методы молекулярной гибридизации с типоспецифичными
advertisement
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ С ТИПОСПЕЦИФИЧНЫМИ ЗОНДАМИ ДЛЯ УСКОРЕННОГО СКРИНИНГА ПАЦИЕНТОВ ГРУППЫ РИСКА ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ (МЛУ-ТБ) ПРОГРАММНОЕ ЗАЯВЛЕНИЕ 27 июня 2008 года 2 ПРОГРАММНОЕ ЗАЯВЛЕНИЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ С ТИПОСПЕЦИФИЧНЫМИ ЗОНДАМИ ДЛЯ УСКОРЕННОГО СКРИНИНГА ПАЦИЕНТОВ ГРУППЫ РИСКА ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ (МЛУ-ТБ) 1. История вопроса Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) представляет собой сложнейшую проблему с точки зрения борьбы с ТБ вследствие неизбежно возникающих комплексных задач в области диагностики и лечения. По расчетным данным, ежегодное глобальное бремя МЛУ-ТБ составляет примерно 490 тыс. случаев или 5% от глобального бремени ТБ; однако, в настоящее время удается диагностировать менее 5% больных МЛУ-ТБ из-за серьезных ограничений в работе лабораторной службы. Вызывающая тревогу динамика роста МЛУ-ТБ, появление ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ), потенциальная передача инфекции внутри лечебных учреждений и резкий подъем смертности среди ВИЧ-инфицированных больных МЛУ-ТБ и ШЛУ-ТБ – все эти обстоятельства привели к неотложной необходимости приступить к разработке экспрессметодов скрининга. Традиционные методы культуральных исследований в области микобактериологии и определения лекарственной чувствительности (ОЛЧ) занимают много времени и обременительны, требуют соблюдения определенной последовательности процедур для изоляции микобактерий из клинического материала и связаны с идентификацией комплекса Mycobacterium tuberculosis и тестированием in vitro чувствительности штаммов к противотуберкулезным препаратам (ПТП). За это время пациенты могут проходить неадекватный курс лечения, может продолжаться циркуляция лекарственно-устойчивых штаммов и может иметь место амплификация резистентности. Новые технологии для быстрого выявления устойчивости к ПТП стали, таким образом, одной из приоритетных задач в области научных исследований и разработок по проблеме ТБ, и в этом плане наиболее продвинутыми для ускоренного обнаружения устойчивости к рифампицину (только к нему или в сочетании с изониазидом) оказались методы молекулярной гибридизации с типоспецифичными зондами. Постановка реакции гибридизации с типоспецифичными зондами предусматривает соблюдение следующей последовательности процедур. Сначала из изолятов M. tuberculosis или непосредственно из клинического диагностического материала выделяют ДНК. Затем проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с амплификацией ответственного за развитие резистентности участка анализируемого гена с использованием биотилинированных праймеров. По завершении амплификации меченные ПЦР-продукты подвергают гибридизации со специфичными олигонуклеотидными зондами, иммобилизированными на индикаторной полоске. Полученные путем захвата меченые гибриды выявляют путем колориметрического проявления, что позволяет обнаружить комплекс M. tuberculosis, а также присутствие зондов диких штаммов и мутаций, связанных с антибиотикорезистентностью. Если мутация имеет место на одном из участков-мишеней, то ампликон1 не будет создавать гибрид с соответствующим зондом. Следовательно, мутации имеют место тогда, когда не происходит связывания с зондами штаммов дикого типа, а также на основании связывания с типоспецифичными зондами применительно к наиболее часто встречающимся мутациям. Реакция после гибридизации проявляется в виде разноцветных бэндов на индикаторной полоске в месте связывания зондов, что можно наблюдать невооруженным глазом. 1 Прим. переводчика: ампликон – продукт реакции амплификации. 3 2. Доказательная база 2.1 Процесс В марте 2008 г. по инициативе Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Специальной программы научных исследований и подготовки кадров по тропическим болезням (TDR) ЮНИСЕФ/ПРООН/Всемирного банка/ВОЗ проходило заседание Группы экспертов для оценки имеющихся данных о методах гибридизации с типоспецифичными зондами, чтобы разработать базовые рекомендации по их применению на практике. Для оценки эффективности работы этих методов и их осуществимости в рамках программной деятельности были использованы данные из опубликованной тематической литературы, результаты валидации лабораторных исследований и изучения опыта исследовательских лабораторий и испытаний в полевых условиях. Кроме того, удалось охарактеризовать связанную с этим инфраструктуру лабораторной сети, потребности в кадровых ресурсах и пробелы в научных исследованиях. В итоге масштабного анализа литературы удалось найти опубликованную информацию о доказанной эффективности двух коммерческих тест-систем гибридизации с типоспецифичными зондами. Судя по всему, пока они являются единственными готовыми продуктами. Несмотря на то, что конкретные коммерческие тест-системы запатентованы, лежащая в их основе технология гибридизации с типоспецифичными зондами доступна для общего пользования. Тест-системы, используемые для принятия информированных решений по ведению больных, считаются этически правомерными лишь в том случае, если их результаты получены с помощью продукта, который в итоге проведения тщательно контролируемых оценочных испытаний продемонстрировал свое соответствие установленным целевым показателям эффективности, и должны быть официально зарегистрированы для определенной области применения. Производство обеих прошедших испытания коммерческих тест-систем соответствует сертификации ISO 13485:2003, причем их преимуществом является наличие высококачественных реактивов и диагностических комплектов, и они предназначены для использования в заданных условиях эксплуатации. Эти тест-системы также одобрены для внедрения Органом нормативного контроля в Европе (с правом маркировки продукции «CE-Marked») и в других регионах. Системы гибридизации с типоспецифичными зондами, разработанные отдельными научно-исследовательскими учреждениями для внутреннего пользования, не проходили соответствующей валидации или оценки за пределами этих учреждений, и поэтому их использование для клинического ведения больных не рекомендуется. Хотя не исключено, что в будущем могут появиться и другие тест-системы, но в таком случае они должны будут пройти валидацию и экспертную оценку на таком же уровне прежде, чем ВОЗ сможет их рекомендовать для внедрения. 2.2 Результаты Данные систематических обзоров и мета-анализов с целью оценить эффективность работы тест-систем по сравнению с традиционными методами ОЛЧ показали, что реакции гибридизации с типоспецифичными зондами отличаются высокой чувствительностью (>=97%) и специфичностью (>=99%) для определения резистентности к рифампицину только или в сочетании с изониазидом (чувствительность >=90%; специфичность >=99%) при анализе изолятов M. tuberculosis и диагностического материала с положительным результатом бактериоскопии мокроты. Суммарная точность выявления МЛУ была не менее высокой, составив 99%, и осталась такой же, когда в качестве маркера МЛУ определяли резистентность к одному лишь рифампицину. Эти результаты были подтверждены в нескольких странах по данным лабораторной валидации и испытаний в полевых условиях, главным образом на примере крупномасштабного демонстрационного проекта в Южной Африке, реализованного Фондом по внедрению новых диагностических технологий (FIND), 4 Советом ЮА по медицинским научным исследованиям (SAMRC) и Национальной службой ЮА по санитарно-гигиеническим лабораториям (NHLS). Данные, полученные в итоге валидации и испытаний в полевых условиях в Южной Африке, также продемонстрировали целесообразность внедрения методов гибридизации с типоспецифичными зондами в практику работы государственных санитарногигиенических лабораторий, выполняющих большой объем исследований. Детальная оценка затрат в Южной Африке показала, что в сравнении с традиционными методами ОЛЧ снижение затрат на постановку реакций гибридизации с типоспецифичными зондами в рамках рутинных диагностических процедур составило от 30% до 50%. Как и ожидалось, сумма затрат была наименьшей при непосредственном анализе положительных по мазку мокроты образцов материала методом гибридизации с типоспецифичными зондами и оказывалась наибольшей при анализе изолятов, полученных из жидкой первичной культуры. Методы гибридизации с типоспецифичными зондами все еще предстоит оценить с точки зрения экономической эффективности и по критерию «затраты-выгоды», и эти показатели будут зависеть от технологий скрининга и диагностики применительно к разной эпидемиологической ситуации. Подробные сведения об экономической эффективности и воздействии на практику ведения больных можно будет получить только по завершении крупных демонстрационных проектов на местах. Помимо влияния на ситуацию с заболеваемостью, смертностью и дальнейшим распространением МЛУ-ТБ внедрение этих методов анализа в практику проведения скрининга и диагностики может существенно уменьшить потребность в традиционно сложившейся разветвленной и затратной инфраструктуре лабораторной сети, которая все еще во многом является неадекватной в большинстве стран с высоким бременем болезни. Экспертная группа пришла к заключению о том, что уже накоплено достаточно обобщенных фактических данных в пользу рекомендации по использованию на страновом уровне методов гибридизации с типоспецифичными зондами для быстрого выявления МЛУ-ТБ, и что через проведение дальнейших операционных исследований можно будет уточнить потребности каждой страны в отдельности в связи с внедрением этих методов. Методы гибридизации с типоспецифичными зондами не являются полной заменой обычных культуральных исследований и ОЛЧ, поскольку культура микобактерий попрежнему нужна при анализе диагностического материала с отрицательным результатом бактериоскопии мазка мокроты, а традиционное ОЛЧ все еще необходимо для подтверждения ШЛУ-ТБ. Вместе с тем, внедрение методов гибридизации с типоспецифичными зондами в практику скрининга МЛУ-ТБ может заметно снизить потребность в традиционных культуральных исследованиях и уровень требований к оснащенности лабораторий для ОЛЧ. 3. Соображения по вопросам внедрения Как и в случае с любой новой технологией, был выявлен целый ряд вопросов, касающихся внедрения, без решения которых методы гибридизации с типоспецифичными зондами не принесут пользы. К ним можно отнести следующее: 3.1 Сбор, хранение и транспортировка диагностического материала Качество поступающих в лабораторию образцов мокроты исключительно важно для получения достоверных результатов реакций гибридизации с типоспецифичными зондами, что актуально и в отношении других вариантов тестирования. Несмотря на то, что контаминация диагностического материала из-за неправильного хранения и длительных сроков доставки образцов в лабораторию вызывает меньшую озабоченность, чем при проведении традиционных культуральных исследований, надежная система 5 транспортировки диагностического материала позволит полностью реализовать те выгоды, которые даст экспресс-анализ за счет сокращения времени на постановку диагноза. Современные рекомендации ВОЗ предписывают проведение скрининга штаммов МЛУ на ШЛУ как в процессе выборочных обследований, так и в лечебных учреждениях, где происходит обследование пациентов для выявления случаев с подозрением на ШЛУ-ТБ или подтверждения такого диагноза. Транспортировка образцов материала в охлажденном виде и наличие систем экспресс-доставки имеют важнейшее значение для проведения обычных культуральных исследований и ОЛЧ; следовательно, необходимо обеспечить строгое соблюдение стандартных операционных процедур по сбору, хранению и транспортировке диагностического материала, если лаборатории поставят перед собой задачу ОЛЧ культуры штаммов к препаратам второго ряда, анализируя образцы возбудителя ТБ с установленной МЛУ по данным гибридизации с типоспецифичными зондами. 3.2 Биобезопасность Постановка реакций гибридизации с типоспецифичными зондами предполагает выполнение таких процедур, как разжижение органических субстанций, деконтаминация и концентрация клинических образцов, еще до экстракции ДНК. При выполнении этих процедур используются процессы гомогенизации и центрифугирования, сопровождаемые образованием аэрозоля, который представляет собой значительный риск инфицирования и перекрестной контаминации диагностического материала. Поэтому пробоподготовка для гибридизации с типоспецифичными зондами должна выполняться в условиях лаборатории при соблюдении адекватных мер предосторожности, соответствующих установленному классу биобезопасности. Согласно ныне действующим рекомендациям ВОЗ, пробоподготовка для получения культуры микобактерий должна осуществляться в ламинарном шкафу биологической безопасности (ЛШББ), который, как минимум, соответствует классу биобезопасности 2 (BSL2). Процедуры, предусматривающие манипуляцию с культурами M. tuberculosis (определение видовой принадлежности, получение субкультуры и ОЛЧ), должны выполняться в лабораториях, которые отвечают требованиям стандарта BSL3. Если применять эти рекомендации к реакциям гибридизации с типоспецифичными зондами, то подготовка положительных по мазку образцов материала для прямого тестирования должна осуществляться в лаборатории с классом биобезопасности BSL2, тогда как для проведения анализа положительных культур необходимы рабочие помещения, которые соответствуют классу биобезопасности BSL3. Образцы мокроты в принципе можно обеззаразить перед их отправкой в специализированную лабораторию, не прибегая к проведению исследований в помещениях класса BSL2; однако, несмотря на то, что методы гибридизации с типоспецифичными зондами, по всей видимости, хорошо проявили себя при работе с инактивированными/обеззараженными после сбора образцами материала, на данном этапе нет достаточных оснований, чтобы рекомендовать эту практику. Следует также иметь в виду, что в процессе инактивации/обеззараживания диагностического материала происходит ослабление жизнеспособности микроорганизмов, и что окажутся невозможными последующие культуральные исследования (например, с использованием отрицательных по мазку образцов материала) и ОЛЧ (например, к ПТП второго ряда для выявления ШЛУ). После денатурации (путем нагревания) деконтаминированных образцов материала присутствующие в нем микроорганизмы становятся нежизнеспособными. Следовательно, дальнейшие этапы анализа можно проводить вне ЛШББ; однако необходимо уделять должное внимание предупреждению контаминации ампликонами путем строгого соблюдения правил уборки и выполнения работы. 6 3.3 Организация лаборатории Для снижения риска перекрестной контаминации процессов анализа ДНК на молекулярном уровне важнейшее значение имеет соблюдение мер предосторожности. Это достигается через использование отдельных комнат для выделения ДНК, подготовки реактивов для ПЦР-анализа (преамплификации), ПЦР-амплификации и гибридизации, а также для интерпретации результатов (постамплификации). Обеспечение ограниченного доступа в рабочие помещения и однонаправленного технологического процесса еще больше снижают вероятность контаминации ампликонами. Тщательная уборка всех помещений всякий раз после завершения работы также имеет большое значение. Ввиду ограничений по площади, скорее всего, просто невозможно выделить отдельные комнаты для каждого этапа исследования в учреждениях любого типа. В качестве минимального требования должны быть предусмотрены три отдельные комнаты для разных этапов молекулярного анализа – одна комната для экстракции ДНК, другая для процедур преамплификации и еще одна для процессов амплификации и постамплификации. Поскольку для выполнения анализов не нужна крупногабаритная аппаратура, рабочие помещения могут быть довольно компактными. Важнейшая роль для получения удовлетворительных результатов принадлежит ограничению доступа в лабораторию, обеспечению определенной направленности потока операций и тщательному соблюдению требований по уборке помещений. В большинстве стран, возможно, потребуется реконструкция здания в целях выделения соответствующих помещений для постановки реакций гибридизации с типоспецифичными зондами с учетом всех деталей, которые касаются сроков, рабочих площадей и средств, необходимых для такой реконструкции. 3.4 Энергоснабжение и резервные источники электропитания Реактивы, используемые для реакций гибридизации с типоспецифичными зондами, должны храниться в охлажденном или замороженном состоянии, а процедуры амплификации и гибридизации – проводиться при тщательно контролируемом температурном режиме. В ходе ПЦР-амплификации и при использовании автоматизированных систем гибридизации необходимо предусмотреть источник бесперебойного питания (ИБП), чтобы исключить вероятность прерывания процедуры и последующей потери результатов анализа. По этой причине в связи с исследованиями методом гибридизации с типоспецифичными зондами возникают серьезные проблемы в тех учреждениях, где перебои с электроснабжением стали обычным явлением. Для таких учреждений настоятельно рекомендуется подключить линию энергоснабжения лаборатории к резервному генератору и ИБП. 3.5 Качество и сроки хранения реактивов Для ПЦР-амплификации должна использоваться вода высокой степени чистоты для молекулярных исследований и фермент Taq-полимераза. Качество этих реактивов может сильно влиять на результативность методов гибридизации с типоспецифичными зондами, а доступные на местах реактивы подлежат валидации до того, как будут использованы. Короткие сроки годности реактивов представляют собой проблему для лабораторий, особенно в относительно труднодоступных территориях с непростыми процедурами таможенной очистки. В связи с этим необходима система управления запасами, функционирующая с учетом частоты их использования, сроков хранения и времени для оформления и размещения заказов. 3.6 Оборудование 7 Помимо оборудования, необходимого для первичного разжижения-деконтаминации образцов мокроты (как например, ЛШББ и безопасные центрифуги), для постановки реакции гибридизации с типоспецифичными зондами требуется специальное оборудование для таких процедур на молекулярном уровне, как термоциклер, качающаяся платформа и водяная баня, термоблок, соникатор2, микроцентрифуга и реакционные пробирки, прибор для гибридизации, холодильник, морозильник, микропипетки и наконечники для пипеток и пробирки для ПЦР-анализа. Перечисленное оборудование реализуется различными частными поставщиками. Правильность спецификаций на оборудование следует подтвердить через производителей тест-систем для анализа методом гибридизации с типоспецифичными зондами, а при внедрении этих методов необходимо предусматривать соответствующее время для прохождения заказа и закупки позиций такого оборудования. Отдельные позиции оборудования, к примеру, термостаты и автоматизированные гибридизаторы, предназначены для работы только с определенными продуктами. И та, и другая коммерческая тест-система для постановки реакций гибридизации с типоспецифичными зондами может использоваться в комплексе с автоматизированными, ориентированными на конкретный продукт системами гибридизации. Тест-системы для анализа диагностического материала вручную методом гибридизации с типоспецифичными зондами подходят для использования в лабораториях, исследующих небольшое количество образцов. Автоматизированные системы требуют значительно большего объема начальных капиталовложений, но могут обрабатывать до 48 образцов материала за один прогон, затрачивая на это от 2 до 3,5 час., и, таким образом, являются вариантом выбора для лабораторий с высокой пропускной способностью. 3.7 Кадровые ресурсы и профессиональная подготовка Успешное внедрение тест-систем для анализа методом гибридизации с типоспецифичными зондами и интерпретация результатов во многом зависят от уровня квалификации лабораторного персонала, выполняющего тестирование, и качества осуществляемой курации. Демонстрационный проект FIND/SAMRC/NHLS показал, что эти методы анализа могут быть успешно реализованы в лабораториях с большим объемом загрузки; однако это напрямую зависит от качества и уровня подготовки сотрудников и их готовности соблюдать четкие операционные процедуры, включая уборку помещений и обеспечение однонаправленного технологического процесса. Поскольку для постановки реакций гибридизации с типоспецифичными зондами необходим опытный и хорошо обученный персонал, еще до внедрения тест-систем в практику следует тщательно проанализировать потребности в кадровых ресурсах. Следует отметить, что, судя по большинству опубликованных исследований, функция курации осуществлялась научными сотрудниками, прошедшими курс последипломного обучения по молекулярной технологии. Интерпретация результатов реакции гибридизации с типоспецифичными зондами должна проводиться с особой тщательностью ввиду сложности расшифровки паттернов бэндинга. Чтобы правильно интерпретировать специфические паттерны окрашивания бэндов, отражающие необычные мутации или смешанную популяцию микобактерий, нужен высокий уровень профессионализма. Эти вопросы должны быть охвачены еще на начальном этапе профессиональной подготовки, причем при получении необычных результатов должна быть предусмотрена возможность для обращения за методической помощью. В связи с этим после завершения курсов обучения персонала настоятельно 2 Прим. переводчика: соникатор – ванна с водой или другим растворителем и источником ультразвука. 8 рекомендуется обеспечить курацию и мониторинг (ad hoc или дистанционный) со стороны специалиста старшего звена с опытом работы в области молекулярных методов анализа. 3.8 Техническая поддержка Важнейшим условием для обеспечения бесперебойного снабжения реактивами и оборудованием и во избежание задержек на таможне, которые могут стать причинами ухудшения качества продуктов ввиду нарушений условий хранения при транспортировке, является взаимодействие между частными поставщиками и заказчиками в отношении порядка размещения заказа, отгрузки и таможенной очистки. Следует разработать подробный план подготовки специалистов с учетом потребностей каждой страны в людских ресурсах. Курсы обучения могут быть организованы непосредственно фирмой-производителем, уполномоченным местным поставщиком или аккредитованной третьей стороной в зависимости от конкретной территории и обстоятельств. Соглашения об ответственности за вопросы обучения персонала должны быть заключены до начала поставок оборудования и реактивов. Помимо этого, большое значение имеет постоянная техническая поддержка и непрерывные поставки расходных материалов и реактивов, снабжение которыми должно быть оформлено в виде официального договора об оказании услуг между поставщиком и заказчиком. Такой договор должен включать в себя следующие аспекты: • Техническое обслуживание оборудования и заключение контракта на обслуживание, включая ремонт или замену вышедшего из строя оборудования по первому требованию; • Поставки расходных материалов и реактивов с не менее чем шестимесячным сроком годности после их прибытия в лабораторию; • Подробный план оказания непрерывной технической поддержки и информация о каналах, по которым она поступает, например, через местного поставщика, службу помощи по телефону или по Интернету. 3.9 Обеспечение качества Исключительно высокая чувствительность реакций амплификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот, таких как ПЦР, также является недостатком, поскольку даже ничтожное количество ДНК поддается амплификации. Поэтому, таргетные методологии амплификации, в частности реакции гибридизации с типоспецифичными зондами, требуют строгого соблюдения целого ряда процедур для минимизации риска контаминации, обусловливающей получение ложноположительных результатов. Источниками контаминации могут быть ситуации, когда посторонняя ДНК заносится в тест-систему через воду, реактивы, лабораторные расходные материалы и оборудование или из окружающей среды, как например, перенос из одного теста в другой остаточного количества диагностического материала или занос продуктов неспецифической амплификации вследствие не связанных с проводимым анализом манипуляций в соседних лабораториях. Размещение в каждой комнате отдельных комплектов оборудования и расходных материалов существенно снижает риск переноса контаминации. Технологические зоны, оборудование и любые предметы, к которым обычно прикасаются рукой (включая дверные ручки, телефонные трубки, ручки холодильников и морозильников и т.п.), должны регулярно протираться с использованием соответствующих чистящих средств и приемов. Кроме того, риск контаминации можно уменьшить за счет тщательного удаления отходов. 9 С клинической точки зрения, не менее актуальным представляется недопущение ложноотрицательных результатов. При проведении реакций амплификации нуклеиновых кислот ложноположительные результаты главным образом возникают из-за ингибиторов (источником которых часто являются рабочие поверхности в лаборатории), постановки реакций в недостаточно оптимальных условиях или пропуска ответственных этапов анализа или отсутствия контрольных положительных образцов и средств внутрилабораторного контроля операций. Помимо строгого соблюдения протоколов по ведению технологического процесса и уборке помещений лаборатории, а также по надлежащему использованию контрольных положительных и отрицательных образцов следует отметить, что мониторинг результатов с учетом ожидаемых исходов лечения представляется исключительно полезным для выявления ложноположительных и ложноотрицательных тенденций. Особенно полезными являются сведения о фоновой распространенности МЛУ-ТБ среди групп населения, от которых поступают образцы диагностического материала. Несмотря на ограниченный объем накопленных данных в итоге проведения многоцентровых исследований по обеспечению качества ПЦР выяснилось, что частота ложноположительных результатов чрезвычайно высока, но при этом также стало очевидным, что причиной такой ситуации являются в большей степени проблемы процедурного характера, а не конкретные аналитические методы. Наряду с непрерывным осуществлением внутрилабораторного контроля качества силами сотрудников настоятельно рекомендуется заниматься внешним контролем качества посредством слепых перепроверок выборочных наборов образцов материала или профессионального тестирования с привлечением независимой внешней организации. Стандартизированных программ внешнего контроля качества реакций гибридизации с типоспецифичными зондами пока нет. Поэтому разработка таких систем является насущной потребностью. 3.10 Ведение учета и выдача результатов Чтобы в полной мере воспользоваться преимуществами от внедрения методов гибридизации с типоспецифичными зондами, соответствующие системы должны функционировать таким образом, чтобы обеспечивать оперативную отправку результатов тестирования клиницистам и пациентам для назначения правильного лечения. Более того, в тех случаях, когда используется традиционный метод ОЛЧ для подтверждения результатов экспресс-анализа, следует иметь в виду вероятность получения противоречивых результатов и предусмотреть механизм разъяснения последствий таких разночтений среди клиницистов. 4. Потребности в научных исследованиях Если предположить, что нижеперечисленные потребности не будут мешать или препятствовать процессу внедрения методов гибридизации с типоспецифичными зондами, то следующие положения можно считать приоритетными направлениями научных исследований: • Оценка значимости реакций гибридизации с типоспецифичными зондами для схем скрининга и диагностики с учетом особенностей эпидемиологической ситуации; • Экономическая эффективность и анализ по критерию «затраты-выгоды» реакций гибридизации с типоспецифичными зондами в рамках всевозможных программ; • Роль реакций гибридизации с типоспецифичными зондами в сочетании с традиционными методами культуральных исследований отрицательных по мазку образцов мокроты; 10 • Влияние процедур инактивации/обеззараживания диагностического материала на эффективность постановки реакции гибридизации с типоспецифичными зондами; • Методы оптимизации выделения ДНК, особенно из образцов материала с небольшим количеством микроорганизмов. 5. Рекомендации по вопросам политики Использование методов гибридизации с типоспецифичными зондами рекомендовано ВОЗ при условии соблюдения следующих руководящих принципов: 5.1 Решение о внедрении в практику методов гибридизации с типоспецифичными зондами для ускоренного выявления МЛУ-ТБ должно приниматься министерствами здравоохранения в контексте запланированных страной мероприятий по надлежащему ведению пациентов МЛУ-ТБ, включая разработку страновых программ скрининговых исследований и обеспечение своевременной доступности высококачественных ПТП второго ряда; 5.2 Параметры эффективности работы тест-систем гибридизации с типоспецифичными зондами прошли соответствующую валидацию в процессе прямого тестирования положительных по мазку образцов мокроты и с использованием изолятов комплекса микобактерий M. tuberculosis, полученных из отрицательных и положительных по мазку образцов мокроты; 5.3 Использование коммерческих тест-систем гибридизации с типоспецифичными зондами, а не методов анализа для внутреннего пользования рекомендуется для обеспечения достоверности и воспроизводимости результатов, поскольку собственные диагностикумы не прошли соответствующей валидации или не применялись за пределами узкого круга научно-исследовательских учреждений. Любые новые или типовые методы гибридизации с типоспецифичными зондами подлежат адекватной валидации, то есть должны учитываться опубликованные данные по валидации лабораторных исследований, соответствующие массивы данных для проведения систематического обзора и мета-анализа (включая оценку качества данных), а также результаты реализации демонстрационных проектов в полевых условиях, в рамках которых обеспечивалась бы регистрация параметров осуществимости и устойчивой работы, сопоставимых с традиционными методами и коммерческими тест-системами гибридизации с типоспецифичными зондами. Новые или типовые тест-системы гибридизации с типоспецифичными зондами для МЛУ-ТБ должны предусматривать следующее: 5.3.1 Специфичный зонд для идентификации микобактерий комплекса M. tuberculosis; 5.3.2 Серии зондов для детекции наиболее распространенных мутаций на уровне гена rpoB (кодоны 531, 526 и 516); 5.3.3 Серии частично совпадающих зондов штаммов дикого типа (чувствительных штаммов), охватывающих весь участок RRDR гена rpoB; 5.3.4 Желательно иметь серию зондов для детекции резистентности к изониазиду как высокого (мутации catG), так и низкого уровней (мутации inhA); 5.3.5 Технологию использования стрипов, включая соответствующие механизмы контроля постановки реакции, в целях визуализации результатов анализа; 11 5.3.6 Выпуск тест-систем гибридизации с типоспецифичными зондами в соответствии со стандартами ISO 13485:2003; 5.3.7 Параметры эффективности, сопоставимые с параметрами традиционных методов ОЛЧ; 5.3.8 Параметры эффективности, сопоставимые с параметрами современных коммерческих тест-систем гибридизации с типоспецифичными зондами. 5.4 Внедрение в практику методов гибридизации с типоспецифичными зондами не исключает необходимости в традиционных методах культуральных исследований и ОЛЧ; культуральные исследования по-прежнему нужны для постановки окончательного диагноза ТБ у больных с отрицательным результатом бактериоскопии мазка мокроты, тогда как традиционный метод ОЛЧ нужен для диагностики ШЛУ-ТБ. Однако спрос на традиционные методы культуральных исследований и ОЛЧ может измениться в зависимости от эпидемиологической ситуации на местах и использования методов гибридизации с типоспецифичными зондами в страновых программах скрининговых исследований; 5.5 Поскольку современные тест-системы гибридизации позволяют выявлять устойчивость только к рифампицину и/или изониазиду, странам, где уже зарегистрированы больные ШЛУ-ТБ или выявлены подозрительные случаи, необходимо создать или расширить лабораторную базу для проведения традиционных культуральных исследований и ОЛЧ в целях высококачественного определения чувствительности к препаратам второго ряда на основании современных стратегических рекомендаций ВОЗ; 5.6 Внедрение в практику методов гибридизации с типоспецифичными зондами для ускоренного выявления МЛУ-ТБ должно осуществляться поэтапно, начиная с национальных/центральных референс-лабораторий или тех, которые уже продемонстрировали свое умение проводить молекулярные исследования. По мере выполнения этой задачи можно рассматривать вопрос о расширении сети лабораторий в контексте планов действий по укреплению лабораторной службы в стране и с учетом наличия подходящего персонала в периферийных центрах, качества работы систем транспортировки диагностического материала и реальных возможностей страны по организации соответствующего лечения и ведения прошедших диагностику больных МЛУ-ТБ. 5.7 Должны быть обеспечены соответствующая и надлежащая инфраструктура и оснащение лабораторий наряду с принятием необходимых мер предосторожности по биобезопасности и профилактике контаминации, включая следующее: 5.7.1 Пробоподготовка для культуральных исследований должна проводиться в ламинарных шкафах биологической безопасности (ЛШББ) в помещениях, соответствующих классу биобезопасности не ниже уровня 2 (BSL2); 5.7.2 Процедуры для манипуляции с культурами (традиционное определение видовой принадлежности, получение субкультуры для выделения ДНК и рутинное ОЛЧ) должны выполняться в помещениях класса BSL3. 5.7.3 В лабораториях для постановки реакции гибридизации с типоспецифичными зондами должно быть предусмотрено не менее трех отдельных комнат – по одной комнате для экстракции ДНК, процедур преамплификации и процедур амплификации и постамплификации. В целях предотвращения контаминации образцов ампликонами, что приводит к ложноположительным результатам, необходимо обеспечить ограниченный доступ в помещения, где проводятся молекулярные исследования, и однонаправленный технологический процесс и внедрить в практику жесткие протоколы уборки помещения; 12 5.7.4 Требуется немало сил, чтобы успешно решить вопросы внедрения, кадрового обеспечения и поддержания уровней биобезопасности BSL2 и BSL3 в лабораториях, где проводятся молекулярные исследования. Следует тщательно планировать и должным образом финансировать работы по реконструкции помещений и созданию необходимой инфраструктуры для проведения молекулярных исследований; 5.8 Для выполнения анализов методом гибридизации с типоспецифичными зондами персонал лаборатории должен пройти соответствующее обучение, причем это особенно важно для тех сотрудников, которые отвечают за этапы амплификации и интерпретации полученных результатов. Настоятельно рекомендуется обеспечить курацию работы персонала со стороны специалиста старшего звена с соответствующим уровнем профессиональной подготовки и опытом работы в области молекулярных исследований. 5.9 Необходимо согласовать условия детального договора купли-продажи на коммерческих условиях и плана обслуживания заказчика с фирмамипроизводителями, которые гарантируют бесперебойные поставки материалов в достаточном объеме, приемлемые условия поставок, таможенную очистку, монтаж оборудования, его техобслуживание, ремонт и замену, а также организацию курсов обучения и обеспечение постоянной технической поддержки; 5.10 Следует обеспечить внедрение и соблюдение требований строгих лабораторных протоколов, стандартных операционных процедур для постановки реакции гибридизации с типоспецифичными зондами и механизмов внутрилабораторного контроля качества; 5.11 Должны быть реализованы механизмы оперативного информирования клиницистов о результатах реакции гибридизации с типоспецифичными зондами, чтобы пациенты смогли воспользоваться преимуществами ранней диагностики; 5.12 ВОЗ и ее партнеры должны оказывать помощь странам в разработке оперативных планов внедрения тест-систем гибридизации с типоспецифичными зондами с учетом сложившейся эпидемиологической ситуации и имеющихся ресурсов. ----- 000 ----- 13
