayes, J.J. Shuster et al // J. Clin. Oncol. – 1991. – Vol. 9. – P. 581-591. 117. Lukas, J. Retinoblastoma-protein-dependent cell-cycle inhibition by the tumour suppressor p16 / J. Lukas, D. Parry, L. Aagaard et al // Nature. – 1995. – Vol. 375. – P. 503-506. 118. Manda, R. Identification of genes (SPON2 and C20orf2) differentially expressed between cancerous and noncancerous lung cells by mRNA differential display / R. Manda, T. Kohno, Y. Matsuno et al // Genomics. – 1999. – Vol. 61. – P. 5-14. 119. Manohar, C.F. Co-amplification and concomitant high levels of expression of a DEAD box gene with MYCN in human neuroblastoma / C.F. Manohar, H.R. Salwen, G.M. Brodeur, S.L. Cohn // Genes Chromosomes Cancer. – 1995. – Vol. 14. – P. 196-203. 120. Marabelle, A. CD34+ Immunoselection of Autologus Grafts for the Treatment of High-Risk Neuroblastoma / A. Marabelle, E. Merlin, P. Halle et al // Pediatr. Blood Cancer. – 2011. – Vol. 56. – P. 134-124. 121. Maris, J.M. Significance of chromosome 1p loss of heterozygosity in neuroblastoma / J.M. Maris, P.S. White, C.P. Beltinger et al // Cancer Res. – 1995. – Vol. 55. – P. 4664-4669. 122. Marshall, B. Loss of heterozygosity at chromosome 9p21 in primary neuroblastomas: evidence for two deleted regions / B. Marshall, G. Isidro, A.G. Martins, M.G. Boavida // Cancer Genet. Cytogenet. – 1997. – Vol. 2. – P. 134-139. 123. Matthay, K.K. Treatment of high-risk neuroblastoma with intensive chemotherapy, radiotherapy, autologous bone marrow transplantation, and 13-cisretinoic acid. Children's Cancer Group / K.K. Matthay, J.G. Villablanca, R.C. Seeger et al // N. Engl. J. Med. – 1999. – Vol. 34. – P. 1165-1173. 124. McArdle, L. Oligonucleotide microarray analysis of gene expression in neuroblastoma displaying loss of chromosome 11q / L. McArdle, M. McDermott, R. Purcell et al // Carcinogenesis. – 2004. – Vol. 25. – P. 1599-1609. 197 125. Monclair, T. The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) Staging System: An INRG Task Force Report / T. Monclair, G.M. Brodeur, P.F. Ambros et al // J. Clin. Oncol. – 2009. – Vol. 27. – P. 298–303. 126. Mondal, N. DNA topoisomerase II-alpha is required for RNA polymerase II transcription on chromatin templates / N/. Mondal, J.D. Parvin // Nature. – 2001. – Vol. 413. – P. 435-438. 127. Mora, J. Comprehensive analysis of the 9p21 region in neuroblastoma suggests a role for genes mapping to 9p21–23 in the biology of favourable stage 4 tumours / J. Mora, M. Alaminos, C. de Torres et al // Br. J. Cancer. – 2004. – Vol. 91. – P. 1112–1118. 128. Morgenstern, D.A. Metastatic neuroblastoma confined to distant lymph nodes (stage 4N) to predict outcome in patients with stage 4 disease: A study from the International Neuroblastoma (NB) Risk Group (INRG) Database / D.A. Morgenstern, W.B. London, D. Stephens // J. Clin. Oncol. – 2013. – Vol. 31 suppl. - Abstract 10015. 129. Morohashi, Y. Molecular cloning and characterization of CALP/KChIP4, a novel EF-hand protein interacting with presenilin 2 and voltagegated potassium channel subunit Kv4 / Y. Morohashi, N. Hatano, S. Ohya et al // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277. – P. 14965-14975. 130. Moss, T.J. Clonogenicity of circulating neuroblastoma cells: implications regarding peripheral blood stem cell transplantation / T.J. Moss, M. Cairo, V.M. Santana et al // Blood. – 1994. – Vol. 83. – P. 3085-3089. 131. Mueller, O. RNA Integrity Number (RIN) – Standardization of RNA Quality Control / O. Mueller. – Agilent Technologies, 2004. – P. 1-8. 132. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). General Protocol. Instructions for use // MRC –Holland. – 2012. – P. 1-14. 133. Nakagawara, A. Comprehensive genomics linking between neural development and cancer: neuroblastoma as a model / A. Nakagawara, M. Ohira // Cancer Lett. – 2004. – Vol. 204. – P. 213-224. 198 134. Obuchowski, N.A. ROC analysis / N.A. Obuchowski // Am. J. Roentgenol. – 2005. – Vol. 184. – P. 364-372. 135. Ohtsu, K. Clinical investigation of neuroblastoma with partial deletion in the short arm of chromosome 1 / K. Ohtsu, E. Hiyama, T. Ichikawa et al // Clin. Cancer Res. – 1997. – Vol. 7. – P. 1221-1228. 136. Ootsuka, S. Useful markers for detecting minimal residual disease in cases of neuroblastoma / S. Ootsuka, S. Asami, T. Sasaki et al // Biol. Pharm. Bull. – 2008. – Vol. 31. – P. 1071-1074. 137. Parareda, A. Prognostic impact of the detection of microcirculating tumor cells by a real-time RT-PCR assay of tyrosine hydroxylase in patients with advanced neuroblastoma / A. Parareda, S. Gallego, J. Roma et al // Oncol. Rep. – 2005. – Vol. 4. – P. 1021-1027. 138. Pattyn, A. Expression and interactions of the two closely related homeobox genes Phox2a and Phox2b during neurogenesis / A. Pattyn, X. Morin, H. Cremer et al // Development. – 1997. – Vol. 124. – P. 4065-4075. 139. Perez, C.A. Biologic variables in the outcome of stages I and II neuroblastoma treated with surgery as primary therapy: a children's cancer group study / C.A. Perez, K.K. Matthay, J.B. Atkinson et al // J. Clin. Oncol. – 2000. – Vol. 18. – P. 18-26. 140. Perri, P. Weak linkage at 4p16 to predisposition for human neuroblastoma / P.Perri, L. Longo, R. Cusano et al // Oncogene. – 2002. – Vol. 54. – P. 8356-8360. 141. Pession, A. The prognostic effect of amplification of the MYCN oncogene in neuroblastoma. The preliminary results of the Italian Cooperative Group for Neuroblastoma (GCINB) / A. Pession, B. De Bernardi, P. Perri et al // Pediatr. Med. Chir. – 1994. – Vol. 16. – P. 211-218. 142. Pezzolo, A. Presence of 1q gain and absence of 7p gain are new predictors of local or metastatic relapse in localized resectable neuroblastoma / A. Pezzolo, E. Rossi, S. Gimelli et al // Neuro Oncol. – 2009. – Vol. 2. – P. 192-200. 199 143. Pfaffl, W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance / W. Pfaffl // Elsevier. – 2005. – P. 127-139. 144. Polyak, K. Cloning of p27(Kip1), a cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals / K. Polyak, M.H. Lee, H. Erdjument-Bromage et al // Cell. – 1994. – Vol. 78. – P. 59-66. 145. Raschellà, G. Expression of B-myb in neuroblastoma tumors is a poor prognostic factor independent from MYCN amplification / G. Raschellà, V. Cesi, R. Amendola et al // Cancer Res. – 1999. – Vol. 59. – P. 3365-3368. 146. Reifenberger, G. Amplification at 12q13–14 in human malignant gliomas is frequently accompanied by loss of heterozygosity at loci proximal and distal to the amplification site / G. Reifenberger. J. Reifenberger, K. Ichimura, V.P. Collins // Cancer Res. – 1995. – Vol. 55. – P. 731-734. 147. Riehm, H. Corticosteroid-dependent reduction of leukocyte count in blood as a prognostic factor in acute lymphoblastic leukemia in childhood (therapy study ALL-BFM 83) / H. Riehm, A. Reiter, M. Schrappe et al // Klin. Padiatr. – 1987. Vol. 199. – P. 151-160. 148. Santo E.E. Oncogenic activation of FOXR1 by 11q23 intrachromosomal deletion-fusions in neuroblastoma / E.E. Santo, M.E. Ebus, J. Koster et al // Oncogene. – 2012. – Vol. 31. – P. 1571-1581. 149. Schleiermacher, G. Segmental chromosomal alterations have prognostic impact in neuroblastoma: a report from the INRG project / G. Schleiermacher, V. Mosseri, W.B. London et al // Br. J. Cancer. – 2012. – Vol. 107. – P. 1418-1422. 150. Schmidt, M. Is there a benefit of 131 I-MIBG therapy in the treatment of children with stage 4 neuroblastoma? A retrospective evaluation of The German Neuroblastoma Trial NB97 and implications for The German Neuroblastoma Trial NB2004 / M. Schmidt, T. Simon, B. Hero et al // Nuklearmedizin. – 2006. – Vol. 45. – P. 145-151. 200 151. Schroeder, A. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements / A. Schroeder, O. Mueller, S. Stocker et al // BMC Molecular Biology. – 2006. – Vol. 7. – P. 1-14. 152. Schumacher-Kuckelkorn, R. Lacking immunocytological GD2 expression in neuroblastoma: report of 3 cases / R. Schumacher-Kuckelkorn, B. Hero, K. Ernestus, F. Berthold // Pediatr. Blood Cancer. – 2005. – Vol. 45. – P. 195-201. 153. Schwab, M. Amplified MYCN in human neuroblastoma: paradigm for the translation of molecular genetics to clinical oncology/ M. Schwab // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2002. – Vol. 963. – P. 63-73. 154. Seeger, R.C. Association of multiple copies of the N-myc oncogene with rapid progression of neuroblastomas/ R.C. Seeger, G.M. Brodeur, H. Sather et al // N. Engl. J. Med. – 1985. – Vol. 313. – P. 1111-1116. 155. Sharma, V.K. Semi-automated fluorogenic PCR assays (TaqMan) forrapid detection of Escherichia coli O157:H7 and other shiga toxigenic E. coli / V.K. Sharma, E.A. Dean-Nystrom, T.A. Casey // Mol. Cell. Probes. – 1999. – Vol. 13. – P. 291-302. 156. Shimada, H. Terminology and morphologic criteria of neuroblastic tumors: recommendations by the International Neuroblastoma Pathology Committee / H. Shimada, I.M. Ambros, L.P. Dehner et al // Cancer. – 1999. – Vol. 86. – P. 349-363. 157. Shimada, H. The International Neuroblastoma Pathology Classification (the Shimada system) / H. Shimada, I.M. Ambros, L.P. Dehner et al // Cancer. – 1999. – Vol. 86. – P. 364-372. 158. Shimada, H. International neuroblastoma pathology classification for prognostic evaluation of patients with peripheral neuroblastic tumors: a report from the Children's Cancer Group / H. Shimada, S. Umehara, Y. Monobe et al // Cancer. – 2001. – Vol. 92. – P. 2451-2461. 201 159. Shirvan, A. Semaphorins as mediators of neuronal apoptosis / A. Shirvan, I. Ziv, G. Fleminger et al // J. Neurochem. – 1999. – Vol. 73. – P. 961971. 160. Shivakumar, L. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation / L. Shivakumar, J. Minna, T. Sakamaki et al // Molec. Cell. Biol. – 2002. – Vol. 22. – P. 4309-4318. 161. Shono, K. Clinical implications of minimal disease in the bone marrow and peripheral blood in neuroblastoma / K. Shono, T. Tajiri, Y. Fujii, S. Suita // J. Pediatr. Surg. – 2000. – Vol. 35. – P. 1415-1420. 162. Simon, T. New definition of low-risk neuroblastoma using stage, age, and 1p and MYCN status / T. Simon, R. Spitz, A. Faldum et al // J. Pediatr. Hematol. Oncol. – 2004. – Vol. 26. – P. 791-796. 163. Soderholm, H. Human achaete-scute homologue 1 (HASH-1) is downregulated in differentiating neuroblastoma cells / H. Soderholm, E. Ortoft, I. Johansson et al // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1999. – Vol. 256. – P. 557– 563. 164. Song, M.S. The tumour suppressor RASSF1A regulates mitosis by inhibiting the APC-Cdc20 complex / M.S. Song, S.J. Song, N.G. Ayad et al // Nature Cell. Biol. – 2004. – Vol. 6. – P. 129-137. 165. Speliotes, E.K. The survivin-like C. elegans BIR-1 protein acts with the Aurora-like kinase AIR-2 to affect chromosomes and the spindle midzone / E.K. Speliotes, A. Uren, D. Vaux, H.R. Horvitz // Molec. Cell. – 2000. – Vol. 6. – P. 211-223. 166. Spitz, R. Deletions in chromosome arms 3p and 11q are new prognostic markers in localized and 4s neuroblastoma / R. Spitz, B. Hero, K. Ernestus, F. Berthold // Clin. Cancer Res. – 2003. – Vol. 9. – P. 52-58. 167. Squire, J.A. Co-amplification of MYCN and a DEAD box gene (DDX1) in primary neuroblastoma / J.A. Squire, P.S. Thorner, S. Weitzman et al // Oncogene. – 1995. – Vol. 10. – P. 1417-1422. 202 168. Stallings, R.L. Are gains of chromosomal regions 7q and 11p important abnormalities in neuroblastoma? / R.L. Stallings, J. Howard, A. Dunlop et al // Cancer Genet. Cytogenet. – 2003. – Vol. 140. – P. 133-137. 169. Stiller, C.A. International variations in the incidence of neuroblastoma / C.A. Stiller, D.M. Parkin // Int. J. Cancer. – 1992. – Vol. 52. – P. 538-543. 170. Stutterheim, J. PHOX2B is a novel and specific marker for minimal residual disease testing in neuroblastoma / J. Stutterheim, A. Gerritsen, L. ZappeijKannegieter et al // J. Clin. Oncol. – 2008. – Vol. 26. – P. 5443-5449. 171. Stutterheim, J. Detecting minimal residual disease in neuroblastoma: the superiority of a panel of real-time quantitative PCR markers / J. Stutterheim, A. Gerritsen, L. Zappeij-Kannegieter et al // Clin. Chem. – 2009. – Vol. 55. – P. 13161326. 172. Stutterheim, J. The prognostic value of fast molecular response of marrow disease in patients aged over 1 year with stage 4 neuroblastoma / J. Stutterheim, L. Zappeij-Kannegieter, R. Versteeg et al // Eur. J. Cancer. – 2011. – Vol. 47. – P. 1193-1202. 173. Stutterheim, J. Methylated RASSF1a is the first specific DNA marker for minimal residual disease testing in neuroblastoma / J. Stutterheim, F.A. Ichou, E. den Ouden, et al // Clin. Cancer Res. – 2012. – Vol. 18. – P. 808-814. 174. Su, W.T. Positional gene expression analysis identifies 12q overexpression and amplification in a subset of neuroblastomas / W.T. Su, M. Alaminos, J. Mora et al // Cancer Genet. Cytogenet. – 2004. – Vol. 154. – P. 131137. 175. Swerts, K. Standardization of the immunocytochemical detection of neuroblastoma cells in bone marrow / K. Swerts, P.F. Ambros, C. Brouzes et al // J. Histochem. Cytochem. – 2005. – Vol. 53. – P. 1433-1440. 176. Swerts, K. Potential application of ELAVL4 real-time quantitative reverse transcription-PCR for detection of disseminated neuroblastoma cells / K. 203 Swerts, B. De Moerloose, C. Dhooge et al // Clin. Chem. – 2006. – Vol. 52. – P. 438-445. 177. Szabo, A. HuD, a paraneoplastic encephalomyelitis antigen, contains RNA-binding domains and is homologous to Elav and Sex-lethal / A. Szabo, J. Dalmau, G. Manley et al // Cell. – 1991. – Vol. 67. – P. 325-333. 178. Takeda, K. WFS1 (Wolfram syndrome 1) gene product: predominant subcellular localization to endoplasmic reticulum in cultured cells and neuronal expression in rat brain / K. Takeda, K. Inoue, Y. Tanizawa et al // Hum. Molec. Genet. – 2001. – Vol. 10. – P. 477-484. 179. Takita, J. Deletion map of chromosome 9 and p16 (CDKN2A) gene alterations in neuroblastoma / J. Takita, Y. Hayashi, T. Kohno et al // Cancer Res. – 1997. – Vol. 57. – P. 907–912. 180. Takita, J. The p16 (CDKN2A) gene is involved in the growth of neuroblastoma cells and its expression is associated with prognosis of neuroblastoma patients / J. Takita, Y. Hayashi, T. Nakajima et al // Oncogene. – 1998. – Vol. 17. – P. 3137-3143. 181. Tan, K.O. MAP-1, a novel proapoptotic protein containing a BH3-like motif that associates with Bax through its Bcl-2 homology domains / K.O. Tan, K.M.L. Tan, S.L. Chan et al // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276. – P. 2802-2807. 182. Tchirkov, A. Molecular monitoring of tumor cell contamination in leukapheresis products from stage IV neuroblastoma patients before and after positive CD34 selection / A. Tchirkov, J. Kanold, M. Giollant et al // Med. Pediatr. Oncol. – 1998. – Vol. 30. – P. 228-232. 183. Tchirkov, A. Significance of molecular quantification of minimal residual disease in metastatic neuroblastoma / A. Tchirkov, C. Paillard, P. Halle et al // J. Hematother. Stem Cell Res. – 2003. – Vol. 12. – P. 435-442. 184. Theissen, J. Heterogeneity of the MYCN oncogene in neuroblastoma / J. Theissen, M. Boensch, R. Spitz et al // Clin. Cancer Res. – 2009. – Vol. 15. – P. 2085–2090. 204 185. Thompson, P.M. Loss of heterozygosity for chromosome 14q in neuroblastoma / P.M. Thompson, B.A. Seifried, S.K. Kyemba et al // Med. Pediatr. Oncol. – 2001. – Vol. 36. – P. 28-31. 186. Thompson, P.M. CHD5, a new member of the chromodomain gene family, is preferentially expressed in the nervous system / P.M. Thompson, T. Gotoh, M. Kok et al // Oncogene. – 2003. – Vol. 22. – P. 1002-1011. 187. Thompson, R.J. PGP 9.5 – a new marker for vertebrate neurons and neuroendocrine cells / R.J. Thompson, J.F. Doran, P. Jackson et al // Brain Res. 1983. – Vol. 278. – P. 224-228. 188. Tonini, G.P. MYCN oncogene amplification in neuroblastoma is associated with worse prognosis, except in stage 4s: the Italian experience with 295 children / G.P. Tonini, L. Boni, A. Pession et al // J. Clin. Oncol. – 1997. – Vol. 15. – P. 85-93. 189. Trager, C. Quantitative analysis of tyrosine hydroxylase mRNA for sensitive detection of neuroblastoma cells in blood and bone marrow / C. Trager, P. Kogner, M. Lindskog et al // Clin. Chem. – 2003. – Vol. 49. – P. 104-112. 190. Trager, C. mRNAs of tyrosine hydroxylase and dopa decarboxylase but not of GD2 synthase are specific for neuroblastoma minimal disease and predicts outcome for children with high-risk disease when measured at diagnosis / C. Trager, A. Vernby, A. Kullman et al // Int. J. Cancer. – 2008. – Vol. 123. – P. 2849-2855. 191. Trochet, D. Germline mutations of the paired-like homeobox 2B (PHOX2B) gene in neuroblastoma / D. Trochet, F. Bourdeaut, I. Janoueix-Lerosey et al // Am. J. Hum. Genet. – 2004. – Vol. 74. – P. 761-764. 192. Tse, C. Human semaphorin 3B (SEMA3B) located at chromosome 3p21.3 suppresses tumor formation in an adenocarcinoma cell line / C. Tse, R.H. Xiang, T. Bracht, S.L. Naylor // Cancer Res. – 2002. – Vol. 62. – P. 542-546. 205 193. Van Roy, N. Identification of two distinct chromosome 12-derived amplification units in neuroblastoma cell line NGP / N. Van Roy, A. Forus, O. Myklebost et al // Cancer Genet. Cytogenet. – 1995. – Vol. 82. – P. 151-154. 194. Vandesompele, J. Genetic heterogeneity of neuroblastoma studied by comparative genomic hybridization / J. Vandesompele, N. Van Roy, M. Van Gele et al // Genes Chromosomes Cancer. – 1998. – Vol. 23. – P. 141-152. 195. Vandesompele, J. Unequivocal delineation of clinicogenetic subgroups and development of a new model for improved outcome prediction in neuroblastoma / J. Vandesompele, M. Baudis, K. De Preter et al // J. Clin. Oncol. – 2005. – Vol. 23. – P. 2280-2299. 196. Viprey, V.F. Standardisation of operating procedures for the detection of minimal disease by QRT-PCR in children with neuroblastoma: Quality assurance on behalf of SIOPEN-R-NET / V.F. Viprey, M.V. Corrias, B. Kagedal et al // Eur. J. Cancer. – 2007. – Vol. 43. – P. 341-350. 197. Wang, Y. Expression of protein gene product 9.5 and tyrosine hydroxylase in childhood small round cell tumors / Y. Wang, P. Einhorn, T.J. Triche et al // Clin. Cancer Res. – 2000. – Vol. 6. – P. 551-558. 198. Weber, A. Coamplification of DDX1 correlates with an improved survival probability in children with MYCN-amplified human neuroblastoma / A. Weber, P. Imisch, E. Bergmann, H. Christiansen // J. Clin. Oncol. – 2004. – Vol. 22. – P. 2681-2690. 199. Wei, J.S. The MYCN oncogene is a direct target of miR-34a / J.S. Wei, Y.K. Song, S. Durinck et al // Oncogene. – 2008. – Vol. 27. – P. 5204-5213. 200. Weinstein, S. Clinical evaluation of diagnostic tests / S. Weinstein, N.A. Obuchowski, M.L. Lieber // Am. J. Roentgenol. – 2005. – Vol. 184. – Р. 1419. 201. Westermann, F. Genetic parameters of neuroblastomas / F. Westermann, M. Schwab // Cancer Lett. – 2002. – Vol. 184. – P. 127-147. 206 202. Wurl, P. Co-expression of survivin and TERT and risk of tumourrelated death in patients with soft-tissue sarcoma / P. Wurl, M. Kappler, A. Meye et al // Lancet. – 2002. – Vol. 359. – P. 943-945. 203. Xiang, R.H. Isolation of the human semaphorin III/F gene (SEMA3F) at chromosome 3p21, a region deleted in lung cancer / R.H. Xiang, C.H. Hensel, D.K. Garcia et al // Genomics. – 1996. – Vol. 32. – P. 39-48. 204. Yanik, G.A. Semiquantitative mIBG scoring as a prognostic indicator in patients with stage 4 neuroblastoma: a report from the Children's oncology group / G.A. Yanik, M.T. Parisi, B.L. Shulkin et al // J. Nucl. Med. – 2013. – Vol. 54. – P. 541-548. 205. Zweig, M.H. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine / M.H. Zweig, G. Campbell // Clin. Chem. – 1993. – Vol. 31. – P. 561-577.
