ГЕН SuUR – УНИКАЛЬНЫЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
advertisement
Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 127 ГЕН SuUR – УНИКАЛЬНЫЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМОСОМ И ГЕНОМА ДРОЗОФИЛЫ И.Ф. Жимулев, Е.С. Беляева, Н.Г. Андреенкова, Е.Н. Андреева, С.Н. Белякин, Л.В. Болдырева, И.В. Брусенцова, Е.И. Волкова, С.А. Демаков, О.В. Демакова, Е.А. Заруцкая, И.А. Зыков, Е.Б. Кокоза, Т.Д. Колесникова, У.А. Комор, Д.Е. Коряков, И.В. Макунин, А.В. Пиндюрин, Г.В. Похолкова, В.Ф. Семешин, В.В. Шлома, А.А. Юрлова Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия, e-mail: Zhimulev@bionet.nsc.ru В обзоре представлены данные о гене SuUR (Suppressor of UnderReplication) у дрозофилы и его применении для изучения структуры и функциональной организации политенных хромосом и генома в целом. SuUR – это единственный известный ген, контролирующий процесс завершения репликации. У мутантов по этому гену репликация завершается раньше, чем в норме, в результате чего полностью супрессируется недорепликация ДНК в районах интеркалярного и частично – прицентромерного гетерохроматина. Продукт гена – белок SUUR – локализуется в политенных хромосомах в районах поздней репликации; он имеет несколько доменов, каждый из которых несет свою функциональную нагрузку – специфичное связывание с материалом хромосом, индукция структурных модификаций гетерохроматина, контроль политенизации хромосом и репликации районов интеркалярного гетерохроматина. Среди генов-мишеней белка SuUR были обнаружены блоки скоординированно функционирующих генов, которые составляют до 7 % от общего числа генов у дрозофилы. Гены, входящие в состав блоков, связывают такие белки, как SUUR, HP1, ламин, PcG. Ген SuUR влияет на пространственную организацию интерфазного ядра с политенными хромосомами. Частичная супрессия недорепликации ДНК в прицентромерном гетерохроматине у мутантов SuUR приводит к тому, что из прицентромерного гетерохроматина хромосомы 3 формируется участок, имеющий дисковую организацию, названный «Атлантидой»; его появление позволило локализовать многие клоны ДНК гетерохроматина, которые другими способами прокартировать было затруднительно. Введение В одной из самых первых статей о политенных хромосомах дрозофилы (Painter, 1934) были описаны разрывы, возникающие в определенных районах хромосом, названные затем «слабыми точками» (weak spots) (Bridges, 1935). Чуть позже в этих районах выявили высокую частоту возникновения точек разрывов хромосомных перестроек, индуцированных радиацией. Поскольку такие же разрывы были обнаружены в прицентромерном гетерохроматине, который образовывал тяжи контактов («эктопическая конъюгация») с участками слабых точек, то по принципу «подобное конъюгирует с подобным» участки разрывов стали также называть гетерохроматином, вкрапленным или интеркалированным в эухроматин. Так возникло понятие об интеркалярном гетерохроматине (ИГХ) (Kaufmann, 1939; Прокофьева-Бельговская, Хвостова, 1939). За последующие почти 70 лет были получены его разнообразные характеристики, которые могут быть суммированы следующим образом. Интеркалярный гетерохроматин представлен дисками, состоящими из плотно конденсированного материала, что свидетельствует об отсутствии экспрессии содержащихся в них генов, по крайней мере в клетках слюнных желез. Эти районы завершают цикл репликации ДНК в самом конце S-периода (поздно реплицирующиеся районы). Всего в политенных хромосомах 128 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 выявляется около 240 районов поздней репликации, разбросанных в эухроматиновых частях плеч хромосом. Примерно в 1/4 этих районов обнаружены «слабые точки», возникающие изза неполной политенизации хроматид в участке политенной хромосомы (недорепликация) (Zhimulev et al., 1982, 2003a; Moshkin et al., 2001). Как оказалось, эктопическая конъюгация полностью зависит от степени недорепликации (Zhimulev et al., 1982; Belyaeva et al., 2006). Позднее, когда после завершения расшифровки генома дрозофилы стало возможным определить содержание ДНК в каждом районе хромосом и даже в индивидуальных крупных дисках, выяснилось, что локализация точек разрывов хромосомных перестроек не является специфической особенностью районов ИГХ, поскольку их удельная (на единицу длины ДНК) частота в районах ИГХ не выше, чем в обычных районах хромосом (Волкова и др., 2008). Наиболее важным в исследовании районов ИГХ оказалось открытие специфического гена SuUR (Suppressor of UnderReplication), влияющего на проявление различных признаков ИГХ (Belyaeva et al., 1998). Ниже представлены сведения о гене SuUR, кодируемом им белке, а также данные, полученные с их использованием, которые позволили изучить многие особенности организации хромосом и генома в целом. Результаты более ранних исследований можно найти в обзоре Т.Д. Колесниковой и др. (2006). SUUR – хромосомный белок Белок SUUR выявляется в интерфазе диплоидных клеток, главным образом в прицентромерном гетерохроматине (хромоцентры интерфазного ядра), в метафазе митоза он покидает хромосомы и располагается на большой территории цитоплазмы (Колесникова и др., 2006). В политенных хромосомах антитела на белок SUUR выявляются исключительно в районах поздней репликации – в прицентромерном и интеркалярном гетерохроматине, внутренних компактных структурах ядрышкового организатора и эухроматиновых районах хромосом, инактивированных и компактизованных в результате эффекта положения (Makunin et al., 2002; Belyaeva et al., 2003). Известно, что в политенных хромосомах можно обнаружить до 240 районов поздней репликации (Zhimulev et al., 2003а), при этом в 113 наиболее поздно реплицируемых районах обнаруживается белок SUUR (Makunin et al., 2002). При увеличении количества этого белка за счет добавления в геном двух дополнительных трансгенных копий гена SuUR+ белок SUUR начинает выявляться еще примерно в 170 участках хромосом, главным образом также в районах поздней репликации (Zhimulev et al., 2003a). Создание и экспрессия транспозонов, кодирующих гибридный белок Dam-SUUR (Dam – ДНК-аденин-метил-трансфераза из генома E. coli) (методика DamID) (van Steensel et al., 2001), и последующий геномный анализ с помощью микрочипов с нанесенными на них кДНК позволяет выявить гены, с которыми связывается белок SUUR. При анализе 11459 генов из генома дрозофилы было выявлено около 3000 генов дрозофилы, связывающих белок SUUR (Pindyurin et al., 2007). В целом выборка из 1034 генов, являющихся мишенями для белка SUUR, обеднена генами, в состав хроматина которых входят модифицированные гистоны (H3-di-meK4, H3-tri-meK4, H3-Ac, H4-Ac и H3-di-meK79, характерные для активного рано реплицирующегося хроматина (Schubeler et al., 2004)). Вместе с тем она обогащена поздно реплицирующимися генами и генами, с которыми связаны специфические гистоны (модификация Н3-tri-meK27, характерная для инактивированных Pc-зависимых генов). Оказалось, что 52 и 59 % изученных генов, связывающих соответственно Pc (785 генов) и Esc (624 гена), одновременно связывают SUUR. 3 белка (Pc, Esc и SUUR) выявляются одновременно в 439 генах. Все эти данные поддерживают представление о том, что белок SUUR главным образом связан с поздно реплицирующимися и транскрипционно неактивными генами (Pindyurin et al., 2007). Кроме белков группы Pc с SUUR солокализуются некоторые другие белки, располагающиеся обычно в гетерохроматине, в частности, HP1 и SU(VAR)3-9, а также Lamin B. Cолокализация HP1 и SUUR была вначале установлена для эухроматиновых районов, ставших компактными в результате эффекта 129 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 положения мозаичного типа, причем до компактизации в этих районах оба белка отсутствовали (Belyaeva et al., 1993, 2003). С помощью методики DamID и микрочипов было показано, что 504 гена из 590 генов-мишеней для НР1 связывают одновременно SUUR (Pindyurin et al., 2008, in press). В опытах с использованием двугибридной системы на основе клеток дрожжей, позволяющей выявлять взаимодействие белков в живой дрожжевой клетке, было установлено, что средняя часть белковой молекулы SUUR (аминокислоты 339-671, см. ниже) взаимодействует с так называемым «chromoshadow» доменом белка HP1 (Pindyurin et al., 2008, in press). С использованием методики «привлечения белков» (tethering), когда в геном вводятся транспозоны, один из которых содержит гибридный ген Gal4/HP1, а второй – UAS (участок связывания Gal4), было показано, что при встраивании UAS-мишени в район хромосомы, в котором никогда до этого не находили ни HP1, ни SUUR, в нем появляются оба белка, что свидетельствует о взаимозависимости их солокализации в районах хромосом. Распределение HP1 тоже может зависеть от SUUR: при сверхэкспрессии последнего белок HP1 перераспределяется в хромосомах, следуя за сайтами связывания SUUR (Pindyurin et al., 2008, in press). В рамках поиска возможных белков-партнеров SUUR мы исследовали распределение антител против белка SU(VAR)3-9 на хромосомах питающих клеток ооцитов и слюнных желез в норме и у мутантов SuUR. SU(VAR)3-9 – это гистон-метил-трансфераза, которая считается одной из ключевых для формирования гетерохроматина. В хромосомах питающих клеток в норме SU(VAR)3-9 обнаруживается в прицентромерном гетерохроматине, а также в более чем 220 сайтах эухроматина. В слюнных железах SU(VAR)3-9 выявляется лишь в прицентромерном гетерохроматине, теломерах и нескольких сайтах в эухроматине. У мутантов SuUR в хромосомах слюнных желез белок SU(VAR)3-9 исчезает. В хромосомах питающих клеток он остается, но связывание отличается в аутосомах и X-хромосоме. Если в X-хромосоме мутация SuUR приводит лишь к перераспределению SU(VAR)3-9, но общее число сайтов остается примерно таким же, то в аутосомах число сайтов связывания SU(VAR)3-9 сокращается в несколько раз (Koryakov et al., 2006). Полученные результаты показывают, что между этими белками есть функциональная зависимость, и белок SUUR, по-видимому, необходим для появления SU(VAR)3-9 в хромосомах. Эта взаимосвязь должна быть чем-то опосредована, так как данные белки не способны непосредственно взаимодействовать друг с другом, как было показано в искусственной двугибридной дрожжевой системе. Фенотипы мутантов по гену SuUR У гомозигот по мутации SuUR не обнаружены какие-либо отклонения в жизнеспособности эмбриона, личинки или имаго, не выявлено также изменений в продолжительности личиночной жизни или в протекании отдельных стадий развития (Volkova, Zhimulev, 2001). Однако фенотипические отклонения проявляются при эктопической сверхэкспрессии этого гена (Volkova et al., 2003). С помощью транспозонов, содержащих промоторы генов, специфически активируемые либо на определенной стадии развития, либо в определенной ткани (так называемые драйверы), можно экспрессировать ген SuUR в тканях, в которых активен драйвер, или значительно повысить уровень активности гена (эктопическая экспрессия или сверхэкспрессия). Так, например, сверхэкспрессия в фолликулярных клетках ооцита приводит к подавлению амплификации хорионовых генов, продукт которых необходим для формирования оболочки яйца (Volkova et al., 2003). Постоянная эктопическая экспрессия гена SuUR под действием драйвера AB1-Gal4, функционирующего в клетках слюнных желез с раннего эмбриогенеза, приводит к тому, что политенные хромосомы слюнных желез не формируются. Размеры ядер становятся лишь немного больше, чем в диплоидных клетках. Таким образом, постоянная сверхэкспрессия этого гена подавляет эндоциклы, приводящие к политенизации хромосом. Постоянная и повсеместная сверхэкспрессия гена SuUR под более сильными драйверами Actin5C-Gal4 и daughterless-Gal4 приводит к гибели на ранних стадиях развития (Volkova et al., 2003). 130 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Эффекты SuUR зависят от дозы гена Одной из особенностей гена SuUR является зависимость проявления мутантного фенотипа от дозы гена. В линиях с двумя природными дозами (дикий тип) белок располагается примерно в 100 районах исключительно поздней репликации и, в основном, недорепликации (Makunin et al., 2002). В трансгенных же линиях дрозофил, содержащих до 8 доз гена (2 геномных и до 6 трансгенных), белок занимает все участки поздней репликации в политенных хромосомах и некоторые другие диски – около 280 сайтов (Zhimulev et al., 2003a). При большем количестве белка (например в системе сверхэкспрессии в клетках слюнных желез с использованием драйвера Sgs3-Gal4) SUUR выявляется во всех крупных дисках, а в районах ИГХ формируются своеобразные модификации участков хромосом в виде вздутий (swellings – см. ниже) (Zhimulev et al., 2003с). У личинок дикого типа (2 дозы гена SuUR+) картина завершения репликации имеет дискретный характер: деконденсированные районы, содержащие активные гены, уже завершили цикл репликации и не включают предшественников синтеза ДНК, в то время как районы ИГХ еще продолжают репликацию. Часть этих районов не успевает ее завершить, и образуются зоны недорепликации, в которых сечение хромосомы ослаблено и формируется разрыв (см. выше). У мутантов SuUR (0 доз гена) вышеупомянутые районы поздней репликации завершают репликацию значительно раньше. В конце S-фазы реплицируются только районы прицентромерного гетерохроматина, а районы ИГХ уже закончили синтез ДНК (Zhimulev et al., 2003a). Еще более рельефно выглядит зависимость степени недорепликции от дозы гена SuUR. Как уже упоминалось выше, в линиях с двумя дозами недорепликация присутствует в сильно инактивированных районах хромосом, в таких, как прицентромерный и интеркалярный гетерохроматин (Moshkin et al., 2001), а также в эухроматиновых районах, компактизованных и инактивированных при эффекте положения (Pokholkova et al., 1993). У мутантов по этому гену происходит супрессия недорепликации, полная – в районах ИГХ и частичная – в прицентромерных районах. В результате на месте небольшого разорванного диска интеркалярного гетерохроматина появляется цельный и более толстый диск (за счет присутствия всего материала данного района хромосомы) (Semeshin et al., 2001), а в хромоцентре из вновь политенизированного материала возникает новый фрагмент, имеющий дисковую организацию, названный «Атлантидой» (Plato Atlantis) (Belyaeva et al., 1998, 2006; Demakova et al., 2007; Andreyeva et al., 2007). В случае добавления дополнительных трансгенных доз нормального гена SuUR число районов, демонстрирующих наличие разломов, увеличивается в десятки раз. Степень недорепликации, оцененная с помощью полуколичественного Саузерн-блот анализа, при этом резко усиливается (Moshkin et al., 2001). Расширяется и зона недорепликации ИГХ, например, в таких районах ИГХ, как 11A, 19E и 75С (рис. 1, 2). Точно так же от дозы гена SuUR зависит проявление другого характерного признака ИГХ – эктопической конъюгации, которая, как известно (Zhimulev et al., 1982; Belyaeva et al., 2006), формируется в районах недорепликаци. У мутантов она полностью отсутствует, а хромосомы выглядят очень ровными и при приготовлении давленых препаратов хорошо расправляются. В хромосомах дикого типа (две дозы гена SuUR) эктопическая конъюгация в той или иной степени присутствует, а в клетках трансгенных личинок (4–8 доз SUUR) увеличивается число районов, вступающих в эктопическую конъюгацию, формируя тяжи настолько прочные, что хромосомы фактически не расправляются в ходе обычной процедуры изготовления давленых препаратов (Zhimulev et al., 2003b). Зависимость эктопической конъюгации от недорепликации ДНК: влияние гена SuUR Данные, рассмотренные выше, свидетельствуют о том, что SUUR – это хромосомный белок, локализующийся в районах поздней репликации. Повышение количества этого белка в районах политенных хромосом приводит к усилению задержки завершения репликации и, соответственно, усилению недорепликации. Отсутствие белка SUUR супрессирует недорепликацию. Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 131 Рис. 1. Молекулярно-цитогенетическая характеристика района 11А6-9 в Х-хромосоме у самок (а) и самцов (б) дрозофилы. По оси абсцисс (для «а» и «б») – физическая карта ДНК (release 5.1), по оси ординат – степень представленности ДНК в районе; в – наличие (+) или отсутствие (–) взаимодействия генов с перечисленными белками; темные кружки – уровень представленности ДНК в данной точке карты у самок и самцов SuUR+; черные треугольники – то же у самок и самцов 4xSuUR+; светлые кружки – у мутанта SuUR. Степень супрессии недорепликации зависит от типа гетерохроматиновых районов. Например, уникальные последовательности, слагающие интеркалярный гетерохроматин, полностью политенизируются у мутантов SuUR, в то же время последовательности прицентромерного гетерохроматина политенизируются частично (см. выше), образуя район «Атлантиды» (Belyaeva et al., 1998; Semeshin et al., 2001). ДНК из «Атлантиды» была выделена с помощью диссекции, клонирована и секвенирована. Оказалось, что район гетерохроматина, избирательно политени- зирующийся у мутантов SuUR, состоит главным образом из умеренных повторов (Moshkin et al., 2002). Недорепликация сателлитных ДНК не супрессируется (Belyaeva et al., 1998). Известно, что в норме недорепликация ДНК полностью супрессирована в районах ИГХ, локализованных в X-хромосомах самцов дрозофилы (Zhimulev et al., 1982, 1989) (рис. 1, 2). Морфологически X-хромосома самца выглядит более рыхлой и примерно в 2 раза более активна транскрипционно, чем X-хромосома самки или аутосомы обоих полов. это связано 132 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Рис. 2. Молекулярно-цитогенетическая характеристика района 19E1-4 в Х-хромосоме самок и самцов дрозофилы. a – самки; б – самцы; в – наличие (+) или отсутствие (–) взаимодействия генов с перечисленными белками. Условные обозначения как на рис. 1. с существованием особого механизма дозовой компенсации – каскада генной активности, который у дрозофилы запускается геном Sxl (см. обзор Lucchesi, Kuroda, 2006). Можно предположить, что повышенный уровень деконденсации хроматина X-хромосомы, возникающий в результате дозовой компенсации, создает возможность полного завершения репликации в районах ИГХ. Чтобы проверить наше предположение, мы исследовали степень недорепликации ДНК в районе ИГХ 11А6-9 (см. рис. 1) у самок, у которых была искусственно индуцирована дозовая компенсация. Известно, что в норме у самок белок SXL связывается с особыми участками регуляторных зон транскрипта msl2 и блокирует экспрессию белка MSL2, который является ключевым для сборки MSL-комплекса (Lucchesi, Kuroda, 2006). Тем не менее достаточно либо выключить ген Sxl, либо нарушить негативную регуляцию трансляции белка MSL2 (Gorman et al., 1995; Kellеy et al., 1997), чтобы у самок оказался включенным механизм дозовой компенсации. В своей работе мы использовали оба подхода для получения эктопической экспрессии белка MSL2. 133 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Так, у самок, гетерозиготных по некоторым мутантным аллелям гена Sxl, обнаруживается соматический мозаицизм в личиночных тканях. Слюнные железы у таких особей состоят из клеток как «женского» (SXL+MSL2–), так и «мужского» типа (SXL–MSL2+). В клетках «мужского» типа формируется MSL-комплекс, Х-хромосома выглядит морфологически диффузной, а в районах ИГХ, локализованных в Х-хромосоме, по данным Southern-blot-гибридизации, происходит полная супрессия недорепликации ДНК (Alekseyenko et al., 2002). Кроме того, такие же признаки «самцовой» Х-хромосомы мы обнаружили у самок из трансгенных линий, в которых было нарушено в разной степени связывание SXL с транскриптом msl2, что приводило к продукции некоторых количеств MSL-комплекса в клетках самок. Мы показали, что степень супрессии недорепликации ДНК в районе ИГХ (11А6-9) прямо коррелирует с количеством MSL2, продуцируемым в конкретной трансгенной линии (Alekseyenko et al., 2002). Эти данные ясно свидетельствуют о том, что в клетках дикого типа у самцов, имеющих нормальные количества белков MSL-комплекса, последний подавляет действие SUUR, однако, если увеличить дозу SUUR, то большое количество этого белка преодолевает супрессирующий эффект дозовой компенсации (см. рис. 1, 2). Как говорилось выше, районы ИГХ имеют ярко выраженную способность вступать в контакты между собой и с прицентромерным гетерохроматином. Эти контакты были названы эктопической (негомологичной) конъюгацией (Slizynski, 1945). В настоящее время наиболее вероятным выглядит представление о связи эктопического спаривания с недорепликацией ДНК в гетерохроматиновых районах. Было высказано предположение о том, что недореплицированные молекулы ДНК имеют «липкие» концы, и соединение таких концов из разных районов гетерохроматина создает непрерывную нить (эктопический тяж) между ними (Zhimulev et al., 1982). Позднее предположили (Leach et al., 2000), что эктопические тяжи возникают вследствие сшивания в результате работы системы репарации двойных разрывов между свободными двунитевыми концами молекул ДНК, которые образуются при остановке вилки репликации в гетерохроматине. Использование SuUR как фактора недорепликации подтвердило эти представления. Наблюдается четкая корреляция между интенсивностью экспрессии SuUR, степенью недорепликации, количеством укороченных (недореплицированных) молекул ДНК и частотой эктопического спаривания в районах интеркалярного гетерохроматина (Belyaeva et al., 2006). В условиях сверхэкспрессии SuUR эта закономерность выражена особенно ярко: эктопические контакты и недорепликация появляются даже в X-хромосоме самца, где в норме все районы реплицируются полностью и нет эктопической конъюгации. Кроме того, между районами ИГХ в политенных хромосомах возникают частичные хромосомные перестройки, что свидетельствует о воссоединении концов недореплицированных молекул ДНК. Недавно образование свободных двунитевых концов в районах недорепликации было показано с помощью антител на фосфорилированную форму гистона H2AV-S137, которая «метит» двунитевые разрывы (Madigan, 2002). В политенных хромосомах диких линий эта форма гистона локализуется в ИГХ и ПГХ, а у мутантов SuUR сигнал на H2AV имеется только в последнем. При усилении недорепликации в условиях сверхэкспрессии SUUR H2AV выявляется во многих дополнительных сайтах в плечах всех хромосом, в том числе в X-хромосоме самца (E.N. Andreyeva et al., in preparation). Структура гена и белка SuUR Ген SuUR имеет очень короткую промоторную зону, расположенную внутри последовательности из 85 нуклеотидов между 5′-концом предыдущего гена и кодирующей зоной SuUR (рис. 3), состоящей из 4 экзонов и кодирующей 962 аминокислоты (рис. 4). Промоторная зона не имеет выраженной гомологии к известным промоторным мотивам; обнаружено два предположительных сайта связывания E2F в 5′UTRгена SuUR (Makunin et al., 2002). Кроме этого, при сравнительном анализе 5′UTR 8 видов дрозофилы была выявлена значительная консервативность в этом районе; более детальное изучение с помощью выравнивания последовательности показало, что большинство замен в этом районе произошли в третьей позиции, а все 134 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Рис. 3. Структура регуляторной зоны гена SuUR. Увеличена 5′UTR-часть первого экзона, где обнаружены три стартовые точки трансляции (AUG-кодоны) и одна короткая последовательность AUG в пределах более длинной рамки. Слева представлена регуляторная зона и 5′UTR соседнего гена CG 32075. делеции и инсерции являются трехбуквенными или кратными трем. Мы обнаружили в 5′UTR гена SuUR открытую рамку считывания (uORF, координаты которой 156–362); у D. melanogaster ее размер составляет 204 нуклеотида. Кроме этого, в 5′UTR D. melanogaster присутствуют еще 2 uORF, вложенные в первую, и одна uORF со сдвигом рамки (начальные точки обозначены на рис. 3). Эти открытые рамки считывания были транслированы для всех 8 видов. Анализ последовательности этого «upstream» белка показал, что он является достаточно консервативным (даже более консервативным, чем сам SUUR). По литературным данным в большинстве белков, в которых есть uORF в 5′UTR, upstream белок осуществляет регуляторную функцию, контролируя уровень трансляции основного гена (Vilela, McCarthy, 2003). Работы по изучению uORFs проделаны главным образом на дрожжах, грибах и млекопитающих. У дрозофилы описаны лишь несколько генов, содержащих uORF (Komonyi et al., 2005). Мутация по гену SuUR индуцирована встройкой транспозона diver в четвертый экзон гена после 366-го кодона (Makunin et al., 2002; И.В. Макунин, неопубл.). Структуру кодирующей части гена SuUR изучали, используя три подхода: 1) с помощью методов биоинформатики (рис. 4); 2) в двугибридной дрожжевой системе; 3) путем анализа доминантно-негативных мутаций и трансгенных конструкций. 1. Анализ геномных последовательностей кодирующей части гена (UCSC site, http:// genome.ucsc.edu) 8 видов дрозофил показал, что белок SUUR быстро эволюционирует, содержит большое количество замен, которые распределены по нему неравномерно. Наиболее консервативной является N-концевая часть белка, в ней отсутствуют инсерции и делеции (рис. 4а), средняя часть молекулы белка SUUR наименее консервативна – максимальное количество замен, делеций и инсерций находится в этой части белковой молекулы. И наконец, С-концевая часть также достаточно консервативна. У ортологов гена SuUR, найденных у других видов дрозофил, сохраняются домены, изначально описанные у D. melanogaster. N-концевая часть белка (SUUR28-253) имеет умеренную гомологию к SWI2/SNF2-домену белков группы хроматинового ремоделинга. Полипептиды SWI2/SNF2 принадлежат к группе NTP-связывающих белков, куда входят РНК Рис. 4. Структура кодирующей части гена SuUR (объяснения в тексте). Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 135 136 и ДНК-геликазы и ДНК-зависимые АТФазы. SWI- и SNF-полипептиды обнаружены во многих мультибелковых комплексах, выполняющих многочисленные функции в клетке: активаторы или репрессоры транскрипции, белки ремоделинга хроматина и репарации ДНК. Как известно, АТФ-зависимые ремоделеры хроматина служат своего рода молекулярными моторами, изменяющими доступность ДНК в хроматине, регулируя, таким образом, многие этапы транскрипции и репликации (Havas et al., 2001). Наименее консервативной является средняя часть белка, содержащая аминокислоты 271–673, в которой находятся сигналы ядерной локализации и кластеры заряженных аминокислот. Несмотря на большое количество замен в этой части, которым подвержены и заряженные аминокислоты, кластеры у большинства видов сохраняются, так же как и суммарный заряд белка. Это дает возможность предположить, что в этой части белка заряд значительно важнее, чем аминокислотная последовательность. У всех видов, кроме D. mojavensis, сохраняются также сигналы ядерной локализации, и у 4 видов есть AT-hook-подобный элемент (А.А. Yurlova et al., in preparation). С-концевой фрагмент молекулы белка (SUUR674-962) также достаточно консервативен (рис. 4а), но в нем не выявлено никаких известных мотивов. 2. Участок молекулы белка SUUR между аминокислотами 339 и 671 (рис. 4е) необходим для связывания с молекулой другого гетерохроматинового белка HP1, что было выявлено при анализе комплексообразования молекул белков в двугибридной системе дрожжей (Pindyurin et al., 2008, in press). 3. Домены в структуре белка SUUR представлены на рис. 4б. Как уже упоминалось выше, увеличение дозы белка приводит к перераспределению белка HP1 в хромосомах, недорепликации в районах ИГХ, в результате постоянной сверхэкспрессии в клетках слюнных желез или в фолликулярных клетках яичников происходит подавление соответственно политенизации хромосом и амплификации хорионовых генов (рис. 4б). В результате короткой сверхэкспрессии в хромосомах слюнных желез районы ИГХ декомпактизуются, и в них образуются вздутия («swellings», или «пузыри») Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 (Volkova et al., 2003; Zhimulev et al., 2003с; Колесникова и др. 2006). Анализ функций доменов в молекуле белка SUUR проводили, используя трансгенные конструкции, полученные двумя основными способами. Первый – это in vivo-мутирование транспозона, содержащего полноразмерный ген SuUR+, и отбор линий, у которых исчезает эффект, вызванный сверхэкспрессией полноразмерного транспозона. Это так называемые доминантно-негативные мутации. В результате было получено несколько транспозонов, дающих усеченные (обрезанные с С-конца) фрагменты молекулы белка (рис. 4в). Второй способ – это получение направленных мутаций в кДНК SuUR (точечных и делеции N-конца) (рис. 4г, д) с подшитыми к ним маркерами, с последующей трансформацией этих транспозонов, и индукция их активности драйверами, обеспечивающими различные варианты экспрессии: постоянную в клетках слюнных желез (AB1), мозаичную в клетках слюнных желез (Arm), только под действием гормона экдизона в клетках слюнных желез в течение последних 24 часов личиночного развития (Sgs3) (Zhimulev et al., 2003с; Kolesnikova et al., 2005). В результате анализа экспрессии трансгенных мутаций выяснили, что: а) способностью вызывать доминантно-негативный эффект обладают все исследованные усеченные фрагменты молекулы SUUR (rs2-rs5). Это означает, что вступить в состав белкового комплекса, в котором участвует SUUR, может даже самый короткий фрагмент этого белка, rs2 (или SUUR1-360). Однако, если SUUR1-360 делает это, не связываясь с участками хромосом, то более длинные фрагменты (rs3-rs5) связываются с хромосомой, удаляя при этом эндогенный SUUR из сайтов его нормальной локализации. Фрагмент SUUR495-962 не вызывает доминантно-негативного эффекта (рис. 4в) (Kolesnikova et al., 2005); б) способность связываться с хромосомой в значительной степени зависит от длины фрагмента. Нормальная, т. е. специфичная для интеркалярного гетерохроматина локализация выявлена для фрагментов rs3-rs5, однако фрагмент rs3 локализуется хотя и в районах ИГХ, но своеобразно – не в виде дисков в политенных хромосомах, а в виде отдельных глобул, распо- Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 ложенных в районах ИГХ и прицентромерного гетерохроматина. Фрагмент SUUR495-962 способен специфически связываться с ИГХ при слабой сверхэкспрессии; этот фрагмент содержит почти половину района 360-599аа. Более короткий фрагмент SUUR669-962, не имеющий участка 360-599, утрачивает способность специфически связываться с хромосомой (рис. 4 г). Таким образом, для нормальной локализации белка SUUR в хромосомах необходим цельный участок, содержащий положительно заряженные аминокислоты и NLS, т. е. примерно SUUR360-599 (Kolesnikova et al., 2005). Это довольно точно соответствует фрагменту 339–671, который по результатам анализа в двугибридной дрожжевой системе связывается с chromoshadow-доменом белка HP1 (рис. 4е). Встройка транспозона diver, приводящая к формированию всех мутантных фенотипов, повреждает также этот домен, поскольку произошла немного выше, а именно в положении 366 (рис. 4б). Второй участок, необходимый для связывания с хромосомами, расположен в пределах SNF-like-домена, поскольку у мутантов по этому району способность связываться с хромосомами резко ослаблена (рис. 4д), возможно, из-за нарушения взаимодействия с АТФазой. Недавно открытое свойство белка SUUR перераспределять HP1 в хромосомах при сверхэкспрессии гена SuUR (Pindyurin et al., 2008, in press) также зависит от наличия в белке SuUR фрагмента 360–671 (rs5 1-799). Есть третий участок, обеспечивающий связывание белка SUUR с хромосомой: при сверхэкспрессии фрагмента A8 (SUUR669-962), не имеющего фрагмента 360–599, выявляется сплошное неспецифическое мечение всех хромосом. Этот результат также косвенно свидетельствует о том, что для специфической локализации белка необходима средняя часть молекулы; в) подавление политенизации хромосом, приводящее к формированию в клетках слюнных желез карликовых ядер без политенизации хромосом, происходит при постоянной сверхэкспрессии целой молекулы белка (рис. 4б); аналогичный, но более слабый эффект наблюдается при сверхэкспрессии единственного из усеченных фрагментов – С17(495-962). Отсутствие супрессии политенизации при сверхэкспрессии 137 A8 (SUUR669-962) и rs5 (SUUR1-779), а также слабая супрессия под влиянием транспозона с мутацией в SNF-районе (рис. 4д) свидетельствуют о том, что для осуществления этой функции необходимо одновременное присутствие в молекуле белка фрагмента связывания c HP1 (339–671) (или его части) и участка между аминокислотами 779 и 962. По-видимому, весь последний фрагмент для осуществления этой функции не нужен, так как две замены аминокислот в положениях 816–817 не приводят к ее нарушению (рис. 4д); г) влияние на недорепликацию в районах ИГХ. По-видимому, для осуществления полной репликации в отдельных районах хромосом необходимы те же самые фрагменты, что и для осуществления политенизации во всем ядре: фрагмент rs5 – SUUR 1-779 – не индуцирует недорепликацию (рис. 4в). Индуцируется недорепликация в ИГХ только при слабой сверхэкспрессии фрагмента SUUR 495-962 (рис. 4г), и это может свидетельствовать о том, что для ее индукции в ИГХ необходимы одновременно фрагменты 495–779 (или же его части) и участка 559–962. Противоречат этому заключению данные об отсутствии недорепликации при сверхэкспрессии транспозона, мутантного по SNF-like-домену, несмотря на то, что оба эти фрагмента в молекуле белка присутствуют. Можно предположить, что в результате замены двух аминокислот произошло изменение третичной структуры всей молекулы, в результате чего проявление функций белка ослаблено, несмотря на наличие необходимых доменов, возможно, из-за слабого связывания белка с хромосомой (см. рис. 4д); д) формирование «пузырей» обнаруживается только при одновременном наличии полного фрагмента 360–599аа и N-концевой части белка. Таким образом, можно представить, что центральная часть молекулы SuUR связывается с «chromoshadow» доменом HP1, и этот комплекс транспортируется в соответствующие участки хромосом. При этом за связывание с нужными генами и осуществление функций отвечают домены с N- и C-концов. В онтогенезе ген SuUR функционирует в клетках с политенными хромосомами (слюнные железы, питающие клетки ооцитов) (Makunin et 138 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 al., 2002; Volkova et al., 2003), в делящихся клетках или клетках полового пути (Колесникова и др., 2006). При этом уровень экспрессии гена постоянно понижается в ходе эмбрионального развития и после стадий 1–8 становится совсем низким (Makunin et al., 2002). Организация районов интеркалярного гетерохроматина – кластеры скоординированно функционирующих генов Вопрос о генетическом составе интеркалярного гетерохроматина долгое время оставался открытым. Первым районом, для которого были определены границы зоны недорепликации, стал район 89DE, в котором располагается Bithorax-Complex (Moshkin et al., 2001). Оказалось, что зона недорепликации занимает около 300 т.п.н. и содержит около 30 генов. При этом ее наиболее недореплицированная часть содержит менее 5 % нитей ДНК по сравнению с эухроматиновыми районами. Как и ожидалось, у мутантов SuUR– весь район 89E политенизируется полностью, наравне с окружающим эухроматином (рис. 5). Для того чтобы исследовать генетический состав остальных районов интеркалярного гетерохроматина, был необходим новый подход. Технология микрочипов, позволяющая проводить одновременный анализ представленности десятков тысяч последовательностей, была адаптирована для решения этой задачи. В качестве образцов использовали ДНК из слюнных желез личинок линии, в которой недорепликация районов интеркалярного гетерохроматина усилена по сравнению с нормой за счет двух дополнительных трансгенных копий гена SuUR, и ДНК из мутантов по гену SuUR. Совместная гибридизация этой ДНК с микрочипом, содержащим около 12 тыс. генов дрозофилы, позволила построить геномную карту политенизации ДНК. На основании этой карты были выявлены 52 района недорепликации, содержащие более 1 тыс. генов (Belyakin et al., 2005). Этот результат позволил провести более глубокий функциональный анализ районов интеркалярного гетерохроматина с использованием результатов независимых геномных исследований. Так, оказалось, что 50 из 52 районов, выявленных в слюнных железах, являются поздно реплицирующимися в культуре эмбриональных клеток (Kc) дрозофилы согласно ранее опубликованным данным (Schubeler et al., 2002). Этот факт указывает на то, что механизм, регулирующий время их репликации, является универсальным и может осуществляться в широком диапазоне клеточных типов, включающих как политенные, так и делящиеся ткани. По-видимому, то же можно сказать и про механизм регуляции экспрессии генов в этих районах. В подтверждение этого было показано, что обнаруженные нами районы обогащены группами совместно регулируемых генов, охарактеризованными в работе Spellman и Rubin (2002) как транскрипционные территории. Эти группы содержат до 20 генов, для которых было показано сходство профилей экспрессии. Из 52 найденных нами районов недорепликации 35 содержат транскрипционные территории. Это указывает на то, что координированная регуляция репликации этих районов может быть связана с регуляцией одновременной экспрессии находящихся в них генов (см. более подробно Колесникова и др., 2006). Чтобы исследовать этот вопрос подробнее, были привлечены данные двух других исследований. В одном из них были построены профили экспрессии около 4 тыс. генов дрозофилы в течение жизненного цикла (Arbeitman et al., 2002). В другом был проведен анализ представленности транскриптов генов в библиотеках кДНК, использованных в проекте EST (Boutanaev et al., 2002). Совместный анализ этих наборов данных и данных о недореплицированных районах показал статистически достоверную неравномерность распределения по геному генов с некоторыми специфическими программами экспрессии. Так оказалось, что районы интеркалярного гетерохроматина значительно обогащены генами, задействованными в развитии тканей зародышевого пути самца дрозофилы, в то время как содержание в них генов, активных в яичниках, значительно снижено по сравнению со средним по геному. Это наблюдение дает возможность сделать предположение о том, что районы интеркалярного гетерохроматина характеризуются совместной регуляцией находящихся в них генов, которая 139 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Рис. 5. Молекулярно-цитогенетическая характеристика района 89E1-4. а – степень представленности ДНК в политенных хромосомах; б – связывание белка PC с генами в районе (по данным статьи Moshkin et al., 2001); в – связывание (+) или отсутствие (–) связывания различных белков с генами района (release 5.1). позволяет их экспрессию в тканях зародышевого пути самца и ограничивает экспрессию в соматических тканях (Belyakin et al., 2005). С целью выяснения принципов генетической организации участков интеркалярного гетерохроматина был проведен молекулярно-цитогенетический анализ индивидуального района ИГХ – района 75С1-2 политенных хромосом, для которого в рамках проекта DrosDel были получены хромосомные перестройки, картированные с точностью до нуклеотида на физической карте генома дрозофилы. Прокартировав эти же делеции цитогенетически и определив, какие части района удалены той или иной делецией, с высокой точностью установили на генетической карте границы района ИГХ (рис. 6), выяснили, какие гены там располагаются, и определили, какие участки района недореплицированы в той или иной степени. Оказалось что район ИГХ 75С1-2 простирается на длину около 450 т.п.н., в нем расположено около 25 генов, а зона недорепликации занимает только 60 % длины ДНК этого района ИГХ. В зоне недорепликации локализован участок «слабой точки», выявляемый цитологически в виде разрыва. Таким образом, в районе 75С вся группа дисков 75С1-75С2 демонстрирует характеристики интеркалярного гетерохроматина, такие, как поздняя репликация, связывание белка SUUR, образование «пузырей», в то время как недо- 140 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Рис. 6. Молекулярная и цитологическая организация района 75С. а – положение использованных ДНК-зондов (прямоугольники), звездочки обозначают положения сайтов рестрикции NotI; б – кривые степени политенизации по данным Саузерн-блот анализа для 2 копий гена SuUR (черная линия и ромбы) и по данным анализа на микрочипах для 4 копий гена SuUR (Belyakin et al., 2005) (серая линия); профиль связывания SUUR (серая пунктирная линия) (Pindyurin et al., 2007) и профиль времени репликации (черная пунктирная линия) в клетках Kc (Schübeler et al., 2002); уровень 100 % соответствует полностью политенизированным эухроматиновым последовательностям со средним временем начала репликации; в – геномные координаты хромосомы 3L D. melanogaster (release 5.1); г – положение точек разрыва хромосомных перестроек; д – положение дисков 75C1–75C2 и ряда соседних дисков, а также зоны недорепликации и зоны формирования «пузырей»; е – расположение генов (genome release 5.1); ж – расположение найденных гомологий генов (белые треугольники – в генах Met75Ca и Met75Cb, черные – в генах Drostar1 и Drostar2, серые – в генах term и CG7271; скобки объединяют гомологичные пары) и палиндромов (крестики); з – расположение транспозонов (genome release 5.1); и – связывание с генами белков SUUR, PC, ESC, SCE, Lam и гистона H3, метилированного по 27-му лизину (metH3K27); к – профиль усредненной эмбриональной экспрессии генов в районе 75ВС по данным Berkeley Drosophila Genome Project (http://www.fruitfly.org/cgi-bin/ex/insitu.pl). Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 репликация обнаружена только в части района. Похожая картина обнаружена в районах 11А6-9 (у самок), 19E1-4, 89E1-4 (рис. 7): в этих районах можно видеть разрыв-зону недорепликации с расположенными слева и справа плотными дисками, обладающими вышеперечисленными признаками гетерохроматина, кроме недорепликации. В линии SuUR эти районы представлены единичными дисками (рис. 7). Таким образом, эти 3 района ИГХ в норме так же, как и 75С, структурно сложны: зона недорепликации окружена с двух сторон районами ИГХ, но с полной политенизацией. По-видимому, зона недорепликации подвижна в пределах интеркалярного гетерохроматина. Так, при увеличении числа доз гена SuUR+ протяженность зоны недорепликации в районе 75С существенно увеличивается (Н.Г. Андреенкова и Е.Б. Кокоза, неопубл.). Еще ярче подвижность границы между полностью реплицирующимися и недореплицирующимися участками ИГХ выявляется для районов ИГХ, расположенных в Х-хромосоме. Как уже упоминали выше, в Х-хромосомах самцов недорепликация в районах ИГХ не отмечена (см. рис. 1, 2), хотя генетический состав этих районов у самцов и самок одинаков. Если же увеличить дозу белка SUUR в клетках самца Рис. 7. Морфология района 89E1-4 в политенных хромосомах дикого типа и мутанта SuUR. а – дикий тип; б – мутант SuUR. 141 за счет экспрессии трансгенов, в этих районах начинает выявляться недорепликация. Форум-домены и участки связывания белка SUUR Области хромосом эукариот, содержащие группы генов, транскрипция которых регулируется координированно, называют транскрипционными территориями (Spellman, Rubin, 2002). При помощи фракционирования больших отрезков ДНК хромосом эукариот методом пульс-электрофореза были открыты фрагменты длиной 50–150 т.н.п., названные авторами форум-доменами (Tchurikov, Ponomarenko, 1992; Tchurikov et al., 1998). С другой стороны, недавно были выявлены цис-регуляторные элементы, представляющие собой участки связывания белков из групп Polycomb и Trithorax с хромосомной ДНК, названные PRE- и TREпоследовательностями соответственно (обзор Ringrose, Paro, 2004). При изучении паттерна PRE-последовательностей (PcG response elements) в геноме дрозофилы были открыты домены длиной 50–150 т.н.п., названные PcGдоменами (Tolhius et al., 2006). Также оказалось, что PRE-последовательности присутствуют на границах выявленных форум-доменов. Было высказано предположение о том, что структура форум-доменов и PcG-доменов отражает устройство хромосомных транскрипционных территорий (Чуриков и др., 2007). Для установления соответствия между локализацией на хромосомах дрозофилы районов интеркалярного гетерохроматина и форум-доменов использовали метод торможения в геле. Было установлено, что небольшие конкретные фрагменты ДНК (300–400 п.н.), расположенные на границах форум-доменов, непосредственно связываются с белком SUUR in vitro, причем специфичность связывания была подтверждена дополнительным торможением в геле комплексов ДНК-белок при добавлении антител к белку SUUR (Tchurikov et al., 2004). С другой стороны, сопоставление размеров форум-доменов с размерами зон недорепликации в геноме дрозофилы, установленными при помощи техники микрочипов (Belyakin et al., 2005), показало, что зоны недорепликации имеют в 3–4 раза большую протяженность, чем форум-домены, 142 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 при этом белок SUUR связывается с генами, расположенными не только в интеркалярном гетерохроматине. Суммируя приведенные сведения, можно сделать следующее предположение: форум-домены представляют собой районы хромосом между участками локализации генов-мишеней белка SUUR, содержащими также и PRE-последовательности (Pindyurin et al., 2007). Поскольку в интеркалярном гетерохроматине таких генов больше, можно ожидать, что локализация концов форум-доменов будет выявляться чаще в районах интеркалярного гетерохроматина. Инактивирующий потенциал интеркалярного гетерохроматина Известно, что прицентромерный и теломерный гетерохроматин демонстрирует эффект положения в отношении генов, перенесенных в данные районы перестройками или посредством инсерций мобильных элементов. Довольно давно было показано, что экспрессия гена mini-white исключительно чувствительна к хроматиновому окружению. Таким образом, различные транспозонные конструкции, в составе которых находится данный маркерный ген, являются удобной моделью для анализа потенциальной способности районов ИГХ подавлять экспрессию генов. Недавно было проанализировано около 3500 линий мух из коллекций Bloomington и Szeged, несущих уникальные встройки P- и PiggyBacтранспозонов в эухроматиновую часть генома дрозофилы. Было выявлено, что примерно в 20 % линий ген-репортер mini-white демонстрирует в разной степени подавленную экспрессию. При этом в большинстве случаев выявлялась мозаичная экспрессия гена, характерная для классического эффекта положения. Поскольку для каждой из взятых в анализ линий позиция транспозона, содержащего ген-репортер miniwhite, ранее была прокартирована в геноме с использованием сиквенса фланкирующих последовательностей (Bellen et al., 2004), мы получили возможность сопоставить локализацию супрессированных инсерций с генами, подвергающимися недоре-пликации в районах ИГХ, при этом выделили 52 района, обогащенных недореплицированными генами и обладающих другими свойствами ИГХ (Belyakin et al., 2005). Ориентируясь на положение генов, являющихся границами указанных районов, показали, что большая часть (> 60 %) инсерций, попавших в эти районы, подверглась супрессии. Доля супрессированных инсерций по остальному геному составила менее 20 %. В районах ИГХ супрессия маркерных генов происходила как при встраивании в гены, так и в протяженные (2–10 т.п.н.) межгенные участки. При детальном анализе было показано, что существует прямая корреляция между супрессией трансгена и степенью недорепликации гена, в который он встроился. Также было показано, что супрессии могут подвергаться инсерции в любую часть гена (регуляторную, экзоны, интроны, 3′-область). Однако наиболее сильно супрессированы трансгены, встроившиеся в протяженные интроны и регуляторные области генов, а также в межгенные участки, тогда как слабая супрессия выявлялась в основном в экзонах и коротких интронах генов. Как ранее было продемонстрировано, значительная часть генов в районах ИГХ относятся к группам генов, транскрипция которых регулируется совместно (Belyakin et al., 2005). Таким образом, механизмы, лежащие в основе инактивации данных районов, так же эффективны в распространении влияния генной супрессии на «привнесенные» гены, как и классический гетерохроматин (И.В. Брусенцова, неопубл.). Картирование фрагментов ДНК в геномном проекте В последние годы работы в рамках геномного проекта дрозофилы по сиквенсу гетерохроматина (DHGP) достигли значительных успехов. Уже закончено непрерывное выравнивание последовательностей ДНК, соответствующих зонам эу-, гетерохроматинового перехода. В то же время физическая карта глубокого гетерохроматина остается прерывистой. Обогащение повторенными последовательностями существенно затрудняет выравнивание отсеквенированных фрагментов ДНК. С использованием мутаций SuUR и Su(var)3-9 разработан новый подход, который делает гетерохроматин политенных хромосом более доступным для цитологических исследований. Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 При одновременном отсутствии двух важных компонентов гетерохроматина – белков SUUR и SU(VAR)3-9 (гистон-метилтрансфераза) происходят сильная декомпактизация и супрессия недорепликации прицентромерных районов политенных хромосом, в результате чего материал, соответствующий участкам митотического гетерохроматина, становится политенизированным и приобретает воспроизводимый дисковый рисунок (Andreyeva et al., 2007; Demakova et al., 2007). Это позволило нам использовать политенные хромосомы слюнных желез двойных мутантов SuUR Su(var)3-906 для картирования как уникальных, так и повторенных фрагментов ДНК из прицентромерного гетерохроматина методом FISH с высокой степенью разрешения (до 8–10 т.п.н.). Нам удалось определить не только линейный порядок целого ряда скаффолдов на молекулярной карте гетерохроматина хромосом 2 и 3, но и в отдельных случаях установить правильную ориентацию скаффолдов на хромосоме 2 (рис. 8). Кроме того, впервые удалось визуализировать в политенных хромо- 143 сомах и точно локализовать район центромеры хромосомы 3, используя гибридизацию in situ таких его маркеров, как сателлит dodeca и BAC CHORI223-11M22 (из района h53 митотического гетерохроматина), а также иммунолокализацию специфичного для центромеры Drosophila варианта гистона H3 – белка CID. Мы полагаем, что политенные хромосомы двойных мутантов SuUR Su(var)3-906 представляют собой новую и перспективную модельную систему для картирования гетерохроматиновых последовательностей ДНК и изучения детальной организации гетерохроматиновых доменов. Недавно было обнаружено, что одновременное отсутствие этих двух структурных белков гетерохроматина – белков SUUR и гистон-метилтрансферазы SU(VAR)3-9 в хромосомах слюнных желез – приводит к уникальному феномену: образованию в проксимальной части района 20 Х-хромосомы огромной пуфоподобной структуры. Используя серию инверсий, разрывающих гетерохроматин Х-хромосомы, мы установили, что эта структура, которая воз- Рис. 8. Расположение гетерохроматиновых фрагментов в дополнительно политенизирующемся районе прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 у двойных мутантов SuUR и Su(var)3-9. 144 никает как на фоне одной мутации Su(var)3-906, так и у двойных мутантов SuUR Su(var)3-906, сформирована материалом из блоков h26-h29 митотического гетерохроматина. Уникальная зона псевдопуфа-гетерохроматина проявляет ряд необычных свойств. Будучи лишенной целого ряда белков, характерных как для активного хроматина, так и для гетерохроматина, она оказалась обогащенной структурными гетерохроматиновыми белками SU(VAR)3-7, а у мутантов Su(var)3-9 еще и SUUR. Кроме того, в состоянии псевдопуфа у мутантов SuUR Su(var)3-906 этот участок политенной Х-хромосомы заканчивает репликацию значительно раньше, чем когда он представлен компактным блоком у личинок дикого типа. Наконец, недорепликация по крайней мере некоторых фрагментов ДНК в составе псевдопуфа сильно супрессирована (Demakova et al., 2007). Необычные структурные модификации дисков интеркалярного гетерохроматина («пузыри») Сверхэкспрессия гена SuUR запускает процессы необычных обратимых изменений в политенной хромосоме: районы гетерохроматина декомпактизуются и образуют в своих пределах хроматиновые структуры, названные нами «пузыри» (swellings), представляющие собой хорошо заметные вздутия с четкой границей и сложной внутренней структурой (Zhimulev и др. 2003с). Для создания подходов к выяснению механизмов образования «пузырей» мы проверили, связана ли сверхэкспрессия гена SuUR с работой PARP – декомпактизатора хроматина. Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) является высококонсервативным ядерным белком, характерным для всех высших эукариот. Большую часть времени подавляющее большинство молекул PARP находится на хромосомах в неактивном состоянии. Повреждение или изменение конформации ДНК вблизи молекулы PARP или же другие, еще не изученные сигналы активируют полимеразу. PARP принимает участие в процессах репарации, элонгации теломер, транскрипции генов, активирующихся при стресс-ответе: фермент рибозилирует все близкорасположенные белки (включая и самих себя), синтезируя длинные цепочки рибозы, ко- Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 валентно присоединенные к модифицируемому белку. Такая модификация хроматина приводит к локальному обратимому разрыхлению хроматина. Показана необходимость участия PARP в процессах образования пуфов теплового шока у дрозофилы (Tulin, Spradling, 2003). Линия мух, содержащая транспозон UAS/ PARP-GFP, была любезно предоставлена нам проф. A. Спрадлингом (США). В результате скрещивания нами были получены личинки, несущие в геноме транспозоны UAS/PARPGFP, UAS/SUUR и Sgs3/GAL4 одновременно. Сверхэкспрессия только одного транспозона UAS/PARP-GFP не приводит к образованию «пузырей». Анализ результатов эктопической одновременной экспрессии белков SUUR и PARP показал, что процессы изменения структуры хроматина, характерные для сверхэкспрессии SUUR и приводящие к образованию «пузырей», происходят и при совместной сверхэкспрессии белков SUUR и PARP: районы гетерохроматина декомпактизуются и образуют в своих пределах хорошо заметные вздутия с четкой границей. Одним из наиболее эффективных ингибиторов PARP считается бензамид /benzamide/ (Virag, Szabo, 2002). Мы провели серию экспериментов для выяснения возможного участия фермента PARP в процессах изменения хроматина при образовании пузырей, при этом использовали совместную сверхэкспрессию белков SUUR и PARP. Скармливая личинкам дрозофил корм, содержащий бензамид в различных концентрациях (0, 0,005, 0,05 и 0,5 mM), мы установили, что хотя присутствие ингибитора и влияет на жизнеспособность, оно никак не отражается на выявляемости «пузырей». Таким образом, процессы возникновения «пузырей», их развития и поддержания структуры не требуют участия активированной PARP (рис. 9). Пространственная организация политенных хромосом в ядрах слюнных желез Drosophila melanogaster Как известно, белок SUUR влияет на образование эктопических контактов. При помощи конфокальной микроскопии нами было исследовано расположение хромосом внутри ядра в линиях, несущих разное количество 145 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Рис. 9. Формирование «пузырей» при оверэкспрессии белка SUUR при активированной PARP и в присутствии бензамида – ингибитора PARP. а – при действии активированной PARP; б – в присутствии бензамида (0,5 mM) при снижении жизнеспособности личинок дрозофилы и ухудшении структуры хромосом. «Пузыри» указаны стрелками. доз гена SuUR, и было показано, что по мере повышения дозы гена SuUR происходит отхождение хромосом к мембране ядра, центральное пространство, не заполненное хромосомами, возрастает (рис. 10). Полученные данные могут быть объяснены усилением эктопической конъюгации между районами недорепликации при увеличении количества белка SUUR, которая приводит к распластыванию хромосом по внутренней мембране ядра. Кроме того, было обнаружено, что изменение пространственной организации ядра происходит на этапе примерно 25–30 час. после откладки яиц, что соответствует времени вылупления личинки первого возраста. В дальнейшем обнаруженный нами эффект отхождения хромосом к периферии ядра сохраняется независимо от времени остановки сверхэкспрессии гена SuUR, что говорит о его стабильности. Более ранняя индукция сверхэкспрессии не оказывает видимого влияния на пространственную организацию ядра. В трехмерной организации хромосом внутри ядра помимо эктопических контактов хромосом принимают участие и контакты хромосом с внутренней ядерной мембраной. Одним из компонентов ядерной ламины, участвующим в закреплении хромосом на мембране, является белок lamin Dm0. При одновременном окрашивании хромосом слюнных желез антителами на белки lamin и SUUR было обнаружено, что при увеличении дозы гена SuUR количество сайтов на хромосомах, в которых удается выявить антитела к белку lamin, уменьшается (рис. 10). Это, возможно, объясняется конкуренцией белков SUUR и lamin за сайты связывания на хромосомах. При свехэкспрессии гена SuUR антитела к белку lamin Dm0 выявлялись во множестве нехарактерных сайтов. Проведенный нами анализ взаимодействия белков lamin Dm0 и SUUR в двугибридной дрожжевой системе не подтвердил гипотезу о существовании какого-либо взаимодействия между ними (данные не показаны). Возможно, взаимодействие этих белков происходит через посредство белка-партнера, общего для белков SUUR и lamin Dm0. Благодарности Работа была поддержана грантом № 10.1 программы президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Молекулярная и клеточ- 146 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Рис. 10. Влияние количества доз гена SuUR на пространственное расположение хромосом в ядрах клеток слюнных желез и на локализацию белка lamin на хромосомах. а – центральные оптические срезы ядер в линиях мух, несущих различное количество доз гена SuUR; по мере возрастания количества доз гена SuUR происходит отхождение хромосом к мембране ядра; б – результаты иммуноокрашивания давленых препаратов политенных хромосом антителами к белку lamin. Верхний ряд: фазовый контраст; нижний ряд: иммуноокрашивание антителами к белку lamin. ная биология); междисциплинарным интеграционным проектом СО РАН № 45 (Парадокс размера геномов: изучение роли избыточной информации); государственными контрактами № 02.512.11.2065 (Направленные изменения структуры генома – новый подход к управлению активностью генов) и № 02.512.11.2145 (Разработка новых методов регуляции транскрипции: реорганизация хроматина); грантами РФФИ № 06.04.48387 и № 06.04.49305. Литература Волкова Е.И., Белякин С.Н., Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. Распределение разрывов индуцированных хромосомных перестроек по длине хромосом и проблема интеркалярного гетеро- хроматина Drosophila melanogaster // Генетика. 2008. В печати. Колесникова Т.Д., Андреева Е.А., Пиндюрин А.В. и др. Ген SuUR и его участие в организации эпигенетически репрессированных районов хромосом Drosophila melanogaster // Генетика. 2006. Т. 42. № 8. С. 1013–1028. Прокофьева-Бельговская А.А., Хвостова В.В. Распределение разрывов в Х-хромосоме Drosophila melanogaster // Докл. АН СССР. 1939. Т. 23. С. 269–271. Чуриков Н.А., Сосин Д.В., Кретова О.В., Моисеева Е.Д. Функциональный анализ последовательностей LCR из локуса cut дрозофилы // Докл. РАН. 2007. Т. 415. № 5. С. 1–5. Alekseyenko A.A., Demakova O.V., Belyaeva E.S. et al. Dosage compensation and intercalary heterochromatin in X chromosomes of Drosophila melanogaster // Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 Chromosoma. 2002. V. 111. P. 106–113. Andreyeva E.N., Kolesnikova T.D., Demakova O.V. et al. High-resolution analysis of Drosophila heterochromatin organization using SuUR Su(var)3-9 double mutants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 12819–12824. Arbeitman M.N., Furlong E.E., Imam F. et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster // Science. 2002. V. 297. P. 2270–2275. Bellen H.J., Levis R.W., Liao G. et al. The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40 % of Drosophila genes // Genetics. 2004. V. 167. P. 761–781. Belyaeva E.S., Boldyreva L.V., Volkova E.I. et al. Effect of the Suppressor of Underreplication (SuUR) gene on position-effect variegation silencing in Drosophila melanogaster // Genetics. 2003. V. 165. P. 1209–1220. Belyaeva E.S., Demakov S.A., Pokholkova G.V. et al. DNA underreplication in intercalary heterochromatin regions in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster correlates with the formation of partial chromosomal aberrations and ectopic pairing // Chromosoma. 2006. V. 115. P. 355–366. Belyaeva E.S., Demakova O.V., Umbetova G.H., Zhimulev I.F. Cytogenetic and molecular aspects of positioneffect variegation in Drosophila melanogaster. V. Heterochromatin-associated protein HP1 appears in euchromatic chromosomal regions that are inactivated as a result of position-effect variegation // Chromosoma. 1993. V. 102. P. 583–590. Belyaeva E.S., Zhimulev I.F., Volkova E.I. et al. Su(UR)ES: a gene suppressing DNA underreplication in intercalary and pericentric heterochromatin of Drosophila melanogaster polytene chromosomes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 7532–7537. Belyakin S.N., Christophides G.K., Alekseyenko A.A. et al. Genomic analysis of Drosophila chromosome underreplication reveals a link between replication control and transcriptional territories // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 8269–8274. Boutanaev A.M., Kalmykova A.I., Shevelyov Y.Y., Nurminsky D.I. Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome // Nature. 2002. V. 420. P. 666–669. Bridges C.B. Salivary chromosome map with a key to the banding of the chromosomes of Drosophila melanogaster // J. Hered. 1935. V. 26. P. 60–64. Demakova O.V., Pokholkova G.V., Kolesnikova T.D. et al. The SU(VAR)3-9/HP1 complex differentially regulates the compaction state and degree of underreplication of X chromosome pericentric heterochromatin in Drosophila melanogaster // Genetics. 2007. V. 175. P. 609–-620. 147 Gorman M., Franke A., Baker B.S. Molecular characterization of the male-specific lethal-3 gene and investigations of the regulation of dosage compensation in Drosophila // Development. 1995. V. 121. P. 463–475. Havas K., Whitehouse I., Owen-Hughes T. ATPdependent chromatin remodeling activities // Cell Mol. Life Sci. 2001. V. 58. P. 673–682. Kaufmann B.P. Distribution of induced breaks along the X-chromosome of Drosophila melanogaster // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1939. V. 25. P. 571–577. Kelley R.L., Wang J., Bell L., Kuroda M.I. Sex lethal controls dosage compensation in Drosophila by a non-splicing mechanism // Nature. 1997. V. 387. P. 195–199. Kolesnikova T.D., Makunin I.V., Volkova E.I. et al. Functional dissection of the Suppressor of UnderReplication protein of Drosophila melanogaster: identification of domains influencing chromosome binding and DNA replication // Genetica. 2005. V. 124. P. 187–200. Komonyi O., Pápai G., Enunlu I. et al. DTL, the Drosophila homolog of PIMT/Tgs1 nuclear receptor coactivatorinteracting protein/RNA methyltransferase, has an essential role in development // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 12397–12404. Koryakov D.E., Reuter G., Dimitri P., Zhimulev I.F. The SuUR gene influences the distribution of heterochromatic proteins HP1 and SU(VAR)3-9 on nurse cell polytene chromosomes of Drosophila melanogaster // Chromosoma. 2006. V. 115. P. 296–310. Leach T.J., Chotkowski H.L., Wotring M.G. et al. Replication of heterochromatin and structure of polytene chromosomes // Mol. Cell Biol. 2000. V. 20. P. 6308–6316. Lucchesi J.C., Kuroda M.I. Dosage compensation in Drosophila / Eds C.D. Allis, T. Jenuwein, D. Reinberg. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2006. P. 307–320. Madigan J.P., Chotkowski H.L., Glaser R.L. DNA double-strand break-induced phosphorylation of Drosophila histone variant H2Av helps prevent radiation-induced apoptosis // Nucl. Acids Res. 2002. V. 30. P. 3698–3705. Makunin I.V., Volkova E.I., Belyaeva E.S. et al. The Drosophila Suppressor of Underreplication protein binds to late-replicating regions of polytene chromosomes // Genetics. 2002. V. 160. P. 1023–1034. Moshkin Y.M., Alekseyenko A.A., Semeshin V.F. et al. The bithorax complex of Drosophila melanogaster: Underreplication and morphology in polytene chromosomes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 570–574. Moshkin Y.M., Belyakin S.N., Rubtsov N.B. et al. Microdissection and sequence analysis of peri- 148 centric heterochromatin from the Drosophila melanogaster mutant Suppressor of Underreplication // Chromosoma. 2002. V. 111. P. 114–125. Painter T.S. A new method for the study of chromosome aberrations and the plotting of chromosome maps in Drosophila melanogaster // Genetics. 1934. V. 19. P. 175–188. Pindyurin A.V., Boldyreva L.V., Shloma V.V. et al. Interaction between the Drosophila heterochromatin proteins SUUR and HP1 // J. Cell Sci. 2008. (in press). Pindyurin A.V., Moorman C., de Wit E. et al. SUUR joins separate subsets of PcG, HP1 and B-type lamin targets in Drosophila // J. Cell Sci. 2007. V. 120. P. 2344–2351. Pokholkova G.V., Makunin I.V., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Observations on the induction of position effect variegation of euchromatic genes in Drosophila melanogaster // Genetics. 1993. V. 134. P. 231–242. Ringrose L., Paro R. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins // Annu. Rev. Genet. 2004. V. 38. P. 413–443. Schübeler D., MacAlpine D.M., Scalzo D. et al. The histone modification pattern of active genes revealed through genome-wide chromatin analysis of a higher eukaryote // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 1263–1271. Schubeler D., Scalzo D., Kooperberg C. et al. Genomewide DNA replication profile for Drosophila melanogaster: a link between transcription and replication timing // Nat. Genet. 2002. V. 32. P. 438–442. Semeshin V.F., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Electron microscope mapping of the pericentric and intercalary heterochromatic regions of the polytene chromosomes of the mutant Suppressor of underreplication in Drosophila melanogaster // Chromosoma. 2001. V. 110. P. 487–500. Slizynski B.M. «Ectopic» pairing and the distribution of heterochromatin in the X-chromosome of salivary gland nuclei of Drosophila melanogaster // Proc. R. Soc. Edinburgh. 1945. V. 62. P. 114–119. Spellman P.T., Rubin G.M. Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome // J. Biol. 2002. V. 1. A. 5. Tchurikov N.A., Krasnov A.N., Ponomarenko N.A. Forum domain in Drosophila melanogaster cut locus possesses looped domains inside // Nucl. Acids Res. 1998. V. 26. P. 3221–3227. Tchurikov N.A., Kretova O.V., Chernov B.K. et al. SuUR protein binds to the boundary regions separating forum domains in Drosophila melanogaster // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 11705–11710. Tchurikov N.A., Ponomarenko N.A. Detection of Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 DNA domains in Drosophila, human, and plant chromosomes possessing mainly 50- to 150-kilobase stretches of DNA // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 6751–6755. Tolhuis B., de Wit E., Muijrers I. et al. Genome-wide profiling of PRC1 and PRC2 Polycomb chromatin binding in Drosophila melanogaster // Nat. Genet. 2006. V. 38. P. 694–699. Tulin A., Spradling A. Chromatin loosening by poly(ADP)-ribose polymerase (PARP) at Drosophila puff loci // Science. 2003. V. 299. P. 560–562. van Steensel B., Delrow J., Henikoff S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase // Nat. Genet. 2001. V. 27. P. 304–308. Vilela C., McCarthy J.E. Regulation of fungal gene expression via short open reading frames in the mRNA 5’untranslated region // Mol. Microbiol. 2003. V. 49. P. 859–867. Virag L., Szabo C. The therapeutic potential of poly(ADPribose) polymerase inhibitors // Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 375–429. Volkova E.I., Zhimulev I.F. Development time of stocks, containing different doses of Suppressor of underreplication (Su(UR)ES) gene in Drosophila melanogaster // Drosophila Inform. Serv. 2001. V. 84. P. 48–49. Volkova E.I., Yurlova A.A., Kolesnikova T.D. et al. Ectopic expression of the Suppressor of Underreplication gene inhibits endocycles but not the mitotic cell cycle in Drosophila melanogaster // Mol. Genet. Genomics. 2003. V. 270. P. 387–393. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Bolshakov V.N., Mal’ceva N.I. Position-effect variegation and intercalary heterochromatin: a comparative study // Chromosoma. 1989. V. 98. P. 378–387. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Makunin I.V. et al. Influence of the SuUR gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes // Chromosoma. 2003a. V. 111. P. 377–398. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Makunin I.V. et al. Intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes and the problem of genetic silencing // Genetica. 2003b. V. 117. P. 259–270. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Semeshin V.F. et al. Overexpression of the SuUR gene induces reversible modifications at pericentric, telomeric and intercalary heterochromatin of Drosophila melanogaster polytene chromosomes // J. Cell Sci. 2003с. V. 116. P. 169–176. Zhimulev I.F., Vlassova I.E., Belyaeva E.S. Cytogenetic analysis of the 2B3-4-2B11 region of the X chromosome of Drosophila melanogaster. III. Puffing disturbance in salivary gland chromosomes of homozygotes for mutation l(1)pp1t10 // Chromosoma. 1982. V. 85. P. 659–672. 149 Вестник ВОГиС, 2008, Том 12, № 1/2 SuUR GENE – A UNIQUE INSTRUMENT FOR THE STUDY OF STRUCTURE AND ORGANIZATION OF DROSOPHILA CHROMOSOMES AND GENOME I.F. Zhimulev, E.S. Belyaeva, N.G.Andreenkova, E.N. Andreeva, S.N. Belyakin, L.V. Boldyreva, I.V. Brusentsova, E.I. Volkova, S.A. Demakov, O.V. Demakova, E.A. Zarutskaya, I.A. Zykov, E.B. Kokoza, T.D. Kolesnikova, U.A. Komor, D.E. Koryakov, I.V. Makunin, A.V. Pindyurin, G.V. Pokholkova, V.F. Semeshin, V.V. Shloma, A.A. Yurlova Institute of Cytology and Genetics, SB RAS, Novosibirsk, Russia, e-mail: zhimulev@bionet.nsc.ru Summary Exhaustive review on the structure of SuUR (Suppressor of UnderReplication) gene as well as its role in studies of genome and chromosome organization is presented. SuUR is the only known gene controlling the process of completion of DNA replication. In the SuUR mutant replication completes earlier than in wild type and, as a consequence, underrelication is completely suppressed in the regions of intercalary and partially in the pericentric heterochromatin. The SUUR protein is localized in polytene chromosome in the regions of late replication. The protein contains, at least, three functional domains responsible for specific functions: binding to chromosome regions of late replication, control of polytenization of chromosomes and underreplication of intercalary heterochromatin regions. Blocks of coordinately activated genes located in regions of late replication are targets of the SUUR protein. These blocks comprise up to 7 % of Drosophila genome, the genes in blocks alongside SUUR bind such proteins as HP1, Lamin and Pc. Partial suppression of underreplication of pericentric heterochromatin in the SuUR mutant results in formation of rather long fragments of pericentric heterochromatin («Plato atlantis»), which permits mapping of the DNA clones normally underrepresented in polytene chromosomes. These clones could not be mapped relatively each other using other approaches. The SUUR protein influences spatial structure of the nuclei containing polytene chromosomes.
