государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия»
advertisement
1 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи ВАХРОМЕЕВА Ксения Александровна ПОЛИМОРФНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2-го ТИПА И ИХ АССОЦИАЦИИ С КЛИНИКОМЕТАБОЛИЧЕСКИМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ 14.01.02 - эндокринология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Суплотова Людмила Александровна Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович Тюмень - 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ……………………………………...……………… ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………......... ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. САХАРНЫЙ ДИАБЕТ 2-го ТИПА КАК МНОГОФАКТОРНОЕ ЗАБОЛЕВАНИЕ ……………………………….. 1.1 Полиморфные генетические маркеры, ассоциированные ссахарным диабетом 2-го типа, в европейских популяциях………………. 1.1.1 Исследование генов-кандидатов сахарного диабета 2-го типа … 1.1.2 Анализ сцепления полиморфных генетических маркеров с сахарным диабетом 2-го типа …………………………………….. 1.1.3 Полногеномный поиск ассоциаций полиморфных генетических маркеров с сахарным диабетом 2-го типа ………......................... 1.2 Полиморфные генетические маркеры, ассоциированные ссахарным диабетом 2-го типа, в восточноазиатских и южноазиатских популяциях …………………………………………………………………… ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………… 2.1 Дизайн исследования…………………………………………….............. 2.2 Общая характеристика обследованных групп…………………............ 2.3 Методы исследования…………………………………………….. …… 2.4 Генотипирование и отбор генетических маркеров……………............. 2.5 Статистическая обработка данных …………………………………….. ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ И ГОРМОНАЛЬНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ ГЛАВА 4. АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ ИССЛЕДУЕМЫХ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-го ТИПА В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ ……………………… 4.1 Распределение частот аллелей и генотипов rs8050136 и rs11642841 гена FTO у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля ……………………………………………………………………… 4.2 Распределение частот аллелей и генотипов rs571312 гена MC4R у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля…..…………………………………………………………………… 4.3 Распределение частот аллелей и генотипов rs2943634 и rs2943641 гена IRS1 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля………………………………………………………………………. 4.4 Распределение частот аллелей и генотипов rs4402960 и rs1470579 4 5 12 14 14 17 18 24 30 30 32 35 38 46 49 61 63 66 67 70 3 гена IGF2BP2 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля ……………………………………………………………………… 4.5 Распределение частот аллелей и генотипов rs163184 гена KCNQ1 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля…………. 71 4.6 Распределение частот аллелей и генотипов rs11924032 гена SLC2A2 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля ………… 72 4.7 Распределение частот аллелей и генотипов rs7172432 гена C2CD4A и rs11634397 гена ZFAND6 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля ……………………………………………………………… 74 4.8 Анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов полиморфных генетических маркеров генов FTO, MC4R, IRS1, C2CD4A, IGF2BP2, KCNQ1, SLC2A2 и ZFAND6 у больных с сахарным диабетом 2-го типа … 76 ГЛАВА 5. АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ ИССЛЕДУЕМЫХ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ С КЛИНИЧЕСКИМИ И МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ ПРОЯВЛЕНИЯМИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2го ТИПА В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ ………... 78 5.1.Анализ ассоциаций исследуемых полиморфных генетических маркеров с ожирением....................................................................................... 79 5.2. Анализ ассоциаций исследуемых полиморфных генетических маркеров с инсулинорезистентностью ……………………………………... 86 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………….......... 93 ВЫВОДЫ …………………………………………………………....................... 104 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………....................... 106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………. 107 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ АД ВОЗ ГЛЮТ-2 ДАД ДН ДНК ДП ДР ИБС ИМТ ИР ИРИ ЛПВП ЛПНП ОБ ОНП ОТ ОТ/ОБ ПГТТ ПССП РФ САД СД2 СКФ США ХБП ТГ ХС A C G HOMA-В HOMA-IR ОR T - артериальная гипертензия - артериальное давление - Всемирная организация здравоохранения - транспортер глюкозы типа 2 - диастолическое артериальное давление - диабетическая нефропатия - дезоксирибонуклеиновая кислота - диабетическая полинейропатия - диабетическая ретинопатия - ишемическая болезнь сердца - индекс массы тела - инсулинорезистентность - иммунореактивный инсулин - липопротеиды высокой плотности - липопротеиды низкой плотности - окружность бедер - однонуклеотидный полиморфизм - окружность талии - индекс отношения окружности талии к окружности бедер - пероральный глюкозо-толерантный тест - пероральные сахароснижающие препараты - Российская Федерация - систолическое артериальное давление - сахарный диабет 2-го типа - скорость клубочковой фильтрации - Соединенные Штаты Америки - хроническая болезнь почек - триглицериды - холестерин - аденин - цитозин - гуанин - индекс функциональной активности В-клеток поджелудочной железы - индекс инсулинорезистентности - отношение шансов - тимин 5 ВВЕДЕНИЕ В настоящее время сахарный диабет 2-го типа (СД2) является наиболее частой формой сахарного диабета и характеризуется развитием специфических микро- и макрососудистых осложнений, приводящих к ранней инвалидизации и преждевременной смерти пациентов. Медицинская и социальная значимость СД2 обусловливает особую роль мероприятий по его профилактике и мер по предупреждению осложнений [122, 153, 174]. По своей природе СД2 – генетически детерминированное заболевание с полигенным типом наследования. Сегодня вследствие активного внедрения в практику технологических достижений современной медицинской науки, а в частности, методов молекулярно-генетического анализа, становится возможным формирование подходов к профилактике и доклинической диагностике СД2, базирующихся на пониманиимолекулярных основ его этиологии и патогенеза. В последние годы активно изучаются генетические аспекты развития СД2, его осложнений и сопутствующих метаболических нарушений во многих популяциях. В настоящий момент во французской [71], финской и шведской [142], британской [200], исландской [81], китайской [72], японской [74] популяциях установлены группы полиморфных генетических маркеров, ассоциированных с развитием СД2. Однако несмотря на понимание значительной роли наследственных факторов в формировании СД2, генетическая составляющая, ответственная за его развитие, до сих пор не установлена. Объединение в мета-анализы популяционных данных также не дало однозначного ответа на вопрос о генетическом дефекте при СД2 [103, 166]. Очевидно, это связано с его сложной природой необходимостью как многофакторного исследования роли заболевания, большого числа то есть с полиморфных генетических маркеров, их взаимодействий, а также взаимосвязей между наследственной предрасположенностью и средовыми факторами. 6 Разнообразие генетических маркеров, характерных для различных популяционных групп, подтверждает также особую значимость этнической составляющей для выявления наследственных рисков. В русской популяции в настоящее время исследованы отдельные гены-кандидаты [5, 49, 54, 83, 213, 218], что определяет актуальность и необходимость подробного, комплексного изучения генетических основ СД2 в русской популяции с учетом тестирования аллельных вариантов многих генов-кандидатов, анализа их сочетаний, а также ассоциаций с клиническими и гормональнометаболическими проявлениями заболевания. Данное исследование выполнено в рамках государственногоконтракта по программе «СТАРТ-12», пригосударственной поддержке в форме субсидии за счет средств бюджета Тюменской области на создание опытного образца технологической инновации, при грантовой поддержке некоммерческого партнерства «Тюменское региональное медицинское общество» в области исследований и внедрения инновационных технологий в области здравоохранения. Цель исследования: изучить ассоциации полиморфных генетических маркеров с сахарным диабетом 2-го типа и клинико-метаболическими факторами риска в русской популяции Тюменской области. Задачи исследования: 1. Изучить ассоциации 96 полиморфных генетических маркеров с развитием СД2 в русской популяции. 2. Оценить риски развития СД2 у носителей различных аллелей и генотипов изучаемых полиморфных генетических маркеров, ассоциированных с СД2. 3. Определить вклад в развитие СД2 типа сочетаний аллелей и генотипов полиморфных генетических маркеров, ассоциированных с СД2, с помощью полигенного анализа. 4. Провести анализ ассоциации 96 полиморфных генетических маркеров с клиническими и метаболическими факторами риска СД2. 7 Научная новизна исследования Впервые в русской популяции Тюменской области установлены ассоциации с СД2 полиморфных маркеров rs11642841 гена, ассоциированного с жировой массой и ожирением (FTO), rs571312 генарецептора меланокортина-4 (MC4R), rs2943634 гена субстрата инсулинового рецептора-1 (IRS1), rs1470579 гена белка 2, связывающего инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF2BP2), rs163184 гена, кодирующего субъединицу-1 канала, зависимого от ионов калия (KCNQ1), rs11924032 гена внутриклеточного транспортера глюкозы 2 типа (SLC2A2), rs11634397 гена, кодирующего домен 6 цинкового пальца (ZFAND6), rs7172432 гена, кодирующего домен С2, зависимый от ионов кальция (C2CD4A). Впервые получены данные, свидетельствующие, что повышает риск развития СД2 в русской популяции Тюменской области аллель А и генотип АА маркера rs571312 (MC4R), аллель С и генотип СС маркера rs2943634 (IRS1), аллель С маркера rs1470579 (IGF2BP2), генотип GG маркера rs163184 (KCNQ1), А маркера rs7172432 (C2CD4A). Впервые выявлено, что с пониженным риском развития СД2 в русской популяции Тюменской области ассоциированы генотип СС маркера rs11642841(FTO), аллель С маркера rs571312 (MC4R), аллель А и генотип АС маркера rs2943634 (IRS1), аллель А маркера rs1470579 (IGF2BP2), генотип AG маркера rs11924032 (SLC2A2), аллель G маркера rs7172432 (C2CD4A), генотип AG маркера rs11634397 (ZFAND6). Впервые при полигенном анализе установлены ассоциации сочетаний аллелей A маркера rs11642841 (FTO) и аллеля А маркера rs7172432 (C2CD4A) с повышенным риском развития СД2 в русской популяции Тюменской области. Впервые одномоментно получены данные о распределении частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs12779790 (CDC123/CAMK1D), rs163184, rs231262 и rs2237892 (KCNQ1), rs7593730 (RBMS1-ITGB6), 8 rs2943634 (IRS1), rs10830963 и rs1387153 (MTNR1B), rs11708067 (ADCY5), rs340874 (PROX1), rs2191349 и rs10244051(DGKB-TMEM195), rs7957197 (HNF1A), rs1531343 (HMGA2), rs13292136 (CHCHD9), rs243021(BCL11A), rs4457053 (ZBED3), rs972283 (KLF14), rs896854 (TP53INP1), rs1552224 (CENTD2), rs8042680 (PRC1), rs5945326 (DUSP9), rs12454712 (BCL2), rs16906158 (FOLH1), rs11671664 (GIPR), rs11924032 (SLC2A2), rs7172432 (C2CD4A-C2CD4B), rs6815464(MAEA), rs7041847 (GLIS3), rs6017317 (FITM2R3HDML-HNF4A), rs831571 (PSMD6), rs9470794 (ZFAND3), rs3786897 (PEPD), rs11920090 (SLC2A2), rs560887 (G6PC2), rs7034200 (GLIS3), rs10885122 (ADRA2A), rs11605924 (CRY2), rs7944584 (MADD), rs174550 (FADS1), rs35767 (IGF1), rs11071657 (C2CD4B), rs16926246 (HK1), rs1046896 (FN3K), rs1800562 (HFE), rs855791 (TMPRSS6), rs4737009 (ANK1), rs552976 (G6PC2), rs11642841 и rs1558902 (FTO), rs2867125 (TMEM18), rs571312 (MC4R), rs10938397 (GNPDA), rs646776 (CELSR2-PSRC1-SORT1), rs579459 (ABO), rs12413409 (CYP17A1-CNNM2-NT5C2), rs964184 (ZNF259-APOA5-A4C3-A1), rs1122608 и rs2228671 (LDLR) у пациентов с СД2 в русской популяции Тюменской области. Впервые установлено, что в русской популяции Тюменской области повышающими риск развития ожирения являютсяаллель А маркера rs11642841 (FTO), аллель A маркера rs1558902 (FTO), аллель А и генотип АА (BCL11A), a снижающими риск являются аллель С и генотип СС маркера rs11642841 (FTO), аллель T маркера rs1558902 (FTO), аллель G маркера rs243021 (BCL11A). Впервые обнаружено, что с риском развития ИР в русской популяции Тюменской области ассоциированы аллель А маркера rs11642841 (FTO), генотип АС маркера rs8050136 (FTO), аллель А маркера rs7172432 (C2CD4A), аллель А и генотип АА маркера rs571312 (MC4R), аллель C маркера rs7593730 (RBMS1-ITGB6), а со снижением риска развития ИР связаны аллель G маркера rs7172432 (C2CD4A), аллель С и генотип СС маркера rs11642841 9 (FTO), аллель T маркера rs7593730 (RBMS1-ITGB6), аллель С и генотип СС маркера rs571312 (MC4R). Практическая значимость исследования Полученные данные генотипирования расширяют представления о генетике СД2в русской популяции. Сбор и анализ данных о распределении частот аллелей и генотипов полиморфных генетических маркеров СД2, расчет относительныхрисков носительства определенных аллелей, генотипов и их сочетаний в конкретных популяциях являются основой развития методов персонифицированной медицины. Так, по результатам выполненной диссертационной работы в Федеральной службе по интеллектуальной собственности (Роспатент) было получено свидетельство о регистрации базы данных «Набор генетических полиморфизмов для проведения генетического тестирования индивидуальной предрасположенности к сахарному диабету 2 типа» (№2014620078 от 13.01.14). Выявленные ассоциации полиморфных генетических маркеров с клинико-метаболическими показателями в будущем могут быть использованы для формирования групп пациентов с высоким риском развития СД2, требующих применения индивидуальных программ профилактики. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Развитие СД2 в русской популяции ассоциировано с полиморфными маркерами rs8050136 и rs11642841 гена FTO, rs2943641 и rs2943634 гена IRS1, rs571312 гена MC4R, rs1470579 гена IGF2BP2, rs163184 гена KCNQ1, rs11924032 гена SLC2A2, rs11634397 гена ZFAND6, rs7172432 гена C2CD4A. 2. Развитие ожирения в русской популяции связано с носительством rs8050136, rs11642841 и rs1558902 гена FTO, rs2241766 гена ADIPOQ, rs243021 гена BCL11A. 10 3. Полиморфные маркеры rs8050136 и rs11642841 гена FTO, rs7172932 гена C2CD4A2, rs571312 гена MC4R, rs16928751 гена ADIPOR2, rs7593730 в области PBMS1-ITGB6 ассоциированы с развитием ИР в русской популяции. Внедрения результатов исследования Результаты исследования внедрены в работу эндокринологического отделения ГБУЗ ТО «Областная клиническая больница №1». Полученные данные используются в учебно-педагогической работе кафедры терапии с курсами эндокринологии, функциональной и ультразвуковой диагностики, факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России. Связь работы с научными программами Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научноисследовательской работы ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России. Личный вклад автора в исследование Автором проведен анализ литературы по теме диссертационной работы, разработан протокол исследования и комплекс диагностических методов для реализации поставленных задач, проведен набор исследуемых согласно критериям включения и исключения, их клиническое обследование. Автором выполнена статистическая обработка и анализ полученных данных, обобщены результаты и оформлена работа. Апробация результатов исследования Основные аспекты диссертационной работы были представлены иобсуждались на 54-й научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (г. Астана, 2012), на VI Всероссийском конгрессе эндокринологов (г. Москва, 2012), на конгрессе «Человек и лекарство. Урал-2012» (г. Тюмень, 2012), на XIII Всероссийской выставкенаучно-технического творчества молодежи (г. Москва, 2013), на X Международном форуме «MedSoft» (г. Москва, 2014), на XI научнопрактической конференции с международным участием «Клинические 11 наблюдения и научные исследования аспирантов, интернов и ординаторов» (г. Тюмень, 2014), на Ежегодной выставке «Информационные технологии в медицине» (г. Москва, 2012, 2014). Результаты работы отмечены дипломом 1-й степени на 54-й научно-практической конференциистудентов и молодых ученых с международным участием (г. Астана, 2012), дипломом l-й степени на I научно-практической конференции с международным участием «Клинические наблюдения и научные исследования аспирантов, интернов и ординаторов» (г. Тюмень, 2014), медалью ВВЦ «За успехи в научнотехническом творчестве» (г. Москва, 2013). Официальная апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии «Современные технологии диагностики, лечения и профилактики внутренних дерматовенерология, заболеваний психиатрия, (эндокринология, неврология, офтальмология) – терапевтические аспекты» при ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России (протокол №3 от 12 ноября 2014 г.). Публикации Материалы диссертации отражены в 13 научных публикациях, из них 3 статьи опубликованы в журналах из перечня Всероссийской аттестационной комиссии. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает 241 наименования, в том числе 65 отечественных и 176 зарубежных источников. Рукопись выполнена на русском языке. 12 ГЛАВА 1. САХАРНЫЙ ДИАБЕТ 2-го ТИПА КАК МНОГОФАКТОРНОЕ ЗАБОЛЕВАНИЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) Сахарный диабет 2-го типа относится к болезням с наследственной предрасположенностью, возникающим у лиц с соответствующим генотипом (сочетанием рисковых вариантов генов) при провоцирующем действии факторов окружающей среды, выявляющих склонность к той или иной болезни. В связи с тем, что вариантов генов, создающих основу предрасположенности к заболеванию, много, говорят о полигенной основе болезни. Выявляют эту предрасположенность многочисленные провоцирующие факторы внешней среды, поэтому такие заболевания и называют многофакторными [36]. При этом роль каждого отдельного фактора в проявлении болезни может быть незначительной, и только суммарный их вклад ведет к развитию заболевания. Известно, что не менее одной трети всех генных локусов содержит многочисленные генетические варианты (полиморфные аллели), различающиеся у разных индивидов. Большая степень полиморфизма в нормальных генах, с которой и могут взаимодействовать разнообразные факторы внешней среды, без сомнения, создает основу для различий в генетической предрасположенности у разных людей. Таким образом, в основе наследствания СД2 лежит генетическое разнообразие, создающееся многообразием комбинаций вариантов генов (аллелей). Чаще всего для изучения генетическойосновы СД2 используют выявление так называемых ассоциаций, что дает основание говорить о наличие наследственной предрасположенности (или, наоборот, устойчивости). Суть данного подхода заключается в выявлении достоверной связи (ассоциации) этого заболевания с каким-либо генетически обусловленным признаком, т.е. генетическим маркером. В качестве генетических маркеров выступают любые полиморфные участки ДНК 13 (индексные маркеры), к которым относятся варьирующие по длине гипервариабельные мини- и микросателлитные фрагменты ДНК и однонуклеотидные замены (полиморфизмы) [26]. Под этим термином понимают отличие последовательности ДНК размером в один нуклеотид. Именно однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), частным случаем которых являются полиморфные участки узнавания рестриктаз, играют основную роль в генетическом полиморфизме человека. Такие замены очень многочисленны, они встречаются через каждые 1-2 тысячи пар нуклеотидов, и их общее число оценивается в 3,2 млн. Предполагают, что половина всех ОНП приходится на смысловую (экспрессирующуюся) часть генома. Генетические полиморфизмы в отличие от мутаций, проявляющихся в виде патологического фенотипа, являются нейтральными (не приводят к нарушению жизнедеятельности организма), поэтому имеют тенденцию накапливаться в популяции [36]. Вместе с тем, генетические полиморфизмы могут приводить к появлению белковых продуктов с измененными физикохимическими свойствами и функциональной активностью. Следовательно, в определенных условиях генетические полиморфизмы могут участвовать в формировании либо предрасположенности, либо резистентности к появлению заболевания [6]. В последние десятилетия произошел значительный прогресс в области идентификации генетических факторов риска развития СД2. Сегодня в различных популяциях установлены ассоциации с СД2 более чем семидесяти полиморфных генетических маркеров. 14 1.1. Полиморфные генетические маркеры, ассоциированные с сахарным диабетом 2-го типа, в европейских популяциях 1.1.1 Исследование генов-кандидатов сахарного диабета 2-го типа Исследование генов-кандидатов основано на изучении генов, выбранных исходя из предполагаемой роли белкового продукта данного гена в этиопатогенезе заболевания. [7]. Так, в случае исследования СД2 с применением подхода ген-кандидат, в геноме удалось идентифицировать несколько локусов (таблица 1), связанных с предрасположенностью к этому заболеванию: локус гена гамма-рецептора, активируемого пероксисомным пролифератором (PPARG) [215], локус гена АТФ-зависимого калиевого канала (KCNJ11) [155], локус гена вольфрамина (WFS1) [113], локус гена транскрипционного фактора-2 (HNF1B) [129], локусы гена адипонектина и его рецептора (ADIPOQ и ADIPOR2) [85, 97]. Таблица 1 Полиморфные генетические маркеры, ассоциированные с сахарным диабетом 2-го типа в европейских популяциях, в исследованиях генов-кандидатов Однонуклеотидные полиморфизмы (наименование по базе данных National Center for Biotechnology Information, США) Название гена Аллель риска OR rs1801282 PPARG G 1,14 [215] rs5219 KCNJ11 T 1,14 [155] rs10010131 WFS1 G 1,11 [113] rs757210 HNF1B A 1,13 [129] rs2241766 ADIPOQ G 1,51 [97] rs11061971 ADIPOR2 Т 2,05 [85] rs16928751 ADIPOR2 А 1,88 [85] Этиологический вариант гена PPARG, ассоциированный с СД2, представляет собой аминокислотный полиморфизм (rs1801282) – остатки пролина или аланина в 12 кодоне. Продукт гена PPARG является основным 15 фактором регуляции дифференцировки адипоцитов, а также способствует экспрессии белка, транспортирующего жирные кислоты, повышает экспрессию и активность ацетил-КоА-синтазы, фосфатидилинозитол-3киназы, увеличивает экспрессию гена адипонектина, транспортера глюкозы (GLUT-4), подавляет экспрессию гена лептина, участвует в регуляции белков, разобщающих окислительное фосфорилирование, ингибирует экспрессию в жировой ткани ФНО-альфа, что сопровождается снижением инсулинорезистентности и улучшением секреции инсулина В-клетками [222]. Ассоциация rs1801282 гена PPARG с СД2 была подтверждена в исследованиях на финской, шведской, британской, французской [75, 142, 200], а также русской популяциях [5, 49, 218]. Ген KCNJ11 кодирует белок Kir6.2., который вместе с SUR1 (рецептор сульфонилмочевины-1) формирует АТФ-зависимый калиевый канал, регулирующий мембранный потенциал, и тем самым глюкозозависимую секрецию инсулина В-клетками. Замена глутаминовой кислоты на лизин в положении 23 (rs5219) приводит к снижению продукции инсулина вследствие повышения активности ионного канала, изменению мембранного потенциала и уменьшению активного транспорта ионов кальция внутрь Вклетки [194]. Продукты генов PPARG и KCNJ11 являются точками приложения в действии таких групп пероральных сахароснижающих средств, как тиазолидиндионы (PPARG) и препараты сульфонилмочевины (KCNJ11). Интересно, что одиночные мутации генов PPARG и KCNJ11 также известны как редкие моногенные синдромы (липодистрофия и неонатальный диабет, соответственно), характеризующиеся тяжелыми метаболическими расстройствами, инсулинорезистентностью и дисфункцией B-клеток [231]. Ассоциация с СД2 полиморфного маркера rs5219 гена KCNJ11 установлена и в русской популяции в работе Потапова, посвященной поиску генетических маркеров, определяющих предрасположенность к СД2 в русской популяции [49]. Кроме того, следует особо отметить, что rs5219 гена 16 KCNJ11 в русской популяции оказался связан с риском развития СД2 у больных с дебютом заболевания до 35 лет [54]. Ассоциация полиморфного маркера rs10010131 гена WFS1 выявлена в британской популяции в исследовании Sundhu. Ген вольфрамина (WFS1), мутации в котором приводят к синдрому Вольфрама (заболеванию, сочетающему сахарный и несахарный диабет с атрофией зрительных нервов, глухотой и дилатацией мочевых путей), также может участвовать в развитии СД2 [113, 239]. В ряде исследований получены ассоциации с СД2 полиморфных генетических маркеров генов ADIPOQ и ADIPOR2. Продуктом гена ADIPOQ, расположенного на хромосоме 3q27, является гормон жировой ткани адипонектин, а ген ADIPOR2 кодирует клеточный рецептор, опосредующий действие адипонектина. Основная функция адипонектина состоит в ингибировании патологических атеросклеротических процессов, улучшении чувствительности к инсулину и предупреждении фиброза ткани печени. В исследовании Siitonen в финской популяции установлена связь с риском развития СД2 аллеля G полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ [97]. В русской популяции установлены ассоциации аллеля Т полиморфного маркера rs11061971 и аллеля А полиморфного rs16928751 гена ADIPOR2 с СД2 [85]. Полиморфный маркер rs757210 гена HNF1B, участвующего в развитии и функционировании клеток островков поджелудочной железы, впервые был идентифицирован в 2007 году. Мутации в гене HNF1B приводят к развитию диабета типа MODY5, который также ассоциируется у больных индивидов с урогенитальной и ренальной патологией [129]. Использование в исследованиях СД2 подхода ген-кандидат расширило представления о генетических факторах риска данного заболевания. Однако недостаток наших знаний о механизмах развития СД2 существенно ограничивает область применения данного подхода. 17 1.1.2 Анализ сцепления полиморфных генетических маркеров с сахарным диабетом 2-го типа При анализе сцепления проводится анализ совместного наследования в семье признака и исследуемого генотипа. Для анализа сцепления СД2 с полиморфными маркерами в настоящее время используются панели из 300500 ДНК-маркеров, распределенных по всему геному [44]. Именно с помощью анализа сцепления были идентифицированы локусы гена транскрипционного фактора-4 (TCF7L2) и локус гена кальпаина-10 (CAPN10). В 1996 году Hanis с соавторами установили ассоциацию с СД2 локуса, располагающегося во второй хромосоме [76]. Позднее, в 2000 выделен ген CAPN10, кодирующий кальпаин-10, цистеинпротеазу, роль которой в метаболизме углеводов не ясна [138]. В мета-анализе Weedon описана связь с СД2 полиморфного маркера rs2975760 гена CAPN10, однако в последующем при полногеномных поисках ассоциаций связь CAPN10 не была подтверждена [181]. Ассоциация с СД2 полиморфных маркеров rs7903146 и rs12255372 гена TCF7L2, локализованного в коротком плече 10 хромосомы, впервые была выявлена в исследовании исландской популяции [214]. Механизм влияния гена TCF7L2 на развитие CД2 до сих пор до конца неясен. Продукт гена TCF7L2 – белковый фактор TCF-4 – является компонентом Wntзависимого сигнального пути, играющего важную роль в развитии поджелудочной железы, миогенезе и адипогенезе [101]. Исследование Grant показало ассоциацию аллеля Т полиморфного маркера rs7903146 с риском развития СД2, нарушением секреции инсулина, инкретиновых эффектов и увеличением скорости гепатической продукции глюкозы [214]. В исследовании ассоциаций полиморфного маркера rs7903146гена TCF7L2 с СД2 в Новосибирской области России установлено, что носительство аллеля 18 Т повышает риск развития СД2, а больные СД2 с генотипом ТТ имеют более высокие значения ИМТ [5]. В 2005 году Yi c соавторами предложили рассматривать TCF7L2 как регулятор экспрессии гена проглюкагона и, следовательно, синтеза L-клетками глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1) [241]. 1.1.3 Полногеномный поиск ассоциаций полиморфных генетических маркеров с сахарным диабетом 2-го типа Прорывом в понимании генетических основ СД2 стало появление в 2007 году технологии полногеномных поисков ассоциаций, позволяющей с помощью ДНК-микрочипов одномоментно тестировать до 500 000 ОНП. С помощью данного полиморфных подхода генетических удалось идентифицировать маркеров, ассоциированных более с СД2 40 в европейских популяциях (таблица 2). Первый полногеномный поиск ассоциаций у пациентов с СД2 был опубликован в феврале 2007 года группой ученых под руководством Sladec [71]. Исследование включало 661 пациента с СД2 и 614 здоровых индивидов. Выявлена взаимосвязь СД2 с двумя прежде не рассматриваемыми локусами генов SLC30A8 (rs13266634) и HHEX (rs1111875). Ген HHEX кодирует транскрипционный фактор Wnt-сигнального пути, регулирует развитие поджелудочной железы в эмбриогенезе [161]. Полиморфный маркер rs13266634 – остатки аргинина или триптофана в позиции 325 гена SLC30A8, кодирующего транспортер ионов цинка-8 (ZnT8). SLC30A8 экспрессируется почти исключительно в островках поджелудочной железы и в небольшом количестве в коре головного мозга и щитовидной железе [123]. Транспортер ионов цинка, встроенный в мембрану инсулиновых секреторных везикул, обеспечивает перенос внутрь везикул ионов цинка, необходимых для правильной упаковки и хранения молекул 19 инсулина. Таким образом, продукт гена SLC30A8 играет ключевую роль в созревании, сохранении и секреции инсулина В-клетками. [162]. Данные, полученные при исследовании гена SLC30A8, демонстрируют, что полногеномные поиски ассоциаций, не учитывающие данных о патогенезе заболевания, возможно, помогут исследователям по-новому взглянуть на механизмы развития СД2. Параллельно с работой Sladek [71] исследователи 3 научных групп: Welcome Trutst Case Control Consortium (WTCCC) [200], Finland-United States Investigation of NIDDM Genetics (FUSION) [75] и Diabetes Genetics Initiative [200] опубликовали (DGI) данные, подтверждающие ассоциацию у европейских испытуемых СД2 с полиморфными маркерами rs13266634 гена SLC30A8 и rs1111875 гена HHEX, а также с вновь выявленными rs10946398 гена CDKAL1 (ген регуляторной субъеденицы цинклин-зависимой киназы-5), rs10811661 гена CDKN2A/В (гены ингибиторов цинклин-зависимой киназы4, которая участвует в сигнальных путях, контролирующих пролиферацию и число B-клеток) и rs4402960 гена IGF2BP2 (ген белка 2, связывающего ИФР2, стимулирует рост, дифференцировку тканей, потенцирует действие инсулина) [200, 142, 75]. В 2009 году Rung c соавторами впервые показали связь аллеля С (rs2943641) гена IRS1 с ИР, гиперинсулинемией и СД2 у 14 358 французских, датских и финских испытуемых [135]. Ген IRS1 – ген субстрата инсулинового рецептора-1. Активация IRS1 считается ключевым звеном внутриклеточного проведения инсулинового сигнала. В норме связывание инсулина с рецептором ведет к фосфорилированию остатков тирозина в молекуле субстрата рецептора инсулина-1. Далее определяющим является активация фосфатидилинозитол-3-киназы, что ведет к транслокации транспортера глюкозы 4 типа из внутриклеточного пула на плазменную мембрану клетки, обеспечивая транспорт глюкозы внутрь клетки. Возможное влияние дефекта IRS1 гена на развитие СД2 связано с 20 нарушением активации клеточного каскада реакций, инициирующееся при связывании инсулина с рецептором на мембране. В последующем ассоциация rs2943641 гена IRS1 с СД2 была подтверждена в крупном метаанализе DIAGRAM+ [227]. В результате проведения целого ряда полногеномных поисков ассоциаций были накоплены многочисленные данные о генах, ассоциированных с СД2. С целью обобщения результатов нескольких исследований, контроля разнообразия между исследованиями, расширения выборки и увеличения статистической мощности были проведены метаанализы результатов полногеномных поисков ассоциаций. Результаты первого мета-анализа данных полногеномных поисков ассоциаций, получившего название DIAGRAM (Diabetes Genetics Replication And Meta-analysis), были представлены Zeggini с соавторами в 2008 году. Авторы проанализировали в три этапа результаты группы исследований, объединив данные генотипирования 10 128 индивидов европейского происхождения. В результате мета-анализа было выявлено шесть до этого момента неизвестных локусов, ассоциированных с развитием СД2: rs864745 гена JAZF1 (ген кодирует белок-репрессор транскрипции ряда генов, в частности NR2C2), rs7961581 гена TSPAN8-LGR5 (ген белка тетраспанина-8), rs12779790 гена CDC123-CAMA1D (ген, возможно, контролирующий число B-клеток, усиливая апоптоз), rs7578597 гена THADA (ген аденомы щитовидной железы), металлопротеиназу, поджелудочной трансмембранный rs4607103 гена экспрессируется железы), rs10923931 рецептор, который в ADAMTS9 клетках гена (ген мышечной NOTCH2 необходим для (ген кодирует ткани и кодирует формирования поджелудочной железы в пренатальном периоде) [182]. В 2010 году к исследованию DIAGRAM были добавлены данные нескольких проектов, и итоговое число участников мета-анализа, названного DIAGRAM+, составило 94 337 лиц европейского происхождения, из них 34 21 412 пациентов с СД2 и 59 925 здоровых участников. В результате были получены данные об ассоциациях с СД2 однонуклеотидных полиморфизмов генов BCL11A, ZBED3, KLF14, TP53INP1, CHCHD9, KCNQ, CENTD2, HMGA2, HNF1A, ZFAND6, PRC1 и DUSP9, а также была подтверждена связь с СД2 полиморфных маркеров rs2943641 гена IRS1 и rs1387153 гена MTNR1B [227]. В том же году появляются данные исследования MAGIC (MetaAnalysis of Glucose and Insulin-related traits Consortium), объединяющего данные пациентов с нарушениями углеводного обмена и СД2. В анализ данных пациентов с СД2 вошли 27 исследований, включающих информацию о 40 655 пациентах с СД2 и 87 022 здоровых индивида. В ходе мета-анализа выявлена четкая связь СД2 с еще пятью полиморфными маркерами генов ADCY5, PROX1, DGKB-TMEM195, GCK, GCKR [189]: 1) Ген ADCY5 кодирует фермент аденилатциклазу-5. Взаимодействие глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1) с рецептором этого фермента в клетках поджелудочной железы активирует протеинкиназу А, транскрипцию гена проинсулина и стимулирует секрецию инсулина [220]. 2) Ген PROX1 кодирует гемеобокс-белок-1 – дополнительный ко-репрессор гена печеночного ядерного фактора-4α (HNF4A), который играет ключевую роль в развитии В-клеткок. Изолированные мутации в гене HNF4A приводят к развитию диабета типа MODY1 [186, 198]. 3) DGKB-TMEM195 кодирует β (1 из 10) изотипов каталитических доменов диацилглицеролкиназы, которая регулирует внутриклеточную концентрацию вторичного мессенджера диацилглицерола. В исследованиях на крысах установлено, что глюкоза повышает уровень дицилглицерола, который активирует протеинкиназу С и потенцирует секрецию инсулина [105, 156]. 4) Гены GCK и GCKR кодируют фермент глюкокиназу и ее регулятор. Глюкокиназа относится к ферментам семейства глюкокиназ, катализирует 22 процесс фосфорилирования глюкозо-6-фосфата. Генетически обусловленный дефект глюкокиназы может приводить к уменьшению притока глюкозы в Вклетки и повышению порога концентрации глюкозы, стимулирующей секрецию инсулина [189]. В 2012 году в ходе масштабного мета-анализа, выполненного Saxena с соавторами, впервые установлены ассоциации с СД2 полиморфных маркеров rs3793991 гена GATAD2A, rs10770141 гена TH/INS, rs12454712 гена BCL2, rs4925115 гена SREBF1 [172]. В том же году еще 10 ранее не известных полиморфных маркеров, ассоциированных с СД2, были представлены в мета-анализе Morris, среди них локусы генов BCAR1, MC4R, CILP2, ANKRD55, TLE1, KLHDC5, MGC21675, ANK1, ZMIZ1 и GRB14, вклад которых в формирование СД2 в настоящее время активно изучается [174]. Таблица 2 Полиморфные генетические маркеры, ассоциированные с сахарным диабетом 2-го типа в европейских популяциях, в полногеномных поисках ассоциаций Однонуклеотидные полиморфизмы (наименование по базе данных National Center for Biotechnology Information, США) Название гена Аллель риска OR rs1111875 HHEX C 1,13 [71] rs13266634 S LC30A8 C 1,12 [71] rs10811661 CDKN2A/В T 1,2 [75, 142, 182] rs10946398 CDKAL1 C 1.12 [75, 142, 182] rs4402960 IGF2BP2 T 1,14 [75, 142, 182] rs2943641 IRS1 C 1,19 [135] rs7961581 TSPAN8 C 1,09 [182] rs4607103 ADAMTS9 C 1,09 [182] rs10923931 NOTCH2 T 1,13 [182] rs12779790 CDC123 G 1,11 [182] rs7578597 THADA T 1,15 [182] rs864745 JAZF1 T 1,1 [182] 23 rs7957197 HNF1A T 1,07 [227] rs1531343 HMGA2 C 1,1 [227] rs13292136 CHCHD9 C 1,11 [227] rs243021 BCL11A A 1,08 [227] rs4457053 ZBED3 G 1,08 [227] rs972283 KLF14 G 1,07 [227] rs896854 TP53INP1 T 1,06 [227] rs1552224 CENTD2 A 1,14 [227] rs8042680 PRC1 A 1,07 [227] rs11634397 ZFAND6 G 1,06 [227] rs231262 KCNQ1 G 1,08 [227] rs5945326 DUSP9 A 1,27 [227] rs1387153 MTNR1B T 1,15 [227] rs11708067 ADCY5 A 1,12 [189] rs340874 PROX1 C 1,07 [189] rs4607517 GCK A 1,07 [189] rs780094 GCKR C 1,06 [189] rs2191349 DGKB T 1,06 [189] rs7177055 HMG20A A 1,08 [174] rs13389219 GRB14 C 1,07 [174] rs12571751 ZMIZI A 1,08 [174] rs516946 ANK1 C 1,09 [174] rs10842994 KLHDC5 C 1,1 [174] rs2786441 TLE1 G 1,07 [174] rs459193 ANKRD55 G 1,08 [174] rs10401969 CILP2 C 1,13 [174] rs12970134 MC4R A 1,08 [174] rs7202877 BCAR1 T 1,12 [174] 24 rs3794991 GATAD2A T 1,14 [75] rs4925115 SREBF1 A 1,09 [75] rs10770141 TH/INS A 1,07 [75] rs12454712 BCL2 T 1,08 [75] Таким образом, использование полногеномных поисков ассоциаций позволило существенно увеличить число изучаемых полиморфных генетических маркеров, ассоциированных с СД2, роль многих из которых требует дальнейшего детального изучения. Однако уже сегодня полученные данные не только значительно расширили наши знания о генетических факторах, предрасполагающих к формированию СД2, но и помогли выделить новые аспекты механизмов развития данного заболевания. 1.2 Полиморфные генетические маркеры, ассоциированные с сахарным диабетом 2-го типа, в восточноазиатских и южноазиатских популяциях Значительный рост числа больных СД2 в азиатских странах, а в частности, в Китае, где распространенность данного заболевания увеличилась с 2,6% населения в 2000 году до 9,7% – в 2010 году, послужил основанием для активизации поиска методов ранней диагностики и профилактики развития СД2 [70]. Основой развития данного направления может стать определение причин наследственной предрасположенности к СД2 (таблица 3). Так, в 2008 году ученые двух групп под руководством Yasuda и Unoki опубликовали данные полногеномных поисков ассоциаций, проведенных для восточноазиатских популяций. Протестировав более полутора тысяч японцев, ученые идентифицировали rs2237892 гена KCNQ1, кодирующего субъединицу-1 канала [207, 235]. Изменения в структуре KCNQ1 в поджелудочной железе влияют на режим секреции инсулина, что, возможно, объясняет связь с развитием СД2 [99, 141]. Данная ассоциация с 25 СД2 в последующем была подтверждена в корейской [96], китайской [237], сингапурской [141], а также и в европейской популяции [235]. Таким образом, rs2237892 гена KCNQ1 считается наиболее значимым полиморфным маркером СД2 для восточноазиатских популяций [210]. Ассоциации с СД2 полиморфных маркеров rs7612463 гена UBE2E2 и rs7172432 гена C2CD4A-C2CD4B выявлены в 2010 году в крупном полногеномном поиске ассоциаций в японской популяции (4470 пациентов с СД2 и 3071 здоровый испытуемый) [74]. В китайской и тайваньской популяции установлены ассоциации с СД2 rs17584499 гена PTPRD и rs391300 гена SRR [72]. Ген PTPRD кодирует белковую тирозин фосфатазу, рецепторный тип, D, которая влияет на ИР и, таким образом, на развитие СД2 [201]. Ген SRR кодирует серин-рацемазу, которая кодирует переход L-серина в D-серин, и, вероятно, определяет риск СД2 через сигнальный путь глутамата [199, 204] В 2011 году в ходе полногеномного поиска ассоциации в южноазиатских популяциях установлены 6 новых предрасполагающих к СД2 локусов в генах GRB14, ST6GAL1, VPS26A, HMG20A, AP3S2 и HNF4A. Полиморфный маркер rs3923113 гена GRB14 в данном исследовании был ассоциирован с инсулиночувствительностью, rs16861329 гена ST6GAL1 и rs4812829 гена HNF4A – с функцией В-клеток поджелудочной железы [150]. В 2013 году при полногеномном поиске ассоциаций в индийской популяции выявлена ассоциация rs998451 гена TMEM163 локуса 2q21 с СД2. Ген TMEM163 кодирует белок-транспортер в нервных окончаниях и, вероятно, вовлечен в формирование СД2 за счет нарушения секреции инсулина [146]. В то же время ассоциации с СД2 полиморфного маркера rs9952911 гена SGCG локуса 13q12 установлены в популяции пенджабских сикхов Северной Индии и подтверждены в мета-анализе Saxena. Однако в восточноазиатских популяциях ассоциация с СД2 rs9952911 гена SGCG не 26 выявлена, что свидетельствует об особой роли данного полиморфного маркера именно для сикхов области Пенджаб [147]. В январе 2012 года группой ученых был опубликован первый метаанализ полногеномных поисков ассоциаций полиморфных генетических маркеров с СД2 в восточноазиатских популяциях. В ходе трех этапов исследований были проанализированы данные 15 052 пациентов с СД2 и 29 611 здоровых индивидов азиатских популяций (корейской, тайваньской, китайской, японской и сингапурской). Комбинированный анализ данных выявил ассоциации с СД2 восьми локусов в генах GLIS3, PEPD, FITMN2R3HDML-HNF4A, KCNK16, MAEA, GCC1-PAX-4, PSMD6 и ZFAND3. В настоящее время известны белковые продукты выявленных генов, большинство из которых – транскрипционные факторы, чья возможная роль в развитии СД2 в настоящее время активно изучается [183]. В 2012 году в полногеномном исследовании японской популяции выявлена ассоциация с СД2 rs515072 гена ANK1 [167]. Ген ANK1, кодирующий белок анкирин 1, также ассоциирован со снижением секреции инсулина и высоким уровнем гликированного гемоглобина [110, 159]. Дополнительно при полногеномном поиске ассоциаций в пекинской и шанхайской популяциях установлена связь с СД2 полиморфных маркеров rs10886471 гена GRK5 и rs7403531 гена RASGRP1 [70]. Продукт гена GRK5 рассматривается как регулятор инсулиночувствительности и может послужить основой разработки новой терапии ИР [137]. В 2013 году в мета-анализе данных трех полногеномных поисков ассоциаций в южнокитайской популяции впервые описан полиморфный маркер rs10229583 гена PAX4 в локусе 7q32 [149]. Продукт гена PAX4 как транскрипционный фактор играет значительную роль в развитии и функционировании В-клеток поджелудочной железы [238]. Позднее в исследовании Hara установлены три локуса в генах MIR129-LEP (rs791595), GPSM1 (rs11787792) и SLC16A13 (rs312457), ассоциированных с СД2 в 27 японской и китайской популяциях [148]. Rs791595 локализован между геном гормона жировой ткани лептином (LEP) и геном MIR129 с неизвестной функцией [109]. Таблица 3 Полиморфные генетические маркеры, ассоциированные с сахарным диабетом 2-го типа в восточноазиатских и южноазиатских популяциях Однонуклеотидные полиморфизмы (наименование по базе данных National Center for Biotechnology Information, США) Название гена Аллель риска OR rs2237892 KCNQ1 C 1,43 [235] rs76124633 UBE2E2 A 1,19 [74] rs7172432 C2CD4A A 1,13 [74] rs6815464 MAEA C 1,13 [183] rs7041847 GLIS3 A 1,1 [90] rs6017317 FITM2 G 1,09 [90] rs831571 PSMD6 C 1,09 [90] rs9470794 ZFAND3 C 1,12 [90] rs3786897 PEPD A 1,1 [90] rs391300 SRR G 1,28 [72] rs17584499 PTPRD T 1,57 [72] rs6467136 GCC1-PAX4 G 1,11 [183] rs1535500 KCNK16 T 1,08 [183] rs515071 ANK1 C 1,18 [80] rs10886471 GRK5 C 1,12 [70] rs7403531 RASGRP1 T 1,1 [70] rs10229583 PAX4 G 1,18 [149] rs791595 MIR129-LEP A 1,17 [149] rs312457 SLC16A13 G 1,2 [72] rs11787792 GPSM1 A 1,15 [72] rs16861329 ST6GAL1 G 1,09 [150] 28 rs4812829 HNF4A A 1,09 [150] rs1802295 VPS26A A 1,08 [150] rs2028299 AP3S2 C 1,1 [150] rs7178572 HMG20A G 1,09 [150] rs3923113 GRB14 A 1,09 [150] rs998451 TMEM163 G 1,56 [126] rs9552911 SGCG A 0,67 [147] Таким образом, сегодня проведены многочисленные исследования генетических основ СД2 во многих популяциях мира, в результате установлено несколько десятков локусов генов, ассоциированных с риском развития СД2. Особого внимания заслуживает тот факт, что наборы полиморфных генетических маркеров СД2 разнятся от популяции к популяции. Этнический фактор в значительной мере влияет на различия в частотах аллелей полиморфных маркеров и, соответственно, на общий генетический риск заболевания, что диктует необходимость более активного изучения основ наследования СД2 в различных этнических группах. Генетические исследования СД2 проводятся и для населения Российской Федерации. Однако, в русской популяции протестировано небольшое число генетических маркеров СД2, что делает особо актуальным исследование наследственной предрасположенности к данному заболеванию расширенным набором полиморфных маркеров. Это позволит выявить новые для русской популяции ассоциации, установить возможные сочетания рисковых аллелей и генотипов, а также изучить вклад исследуемых полиморфных генетических маркеров в патогенез СД2, формирование его клинических и метаболических проявлений, что в перспективе сделает возможной лучшую дифференциацию и более точную субклассификацию этого заболевания. Данные исследования являются важным этапом на пути к разработке и эффективному использованию в клинической эндокринологии 29 методов молекулярно-генетической диагностики. Их внедрение является технологической и персонализированной точности методологической медицине, прогнозирования основой основная цель заболеваемости, профилактики и снижение количества осложнений. для перехода к которой – повышение разработка программ 30 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Дизайн исследования Диссертационная работа выполнена на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ректор – член-корр. И. В. Медведева). Исследование проведено в соответствии с положениями Конституции Российской Федерации и Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Рекомендации для врачей, занимающихся биомедицинскими исследованиями с участием людей». В исследование при добровольном информированном согласии в соответствии с критериями включения и исключения были набраны 192 неродственных испытуемых женского (n=120) и мужского (n=72) пола. Набор пациентов проведен в Многопрофильной клинике ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России (главный врач – к.м.н. Р. Н. Багиров), а также ГБУЗ ТО «Областная клиническая больница № 1» (главный врач – к.м.н. С. Е. Ярцев). Критерии включения в исследование: мужчины и женщины с установленным согласно критериям ВОЗ (1999 г.) диагнозом СД2, русской национальности, проживающие на территории Тюменской области. Этническую принадлежность выясняли путем индивидуального опроса, учитывая данные до третьего поколения. Критерии исключения из исследования: пациенты с подтвержденным диагнозом сахарный диабет 1-го типа, больные гестационным диабетом, а также индивиды, имеющие клинические симптомы вторичного диабета вследствие панкреатита, гемохроматоза и прочих заболеваний. 31 Условно здоровые индивиды русской национальности без ожирения, имеющие показатели общего холестерина и толерантность к глюкозе в пределах нормы, составляли контрольную группу. Научно-исследовательская работа включала два этапа. I этап: формирование группы генетических маркеров, ассоциированных в различных популяциях с СД2, нарушениями углеводного обмена, ожирением, АГ и дислипидемией на основании обзора литературных данных. II этап: одномоментное (поперечное) исследование основной группы и группы контроля (рисунок 1). Рисунок 1. Схема исследования полиморфных генетических маркеров сахарного диабета 2-го типа Протокол исследования одобрен комитетом по этике ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России. Все лица, участвовавшие в исследовании, подписывали информированное согласие, утвержденное комитетом по этике ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России (председатель – д.м.н., проф. Э. А. Ортенберг). 32 2.2 Общая характеристика групп испытуемых В исследование включены 192 неродственных испытуемых, из которых 96 участников имели СД2 и были отнесены в основную группу, а 96 условно здоровых испытуемых составляли группу контроля. В основную группу вошли 36 (37,5%) мужчин и 60 (62,5%) женщин, средний возраст которых на момент обследования составлял 52,5 [44,5; 62,0] года. Средний возраст дебюта СД2 составил 36 [29,0; 71,1] лет, а средняя длительность стажа СД2 – 4,0 [2,0; 9,0] года. Группа контроля также представлена 36 (37,5%) мужчинами и 60 (62,5%) женщинами. Средний возраст в группе контроля составил 47,0 [30,0; 74,0] лет и был сопоставим (p=0,29) с основной группой (таблица 4). Согласно данным, представленным в таблице 4, в основной группе большинство пациентов имели среднее образование – 72,9%, а в контрольной группе – высшее – 66,7% (χ2=28,6; р<0,001). Городские жители преимущественно входили в группу контроля – 71,9%, в основной группе городские жители составляли 48,9% (χ2=9,6; р=0,002). Таблица 4 Общая характеристика обследованных групп Признак Возраст, годы Высшее образование Среднее образование Проживание в городе Проживание в сельской местности Основная группа (n=96) 52,5 [44,5; 62,0] 26 (27,1%) 70 (72,9%) 47 (48,9%) 49 (51,1%) Группа контроля (n=96) 47,0 [30,0; 74,0] 64 (66,7%) 32 (33,3%) 69 (71,9%) 27 (28,1%) χ2, р p=0,29 χ2=28,6; р<0,001 χ2=9,6; р=0,002 Табакокурение зарегистрировано у четверти испытуемых основной группы, а в группе контроля – в 20% случаев (χ2=0,27; р=0,606). При анализе взаимосвязей курения с клинико-метаболическими показателями не было выявлено статистически значимых корреляций. 33 Отягощенную наследственность по СД2 имели 63 (65,6%) пациента основной группы, семейный анамнез СД2 преобладал по линии матери (таблица 5). Таблица 5 Распределение больных с сахарным диабетом 2-го типа в зависимости от семейного анамнеза Основная группа (n=96) Отягощенный семейный анамнез по сахарному диабету 2-го типа Отец Мать Оба родителя Отец + дргуие родственники Мать+другие родственники Другие родственники Абс. % 9 20 7 4 9 14 9,4 20,8 7,3 4,2 9,4 14,6 При оценке данных антропометрии и значений артериального давления в основной группе и группе сравнения установлено (таблица 6), что показатели веса, ОТ, ОБ, ИМТ, ОТ/ОБ в основной группе статистически значимо отличались от группы контроля (р˂0,00001). Таблица 6 Сравнительная характеристика данных антропометрии и значении артериального давления в основной группе и группе сравнения Показатель Вес, кг ИМТ, кг/м2 ОТ, см ОБ, см ОТ/ОБ Основная группа (n=96) 93,2±17,5 36,0±5,8 106,9±11,7 110,2±11,0 0,97±0,08 Группа контроля (n=96) 65,5±12,2 23,2±2,5 79,0±10,2 96,5±0,09 0,81±0,09 Р р˂0,00001 р˂0,00001 р˂0,00001 р˂0,00001 р˂0,00001 Проведен анализ взаимосвязей наследственного анамнеза по СД2 и ожирению с данными антропометрии (таблица 7). Представленные данные демонстрируют, что отягощенный семейный анамнез по СД2 и ожирению 34 значимо ассоциирован с увеличением объема жировой ткани и абдоминальным типом ее распределения. Таблица 7 Коэффициенты корреляции между показателями антропометрии и наследственным анамнезом по сахарному диабету 2-го типа и ожирению Показатель Масса тела, кг Окружность талии, см Окружность бедер, см ИМТ, кг/м2 ОТ/ОБ Наследственный анамнез по сахарному диабету 2-го типа Коэффициент р корреляции Спирмена (r) 0,33 0,000004 0,38 <0,00001 0,28 0,00007 0,41 <0,00001 0,36 <0,00001 Наследственный анамнез по ожирению Коэффициент Р корреляции Спирмена (r) 0,16 0,03 0,18 0,02 0,16 0,03 0,19 0,007 0,16 0,23 В ходе анализа проводимой в основной группе сахароснижающей терапии отмечено, что большинство пациентов (61,5%) использовали метформин или его комбинации с другими классами ПССП (рисунок 2). Рисунок 2. Характеристика проводимой сахароснижающей терапии 35 В основной группе 40 (41,6%) человек находилось на инсулинотерапии, из них 22 (22,9%) применяли комбинацию препаратов (инсулин+другой класс препаратов). Все пациенты соблюдали диету с ограничением потребления углеводов – диета №9 по М. И. Певзнеру. Таким образом, следует отметить, что основным принципом формирования групп исследования являлось наличие СД2. При этом испытуемые исследуемых групп были сопоставимы по полу, возрасту и этнической принадлежности. 2.3 Методы исследования Всем участникам обследование с исследования оценкой жалоб, проведено изучением общеклиническое анамнеза заболевания, наследственности и объективных данных клинического осмотра. Результаты общеклинического осмотра, а также паспортные данные, полный клинический диагноз, длительность заболевания, вес испытуемого при рождении, наличие ожирения в детстве, вес детей при рождении (у женщин), данные антропометрии, клинико-лабораторных, инструментальных тестов и сведения о лечении СД2 фиксировались в индивидуальной клинической карте. Клинический диагноз СД2 определялся согласно диагностическим критериям Всемирной организации здравоохранения (1999 г.): концентрация глюкозы натощак в плазме крови более 7,0 моль/л, либо концентрация глюкозы в плазме более 11,1 ммоль/л спустя 2 часа после проведения ПГТТ, либо прием лекарств, снижающих уровень глюкозы в крови. Форма диабетической нейропатии устанавливалась при наличии характерных жалоб (боли в конечностях, чувство жжения в конечностях, парестезии и др.), а также при осмотре ног с исследованием вибрационной 36 чувствительности камертоном 128 Hz, тактильной – монофиламентом; измерялись болевая и температурная чувствительность. Для верификации диабетической ретинопатии пациенты осматривались офтальмологом. Состояние глазного дна оценивалось с использованием классификации Американской диабетической ассоциации 2002 г. Верификацию диабетической нефропатии проводили с использованием классификации Национального почечного фонда США 2002 г. Функциональное состояние почек оценивалось с использованием теста на микроальбуминурию, суточную протеинурию. Скорость клубочковой фильтрации рассчитывалась по формуле MDRD. Антропометрическое обследование включало в себя измерение роста в положении стоя с помощью стандартного медицинского ростомера с точностью до 0,5 см, определение массы тела с помощью стационарных напольных электронных медицинских весов «МАССА-К» (Россия), с точностью измерения до 50 граммов, измерение ОТ проводилось сантиметровой лентой в положении стоя на уровне I поясничного позвонка и пупка, измерение ОБ с помощью сантиметровой ленты в положении стоя на уровне больших вертелов тазобедренных костей. Массу тела оценивали с использованием индекса массы тела (ИМТ, или индекс Кетле), рассчитывающимся по формуле: масса (кг/рост2 (м2). По классификации ВОЗ (1997 г.) ИМТ интерпретировался следующим образом: выраженный недостаток веса (ИМТ менее 16,5 кг/м2), дефицит массы тела (ИМТ от 16,5 до 18,4 кг/м2), нормальный вес тела (ИМТ от 18,5 до 24,9 кг/м2), избыточная масса тела (ИМТ от 25,0 до 29,9 кг/м2), ожирение I степени (ИМТ от 30,1 до 34,9 кг/м2), ожирение II степени (ИМТ от 35,0 до 40,0 кг/м2), ожирение III степени (ИМТ более 40,0 кг/м2). Определение типа распределения жировой клетчатки осуществлялось по индексу отношения объема талии к бедрам (ОТ/ОБ). Согласно рекомендациям ВОЗ (1997 г.) 37 значение ОТ/ОБ более 0,95 у мужчин и 0,85 у женщин соответствует абдоминальному типу ожирения. Артериальное давление измерялось с помощью тонометра в положении сидя на левой руке дважды с расчетом среднего арифметического обоих измерений после 30-минутного отдыха. Артериальная гипертензия была верифицирована при уровне АД ≥ 130 мм рт.ст. для систолического и ≥ 80 мм рт.ст. для диастолического артериального давления в соответствии с рекомендациями Всероссийского научного общества кардиологов (2008 г.). Лабораторная диагностика проводилась в клинико-биохимической лаборатории Многопрофильной клиники ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России (зав. лабораторией – к.м.н. Н. Ю. Южакова). Биохимические и гормональные показатели плазмы крови определялись на автоматическом анализаторе «Chem Well +» производства Awareness Technology (США). Для оценки состояния углеводного обмена выполнялся пероральный глюкозо-толерантный тест, включающий в себя определение концентрации глюкозы натощак в плазме крови (фотометрический метод, набор «Глюкоза», Biosystems, Испания) и спустя 2 ч после перорального приема внутрь 75 г глюкозы. В ходе проведения ПГТТ исследовались базальные и стимулированные концентрации иммунореактивного инсулина (иммуноферментный анализ, «DRG Insulin ELISA EIA-2935», Германия) и Спептида (радиоиммунологический метод, Bering werke-AG, Германия). Дополнительно определялись уровни АСТ и АЛТ (кинетический метод, набор «АСТ», Biocon, Германия), липидограмма (фотометрический метод, наборы «Холестерол», Biosystems, Испания; «Триглицериды», Biocon, Германия, «HDL холестерин», «Human», Германия), мочевая кислота (ферментативный колориметрический метод, набор «Мочевая кислота» Biocon, Германия), фибриноген (количественное определение по Клауссу, набор «Тех-Фибриноген-тест», Технология стандарт). Уровни 38 гликированного гемоглобина (HbA1c) исследовали на анализаторе DCA2000+ фирмы «Bayer» (Германия). Параметры липидного обмена и адекватность контроля диабета оценивали согласно критериям Международной федерации диабета (2005). Целевые значения общего холестерина (ХС) менее 4,5 ммоль/л, ХС ЛПНП менее 2,5 ммоль/л, ХС-ЛПВП у мужчин более 1,0 ммоль/л, у женщин более 1,2 ммоль/л, триглицеридов менее 1,7 ммоль/л. Содержание ХС липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП) рассчитывалось по формуле Фридвальда в модификации Dahlen (1986 г.): ХС ЛПНП=ОХС-(ТГ/2,2+ХС ЛПВП) Коэффициент атерогенности (КА) рассчитывался по формуле: КА = (ОХС-ХСЛПВП)/ХСЛПВП. Для оценки инсулинорезистентности и функциональной активности Bклеток поджелудочной железы применялся метод математической модели оценки гомеостаза, в частности, индекс НОМА-IR (глюкоза натощак (ммоль/л) х ИРИ (меЕД/мл)/22,5) и индекс НОМА-B (20 х ИРИ базальный (мкЕд/мл)/глюкоза базальная (ммоль/л)-3,5). Критерием ИР является показатель НОМА-IR более 2,77. Показатель активности B-клеток (НОМАB) не должен превышать 180%. Из инструментальных ультразвуковое ультразвуковое исследование исследование методов органов обследования брюшной щитовидной проводилось полости, железы, а также суточное мониторирование ЭКГ у части больных. 2.4 Генотипирование и отбор генетических маркеров Генотипирование образцов ДНК 192 участников исследования проведено в лаборатории ЗАО «Геноаналитика» научного парка МГУ (директор по науке – к. ф-м. н. А. М. Мазур), г. Москва (лицензия на 39 осуществление Идентификация медицинской генотипов деятельности полиморфных №ЛО-77-01-005379). маркеров проводилась по протоколу BeadСhip GoldenGate компании Illumina [157] с использованием синтезированного ДНК-биочипа, содержащего 96 ОНП, ассоциированных в различных популяциях с СД2, нарушениями углеводного обмена, ожирением, АГ и дислипидемией (таблица 8). Группа исследуемых полиморфных маркеров сформирована на основании результатов научных работ по изучаемой теме: рассмотрены проведенные в различных популяциях исследования генов-кандидатов, полногеномные исследования и их мета-анализы. В группу изучаемых полиморфных маркеров включены ОНП, выявленные в популяционных исследованиях генов-кандидатов СД2, rs1801282 гена PPARG [215], rs5219 (KCNJ11) [155], rs10010131 (WFS1) [113], rs757210 (HNF1B) [129], rs11061971 и rs16928751 (ADIPOR2) [85], rs2241766, rs266729, rs2082940 (ADIPOQ) [97] и при помощи семейного анализа сцепления rs7903146, rs12255372 (TCF7L2) [214]. Кроме того, в тестируемую группу ОНП вошли идентифицированные в европейских популяциях с использованием полигенного поиска ассоциаций полиморфные маркеры rs1111875 (HHEX) и rs13266634 (SLC30A8) [71], а также rs8050136 (FTO), rs10811661 (CDKN2A/В), rs7754840, rs10946398 (CDKAL1) и rs4402960 (IGF2BP2), продемонстрированы в ассоциации исследованиях СД2 с которыми Welcome Trutst были Case Control Consortium (WTCCC) [200], Finland-United States Investigation of NIDDM Genetics (FUSION) [75] и Diabetes Genetics Initiative (DGI) [142]. Выявленные в полногеномных исследованиях rs7756992 гена CDKAL1 (группа Steinthorsdottir V., 2007 г.) [81], rs2943641 гена IRS1 (группа Rung L., 2009 г.) [135] и rs7593730 в области RBMS-ITGB6 (группа Lu Qi, 2010 г.) [136] также внесены в список изучаемых ОНП. 40 Также для генотипирования отобраны полиморфные маркеры СД2, выявленные в процессе мета-анализов данных полногеномных поисков ассоциаций в европейской популяции. Это rs864745 (JAZF1), rs7961581 (TSPAN8-LGR5), rs12779790 (CDC123-CAMA1D), rs7578597 (THADA), rs4607103 (ADAMTS9) и rs10923931 (NOTCH2), идентифицированные в процессе мета-анализа DIAGRAM (Diabetes Genetics Replication And Metaanalysis) [182]. Из исследования DIAGRAM+ [227] в группу исследуемых ОНП вошли rs243021 (BCL11A), rs1801214 (WFS1), rs4457053 (ZBED3), rs972283 (KLF14),rs896854 (TP53INP1), rs13292136 (CHCHD9), rs231262 (KCNQ), rs11642841 (FTO), rs1552224 CENTD2, rs1531343 (HMGA2), rs7957197 (HNF1A), rs11634397 (ZFAND6), rs8042680 (PRC1) и rs5945326 (DUSP9. Еще шесть полиморфных маркеров отобрано из мета-анализа MAGIC (Meta-Analysis of Glucose and Insulin-related traits Consortium) [189]. Это rs11708067 (ADCY 5), rs340874 (PROX1), rs2191349 (DGKB-TMEM195), rs10830963 (MTNR1B), а также rs4607517 (GCK) и rs780094 (GCKR). В исследование введена группа полиморфных маркеров СД2, установленных в ходе масштабного мета-анализа, выполненного Saxena с соавторами. В нее вошли полиморфные маркеры ранее изучаемых генов СД2: rs1470579 (IGF2BP2), rs102440051 (DGKB-TMEM195), rs5015480 (HHEX), rs163184 (KCNQ1), rs2943634 (IRS1), rs4430796 (HNF1B), продемонстрировавших статистически значимые ассоциации (р=2,4×10 -6 для IBC исследований), а также впервые выявленные rs3793991 (GATAD2A), rs10770141 (TH/INS), rs12454712 (BCL2), rs4925115 (SREBF1). Дополнительно включены rs16906158 (FOLH1), rs11924032 (SLC2A2), rs11671664 (GIPR), rs9273363 (HLA-DQB1) с пограничными значениями статистической значимости [172]. В ходе отбора ОНП для тестирования проанализированы результаты целого ряда исследований, проведенных в азиатских популяциях. В частности, полногеномные поиски ассоциаций, проведенные Yamauchi и 41 Yasuda среди японцев [74, 235], а также мета-анализ полногеномных поисков ассоциаций корейской, тайваньской, китайской, японской и сингапурской популяций [183]. В результате в исследование были включены rs76124633 (URE2E2), rs7172432 (C2CD4A-C2CD4B), rs2237892 (KCNQ1) и восемь новых локусов, ассоциации с СД2 которых выявлены в ходе мета-анализа: rs7041847 (GLIS3), rs3786897 (PEPD), rs6017317 (FITMN2-R3HDML-HNF4A), rs1535500 (KCNK16), rs6815464 (MAEA), rs6467136 (GCC1-PAX-4), rs831571 (PSMD6) и rs9470794 (ZFAND3). Далее в ходе анализа работ, посвященных изучению генетических аспектов СД2, выделена группа ОНП, ассоциированных с различными нарушениями углеводного обмена: инсулинорезистентностью (индекс HOMA-IR), нарушенной толерантностью к глюкозе и гликемией натощак [189], высоким уровнем гликированного гемоглобина [110]. Данная группа включена в исследование, в нее вошли rs11920090 (SLC2A2), rs560887 (G6PC2), rs7034200 (GLIS3), rs10885122 (ADRA2A), rs11605924 (CRY2), rs7944584 (MADD), rs174550 (FADS1), rs35767 (IGF1), rs11071657 (C2CD4B), rs16926246 (HK1), rs1046896 (FN3K), rs1800562 (HFE), rs855791 (TMPRSS6), rs4737009 (ANK1), rs552976 (G6PC2/ABCB11), rs2779116 (SPTA1), rs7998202 (ATP11A-TUBGCP3), rs1799884 (GCK) и rs 1387153 (MNTR1B). В настоящее время ведется активная работа по изучению генетических механизмов развития не только СД2, но и других компонентов, сопутствующие ухудшению обмена углеводов – это нарушенный липидный обмен и артериальная гипертония. Вследствие чего в группу тестируемых ОНП вошли маркеры, идентифицированные в различных популяциях в ходе полногеномных поисков ассоциаций пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и их мета-анализов – это исследования Tsuzaki [219], Leu [87], Lu Qi [136], мета-анализ группы Huedan Ye [240], мета-анализ Coronary Artery Disease Genome-wide Replication and Meta-analysis (CARDIoGRAM) [173]. Из представленных в данных исследованиях полиморфных маркеров в 42 тестируемую группу дислипидемией rs4977574 и вошли ОНП, артериальной продемонстрировавшие гипертонией: (CDKN2A/B), rs12526453 (PHACTR1), rs1501299 связи с (ADIPOQ), rs2259816 (HNF1A), rs11206510 (PCSK9), rs646776 (CELSR2), rs3798220 (LPA), rs579459 (ABO), rs12413409 (CNNM2), rs964184 (ZNF259), rs2228671 и rs1122608 (LDLR). Исследование дополнено полиморфными маркерами rs15558902 (FTO), rs2867125 (TMEM18), rs571312 (MC4R), rs10938397 (GNPDA), значимо ассоциированными с ожирением в европейской популяции, что подтверждено мета-анализом Speliotes [293]. Далее для каждого ОНП компанией Illumina рассчитан индекс чувствительности (FS). Значение индекса FS менее 0,5 свидетельствало о низкой диагностической эффективности полиморфного маркера. В результате из исследования были исключены rs49255115 (SREBF1), rs1535500 (KCNK16), rs6467136 (GCC1PAX4), rs2779116 (SPTA1), rs7998202 (ATP11A-TUBGCP3), rs4977574 (CDKN2A/B), rs12526453 (PHACTR1), rs2259816 (HNF1A), rs11206510 (PCSK9). Таблица 8 Однонуклеотидные полиморфизмы, отобранные для изучения ассоциаций с сахарным диабетом 2-го типа в русской популяции Тюменской области п/н Однонуклеотидные полиморфизмы (наименование по базе данных National Center for Biotechnology Information, США) Название гена 1. rs1801282 PPARG 2. 3. 4. 5. 6. 7. rs5219 rs100010131 rs757210 rs11061971 rs16928751 rs2241766 KCNJ11 WFS1 HNF1B ADIPOR2 ADIPOR2 ADIPOQ Полное название гена Peroxisome proliferator-activated receptor gamma Kir6.2 K+ channel Wolfram syndrome 1 (wolframin) HNF1 homeobox B Adiponectin receptor 2 Adiponectin receptor 2 Adiponectin [215] [155] [113] [129] [85] [85] [97] 43 8. 9. rs7903146 rs12255372 TCF7L2 TCF7L2 10. rs1111875 HHEX 11. rs13266634 SLC30A8 Transcription factor 7-like 2 Transcription factor 7-like 2 Hematopoietically expressed homeobox Solute carrier family 30 (zinc transporter), member 8 [214] [214] [71] [71] [75, 142, 200] [75, 142, 200] [75, 142, 200] [75, 142, 200] [75, 200] 12. rs10811661 CDKN2A/В Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A/В 13. rs10946398 CDKAL1 CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1 14. rs7754840 CDKAL1 CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1 15. rs4402960 IGF2BP2 Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2 16. rs8050136 FTO Fat mass and obesity associated 17. rs7756992 CDKAL1 18. rs2943641 IRS1 19. rs7593730 RBMS1 20. rs7961581 TSPAN8 21. rs4607103 ADAMTS9 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. rs10923931 rs12779790 rs7578597 rs864745 rs1801214 rs7957197 rs1531343 NOTCH2 CDC123 THADA JAZF1 WFS1 HNF1A HMGA2 29. rs13292136 CHCHD9 Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2 pseudogene 9 [227] 30. rs243021 BCL11A B-cell CLL/lymphoma 11A (zinc finger protein) [227] 31. rs4457053 ZBED3 Zinc finger, BED-type containing 3 [227] CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1 Insulin receptor substrate 1 RNA binding motif, single stranded interacting protein 1 Tetraspanin 8 ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 9 Notch 2 Cell division cycle 123 Thyroid adenoma associated JAZF zinc finger 1 Wolfram syndrome 1 (wolframin) HNF1 homeobox A High mobility group AT-hook 2 [81] [135] [136] [182] [182] [182] [182] [182] [182] [182] [227] [227] 44 32. rs972283 KLF14 [227] CENTD2 Kruppel-like factor 14 Tumor protein p53 inducible nuclear protein 1 Centaurin-Delta-2 33. rs896854 TP53INP1 34. rs1552224 35. rs8042680 PRC1 Protein regulator of cytokinesis 1 [227] 36. 37. rs11642841 rs11634397 FTO ZFAND6 Fat mass and obesity associated Zinc finger, AN1-type domain 6 [227] [227] 38. Rs231262 KCNQ1 Potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily, member 1 [227] 39. 40. 41. 42. 43. rs5945326 rs10830963 rs11708067 rs340874 rs4607517 DUSP MTNR1B ADCY5 PROX1 GCK 44. rs780094 GCKR 45. rs2191349 46. [227] [227] Dual specificity phosphatase 9 Melatonin receptor 1B Adenylate cyclase 5 Prospero homeobox 1 Glucokinase (hexokinase 4) Glucokinase (hexokinase 4) regulator [227] [184] [184] [184] [184] DGKB Diacylglycerol kinase, beta 90kDa [184] rs1470579 IGF2BP2 Insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2 [172] 47. rs10244051 DGKB Diacylglycerol kinase, beta 90kDa [172] 48. rs5015480 HHEX Hematopoietically expressed homeobox [172] 49. rs163184 KCNQ1 Potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily, member 1 [172] 50. 51. rs2943634 rs4430796 IRS1 HNF1B 52. rs3794991 GATAD2A 53. 54. rs10770141 rs12454712 TH/INS BCL2 55. rs16906158 FOLH1 56. rs11924032 SLC2A2 57. rs11671664 GIPR 58. rs9273363 HLA-DQB1 Insulin receptor substrate 1 HNF1 homeobox B GATA zinc finger domain containing 2A Ttyrosine hydroxylase B-cell CLL/lymphoma 2 Folate hydrolase (prostate-specific membrane antigen) 1 Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 2 Gastric inhibitory polypeptide receptor Major histocompatibility complex, class II, DQ beta 1 [184] [172] [172] [172] [172] [172] [172] [172] [172] [172] 45 Potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily, member 1 59. rs2237892 KCNQ1 60. rs76124633 URE2E2 61. rs7172432 C2CD4A 62. rs6815464 MAEA Macrophage erythroblast attacher [183] 63. rs7041847 GLIS3 [183] 64. rs6017317 FITM2 GLIS family zinc finger 3 Fat storage-inducing transmembrane protein 2 65. rs831571 PSMD6 66. 67. rs9470794 rs3786897 ZFAND3 PEPD 68. rs11920090 SLC2A2 69. rs560887 70. 71. Ubiquitin-conjugating enzyme E2E 2 C2 calcium-dependent domain containing 4А Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 6 [235] [74] [74] [183] [183] Zinc finger, AN1-type domain 3 Peptidase D Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 2 [183] [183] G6PC2 Glucose-6-phosphatase, catalytic, 2 [189] rs7034200 rs10885122 GLIS3 ADRA2A GLIS family zinc finger 3 Adrenoceptor alpha 2A [189] [189] 72. rs11605924 CRY2 Cryptochrome 2 (photolyase-like) [189] 73. rs7944584 MADD 74. rs174550 FADS1 75. rs35767 IGF1 76. rs11071657 C2CD4B 77. 78. 79. rs16926246 rs1046896 rs1800562 HK1 FN3K HFE MAP-kinase activating death domain Fatty acid desaturase 1 Insulin-like growth factor 1 (somatomedin C) C2 calcium-dependent domain containing 4B Hexokinase 1 Fructosamine 3 kinase Hemochromatosis 80. rs855791 TMPRSS6 Transmembrane protease, serine 6 [110] 81. rs4737009 ANK1 Ankyrin 1, erythrocytic [110] 82. rs552976 G6PC2 Glucose-6-phosphatase, catalytic, 2 [110] 83. 84. rs1799884 rs1387153 GCK MTNR1B Glucokinase (hexokinase 4) Melatonin receptor 1B 85. rs1501299 ADIPOQ Adiponectin [110] [110] [87, 219] 86. rs646776 CELSR2 Cadherin, EGF LAG seven-pass G- [189] [189] [189] [189] [189] [110] [110] [110] [173] 46 type receptor 2 87. rs3798220 LPA 88. rs579459 ABO 89. rs12413409 CYP17A1 90. 91. 92. 93. 94. 95. rs964184 rs1122608 rs2228671 rs1558902 rs2867125 rs571312 ZNF259 LDLR LDLR FTO TMEM18 MC4R 96. rs10938397 GNPDA Lipoprotein, Lp(a) ABO blood group (transferase A, alpha 1-3-Nacetylgalactosaminyltransferase; transferase B, alpha 1-3galactosyltransferase) Cytochrome P450, family 17, subfamily A, polypeptide 1 Zinc finger protein 259 Low density lipoprotein receptor Low density lipoprotein receptor Fat mass and obesity associated Transmembrane protein 18 Melanocortin 4 receptor Glucosamine-6-phosphate deaminase 1 [173] [173] [173] [173] [173] [240] [93] [93] [93] [93] По завершении первого этапа научно-исследовательской работы в Федеральной службе по интеллектуальной собственности (Роспатент) были получены свидетельства о регистрации баз данных «Набор генетических полиморфизмов для проведения генетического тестирования индивидуальной предрасположенности к сахарному диабету 2 типа» (№2014620078 от 13.01.14) и «Генетические полиморфизмы, ассоциированные с сахарным диабетом 2 типа» (№2012620304 от 23.03.12). 2.5 Статистическая обработка данных Статистический анализ полученных данных проведен с применением пакета прикладных программ STATISTICA (StatSoft Inc. версия 6,0, США), а также программ статистического анализа Microsoft Excel, версия 7.0, SPSS/Win (версия 13.0; SPSS Inc., США). Количественные показатели, подчиняющиеся нормальному распределению, представлены в виде среднего 47 значения и стандартного отклонения (М±δ). При распределении, отличном от нормального, количественные показатели представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Ме [25%; 75%]). При сравнении средних значений двух независимых выборок, подчиняющихся нормальному распределению, применялся статистический тест Стьюдента. Сравнение двух независимых выборок с непараметрическим распределением проводилось с помощью теста Колмогорова-Смирнова и U-теста по методу Манна-Уитни. Для количественных определения показателей взаимосвязи применялся качественных коэффициент и/или корреляции Спирмена. Анализ качественных показателей проведен методом подсчета абсолютных и относительных частот с построением таблиц сопряженности. Достоверность различий частот в изучаемых признаках оценивалась с помощью критерия непараметрический χ2, для точный малых критерий выборок Фишера. рассчитывался Различия считались достоверными при p<0,05 (95% уровень значимости). Относительный риск заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли как соотношение шансов (OR). Значение OR вычисляли с помощью online-программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (http://gen-exp.ru/calculator_or.php). В программу вводили значения А, В, С, D, где А – число лиц с наличием и В – с отсутствием данного аллеля (генотипа) среди больных (осложненных) пациентов, С и D – число лиц, соответственно, с наличием и отсутствием данного аллеля (генотипа) среди здоровых лиц. OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR более 1 как положительную ассоциацию («фактор предрасположенности»), OR менее 1 – как заболеванием отрицательную («фактор ассоциацию устойчивости»). аллеля или Доверительный генотипа с интервал представляет собой интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95% находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра; в данном случае, значение OR. Для проверки соответствия эмпирического 48 распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга проводилось с использованием точного критерия Фишера и теста хи-квадрат (χ2). Для установления значимых связей СД2 и носительства сочетаний аллелей и/или генотипов применяли оригинальное программное обеспечение APSampler (http://code.google.com/p/apsampler/), использующее метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику. 49 ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ И ГОРМОНАЛЬНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ Для определения клинических особенностей СД2 проведен анализ антропометрических показателей участников групп исследования. Распределение пациентов с СД2 и испытуемых группы контроля в зависимости от индекса массы тела представлено в таблице 9. Пациенты основной группы в 100% случаев имели избыток массы тела или ожирение, в сравнении с группой контроля, которая представлена испытуемыми с нормальной массой тела в 73,9% или легким избытком (ИМТ ≤ 27,9) в 26,1% случаев. Пациенты с ожирением не включались в контрольную группу. Избыток массы тела имели 22 (22,9%) участника основной группы, 74 пациента (71,1%) страдали ожирением, из них первая степень ожирения зарегистрирована у 32,3% больных, вторая – у 22,9% и третья – у 21,9% пациентов. Таблица 9 Распределение пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и здоровых испытуемых в зависимости от индекса массы тела Основная группа (n=96) абс. % 0 Группа контроля (n=96) абс. % 71 73,9 Нормальная масса тела (ИМТ < 24,9 кг/м2) Избыток массы тела (ИМТ 25-29,9 кг/м2) Ожирение (всего) I (ИМТ 30,0-34,9 кг/м2) 22 22,9 25 26, 1 74 31 71,1 32,3 0 0 0 0 II (ИМТ 35,0-40,0кг/м2) 22 22,9 0 0 III (ИМТ>40 кг/м2) 21 21,9 0 0 Для определения особенностей распределения χ2, р p<0,0001 χ2=0,11 р=0,74 p<0,0001 χ2=34,6 p<0,0001 χ2=22,6 p<0,0001 χ2=21,4 p<0,0001 жировой ткани у испытуемых проанализированы показатели ОТ, ОБ, а также индекс ОТ/ОБ 50 (таблица 10). Установлено, что в основной группе 100% мужчин и 100% женщин имели увеличение окружности талии в сравнении с группой контроля, где эти показатели составили 10,41% и 13,54% соответственно (χ2=34,6; p<0,001 и χ2=74,0; p<0,01). В исследовании отмечено, что соотношение ОТ/ОБ более 0,85 у женщин и более 0,95 у мужчин выявлено в 88,54% случаев в основной группе, причем, абдоминальный тип ожирения чаще регистрировался среди женщин, чем среди мужчин. Представленные данные свидетельствуют, что для пациентов с СД2 характерно наличие ожирения с распределением жировой ткани преимущественно по абдоминальному типу. Таблица 10 Распределение участников в исследуемых группах в зависимости от окружности талии и бедер, индекса ОТ/ОБ Основная группа, Группа контроля, абс. (%) абс. (%) Показатель Нормальный показатель ОТ (мужчины ˂ 94 см) (женщины ˂ 80 см) Увеличенный объем ОТ (мужчины ≥ 94 см) (женщины ≥ 80 см) Нормальный индекс ОТ/ОБ (мужчины ОТ/ОБ ˂ 0,95) (женщины ОТ/ОБ ˂ 0,85) Абдоминальный тип ожирения (мужчины ОТ/ОБ ≥ 0,95) (женщины ОТ/ОБ ≥ 0,85) Всего(n=96) Мужчины Женщины (n=36) (n=60) 0 0 0 Всего(n=96) Мужчины Женщины (n=36) (n=60) 73 (76,0) 26 47 (27,08) (48,95) 96 (100) 23 (24,0) 36 (37,5) 60 (62,5) 10 (10,41) 11 (11,5) 6 (6,25) 5 (5,20) 85 (88,5) 30 55 (57,29) (31,25) 13 (13,54) 81 (84,4) 32 (33,33) 49 (51,04) χ2 , р Всего Мужчины Женщины χ2=114,6 p<0,01 χ2=34,6 p<0,01 χ2=74,0 p<0,01 χ2=99,4 p<0,01 15 (15,6) 4 (4,16) 11 (11,45) χ2=34,8 p<0,001 χ2=62,3 p<0,001 Рассмотрены анамнестические данные о причинах прибавки массы тела у испытуемых основной группы (таблица 11). Наиболее часто женщины 51 основной группы отмечали прибавку массы тела после беременности и родов (33,3%). У мужчин лидирующую позицию среди причин ожирения занимает избыточное питание (16,7%). Малоподвижный образ жизни у мужчин как фактор прибавки веса фиксировался чаще (7,3%), чем у женщин (3,1%), при этом занимая второе место среди причин ожирения (χ2=3,6; р=0,058). Появление избытка массы тела и ожирения в пубертатном возрасте указали 5,2% мужчин основной группы. Следовательно, в соответствии с анамнестическими данными, наиболее часто избыток массы тела и ожирения у пациентов с СД2 связан с неправильным питанием, беременностью и родами. Таблица 11 Причины прибавки массы тела у пациентов основной группы Основная группа (n=96) Причины прибавки массы тела Пубертатный возраст Беременность и роды Избыточное питание Малоподвижный образ жизни Соматические заболевания Другие причины Мужчины (n=36) абс. % 5 5,2 χ2, р Женщины (n=60) абс. % 0 0 Всего абс. 5 % 5,2 - - 32 33,3 32 33,3 16 16,7 9 9,4 25 26,0 7 7,3 3 3,1 10 10,4 2 2,1 6 6,3 8 8,3 1 1 3 3,1 4 4,2 χ2=6,2 p=0,013 χ2=8,7 p=0,003 χ2=3,6 p=0,058 χ2=0,15 p<0,7 χ2=0,1 p=1,0 Проведен анализ наследственной предрасположенности к ожирению, в ходе которого рассматривалась распространенность ожирения среди родственников испытуемых исследуемых групп (таблица 12). Отягощенный семейный анамнез по ожирению чаще (χ2=7,02; p<0,01) фиксировался в основной группе (52,1%), чем в группе контроля (34,3%). Следует отметить тот факт, что и в основной группе, и в группе контроля семейный анамнез по ожирению преобладал по линии матери. Таким образом, полученные данные 52 свидетельствуют, что в формировании ожирения значительная роль принадлежит генетическим факторам. Таблица 12 Распределение пациентов в группах исследования в зависимости от наследственного анамнеза по ожирению Отягощенная наследственнос ть по СД2 Основная группа, Группа контроля, абс. (%) абс. (%) Всего (n=96) Мужчины Женщины (n=36) (n=60) 7 (7,3) Всего (n=96) Мужчины Женщины (n=36) (n=60) 10 (10,4) Отец 5 (5,2) 2 (2,1) 7 (7,3) 21 (21,9) 3 (3,1) χ2, р Всего (n=96) Мужчины Женщин (n=36) ы (n=60) 2 χ =0,3 p>0,05 χ2=0,1 χ2=0,1 p=0,752 p=1,0 χ2=3,2 p>0,05 12 (12,5) Мать 5 (5,2) 16 (16,7) 2 (2,1) 12 (12,5) 2 (2,1) χ2=0,63 χ2=1,23 p=0,426 p=0,268 2 χ =6,2 p<0,05 χ2=0,51 χ2=4,54 p=0,473 p=0,033 - χ2=0,3 p>0,05 χ2=0,51 χ2=4,54 p=0,473 p=0,033 10 (10,4) 2 (2,1) Оба родителя 2 (2,1) 10 (10,4) - 1 (1) 2 (2,1) Мать+другие родственники - 1 (1) 2 (2,1) 1 (1) χ2=0,5 p>0,05 1 (1) Отец + другие родственники 1 (1) - 1 (1) - 8 (8,3) 6 (6,3) Другие родственники 6 (6,3) 2 (2,1) 1 (1) 50 (52,1) 5 (5,2) χ2=0,51 χ2=0,1 p=0,473 p=1,0 χ2=0,3 p>0,05 χ2=2,53 χ2=0,61 p=0,112 p=0,436 χ2=7,02 p<0,01 33 (34,4) Всего 19 (19,8) CД2 31 (32,3) характеризуется 13 (13,5) развитием 20 (20,8) χ2=1,41 p=0,236 специфических χ2=3,4 p=0,065 микро- и макрососудистых осложнений. Проведен анализ частоты микрососудистых осложнений, таких как диабетическая полинейропатия (таблица 13). ретинопатия, нефропатия и 53 Наиболее частым микрососудистым осложнением является диабетическая полинейропатия, ретинопатия зафиксированная установлена у в 55,20% 44,79% случаев. больных, Диабетическая при этом ранняя непролиферативная ретинопатия наблюдалась у 27% пациентов, а пре- и пролиферативная – у 8,3%. Анализ функционального состояния почек показал, что диабетическая нефропатия зарегистрирована у 33,6% пациентов, из них 26,3% – в стадии микроальбуминурии и 7,3% – в стадии протеинурии. Согласно рассчитанным значениям СКФ в основной группе исследования 28 (29,2%) пациентов имели 1 стадию ХБП, 56 (58,3%) – 2 стадию, 9 (9,4%) – 3а стадию и 2 (2,1%) – 3б стадию ХБП. В основной группе регистрировалась различная длительность заболевания: у 19 (19,7%) больных стаж СД2 составлял менее 1 года, максимально зарегистрированная продолжительность СД2 – 30 лет C увеличением длительности СД2 растет число сосудистых осложнений (рисунок 3). Основной Основной Более 15 лет Основной Основной Основной Основной Диабетическая ретинопатия 5-15 лет 1-5 лет Основной Основной Основной До 1 года Основной Основной Основной Диабетическая нефропатия Диабетическая полинейропатия ОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновной Рисунок 3. Характеристика пациентов сахарным диабетом 2-го типа в зависимости от наличия микрососудистых осложнений и стажа заболевания Рост числа наблюдается при случаев стаже диабетической заболевания нефропатии более 5 лет. и ретинопатии Диабетическая 54 полинейропатия зафиксирована в 100% случаев в группах пациентов с длительностью заболевания от 5 до 15 и более 15 лет. Ранняя инвалидизация и высокая смертность среди больных СД2 обусловлены, в первую очередь, развитием макрососудистых осложнений, в особенности ИБС. Вследствие чего проанализирована распространенность ИБС в исследуемых группах. У испытуемых основной группы ИБС и инфаркт миокарда зафиксированы в 39,6% и 22,0% случаев соответственно, что значительно чаще (χ2=11,36; р<0,001 и χ2=4,36; р=0,037), чем в группе контроля (16,7% и 2,1%). Согласно анамнестическим данным родственники с ИБС и/или перенесенным инфарктом миокарда в группах исследования встречались со сходной частотой (22,0% и 26%) – χ2=0,26; р=0,6. Общность патогенетических механизмов обусловливает высокую частоту коморбидности артериальной гипертонии и СД2. Артериальная гипертония является крайне распространенным заболеванием, встречающимся у 20% взрослого населения, а у пациентов с СД2 – более чем у 50% случаев. В ходе исследования пациенты с артериальной гипертонией выявлены как в основной группе, так и в группе контроля. Согласно критериям диагностики артериальная гипертония установлена у 76% пациентов с СД2 и у 20,8% испытуемых группы контроля (χ2=56,4; р<0,001). У мужчин основной группы артериальная гипертония встречается в 25% случаев, а в группе контроля – 7,3% (χ2 =14,5; р<0,001), среди женщин 51% и 13,5% соответственно (χ2=40,9; р<0,001). Однако средние значения САД (139,8±16,6 и 119,9±17,7) и ДАД (87,4±11,7 и 77,0±11,1) были статистически значимо выше в основной группе, чем в группе контроля (р<0,001; р=0,00003). Отягощенный наследственный анамнез по артериальной гипертонии наблюдался у 52,1% случаев основной группы и у 49,3% – группы контроля (χ2=0,08; р=0,77). Острое нарушение мозгового кровообращения в анамнезе выявлено у 4 (4,2%) пациентов основной группы. 55 Гликемия натощак, постпрандиальная гликемия, уровни ИРИ и С-пептида являются основными характеристиками течения и прогрессирования СД2. Гипергликемия, особенно постпрандиальная, приводит к снижению синтеза и секреции инсулина, а также к развитию оксидативного стресса и, следовательно, к развитию осложнений. В исследовании выполнен сравнительный анализ показателей углеводного обмена. Установлено (рисунок 4), что пациенты основной группы имели статистически значимо более высокие показатели как базального, так и стимулированного уровня глюкозы 5,6 [4,9; 7,1] и 7,11 [5,6; 13,3] ммоль/л, чем в группе сравнения 4,95 [4,69; 5,35] и 5,0 [4,5; 5,79] ммоль/л соответственно (р<0,001). Рисунок 4. Медиана концентраций базального и стимулированного уровней глюкозы в группах исследования (p<0,0001) Уровни гликемии, базальный и стимулированный, влияют на показатели гликированного гемоглобина, являющегося так же, как и постпрандиальная гликемия, индикатором риска развития сосудистых осложнений. В основной группе HbA1c менее 7% имеют 66,7% пациентов, а более 7% – 33,3%. Средний уровень гликированного гемоглобина в основной группе составил 7,05 [6,4; 8,3]. Cравнительный анализ показателей функциональной активности Вклеток (ИРИ и С-пептида) представлен на рисунке 5. Пациенты основной группы имели статистически значимо (p<0,001) более высокие и базальные, и стимулированные значения ИРИ (16,0 [10,1; 19,9] и 31,0 [19,6; 47,2]) 56 мкЕд/мл, С-пептида (2,8 [19,1; 4,7] и 5,8 [2,9; 8,5] нг/мл), чем в группе контроля (8,5 [6,4; 10,9] и 21,4 [12,7; 30,5] мкЕд/мл, 1,3 [1,1; 1,6], а также 1,7 [1,4;2,5]и 4,7 [3,2; 6,7] соответственно). Рисунок 5. Медианы концентраций базального и стимулированного уровней ИРИ и С-пептида в группах исследования (p<0,0001) В ходе исследования рассчитаны показатели оценки инсулинорезистентности (индекс HOMA-IR) и функциональной активности В-клеток (индекс HOMA-B). Полученные данные представлены на рисунке 6. Рисунок 6. Сравнительная характеристика индексов HOMA-B и HOMA-IR в группах исследования (p<0,05) У пациентов с СД2 выявлено статистически значимое (p<0,0001) снижение функциональной активности В-клеток (индекс HOMA-B – 80,95%) на фоне возрастающей инсулинорезистенстности (индекс HOMA-IR – 4,8 [3,4; 8,2]) по сравнению с группой контроля (109,3% и 1,9 [1,6; 2,3]). Значение HOMA-IR более 2,77 зарегистрировано у 67,7% пациентов 57 основной группы. Таким образом, для пациентов с СД2 в отличие от группы контроля характерно наличие инсулинорезистентности, более высокие показатели уровня гликемии, С-пептида, а также ИРИ, который носит компенсаторный характер и направлен на поддержание эугликемии. Для установления взаимосвязей показателей углеводного обмена с наличием сосудистых осложнений СД2 в основной группе проведен корреляционный анализ (таблица 13). Установлены положительные корреляционные связи между уровнем базальной и стимулированной глюкозы и ДР (r=0,17; p=0,02 и r=0,38; p<0,0001), ДН (r=0,19; p=0,008 и r=0,38; p<0,0001) и ДП (r=0,26; p=0,0002 и r=0,45; p=0,0001). Также слабая корреляционная зависимость выявлена между уровнем инсулина базального и ДН (r=0,15; p<0,037). Таблица 13 Корреляционные связи показателей углеводного обмена с наличием сосудистых осложнений сахарного диабета 2-го типа в основной группе Показатели ДР ДН ДП АГ ИБС Глюкоза базальная, ммоль/л Глюкоза стимулированн ая, ммоль/л Инсулин базальный, мМЕ/мл Инсулин стимулированн ый, мМЕ/мл С-пептид базальный, нг/мл С-пептид стимулированн ый, нг/мл r=0,17 p=0,02 r=0,19 p=0,008 r=0,26 p=0,0002 r=0,48 p<0,0001 r=0,05; p=0,63 r=0,38 p<0,0001 r=0,38 p<0,0001 r=0,45 p=0,0001 r=0,53 p<0,0001 r=0,04; p=0,65 r=0,15 p<0,037 r=0,15; р=0,16 r=0,29 p<0,01 r=-0,25 p=0,002 r=0,23; р=0,9 r=0,25 р=0,6 r=0,13; p=0,3 r=0,07; р=0,06 r=-0,36 p<0,001 r=0,07; p=1,0 r=0,03; p=0,4 r=0,13; p=0,6 r=0,29 p<0,0003 r=0,34; р=0,16 r=0,2; р=0,5 r=0,17; P=0,25 r=0,13 p=0,84 r=0,18; р=0,34 r=-0,35 p=0,001 r=0,13; р=0,09 Наибольшее число корреляционных взаимодействий установлено для АГ: с глюкозой базальной – r=0,48; p<0,0001, с глюкозой стимулированной – r=0,53; p<0,0001, С-пептидом базальным – r=0,29; p<0,01, С-пептидом стимулированным – r=0,29; p<0,0003. 58 При анализе метаболических показателей установлены статистически значимые различия в липидном профиле испытуемых исследуемых групп (таблица 14). Таблица 14 Сравнительная характеристика основных показателей липидного обмена в основной группе и группе контроля Показатель Общий холестерин, ммоль/л Триглицериды, ммоль/л ЛПВП, ммоль/л ЛПНП, ммоль/л Основная группа (n=96) 5,3 [4,8; 5,9] 1,7 [1,1; 2,2] 1,1 [0,8; 1,5] 3,0 [2,5; 4,0] Группа контроля (n=96) 4,8 [4,5; 5,4] 0,92 [0,6; 1,2] 1,6 [1,4; 1,9] 3,0 [2,6; 3,5] Р p=0,014 p<0,00001 p<0,00001 p=0,34 Так, в основной группе показатели ХС и ТГ были статистически значимо выше (р=0,014; р<0,00001), а уровни ЛПВП – ниже (р<0,00001), чем в группе контроля. Различия средних уровней ЛПНП в группах исследования не достигали статистической значимости (р=0,34). Для выявления особенностей липидного обмена у пациентов СД2 проанализирована частота нарушений профиля липидов среди мужчин и женщин основной группы (рисунок 7). Различные формы дислипидемии встречаются более чем у половины пациентов с СД2. Согласно представленным данным, среди мужчин чаще, чем среди женщин наблюдались гиперхолестеринемия (86,1% и 75,0%) и гипертриглицеридемия (58,3% и 53,3%). ЛПНП ≥ 2,6 ЛПВП < 1,2 / < 1,0 Триглицериды ≥ 1,7 Общий холестерин ≥ 4,5 Основной Основной Основной Основной Основной Основной Женщины (n=60) Мужчины (n=36) Основной Основной Основной Основной Основной Основной Основной Основной Рисунок 7. Частота нарушений липидного обмена среди мужчин и женщин основной группы 59 В исследовании определены взаимосвязи показателей углеводного и липидного обмена у пациентов с СД2 (таблица 15). Установлено, что показатели ТГ положительно коррелируют с уровнем глюкозы базальной (r=0,24; p=0,02), с ИРИ базальным (r=0,23; p=0,01) и стимулированным (r=0,25; p=0,02), а отрицательно взаимосвязаны показатели общего холестерина с С-пептидом базальным (r=-0,24; p=0,03), уровни ЛПНП с Спептидом базальным (r=-0,34; р=0,002) и С-пептидом стимулированным (r=0,22; p=0,04). Таблица 15 Корреляционные связи показателей углеводного и липидного обмена в основной группе Показатели Глюкоза базальная, ммоль/л Глюкоза стимулированная, ммоль/л Инсулин базальный, мМЕ/мл Инсулин стимулированный, мМЕ/мл ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л ЛПВП, ммоль/л ЛПНП, ммоль/л r=0,14; р=0,17 r=0,24; р=0,02 r=0,05; р=0,64 r=-0,002; р=0,99 r=0,19; р=0,07 r=0,16; р=0,12 r=0,07; р=0,94 r=0,016; р=0,88 r=0,009; р=0,94 r=0,27; р=0,01 r=-0,22; р=0,05 r=-0,06; р=0,59 r=-0,03; р=0,81 r=0,25; р=0,02 r=0,18; =р=0,09 r=0,05; р=0,68 r=-0,24; р=0,03 r=0,15; р=0,18 r=-0,34; р=0,02 r=-0,34; р=0,002 r=-0,14; р=0,19 r=0,14; р=0,19 r=-0,1; р=0,37 r=-0,22; р=0,04 С-пептид базальный, нг/мл С-пептид стимулированный, нг/мл Таким образом, в ходе проведенного анализа установлено, что для пациентов с СД2 характерны более высокие значения массы тела, а также абдоминальный тип распределения жировой ткани. При сравнительной характеристике гормонально-метаболических показателей выявлено, что у пациентов основной группы в отличие от группы контроля чаще регистрировались нарушения липидного обмена: гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия; снижение индекса HOMA-В, высокие значения 60 индекса HOMA-IR и показателей углеводного обмена: базального и стимулированного уровня глюкозы, ИРИ, С-пептида, взаимосвязанных с формированием микрососудистых осложнений, увеличивается вместе с длительностью заболевания. число которых 61 ГЛАВА 4. АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ ИССЛЕДУЕМЫХ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-го ТИПА В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ В соответствии с поставленными задачами в работе проведен анализ частот аллелей и генотипов 96 исследуемых полиморфных маркеров в группе пациентов с СД2 и у здоровых испытуемых. При проведении первичной статистической обработки распределение частот генотипов полиморфных маркеров rs1801214 и rs10010131 гена WFS1, rs10946398 гена CDKAL1, rs13292136 гена CHCHD9, rs16926246 гена HK1, rs5945326 гена DUSP9, rs855791 гена TMPRSS6 было определено как не соответствующее равновесию Харди-Вайнберга, и указанные ОНП не подвергались дальнейшему анализу. Данных, полученных в ходе генотипирования полиморфных маркеров rs5219 гена KCNJ11, rs10770141 гена TH/INS, rs3794991 гена GATAD2A, rs37982220 гена LPA, rs76124633 гена URE2E2, rs7961581 гена TSPAN9, было недостаточно для анализа, вследствие чего перечисленные позиции были исключены из исследования. При проведении сравнительного анализа распространенности аллелей и генотипов исследуемых маркеров установлены ассоциации 10 полиморфных генетических маркеров с СД2 в русской популяции Тюменской области (таблица 16). Таблица 16 Аллельные варианты генов, ассоциированных с развитием сахарного диабета 2-го типа, в русской популяции Тюменской области № Однонуклеотидные полиморфизмы Название гена 1 rs8050136 FTO 2 rs11642841 FTO 3 rs571312 MC4R 4 rs2943641 IRS1 5 rs2943634 IRS1 62 6 7 8 9 10 rs7172432 rs1470579 rs163184 rs11924032 rs11634397 C2CD4A IGF2BP2 KCNQ1 SLC2A2 ZFAND6 Среди испытуемых контрольной группы и пациентов с СД2 русской популяции Тюменской области не выявлено статистически значимых различий в частоте встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов rs1801282 (PPARG), rs7903146 и rs12255372 (TCF7L2), rs13266634 (SLC30A8), (CDKN2A), rs757210 rs1111875 и rs4430796 и rs5015480 (HNF1B), (HHEX), rs4607103 rs10811661 (ADAMTS9), rs10923931, (NOTCH2), rs12779790 (CDC123), rs7578597 (THADA), rs864745 (JAZF1), rs2237892 и rs231262 (KCNQ1), rs7593730 (RBMS1), rs10830963 и rs1387153 (MTNR1B), rs11708067 (ADCY5), rs340874 (PROX1), rs4607517, rs1799884 (GCK), rs780094 (GCKR), rs2191349 (DGKB), rs7957197 (HNF1A), rs1531343 (HMGA2), rs243021 (BCL11A), rs4457053 (ZBED3), rs4402960 (IGF2BP2), rs972283 (KLF14), rs896854 (TP53INP1), rs1552224 (CENTD2), rs8042680 (PRC1), rs76124633 (FHIT), rs10244051 (DGKB), rs6815464 (MAEA), rs6017317 (FITM2), rs831571 (PSMD6), rs9470794 (ZFAND3), rs3786897 (PEPD), rs12454712 (BCL2), rs16906158 (FOLH1), rs11671664 (GIPR), rs11920090 (SLC2A2), rs7034200 и rs7041847 (GLIS3), rs10885122 (ADRA2A), rs11605924 (CRY2), rs7944584 (MADD), rs174550 (FADS1), rs35767 (IGF1), rs11071657 (C2CD4B), rs1046896 (FN3K), rs1800562 (HFE), rs4737009 (ANK1), rs552976 и rs560887 (G6PC2), rs11061971 и rs16928751 (ADIPOR2), rs2241766 и rs1501299 (ADIPOQ), rs7756992 и rs7754840 (CDKAL1), rs646776 (CELSR2), rs579459 (ABO), rs12413409 (CYP17A1), rs964184 (ZNF259), rs1122608 и rs2228671 (LDLR), rs1558902 (FTO), rs2867125 (TMEM18), rs10938397 (GNPDA). Далее проведен анализ распространенности и оценка рисков развития СД2 у носителей различных аллелей и генотипов полиморфных 63 генетических маркеров, продемонстрировавших ассоциации с СД2 в русской популяции Тюменской области: rs8050136 и rs11642841 гена, ассоциированного с жировой массой и ожирением (FTO), rs2943641 и rs2943634 гена субстрата инсулинового рецептора-1 (IRS1), rs571312 гена рецептора меланокортина-4 (MC4R), rs1470579 гена белка 2, связывающего инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF2BP2), rs163184 гена, кодирующего субъединицу-1 канала, зависимого от ионов калия (KCNQ1), rs11924032 гена внутриклеточного транспортера глюкозы 2 типа (SLC2A2), rs11634397 гена, кодирующего домен 6 цинкового пальца (ZFAND6), rs7172432 гена, кодирующего домен С2, зависимый от ионов кальция (C2CD4A). 4.1. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs8050136 и rs11642841 гена FTO у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля Ген FTO кодирует фермент диоксигеназу, зависимую от альфакетоглутарат, и ассоциирован с массой жировой ткани и ожирением [68]. Увеличение массы тела за счет жировой ткани потенцирует развитие инсулинорезистентности и, как следствие, СД2. В 2007 году Frayling с соавторами обнаружил в европейской популяции ассоциацию гена FTO с СД2 [68]. У людей с избыточным весом отмечена связь между носительством гена FTO и повышенным значением индекса HOMA-IR, содержанием триглицеридов, инсулина и глюкозы натощак [116]. Исследование роли гена FTO в формировании ожирения и СД2 в русской популяции немногочисленны. При этом рисковые для европейцев rs8050136 (OR=1,15 [1,09-1,22]) [182] и rs11642841 (OR=1,13 [1,08-1,18]) [227] в исследованиях русской популяции ранее не проявили ассоциаций ни с метаболическим синдромом (в работе М. А. Гарбузовой (2010) [17], ни с СД2 (в работе В. А. Потапова) [49]. 64 Результаты исследования полиморфного маркера rs8050136 гена FTO у испытуемых контрольной группы и у пациентов с СД2 русской популяции Тюменской области представлены в таблице 17. Cтатистически значимых различий в распределении частот аллелей полиморфного маркера rs8050136 гена FTO не выявлено (χ2=3,42; р=0,06). В ходе изучения распределения частот генотипов маркера rs8050136 гена FTO установлено, что доля генотипа АА составила 22% в основной группе по сравнению с группой контроля (19,1%), доля генотипа АС (56,0%) у пациентов с СД2 была также выше, чем у здоровых испытуемых, а генотип СС, напротив, чаще встречался в контрольной (38,3%), чем в основной группе (22,0%) – (χ2=5,96; р=0,05). Последующий анализ позволил установить статистически значимую ассоциацию генотипа СС со снижением риска развития СД2 (OR=0,45 [0,240,87]; р=0,05). При этом не показали наличия ассоциаций с СД2 аллель А (OR=1,47 [0,98-2.22]; р=0,06) и аллель С (OR=0,68 [0,45-1,02]; р=0,06), генотип АА (OR=1,19 [0,58-2,43]; р=0,05) и генотип СС (OR=1,72 [0,96-3,08]; р=0,05). Таблица 17 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs8050136 гена FTO в основной группе и в группе контроля OR Основная Группа Аллели χ2 р группа контроля знач. 95% CI Аллель A 0,500 0,404 1,47 0,98 – 2,22 3,42 0,06 Аллель C 0,500 0,596 0,68 0,45 – 1,02 Генотип AA 0,220 0,191 1,19 0,58 – 2,43 Генотип AC 0,560 0,426 5,96 0,05 1,72 0,96 – 3,08 Генотип CC 0,220 0,383 0,45 0,24 – 0,87 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11642841 гена FTO в основной и контрольной группе испытуемых русской популяции Тюменской области представлено в таблице 18. 65 Частота аллеля А (50,0%) и аллеля С (50,0%) одинакова у пациентов с СД2, при этом в группе контроля частота аллеля С (60,2%) выше, чем аллеля А (39,8%) – χ2=3,88; р=0,05. Анализ частот генотипов полиморфного маркера rs11642841 позволил установить, что гомозиготное носительство генотипа АА и гетерозиготное носительство генотипа АС чаще регистрировалось в основной группе (20,9% и 58,2%), чем в группе контроля (17,2% и 45,2%). С другой стороны, носительство генотипа СС более распространено среди здоровых испытуемых (37,6%) – χ2=6,25; р=0,04. Таблица 18 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11642841 гена FTO в основной группе и в группе контроля OR Основная Группа Аллели χ2 р группа контроля знач. 95% CI 0,500 0,398 1,51 1,00 – 2,29 Аллель A 3,88 0,05 Аллель C 0,500 0,602 0,66 0,44 – 1,00 Генотип AA 0,209 0,172 1,27 0,61 – 2,66 6,25 0,04 Генотип AC 0,582 0,452 1,69 0,95 – 3,04 Генотип CC 0,209 0,376 0,44 0,23 – 0,84 Данные, полученные при расчете отношения шансов для аллеля А (OR=1,51 [1,0-2,29]; р=0,05), аллеля С (OR=0,66 [0,44-1,0]; р=0,05), генотипа АА (OR=1,27 [0,61-2,66]; р=0,04) и генотипа АС (OR=1,69 [0,95-3,04]; р=0,04) полиморфного маркера rs11642841 гена FTO не достигают статистической значимости. При этом выявлена ассоциация генотипа СС (OR=0,44 [0,230,84]; р=0,04) с пониженным риском развития СД2. Таким образом, исследования rs8050136 и rs11642841 гена FTO выявили наличие ассоциаций данных полиморфных генетических маркеров с СД2 в русской популяции Тюменской области. 66 4.2 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs571312 гена MC4R у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля Полиморфные маркеры гена MC4R, как и гена FTO, в исследованиях демонстрируют ассоциации с нарушениями углеводного обмена и ожирением [114, 111, 94]. Продукт гена является фактором регуляции пищевого поведения, потенцируя передачу сигналов лептина и других гормонов-регуляторов чувства насыщения. Нарушение гена рецептора меланокортина-4 (МС-4) у мышей вызывает диабет взрослого типа, гиперинсулинемию и гипергликемию, т.е. развитие фенотипического синдрома, характерного для СД2 у человека [8]. В таблице 19 представлено распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs571312 гена MC4R среди испытуемых контрольной группы и пациентов с СД2 русской популяции Тюменской области. Таблица 19 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs571312 гена MC4R в основной группе и в группе контроля OR Основная Группа Аллели χ2 р группа контроля знач. 95% CI Аллель A 0,239 0,138 1,96 1,15 – 3,34 6,19 0,01 Аллель C 0,761 0,862 0,51 0,30 – 0,87 Генотип A/A 0,087 0,011 8,86 1,08 – 72,31 Генотип A/C 0,304 0,255 7,08 0,03 1,28 0,67 – 2,42 Генотип C/C 0,609 0,734 0,56 0,30 – 1,05 Установлено, что доля аллеля А (23,9%) выше в основной группе, а доля аллеля С, наоборот, выше в группе контроля (86,2%) – χ2=6,19; р=0,01. Для пациентов с СД2 более характерно носительство гомозиготного генотипа АА (8,7%) и гетерозиготного генотипа АС (30,4%), чем для испытуемых контрольной группы (1,1% и 25,5%, соответственно). При этом 67 гомозиготный генотип СС чаще встречался в группе контроля (73,4%), чем в основной группе (60,9%) – χ2=7,08; р=0,03. Расчет отношения шансов для аллелей и генотипов полиморфного маркера rs571312 гена MC4R продемонстрировал, что с риском развития СД2 ассоциировано носительство аллея А (OR=1,96 [1,15-3,34]; р=0,01) и генотипа АА (OR=8,86 [1,08-72,35]; р=0,03), а снижает риск СД2 носительство аллеля С (OR=0,51 [0,30-0,87]; р=0,01). и генотипа СС (OR=0,42 [0,20-0,87]; р=0,01). Результаты расчетов для генотипа AC (OR=1,28 [0,67-2,42], p=0,03) и генотипа СС (OR=0б56 [0,30-1,05]; р=0,03) статистически не значимы. Из представленных данных можно заключить, что rs571312 гена MC4R относится к маркерам риска развития СД2 в русской популяции Тюменской области. 4.3 Распределение частот аллелей и генотипов rs2943634 и rs2943641 гена IRS1 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля Ген IRS1 кодирует субстрат инсулинового рецептора 1 (СИР-1). СИР-1 – первый рецептор в клетке, который активируется инсулином и запускает внутриклеточные процессы усвоения глюкозы. Первые ассоциации полиморфных маркеров гена IRS1 c СД2 были представлены Almind с соавторами в 1993 году в датской популяции [91]. В 2007 году в европейской популяции выявлена связь аллеля С полиморфного маркера rs2943641 гена IRS1 (OR=1,19 [1,13-1,25]) с развитием СД2 [135]. В таблице 20 представлено распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2943641 гена IRS1 у пациентов с СД2 и испытуемых контрольной группы. Частота аллеля Т ниже в основной группе (27,7%), чем в группе контроля (38,9%) – χ2=5,30; р=0,03. Напротив, аллель 68 С чаще выявлялся у пациентов с СД2 (72,3%), чем в контрольной группе (61,1%). Гомозиготное носительство генотипа ТТ (12,6%) и гетерозиготное носительство ТС (52,6%) чаще регистрировались в контрольной группе, чем среди пациентов с СД2 (9,8% и 35,9%), а носительство гомозиготного генотипа СС более характерно для основной группы (54,3%), чем для группы контроля (34,7%) – χ2=7,35; р=0,03. Результаты расчета отношения шансов для аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2943641 гена IRS1 позволили отнести аллель Т (OR=0,60 [0,39-0,93]; р=0,03) и генотип ТС (OR=0,50 [0,28-0,90]; р=0,03) к маркерам пониженного риска развития, а аллель С (OR=1,6 [1,08-2,57]; р=0,03) и генотип СС (OR=2,24 [1,24-4,03]; р=0,03) к маркерам повышенного риска СД2. Следовательно, ассоциация rs2943641 гена IRS1с СД2 актуальна и для русской популяции, что подтверждено представленными результатами настоящего исследования. Таблица 20 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2943641 гена IRS1 в основной группе и в группе контроля Основная Группа OR Аллели χ2 Р знач. 95% CI группа контроля Аллель Т 0,277 0,389 0,60 0,39 – 0,93 5,30 0,03 Аллель С 0,723 0,611 1,66 1,08 – 2,57 Генотип ТТ 0,098 0,126 0,75 0,30 – 1,87 Генотип ТС 0.359 0,526 7,35 0,03 0,50 0,28 – 0,90 Генотип СС 0,543 0,347 2,24 1,24 – 4,03 Значимая ассоциация полиморфного маркера rs2943634 региона гена IRS1 (OR=1,09 [1,05-1,12]) с СД2 подтверждена в крупном исследовании, выполненном Saxena с соавторами в 2012 году [172]. Голландские исследователи в 2012 году установили роль полиморфного маркера rs2943634 гена IRS1 в регуляции массы тела и метаболизма инсулина при метаболическом синдроме [206]. 69 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2943634 гена IRS1 в группе пациентов с СД2 и в группе здоровых испытуемых русской популяции Тюменской области отображено в таблице 21. Таблица 21 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2943634 гена IRS1 в основной группе и в группе контроля Основная Группа OR Аллели χ2 р знач. 95% CI группа контроля Аллель A 0,265 0,376 0,60 0,38 – 0,95 4,68 0,03 Аллель C 0,735 0,624 1,67 1,05 – 2,66 Генотип AA 0,062 0,082 0,73 0,22 – 2,41 Генотип AC 0,407 0,588 6,89 0,03 0,48 0,26 – 0,89 Генотип CC 0,531 0,329 2,30 1,23 – 4,32 Отмечено, что в основной группе доля аллеля С больше (73,5%), чем в группе контроля (62,4%), а аллеля А, напротив, больше в группе здоровых (37,6%), чем у пациентов с СД2 (25%) – χ2=4,68; р=0,03. Генотип АА и генотип АС преобладают в контрольной группе (8,2% и 58,8%), а генотип СС – в основной группе (53,1%) – χ2=6,89; р=0,03. Значение отношения шансов для аллеля С составляет 1,67 [1,05-2,66]; р=0,03, а для генотипа СС – 2,3 [1,23-4,32]; р=0,03, что позволяет отнести их к возможным маркерам повышенного риска СД2. Вероятным маркером пониженного риска СД2 является генотип АС (OR=0,48 [0,26-0,89]; p=0,03) и аллель А (OR=0,60 [0,38-0,95]; p=0,03). Таким образом, в настоящем исследовании подтверждена ассоциация полиморфного маркера rs2943641 гена IRS1 с СД2, а также впервые в русской популяции выявлена ассоциация c CД2 полиморфного маркера rs2943634 гена IRS1. 70 4.4 Распределение частот аллелей и генотипов rs1470579 гена IGF2BP2 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля Ген IGF2BP2 кодирует один из трех агентов, регулирующих трансляцию ИФР-2. ИФР-2 является главным фактором роста плода [69]. Эксперименты на мышах, посвященные изучению апоптоза B-клеток и ИФР2 как фактору их выживания, показали, что гибель В-клеток связана с падением экспрессии ИФР-2 в постнатальном периоде, что, вероятно, связано с ингибирующим влиянием IGF2BP2 [193]. В мета-анализе данных генотипирования европейской популяции выявлена статистически значимая ассоциация с СД2 полиморфного маркера rs1470579 гена IGF2BP2 [172]. Нами не было встречено исследований в русской популяции, посвященных rs1470579 гена IGF2BP2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1470579 гена IGF2BP2, проведенного в ходе данной работы, представлено в таблице 22. Таблица 22 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1470579 гена IGF2BP2 в основной группе и в группе контроля Основная Группа OR Аллели χ2 Р знач. 95% CI группа контроля Аллель A 0,250 0,346 0,63 0,40 – 0,99 4,07 0,04 Аллель C 0,750 0,654 1,59 1,01 – 2,48 Генотип AA 0,043 0,085 0,49 0,14 – 1,68 Генотип AC 0,413 0,521 0,36 – 1,15 4,65 0,1 0,65 Генотип CC 0,543 0,394 1,83 1,02 – 3,28 Генотипы АА, АС и СС встречаются среди пациентов с СД2 в 4,3%, 41,3% и 54,3% случаев, а среди условно здоровых испытуемых в 8,5%, 52,1% и 39,4% соответственно – χ2=4,07; р=0,04. Частота аллеля С выше, чем аллеля А, как в основной группе (75,0% и 25,0%), так и в группе контроля 71 (65,4% и 34,6%), однако представленные различия не достигают статистической значимости (χ2=6,65; р=0,1). Расчет отношения шансов для аллелей полиморфного маркера rs1470579 гена IGF2BP2 позволил установить, что с риском СД2 ассоциирован аллель С (OR=1,59 [1,01-2,48]; р=0,04), а со снижением риска развития СД2 связан аллель А (OR=0,63 [0,40-0,99]; р=0,04). Значения отношения шансов для генотипов АА, АС и СС среди пациентов с СД2 и индивидов группы контроля статистически значимо не отличались. Таким образом, на основании полученных результатов впервые установлено, что полиморфный маркер rs1470579 гена IGF2BP2 является рисковым в русской популяции Тюменской области. 4.5 Распределение частот аллелей и генотипов rs163184 гена KCNQ1 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля Ген KCNQ1 кодирует субъединицу-1 канала, зависимого от ионов К+. Этот ген относится к семейству генов KQT, дефекты в этих генах в поджелудочной железе влияют на режим секреции инсулина. Связь полиморфных маркеров гена KCNQ1 с СД2 выявлена в 2008 году в японской популяции [207, 235]. Значимая ассоциация полиморфного маркера rs163184 в европейской популяции подтверждена в исследовании Saxena с соавторами в 2012 году [172]. Данные о распределении частот аллелей и генотипов маркера rs163184 гена KCNQ1 у пациентов с СД2 русской популяции представлены впервые (таблица 23). В основной группе аллели T и G зарегистрированы в 77,3% и 22,7% случаев, а генотипы TT, TG и GG встречались с частотами 71,6%, 11,4% и 17,0%, соответственно. В группе контроля наблюдалось следующее распределение аллелей и генотипов: аллель T – у 84,8%, G – у 15,2% испытуемых, генотип TT – у 75,3%, TG – у 19,1%, GG – у 5,6%. 72 Таблица 23 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs163184 гена KCNQ1 в основной группе и в группе контроля Аллели Основная Группа группа контроля Аллель T 0,773 0,848 Аллель G 0,227 0,152 Генотип TT 0,716 0,753 Генотип TG 0,114 0,191 Генотип GG 0,170 0,056 Получены статистически χ2 Р 3,30 0,07 6,93 0,03 не OR знач. 95% CI 0,61 0,35 – 1,04 1,64 0,96 – 2,82 0,83 0,42 – 1,61 0,54 0,23 – 1,26 3,45 1,20 – 9,96 значимые результаты значений отношения шансов для генотипов TT (OR=0,83 [0,42-1,61]; p=0,03) и TG (OR=0,54 [0,23-1,26]; p=0,03). При расчете отношения шансов установлено, что среди больных с СД2 статистически значимо чаще встречается и ассоциирован с повышенным риском развития СД2 генотип GG (OR=3,45 [1,20-9,96]; p=0,03). Из этого следует, что полиморфный маркер rs163184 гена KCNQ1 можно отнести к маркерам риска развития СД2 для русской популяции. 4.6 Распределение частот аллелей и генотипов rs11924032 гена SLC2A2 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля Ген SLC2A2 кодирует внутриклеточный транспортер глюкозы типа 2 (ГЛЮТ-2), экспрессируется в печени, В-клетках поджелудочной железы, кишечнике и эпителии почечных канальцев. Еще в 1993 году Milburn с соавторами зафиксировали снижение числа транспортеров глюкозы 2 и 4 типа при СД2 [102]. ГЛЮТ-2 – белок семейства глюкозных транспортеров, переносящих глюкозу через мембрану в кишечнике и почках против градиента концентрации. При участии ГЛЮТ-2 глюкоза переходит в кровь 73 из энтероцитов и печени. К тому же ГЛЮТ-2 участвует в транспорте глюкозы в В-клетки поджелудочной железы. Мутации в данном гене также приводят к синдрому Фанкони-Бикеля – болезни накопления гликогена 2 типа. В исследовании Saxena в 2012 году в европейской популяции впервые выявлен номинально ассоциированный с СД2 полиморфный маркер rs11924032 (OR=1,08 [1,04-1,12]) [172]. Распределение аллелей и генотипов rs11924032 гена SLC2A2 у пациентов с СД2 и условно здоровых испытуемых русской популяции Тюменской области представлено в таблице 24. Статистически значимых различий в распределении аллелей полиморфного маркера rs11924032 не выявлено: аллель А и аллель G обнаруживаются соответственно у 13,2% и 86,8% пациентов с СД2, 15,3% и 84,7% условно здоровых испытуемых – χ2=0,33; р=0,57. Генотипы АА, AG и GG обнаруживаются соответственно у 6,6%, 13,2% и 80,2% пациентов с СД2, 2,1%, 26,3% и 71,6% индивидов контрольной группы – χ2=6,66; р=0,04. Таблица 24 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11924032 гена SLC2A2 в основной группе и в группе контроля OR Основная Группа Аллели χ2 р группа контроля знач. 95% CI Аллель A Аллель G 0,132 0,868 0,153 0,847 0,33 0,57 0,84 1,19 0,47 – 1,51 0,66 – 2,13 Генотип AA Генотип AG 0,066 0,132 0,021 0,263 6,66 0,04 3,28 0,43 0,64 – 16,70 0,20 – 0,91 Генотип GG 0,802 0,716 1,61 0,81 – 3,18 При расчете отношения шансов выявлено, что с пониженным риском развития СД2 ассоциирован генотип AG (OR=0,43 [0,20-0,91]; p=0,04). Данные для генотипов AA (OR=3,28 [0,61-16,70]; p=0,04) и AG (OR=1,61 [0,81-3,18]; p=0,04) не достигают статистической значимости. 74 Таким образом, в русской популяции у пациентов с СД2 впервые исследован полиморфный маркер rs11924032 гена SLC2A2 и установлены его ассоциации с СД2. 4.7 Распределение частот аллелей и генотипов rs7172432 гена C2CD4A и rs11634397 гена ZFAND6 у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа и в группе контроля В настоящем исследовании русской популяции Тюменской области впервые изучены ассоциации с СД2 полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A, кодирующего домен С2, зависимый от ионов кальция, и rs11634397 гена ZFAND6, кодирующего домен 6 белка цинкого пальца. Функция продуктов генов C2CD4A и ZFAND6 требует уточнения. Однако существует ряд исследований, выявивших связь данных маркеров с СД2. Так, в 2010 году Yamauchi с соавторами выявили связь rs7172432 гена C2CD4A с СД2 в японской популяции (OR=1,13 [1,09-1,18]), а ассоциация rs11634397 гена ZFAND6 с СД2 у европейцев продемонстрирована в мета-анализе DIAGRAM+ (OR=1,06 [1,04-1,08]) [227, 74]. При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A в группах исследования выявлена более высокая частота аллеля А как в основной группе, так и в группе контроля, составляющая 74,7% и 64,9% соответственно. Частота аллеля G составила 25,3% у пациентов с СД2 и 35,1% у условно здоровых испытуемых – χ2=4,12; р=0,04 (таблица 25). Гетерозиготный генотип АG реже встречается у пациентов с СД2 (43,7%), чем в группе контроля (51,1%). При этом среди испытуемых контрольной группы менее распространен гомозиготный генотип АА (39,4%). Гомозиготный генотип GG реже других генотипов встречается и в 75 основной группе, и в группе контроля (3,4% и 9,6%), однако представленные различия не достигают статистической значимости – χ2=4,88; р=0,09. Расчет отношения шансов позволил установить, что в русской популяции Тюменской области аллель A показал ассоциации с повышенным риском развития СД2 (OR=1,50 [1,01-2,52]; p=0,04), а аллель G – c пониженным риском (OR=0,63 [0,40-0,99]; p=004). Таблица 25 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A в основной группе и в группе контроля OR Основная Группа Аллели χ2 р группа контроля знач. 95% CI Аллель A 0,747 0,649 Аллель G 0,253 0,351 Генотип AA 0,529 0,394 Генотип AG 0,437 0,511 Генотип GG 0,034 0,096 4,12 4,88 0,04 0,09 1,60 1,01 – 2,52 0,63 0,40 – 0,99 1,73 0,96 – 3,12 0,74 0,41 – 1,33 0,34 0,09 – 1,29 Показатели отношения шансов для носительства генотипов АА, AG и GG в русской популяции статистически не значимы. По результатам представленных данных можно заключить, что rs7172432 гена C2CD4 в русской популяции ассоциирован с риском развития СД2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11634397 гена ZFAND6 у пациентов с СД2 и условно здоровых испытуемых русской популяции Тюменской области представлено в таблице 26. Выявлено, что аллель А и аллель G обнаруживаются соответственно у 35,3% и 64,7% пациентов с СД2, 36,8% и 63,2% условно здоровых испытуемых, при этом различия в частотах аллелей незначимы – χ2=0,09; р=0,76. Генотипы АА, АG и GG встречаются у 16,3%, 38,0% и 45,7% пациентов основной группы, 8,4%, 56,8% и 34,7% участников группы контроля – χ2=7,22; р=0,03. Таблица 26 76 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11634397 гена ZFAND6 в основной группе и в группе контроля OR Основная Группа Аллели χ2 р группа контроля знач. 95% CI Аллель A 0,353 0,368 Аллель G 0,647 0,632 Генотип AA 0,163 0,084 Генотип AG 0,380 0,568 Генотип GG 0,457 0,347 0,09 7,22 0,76 0,03 0,94 0,61 – 1,43 1,07 0,70 – 1,63 2,12 0,85 – 5,27 0,47 0,26 – 0,84 1,58 0,88 – 2,84 Значения отношения шансов для аллеля А (OR=0,94 [0,61-1,43]; р=0,76) и аллеля G (OR=1,07 [0,70-1,63]; р=0,76), генотипа АА (OR=2,12 [0,85-5,27]; р=0,03) и генотипа GG (OR=1,58 [0,88-2,84]; р=0,03) не имеют достаточной статистической значимости. При этом генотип AG маркера rs11634397 гена ZFAND6 статистически значимо ассоциирован с пониженным риском развития СД2 (OR=0,47 [0,26-0,84]; p=0,03). Следует отметить тот факт, что в русской популяции ассоциации полиморфных маркеров rs7172432 гена C2CD4A и rs11634397 гена ZFAND6 с СД2 установлены впервые. Таким образом, в результате проведенного анализа ассоциаций изучаемых полиморфных генетических маркеров с СД2 в группах исследования установлены статистически значимые связи СД2 с 10 полиморфными маркерами, 6 из которых впервые исследованы в русской популяции. 4.8 Анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов полиморфных генетических маркеров генов FTO, MC4R, IRS1, C2CD4A, IGF2BP2, KCNQ1, SLC2A2 и ZFAND6 у больных с сахарным диабетом 2-го типа С помощью программного обеспечения на основе алгоритма APSampler, основанном на динамическом методе Монте-Карло, выполнен комплексный 77 анализ кумулятивного эффекта носительства сочетаний двух и более полиморфных генетических маркеров на формирование СД2 (полигенный анализ). Изучению подверглись сочетания аллелей и генотипов полиморфных генетических маркеров rs8050136 и rs11642841 гена FTO, rs571312 гена MC4R, rs2943641 и rs2943634 гена IRS1, rs7172432 гена C2CD4A, rs1470579 гена IGF2BP2, rs163184 гена KCNQ1, rs11924032 гена SLC2A2, rs11634397 гена ZFAND6, уже показавшие в настоящем исследовании статистически значимые ассоциации с СД2 в изучаемой популяции. Выявлена биаллельная комбинация аллеля А полиморфного маркера rs8050136 гена FTO и аллеля А полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A. Аллель самостоятельно не А полиморфного был значимо маркера гена FTO развитием СД2 rs8050136 ассоциирован с (статистически значимую ассоциацию со сниженным риском развития СД2 продемонстрировал гомозиготный генотип СС (OR=0,45 [0,24-0,87]; р=0,05), однако его роль выявлена в составе комбинации с аллелем А полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A, носительство которого по данным настоящего исследования связано с повышенной предрасположенностью к СД2 (OR=1,60 [1,01-2,52]; p=0,04). При анализе ассоциаций сочетаний аллелей исследуемых генов установлено, что совместное носительство комбинации аллеля А полиморфного маркера rs8050136 и аллеля А полиморфного маркера rs7172432 ассоциировано с повышенными рисками формирования СД2 (OR=1,97 [1,18-3,29]; p=0,006). При этом выявленное сочетание аллелей характеризуется большей значимостью ассоциации, чем входящие в сочетание аллели по одиночке, следовательно, полученные результаты соответствуют критерию минимального множества аллелей, и данную комбинацию можно отнести к дополнительным значимым маркерам генетического риска СД2. 78 ГЛАВА 5. АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ ИССЛЕДУЕМЫХ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ С КЛИНИЧЕСКИМИ И МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ ПРОЯВЛЕНИЯМИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2-го ТИПА В РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ В исследовании проведен анализ ассоциаций 96 исследуемых полиморфных маркеров с ожирением и ИР. Для выявления ассоциаций полиморфных маркеров с ожирением пациенты с СД2 основной группы (n=96) сравнивались с подгруппой испытуемых с нормальной массой тела без СД2 (n=71). В случае исследования ассоциаций с ИР группы также были детализированы и разделены на подгруппу пациентов с СД2 и ИР (n=65) и подгруппу пациентов без СД2 и без ИР (n=81). В указанных подгруппах проведено исследование соответствия распределения частот аллелей и генотипов равновесию Харди-Вайнберга. В результате из анализа ассоциаций полиморфных маркеров с ожирением исключены rs10010131 и rs1801214 гена WFS1, rs16926246 гена HK1, rs5945326 гена DUSP9, rs855791 гена TMRRSS6, rs7903164 гена TCF7L2; а из исследования ассоциаций с ИР – rs10010131 и rs1801214 гена WFS1, rs16926246 гена HK1, rs5945326 гена DUSP9, rs855791 гена TMRRSS6 и rs13292136 гена CHCHD9. При этом rs5219 гена KCNJ11, rs10770141 гена TH/INS, rs3794991 гена GATAD2A, rs37982220 гена LPA, rs76124633 гена URE2E2, rs7961581 гена TSPAN9 выведены из исследования по причине недостаточного для статистической обработки объема данных, полученных при генотипировании. В результате проведенного анализа в русской популяции Тюменской области установлены ассоциации полиморфных маркеров rs8050136, rs11642841 и rs1558902 гена FTO, rs2241766 гена ADIPOQ, rs243021 гена 79 BCL11A – с ожирением, а rs8050136 и rs11642841 гена FTO, rs7172932 гена C2CD4A2 и rs571312 гена MC4R, rs16928751 гена ADIPOR2, rs7593730 в области PBMS1-ITGB6 – с ИР. Далее для каждого из установленных полиморфных маркеров определены аллели и генотипы, ассоциированные с повышенным и пониженным риском развития ожирения и ИР. 5.1 Анализ ассоциаций исследуемых полиморфных генетических маркеров с ожирением Проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs8050136, rs11642841 и rs1558902 гена FTO в основной группе и в подгруппе испытуемых с нормальной массой тела в русской популяции Тюменской области. Согласно материалам исследований европейских и азиатских генетические маркеры популяций, имеют исследуемые ассоциации с СД2, полиморфные ожирением и метаболическим синдромом: в мета-анализе Peng аллель А маркера rs8050136 ассоциирован с ожирением (OR=1,25 [1,13-1,38]), в работе Wang с соавторами аллель А ассоциирован с метаболическим синдромом (OR=1,19 [1,05-1,35]), а Zeggini с соавторами в 2008 г. установили связь аллеля А с СД2 (OR=1,15[1,09-1,22]) [132, 137, 182]. В 2010 году Zhang c соисследователями отметили ассоциацию аллеля А полиморфного маркера rs11642841 гена FTO с ИМТ (р=0,00478) в островной хорватской популяции, в исследовании Voight обозначена связь аллеля А с СД2 (OR=1,13 [1,081,18]) [227, 109]. Связь полиморфного маркера rs1558902 гена FTO с ожирением и метаболическим синдромом зафиксирована в исследованиях детей и взрослых европейских и азиатских популяций [131, 98, 133, 93]. В русской популяции Тюменской области полиморфные генетические маркеры rs8050136 и rs11642841 гена FTO в данном исследовании продемонстрировали статистически значимые ассоциации с СД2. 80 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs8050136 гена FTO в основной группе и в подгруппе испытуемых с нормальным весом представлены в таблице 27. В основной группе пациентов доля аллеля А (50,0%) и аллеля С (50,0%) одинакова, однако в подгруппе пациентов с нормальным весом частота аллеля С (65,7%) выше, чем аллеля А (34,3%)- χ2=7,96; р=0,005. Генотипы АА, АС и СС встречаются с частотой 22,0%, 56,0% и 22,0% в основной группе, а в подгруппе клинически здоровых лиц – с частотой 12,9%, 42,9% и 44,3% соответственно. Расчет отношения шансов для аллелей и генотипов полиморфного маркера rs8050136 гена FTO позволяет отнести аллель А к маркерам повышенного риска в отношении развития ожирения (OR=1,92 [1,22-3,02]; р=0,005). Аллель С и гомозиготный генотип СС – напротив, ассоциированы с пониженным риском формирования ожирения (OR=0,52 [0,33-0,82]; p=0,005 и OR=0,35 [0,18-0,70]; р=0,009). Таблица 27 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs8050136 гена FTO в подгруппах исследования Аллели Основная группа Подгруппа пациентов с нормальной массой тела без СД2 Аллель A 0,500 0,343 Аллель С 0,500 0,657 Генотип AA 0,220 Генотип AС Генотип СС OR χ2 Р знач. 95% CI 1,92 1,22 – 3,02 0,52 0,33 – 0,82 0,129 1,91 0,81 – 4,50 0,560 0,429 9,41 0,009 1,70 0,91 – 3,19 0,220 0,443 0,35 0,18 – 0,70 7,96 0,005 В случае полиморфного маркера rs11642841 гена FTO (таблица 28) аллель А встречается существенно чаще в основной группе пациентов (50,0%), чем у пациентов с нормальной массой тела (34,8%). В тоже время 81 частота аллеля С статистически значимо выше у лиц с нормальным весом (65,2%), чем у пациентов с СД2 и ожирением (50,0%,) – χ2=7,40; р=0,007. Генотипы АА, АС и СС встречаются у 20,9%, 58,2% и 20,9% пациентов основной группы, 13,0%, 43,5% и 43,5% участников с нормальной массой тела. Значение отношения шансов для аллеля А составляет 1,88 [1,19-2,96]; p=0,007, для аллеля С – 0,53 [0,34-0,84]; p=0,008. Из чего следует, что аллель А ассоциирован с повышенным риском развития ожирения, а аллель С, соответственно, – с пониженным. При этом генотип СС маркера rs11642841 гена FTO статистически значимо ассоциирован со снижением риска развития ожирения (OR=0,34 [0,17-0,69]; p=0,008). Таблица 28 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11642841 гена FTO в подгруппах исследования Подгруппа OR пациентов с Основная Аллели нормальной χ2 р группа знач. 95% CI массой тела без СД2 Аллель A 0,500 0,348 Аллель С 0,500 0,652 Генотип AA 0,209 0,130 Генотип AС 0,582 0,435 Генотип СС 0,209 0,435 7,40 9,57 0,007 0,008 1,88 1,19 – 2,96 0,53 0,34 – 0,84 1,76 0,74 – 4,17 1,81 0,96 – 3,41 0,34 0,17 – 0,69 Согласно данным о распределении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1558902 гена FTO (таблица 29), в основной группе аллель Т фиксировался реже (47,8%), чем аллель А (52,5), частоты аллелей Т и А составляют 59,6% и 40,4% в подгруппе пациентов с нормальной массой тела – χ2=4,32; р=0,04. В группе пациентов с СД2 и ожирением носительство гетерозиготного генотипа АТ (54,3%) встречается чаще, чем гомозиготных 82 ТТ и АА (20,7% и 25,0% соответственно). У пациентов с нормальной массой тела генотипы АА, АТ и ТТ наблюдаются со следующими частотами: 16,2%, 48,5% и 35,3%. В результате расчета отношения шансов установлено, что с повышенным риском развития ожирения ассоциирован аллель А (OR=1,61 [1,03-2,52]; p=0,04), а снижающим риск является аллель Т (OR=0,62 [0,400,97]; р=0,04). При этом получены статистически не значимые результаты значений отношения шансов для генотипов АА (OR=1,73 [0,78-3,84]; р=0,09), AT (OR=1,26 [0,67-2,37]; p=0,09) и ТТ (OR=0,48 [0,23-0,97]; p=0,09). Таблица 29 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1558902 гена FTO в подгруппах исследования Подгруппа OR пациентов с Основная Аллели нормальной χ2 р группа знач. 95% CI массой тела без СД2 Аллель A 0,522 0,404 Аллель Т 0,478 0,596 Генотип AA 0,250 0,162 Генотип AТ 0,543 0,485 Генотип ТТ 0,207 0,353 4,32 0,04 4,81 0,09 1,61 1,03 – 2,52 0,62 0,40 – 0,97 1,73 0,78 – 3,84 1,26 0,67 – 2,37 0,48 0,23 – 0,97 Представленные данные позволяют сделать вывод о наличии статистически значимых ассоциаций полиморфных маркеров rs8050136, rs11642841 и rs1558902 гена FTO с избытком массы тела и ожирением в русской популяции Тюменской области. Ген ADIPOQ кодирует гормон висцеральной жировой ткани – адипонектин, который играет роль в регуляции углеводного и липидного обмена, имеет противовоспалительный и антиатерогенный эффект. Опубликованы немногочисленные исследования полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ в русской популяции, где отмечена связь данного 83 ОНП с метаболическим синдром [47], но не выявлены ассоциации с СД2 [49]. Значимые ассоциации rs2241766 с компонентами метаболического синдрома подтверждают роль ADIPOQ в формировании ожирения и ИР, что делает дальнейшее изучение данного маркера и его ассоциаций особенно актуальными. В таблице 30 представлено распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ в основной группе исследования и среди пациентов с нормальной массой тела русской популяции Тюменской области. Установлено, что среди пациентов с СД2 и ожирением доля аллеля Т меньше (86,0%), чем в подгруппе без ожирения и без СД2 (92,7%), а аллеля G, напротив, больше у лиц с нормальной массой тела (14,0%), чем у пациентов основной группы (7,3%)- χ2=4,40; р=0,04. Таблица 30 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ в подгруппах исследования Аллели Основная группа Подгруппа пациентов с нормальной массой тела без СД2 Аллель T 0,927 0,860 Аллель G Генотип TT 0,073 0,872 0,140 0,765 Генотип TG 0,111 0,191 Генотип GG 0,017 0,044 OR χ2 р 4,40 0,04 3,72 0,16 знач. 95% CI 2,07 1,04 – 4,14 0,48 2,09 0,24 – 0,96 0,96 – 4,56 0,53 0,23 – 1,22 0,38 0,06 – 2,31 Гомозиготное носительство генотипа TT и генотипа GG, а также гетерозиготоное носительство генотипа TG чаще регистрировалось в группе пациентов с СД2 и ожирением (76,5%, 19,1% и 4,4%), чем в подгруппе испытуемых с нормальным весом (87,2%, 11,1% и 1,7% соответственно), однако полученные данные не достигают статистической значимости – 84 χ2=3,72; р=0,16. Значение отношения шансов для аллеля T составляет 2,07 [1,04-4,14]; p=0,04, а для аллеля G – 0,48 [0,24-0,96]; p=0,04, что позволяет отнести их к возможным маркерам повышенного (аллель T) и сниженного (аллель G) риска развития ожирения. Результаты значений отношения шансов для генотипов TT (OR=2,09 [0,96-4,56]; p=0,16), TG (OR=0,53 [0,231,22]; p=0,16) и GG (OR=0,38 [0,06-2,31]; р=0,16) статистически незначимы. Из представленных результатов исследования следует, что полиморфный маркер rs2241766 гена ADIPOQ статистически значимо ассоциирован с развитием ожирения в русской популяции Тюменской области. Ген BCL11A кодирует белок С2Н2, относящийся к белку цинкового пальца, также известен как ген В-клеточной лимфомы, вероятно, играет роль в гемопоэзе, особенно лимфопоэзе, т.к. необходим для формирования Влимфоцитов в эмбриональной печени. В мета-анализе DIAGRAM+ полиморфный маркер rs243021 гена BCL11A отмечен как маркер риска развития СД2 (OR=1,08 [1,06-1,10]) [227]. Данных о роли полиморфного маркера rs243021 в формировании СД2 в русской популяции в настоящий момент нет. В текущем исследовании ассоциаций rs243021 гена BCL11A с СД2 не выявлено, однако была исследована связь данного ОНП с ожирением. Данные о распределении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs243021 гена BCL11A в основной группе исследования и в подгруппе испытуемых с нормальной массой тела представлены в таблице 31. Частота аллеля А выше у пациентов основной группы (48,3%) , чем у лиц с нормальным весом (36,0%). Напротив, аллель G чаще выявлялся в подгруппе пациентов с нормальной массой тела (64,0%), чем в группе испытуемых с СД2 и ожирением (51,7%) – χ2=5,23; р=0,02. У пациентов основной группы по сравнению со здоровыми испытуемыми выявлена более высокая частота генотипа АА (25,0% и 11,8% соответственно), 85 гетерозиготный генотип AG и гомозиготный генотип GG, наоборот, более распространены среди пациентов с нормальной массой тела (48,5% и 39,7%), чем у пациентов с СД2 и ожирением (46,6% и 28,4%) – χ2=5,03; р=0,03. Таблица 31 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs243021 гена BCL11A в подгруппах исследования Аллели Основная группа Подгруппа пациентов с нормальной массой тела без СД2 Аллель A 0,483 0,360 Аллель G 0,517 0,640 Генотип AA 0,250 0,118 Генотип AG 0,466 0,485 Генотип GG 0,284 0,397 OR χ2 р 5,23 0,02 5,03 0,03 знач. 95% CI 1,66 1,07 – 2,56 0,60 0,39 – 0,93 2,50 1,07 – 5,84 0,92 0,51 – 1,68 0,60 0,32 – 1,14 Расчет отношения шансов выявил, что аллель А ассоциирован с повышенным риском возникновения ожирения (OR=1,66 [1,07-2,56]; р=0,02), а аллель С – со снижением рисков (OR=0,6 [0,39-0,93]; р=0,02). Статистически значимых значений отношения шансов для генотипов AG (OR=0,92 [0,51-1,68]; p=0,03) и GG (OR=0,60 [0,32-1,14]; p=0,03) полиморфного маркера rs243021 гена BCL11A не вявлено. При этом вероятным маркером повышенного риска развития ожирения является гомозиготный генотип АА (OR=2,50 [1,07-5,84]; р=0,03). Таким образом, в результате проведенного анализа ассоциаций в подгруппах исследования установлены ассоциации у пациентов с СД2 и ожирением. дополнительные генетические 86 5.2 Анализ ассоциаций исследуемых полиморфных генетических маркеров с инсулинорезистентностью При анализе распределения частот аллелей и генотипов в подгруппе пациентов с СД2 и ИР и у испытуемых без СД2 и ИР статистически значимые ассоциации с наличием ИР продемонстрировали rs8050136 и rs11642841 гена, ассоциированного с ожирением и жировой тканью (FTO). Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs8050136 гена FTO в подгруппе пациентов с СД2 и ИР и у испытуемых без СД2 и ИР представлено в таблице 32. Выявлено, что аллель А и аллель С обнаруживается соответственно у 50,8% и 49,2% пациентов с ИР, 39,3% и 60,7% испытуемых без ИР. Генотипы АА, АС и СС встречаются в подгруппе пациентов с ИР у 21,0%, 59,7% и 19,4% участников, а в подгруппе испытуемых без ИР у 18,7%, 41,3% и 40,0% соответственно – χ2=7,11; р=0,03. Ассоциаций носительства аллеля А (OR=1,59 [0,98-2,58]; p=0,06), аллеля С (OR=0,63 [0,39-1,02]; p=0,06) и генотипа АА (OR=1,16 [0,50-2,69]; p=0,06) c ИР не уcтановлено. При этом гетерозиготный генотип AС статистически значимо ассоциирован с повышенным риском развития ИР (OR=2,10 [1,06-4,17]; p=0,03), а гомозиготный генотип СС – с пониженным (OR=0,36 [0,16-0,79]; p=0,03). Таблица 32 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs8050136 гена FTO в подгруппах исследования Подгруппа Подгруппа OR 2 Аллели пациентов пациентов χ р знач. 95% CI с ИР без ИР Аллель A 0,508 0,393 1,59 0,98 – 2,58 3,62 0,06 Аллель C 0,492 0,607 0,63 0,39 – 1,02 Генотип AA 0,210 0,187 1,16 0,50 – 2,69 Генотип AC 0,597 0,413 7,11 0,03 2,10 1,06 – 4,17 Генотип CC 0,194 0,400 0,36 0,16 – 0,79 87 Относительно полиморфного маркера rs11642841 гена FTO установлено (таблица 33), что частота аллеля А выше в подгруппе пациентов с ИР (51,6%), чем в подгруппе участников без ИР (39,3%). Напротив, аллель С чаще выявлялся у пациентов без ИР (60,7%), чем у больных с ИР (48,4%) – χ2=4,16; р=0,04. Таблица 33 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11642841 гена FTO в подгруппах исследования Подгруппа Подгруппа OR 2 Аллели пациентов пациентов χ р знач. 95% CI с ИР без ИР Аллель A 0,516 0,393 Аллель C Генотип AA 0,484 0,222 0,607 0,173 Генотип AC Генотип CC 0,587 0,190 0,440 0,387 4,16 0,04 6,32 0,04 1,64 1,02 – 2,65 0,61 1,36 0,38 – 0,98 0,59 – 3,17 1,81 0,37 0,92 – 3,57 0,17 – 0,82 Гомозиготное носительство генотипа АА (22,2%) и гетерозиготное носительство AС (58,7%) чаще регистрировались в подгруппе пациентов с ИР, чем среди пациентов без нее (17,3% и 44,0%), а носительство гомозиготного генотипа СС более характерно для подгруппы здоровых без ИР (38,7%), чем для подгруппы испытуемых с ИР (19,0%) – χ2=6,32; р=0,04. Значения отношения шансов для гетерозиготного генотипа АС (OR=1,81 [0,92-3,57]; p=0,04) и гомозиготного генотипа АА (OR=1,36 [0,59-3,17]; p=0,04) не имеют достаточной статистической значимости. В тоже время, аллель С и гомозиготный генотип СС ассоциированы с пониженным риском развития ИР (OR=0,61 [0,38-0,98]; p=0,04 и OR=0,37 [0,17-0,82]; p=0,04), а аллель А (OR=1,64 [1,02-2,65]; p=0,04) – с повышенным риском. Следует обратить внимание на тот факт, что рассматриваемые ОНП rs8050136 и rs11642841 гена FTO ранее в исследовании продемонстрировали значимые ассоциации и с СД2, и с ожирением. Причины ИР, ожирения и СД2 гетерогенны, но наличие их перекрестных ассоциаций с исследуемыми 88 полиморфными маркерами свидетельствует о патогенетической взаимосвязи и сходной генетической природе этих состояний. Другим геном, продемонстрировавшим роль в развитии ИР, стал ген MC4R. Ген MC4R известен, как ген ответственный за ожирение. Наряду с этим в исследовании Xi c соавторами в 2012 г. обозначена взаимосвязь ряда полиморфизмов в гене MC4R с СД2 [108]. В тоже время сегодня роль rs571312 в развитии нарушений углеводного обмена остается неясной. Изучение полиморфных маркеров гена MC4R в русской популяции представлено единичными изысканиями. Исследование роли полиморфного маркера rs571312 в отношении формирования СД2 и ИР в русской популяции проведено впервые. Исследование полиморфного маркера rs571312 гена MC4R в подгруппах с учетом ИР позволил установить, что у пациентов с ИР аллели А и С встречались с частотами 27,0% и 73,0% случаев, а генотипы АА, АС и СС в 12,7%, 28,6% и 58,7% случаев, соответственно (таблица 34). Таблица 34 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs571312 гена MC4R в подгруппах исследования Подгруппа Подгруппа OR 2 Аллели пациентов пациентов χ р знач. 95% CI с ИР без ИР Аллель A 0,270 0,120 2,71 1,44 – 5,09 10,06 0,002 Аллель C 0,730 0,880 0,37 0,20 – 0,69 Генотип AA 0,127 0,013 10,76 1,31 – 88,60 Генотип AC 0,286 0,213 9,23 0,01 1,48 0,68 – 3,21 Генотип CC 0,587 0,773 0,42 0,20 – 0,87 В подгруппе пациентов без ИР наблюдалось следующее распределение аллелей и генотипов: аллель А – у 12,0%, С – у 88,0%; генотип АА – у 1,3%, АС – у 21,3%, СС – у 77,3%. При расчете отношения шансов установлено, что среди пациентов с ИР статистически значимо чаще встречается и ассоциирован с повышенным риском развития ИР аллель А (OR=2,71 [1,44- 89 5,09]; p=0,002), и генотип АА (OR=10,76 [1,31-88,60]; p=0,01). Со снижением риска развития ИР связаны аллель С (OR=0,37 [0,20-0,69]; p=0,002) и генотип СС (OR=0,42 [0,20-0,87]; p=0,01). Таким образом, в настоящем исследовании русской популяции Тюменской области впервые получены данные об ассоциациях rs517312 с ИР и, как отмечалось ранее, с СД2. Представленные результаты позволяют обозначить потенциальную значимость полиморфного маркера rs517312 гена MC4R и определяют необходимость последующего изучения данного полиморфного маркера в контексте нарушений углеводного обмена. Полиморфный маркер rs7593730 располагается в локусе 2q24 между геном РНК-связывающего протеина-1 (RBMS1) и гена бета-6 интегрина (ITGB6). Функциональная значимость данного полиморфного маркера в отношении развития СД2 изучена недостаточно. По данным мета-анализа 11 независимых полногеномных исследований европейцев с СД2 [136] определена ассоциация аллеля Т полиморфного маркера rs7593730 со снижением риска СД2 (OR=0,92 [0,86-0,93]). В исследовании Dupuis установлено, что локус 2q24 номинально связан со снижением уровня гликемии натощак и значений индекса HOMA-IR (р<0,05) [189]. Исследование значимости rs7593730 (RBMS1-ITGB6) в формировании СД2 и ИР в русской популяции проводятся впервые. Ассоциации данного полиморфного маркера с СД2 в настоящем исследовании не выявлено, в то время как в отношении ИР были получены статистически значимые различия. Среди пациентов с ИР доля аллеля Т меньше (25,5%), чем в подгруппе лиц без ИР (35,1%), а аллеля С, напротив, больше у испытуемых с ИР (74,5%), чем у пациентов без нее (64,9%) – χ2=4,08; р=0,04. Вместе с тем, в подгруппе пациентов с ИР генотип ТТ встречался в 9,6% случаев, генотип ТС – в 54,1%, а генотип СС – в 39,4%. Гомозиготное носительство генотипов ТТ, СС и гетерозиготное носительство генотипа ТС в подгруппе испытуемых без ИР встречалось у 9,6%, 51,1% и 39,4% соответственно (таблица 35). 90 Данные, полученные при расчете отношения шансов для гомозиготных генотипов ТТ (OR=0,53 [0,17-1,65]; p=0,1) и СС (OR=0,65 [0,37– 1,16]; p=0,1) и гетерозиготного генотипа ТС (OR=1,83 [1,02-3,26]; p=0,1), не достигают статистической значимости. В то же время аллель С маркирует повышенный (OR=1,58 [1,01-2,46]; p=0,04), а аллель Т пониженный (OR=0,63 [0,41-0,99]; p=0,04) риск формирования ИР. Таблица 35 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркераrs7593730 в области RBMS1-ITGB6 в подгруппах исследования Подгруппа Подгруппа OR 2 Аллели пациентов пациентов χ р знач. 95% CI с ИР без ИР Аллель T 0,255 0,351 0,63 0,41 – 0,99 4,08 0,04 Аллель C 0,745 0,649 1,58 1,01 – 2,46 Генотип TT 0,053 0,096 0,53 0,17 – 1,65 4,53 0,1 Генотип TC 0,404 0,511 0,65 0,37 – 1,16 Генотип CC 0,543 0,394 1,83 1,02 – 3,26 Таким образом, следует заключить, что полиморфный маркер rs7593730 в области RBMS1-ITGB6, вероятно, является рисковым в отношении формирования ИР в русской популяции Тюменской области. Ген ADIPOR2 кодирует рецептор гормона адипонектина, протеолитический фрагмент которого стимулирует бета-окисление жирных кислот в мышцах и редуцирует концентрацию триглицеридов в плазме крови, повышая чувствительность к инсулину [86, 205]. При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs16928751 гена ADIPOR2 установлено, что аллель G определялся у 75,3% пациентов с ИР и 83,9% испытуемых без ИР, при этом аллель А встречается у 16,1% испытуемых без СД2 и ИР, у 24,7% больных с ИР – χ2=4,21; р=0,04. Генотипы AA, AG, GG обнаруживаются соответственно у 76,3%, 19,7%, 3,9% здоровых испытуемых и 87,2%, 12,7%, 0,1% пациентов с ИР (таблица 36). Статистически значимых данных, полученных при расчете 91 отношения шансов для генотипов AA (OR=3,41 [0,91-12,83]; p=0,12), AG (OR=1,16 [0,60-2,22]; p=0,12), GG (OR=0,64 [0,34-1,18]; p=0,12) не выявлено. При этом расчет относительных рисков позволяет отнести аллель G (OR=0,58 [0,35-0,98]; p=0,04) к маркерам пониженного риска формирования ИР, а аллель А (OR=1,71 [1,02-2,87]; p=0,04) – к маркерам повышенного риска. Таблица 36 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs16928751 гена ADIPOR2 в подгруппах исследования Подгруппа Подгруппа OR 2 Аллели пациентов пациентов χ р знач. 95% CI с ИР без ИР Аллель A 0,247 0,161 1,71 1,02 – 2,87 4,21 0,04 Аллель G 0,753 0,839 0,58 0,35 – 0.98 Генотип AA 0,105 0,033 3,41 0,91 – 12,83 Генотип AG 0,284 0,256 0,60 – 2,22 4,25 0,12 1,16 Генотип GG 0,611 0,711 0,64 0,34 – 1,18 Следовательно, полиморфный маркер rs16928751 гена ADIPOR2 ассоциирован с ИР в русской популяции Тюменской области. Результаты исследования rs7172432 гена C2CD4A у пациентов с СД2 и ИР и в подгруппе испытуемых без СД2 и ИР представлены в таблице 37. У пациентов с ИР доля аллеля А больше (75,3%), чем в подгруппе испытуемых без ИР (64,9%), при этом у них, напротив, больше представлен аллель G (35,1%) - χ2=4,80; р=0,03. Значение отношения шансов для аллеля A составляет 1,65 [1,05-2,58]; p=0,03, что позволяет отнести его к возможным маркерам повышенного риска формирования ИР, а аллель G, вероятно, ассоциирован со снижением рисков в отношении развития ИР (OR=0,61 [0,39-0,95]; p=0,03). Следует отметить, что показатели отношения шансов для генотипов GG (OR=0,42 [0,13-1,43]; p=0,07), AG (OR=0,66 [0,37-1,18]; p=0,07) и AA (OR=1,87 [1,05-3,35]; p=0,07) статистически незначимы. 92 Таблица 37 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A в подгруппах исследования Подгруппа Подгруппа OR 2 Аллели пациентов пациентов χ Р знач. 95% CI с ИР без ИР Аллель A 0,753 0,649 1,65 1,05 – 2,58 4,80 0,03 Аллель G 0,247 0,351 0,61 0,39 – 0,95 Генотип AA 0,548 0,394 1,87 1,05 – 3,35 Генотип AG 0,409 0,511 5,31 0,07 0,66 0,37 – 1,18 Генотип GG 0,043 0,096 1,52 0,13 – 1,43 Нами впервые получены данные об ассоциации rs7172432 гена C2CD4A с ИР в русской популяции. При этом связь данного полиморфного маркера с развитием СД2 выявлена в настоящем исследовании русской популяции, а также у японцев и европейцев [227, 74]. Несмотря на существующие данные о том, что в европейской популяции рассматриваемый ОНП связан с уровнем проинсулина натощак [144], точная роль продукта гена C2CD4A в формировании СД2 не установлена. Выявленная ассоциация полиморфного маркера rs7172432 с ИР определяет необходимость более подробного изучения их взаимосвязей. Анализ маркеров в ассоциаций подгруппах исследуемых исследования полиморфных генетических продемонстрировал общность генетических факторов риска ИР, ожирения и СД2, что говорит о единстве их механизмов развития. В тоже время получены новые данные о рисковых алеллях и генотипах в отношении ожирения и ИР для русской популяции. Результаты проведенных исследований ассоциаций позволили уточнить генетические аспекты клинико-патогенетических особенностей СД2. 93 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Актуальность изучения первопричин развития СД2 обусловлена масштабом его распространенности. Рост заболеваемости СД2 имеет положительную динамику и признан экспертами ВОЗ неинфекционной эпидемией [92, 111]. В связи с чем особую значимость приобретает поиск методов доклинического определения повышенных рисков развития СД2 с целью проведения предупреждению персонифицированных развития заболевания. профилактических В настоящее мер время по СД2 определяется как полигенное заболевание, наследственные факторы, ответственные за развитие которого, активно изучаются во многих популяциях [71, 72, 74, 81, 142, 200]. Документирование разнообразия полиморфных вариаций генов-кандидатов в различных популяционных группах является важным этапом к более глубокому пониманию механизмов возникновения СД2, и, как следствие, к появлению актуализированных диагностических методик, подходов к профилактике, новых точек приложения лекарственных препаратов. В данном исследовании на основании литературных данных популяционных исследований генетических аспектов СД2 [71, 74, 75, 81, 85, 87, 93, 97, 110, 113, 129, 135, 136, 142, 155, 172, 173, 182, 183, 184, 189, 200, 214, 215, 219, 227, 235, 240, ] сформирован набор генетических маркеров для выявления ассоциаций с СД2 русской популяции. На основании данного набора для проводимого исследования был синтезирован ДНК-биочип, содержащий 96 ОНП, ассоциированных с СД2 в европейских популяциях: rs1801282 (PPARG), rs5219 (KCNJ11), rs7903146 и rs12255372 (TCF7L2), rs13266634 (SLC30A8), rs1111875 и rs5015480 (HHEX), rs7754840 (CDKAL1), rs4402960 и rs1470579 (IGF2BP2), rs10811661 (CDKN2A/B), rs1801214 и rs10010131 (WFS1), rs757210 и rs4430796 (HNF1B), rs7961581 (TSPAN8), rs4607103 (ADAMTS9), rs10923931 (NOTCH2), rs12779790 94 (CDC123/CAMK1D), rs7578597 (THADA), rs864745 (JAZF1), rs163184, rs231262 и rs2237892 (KCNQ1), rs7593730 (RBMS1-ITGB6), rs2943641 и rs2943634 (IRS1), rs10830963, rs1387153 (MTNR1B), rs11708067 (ADCY5), rs340874 (PROX1), rs4607517 и rs1799884 (GCK), rs780094 (GCKR), rs2191349 и rs10244051 (DGKB-TMEM195), rs7957197 (HNF1A), rs1531343 (HMGA2), rs13292136 (CHCHD9), rs243021 (BCL11A), rs4457053 (ZBED3), rs972283 (KLF14), rs896854 (TP53INP1), rs1552224 (CENTD2), rs8042680 (PRC1), rs5945326 (DUSP9), rs3794991 (GATAD2A), rs10770141 (TH/INS), rs12454712 (BCL2), rs16906158 (FOLH1), rs11671664 (GIPR), rs11924032 (SLC2A2), rs11061971 и rs16928751 (ADIPOR2), rs2241766 и rs1501299 (ADIPOQ), rs7756992 и rs10946398 (CDKAL1); с СД2 в азиатских популяциях rs76124633 (URE2E2), rs7172432 (C2CD4A-C2CD4B), rs2237892 (KCNQ1), rs6815464 (MAEA), rs7041847 (GLIS3), rs6017317 (FITM2-R3HDML-HNF4A), rs831571 (PSMD6), rs9470794 (ZFAND3), rs3786897 (PEPD); c различными нарушениями углеводного обмена: rs11920090 (SLC2A2), rs560887 (G6PC2), rs7034200 (GLIS3), rs10885122 (ADRA2A), rs11605924 (CRY2), rs7944584 (MADD), rs174550 (FADS1), rs35767 (IGF1), rs11071657 (C2CD4B), rs16926246 (HK1), rs1046896 (FN3K), rs1800562 (HFE), rs855791 (TMPRSS6), rs4737009 (ANK1), rs552976 (G6PC2), rs1799884 (GCK), rs1387153 (MNTR1B); c ожирением: rs8050136, rs11642841 и rs1558902 (FTO), rs2867125 (TMEM18), rs571312 (MC4R), rs10938397 (GNPDA), а также с нарушенным липидным обменом и артериальной гипертонией: rs646776 (CELSR2-PSRC1SORT1), rs3798220 (LPA), rs579459 (ABO), rs12413409 (CYP17A1-CNNM2NT5C2), rs964184 (ZNF259-APOA5-A4-C3-A1), rs1122608, rs2228671 (LDLR). С его помощью в лаборатории ЗАО «Геноаналитика» научного парка МГУ (директор по науке – к. ф.м. н. А. М. Мазур), г. Москва по протоколу BeadСhip GoldenGate компании Illumina проведено генотипирование 192 участников исследования. Из 192 испытуемых 96 имели СД2, а 96 составляли группу контроля, т.е. не имели ожирения, а их показатели общего 95 холестерина и толерантность к глюкозе были в пределах нормы. По полу и возрасту группы были сопоставимы, все испытуемые относились к одной этнической группе. Основное отличие групп – это наличие СД2. Для профилей выявления участников особенностей клинических исследования и метаболических проведена сравнительная характеристика группы пациентов с СД2 и контрольной группы. Для этого всем участникам исследования проводилось клиническое обследование, включающее сбор жалоб, анамнеза и физикальный осмотр, измерение АД, определение антропометрических показателей (роста, массы тела, индекса массы тела, окружностей талии и бедер, индекса ОТ/ОБ). Всем участникам исследования проводился ПГТТ с определением уровней ИРИ и С-пептида, липидограмма, исследование уровня гликированного гемоглобина, мочевой кислоты. Рассчитывались индексы HOMA-IR, HOMA-В, коэффициент атерогенности. Постановку диагноза СД2 и нарушений питания проводили согласно рекомендациям ВОЗ (1999 г.). В результате проведенного обследования установлено, что участники основной группы в 100% случаев имели избыток массы тела или ожирение, с преимущественным распределением жировой ткани по абдоминальному типу (88,54%). Среди причин избыточной массы тела пациенты с СД2 мужского пола наиболее часто называли неправильное питание (16,7%), а женщины связывали прибавку массы тела с беременностью и родами (33,3%). Пациенты основной группы в 65,6% случаев имели отягощенную по СД2 наследственность, причем преимущественно по материнской линии (30,2%). Терапия всех пациентов с СД2 включала диету по М. И. Певзнеру. В структуре медикаментозной терапии первое место по распространенности занимает комбинация метформина с другими группами препаратов (35,5%), монотерапия метформином зарегистрирована в 26,0% случаев, сульфанилмочевинными препаратами – в 13,5%. На инсулинотерапии 96 находилось 41,6% пациентов, причем в 22,9% инсулин сочетался с другими лекарственными средствами. При сравнительной характеристике гормонально-метаболических показателей выявлено, что для пациентов с СД2 характерно наличие инсулинорезистентности, стимулированных более уровней высокие гликемии, показатели ИРИ базальных и и С-пептида. Гиперхолестеринемия у пациентов с СД2 наблюдается в 79,2% случаев, гипертриглицеридемия – в 55,2%. В ходе обработки данных, полученных в ходе генотипирования образцов ДНК 192 участников исследования, отмечено, что в основной группе и группе контроля распределение частот аллелей и генотипов 7 полиморфных маркеров отклоняется от распределения Харди-Вайнберга. Недостаточное для анализа число результатов тестирования было получено для 6 полиморфизмов. Вследствие чего все 13 исключены из дальнейшего анализа. При дальнейшем анализе установлено, что в русской популяции Тюменской области с СД2 ассоциированы 10 полиморфных маркеров, а именно: rs8050136 и rs11642841 гена, ассоциированного с жировой массой и ожирением (FTO), rs2943641 и rs2943634 гена субстрата инсулинового рецептора-1 (IRS1), rs571312 гена рецептора меланокортина-4 (MC4R), rs1470579 гена белка 2, связывающего инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF2BP2), rs163184 гена, кодирующего субъединицу-1 канала, зависимого от ионов калия (KCNQ1), rs11924032 гена внутриклеточного транспортера глюкозы 2 типа (SLC2A2), rs11634397 гена, кодирующего домен 6 цинкового пальца (ZFAND6), rs7172432 гена, кодирующего домен С2, зависимый от ионов кальция (C2CD4A). Дополнительно, с целью выявления в русской популяции взаимосвязей исследуемых полиморфных генетических маркеров с клиническими и метаболическими показателями СД2, проведен анализ ассоциаций изучаемых ОНП с ожирением и ИР. При исследовании ассоциаций 97 изучаемых полиморфных генетических маркеров с ожирением испытуемые основной группы (n=96) сравнивались с пациентами нормальной массы тела из группы контроля (n=71). При исследовании ассоциаций с ИР группы также были детализированы и разделены на подгруппу пациентов с СД2 и ИР (n=65) и подгруппу пациентов без СД2 и без ИР (n=81). В результате в русской популяции Тюменской области установлены связи полиморфных маркеров rs8050136 и rs11642841 (FTO), rs7172432 (C2CD4A) и rs571312 (MC4R), rs16928751 (ADIPOR2), rs7593730 (PBMS1-ITGB6) с ИР. Сравнение пациентов с избытком массы тела и ожирением и участников контрольной группы с нормальной массой тела выявило ассоциации полиморфных маркеров rs8050136, rs11642841 и rs1558902 (FTO), rs2241766 (ADIPOQ), rs243021 (BCL11A) с ожирением. Далее для каждого из установленных полиморфных генетических маркеров рассчитаны показатели отношения шансов и определены аллели и генотипы, ассоциированные с повышенным и с пониженным риском развития СД2, ИР и ожирения. Расчет отношения шансов позволил выявить ассоциации с СД2 полиморфного маркера rs1470579 гена IGF2BP2, впервые исследованного в русской популяции. Представленный ген IGF2BP2 кодирует белок 2, связывающий инсулиноподобный фактор роста-2 – один из трех агентов, регулирующих трансляцию ИФР-2 как главного фактора роста плода [69]. Эксперименты на мышах, посвященные изучению апоптоза B-клеток и ИФР2 как фактору их выживания, показали, что гибель В-клеток связана с падением экспрессии ИФР-2 в постнатальном периоде, что, вероятно, связано с ингибирующим влиянием IGF2BP2 [193]. Согласно результатам проведенного анализа в русской популяции Тюменской области с риском СД2 ассоциирован аллель С (OR=1,59 [1,01-2,48]; р=0,04), а со снижением риска развития СД2 связан аллель А (OR=0,63 [0,40-0,99]; р=0,04) полиморфного маркера rs1470579 гена IGF2BP2. 98 Ассоциация rs163184 гена KCNQ1, кодирующего субъединицу-1 канала, зависимого от ионов калия, дефекты которого в поджелудочной железе влияют на режим секреции инсулина [90], в российской популяции представлена впервые. Показатель отношения шансов генотипа GG полиморфного маркера rs163184 гена KCNQ1 составил 3,45 [1,20-9,96]; p=0,03, что позволило отнести данный генотип к маркерам повышенного риска развития СД2. Относительно гена IRS1 – гена субстрата инсулинового рецептора-1, запускающего внутриклеточные процессы усвоения глюкозы [91], установлено, что повышающими риск развития СД2 являются аллель С (OR=1,6 [1,08-2,57]; р=0,03) и генотип СС (OR=2,24 [1,24-4,03]; р=0,03) полиморфного маркера rs2943641 гена IRS1 и аллель С (OR=1,67 [1,05-2,66]; р=0,03) и генотип СС (OR=2,3 [1,23-4,32]; р=0,03) полиморфного маркера rs2943634 гена IRS1, а снижающими риск – аллель Т (OR=0,60 [0,39-0,93]; р=0,03) и генотип ТС (OR=0,50 [0,28-0,90]; р=0,03) полиморфного маркера rs2943641 гена IRS1 и аллель А (OR=0,60 [0,38-0,95]; p=0,03) и генотип АС (OR=0,48 [0,26-0,89]; p=0,03) и полиморфного маркера rs2943634 гена IRS1. Ген SLC2A2 кодирует внутриклеточный транспортер глюкозы 2 типа, переносящий глюкозу через мембрану в кишечнике, почках, В-клетках поджелудочной железы против градиента концентрации [226]. При расчете отношения шансов установлено, что с пониженным риском развития СД2 ассоциирован генотип AG (OR=0,43 [0,20-0,91]; p=0,04) полиморфного маркера rs11924032 гена SLC2A2. Носительство генотипа AG маркера rs11634397 гена ZFAND6, функция которого требует уточнения, статистически значимо ассоциировано с пониженным риском развития СД2 (OR=0,47 [0,26-0,84]; p=0,03). Следует отметить тот факт, что в русской популяции ассоциации полиморфного маркера rs11634397 гена ZFAND6 с СД2 установлены впервые. 99 В ходе анализа ассоциации исследуемых полиморфных генетических маркеров с метаболическими показателями СД2 установлена связь с развитием ИР адипонектина полиморфного ADIPOR2 и маркера rs16928751 полиморфного гена маркера рецептора rs7593730, располагающегося между генами RBMS1 и ITGB6 в локусе 2q24. Маркерами, связанными с повышенным риском формирования ИР, являются аллель A полиморфного маркера rs16928751 гена ADIPOR2 (OR=1,71 [1,02-2,87]; p=0,04) и аллель C полиморфного маркера rs7593730 в области PBMS1-ITGB6 (OR=1,58 [1,01-2,46]; p=0,04). Аллель G (rs16928751) и аллель Т (rs7593730) ассоциированы со сниженным риском ИР (OR=0,58 [0,35-0,98]; p=0,04) и (OR=0,63 [0,41-0,99]; p=0,04). Полиморфный маркер rs7593730 (RBMS1-ITGB6) в российской популяции исследован впервые. Дополнительно, в ходе изучения исследуемых генетических маркеров, выявлены ассоциации с ожирением полиморфного маркера rs1558902 гена FTO, ассоциированного с жировой тканью, полиморфного маркера rs2241766 гена гормона висцеральной жировой ткани – адипонектина ADIPOQ и полиморфного маркера rs243021 гена В-клеточной лимфомы BCL11A. Установлены взаимосвязи с повышенным риском развития ожирения аллеля A (OR=1,61 [1,03-2,52]; p=0,04) полиморфного маркера rs1558902 гена FTO и аллеля T (OR=2,07 [1,04-4,14]; p=0,04) полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ. Также связь со сниженными рисками ожирения аллеля T (OR=0,62 [0,40-0,97]; p=0,04) полиморфного маркера rs1558902 гена FTO, аллеля G (OR=0,48 [0,24-0,96]; p=0,04) полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ. Впервые в русской популяции установлены ассоциации с ожирением полиморфного маркера rs243021 гена BCL11A. В исследовании DIAGRAM+ указанный ОНП отмечен как маркер риска развития СД2 (OR=1,08 [1,061,10]) [227]. В данном исследовании расчет отношения шансов выявил, что аллель А (OR=1,66 [1,07-2,56]; р=0,02) и генотип АА (OR=2,50 [1,07-5,84]; 100 р=0,03) полиморфного маркера rs243021 гена BCL11A ассоциированы с повышенным риском возникновения ожирения, а аллель С полиморфного маркера rs243021 гена BCL11A – со снижением рисков (OR=0,6 [0,39-0,93]; р=0,02). Следует особо отметить, что часть исследуемых полиморфных генетических маркеров продемонстрировали связи не только с СД2, но и с развитием ИР и ожирением. Так, получены данные о перекрестных ассоциациях полиморфных маркеров rs7172932 гена C2CD4A2 и rs571312 гена MC4R с ИР и СД2, а rs8050136 и rs11642841 гена FTO c ожирением, ИР и CД2, что, вероятно, свидетельствует о патогенетической взаимосвязи и сходной генетической природе этих состояний. В отношении полиморфного маркера rs571312 гена рецептора меланокортина-4 MC4R установлено, что со снижением риска развития ИР и СД2 связаны аллель С (OR=0,37 [0,20-0,69]; p=0,002 и OR=0,51 [0,30-0,87]; p=0,01) и) и генотип СС (OR=0,42 [0,20-0,87]; p=0,01 и OR=0,56 [0,30-1,05]; p=0,03), а аллель А (OR=2,71 [1,44-5,09]; p=0,002 и OR=1,96 [1,15-3,34]; p=0,01) и генотип АА (OR=10,76 [1,31-88,60]; p=0,01 и OR=8,86 [1,08-72,31]; p=0,03) ассоциированы с повышенным риском развития ИР и СД2. Точная роль полиморфных маркеров генов FTO и MC4R в формировании ожирения и СД2 требует дальнейшего изучения. Однако уже сегодня появляются данные о том, что возможен кумулятивный эффект сочетания различных полиморфных маркеров данных генов. Так Cauchi с соавторами в 2009 году подтвердил сочетанный эффект rs1421085 гена FTO и rs17782313 гена MC4R на формирование ожирения у европейцев [107]. Расчет отношения шансов для аллелей и генотипов rs11642841 и rs8050136 гена FTO показал, что в русской популяции с пониженным риском развития СД2 ассоциированы генотип СС полиморфного маркера rs8050136 (OR=0,45 [0,24-0,87]; p=0,05) и генотип СС маркера rs11642841 (OR=0,44 [0,23-0,84]; p=0,04). При исследовании распределения частот аллелей и 101 генотипов полиморфного маркера rs8050136 гена FTO у пациентов с избытком массы тела и ожирением, страдающих СД2, и в группе испытуемых с нормальной массой тела без СД2 выявлено, что с повышенным риском развития ожирения связан аллель А (OR=1,92 [1,223,02]; p=0,005), снижают риск развития заболевания аллель С (OR=0,52 [0,33-0,82]; p=0,005) и генотип СС (OR=0,35 [0,18-0,70]; р=0,009). При анализе распределения частот аллелей и генотипов в группе пациентов с ИР и СД2 и у испытуемых без СД2 и ИР также были получены статистически значимые ассоциации с маркером rs8050136 гена FTO. В соответствии с общей тенденцией рисковым, ассоциированным с ИР, является генотип АС (OR=2,10 [1,06-4,17]; p=0,03), а со снижением риска развития ИР связан генотип СС (OR=0,36 [0,16-0,79]; p=0,03). Для полиморфного маркера rs11642841 гена FTO в русской популяции Тюменской области повышающим риск развития ожирения является аллель А (OR=1,64 [1,022,65]; р=0,007), а понижающими риск – аллель С и генотип СС (OR=0,61 [0,38-0,98]; p=0,004 и OR=0,37 [0,17-0,82]; р=0,004). Повышающими риск формирования ИР являются аллель А (OR=1,88 [1,19-2,96]; p=0,007) полиморфного маркера rs11642841 гена FTO, снижет риск ИР аллель С (OR=0,61 [0,38-0,98]; p=0,04) и генотип СС (OR=0,37 [0,17-0,82]; p=0,04). Ассоциации с СД2 и ИР полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A впервые исследованы в русской популяции. Точная роль продукта гена C2CD4A в формировании нарушений углеводного обмена не установлена, однако при расчете отношения шансов в русской популяции Тюменской области аллель А показал ассоциации с повышенным риском развития СД2 (OR=1,60 [1,01-2,52]; p=0,04). Ассоциированным с ИР также является аллель А (OR=1,65 [1,05-2,58]; р=0,03). Аллель G полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A связан с пониженным риском развития СД2 (OR=0,63 [0,40-0,99]; p=0,04) и ИР (OR=0,61 [0,39-0,95]; р=0,03). 102 Отдельного внимания заслуживает тот факт, что c помощью программного обеспечения на основе алгоритма APSampler, основанного на динамическом установлено, методе что Монте-Карло, совместное впервые носительство в русской комбинации популяции аллеля А полиморфного маркера rs8050136 гена FTO и аллеля А полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A ассоциировано с повышенными рисками формирования СД2 (OR=1,97 [1,18-3,29]; p=0,006). При этом выявленное сочетание аллелей соответствуют критерию минимального множества аллелей и является дополнительным значимым маркером генетического риска СД2. Подводя итоги, стоит отметить, что проведенное исследование является попыткой комплексного анализа ассоциаций клинических, метаболических и молекулярно-генетических маркеров у пациентов с СД2 в русской популяции. В процессе работы для выявления возможных взаимосвязей клинических проявлений, метаболических показателей и генетических факторов применялись различные методы поиска ассоциаций. Это расчет относительных рисков развития СД2 в группах пациентов с СД2 и условно здоровых испытуемых, а также при разделении выборок пациентов с СД2 и контрольной группы на подгруппы с учетом ИМТ и значения индекса HOMA-IR, это полигенный анализ ассоциаций с СД2 сочетаний аллелей и генотипов исследуемых полиморфных генетических маркеров. В результате выявлены ассоциации 10 полиморфных генетических маркеров с СД2 в русской популяции, причем 4 из которых перекрестно ассоциированы с развитием ИР и ожирения, что подтверждает общность механизмов наследования и развития ожирения, ИР и СД2. Установлено биаллельное сочетание исследуемых полиморфных маркеров, которое является дополнительным значимым фактором риска развития СД2. Таким образом, результаты проведенного исследования полиморфных генетических маркеров СД2 и их ассоциаций с клинико-метаболическими 103 показателями должны стать частью формирующейся системы данных о генетических детерминантах СД2 в русской популяции, необходимой для дальнейшего развития подходов к персонификации профилактических мероприятий, направленных на предупреждение новых случаев развития СД2. 104 ВЫВОДЫ 1. В русской популяции Тюменской области с СД2 ассоциированы полиморфные маркеры rs8050136 и rs11642841 гена, ассоциированного с жировой массой и ожирением (FTO), rs2943641 и rs2943634 гена субстрата инсулинового рецептора-1 (IRS1), rs571312 гена рецептора меланокортина-4 (MC4R), rs1470579 гена белка 2, связывающего инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF2BP2), rs163184 гена, кодирующего субъединицу-1 канала, зависимого от ионов калия (KCNQ1), rs11924032 гена внутриклеточного транспортера глюкозы 2 типа (SLC2A2), rs11634397 гена, кодирующего домен 6 цинкового пальца (ZFAND6), rs7172432 гена, кодирующего домен С2, зависимый от ионов кальция (C2CD4A). 2. Повышает риск развития СД2 в русской популяции Тюменской области аллель А (OR=1,96; p=0,01) и генотип АА (OR=8,86; p=0,03) маркера rs571312 гена MC4R, аллель С (OR=1,55; p=0,03) и генотип CC (OR=2,24; p=0,03) маркера rs2943641 гена IRS1 и аллель С (OR=1,67; p=0,03) и генотип СС (OR=2,3; p=0,03) маркера rs2943634 гена IRS1, аллель C (OR=1,59; p=0,04) маркера rs1470579 гена IGF2BP2, генотип GG (OR=3,45; p=0,03) маркера rs163184 гена KCNQ1, аллель А (OR=1,6; p=0,04) маркера rs7172432 гена C2CD4A. 3. С пониженным риском развития СД2 в русской популяции Тюменской области ассоциированы генотип СС (OR=0,45; p=0,05) маркера rs8050136 гена FTO, генотип СС (OR=0,44; p=0,04) маркера rs11642841 гена FTO, аллель С маркера (OR=0,51; p=0,01) rs571312 гена MC4R, аллель T (OR=0,6; p=0,03) и генотип TC (OR=0,5; p=0,03) маркера rs2943641 гена IRS1, аллель А (OR=0,6; p=0,03) и генотип АС (OR=0,48; p=0,03) маркера rs2943634 гена IRS1, аллель А (OR=0,63; p=0,04) маркера rs1470579 гена IGF2BP2, генотип AG (OR=0,43; p=0,04) маркера rs11924032 гена SLC2A2, аллель G (OR=0,63; 105 p=0,04) маркера rs7172432 гена C2CD4A, генотип AG (OR=0,47; p=0,03) маркера rs11634397 гена ZFAND6. 4. Cочетание аллелей A маркера rs11642841 гена FTO и аллеля A маркера rs7172432 гена C2CD4A при полигенном анализе ассоциировано в русской популяции Тюменской области с повышенным риском развития СД2 (OR=1,97; p=0,006). 5. В русской популяции Тюменской области повышающими риск развития ожирения являются аллель А (OR=1,92; p=0,005) маркера rs8050136 гена FTO, аллель А (OR=1,88; p=0,007) маркера rs11642841 гена FTO, аллель А (OR=1,61; p=0,04) маркера rs1558902 гена FTO, аллель Т (OR=2,07; p=0,04) маркера rs2241766 гена ADIPOQ, аллель А (OR=1,66; p=0,02) и генотип АА (OR=2,5; p=0,03) гена BCL11A, a снижающими риск являются аллель С (OR=0,52; p=0,005) и генотип СС (OR=0,35; p=0,009) маркера rs8050136 гена FTO, аллель С (OR=0,53; p=0,007) и генотип СС (OR=0,34; p=0,008) маркера rs11642841 гена FTO, аллель Т (OR=0,62; p=0,04) маркера rs1558902 гена FTO, аллель G (OR=0,48; p=0,04) маркера rs2241766 гена ADIPOQ, аллель G (OR=0,6; p=0,02) маркера rs243021 гена BCL11A. 6. С риском развития ИР ассоциированы генотип АС (OR=0,36; p=0,03) маркера rs8050136 гена FTO, аллель А (OR=1,64; p=0.04) маркера rs11642841 гена FTO, аллель А (OR=2,71; p=0,002) и генотип АА (OR=10,76; p=0,01) маркера rs571312 гена MC4R, аллель C (OR=1,58; p=0,04) маркера rs7593730 в области RBMS1-ITGB6, аллель А (OR=1,71; p=0,04) маркера rs16928751 гена ADIPOR2, аллель А (OR=1,65; p=0,03) маркера rs7172432 гена C2CD4A, а со снижением риска развития ИР связаны аллель С (OR=0,61; p=0,04) и генотип СС (OR=0,37; p=0,04) маркера rs11642841 гена FTO, аллель С (OR=0,37; p=0,002) и генотип СС (OR=0,42; p=0,01) маркера rs571312 гена MC4R, аллель T (OR=0,63; p=0,04) маркера rs7593730 в области RBMS1ITGB6, аллель G (OR=0,58; p=0,04) маркера rs16928751 гена ADIPOR2, аллель G (OR=0,61; p=0,03) маркера rs7172432 гена C2CD4A. 106 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Молекулярно-генетическое тестирование полиморфных маркеров rs8050136 и rs11642841 гена, ассоциированного с жировой массой и ожирением (FTO), rs2943641 и rs2943634 гена субстрата инсулинового рецептора-1 (IRS1), rs571312 гена рецептора меланокортина-4 (MC4R), rs1470579 гена белка 2, связывающего инсулиноподобный фактор роста-2 (IGF2BP2), rs163184 гена, кодирующего субъединицу-1 канала, зависимого от ионов калия (KCNQ1), rs11924032 гена внутриклеточного транспортера глюкозы 2 типа (SLC2A2), rs11634397 гена, кодирующего домен 6 цинкового пальца (ZFAND6), rs7172432 гена, кодирующего домен С2, зависимый от ионов кальция (C2CD4A) может быть использовано для формирования группы риска по развитию СД2. 2. Выявление носительства рисковой комбинации аллеля А полиморфного маркера rs8050136 гена FTO и аллеля А полиморфного маркера rs7172432 гена C2CD4A обосновывает включение пациентов в группу высокого риска и необходимость проведения профилактических мероприятий по предупреждению СД2. 107 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом / Под ред. Дедова И.И., Шестаковой М.В. - 4-е, дополненное изд. - М.: 2009. - 103 с. 2. Аметов А.С. Регуляция секреции инсулина в норме и при сахарном диабете 2 типа: роль инкретинов // Русский медицинский журнал. - 2006. №14. - С. 1867-1872. 3. Аметов А.С., Богданова Л.Н. Гипергликемия и глюкозотоксичность – ключевые факторы прогрессирования сахарного диабета 2-го типа // Русский медицинский журнал. - 2010. - №23. - С. 1416-1419. 4. Аметов, А.С., Сокарева, Е.В. Нарушения липидного обмена при сахарном диабете 2-го типа и их коррекция // Русский медицинский журнал. - 2009. - №24. - С. 1586-1590. 5. Ассоциация полиморфных маркеров rs7903146 гена TCF7L2 и rs1801282 гена PPARG (Pro12Ala) с сахарным диабетом 2 типа в Новосибирской области / И.А. Бондарь [и др.] // Сахарный диабет. - 2013. - №4. - С.17-22. 6. Аульченко Ю.С. Разработка и применение методов полногеномного анализа генетических ассоциаций сложных признаков: автореф. дис. ... д-р. биол. наук: 03.02.07. - Новосибирск, 2010. - 33 с. 7. Аульченко Ю.С., Аксенович Т.И. Методологические подходы и стратегии картирования генов, контролирующих комплексные признаки человека // Вестник ВОГиС. - 2006. - №10. - С. 5-14. 8. Балаболкин М.И., Дедов И.И. Генетические аспекты сахарного диабета // Сахарный диабет. - 2000. - №1. - С. 18-20. 9. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений: руководство для врачей. - М.: Медицина, 2005. 511 с. 108 10. Баранов В.С. Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины. - СПб: Н-Л, 2009. - 528 с. 11. Баранов В.С. Полиморфизм генов, экогенетические болезни и предикативная персонализированная медицина // Экологическая генетика. 2011. - №IX(3). - С. 3-14. 12. Бирюкова Е.В. Молекулярно-генетические, гормонально- метаболические и клинические аспекты метаболического синдрома: автореф. дис. ... д-р. мед. наук: 14.00.03. - М., 2009. - 48 с. 13. Бондарь И.А., Шабельникова О.Ю. Генетические основы сахарного диабета 2 типа // Сахарный диабет. - 2013. - №4. - С. 11-16. 14. Бочков Н.П. Клиническая генетика: учебник для вузов. - 3-е, испр. и доп. изд. - М.: Гоэтар-Мед, 2004. - 480 с. 15. Викулова О.К. Противоречия и консенсусы метаболического синдрома. По материалам IV Международного конгресса "Предиабет и метаболический синдром" // Сахарный диабет. - 2011. - № 2. - С. 127-130. 16. Газизова Р.Г. Молекулярно-генетические маркеры предрасположенности к гепертонической болезни населения Республики Татарстан: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04 . - Казань, 2007. - 20 с. 17. Гарбузова М.А. Роль генетических маркеров в формировании кластерных особенностей метаболического синдрома: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.02 . - М., 2010. - 24 с. 18. Генетика моногенных форм сахарного диабета / Т.Л. Кураева [и др.] // Сахарный диабет. - 2011. - №1. - С. 20-27. 19. Генетика сахарного диабета: история и современное состояние проблемы / Т.Л. Кураева [и др.] // Сахарный диабет. - 2005. - №3. - С. 14-16. 20. Генетическая паспортизация населения - новая технология профилактики и реабилитации в медицине / В.Е. Третьяков [и др.] // Эстическая медицина. - 2008. - № 2, том VII. - С. 165-175. 109 21. Генетические маркеры инсулинорезистентности при гестационном сахарном диабете / Т.В. Себло [и др.] // Сахарный диабет. - 2009. - №4. - С. 38-41. 22. Генетические нарушения при сахарном диабете взрослого типа у молодых / Ю.А. Серегин [и др.] // Сахарный диабет. - 2000. - №4. - С. 1-3. 23. Геномика – медицине / Под ред. Иванова В.И., Киселева Л.Л. - М.: Академкнига, 2005. - 392 с. 24. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1998. 459 с. 25. Горбунова В.Н Генетика и эпигенетика синтропных заболеваний // Экологическая генетика. - 2010. - №4, том VIII. - С. 39-43. 26. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. – СПб.: Специальная литература, 1997. - 286 с. 27. Григорян О.Р., Чернова Т.О., Анциферон М.Б. Инсулинорезистентность и патофизиологтческие аспекты старения женщин // Проблемы репродукции. - 2001. - №1. - С. 11-17. 28. Дедов И.И., Балаболкин М.И. Инсулиновая резистентность в патогенезе СД типа 2 и медикаментозная возможность еѐ преодоления // Врач. - 2006. №11. - С. 3-9. 29. Дедов И.И., Каноненко И.В., Смирнова О.М. Значение результатов полногеномных исследований для первичной профилактики сахарного диабета 2 типа и его осложнений. Персонализированный подход // Сахарный диабет. - 2014. - №2. - С. 10-19. 30. Демидова Т.Ю., Круглова Е.Л. Ожирение, как ключевая и модифицируемая причина развития сахарного диабета 2 типа // Российский медицинский журнал. - 2009. - №17 (7). - С. 450-458. 31. Дмитриев А.Н. Метаболический синдром: маркеры индивидуальной предрасположенности, диагностика доклинической стадии, обоснование 110 тактики ведения пациентов: автореф. дис. ... д-р. мед. наук: 14.04.04 . Екатеринбург, 2011. - 14 с. 32. Емельянов, А.О. Возможность эффективной терапии неонатального сахарного диабета препаратами сульфонилмочевины при наличии мутации в гене KCNJ11: собственные наблюдения / А.О. Емельянов [и др.] // Сахарный диабет. - 2009. - №3. - С. 86-89. 33. Инсулиновая резистентность: молекулярно-генетические механизмы развития, диагностика и коррекция при сахарном диабете тип 2: пособие для врачей / М.И. Балаболкин [и др.]. - М.: ММА им. И.М.Сеченова, 2007. - 36 с. 34. Клинико-генетические детерминанты нарушений углеводного обмена у больных с артериальной гипертонией и избыточной массой тела / Ж.Д. Кобалава [и др.] // Кардиология. - 2005. - № 4. - С. 37-43. 35. Клинические рекомендации. Эндокринология / Под ред. Дедова И.И., Мельниченко Г.А. – М.: Гоэтар-Медия, 2012. - 227 с. 36. Клюева С.К. Мультифакториальные заболевания. - СПб.: СПб. МАПО, 2002. - 144 с. 37. Львовс Д. Статистический поиск и валидация биомаркеров, связанных с рассеянным склерозом: автореф. дис. ... канд. физ.-мат. наук: 03.01.09 . - М., 2012. - 26 с. 38. Майоров А.Ю. Инсулинорезистентность в патогенезе сахарного диабета 2 типа // Сахарный диабет. - 2011. - №1. - С. 35-43. 39. Майоров А.Ю. Состояние инсулинорезистентности в эволюции сахарного диабета 2 типа: автореф. дис. ... д-р. мед. наук: 14.00.03 . - М., 2009. - 60 с. 40. Майоров А.Ю., Урбанова К.А., Галстян Г.Р. Методы количественной оценки инсулинорезистентности // Ожирение и метаболизм. - 2009.- №2. С. 19-23. 41. Махмутова Ж.С. Популяционно-генетический анализ полиморфизма гена метилентетрагидрофолатредуктазы при дефектах невральной трубки в 111 казахской популяции: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 03.00.15 - М., 2007. – 27 с. 42. Мельниченко Г.А., Глинкина И.В. Статины в лечении дислипидемии при сахарном диабете // Ожирение и метаболизм. - 2005. - №1. - С. 21-26. 43. Мкртумян А.М., Бирюкова Е.В., Маркина Н.В. Молекулярно- генетические особенности, характер метаболизма глюкозы и функция эндотелия у больных метаболическим синдромом русской популяции // Сахарный диабет. - 2008. - №4. - С. 26-30. 44. Мутовин Г.Р. Клиническая генетика: учебное пособие . - 3-е изд. - М.: Гоэтар-Медиа, 2010. - 832 с. 45. Никитин Ю.П., Воевода М.И., Симонова Г.И. Сахарный диабет и метаболический синдром в Сибири и на Дальнем Востоке // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2012. - №1. - С. 66-74. 46. Пальцев М.А. Персонифицированная медицина // Наука в России. 2011. - №1. - С. 12-17. 47. Плотников Н.В. Клинические и молекулярно-генетические особенности инсулинорезистентности у женщин репродуктивного возраста при ожирении и метаболическом синдроме: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.02. Самара, 2013. - 25 с. 48. Полиморфные маркеры rs12255372 и rs13266634 генов TCF7L2 и SLC30A8 связаны с развитием сахарного диабета типа 2 в русской популяции / В.А. Потапов [и др.] // Генетика. - 2010.- №46(8). - С. 1123-1231. 49. Потапов В.А. Поиск генетических маркеров, определяющих предрасположенность к сосудистым сахарному диабету 2 типа: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.01.03 . - М., 2010. - 20 с. 50. Пузырев В.П., Макеева О.А., Голубенко М.В. Гены синтропий и сердечно-сосудистый континуум // Вестник ВОГиС. 2006. - №3(10). - С. 479491. 112 51. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. - М.: Медиа Сфера, 2006. - 312 с. 52. Результаты реализации подпрограммы Федеральной целевой программы “Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями: федеральная целевая программа - М.: Министерство Здравоохранения Российской Федерации Федеральное Государственное бюджетное учреждение «Эндокринологический научный центр», 2012. - 144 с. 53. Рекомендации экспертов Всероссийского научного общества кардиологов по диагностике и лечению метаболического синдрома. Второй пересмотр // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2009. - №6, прил. 2. - С. 1-29. 54. Рожнова Н.А. Клинико-патогенетиеские особенности течения сахарного диабета 2 типа у больных с дебютом заболевания в молодом возрасте: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.02. - СПб., 2011. - 20 с. 55. Российские рекомендации «Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза», Комитет экспертов ВНОК // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2004. - № 2 (приложение). - С. 35. 56. Рунихин А.Ю., Новикова Ю.В. Современные аспекты патогенеза и лечения сахарного диабета 2 типа // Сахарный диабет. - 2006. - №2. - С. 1-3. 57. Стратегия поиска маркеров генетической предрасположенности к сосудистым осложнениям сахарного диабета на примере диабетической нефропатии / Я.Ю. Кондратьев [и др.] // Сахарный диабет. - 1998.- №1. - С. 22-25. 58. Стратегия поиска маркеров генетической предрасположенности к сосудистым осложнениям сахарного диабета на примере диабетической нефропатии / Я.Ю. Кондратьев [и др.] // Сахарный диабет. - 1998.- №1. - С. 22-25. 113 59. Титович Е.В. Молекулярно-генетические, иммунологические основы и перспективы профилактики сахарного диабета у детей // Проблемы эндокронологии. - 2011. - №1. - С. 9- 17. 60. Тюльпаков А.Н. Роль молекулярной генетики в диагностике и лечении эндокринных заболеваний. Краткая характеристика моногенных форм наследственных эндокринопатий, диагностированных в ФГУ ЭНЦ за 15летний период // Проблемы эндокринологии. - 2011. - №1. - С. 26. 61. Чубриева С.Ю., Глухов Н.В., Зайчик А.М. Жировая ткань как эндокринный регулятор // Вестник Санкт-Петербургского университета. 2008. - №1(11). - С. 32-39. 62. Шахтарин В.В. Результаты исследования геномных ассоциаций (Genome Wide Association Studies) - в эндокринологическую практику // Русский медицинский журнал. 2012 URL: http://www.rmj.ru/articles_8156.htm. 63. Шестакова Е.А. Инкретиновая и "антиинкретиновая" системы в патогенезе сахарного диабета 2 типа: факты и гипотезы // Сахарный диабет. 2011. - №3. - С. 26-29. 64. Шляхто Е.В. Молекулярные и генетические аспекты сердечной недостаточности при сахарном диабете // Вестник РАМН. - 2012. - №1. С. 3137. 65. Эндокринология по Вильямсу. Сахарный диабет и нарушения углеводного обмена / Кроненберг Г.М., Мелмед Ш., Полонски К.С., Ларсен П.Р. Под ред. Дедова И.И., Мельниченко Г.А. - М.: Гоэтар-Медиа, 2010. 448 с. 66. A 100K genome- wide association scan for diabetes and related traits in the Framingham Heart Study: replication and integration with other genome-wide datasets / J.C. Florez [et al.] // Diabetes. - 2007. - Vol. 56. - P. 3063-3074. 67. A common genetic variant in WFS1 determines impaired glucagon-like peptide-1-induced insulin secretion / S.A. Schäfer [et al.] // Diabetologia. - 2009. Vol. 52 (6). – P. 1075-1082. 114 68. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity / T. M. Frayling [et al.] // Science. 2007. - Vol. 316(5826). - Р . 889-894. 69. A family of insulin-like growth factor II mRNA-binding proteins represses translation in late development / J. Nielsen [et al.] // Mol Cell Biol. - 1999. - Vol. 19(2). - P.1262-1270. 70. A genome-wide association study identifies GRK5 and RASGRP1 as type 2 diabetes loci in Chinese Hans / H. Li [et al.] // Diabetes. - 2013 - Vol. 62(1). - P. 291-298. 71. A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes / R. Sladek [et al.] // Nature. - 2007. - Vol. 445(7130). - P. 881-885. 72. A genome-wide association study identifies susceptibility variants for type 2 diabetes in HanChinese / F.J. Tsai [et al.] // PLoS Genet. - 2010. - Vol. 19;6(2). e1000847. 73. A genome-wide association study in Europeans and South Asians identifies five new loci for coronary artery disease / J.F. Peden [et al.] // Nat Genet. - 2011. Vol. 43(4). - Р. 339-344. 74. A genome-wide association study in the Japanese population identifies susceptibility loci for type 2 diabetes at UBE2E2 and C2CD4A-C2CD4B / T. Yamauchi [et al.] // Nat Genet. - 2010. - Vol. 42(10). - P. 864-868. 75. A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants / L.J. Scott [et al.] // Science. - 2007. - Vol. 316(5829). - Р. 1341-1345. 76. A genome-wide search for human non-insulin-dependent (type 2) diabetes genes reveals a major susceptibility locus on chromosome 2 / C.L. Hanis [et al.] // Nat Genetics. – 1996. – Vol. 13. – p. 161-166. 77. A multilocus genetic risk score for coronary heart disease: case- control and prospective cohort analyses / S. Ripatti [et al.] // Lancet. - 2010. - Vol. 376(9750). - Р. 1393-1400. 115 78. A Pro12Ala substitution in PPARgamma2 associated with decreased receptor activity, lower body mass index and improved insulin sensitivity/ S.S. Deeb [et al.] // Nat Genet. - 1998. - Vol. 20(3). - Р. 284-287. 79. A search for variants associated with young- onset type 2 diabetes in American Indians in a 100K genotyping array / R.L. Hanson [et al.] // Diabetes. 2007. - Vol. 56. - P. 3045-3052. 80. A single-nucleotide polymorphism in ANK1 is associated with susceptibility to type 2 diabetes in Japanese populations / M. Imamura [et al.] // Human Molecular Genetics. - 2012 - Vol. 21(13). - P. 3042-3049. 81. A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes / V. Steinthorsdottir [etal.] // NatGenet. - 2007. - Vol. 39(6). - P. 770-775. 82. A variant near MTNR1B is associated with increased fasting plasma glucose levels and type 2 diabetes risk / N. Bouatia-Naji [et al.] // Nat Genet. - 2009. - Vol. 41(1) . - P. 89-94. 83. A WFS1 haplotype consisting of the minor alleles of rs752854, rs10010131, and rs734312 shows a protective role against type 2 diabetes in Russian patients / D.A. Chistiakov [et al.] // The Review of Diabetic Studies. - 2010. - Vol. 7(4). P. 285-292. 84. Adipokines and Insulin Resistance / K. Rabe [et al.] // Mol Med. - 2008. Vol. 14(11-12). - P. 741-751. 85. Adiponectin and Adiponectin Receptor Gene Variants in Relation to Type 2 Diabetes and Insulin Resistance-Related Phenotypes / V.A. Potapov [et al.] // Rev Diabet Stud. - 2008. - Vol. 5(1). - P. 28-37. 86. Adiponectin and the development of type 2 diabetes: the atherosclerosis risk in communities study / B.B. Duncan [et al.] // Diabetes. - 2004. - Vol.53. - P. 24732478. 87. Adiponectin gene polymorphism is selectively associated with the concomitant presence of metabolic syndrome and essential hypertension / H.B. Leu [et al.] // PLoS One. - 2011 - Vol. 6 (5) - e19999. 116 88. Adiponectin, type 2 diabetes and the metabolic syndrome: lessons from human genetic studies / F. Vasseur [et al.] // Expert Rev Mol Med. - 2006. - Vol. 8. - P. 1-12. 89. Age influences DNA methylation and gene expression of COX7A1 in human skeletal muscle / T. Rönn [et al.] // Diabetologia. - 2008. - Vol. 51(7). - Р. 11591168. 90. Ahlqvist E., Ahluwalia T.S., Groop L. Genetics of type 2 diabetes // Clin Chem. - 2011. - Vol. 57(2). - P. 241-254. 91. Aminoacid polymorphisms of insulin receptor substrate- 1 in non-insulindependent diabetes mellitus / K. Almind [et al.] // Lancet. - 1993. - Vol. 342(8875). - Р. 828-832. 92. Assessing the effect of interaction between an FTO variant (rs9939609) and physical activity on obesity in 15,925 Swedish and 2,511 Finnish adults / A. Jonsson [et al.] // Diabetologia. - 2009. - Vol. 52(7). - P. 1334-1338. 93. Association analyses of 249,796 individuals reveal 18 new loci associated with body mass index / E.K. Speliotes [et al.] // Nat Genet. - 2010. - Vol. 42(11). Р. 937-948. 94. Association between common polymorphism near the MC4R gene and obesity risk: a systematic review and meta-analysis / B. Xi [et al.] // PLoS One. 2012. – Vol. 7(9). - e45731. 95. Association between insulin secretion, insulin sensitivity and type 2 diabetes susceptibility variants identified in genome-wide association studies / S.M. Ruchat [et al.] // Acta Diabetol. - 2009. - Vol. 46(3). - P. 217-226. 96. Association between polymorphisms in SLC30A8, HHEX, CDKN2A/B, IGF2BP2, FTO, WFS1, CDKAL1, KCNQ1 and type 2 diabetes in the Korean population / Y.H. Lee [et al.] // Journal of Human Genetics. - 2008 - Vol. 53(1112). - P. 991-998. 117 97. Association of ADIPOQ gene variants with body weight, type 2 diabetes and serum adiponectin concentrations: the Finnish Diabetes Prevention Study / N. Siitonen [et al.] // BMC Med Genet. - 2011 - Vol. 12:5. 98. Association of gene polymorphism of the fat mass and obesity associated gene with metabolic syndrome: a retrospective cohort study in Japanese workers / T. Kawajiri [et al.] // Yonago Acta Med. - 2012. - Vol. 55(2). - P. 29-40. 99. Association of type 2 diabetes candidate polymorphisms KCNQ1 with incretin and insulin secretion / K. Müssig [et al.] // Diabetes. - 2009 - Vol. 58(7). P. 1715-1720. 100. Association studies of genetic variation in the WFS1 gene and type 2 diabetes in U.K. populations / J. A. Minton [et al.] // Diabetes. - 2002. - Vol. 51(4). - Р. 1287-1290. 101. Attenuated Wnt signaling perturbs pancreatic growth but not pancreatic function / S. Papadopoulou [et al.] // Diabetes. - 2005. - Vol. 54(10). - Р. 28442851. 102. Beta-cell GLUT-2 loss and non-insulin-dependent diabetes mellitus: current status of the hypothesis / JL. Jr. Milburn [et al.] // Diabetes Metab Rev. - 1993. Vol. 9(3). - P. 231-236. 103. Billings L.K., Florez J.C. The genetics of typе 2 diabetes: what have we learned from GWAS? // Ann N.Y. Acad Sci. - 2010. - Vol. 1212. - P. 59-77. 104. Bonadonna R.C., De Fronzo R.A. Glucose metabolism in obesity and type 2 diabetes // Diabete Metab. - 1991. Vol. 17.1(2). - Р. 112-135. 105. Ca2+, cAMP, and phospholipid-derived messengers in coupling mechanisms of insulin secretion / M. Prentki [et al.] // Physiol Rev. - 1987. - Vol. 67(4). - Р. 1185-1248. 106. Clinical risk factors, DNA variants, and the development of type 2 diabetes / V. Lyssenko [et al.] // N Engl J Med. - 2008. - Vol. 359(21). - Р. 2220-2232. 118 107. Combined effects of MC4R and FTO genetic variants on obesity in European general populations / S. Cauchi [et al.] // Journal of molecular medicine. – 2009. – Vol. 87. – P. 537-346. 108. Common polymorphism near the MC4R gene is associated with type 2 diabetes: data from a meta-analysis of 123,373 individuals / B. Xi [et al.] // Diabetologia. - 2012. – Vol. 55(10). - P. 2660- 2666. 109. Common SNPs in FTO gene are associated with obesity related anthropometric traits in an island population from the eastern Adriatic coast of Croatia / G. Zhang [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 5(4). - e10375. 110. Common variants at 10 genomic loci influence hemoglobin A₁(C) levels via glycemic and nonglycemic pathways / N. Soranzo [et al.] // Diabetes. - 2010. Vol. 59(12). - P. 3229-3239. 111. Common variants in FTO, MC4R, TMEM18, PRL, AIF1, and PCSK1 show evidence of association with adult obesity in the Greek population / К. Rouskas [et al.] // Obesity (Silver Spring). - 2012. - Vol. 20(2). - P. 389-395. 112. Common variants in maturity-onset diabetes of the young genes contribute to risk of type 2 diabetes in Finns / L.L. Bonnycastle [et al.] // Diabetes. - 2006. Vol.55 (9). - Р. 2534-2540. 113. Common variants in WFS1 confer risk of type 2 diabetes / M. S. Sandhu [et al.] // NatGenet. - 2007. - Vol. 39(8). - Р. 951-953. 114. Common variants near MC4R are associated with fat mass, weight and risk of obesity / R.J. Loos [et al.] // Nat Genet. - 2008. - Vol. - 40(6). - P. - 768-775. 115. Common variants of the novel type 2 diabetes genes CDKAL1 and HHEX/IDE are associated with decreased pancreatic beta-cell function / L. Pascoe [et al.] // Diabetes. - 2007. - Vol. 56(12). - Р. 3101-3104. 116. Common variation in the FTO gene alters diabetes-related metabolic traits to the extent expected given its effect on BMI / R.M. Wang [et al.] // Diabetes. 2008. - Vol. 57(5). - P.1419-1426. 119 117. Commonvariants at 30 loci contribute to polygenic dyslipidemia / S. Kathiresan [et al.] // Nat Genet. - 2009. - Vol. - 41(1). P. 56-65. 118. Commonvariants in the ATP-sensitive K+ channel genes KCNJ11 (Kir6.2) and ABCC8 (SUR1) in relation to glucose intolerance: population- based studies and meta- analyses / R.M. van Dam [et al.] // Diabet Med. - 2005. - Vol. 22(5). - P. 590-598. 119. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Geneva, World Health Organization, 1999 (WHO/NCD/NCS/99.2). 120. Designing customized cell signalling circuits / А. Lim Wendell [et al.] // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2010. - Vol. 11(6). - Р. 393-403. 121. Detailed physiologic characterization reveals diverse mechanisms for novel genetic Loci regulating glucose and insulin metabolism in humans / E. Ingelsson [et al.] // Diabetes. - 2010. - Vol. 59(5). - P. 1266-1275. 122. Diabetes Atlas IDF / Guariguata L. [et al.] // 6th Ed. IDF, 2013. - 162 p. 123. Diabetes-linked zinc transporter ZnT8 is a homodimeric protein expressed by distinct rodent endocrine cell types in the pancreas and other glands / C. Murgia [et al.] // Nutr Metab Cardiovasc Dis. - 2009. - Vol. 19(6). - Р. 431-439. 124. DIAGRAM Consortium, GIANT Consortium, Global BPgen Consortium, Anders Hamsten on behalf of Procardis Consortium, MAGIC investigators. New genetic loci implicated in fasting glucose homeostasis and their impact on type 2 diabetes risk / DIAGRAM Consortium, GIANT Consortium, Global BPgen Consortium, Anders Hamsten on behalf of Procardis Consortium, MAGIC investigators // Nat. Genet. - 2010. - Vol. 42. - P. 105-116. 125. Differential expression of KvLQT1 and its regulator IsK in mouse epithelia / S. Demolombe [et al.] // American Journal of Physiology-Cell Physiology. - 2001. - Vol. 280. - P. 359-372. 120 126. Dominant negative mutations in human PPARgamma associated with severe insulin resistance, diabetes mellitus and hypertension / I. Barroso [et al.] // Nature. - 1999. - Vol. 402(6764). - Р. 880-883. 127. Early loss of mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) signalling and reduction in cell size during dominant- negative suppression of hepatic nuclear factor 1-alpha (HNF1A) function in INS-1 insulinoma cells / A.M. Farrelly [et al.] // Diabetologia. - 2009. - Vol. 52(1). - Р. 136-144. 128. Effect of genetic variants in KCNJ11, ABCC8, PPARG and HNF4A loci on the susceptibility of type 2 diabetes in Chinese Han population / F. Wang [et al.] // Chin Med J (Engl). - 2009. - Vol. 122. - P. 2477-2482. 129. Evaluation of common variants in the six known maturity- onset diabetes of the young (MODY) genes for association with type 2 diabetes / W. Winckler [et al.] // Diabetes.- 2007. - Vol. 56(3). - Р. 685-693. 130. Evidence that an isoform of calpain-10 is a regulator of exocytosis in pancreatic beta-cells / C. Marshall [et al.] // Mol Endocrinol. - 2005. - Vol. 19(1). Р. 213-224. 131. FTO first intron rs1558902 variant and platelets count in white middle-aged women: prague pre-and post-menopausal females (3PMFs) study / J.A. Hubacek [et al.] // J Investig Med. - 2013. - Vol. 61(2). - P. 291-293. 132. FTO gene polymorphisms and obesity risk: a meta- analysis / S. Peng [et al.] // BMC Med. - 2011. - Vol. 9. - e71. 133. FTO gene variant and risk of overweight and obesity among children and adolescents: a systematic review and meta- analysis / C. Liu [et al.] // PLoS One. 2013. - Vol. 8(11). - e82133. 134. Genetic risk reclassification for type 2 diabetes by age below or above 50 years using 40 type 2 diabetes risk single nucleotide polymorphisms / J.M. de Miguel-Yanes [et al.] // Diabetes Care. - 2011. - Vol. 34(1). - P. 121-125. 121 135. Genetic variant near IRS1 is associated with type 2 diabetes, insulin resistance and hyperinsulinemia / J. Rung [et al.] // Nat Genet. - 2009. - Vol. 41. - P.11101115. 136. Genetic variants at 2q24 are associated with susceptibility to type 2 diabetes / Qi Lu [et al.] // Hum Mol Genet. - 2010. - 19(13). - P. 2706-2715. 137. Genetic variants in FTO associated with metabolic syndrome: a meta- and gene-based analysis / H. Wang [et al.] // Mol Biol Rep. - 2012 - Vol. 39(5). - P. 5691-5698. 138. Genetic variation in the gene encoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus / Y. Harlkawa [et al.] // Nat Genet. – 2000. – Vo. 26. – P. 161175. 139. Genetics of diabetes complications / А. Doria [et al.] // Curr Diab Rep. 2010. - Vol. 10(6). – P. 467-475. 140. Genetics of type 2 diabetes: pathophysiologic and clinical relevance / C. Herder [et al.] // Eur J Clin Invest. - 2011. - Vol. 41(6). - Р. 679-692. 141. Genetics variation in KCNQ1 associates with fasting glucose and beta cell function: a study of 3,734 subjects comprising three ethnicities living in Singapore / J.T. Tan [et al.] // Diabetes. - 2009 - Vol. 58 (6). - P. 1449-1449. 142. Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels / R. Saxena [et al.] // Science. - 2007. - Vol. 316(5829). - Р. 1331-1336. 143. Genome-wide association analysis of metabolic traits in a birth cohort from a founderpopulation / C. Shibatti [et al.] // Nat Genet. - 2009. - Vol. - 41(1). - P. 3546. 144. Genome-wide association identifies nine common variants associated with fasting proinsulin levels and provides new insights into the pathophysiology of type 2 diabetes / R.J. Strawbridge [et al.] // Diabetes. - 2011. - Vol. 60(10). P.2624-2634. 122 145. Genome-wide association scan meta-analysis identifies three Loci influencing adiposity and fat distribution / C. M. Lindgren [et al.] // PLoS Genet. 2009. - Vol. 5:6. - e1000508. 146. Genome-wide association study for type 2 diabetes in Indians identifies a new susceptibility locus at 2q21 / R. Tabassum [et al.] // Diabetes. - 2013 - Vol. 62(3). P. 977-986. 147. Genome-wide association study identifies a novel locus contributing to type 2 diabetes susceptibility in Sikhs of Punjabi origin from India / R. Saxena [et al.] // Diabetes. - 2013 - Vol. 62(5). P. 1746-1755. 148. Genome-wide association study identifies three novel loci for 2 diabetes / K. Hara [et al.] // Human Molecular Genetics. - 2014 - Vol. 23(1). P. 239-246. 149. Genome-wide association study in a Chinese population identifies a susceptibility locus for type 2 diabetes at 7q32 near PAX4 / R.C. Ma [et al.] // Diabetologia. - 2013 - Vol. 56(6). - P. 1291-1305. 150. Genome-wide association study in individuals of South Asian ancestry identifies six new type 2 diabetes susceptibility loci / J.S. Kooner [et al.] // Nature Genetics. - 2011 - Vol. 43(10). - P. 984-989. 151. Genome-wide meta-analysis for severe diabetic retinopathy / M. A. Grassi [et al.] // Hum Mol Genet. - 2011. - Vol. 20(12). – P. 2472-2481. 152. Genotype score in addition to common risk factors for prediction of type 2 diabetes / J.B. Meigs [et al.] // N Engl J Med. - 2008. - Vol. 359(21). - P. 22082219. 153. Global data on visual impairments 2010. Geneva, World Health Organization, 2012. 154. Global status report on noncommunicable diseases 2010. - Geneva, World Health Organization, 2011. 155. Gloyn A.L., Siddiqui J., Ellard S. Mutations in the genes encoding the pancreatic beta-cell KATP channel subunits Kir6.2 (KCNJ11) and SUR1 (ABCC8) in diabetes mellitus and hyperinsulinism // Hum Mutat. - Vol. 27(3). - P. 220-231. 123 156. Glucose and carbachol generate 1,2-diacylglycerols by different mechanisms in pancreatic islets / B. Peter-Riesch [et al.] // J Clin Invest. - 1988. - Vol. 81(4). Р. 1154-1161. 157. GoldenGate Genotyping Assay Guide (15004065 B) // Instructions for performing the GoldenGate Genotyping assay URL: http://support.illumina.com/downloads/goldengate_genotyping_assay_guide_(150 04065_b).ilmn. 158. Haplotype combinations of calpain 10 gene polymorphisms associate with increased risk of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes in South Indians / P.G. Cassell [et al.] // Diabetes. - 2002. - Vol. 51(5). - Р. 1622-1628. 159. Harder M.N., Ribel-Madsen R., Justesen J.M. Type 2 diabetes risk alleles near BCAR1 and in ANK1 associate with decreased B-cell function whereas risk alleles near ANKRD55 and GRB14 associate with decreased insulin sensitivity in the Danish Inter99 cohort // The Journal of Clinical Endocrinology& Metabolism. – 2013. - Vol. 98, 4, - e801-e806. 160. Herder C., Karakas M., Koenig W. Biomarkers for the prediction of type 2 diabetes and cardiovascular disease // Clin Pharmacol Ther. - 2011. – Vol. 90(1). Р. 52-66. 161. Hex homeobox gene-dependent tissue positioning is required for organogenesis of the ventral pancreas / R. Bort [et al.] // Development. - 2004. Vol. 131(4). - Р. 797-806. 162. Identification and cloning of a beta-cell-specific zinc transporter, ZnT-8, localized into insulin secretory granules / F. Chimienti [et al.] // Diabetes. - 2004. Vol. 53(9). - Р. 2330-2337. 163. Identification of interactive loci linked to insulin and leptin in mice with genetic insulin resistance / K. Almind [et al.] // Diabetes. - 2003. - Vol. 52(6). - P. 1535-1543. 164. Identification of new genetic risk variants for type 2 diabetes / X.O. Shunkert // PLoS Genetics. - 2010 - Vol. 6(9). – P. 774-780. 124 165. Identification of the imprinted KLF14 transcription factor undergoing human-specific accelerated evolution / L. Parker-Katiraee [et al.] // PLoS Genet. 2007. - Vol. 3(5). – e65. 166. Identification of type 2 diabetes genes in Mexican Americans through genome-wide association studies / M.G. Hayes [et al.] // Diabetes. - 2007 - Vol. 56(12). P. 3033-3044. 167. Imamura M., Maeda S. Genetics of type 2 diabetes: the GWAS era and future perspectives // Endocr J.- 2011. - Vol. 58(9). - P. 723-739. 168. Implications of central obesity-related variants in LYPLAL1, NRXN3, MSRA, and TFAP2B on quantitative metabolic traits in adult Danes / D. S. Bille [et al.] // PLoS One. - 2011. - Vol. 6 (6). - e20640. 169. Interaction between prenatal growth and high-risk genotypes in the development of type 2 diabetes / N. Pulizzi [et al.] // Diabetologia. - 2009. - Vol. 52(5). - Р. 825-829. 170. International HapMap Consortium. A haplotype map of the human genome / International HapMap Consortium // Nature. - 2005. - Vol. - 437. - P. 1299-1320. 171. Kadowaki T., Yamauchi T. Adiponectin and adiponectin receptors // Endocr Rev. - 2005. - Vol. 26. - P. 439-451. 172. Lage-Scale Gene-Centric Meta-Analysis across 39 Studies Identifies Type 2 Diabetes Loci / R. Saxena [et al.] // The American Journal of Human Genetics. 2012. - Vol. 90. - P. 410-425. 173. Large-scale association analysis identifies 13 new susceptibility loci for coronary artery disease / H. Shunkert [et al.] // Nat. Genet. - 2011. - Vol. - 43. = P. 333-338. 174. Large-scale association analysis provides insights into the genetic architecture and pathophysiology of type 2 diabetes / A.P. Morris [et al.] // Nature Genetics. 2012 - Vol. 44(9). P. 98-990. 125 175. Linkage of type 2 diabetes mellitus and of age at onset to a genetic location on chromosome 10q in Mexican Americans / R. Duggirala [et al.] // Am J Hum Genet. - 1999. - Vol. 64(4). - Р. 1127-1140. 176. Localization of a susceptibility gene for type 2 diabetes to chromosome 5q34q35.2 / I. Reynisdottir [et al.] // Am J Hum Genet. - 2003. - Vol. 73(2). - Р. 323335. 177. Lvovs D., Фаворова О.О., Фаворов А.В. Полигенный подход к исследованиям полигенных заболеваний // ACTA NATURE. - 2012. - № 3(14), том 4. - С. 62-75. 178. Malecki M.T., Klupa T. Type 2 diabetes mellitus: from genes to disease // Pharmacological Reports. - 2005. - Vol. 57. - P. 20-32. 179. Mathers C.D., Loncar D. Updated projections of global mortality and burden of disease, 2002-2030: data sources, methods and results. World Health Organization, 2005. - 130 p. 180. Mechanisms by which common variants in the TCF7L2 gene increase risk of type 2 diabetes / V. Lyssenko [et al.] // J Clin Invest. - 2007. - Vol. 117(8).- Р. 2155-2163. 181. Meta-analisis and a large association study confirm a role for calpain-10 variation in the type 2 diabetes susceptibility / M.N. Weedon [et al.] // Am J Hum genet. – 2004. – Vol. 73. – P. 1208-1212. 182. Meta-analysis of genome-wide association data and large-scale replication identifies additional susceptibility loci for type 2 diabetes / E. Zeggini [et al.] // NatGenet. - 2008 - Vol. 40(5). - Р. 638-645. 183. Meta-analysis of genome-wide association studies identifies eight new loci for type 2 diabetes in east Asians / Y.S. Cho [et al.] // Nat Genet. - 2011. - Vol. 44(1). - Р. 67-72. 184. Missense mutations in the pancreatic islet beta cell inwardly rectifying K+ channel gene (KIR6.2/BIR): a meta-analysis suggests a role in the polygenic basis 126 oftype II diabetes mellitus in Caucasians / E.H. Hani [et al.] // Diabetologia. 1998. - Vol. 41(12). - Р. 1511-1515. 185. Mortality and causes of death in the WHO Multinational Study of Vascular Disease in Diabetes / N.J. Morrish [et al.] // Diabetologia. - 2001 - Vol. 44. – P. 1421. 186. Mutations in the hepatocyte nuclear factor- 4alpha gene in maturity- onset diabetes of the young (MODY1) / K. Yamagata [et al.] // Nature. - 1996. - Vol. 384(6608). - P. 458-460. 187. Myocardial Infarction Genetics Consortium. Genome-wide association of early- onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants / Myocardial Infarction Genetics Consortium. // Nat Genet. 2009. - Vol. 41(3). - P. 334-341. 188. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants / G. Danaei [et al.] // Lancet. - 2011 - Vol. 378(9785). - P. 31-40. 189. New genetic loci implicated in fasting glucose homeostasis and their impact on type 2 diabetes risk / J. Dupuis [et al.] // Nat Genet. - 2010. - Vol. 42(2). - P. 105-116. 190. Novel loci for adiponectin levels and their influence on type 2 diabetes and metabolic traits: a multi-ethnic meta-analysis of 45,891 individuals / Z. Dastani [et al.] // PLoS Genet. - 2012. - Vol. 8:3. - e1002607. 191. Parental origin of sequence variants associated with complex diseases / A. Kong [et al.] // Nature. - 2009. - Vol. 462 (7275). - P. 868-874. 192. Paschou S.A., Leslie R.D. Personalizing guidelines for diabetes management: twilight or dawn of the expert? / // BMC Med. - 2013. - Vol. 11. - e161. 193. Petrik J. Overexpression of insulin- like growth factor- II in transgenic mice is associated with pancreatic islet cell hyperplasia // Endocrinology. - 1999. - Vol. 140. - P. 2353-2363. 127 194. Physiological and pathophysiological roles of ATP-sensitive K+ channels / S. Seino [et al.] // Prog Biophys Mol Biol. - 2003. - Vol. 81(2). - Р. 133-176. 195. Polymorphic variations in the neurogenic differentiation-1, neurogenin- 3, and hepatocyte nuclear factor-1 alpha genes contribute to glucose intolerance in a South Indian population / A.E. Jackson [et al.] // Diabetes. - 2004. - Vol. 53(8). Р. 2122-2125. 196. PPARGC1A sequence variation and cardiovascular risk-factor levels: a study of the main genetic effects and gene x environment interactions in children from the European Youth Heart Study / E.C. Brito [et al.] // Diabetologia. - 2009. - Vol. 52(4). - Р. 609-613. 197. Prevalence of monogenic diabetes in young adults: a community-based, cross-sectional study in Oxfordshire, UK / J. Kropff [et al.] // Diabetologia. - 2011. - Vol. 54(5). - Р. 1261-1263. 198. Prospero-related homeodomain protein is a novel co-regulator of hepatocyte nuclear factor 4alpha that regulates the cholesterol 7 alpha-hydroxylase gene / K.H. Song [et al.] // J Biol Chem. - 2006. - Vol. 281(15). - e10081- 10088. 199. Purification of serine racemase: biosynthesis of the neuroma do later D-serine / H. Wolosker [et al.] // Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. - 1999 - Vol. 96(2). P. 721-725. 200. Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes / E. Zeggini [et al.] // Science. - 2007 - Vol. 316(5829). Р. 1336-1341. 201. Replication of Genome-wide association signals of type 2 diabetes in Han Chinese in a prospective cohort / Y.C. Chang [et al.] // Clinical Endocrinology. – 2012. - Vol. 76(3). P. 365-372. 202. Risk of type 2 diabetes and obesity is differentially associated with variation in FTO in whites and African- Americans in the ARIC study / J. Bressel [et al.] // PLoS One. - 2010. - Vol. 5(5). - e10521. 128 203. Role of insulin-like growth factor in maintaining normal glucose homeostasis / D.R. Clemmons [et al.] // Horm Res. - 2004. - Vol. 62(l). - P. 77-82. 204. Serine racemase: a glial enzyme synthesizing D-serine to regulate glutamateN-methyl-D-aspartate neurotransmission / Wolosker H. [et al.] // Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. - 1999 - Vol. 96(23). - P. 13409-13414. 205. Sharma A.M., Tarnopolsky M.A. Regulating adiponectin: of flax and flux // Diabetologia. - 2005. - Vol. 48. - P. 1035-1037. 206. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) involved in insulin resistance, weight regulation, lipid metabolism and inflammation in relation to metabolic syndrome: an epidemiological study / C.M. Povel [et al.] // Cardiovasc Diabetol. 2012. - Vol. 11:133. - P. 1-9. 207. SNPs in KCNQ1 are associated with susceptibility to type 2 diabetes in East Asian and European populations / H. Unoki [et al.] // Nat Genet. - 2008. - Vol. 40(9). - Р. 1098-1102. 208. Spiegel A.M., Hawkins M. 'Personalized medicine' to identify genetic risks for type 2 diabetes and focus prevention: can it fulfill its promise? // Health Aff (Millwood). - 2012. - Vol. 31(1). - P. 43-49. 209. SPINK1 is a susceptibility gene for fibrocalculous pancreatic diabetes in subjects from the Indian subcontinent / Z. Hassan [et al.] // Am J Hum Genet. 2002. - Vol. 71 (4). - Р. 964-968. 210. Sun X., Yu W., Hu C. Genetics of type 2 diabetes: insights into the pathogenesis and its clinical application // Hindawi Publishing Corporation. BioMed Research International URL: http://dx.doi.org/10.1155/2014/926713. 211. TCF7L2 variants are associated with increased proinsulin/insulin ratios but not obesity traits in the Framingham Heart Study / E.S. Stolerman [et al.] // Diabetologia. - 2009. - Vol. 52 (4). - P. 614-620. 212. The burden of mortality attributable to diabetes: realistic estimates for the year 2000 / G. Roglic [et al.] // Diabetes Care. - 2005 - Vol. 28(9). P. 2130-2135. 129 213. The carriage of risk variants of CDKAL1 impairs beta-cell function in both diabetic and non-diabetic patients and reduces response to non-sulfonylurea and sulfonylurea agonists of the pancreatic KATP channel / D. A. Chistiakov [et al.] // Acta Diabetol. - 2011. - Vol. 48(3). - P. 227-235. 214. The clinical application of genetic testing in type 2 diabetes: a patient and physician survey / R.W. Grant [et al.] // Diabetologia. - 2009. - Vol. - 52(11). - P. 2299-2305. 215. The common PPARgamma Pro12Ala polymorphism is associated with decreased risk of type 2 diabetes / D. Altshuler [et al.] // Nat Genet. - 2000. - Vol. 26(1). - Р. 76-80. 216. The Coronary Artery Disease Genetics Consortium. A genome-wide association study in Europeans and South Asians identifies five novel loci for coronary artery disease / The Coronary Artery Disease Genetics Consortium // Nat. Genet. - 2011. - Vol. - 43. - P. 339-344. 217. The pathophysiology of diabetes involves a defective amplification of the late- phase insulin response to glucose by glucose-dependent insulinotropic polypeptide-regardless of etiology and phenotype / O. Pedersen [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. - 2003. - Vol. 88(10). - P.4897-4903. 218. The PPARgamma Pro12Ala variant is associated with insulin sensitivity in Russian normoglycaemic and type 2 diabetic subjects / D.A. Chistiakov [et al.] // Diab. Vasc. Dis. Res. - 2010. - Vol. 7(1). - P. 56-62. 219. The relationship between adiponectin, an adiponectin gene polymorphism, and high-density lipoprotein particle size: from the Mima study / K. Tsuzaki [et al.] // Metabolism. - 2012 - Vol. 61(1). - P. 17-21. 220. The role of gut hormones in glucose homeostasis / D.J. Drucker // J Clin Invest. - 2007. - Vol. 117(1). - Р. 24-32. 221. The role of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in diabetes and obesity / F.S. Celi [et al.] // CurrDiabRep. - 2002. - Vol. 2(2). - Р. 179-185. 130 222. The rs11705701 G>A polymorphism of IGF2BP2 is associated with IGF2BP2 mRNA and protein levels in the visceral adipose tissue - a link to type 2 diabetes susceptibility / D.A. Chistiakov [et al.] // The Review of Diabetic Studies. - 2010. Vol. - 9(2). P. 105-115. 223. The sequence of the human genome / J.C. Venter [et al.] // Science. - 2001. Vol. 291(5507). - P. 1304-1351. 224. The T allele of rs7903146 TCF7L2 is associated with impaired insulinotropic action of incretin hormones, reduced 24 h profiles of plasma insulin and glucagon, and increased hepatic glucose production in young healthy men / К. Pilgaard [et al.] // Diabetologia. - 2009. - Vol. 52(7). - Р. 1298-1307. 225. The Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome- wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls /The Wellcome Trust Case Control Consortium // Nature - 2007. - Vol. 447. - P. 661678. 226. Tiedge M., Lenzen S. Regulation of glucokinase and GLUT-2 glucosetransporter gene expression in pancreatic B-cells / // Biochem J. - 1991. - Vol. 279(Pt 3). - P.899-901. 227. Twelve type 2 diabetes susceptibility loci identified through large-scale association analysis / B.F. Voight [et al.] // Nat Genet. - 2010. - Vol. 42(7). - Р. 579-589. 228. Two new Loci for body-weight regulation identified in a joint analysis of genome-wide association studies for early-onset extreme obesity in French and german study groups / A. Scherag [et al.] // PLoS Genet. - 2010. - Vol. 6:4. 229. Type 2 diabetes mellitus and skeletal muscle metabolic function / E. Phielix [et al.] // Physiol Behav. - 2008. - Vol. 94(2). - Р. 252-258. 230. Type 2 diabetes whole-genome association study in four populations: the DiaGen consortium / J.T. Salonen [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 2007. - Vol. 81. P. 338-345. 131 231. Type 2 diabetes: new genes, new understandning / I. Prokopenko [et al.] // Trends Genet. - 2008. - Vol. 24(12). - Р. 613-621. 232. Unique splicing pattern of the TCF7L2 gene in human pancreatic islets / P. Osmark [et al.] // Diabetologia. - 2009. - Vol. 52(5). - Р. 850-854. 233. Utility of genetic and non- genetic risk factors in prediction of type 2 diabetes: Whitehall II prospective cohort study / P.J Talmud [et al.] // BMJ. - 2010. - Vol. 14. - b4838. 234. Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes / S.F. Grant [et al.] // Nat Genet. - 2006 - Vol. 38(3). - P. 320-323. 235. Variants in KCNQ1 are associated with susceptibility to type 2 diabetes mellitus / K. Yasuda [et al.] // Nature Genetics. - 2008 - Vol. 40(9). P. 1092-1097. 236. Variants in MTNR1B influence fasting glucose levels / I. Prokopenko [et al.] // Nat Genet. - 2009. - Vol. 41(1). - P. 77-81. 237. Variations in KCNQ1 are associated with type 2 diabetes and beta cell function in a Chinese population / C. Hu [et al.] // Diabetologia. - 2009 - Vol. 52(7). - P. 1322-1325. 238. Wang J., Elghazi L., Radker S.E. The concerted activities of PAX4 and Nkx2.2 are essential to initiate pancreatic B-cell differentiation // Developmental Biology. - 2004. - Vol. 266, 1. - P. 178-189. 239. Wolfram syndrome 1 and adenylyl cyclase 8 interact at the plasma membrane to regulate insulin production and secretion / S.G. Fonseca [et al.] // Nat Cell Biol.2012. - Vol. 14(10). - P.1105-1112. 240. Meta-Analysis of Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR) rs2228671 Polymorphism and Coronary Heart Disease / Ye H. [et al.] // Hindawi Publishing Corporation. BioMed Research International URL: http://dx.doi.org/10.1155/2014/564940 241. Yi F., Brubaker P.L., Jin T. TCF-4 mediates cell type- specific regulation of proglucagon gene expression by beta-catenin and glycogen synthase kinase-3 beta // J Biol Chem. - 2005. - Vol. 280(2). - Р. 1457-1464.
