Иммуноферментный анализx
advertisement
Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКОСТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра патофизиологии лечебного факультета Круглов С.В. Малышев И.Ю. ОСНОВЫ МЕТОДА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Учебное пособие для студентов лечебного факультета Москва 2010 Содержание Стр. 1. Введение 2 2. История развития иммунохимических методов 3 3. Теоретические основы ИФА 3.1. Антитела структура и свойства 7 3.2. Закономерности реакции антиген-антитело 11 3.3. Синтез антител 12 3.3.1. Получение поликлональных антител 12 3.3.2. Получение моноклональных антител 15 3.4. Ферменты в ИФА 17 3.4.1. Методы определения ферментативной активности 3.4.2. Конъюгация ферментов и иммобилизация 21 антител и антигенов на твердую фазу. 22 4. Методы проведения иммуноферментного анализа 4.1. Классификация методов ИФА 25 4.2. Схемы проведения ИФА (варианты ELISA) 30 4.3. Титрование 39 Контроль полученных знаний 42 Список литературы 45 5 Рабочая тетрадь и руководство к методическому пособию 46 1 1. ВВЕДЕНИЕ Метод иммуноферментного детектирования анализа (ИФА) предназначен для и количественной оценки веществ, способных вызывать образование антител. ИФА на протяжении нескольких десятилетий успешно применяются в научных и диагностических целях в области медицины, иммуногистохимии, иммунологии, ветеринарии, микробиологии и пищевой промышленности. Столь широкое применение этого метода обусловлено тем, что он сочетает в себе уникальную специфичность с чрезвычайно высокой чувствительностью, достигающей 97-99%. Сочетание этих качеств достигается за счет: - использования специально полученных антител, избирательно связывающихся только с определяемым веществом; - создания комплекса антитело-метка (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе (метка может быть ферментной, изотопной, флуоресцентной или парамагнитной); - использования для детектирования образовавшихся комплексов антиген-антитело-метка высокочувствительных физико-химических методов (фотометрических, флуориметрических, а также био-и хемилюминесцентных). Метод ИФА позволяет решать огромный спектр задач по количественному определению широкого класса веществ. Он используется для определения: токсинов, гормонов, онкомаркеров, лекарственных препаратов, наркотиков, пептидов и белков в биосредах человека, животных и культуральных средах. Методами ИФА возможно определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность), а также идентификация лимфоцитов (субпопуляций). В настоящее время благодаря своей относительно невысокой стоимости и экологической безопасности ИФА перешёл в разряд стандартных, «рутинных» методов качественного и количественного анализа веществ. 2 2. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ История развития иммуноанализа тесно связана с развитием науки иммунологии. Термин «иммунитет» происходит от латинского «immunitas», означающего «освобождение, избавление от чего-либо». Только в XIX веке благодаря широкому распространению вакцинации, создающей иммунитет к оспе, термин «иммунитет» стал постепенно входить в медицинскую литературу. В этом новом (медицинском) качестве - как «освобождение от болезни» - его впервые в 1869 г. официально закрепил французский словарь Литте. В 1890 г. Эмиль фон Беринг (1854 - 1917) и его сотрудник Китасато открыли, что после иммунизации дифтерийным или столбнячным токсином в крови животных появляется нечто, способное нейтрализовать или разрушить токсин и тем самым предотвратить заболевание. Вещество, которое вызывало обезвреживание токсина, получило название антитоксина, а позднее для обозначения этого нового класса веществ был введен более общий термин - антитело. А то, что вызывает образование этих антител стали называть антигеном. В 1897 г. Крауз описал реакцию преципитации между антигеном и антителом. В результате появилась возможность проводить количественное и качественное изучение антител in vitro и практически наблюдать их действие. Большой вклад в развитие иммуноанализа внес Пауль Эрлих (1854 1915). Эрлих впервые ввёл в иммунологическое исследование статистический метод - метод титрования антител и антигенов. В 1897 г. он публикует статью "Измерение активности дифтерийной сыворотки и её теоретические основы". В этой статье были заложены основы для развития иммунохимии и определены пути для количественного изучения реакции антиген - антитело на последующие примерно 50 лет. В статье декларировалось, что специфичность антител и их реакции опираются на законы структурной химии. А также в ней была предложена теория 3 образования антител. В 1908 г. Пауль Эрлих и Илья Мечников разделили Нобелевскую премию в качестве «признания их работ по иммунитету». В 1907 г. выходит книга «Иммунохимия», написанная Сванте Аррениусом, которая дала название новому разделу иммунологии. В 1937г. электрофорез, Тизелиус совместно продемонстрировали с Кабатом увеличение (Kabat), используя гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови иммунизированных животных. Чем положили начало изучению молекулярной природы антител. Основываясь на результатах их работ, Родней Портер и Джералд Эдельман внесли огромный вклад в исследование химической структуры антител. В 50-60-ых они установили, что молекула иммуноглобулина образована двумя легкими и двумя тяжелыми цепями, и то что в ней можно выделить три фрагмента: два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. На основе этих данных была создана теперь уже общепризнанная модель строения IgG. Наконец в 1969 г. Эдельман и его сотрудники полностью сумели расшифровать первичную структуру одной молекулы иммуноглобулина. Это позволило установить положение антиген-связывающего участка, а также локализовать те «домены», которые обеспечивают вторичные биологические функции антител. За эти открытия в 1972 году им была присуждена Нобелевская премия. В 1976 году Kohler and Milstein был разработан метод получения гибридом - клеточных линий, продуцирующих антитела одной специфичности (моноклональные антитела). Начиная с 50-ых годов 20-ого века, развиваются физико-химические методы детекции реакции антиген-антитело. Их развитие позволило увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов. Новые иммунохимические методы, были основанные на применении меченых реагентов. 4 В конце 50-х годов Р. Йалоу и С. Берсоном (Yalow and Berson) был разработан радиоиммунологический анализ (РИА). В качестве метки ими был использован изотоп 125 I, благодаря чему удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА, положила начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии. Позднее были разработаны различные варианты радиоиммуноанализа. Так, например, Майлес и Халес (Miles and Hales) в 1968 году использовали йодированные антитела в комбинации с антигеном на твёрдой фазе. В1978 году Лангон (Langone) предложил метить йодом белок А, который способен специфично связываться с Fc фрагментами антител. Таким образом, меченый белок А можно использовать как универсальный реагент. В 1979 Вейлером и Зенком(Weiler and Zenk) был предложен авторадиографический РИА, в котором они использовали мультиканальные плашки. Кроме того, в 1981 Аксельсон с коллегами(Axelson) разработали липосомный иммуноанализ, где антиген включался в меченые йодом липидные визикулы, которые затем могли быть осаждены антителами. В середине 60-х годов в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до 10-12 М и ниже). На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением 5 образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ провели в 1971 году Энгвал и Перлман (Е. Engvall и P. Perlmann) для IgG фракции, Ван Веемен и Шурс (К Van Weemen и A. Schuurs) для эстрогенов (1971). В 1972 г. Рубенштейн с сотр. (К. Е. Rubenstein et al., 1972) разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. В дальнейшем термин «гомогенный иммуноанализ» стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Внедрение гомогенного мультиканального варианта ИФА, получившего название EMIT-анализа (Энгвал, 1980), в область клинической биохимии содействовало созданию высокочувствительных методов количественного определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ в биологических жидкостях, что дало возможность изучить их фармакокинетику и метаболизм в организме. Большим преимуществом метода EMIT-анализа является возможность использования малых объемов анализируемого образца (5-50 мкл) и отсутствие стадии его предварительной обработки. Ещё один вариант иммуноанализа – флуоресцентный иммуноанализ (ФИА) c использование флуоресцентных меток. Впервые такой анализ провели Смит и Хеммина (Smith, 1981 and Hemmina, 1984). Наиболее удобным из поляризационный гомегенных ФИА, флуоресцентных основанный на методов измерении оказался поляризации флуоресценции. Так, после первых работ Вебера (Weber, 1952), применение 6 поляризации и флуоресценции для изучения биологических систем стало быстро внедрятся в иммуноанализ. Впервые поляризационно- флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) был описан в работах Дандликера и Спесера (Dandliker and Spencer, 1973). Основан он на конкуренции определяемого антигена и антигена, меченого флуоресцентной меткой за ограниченое число центров связывания специфических антител и измерении степени поляризации флуоресценции реакционной смеси. Первым клиническим применением ПФИА было измерение гентамицина (Watson, 1976). В качестве метки использовался флуоресцеин изотиокарбонат (FITC). Кроме флуоресцентных существуют ещё био- и хемилюминисцентные методы (Velan and Haimann, 1978). В настоящее время метод иммуноанализа продолжает развиваться. Это обусловлено тем, что с одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Кроме того, идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров, чему способствует развитие химии высокомолекулярных соединений, клеточной и генной инженерии. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИФА 3.1. Антитела: структура и свойства. Так как, основным компонентом ИФА являются антитела необходимо более подробно познакомиться со структурой и свойствами этих веществ. Антитела появляются в сыворотке иммунизированного человека или животного в результате специфической реакции организма на введение в него антигенов. Антитела могут находиться не только в крови, но и в тканевой жидкости. Благодаря своей идентичности исходным антигенраспознающим рецепторам B-клеток они взаимодействуют с тем антигеном, который первоначально активировал B-клетки, проявляя, таким образом, строгую специфичность. В организме антитела выполняют две основные функции: 7 - распознавание и специфическое связывание антигена; - индукция важнейших физиологических процессов, направленных на уничтожение антигена. Антитела или иммуноглобулины в химическом отношении являются гликопротеидами, состоящими из аминокислот и олигосахаридов. По своим эффекторным свойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgA, IgD, IgG, IgМ, IgE (рис. 1). При этом, все антитела имеют общий план строения. Молекула иммуноглобулина состоит из двух одинаковых тяжелых (Н-цепь) и двух одинаковых легких (L-цепь) полипептидных цепей. Наличие дисульфидных связей в молекуле обеспечивает прочное соединение легких цепей с NH2концевыми участками тяжелых цепей и взаимодействие свободных участков тяжелых цепей между собой. В целом структура такого комплекса схожа с латинской буквой “Y” и характерна для иммуноглобулинов классов IgD, IgG, IgМ (рис2). Рисунок 1. Классы антител При действии на молекулу IgG протеолитического фермента папаина образуется три фрагмента. Два идентичных фрагмента, за способность 8 связывать антиген получивших название Fab-фрагмент (от английского fragment antigen binding), и третий, за способность к кристаллизации названный Fc-фрагмент (от английского fragment cristalline). Рисунок 2. Строение молекулы антитела Fab-фрагмент молекулы антитела ответственен за специфическое распознавание антигена, Fc-фрагмент ответственен за биологические функции антител – связывание с компонентами системы комплимента, взаимодействие с мембранными рецепторами и т.д. Структурной особенностью, как легких, так и тяжелых цепей является наличие в их составе различных областей (доменов) – вариабельной (V) и константной (С). Легкие цепи образуют по два домена ( VL-домен и CLдомен), тяжелые - четыре или пять в зависимости от класса Ig (один VHдомен и три или четыре CH-домена, соответственно). 9 Специфичность антител определяется изменениями в последовательности аминокислотных остатков VH-домена и VL-домена цепей иммуноглобулина, антигенсвязывающие взаимодействие участки между этой которыми молекулы. В формирует аминокислотной последовательности V-области любой легкой или тяжелой цепи имеются положения, характеризующиеся частой заменой аминокислот – гипервариабельные участки. Гетерогенность аминокислот в гипервариабельных последовательностях, как легких, так и тяжелых цепей обеспечивает огромное разнообразие специфических антител благодаря тому, что форма и размер поверхности, образуемой каждой гипервариабельной последовательностью, различны. Антитела распознают не отдельные химические группы, а пространственную форму антигенов. Методом рентгеноструктурного анализа V-домена было установлено, что каркасные участки Fab-фрагмента молекул антител, обычно не принимающие участие в связывании антигена, имеют существенное адекватную значение для конформацию укладки домена, (комплементарность) которая обеспечивает антигенсвязывающего центра антитела (паратопа) с антигенной детерминантой (эпитопом). А множество нековалентных связей с антигеном образуют отдельные аминокислотные остатки гипервариабельных участков, сосредоточенных на концах Fab-ветвей. Эти взаимодействия (водородные связи, электростатические, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные) весьма слабы, однако при большом их числе суммарная энергия связывания получается значительной. Именно действием этих сил обусловлена специфичность антител к данному антигену (т.е. способность различать антигены). В каждой молекуле иммуноглобулина существует, по крайней мере, два идентичных антигенсвязывающих центра. Эта бивалентность позволяет антителам перекрестно связывать антигены с двумя или более антигенными детерминантами, при этом, подвижность плеч молекулы антител позволяет 10 ей связываться одновременно с антигенными детерминантами, находящимися на разных расстояниях. Наличие шарнирной области в тяжелой цепи обеспечивает иммуноглобулина, позволяя конформационную обоим гибкость молекулы антигенсвязывающим центрам, действовать независимо друг от друга при взаимодействии с антигенными детерминантами. Конформационную гибкость молекулы обеспечивает повышенное содержание пролина в шарнирной области тяжелой цепи. 3.2. Закономерности реакции антиген-антитело Все реакции антиген-антитело обратимы. И мера прочности связи определяется аффинностью антитела (величиной связи одного антигенсвязывающего центра с индивидуальным эпитопом антигена) и его авидностью (суммарной силой взаимодействия антитела с антигеном в случае взаимодействия антигеном). поливалентного Реакциям антитела антиген-антитело с поливалентным свойственна высокая специфичность. Однако, в некоторых случаях может возникать феномен называемый перекрестной реактивностью. Этот феномен возникает в том случае если антиген А имеет общие эпитопы с антигеном Б, тогда часть антител, специфичных к А, будет реагировать также с Б. Следует отметить также, что один и тот же антиген часто способен связывать разные по специфичности антитела перекрывающимися эпитопами своей поверхности. Взаимодействие антиген - антитело обратимо и скорость диссоциации комплекса (т.е. прочность взаимодействия антиген-антитело) зависит от константы ассоциации, называемой аффинностью (или сродством). Величина константы K определяется разностью свободной энергии (∆G) между состоянием антигена и антитела, когда они не взаимодействуют между собой, и тем состоянием, когда они образуют комплекс: ∆G = -RTlnK, где R - универсальная газовая постоянная, а T - абсолютная температура. 11 Аффинность зависит от площади контакта между антителом и эпитопом, межмолекулярных расстояний в области контакта, распределения заряженных и гидрофобных групп, а также от тех конформационных изменений, которые вызваны перекрыванием электронных облаков (если электронные облака двух молекул перекрываются, то возникают мощные силы отталкивания). Константа ассоциации имеет большое значение для определения эффективности протекания реакции антиген – антитело. С помощью этого показателя можно оценить специфичность антитела по отношению к различным антигенам. Так если одна популяция антител способна связываться с различными антигенами, то специфичность связывания будет выше для той реакции, константа ассоциации которой больше. На практике антитела с константой равновесия выше 108л/моль принято считать высокоаффинными антителами. 3.3. Синтез антител В организме антитела образуются в ответ на взаимодействие антигенов с В-лимфоцитами. Сенсибилизированные антигеном В-лимфоциты, проходят несколько стадий пролиферации и формируют большой клон плазматических клеток, которые будут синтезировать антитела, причем только той специфичности, на которую был запрограммирован лимфоцитпредшественник. Используемые в иммунологических методах антитела могут быть поликлональные или моноклональные. Для получения антител проводят иммунизацию, т.е. полученный антиген вводят какому-либо животному, чаще всего для этой цели используют мышей, кроликов или крыс. 3.3.1.Получение поликлональных антител Процесс получения поликлональных антител можно разделить на несколько этапов. На первом этапе проводится иммунизация животного. 12 При проведении иммунизации необходимо учитывать ряд особенностей, чтобы получить высококачественные антитела. Большое значение имеет иммуногенность антигена – способность антигена вызывать в организме иммунизированного животного образование антител. Не каждое вещество обладающее антигенными свойствами в одинаковой степени будет стимулировать синтез антител. Иммуногенность антигена зависит от различных факторов: - от молекулярной массы антигена. Высокомолекулярные вещества по сравнению с низкомолекулярными обладают большей иммуногенностью. Это может быть связано с увеличением количества антигенных детерминант, что повышает эффективность взаимодействия антигена с иммунными клетками. - от времени пребывания антигена в организме. - от уровня “чужеродности” антигена. Как правило, чем сильнее структура антигена отличается от структур веществ организма, тем выше его иммуногенность. Качество получаемых антител зависит от гомогенности (чистоты) вводимого антигена. Это обусловлено тем, что примеси также могут обладать иммуногенностью, а в некоторых случаях даже большей, чем основной антиген. Еще один фактор, который необходимо учитывать при проведении иммунизации – это количество вводимого антигена. Слишком высокие или слишком низкие концентрации антигена могут часто не способны тормозить механизмы гуморального иммунитета. Поэтому в каждом конкретном случае необходимо подбирать оптимальную дозу антигена. Исходя из того, что образование антител является компонентом гуморального иммунитета, необходимо учитывать способ и периодичность введения антигена. Иммунный ответ в организме развивается постепенно. После первого попадания антигена в организм развивается первичный ответ, затем после последующих введений – вторичный ответ (рис. 3). 13 Рисунок 3. Иммунизация и иммунный ответ. Состав антител в разные стадии иммунного ответа может сильно варьировать. Наибольшей эффективности удается добиться при проведении нескольких циклов иммунизации введением небольших порций антигена в различные точки. Основные места введения антигена: - внутрикожное введение – на участке кожи удаляют шерсть, делают несколько царапин и втирают раствор антигена. Этот способ позволяет получать высокий иммунный ответ уже после первого введения антигена. - подкожное введение – вводят несколько доз антигена вдоль позвоночника животного. - внутримышечное введение – вводят антиген небольшими порциями в мышцы задних лап. - внутрибрюшинное введение - введение в лимфатические узлы - внутривенное введение – этот способ часто используют при проведении повторных инъекций с отбором крови. 14 Часто введение антигена проводят в комплексе с адъювантом. Адъюванты – вещества способные вызывать неспецифическое усиление иммунного ответа (примеры таких веществ: липосомы, полимеры, клеточные мембраны бактерий и др.). Введение адъювантов снижает возможность развития толерантности, способствует более медленному высвобождению антигена из участка инъекции, снижая его токсичность, стимулирует местную воспалительную реакцию. При внутривенной иммунизации адъювант не используют, так как в этом случае он может привести к гибели животного. В ходе иммунизации производят оценку количества антител. Как правило, при введении растворимого антигена максимальная концентрация антител возникает через 40-60 дней, и 12-20 дней, если иммунизация проводилась клетками микроорганизмов. После достижения максимальной концентрации антител у иммунизированного животного отбирают некоторое количество крови (в зависимости от вида, одно животное можно использовать в качестве донора от 3 до 7 месяцев, проводя повторные циклы иммунизации). Из отобранной крови удаляют форменные элементы, фибриноген, полученную сыворотку прогревают при 56°С для инактивации системы комплемента. После этого иммунная сыворотка готова к применению. Для длительного хранения полученную иммунную сыворотку рекомендуется хранить в лиофилизированном состоянии. Для увеличения относительного количества антител из иммунной сыворотки выделяют γглобулиновую или Ig-G фракцию методом осаждения с последующим диализом ( в качестве осадителя используется полиэтиленгликоль или сульфат аммония) или при помощи ионообменной хроматографии. 3.3.2. Получение моноклональных антител В 1975 году была описана методика, позволяющая получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител (моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью. Это 15 открытие определило бурный прогресс в использовании антител, как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная технология" является одним из основных направлений в биотехнологии. Рисунок 4. Получение моноклональных антител. Для получения моноклональных антител изолируют В-лимфоциты из селезенки иммунизированной мыши и производят их слияние с опухолевыми клетками мыши (клетками миеломы). Это необходимо, так как жизнеспособность антителопродуцирующих лимфоцитов в культуре ограничена лишь несколькими неделями. При слиянии с опухолевой клеткой возникают гибридные клетки, так называемые гибридомы, которые являются потенциально бессмертными. Слияние клеток является редким событием, частота которого повышается в присутствии полиэтиленгликоля [ПЭГ (PEG)]. Отбор продуктивных гибридных клеток проводится при длительной инкубации первичной культуры в ГАТ-среде (НАТ-среде), содержащей гипоксантин, 16 аминоптерин и тимидин. Поскольку дТМФ существенно необходим для синтеза ДНК, миеломные клетки не могут выживать в присутствии аминоптерина. С другой стороны, клетки селезенки могут преодолевать действие ингибитора, используя для синтеза ДНК гипоксантин и тимидин, однако и они существуют в течение ограниченного времени. Только гибридома выживает в виде культуры в среде ГАТ, так как эти клетки обладают одновременно бессмертием миеломных клеток и способностью клеток селезенки приспосабливаться к аминоптерину. В действительности продуцировать антитела способны только единичные гибридомные клетки. Такие клетки необходимо выделить и размножить клонированием. После тестирования клонов на способность образовывать антитела отбираются положительные культуры, которые снова клонируются и подвергаются последующей селекции. В результате получают гибридому, продуцирующую моноклональные антитела. Производство моноклональных антител этими клетками осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости мыши . Одним из главных достоинств моноклональных антител является возможность их получения в неограниченном количестве при неизменных от партии к партии характеристиках. Благодаря этой особенности появилась возможность создания стандартных диагностических наборов реагентов для определения различных веществ. 3.4. Ферменты в ИФА Второй составляющей метода ИФА является фермент конъюгированный с антителом или антигеном. Ферменты являются биокатализаторами, т.е. веществами биологического происхождения, ускоряющими химические реакции. Ферменты способны повышать скорость катализируемой реакции в 10 12 раз и более. Ферменты специфически связывают реагенты (свои субстраты) в активном центре. При этом субстраты ориентируются таким образом, что 17 приобретают оптимальное положение для образования переходного состояния. Сближение и необходимая ориентации реагентов значительно повышают вероятность образования продуктивного комплекса A—B. Кроме того, связывание субстрата в активном центре приводит к удалению гидратной оболочки субстрата. В результате удаления молекул воды в активном центре фермента во время катализа создаются совершенно другие условия, чем в растворе. Еще одним важным фактором является стабилизация переходного состояния вследствие взаимодействия между аминокислотными остатками белка и субстратом. Таким образом, переходное состояние в случае ферментативной реакции требует меньшей энергии активации. Кроме того, многие ферменты во время катализа переносят специфические группировки с субстрата или на субстрат. Особенно часто осуществляется перенос протонов. Ферменты играют важную роль в биохимическом анализе. В биологических материалах, например в жидкостях организма, с помощью определения каталитической активности можно обнаружить ферменты в ничтожно малых концентрациях. При этом имеется возможность значительно снизить предел обнаружения ферментов за счет увеличения времени ферментативной реакции, а также за счет увеличения чувствительности регистрации продукта реакции. В связи с этим наиболее перспективными и широко применяемыми на практике методами детекции являются люминесцентные и методы, основанные на ферментативном усилении сигнала. К ферментам, используемым в иммуноферментном анализе, предъявляется ряд требований: - высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментную метку при низких концентрациях; 18 - доступность ферментов; возможность получения высокочистых ферментных препаратов, сохраняющих свою активность после модификации при получении конъюгата с антителами или антигенами; - стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом; - простота и чувствительность метода определения концентрации фермента. Существует достаточно большое количество ферментов удовлетворяющих эти требования и используемых в иммуноанализе. Однако, наибольшее распространение среди них нашли пероксидаза хрена, β-Dгалактозидаза, уреаза и алкалиновая фосфатаза (табл 1). Характерной особенностью для всех этих ферментов является низкий предел обнаружения на уровне пикомолярных концентраций. Таблица 1. Основные ферментные системы, используемые при проведении ИФА Фермент Субстрат Хромофор (краситель) Буфер HRP (пероксидаза хрена) Перекись водорода (0,004%) Ortho-phenylenediamine (OPD) Фосфатноцитратный, рН 5.0 Перекись водорода (0,004%) Tetramethyl benzidine (TMB) Ацетатный буфер, 0.1 M, pH 5.6 Перекись водорода (0,002%) 2,2'-Azino diethylbenzothiazoline sulfonic acid (ABTS) Фосфатноцитратный, pH 4.2 Перекись водорода (0,006%) 5-aminosalicylic acid (5-AS) Фосфатный, 0.2 M, pH 6.8 Перекись водорода (0,002%) Diaminobenzidine Tris или PBS, pH 7.4 Алкалиновая фосфотаза p-Nitrophenylphosphate pnpp (pnpp) Диэтаноламин (10 mM) и хлорид магния (0.5 mM), pН 9.5 галактозидаза o-nitrophenyl- -Dgalactopyranoside (ONPG) Мочевина Хлорид магния и 2меркаптоэтанол в PBS, pH 7.5 pH 4.8 Уреаза ONPG Бромокрезол 19 Пероксидаза хрена – глобулярный белок, молекулярная масса 40000. в состав активного феррипротопорфирин центра IX. молекулы Фермент пероксидазы катализирует в входит основном двухсубстратные реакции с участием перекиси водорода. В качестве второго субстрата могут выступать различные органические и неорганические вещества (например: люминол, анилины, замещенные фенолы). Реакция протекает в несколько стадий: на первой взаимодействие фермента с перекисью приводит к образованию промежуточной окисленной формы фермента (I), на второй стадии происходит восстановление окисленной формы вторым субстратом, являющимся донором водорода, с образованием второй промежуточной формы фермента (II). Затем вторая промежуточная форма фермента взаимодействует с еще одной молекулой второго субстрата, в результате чего фермент переходит в нативную форму (III). Enz + H2O2 ↔ Enz1 Enz1 + суб-Н2→ Enz2 + суб-НEnz2 + суб-Н2→ Enz + суб-Н2(суб-Н-) → суб-Н2 + суб Для определения каталитической активности пероксидазы могут быть использованы фотометрические, хемилюминесцентные, флуорометрические и электрохимические методы. Важной особенностью этого фермента является его полное отсутствие в крови. Щелчная фосфотаза – молекула этого фермента является димером с ИФА.молекулярной массой 100 000. В состав каждой субъединицы входят два атома цинка, один из которых необходим для поддержания структурной целостности, а другой входит в состав активного центра фермента, обеспечивая его каталитическую активность. Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз различных ортофосфатных эфиров. моноэфир ортофосфорной кислоты + Н2О → спирт + РО43Для определения каталитической активности этого фермента используют фотометрические и флуорометрические методы. 20 Глюкозооксидаза молекулярная масса – фермент 160 000, в представляет состав собой входят гликопротеин, две молекулы флавинадениндинуклеотида. Фермент катализирует окисление β-D-глюкозы кислородом с образованием перекиси водорода: β-D-глюкоза + Н2О + О2 → Н2О2 + β-D-глюконо-σ-лактон. Определение каталитической активности проводят по определению концентрации перекиси водорода с помощью пероксидазы хрена. Методы определения ферментативной активности К основным методам определения ферментативной активности, получившие наибольшее распространение при проведении иммуноферментного анализа, относятся: - фотометрический метод - для регистрации ферментной активности используют субстраты продукты превращения, которых являются окрашенными соединениями, или окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. Окрашенные соединения поглощают свет в видимой или ультрафиолетовой области спектра. Величина поглощения зависит от типа и концентрации вещества, а также от длины волны используемого света. Поэтому применяют монохроматический свет, т. е. свет определенной длины волны, который можно выделить из белого света с помощью монохроматора. Монохроматический свет интенсивности I0 проходит через ячейку из пластика, стекла или кварца (кювету), в которой находится раствор поглощающего вещества. Интенсивность I выходящего света, ослабленного поглощением, измеряется с помощью детектора. Поглощение света (А) раствора (оптическая плотность) определяется как отрицательный логарифм отношения I / I0. Закон Ламберта-Бера гласит, что А пропорциональна концентрации (с) вещества и толщине (d) слоя раствора. Коэффициент экстинкции ε зависит от типа вещества и длины волны. 21 Рисунок 5. Принципы спектрофотометрии. - флуорометрический метод - для регистрации ферментной активности используют субстраты продукты превращения, которых, способны к флуоресценции. Сущность флуоресценции заключается в следующем: молекула вещества поглощает фотон, определенной длинны волны, переходя из основного в возбужденное электронное состояние, находясь в возбужденном состоянии, молекула может вернуться в основное состояние, избыток энергии при этом испускается в виде кванта света с длинной волны отличной от первоначальной. Чувствительность флуоресцентных методов детекции на 1-2 порядка выше фотометрических методов. 3.4.2. Конъюгация ферментов и иммобилизация антител и антигенов на твердую фазу. Высокая чувствительность методов ИФА основана на использовании ферментной метки конъюгированной с антителами. Методы получения конъюгатов в зависимости от типа сшивающего реагента можно разделить на две группы: - гомобифункциональные - гетеробифункциональные При получении конъюгатов с помощью гомобифункциональных реагентов часто используют глутаровый альдегид. Этот сшивающий реагент 22 взаимодействует с аминогруппами лизиновых остатков антител и ферментов (рис. 6). Рисунок 6. Гомобифункциональный метод получения конъюгатов. Процесс конъюгации может проходить в одну или в две стадии. Этот метод применяют для получения конъюгатов антител с пероксидазой хрена и алкалиновой фосфотазы. Достоинство этого метода – его простота, однако выход готового продукта небольшой. В гетеробифункциональном методе получения конъюгатов в качестве сшивающего реагента используют различные соединения, основным компонентом которых является малеимид. Метод заключается во введении малеимидных групп в молекулу белка (фермента или антитела) при взаимодействии группы сшивающего реагента с NH2 группой фермента с образованием пептидной связи, которые затем реагируют с SH-группой другого белка (антитела или фермента). 23 Рисунок 7. Гетеробифункциональный метод получения конъюгатов. При отсутствии свободных SH-групп в молекуле белка они могут быть введены в состав молекулы несколькими методами (рис. 7). Гетеробифункциональный метод имеет высокий выход конъюгата. Кроме вышеперечисленных методов широкое распространение для получения конъюгатов с пероксидахзой хрена имеет перйодатный метод (метод Накане (1974)). Его сущность состоит в модификации фермента с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с NH2 группами антител (рис. 8). Рисунок 8. Перйодатный метод получения конъюгатов. Одной из важных стадий многих методов ИФА (твердофазные методы ИФА) является иммобилизация антител или антигенов на нерастворимые носители (твердая фаза). Иммобилизованные на твердой фазе вещества называют иммуносорбенты. В настоящее время в качестве твердой фазы используют пробирки и планшеты из непористых полимерных материалов – полистирола, поливинилхлорида и т.д. Иммобилизация может осуществляться либо за счет ковалентного связывания, либо за счет адсорбции вещества на поверхность носителя. Адсорбционная иммобилизация в настоящее время является основным способом, так как благодаря своей простоте этот способ позволяет автоматизировать проведение анализа. Однако возможная элюция части адсорбированного материала в процессе инкубации и отмывок является недостатком этого 24 метода. Процесс адсорбции на поверхность носителя осуществляется за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также благодаря водородным связям. Количество сорбированного вещества будет определяться площадью поверхности, временем контакта, концентрацией белка, рН, температурой и рядом других факторов. Ковалентное связывание белка с твердой фазой предусматривает предварительную обработку поверхности пробирок или планшет каким либо активатором. В качестве активирующих веществ используют водный раствор глутарового альдегида, толуол-2,4-диизоцианат и поли-L-лизин. Механизм активации как правило связан с прочной адсорбцией активатора (для поли-Lлизин адсорбция необратимая) и его последующим ковалентным связыванием с белковой молекулой. 4. МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА 4.1. Классификация методов ИФА Наиболее широкое распространение среди иммунохимических методов нашел метод иммуноферментного анализа. В настоящее время разработано несколько десятков вариантов проведения ИФА, имеющих как небольшие, так и принципиальные различия. Общим признаком всех этих методов является использование в качестве метки ферментов и возможность их детектирования в растворе с помощью соответствующих субстратных систем. При проведении любого варианта ИФА можно выделить три основные стадии: - первой стадией в любом варианте ИФА является узнавание анализируемого соединения специфичным к нему антителом; - на второй стадия происходит формирование связи меченого ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания; 25 МЕТОДЫ ИФА Тип II Определение оставшихся свободных центров специфического связывания Тип I Определение специфического иммунного комплекса анализируемого соединения Неконкурентные Гетерогенные Твердофазные Т в е р д о ф а з н ы е Неконкурентные Конкурентные Г е т е р о г е н н ы е Г е т е р о г е н н ы е Г о м о г е н н ы е Гетерогенногомогенные Т в е р д о ф а з н ы е Г о м о г е н н ы е Гетерогенногомогенные Различные схемы проведения анализа Рисунок 9. Классификация методов иммуноферментного анализа. - на третьем в результате реакции фермента с соответствующим субстратом происходит трансформация ферментной метки в 26 соответствующий сигнал, измеряемый различными физико-химическими методами. Существуют различные классификации методов ИФА. Наиболее часто встречающаяся в современной литературе классификации, предложенная Б.Б. Дзантиевым, А.П. Осиповым (рис 9). Основным критерием, положенным в основу этой классификации, является способ количественной оценки иммунных комплексов – продуктов реакции антиген-антитело. Для такой оценки существует два подхода: - определение концентрации образовавшихся комплексов антигенантитело (тип 1); - определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступивших в реакцию, компонентов несущих метку (либо антиген, либо антитело). При этом количество образовавшихся иммунных комплексов будет определяться по разнице: общее количество (добавленных) компонентов несущих метку – количество свободных (оставшихся) компонентов несущих метку (тип 2). а) 27 б) Рисунок 10. Калибровочный график зависимости уровня регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого вещества; а) для определения специфического иммунного комплекса анализируемого соединения; б) для определения оставшихся свободных центров специфического связывания Первый подход подразумевает расположение ферментной метки на образовавшихся иммунных комплексах. иммунных комплексов, образующихся В связи с этим количество в результате взаимодействия антитело-антиген, будет прямо пропорционально уровню регистрируемого сигнала, таким образом, высокий регистрирующий сигнал соответствует высокой концентрации определяемого иммунного комплекса. В этом случае калибровочный график, представляющий собой зависимость уровня регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого вещества, будет описываться возрастающей функцией (рис. 10 а). В случае определения оставшихся свободных центров связывания, несущих метку, калибровочная кривая будет описывать уменьшение регистрируемого сигнала. Максимальное значение оптической плотности при этом должно соответствовать нулевой концентрации компонента несущего метку, а при увеличении концентрации значение оптической плотности уменьшается (рис. 10 б). 28 Следующим важным критерием классификации является тип реагентов, используемых на первой стадии анализа. В соответствии с этим критерием методы ИФА делятся на: - неконкурентные – группа методов, в которой на первой стадии анализа в растворе присутствуют только анализируемый антиген и специфические антитела; - конкурентные – группа методов, в которой на первой стадии анализа в растворе одновременно присутствуют анализируемое соединение, его аналог, несущий ферментную метку, и центры специфического связывания. В этом случае анализируемое соединение и его аналог будут конкурировать между собой за взаимодействие с центрами специфического связывания. Необходимым условием проведения неконкурентных методов является соблюдение соотношений компонентов реакций: для методов типа 1 – концентрация специфических центров связывания должна быть значительно выше концентрации определяемого соединения; для методов типа 2 – концентрация определяемого соединения должна быть больше или сравнима с концентрацией специфических центров связывания. Необходимым условием проведения конкурентного метода анализа является недостаток центров специфического связывания по отношению к суммарной концентрации анализируемого соединения и его аналога. Следующим критерием классификации методов ИФА является тип проводимых на различных стадиях реакций. В соответствии с этим критерием методы делятся на: - гомогенные - если все реакции, проводимые в процессе анализа, проходят в растворе, т.е. в данном случае не происходит разделения исходных и образующихся компонентов реакции; - гетерогенные – если анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии анализа. 29 Обязательным разделение компонентом исходных (не гетерогенных прореагировавших) компонентов реакции. Разделение свободного методов и является образовавшихся и связанного реагента несущего метку может происходить с помощью твердой фазы или путем осаждения иммунных комплексов. В качестве твердой фазы обычно используется пластиковая поверхность. Гетерогенные методы могут быть разделены на твердофазные и гомогенно-гетерогенные в зависимости от характера проведения первой стадии. Твердофазные – если на первой стадии антиген или антитело иммобилизованы на твердой поверхности. Гомогенно-гетерогенные – если на первой стадии взаимодействие антигена и антитела происходит в растворе, и лишь затем образовавшийся иммунный комплекс иммобилизуется на твердой поверхности. Таким образом, большое количество вариантов проведения анализа позволяет исследователю выбирать методику соответствующую поставленным задачам. 4.3. Схемы проведения ИФА (варианты ELISA) Наибольшее распространение в настоящее время получил твердофазный гетерогенный иммунный анализ - ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Существует три базовых варианта проведения этого метода: 1. прямой (Direct ELISA) 2. непрямой (Indirect ELISA) 3. сендвич-метод (Sandwich ELISA) Direct ELISA – этот метод является наиболее простым вариантом проведения ИФА. Сущность проведения этого метода состоит в следующем: - на первом этапе растворенный в буфере анализируемый антиген вносится в пластиковую лунку (твердая фаза). В качестве буфера может быть использован карбонат/бикарбонатная буферная система рН(9,6) или 30 нейтральный фосфатный буфер (PBS). Необходимым условием является чистота буферных растворов, отсутствие в них других посторонних белков, поэтому все буферные растворы должны готовиться на деионизированной воде. Затем в течение определенного времени происходит инкубация антигена в лунках. Время и температура при этом не являются критическими параметрами, как правило, эти условия стандартизированы и указаны в стандартных протоколах определения. Стандартная температура инкубации 37°С. В процессе инкубации происходит иммобилизация антигена на твердую фазу. После инкубации проводят отмывку, чтобы удалить свободные (неиммобилизованные) отмывки используют молекулы антигена. Для процедуры нейтральный буферный раствор (например, фосфатный) (стадия 2); - после этого к иммобилизованному на пластиковой поверхности антигену добавляются антитела, конъюгированные с ферментом (стадия 3), которые специфичны данному антигены и напрямую связываются с ним. - после инкубации вновь проводят процедуру отмывки и вносят в лунки соответствующий ферменту субстрат. В результате происходит ферментативная реакция с появлением окрашенного соединения (5). Через определенное время после развития окраски ферментативную реакцию останавливают, добавляя ингибирующий реагент (6). - последним этапом является количественное определение оптической плотности окрашенного раствора с помощью спектрофотометрического оборудования. Indirect ELISA – второй базовый метод, используемый в различных вариантах ELISA. Порядок проведения этого метода представлен на рисунке . - начальные (1 и 2) этапы этого метода соответствуют стадиям direct ELISA, т.е. на этих стадиях происходит иммобилизация антигена на твердой фазе. 31 Рисунок 11. Схема прямого ELISA - на следующем этапе в лунки вводятся специфичные антитела, не связанные с ферментативной меткой. Антитела должны быть растворены в специальном буфере, который предотвращает неспецифическое связывание антител с компонентами твердой фазы. После инкубации и отмывки (удалении несвязавшихся антител) в лунке остаются только связавшиеся иммунные комплексы антиген-антитело (4). - на следующем этапе в лунки добавляют антивидовые антииммуноглобулиновые антитела связанные с ферментом. Эти антитела специфически связываются не с антигеном, а с антителами специфичными к 32 анализируемому антигену (6). Антивидовые антитела (часто называемые вторые антитела) получают против иммуноглобулинов тех видов животных, которых иммунизировали антигеном. Например, если специфические к анализируемому антигену антитела были получены иммунизацией мыши, то антивидовые антитела получат путем введения иммуноглобулинов мыши другому животному. Достоинством меченных антивидовых антител является Рисунок 12. Схема непрямого ELISA 33 их универсальность, что позволяет использовать одни и те же антивидовые антитела для анализа различных антигенов. - заключительные этапы этого метода соответствуют direct ELISA. Они также включают в себя стадии добавления субстрата, развития окраски и определение оптической плотности раствора. Sandwich ELISA – третий базовый вариант проведения ELISA. Свое название получил из-за того, что на стадии выявления иммунного комплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител. Этот метод используют для определения антигенов имеющих два и более неперекрывающихся антигенных эпитопа. Против каждого из эпитопов получают специфические антитела. Достоинством этого метода является то, что он не требует использования очищенных препаратов антигенов, что значительно снижает стоимость проведения анализов. Кроме того, использование сендвичметодики позволяет увеличить чувствительность. Схема проведения ELISA в свою очередь может проходить по двум вариантам: прямой сэндвич ELISA (direct sandwich ELISA) непрямой сэндвич ELISA (indirect sandwich ELISA) Прямой сэндвич ELISA Схема прямого сэндвич ELISA, представленная на рисунке, включает в себя: - пассивное прикрепление антител на твердую фазу (стадия 1 и 2). - затем эти антитела (прикрепленные антитела), специфичные к одному эпитопу антигена, связывают с антигеном (во избежание неспецифического связывания с твердой фазой антиген растворен в блокирующем буфере) (стадия 3). Важно чтобы в блокирующем буфере отсутствовали любые другие антигены, способные взаимодействовать с прикрепленными антителами. 34 - после инкубации и отмывки иммунные комплексы (прикрепленное антитело-антиген) остаются на твердой фазе. На следующем этапе для последующей детекции иммунных комплексов в лунки добавляют антитела конъюгированные с ферментом (эти антитела специфичные к другому эпитопу антигена). - на заключительном этапе добавляют хромогенный субстрат, и после остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора. Следует учитывать некоторые недостатки этого варианта. Основной лимитирующий фактор связан с использованием антител конъюгированных с ферментом. Так как эти антитела специфичны только для одного антигена, то для определения различных антигенов необходимо каждый раз создавать новые антитела конъюгированные с ферментом. Это значительно снижает универсальность и увеличивает стоимость метода. Непрямой сэндвич ELISA Схема проведения этого варианта метода ИФА представлена на рисунке - начальные стадии этого метода схожи с прямым сэндвич ELISA и заключаются в: иммобилизации на твердой фазе антител, специфичных к одному эпитопу антигена (стадии 1 и 2); связывании этих антител с антигеном (стадия 3); инкубации и отмывки; - на следующей стадии к иммунным комплексам добавляют антитела (специфичные к другому эпитопу антигена) не несущие ферментативной метки; - для детектирования иммунных комплексов, как и во всех непрямых методах ИФА в лунки вносят антивидовые антииммуноглобулиновые (вторые) антитела конъюгированные с ферментом. - на заключительном этапе добавляют хромогенный субстрат, и после остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора. 35 Рисунок 13. Схема прямого сэндвич ELISA Главным преимуществом этого метода является его универсальность, связанная с использованием вторых антител. Благодаря этому свойству вторых антител создано большое количество различных тест-систем, используемых для диагностики многих заболеваний. Кроме простых базовых методик при проведении иммуноферментных анализов часто используются более сложные варианты ELISA. Как правило, в сложных вариантах ELISA используются конкурентный или ингибиторный тип реакции. В современной иностранной литературе эти варианты соответственно имеют аббревиатуру С – тест (Competition) и I – тест 36 (Inhibition). Кроме того, выбор варианта метода зависит от того, что является определяемым компонентом антиген или антитело. Таким образом, сложные варианты ELISA могут быть следующими: - прямой конкурентный ELISA для определения антигена (Direct CELISA for Antigen) - прямой конкурентный ELISA для определения антитела (Direct CELISA for Antibody) - прямой ингибиторный ELISA для определения антигена (Direct IELISA for Antigen) - прямой ингибиторный ELISA для определения антитела (Direct IELISA for Antibody) - непрямой конкурентный ELISA для определения антигена (Indirect CELISA for Antigen) - непрямой конкурентный ELISA для определения антитела (Indirect CELISA for Antibody) - непрямой ингибиторный ELISA для определения антигена (Indirect IELISA for Antigen) - непрямой ингибиторный ELISA для определения антитела (Indirect IELISA for Antibody) - прямой конкурентный Sandwich ELISA для определения антигена (Direct Sandwich C-ELISA for Antigen) - прямой конкурентный Sandwich ELISA для определения антитела (Direct Sandwich C-ELISA for Antibody) - прямой ингибиторный Sandwich ELISA для определения антигена (Direct Sandwich I-ELISA for Antigen) - прямой ингибиторный Sandwich ELISA для определения антитела (Direct Sandwich I-ELISA for Antibody) - непрямой конкурентный Sandwich ELISA для определения антигена (Indirect Sandwich C-ELISA for Antigen) 37 - непрямой конкурентный Sandwich ELISA для определения антитела (Indirect Sandwich C-ELISA for Antibody) Рисунок 14. Схема непрямого сэндвич ELISA - непрямой ингибиторный Sandwich ELISA для определения антигена (Indirect Sandwich I-ELISA for Antigen) - непрямой ингибиторный Sandwich ELISA для определения антитела (Indirect Sandwich I-ELISA for Antibody) Однако на практике не все эти варианты находят применение. Особенностью всех сложных вариантов ELISA является предварительное титрование определяемых иммунных комплексов. Эта 38 процедура необходима для определения оптимальных рабочих концентраций всех компонентов реакции. 4.4. Титрование Большинство вариантов проведения ELISA требуют предварительного подбора оптимальных концентраций всех компонентов реакции. Для этой цели используют метод титрования. Титр – эффективная величина, характеризующая связывающую способность антител, зависящая от их концентрации и аффинности. Титр является относительной величиной зависящей от вида метода, условий его проведения ( время, температура, рН и т.д.) и концентрации антигена. Количество определяемых компонентов будет зависеть от вида метода (табл. ) Титрование, как и определение обычно проводят в 96-ти луночных планшетах. Все растворы вносят в лунки используя многоканальные пипетки (8-ми и 12-ти канальные соответственно количеству лунок в горизонтальных и вертикальных рядах).Сущность этого процесса состоит в постепенном разведении двух компонентов реакции до тех пор, пока есть возможность определить эффект (как правило, оптическую плотность) взаимодействия этих компонентов соответствующим методом. Если в методе используется более двух компонентов, то процесс титрования ведут постепенно. На рисунке представлена схема наиболее простого варианта титрования для прямого метода ELISA. - Первый этап этого процесса заключается в постепенном разведении антигена. Для этого во все лунки микропланшеты вносят буферный раствор ( 50-100 мкл). Затем в лунки 1-ого ряда вносят раствор антигена и перемешивают при помощи многоканальной пипетки, аккуратно отбирая и возвращая содержимое в лунку (прием называемый пипетирование). После этого из лунок первого ряда при помощи многоканальной пипетки отбирают часть раствора антигена и переносят его в лунки 2-ого ряда и пипетируют 39 (уровень разведения будет зависеть от объема раствора антигена взятого из лунок 1-ого ряда) (рис. 15). Рисунок 15. Титрование. Разведение антигена Далее из лунок 2-ого ряда отбирают такой же, как и в первом случае, объем раствора и перенося в лунки 3-его ряда и т.д. до 11-ого ряда. В лунки 12-ого ряда антиген не вносят, их используют в качестве контрольных лунок, которые будут содержать только антитела и субстрат. Во всех лунках объем раствора должен быть одинаковым, поэтому из лунок 11-ого ряда удаляют соответствующий объем. Планшету инкубируют для иммобилизации антигена (стандартные условия инкубации 2 часа при 37°С) и отмывают фосфатным буфером. 40 Рисунок 16. Титрование. Разведение антител - Вторая стадия включает схожую процедуру разведения антител, конъюгированных с ферментной меткой. В этом случае разведение проводят в рядах с буквенными обозначениями от А до G, а лунки ряда Н будут являться контролем, содержащем только антиген и субстрат. Антитела разводят в блокирующем буфере (содержащим инертный белок и детергент для предотвращения неспецифического связывания антител). После раскапывания всех лунок планшету термостатируемом шейкере от 1 до 2 часов при инкубируют в 37°С. Затем лунки промывают и добавляют субстрат инкубируют и определяют оптическую плтность. В таблице представлены примерные результаты титрования и анализ полученных данных. Оптимальная концентрация антител наблюдается в рядах D и E. При этих концентрациях антител в зависимости от концентрации антигена изменение оптической плотности имеет линейный характер от нулевого до максимальных значений. Таблица 2. Результат титрования -определение оптимальных концентраций по полученным значениям оптической плотности 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 2,1 2,2 2,1 2 2,1 2,1 1,9 1,7 1,5 1,3 1 0,6 B 2,1 2 1,9 2 1,9 1,8 1,7 1,5 1,3 0,9 0,5 0,3 C 2,1 2 1,9 1,9 1,8 1,7 1,7 1,5 1,2 0,9 0,5 0,3 D 1,8 1,81 1,71 1,8 1,5 1,2 1 0,71 0,51 0,31 0,2 0,1 E 1,8 1,8 1,7 1,5 1,3 1,1 0,9 0,7 0,5 0,3 0,2 0,1 F 1,5 1,5 1,4 1,3 1,1 0,9 0,7 0,5 0,3 0,2 0,1 0,1 G 0,7 0,7 0,7 0,6 0,6 0,5 0,3 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 H 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 41 Контроль полученных знаний I. Укажите один правильный ответ 1. За что ответственен Fab-фрагмент молекулы антитела? А. Уничтожение антигена Б. Специфическое распознавание антигена В. Связывание с компонентами системы комплимента Г. Взаимодействие с мембранными рецепторами Д. Активацию макрофагов 2. Из чего получают моноклональные антитела? А. Любых иммунных клеток Б. Инфицированного животного В. Гибридом Г. Иммунизированного животного Д. Комплексов антиген-антитело 3. Для чего используют ферменты в биохимическом анализе? А. Увеличения скорости взаимодействия антигена с антителом Б. Увеличение активности антигена. В. Увеличения предела обнаружения определяемого вещества. Г. Уменьшение активности антигена. Д. Снижения предела обнаружения определяемого вещества. 4. Что одновременно присутствует на первой стадии анализа в растворе при Конкурентных методах ИФА ? А. Анализируемое соединение, его аналог, несущий ферментную метку, и центры специфического связывания Б. Анализируемое соединение, его аналог В. Анализируемое соединение, антиген несущий ферментную метку, и центры специфического связывания 42 Г. Анализируемый антиген и специфические антитела Д. Анализируемый антиген и неизвестный антиген 5. Чем является метод ELISA? А. Твердофазным гомогенным методом Б. Методом осаждения иммунных комплексов В. Твердофазным гетерогенным методом Г. Гомогенным методом Д. Гомогенным методом 6. Что является отличительным признаком непрямого метода от прямого? А. Использование антигенов имеющих два и более неперекрывающихся антигенных эпитопа Б. Использование антител с радиоактивной меткой В. Использование антител конъюгированных с пероксидазой С. Использование двух видов антител специфичных к одному антигену Д. Использование антивидовых антител 7. Какой прибор необходим для проведения ИФА? А. Центрифуга Б. Хроматограф В. Проточный цитометр Г. Биохимический анализатор Д. Планшетный фотометр или спектрофотометр 8. Что является заключительным этапом ИФА? А. Определение оптической плотности Б. Сорбция антигена 43 В. Раститровка антител Г. Блокировка Д. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта II. Соотнесите критерии с классификацией А. Тип реагентов, используемых на первой стадии анализа Б. Способ количественной оценки иммунных комплексов – продуктов реакции антиген-антитело В. Тип проводимых на различных стадиях реакций 1. Гомогенные или Гетерогенные 2. Определение специфического иммунного комплекса анализируемого соединения или определение оставшихся свободных центров специфического связывания 3. неконкурентные или конкурентные Ответы: I. 1–Б 2–В 3–Д 4–А 5–В 6–Д 7–Д 8–А II. А–3 Б–2 В–1 44 Список литературы: 1. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. – М.: Мир; 2000; 592с. 2. John R. Crowther The ELISA Guidebook. The International Atomic Energy Agency, Vienna, Austria, Humana press 2000, p.416 3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. — М.: Мир, 2000. - 469 с. 4. Margulies DH Monoclonal antibodies: producing magic bullets by somatic cell hybridization. J Immunol. 2005 Mar 1;174(5):2451-2. Рекомендуемая литература: 1. Иммунологические методы. /Под ред. Г. Фримеля , пер. с нем. А.П.Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с. 2. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. – М.: Высш. шк., 1991. – 288 с 45 Рабочая тетрадь и руководство к методическому пособию Цели изучения После изучения данного методического пособия, обучающийся: 1. Получит представление о функциях, структуре и свойствах антител, а также о закономерностях реакции антиген-антитело. См. стр. 3-11 и рис. 1-2 методического пособия. Антитела появляются в сыворотке иммунизированного человека или животного в результате специфической реакции организма на введение в него антигенов. В организме антитела выполняют две основные функции: - распознавание и специфическое связывание антигена; - индукция важнейших физиологических процессов, направленных на уничтожение антигена. Антитела или иммуноглобулины в химическом отношении являются гликопротеидами, состоящими из аминокислот и олигосахаридов. Иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgA, IgD, IgG, IgМ, IgE. Молекула иммуноглобулина состоит из двух одинаковых тяжелых (Н-цепь) и двух одинаковых легких (L-цепь) полипептидных цепей. При действии на молекулу IgG протеолитического фермента папаина образуется три фрагмента. Два идентичных фрагмента, за способность связывать антиген получивших название Fab-фрагмент (от английского fragment antigen binding), и третий, за способность к кристаллизации названный Fc-фрагмент (от английского fragment cristalline). Fab-фрагмент молекулы антитела ответственен за специфическое распознавание антигена, Fc-фрагмент ответственен за биологические 46 функции антител – связывание с компонентами системы комплимента, взаимодействие с мембранными рецепторами и т.д. Структурной особенностью, как легких, так и тяжелых цепей является наличие в их составе различных областей (доменов) – вариабельной (V) и константной (С). Специфичность антител определяется изменениями в последовательности аминокислотных остатков VH-домена и VL-домена цепей иммуноглобулина, взаимодействие между которыми формирует антигенсвязывающие участки этой молекулы. Антитела распознают не отдельные химические группы, а пространственную форму антигенов. В каждой молекуле иммуноглобулина существует, по крайней мере, два идентичных антигенсвязывающих центра. Наличие шарнирной области в тяжелой цепи обеспечивает иммуноглобулина, позволяя конформационную обоим гибкость молекулы антигенсвязывающим центрам, действовать независимо друг от друга при взаимодействии с антигенными детерминантами. Все реакции антиген-антитело обратимы. И мера прочности связи определяется аффинностью антитела (величиной связи одного антигенсвязывающего центра с индивидуальным эпитопом антигена) и его авидностью (суммарной силой взаимодействия антитела с антигеном в случае взаимодействия поливалентного антитела с поливалентным антигеном). Взаимодействие антиген - антитело обратимо и скорость диссоциации комплекса (т.е. прочность взаимодействия антиген-антитело) зависит от константы ассоциации, называемой аффинностью (или сродством). Величина константы K определяется разностью свободной энергии (∆G) между состоянием антигена и антитела, когда они не взаимодействуют между собой, и тем состоянием, когда они образуют комплекс: ∆G = -RTlnK, 47 где R - универсальная газовая постоянная, а T - абсолютная температура. Константа ассоциации имеет большое значение для определения эффективности протекания реакции антиген – антитело. С помощью этого показателя можно оценить специфичность антитела по отношению к различным антигенам. 2. Изучит основные способы получения антител. См. стр. 12-17 и рис. 3-4 методического пособия. В организме антитела образуются в ответ на взаимодействие антигенов с В-лимфоцитами. Сенсибилизированные антигеном В-лимфоциты, проходят несколько стадий пролиферации и формируют большой клон плазматических клеток, которые будут синтезировать антитела, причем только той специфичности, на которую был запрограммирован лимфоцитпредшественник. Используемые в иммунологических методах антитела могут быть поликлональные или моноклональные. Процесс получения поликлональных антител можно разделить на несколько этапов. На первом этапе проводится иммунизация животного. При проведении иммунизации необходимо учитывать ряд особенностей, чтобы получить высококачественные антитела. Большое значение имеет иммуногенность антигена – способность антигена вызывать в организме иммунизированного животного образование антител. Иммуногенность антигена зависит от различных факторов: - от молекулярной массы антигена. - от времени пребывания антигена в организме. - от уровня “чужеродности” антигена. Качество получаемых антител зависит от гомогенности (чистоты) вводимого антигена. Еще один фактор, который необходимо учитывать при проведении иммунизации – это количество вводимого антигена. 48 Исходя из того, что образование антител является компонентом гуморального иммунитета, необходимо учитывать способ и периодичность введения антигена. Наибольшей эффективности удается добиться при проведении нескольких циклов иммунизации введением небольших порций антигена в различные точки. Основные места введения антигена: - внутрикожное введение – этот способ позволяет получать высокий иммунный ответ уже после первого введения антигена. - подкожное введение – вводят несколько доз антигена вдоль позвоночника животного. - внутримышечное введение – вводят антиген небольшими порциями в мышцы задних лап. - внутрибрюшинное введение - введение в лимфатические узлы - внутривенное введение – этот способ часто используют при проведении повторных инъекций с отбором крови. Часто введение антигена проводят в комплексе с адъювантом. Адъюванты – вещества способные вызывать неспецифическое усиление иммунного ответа (примеры таких веществ: липосомы, полимеры, клеточные мембраны бактерий и др.). После достижения максимальной концентрации антител у иммунизированного животного отбирают некоторое количество крови. Из отобранной крови удаляют форменные элементы, фибриноген, полученную сыворотку прогревают при 56°С для инактивации системы комплемента. После этого иммунная сыворотка готова к применению. В 1975 году была описана методика, позволяющая получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител (моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью. Для получения моноклональных антител изолируют В-лимфоциты из селезенки иммунизированной мыши и производят их слияние с 49 опухолевыми клетками мыши (клетками миеломы). При слиянии с опухолевой клеткой возникают гибридные клетки, так называемые гибридомы, которые являются потенциально бессмертными. После тестирования клонов на способность образовывать антитела отбираются положительные культуры, которые снова клонируются и подвергаются последующей селекции. В результате получают гибридому, продуцирующую моноклональные антитела. Производство моноклональных антител этими клетками осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости мыши . Одним из главных достоинств моноклональных антител является возможность их получения в неограниченном количестве при неизменных от партии к партии характеристиках. Благодаря этой особенности появилась возможность создания стандартных диагностических наборов реагентов для определения различных веществ. 3. Получит представление об использовании ферментов в методах иммуноферментного анализа. См. стр. 17-24 и рис. 5-8 методического пособия. Важной составляющей метода метода иммуноферментного анализа является фермент конъюгированный с антителом или антигеном. Ферменты являются биокатализаторами, т.е. веществами биологического происхождения, ускоряющими химические реакции. Ферменты способны повышать скорость катализируемой реакции в 1012 раз и более. Ферменты играют важную роль в биохимическом анализе. В биологических материалах, например в жидкостях организма, с помощью определения каталитической активности можно обнаружить ферменты в ничтожно малых концентрациях. К ферментам, используемым в иммуноферментном анализе, предъявляется ряд требований: 50 - высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментную метку при низких концентрациях; - доступность ферментов; возможность получения высокочистых ферментных препаратов, сохраняющих свою активность после модификации при получении конъюгата с антителами или антигенами; - стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом; - простота и чувствительность метода определения концентрации фермента. Существует достаточно большое количество ферментов удовлетворяющих эти требования и используемых в иммуноанализе. Однако, наибольшее распространение среди них нашли пероксидаза хрена, β-Dгалактозидаза, уреаза и алкалиновая фосфатаза. Характерной особенностью для всех этих ферментов является низкий предел обнаружения на уровне пикомолярных концентраций. Методы определения ферментативной активности К основным методам определения ферментативной активности, получившие наибольшее распространение при проведении иммуноферментного анализа, относятся: - фотометрический метод - для регистрации ферментной активности используют субстраты продукты превращения, которых являются окрашенными соединениями, или окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции. - флуорометрический метод - для регистрации ферментной активности используют субстраты продукты превращения, которых, способны к флуоресценции. Чувствительность флуоресцентных методов детекции на 1-2 порядка выше фотометрических методов. Способы получения конъюгатов 51 Высокая чувствительность методов ИФА основана на использовании ферментной метки конъюгированной с антителами. Методы получения конъюгатов в зависимости от типа сшивающего реагента можно разделить на две группы: - гомобифункциональные - гетеробифункциональные При получении конъюгатов с помощью гомобифункциональных реагентов часто используют глутаровый альдегид. Этот сшивающий реагент взаимодействует с аминогруппами лизиновых остатков антител и ферментов В гетеробифункциональном методе получения конъюгатов в качестве сшивающего реагента используют различные соединения, основным компонентом которых является малеимид. Гетеробифункциональный метод имеет высокий выход конъюгата. Кроме вышеперечисленных методов широкое распространение для получения конъюгатов с пероксидахзой хрена имеет перйодатный метод (метод Накане (1974)). Его сущность состоит в модификации фермента с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с NH2 группами антител. 4. Ознакомится с классификацией методов иммуноферментного анализа. См. стр. 25-30 и рис. 9-10 методического пособия. В настоящее время разработано несколько десятков вариантов проведения ИФА. использование, в Общим признаком качестве метки, всех этих ферментов и методов является возможность их детектирования в растворе с помощью соответствующих субстратных систем. При проведении любого варианта ИФА можно выделить три основные стадии: - первой стадией является узнавание анализируемого соединения специфичным к нему антителом; 52 на второй стадия происходит формирование связи меченого - ферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрами связывания; - на третьем в результате реакции фермента с соответствующим субстратом происходит трансформация ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый различными физико-химическими методами. Наиболее часто встречающаяся в современной литературе классификация, предложенная Б.Б. Дзантиевым, А.П. Осиповым. Основным критерием, положенным в основу этой классификации, является способ количественной оценки иммунных комплексов – продуктов реакции антиген-антитело. Для такой оценки существует два подхода: - определение концентрации образовавшихся комплексов антигенантитело (тип 1); - определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступивших в реакцию, компонентов несущих метку (либо антиген, либо антитело). Другим важным критерием классификации является тип реагентов, используемых на первой стадии анализа. В соответствии с этим критерием методы ИФА делятся на: - неконкурентные – группа методов, в которой на первой стадии анализа в растворе присутствуют только анализируемый антиген и специфические антитела; - конкурентные – группа методов, в которой на первой стадии анализа в растворе одновременно присутствуют анализируемое соединение, его аналог, несущий ферментную метку, и центры специфического связывания. В этом случае анализируемое соединение и его аналог будут конкурировать между собой за взаимодействие с центрами специфического связывания. 53 Еще одним критерием классификации методов ИФА является тип проводимых на различных стадиях реакций. В соответствии с этим критерием методы делятся на: - гомогенные - если все реакции, проводимые в процессе анализа, проходят в растворе, т.е. в данном случае не происходит разделения исходных и образующихся компонентов реакции; - гетерогенные – если анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии анализа. Таким образом, большое количество вариантов проведения анализа позволяет исследователю выбирать методику соответствующую поставленным задачам. 5. Ознакомится с основными схемами проведения иммуноферментного анализа. См. стр. 30-41 и рис. 11-16 методического пособия. Наибольшее распространение в настоящее время получил твердофазный гетерогенный иммунный анализ - ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Существует три базовых варианта проведения этого метода: Direct ELISA – этот метод является наиболее простым вариантом проведения ИФА. Сущность проведения этого метода состоит в следующем: - на первом этапе растворенный в буфере анализируемый антиген вносится в пластиковую лунку (твердая фаза). Затем в течение определенного времени происходит инкубация антигена в лунках. В процессе инкубации происходит иммобилизация антигена на твердую фазу. После инкубации проводят отмывку, чтобы удалить свободные (неиммобилизованные) молекулы антигена. - после этого к иммобилизованному на пластиковой поверхности антигену добавляются антитела, конъюгированные с ферментом. 54 - после инкубации вносят в лунки соответствующий ферменту субстрат. В результате происходит ферментативная реакция с появлением окрашенного соединения. - последним этапом является количественное определение оптической плотности окрашенного раствора с помощью спектрофотометрического оборудования. Indirect ELISA – второй базовый метод, используемый в различных вариантах ELISA. - начальные (1 и 2) этапы этого метода соответствуют стадиям direct ELISA, т.е. на этих стадиях происходит иммобилизация антигена на твердой фазе. - на следующем этапе в лунки вводятся специфичные антитела, не связанные с ферментативной меткой. После инкубации и отмывки (удалении несвязавшихся антител) в лунке остаются только связавшиеся иммунные комплексы антиген-антитело. - на следующем этапе в лунки добавляют антивидовые антииммуноглобулиновые антитела связанные с ферментом. Эти антитела специфически связываются не с антигеном, а с антителами специфичными к анализируемому антигену. Антивидовые антитела (часто называемые вторые антитела). - заключительные этапы этого метода соответствуют direct ELISA. Они также включают в себя стадии добавления субстрата, развития окраски и определение оптической плотности раствора. Sandwich ELISA – третий базовый вариант проведения ELISA. Свое название получил из-за того, что на стадии выявления иммунного комплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител. Достоинством этого метода является то, что он не требует использования очищенных препаратов антигенов, что значительно снижает 55 стоимость проведения анализов. Кроме того, использование сендвичметодики позволяет увеличить чувствительность. Схема проведения ELISA в свою очередь может проходить по двум вариантам: прямой сэндвич ELISA (direct sandwich ELISA) непрямой сэндвич ELISA (indirect sandwich ELISA) Прямой сэндвич ELISA - пассивное прикрепление антител на твердую фазу (стадия 1 и 2). - затем эти антитела (прикрепленные антитела), специфичные к одному эпитопу антигена, связывают с антигеном. - после инкубации и отмывки иммунные комплексы остаются на твердой фазе. На следующем этапе для последующей детекции иммунных комплексов в лунки добавляют антитела конъюгированные с ферментом (эти антитела специфичные к другому эпитопу антигена). - на заключительном этапе добавляют хромогенный субстрат, и после остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора. Непрямой сэндвич ELISA - начальные стадии этого метода схожи с прямым сэндвич ELISA - на следующей стадии к иммунным комплексам добавляют антитела не несущие ферментативной метки; - для детектирования иммунных комплексов, как и во всех непрямых методах ИФА в лунки вносят антивидовые антииммуноглобулиновые (вторые) антитела конъюгированные с ферментом. - на заключительном этапе добавляют хромогенный субстрат, и после остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора. Кроме простых базовых методик при проведении иммуноферментных анализов часто используются более сложные варианты ELISA. Как правило, в сложных вариантах ELISA используются конкурентный или ингибиторный тип реакции. Кроме того, выбор варианта 56 метода зависит от того, что является определяемым компонентом антиген или антитело. Особенностью всех сложных вариантов ELISA является предварительное титрование определяемых иммунных комплексов. Эта процедура необходима для определения оптимальных рабочих концентраций всех компонентов реакции. 57