Министерство здравоохранения Республики Казахстан КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
advertisement
Министерство здравоохранения Республики Казахстан КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени С.Д. АСФЕНДИЯРОВА (КазНМУ) МРНТИ 76.29.55 УДК [616.72-002+616.71-007.234]-078:577.23|24(574) № гос.регистрации 0114РК00037 Инв. № «УТВЕРЖДАЮ» Ректор КазНМУ им. С.Д.Асфендиярова д.м.н., профессор __________ А.А. Аканов «___»___________20__г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ по теме: СРАВНИТЕЛЬНОЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕГРАДАЦИИ СУСТАВА В ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛОВЕКА (заключительный) Руководитель темы, к.м.н., доцент _________________ Алматы, 2015г. Г.Х. Габдулина СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ Руководитель темы: Ведущий научный сотрудник, к.м.н., доцент ________________ Старший научный сотрудник, к. м. н. ________________ М.Г. Оразгалиева (раздел 1-2, заключение) Старший научный сотрудник ________________ А.М. Нусупбекова (раздел 1-2) Научный сотрудник ________________ Г.Ш. Тримова (раздел 1-2) Научный сотрудник ________________ Г.С. Есиркепова (раздел 1-2) Научный сотрудник ________________ А.С. Аманжолова (раздел 1,2) Лаборант ________________ С.К. Салимбекова (раздел 1,2) Нормоконтролер, Начальник отдела менеджмента и инноваций НИР ________________ А.Г. Шамсутдинова 2 Г.Х. Габдулина (реферат, введение, раздел 1-2, заключение) РЕФЕРАТ Отчет состоит из 23 страниц, 6 рисунков, 7 таблиц, 46 источников. Ключевые слова: молекулярно-генетическое исследование, ревматоидный артрит, полиморфизм гена DKK, деградация сустава. Объектом исследования: 205 пациентов с ревматоидным артритом, которым проведено полное клиническое, биохимическое и рентгенологическое обследование. Средний возраст больных составил 50,11 лет (25-63 года). Среди обследованных 84,9% были женщины, 15,02% – мужчины. У 67,4% обнаружен ревматоидный фактор, у 49,11% АЦЦП. 98% пациентов были лица казахской национальности. Цель работы статистическое обоснование и сбор желательного объема выборки для сравнительного молекулярно-генетического исследования деградации сустава в популяции человека. Актуальность проблемы. Поражение суставов, часто приводящее к их деформации у пациентов с ревматоидным артритом (РА), является одной из самых распространенных причин нетрудоспособности, вызывающей ухудшение качества жизни и значительные финансовые затраты, во всех возрастных группах по всему миру. Хотя причастность наследственных факторов в развитии этой патологии ясно установлена в многочисленных предыдущих исследованиях, основные молекулярно-генетические механизмы остаются непонятными, особенно в свете многих общих патологических изменений. Эти изменения включают патологическую модификацию в субхондральной кости, воспалительные процессы в синовиальной ткани, деградацию хряща или разрушение межпозвоночных дисков. Изучение и идентификация генетических и метаболических факторов риска, которые способствуют или препятствуют развитию патологических процессов в кости, обеспечат понимание различной степени выраженности дегенеративных изменений. Исследования в этой области расширит наше понимание этиологии болезни и приведет к разработке стратегических подходов профилактики и лечения ревматоидного артрита. Методы: ревматологическое, рентгенологическое, остеоденситометрическое обследование, молекулярно-генетические методы, статистический анализ. Результаты исследований. В результате данного исследования произведена отладка методик выделения ДНК, произведен дизайн праймеров и taqman зондов для реал-тайм ПЦР, подобраны условия реал-тайм ПЦР. Полученные данные являются предварительными и являются заделом для дальнейшего более подробного полиморфизмов гена DDK1 с развитием ревматоидного артрита. 3 исследования взаимосвязи ТҰЖЫРЫМ Кілтті сөздер: ревматоидты артрит, ген полиморфизмі, DKK гені. Зеттеу объектісі: Толық клиникалық, биохимиялық және рентгенологиялық зерттеулер жасалған ревматоидты артритпен ауыратын205 пациент. Науқастардың орташа жасы 50,11 жас (25-63 жылдар) құрайды. Зерттеушілер арасында 84,9%ы әйелдер, 15,02% –ы ерлер. 67,4%ында ревматоидты фактор, ал 49,11% -ында АЦЦП анықталған. Пациенттердің 98%ы ұлты қазақтар болған. Жұмыстың мақсатыадамдар молекулярлы-генетикалық салыстыру арасында мақсатында буындар қалаған деградациясын мөлшерде анықтау, жинау және статистикалық негіздеу. Мәселенің өзектілігі. Буындардың зақымдалуы, олардың деформациясы бүкіл әлемдер адамдар арсында ревматоидты артритпен(РА) ауыратын науқастардың жұмысқа жарамсыздығының негізгі себебі, өмір сапасының төмендеуі және финанстық шығындалуға алып келеді. Алдыңғы көптеген зерттеулердің нәтижесінде бұл патологияның даму факторына тұқымқуалаушылық пен негізгі молекулярлы-генетикалық механизмдер белгісіз болып қала бермек, әсіресе көптеген жалпы патологиялық өзгерістер кезінде. Бұл өзгерістерге субхондралды сүйектің патологиялық модификациясы, синовиалдық тіндегі қабынулық өзгерістер, сіңірлер деградациясы немесе омыртқа аралық дисктердің бұзылысы жатады.Сүйектердегі патологиялық үрдістердің дамуына немесе өршуіне алып келетін метаболикалық факторлар қауіпі және генетикалық идентификация әртүрлі дәрежедегі дегенеративті өзгерістердің үдеуіне алып келеді. Бұл зерттеулер аурудың этологиясын анықтауға, профилактикалық шаралар жүргізуге және ревматоидты артриттің емдеу жолдарын анықтауға бағытталған. Әдістері: ревматологиялық,рентгенологиялық, остеоденситометриялық зерттеу лер, молекулярлы-генетикалық әдіс,статистикалық анализ. Зерттеулер нәтижелері. Зерттеу нәтижелері. Бұл зерттеу нәтижесінде ДНҚ бөліп алу әдістері, реал-тайм ПТРға праймер мен taqman дизайны жасалып, реал-тайм ПТР жасалу жағдайы қарастырылып бекітілді. Алынған мәліметтер DDK1 ген полиморфизмінің ревматоидты артритпен байланысын тереңдетіліп зерттеуге мүмкіндік береді. 4 СОДЕРЖАНИЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ………………………………………………… ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………… 6 7 1 НАБОР КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА DKK…………………………………………….......................................... 15 1.1 Материалы и методы исследований …………………………………………… 15 1.2 Результаты исследований........................................................................................ 18 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………….............................................................. 20 . СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ…………………………….......... 5 21 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ РНК рибонуклеиновая кислота ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота ПЦР полимеразная цепная реакция РА ревматоидный артрит OП остеопороз ИЛ-1 интерлейкин-1 бета ИЛ-6 интерлейкин-6 США соединенные штаты америки ОПГ остеопротегерин CKIα казеин-киназы Iα VEGF фактор роста эндотелия сосудов СРБ С-реактивный белок MSC мезенхимальные стволовые клетки NF-kB нуклеарныйфактор каппа β IgG иммуноглобулин G 6 ВВЕДЕНИЕ Ревматоидный артрит (РА) является наиболее распространенным хроническим аутоиммунным заболеванием, приводящим к тяжелому поражению суставов [1] и часто сопровождающимся остеопорозом (OП) [2,3]. РА чаще встречается у женщин, чем у мужчин, и им болеют лица возрасте после 40 лет [4]. РА встречается у ~ 1% взрослого населения в развитых странах мира [5] и приводит к гибели ~ 49, 000 больных в мире ежегодно [6]. Наряду с этим, в связи с расходами на госпитализацию и потерями в рабочей силе, РА ложится тяжелым бременем на национальную экономику. Так, например, в США РА приносит ущерб, оцениваемый в ~ $ 128 млрд [7]. Поэтому, обнаружение основных факторов риска заболевания, его эффективная профилактика и успешное лечение представляет собой одну из наиболее важных проблем в современной медицине. Основными в определении предрасположенности к РА и ОП являются генетические факторы со степенью наследуемости >0,50 [8,9]. При этом сцепленность с главным комплексом гистосовместимости (MHC) составляет примерно 3% дисперсии РА у европейцев [10]. Исследования ассоциации генома (GWAS) выявили ~ 40 не- MHC локусов, которые связаны с РА [11-14], которые объясняют <18% дисперсии в восприимчивости к РА [15,16]. Большинство этих результатов, однако, были получены в исследованиях лиц европейского происхождения. Поскольку существуют различия в генетических ассоциациях между азиатами и европейцами как в HLA-DRB1, так и не MHC регионах [17,18], важно исследовать не MHC варианты восприимчивости РА в казахской популяции в целях дальнейшего расширения понимания генетического вклада в патогенез РА и ОП, и более подробного изучения трансдемографических различий. Чрезвычайно важную роль в ремоделировании костной ткани играют система RANK/RANKL/OPG, сигнальный путь Wnt и система костных морфогенетических белков. Кроме того, исследования патогенеза ОА показали, что Wnt-b-катениновый сигнал [19,20,21,22] и другие сигнальные молекулы могут играть важную роль в развитии ОА посредством воздействия на процессы эндохондрального окостенения, включая влияние на мутации определенных генов и апоптозхондроцитов. Также в некоторых исследованиях показано, что моделирование продукции костных морфогенетических белков является важным фактором не только в ремоделировании костной ткани, но и в индукции остеоартроза, связанного с травматическим повреждением хряща [19, 23]. 7 Сигнальный путь Wnt является одним из внутриклеточных регуляторных путей. Молекулы Wnt относятся к семейству гликопротеинов, это целый класс белков, регулирующих такие типы клеточной активности как гибель клетки, пролиферация, миграция, полярность и экспрессия генов. Wnt регуляция может быть «каноническая» или «неканоническая» (рисунок 1)[24]. Рассмотрим канонический путь Wnt регуляции. В отсутствие белков Wnt, молекулы гликоген-синтазы-киназы-β (GSK3β), Axin, adenomatouspolyposiscoli(APC) и казеин-киназы Iα (CKIα) образуют комплекс деструкции βкатенина [25]. Фермент CKIα фосфорилирует β-катенин в положении Ser45, а затем GSK3β фосфорилирует β-катенин в положении Ser33/Ser37/Thr41. Рисунок 1 - «Канонический» и «неканонический» путь Wnt регуляции [24]. Фосфорилированный β-катенин узнается белком β-transducinrepeat, убиквитинируется и деградируется протеасомами. С другой стороны, при активации канонического пути Wnt сигнализации Wnt белок связывается с одним из 10 членов frizzled (FZD) семейства рецепторов; комплекс Wnt-FZD затем связывается с липопротеином низкой плотности – lipoprotein-relatedprotein-5 (LRP5) или LRP6. Полученный комплекс активирует Dishevelled (Dvl) белок, который не дает Axin присоединиться к комплексу деструкции и противодействует способности GSK3β фосфорилироватьβ-катенин, тем самым предотвращая образования комплекса деструкции. Не деградируя, β-катенин стабилизируется и транслоцируется в ядро, где связывается с фактором транскрипции TCF4 и повышает экспрессию гена-мишени, в том числе циклина D1, c-myc, c-jun, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), а также некоторых других, связанных с повышенным ростом клеток. 8 Канонический Wnt путь содействует кавеолин-зависимой интернализации LRP и способствует взаимодействию с белком Axin [26]. Напротив, в случае, когда белок DKK1 конкурентно связывается с LRP5/6 и привлекает белок-рецептор Kremen, это взаимодействие способствует клатрин-опосредованной интернализации, что приводит к инактивации LRP, а GSK3β, Axin, APC, и CKIα формируют комплекс деструкции β-катенина, препятствуя, таким образом, Wnt-сигнализации [27, 28]. Кроме DKK1, существует целый ряд белков антагонистов, которым противостоят агонисты, усиливая или ингибируя активность канонического Wnt пути. Семейство белков DKK по современным сведениям состоит из 4 представителей, а именно DKK1, DKK2; DKK3 и DKK4. Наиболее хорошо изученный белок, Dkk-1 – это секретируемый протеин с молекулярной массой 28 кДа, растворимый ингибитор сигнального пути Wnt. Установлена важная роль Wnt-сигналинга в подавлении дифференцировки мезенхимальных клеток-предшественников в адипоциты и хондроциты (клетки хряща) и в усилении образования остеобластов. Dkk-1 участвует в регуляции костного метаболизма, т.к. останавливает дифференцировку и пролиферацию остеобластов (рисунок 2), таким образом, DKK1 регулирует развитие костей, увеличение и поддержание костной массы. Ген DKK1 (на первом рисунке изображена структура гена DKK1) кодирует белок, который является членом семейства Dickkopf белков. Продукт данного гена представляет собой секретируемый белок с двумя цистеин богатыми участками и участвует в эмбриональном развитии через ингибирование WNT сигнального пути. Повышенные уровни DKK1 в костном мозге, плазме и периферической крови связаны с наличием остеолитических поражений костей у пациентов с множественной миеломой. Рисунок 2 – структура гена DKK1 (ссылка http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/348) 9 Продукт гена DKK1 играет одну из ключевых ролей в процессах, связанных с развитием и поддержанием гомеостаза костной ткани. DKK1 принимает участие в LRP5опосредованном сигнальном пути, что важно для поддержания костной массы в результате мутаций гена DKK1 возможно возникновение генетических синдромов, связанных с нарушением метаболизма кости. Кроме того, DKK1 участвует в процессах, связанных с возникновением и развитием эрозивного артрита. DKK1 также играет роль в адипогенезе, хондрогенезе, пролиферации желудочно-кишечного эпителия, потере костной ткани, ассоциированной с ревматизмом. Повышенные уровни DKK1 в сыворотке ассоциированы с раком предстательной железы, а повышенные уровни DKK1 и RANKL в плазме костного мозга и периферической крови пациентов, страдающих множественной миеломой, ассоциированы с присутствием локальных повреждений костной ткани[3, 4]. Рисунок 3 - Двойная роль сигнального пути Wnt в регуляции дифференцировки остеобластов и остеокластов.©«БиоХимМак» Рассмотрим более подробно эти процессы. Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) костного мозга могут дифференцироваться в адипоциты, хондроциты или остеобласты. Хотя точная регуляция Wnt сигнализации во время развития костей зависит от комплекса сигналов микросреды, данные нескольких групп исследователей показывают, что белки Wnt3a, Wnt5a, Wnt7b и Wnt10b играют центральную роль в дифференцировке остеобластов (рисунок 3) [29, 30, 31, 32, 33]. Исследователями обнаружено повышение уровня β-катенина в клетках линии остеобластов, тогда как снижение уровня β-катенина в клеткахпредшественниках остеобластов приводит к замедлению формирования костной структуры 10 [34]. Помимо содействия остеобластной дифференцировке, канонический путь Wnt сигнализации ингибирует дифференцировку адипоцитов, в первую очередь путем стабилизации β-катенина и последующей трансактивацииTCF-отвечающих генов [35, 36]. DKK1 противодействует Wnt-опосредованному влиянию на дифференциацию кости и адипогенез. В течение 6 часов после начала адипогенеза было отмечено кратковременное повышение мРНК и белковой экспрессии DKK1 в преадипоцитах, что было связано со снижением регуляции цитоплазматического и ядерногоβ-катенина. Рисунок 4 - Роль DKK1 и мезенхимальных стволовых клеток в развитии костей и поддержании гомеостаза костной массы. Примечание. Wnt 3а, 5а, и 7b и Ihh совместно содействуют дифференцировке остеобластов, а DKK1 ингибирует остеобластогенез и сдвигает программу развития в сторону адипогенеза. Комплекс β-catenin/TCF1 способствует ранней дифференцировке линии остеобластов через индукцию Runx2. Runx2 затем способствует активации транскрипции Osterix (OSX), который использует DKK1 для подавления экспрессии Runx2 для дальнейшего усиления созревания предшественников остеобластов.Также показаны фенотипические специфические маркеры для созревания остеобластов [24]. Кроме того, конститутивная экспрессия DKK1 в 3T3-L1 преадипоцитах способствует адипогенной дифференциации клеток [37]. В последнее время 11 установлено, что трансгеннаясверхэкспрессия Msx2 (гомеодоменовый фактор транскрипции, впервые выявлен в остеобластах) у мышей подавляет адипогенез при одновременном повышении остеогенной дифференцировки, увеличении формирования объема костей, что в результате приводит к увеличению экспрессии Wnt7a и Wnt7b и снижению экспрессии DKK1. Кроме того, Msx2 ингибирует Dkk1 промоторную активность, а также снижает ассоциацию РНК-полимеразы с Dkk1 хроматином [38]. Эти данные позволяют предположить, что DKK1 ингибирует остеобластогенез и индуцирует липогенез, эффективно переключая путь дифференциации MSC (мезенхимальных стволовых клеток) (рисунок 3). Наконец, отдельные члены Wnt семейства, а именно Wnt8 и, в меньшей степени, Wnt4 способствуют дифференциации хондроцитов. Не удивительно, что белок frizzled-relatedproteinFrzb/sFRP3, антагонист Wnt1 и Wnt8 сигнализации, как было показано, ингибирует дифференцировку хондроцитов invivo(рис. 3) [39, 40]. Интересно, что рекомбинантный белок bonemorphogenicprotein-2 (Bmp2), имплантированный рецепторов, в мышцы мышей, усиливает активируетβ-катенин-опосредованную регуляцию Wnt лигандов и TCF-зависимую транскрипционную активность, и способствует эндохондральной костной формации. При этом Dkk1 ингибирует β-катениновый сигнал, а также хондрогенез и остеогенез, тем самым предотвращая эндохондральную костную формацию [41]. Таким образом, данные, полученные в экспериментах на животных и в исследованиях человека, подтверждают анаболическую роль Wnt сигнального пути в нарастании и поддержании костной массы, опосредованную усилением дифференциации/активности остеобластов с сопутствующим подавлением дифференциации/активности остеокластов [42, 43, 44, 45]. Остеобласты производят osteoprotegrin (OPG) и рецептор активатор NF-kB (RANK) лиганд (RANKL). RANKL связывается с RANK и усиливает дифференциацию/активность остеокластов. OPG, растворимый рецептор-приманка для RANKL, конкурентно ингибирует RANKL-RANK взаимодействие, и поэтому OPG: RANKL соотношение определяет результирующий эффект на остеокласты [46]. Практика показывает, что DKK1 также является основным фактором, определяющим патологию костей и суставов при воспалительном артрите [20]. Экспрессия белка DKK1 усиливается в синовиальных фибробластах и увеличена в сыворотке пациентов с ревматоидным артритом (РА) по сравнению со здоровым контролем. В отличие от РА, где происходит эрозия кости, концентрация DKK1 в сыворотке у пациентов с анкилозирующим спондилитом, заболеванием, характеризующимся формированием остеофитов, была снижена по сравнению со здоровым контролем. Исследователями было показано, что анти- TNF-α антитела уменьшают уровень DKK1 в сыворотке у пациентов с РА. Dkk1 индуцировали у TNF-αтрансгенных мышей с моделью воспалительного артрита; анти- Dkk1 антитела 12 предотвращали эрозию кости и способствовали формированию остеофитов, но не влияли на воспаление [20]. Наконец, было показано, что воздействие Dkk1 на кости было опосредовано ингибированием Wnt сигнального пути, которое непосредственно нарушало образование новой костной ткани и ограничивало экспрессию OPG, тем самым сдвигая OPG: RANKL соотношение в пользу резорбции кости. Эти данные подтверждают концепцию, что DKK1 ингибирует формирование костей и усиливает резорбцию кости (рисунок 4). Рисунок 5 - Анаболическая и антикатаболическая функция DKK1 в кости. Примечание. TNF-α усиливает секрецию DKK1 которая ингибирует остеобластогенез в MSC и снижает уровень OPG, что приводит к снижению срастания кости. Кроме того, DKK1 повышает уровень RANKL, и повышенное RANKL: OPG соотношение активирует активность остеокластов, что приводит к резорбции кости [24]. Баланс между анаболическим формированием костной ткани и аналитической резорбцией костной ткани регулирует нормальную плотность костной ткани, в повышение уровня одного или другого процесса снижает плотность костной ткани или приводит к повышенной потери костной ткани соответственно. DKK1 также играет роль в адипогенезе, хондрогенезе, пролиферации желудочнокишечного эпителия, потере костной ткани, ассоциированной с ревматизмом. Кроме того, повышенные уровни DKK1 в сыворотке ассоциированы с раком предстательной железы, а повышенные уровни DKK1 и RANKL в плазме костного мозга и периферической крови пациентов, страдающих множественной миеломой, ассоциированы с присутствием локальных повреждений костной ткани. 13 Таким образом, изучение и идентификация генетических и метаболических факторов риска, которые способствуют или препятствуют развитию патологических процессов в кости, могли бы обеспечить понимание различной степени выраженности дегенеративных изменений. Исследования в этой области могли бы расширить наше понимание этиологии болезней и привести к разработке стратегических подходов профилактики и лечения этих заболеваний. Цель работы: Статистическое обоснование и сбор желательного объема выборки для сравнительного молекулярно-генетического исследования деградации сустава в популяции человека. Задачи исследования: 1. Статистическое обоснование желательного объема выборки для проведения сравнительного молекулярно-генетического исследования. 2. Сбор желательного объема выборки сравнительного молекулярно-генетического исследования деградации сустава в казахской популяции. 3. Клиническое обследование больных РА для выявления у них признаков остеопороза. 4. Проведение рентгенологических и остеоденситометрических исследований у и остеоденситометрических исследований у обследуемого контингента. 5. Проведение рентгенологических родственников первой степени родства больных РА. 6. Выделение ДНК из венозной крови больных РА и у родственников первой степени родства. 14 1 НАБОР КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА DKK Материалы и методы исследований В исследование включены пациенты с заболеваниями ревматоидного артрита: 216 человек, которые находились на стационарном лечении в Городском ревматологическом центре г. Алматы. Клиническая характеристика пациентов представлена в таблице 1. Данным пациентам был установлен согласно критериям ACR/EULAR (2010). Все обследуемые подписали информированные согласия на проведение анкетирования и взятие венозной крови из кубитальной вены. Средний возраст больных составил 50,11 лет (25-63 года). Среди обследованных 84,9% были женщины, 15,02% – мужчины, 98% пациентов были лица казахской национальности. Таблица 1 - Клиническая характеристика исследуемых групп, n (%) Характеристики Всего (n=216) 33 (15,02%) 183 (84,9%) 50,11 Мужчины, кол. Женщины, кол. Средний возраст, годы Больным было проведено полное физикальное обследование, собраны анамнез заболевания и жизни. Данные анамнеза и клинического осмотра заносили в формализованную историю болезни. Оценивали состояние костно-суставной системы и нарушение их функции, возможные контрактуры, деформации. Также проводили оценку активности заболевания по индексу DAS 28, на основании СОЭ, визуальной аналоговой шкалы, числа болезненных и припухших суставов. Молекулярно-генетическим методом из венозной крови больных ревматоидным артритом и у родственников первой степени родства было выделено ДНК. Геномную ДНК выделяли из 50 мкл периферической крови с использованием набора «MagMax-96 DNA Multi-SampleKit» (AppliedBiosystems, США) и автоматической станции для выделения ДНК MagMaxExpress 96 (Applied Biosystems, США), методика с использованием магнитных твердых носителей. Выделение проводили согласно рекомендациям производителя. Определение концентрации ДНК в образцах производили на приборе «NanoDrop» (ThermoScientific, США). Для контроля продукты амплификации визуализировались электрофорезом в агарозном геле. 15 1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D Рисунок 6 - образцы выделенной ДНК в агарозном геле. 1D- 7D – номера образцов ДНК. Для детекции полиморфизмов гена Dkk1 (rs1569198, rs1528877, rs11001560, rs1569199) использовали флуоресцентно-меченные олигонуклеотиды по технологии TaqMan. В качестве матрицы использовалось 5–10 нг геномной ДНК. Выявление аллельных вариантов исследуемого гена с использованием ПЦР в режиме «реального времени» проводили с использованием термоциклера RotorGene ( Qiagen. Германия) в 25 мкл реакционной смеси. Детекцию полиморфизма rs1569198 гена Dkk1 проводили при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95°С, далее 50 циклов: 10 с при 94°С, 40 с при 60,0°С с регистрацией уровня флуоресценции FAM и ROX. Детекцию полиморфизма rs1528877 гена Dkk1 проводили при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95°С, далее 50 циклов: 10 с при 94°С, 40 с при 58,0°С с регистрацией уровня флуоресценции FAM и ROX. Детекцию полиморфизма rs11001560 гена Dkk1 проводили при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95°С, далее 50 циклов: 10 с при 94°С, 40 с при 56,0°С с регистрацией уровня флуоресценции FAM и ROX. Детекцию полиморфизма rs1569199 гена Dkk1 проводили при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95°С, далее 50 циклов: 10 с при 94°С, 40 с при 56,0°С с регистрацией уровня флуоресценции FAM и ROX. Детекцию полиморфизма rs2241529 гена Dkk1 проводили при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95°С, далее 50 циклов: 10 с при 94°С, 40 с при 56,0°С с регистрацией уровня флуоресценции FAM и ROX. Стандартные олигонуклеотиды и олигонуклеотиды, несущие 6-карбоксифлуоресцеин (FAM), карбокси-x-родамин (ROX) были синтезированы в Национальном центре биотехнологий (Астана). 16 Анализ данных проводили в программах Microsoft Excel 2007, параметрическими и непараметрическими статистическими тестами (Т-критерий, хи-квадрат, OR). Предварительно были проведены исследования региона генома, несущего ген DKK1, на наличие всех возможных однонуклеотидных полиморфизмов. Далее проводился отбор полиморфизмов с MAF(minorallelefrequency) не менее 0,1 (то есть с частотой 10% на 1000 человек). Для оставшихся полиморфизмов проводили анализ на сцепление и полиморфизмы с показателями неравновесного сцепления равными или более 0,8 были отобраны в качестве кандидатов. Все вышеперечисленные операции были проведены под руководством Грегори Лившица на базе Тель-Авивского университета, Тель-Авив, Израиль. 17 2 Результаты исследований Полный анализ клинических и генетических данных было проведено 70 пациентам. На основании жалоб, анамнеза и лабораторных данных пациентов выявлена активность заболевания по DAS 28 соответствующая II и III степени в соотношении 3:1. У 67,4% обнаружен ревматоидный фактор, у 49,11% - АЦЦП. Одной части пациентов не было проведено иммунологическое исследование в связи с тем, что данное обследование не было заложено в проект, получены следующие результаты (таблица 2) Иммунологическое исследование АЦЦП + РФ+ АЦЦП – РФ + АЦЦП + РФ АЦПП – РФ АЦЦП необсл РФ + АЦЦП необсл РФ АЦЦП + РФ необсл АЦЦП - РФ необсл Обследованные (n=70) 22 (31,4%) 7 (10%) 6 (8,6%) 6 (8,6%) 15 (21,4%) 12 (17,1%) 1 (1,4%) 1 (1,4%) Из этого следует, что 8,6% пациентов относится к «Серонегативному» варианту РА. Из 70 образцов ДНК, выделенных из крови пациентов с диагнозом ревматоидный артрит, обнаружено следующее процентное соотношение генотипов и аллелей (таблица 3): DKK1 rs1528877 Генотипы Дикий тип - 15 обр (15,7%) Гетерозигота - 28 обр (35,6%) Мутант -27 (47%) DKK1 rs2241529 Генотипы Дикий тип - 61 обр (88,4%) Гетерозигота - 5 обр (7,24%) Аллели A – 35% G – 65% Аллели А – 92% G – 8% Мутант - 4 обр (4,35%) DKK1 rs1569198 Генотипы Дикий тип - 28 обр (40%) Гетерозигота – 20 обр (23,5%) Мутант - 21 (36,5%) DKK1 rs11001560 Генотипы Дикий тип - 11 обр (22,35%) Аллели A – 51,8% G – 48,2% Аллели C – 45% 18 Гетерозигота - 40 обр (45,9%) Мутант - 19 (31,8%) DKK1 rs1569199 Генотипы Дикий тип - 18 обр (23,8%) Гетерозигота - 43 обр (58,3%) Мутант -9 (17,86%) T – 55% Аллели T – 53% C – 47% В результате данного исследования произведена отладка методик выделения ДНК, произведен дизайн праймеров и taqman зондов для реал-тайм ПЦР, подобраны условия реалтайм ПЦР. Полученные данные являются предварительными и являются заделом для дальнейшего более подробного исследования взаимосвязи полиморфизмов гена DDK1 с развитием ревматоидного артрита. Объем выборки будет увеличен до 1000 человек и также аналогичные исследования будут проведены на контрольной группе с целью расчета Odds Ratio. Также планируется рассмотрение гена DKK1 в качестве терапевтической мишени для использования в диагностике и предотвращения ревматоидного артрита. 19 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Ревматоидный артрит — это хроническое аутоиммунное заболевание, которое часто приводит к деформации суставов у людей различного возраста. Таким образом, выявление причин и лечение заболевания ревматоидного артрита снижают риск развития инвалидизации. Активность заболевания по DAS 28 соответствующая II и III степени выявлена в соотношении 3:1. Более 50% пациентов были «Серопозитивны» по ревматоидному фактору, либо АЦЦП. Произведена отладка методик выделения ДНК Полученные данные являются предварительными и являются заделом для дальнейшего более подробного исследования взаимосвязи полиморфизмов гена DDK1 с развитием ревматоидного артрита и рассмотрение его в качестве терапевтической мишени для использования в диагностике и предотвращения ревматоидного артрита. 20 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Smirnov, AV &Seisenbaev, ASh. 2007. Roentgenological diagnostics of rheumatic diseases. Zdravoochranenie Kazkhstan, Almaty. 2. Roux C. Osteoporosis in inflammatory joint diseases. Osteoporos Int. 2011; 22:421-33. 3. Murariu RV, Macovei LA, Brujbu IC. Osteoporosis in rheumatoid arthritis. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi.2013;117(2):394-403. 4. Helmick CG, Felson DT, Lawrence RC, Gabriel S, Hirsch R, Kwoh CK, et al; National Arthritis Data Workgroup. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. Part I. Arthritis Rheum. 2008;58(1):15-25. 5. Scott DL, Wolfe F, Huizinga TW. Rheumatoid arthritis. Lancet. 2010; 25;376(9746):10941108. 6. Lozano R, Naghavi M, Foreman K, Lim S, Shibuya K, Aboyans V, Abraham J, Adair T, et al., Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 2012; 15;380(9859):2095-128. 7. Scott DL, Shipley M, Dawson A, Edwards S, Symmons DP, Woolf AD. The clinical management of rheumatoid arthritis and osteoarthritis: strategies for improving clinical effectiveness. Br J Rheumatol. 1998 May;37(5):546-54. 8. Okada Y, Wu D, Trynka G, Raj T, Terao C, Ikari K, et al., Genetics of rheumatoid arthritis contributes to biology and drug discovery. Nature. 2014; 20;506(7488):376-81. 9. Livshits G, Deng HW, Nguyen TV, Yakovenko K, Recker RR, Eisman JA. Genetics of bone mineral density: evidence for a major pleiotropic effect from an intercontinental study. J Bone Miner Res. 2004;19(6):914-23. 10. Raychaudhuri S. Recent advances in the genetics of rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol. 2010;22(2):109-18. 11. Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature. 2007; 7;447(7145):661-78. 12. Julia A, Ballina J, Cañete JD, Balsa A, Tornero-Molina J, Naranjo A, et al., Genome-wide association study of rheumatoid arthritis in the Spanish population: KLF12 as a risk locus for rheumatoid arthritis susceptibility. Arthritis Rheum. 2008;58(8):2275-86. 13. Stahl EA, Raychaudhuri S, Remmers EF, Xie G, Eyre S, Thomson BP, et al., Genome-wide association study meta-analysis identifies seven new rheumatoid arthritis risk loci. Nat Genet. 2010;42(6):508-14. 14. Jiang L, Yin J, Ye L, Yang J, Hemani G, Liu AJ, et al., Novel risk loci for rheumatoid arthritis in Han Chinese and congruence with risk variants in Europeans. Arthritis Rheumatol. 2014;66(5):1121-32. 15. Stahl EA, Wegmann D, Trynka G, Gutierrez-Achury J, Do R, Voight BF, et al., Bayesian inference analyses of the polygenic architecture of rheumatoid arthritis. Nat Genet. 2012 ;44(5):483-9. 16. Viatte S, Plant D, Raychaudhuri S. Genetics and epigenetics of rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 2013;9(3):141-53. 17. Kochi Y, Okada Y, Suzuki A, Ikari K, Terao C, Takahashi A, et al., A regulatory variant in CCR6 is associated with rheumatoid arthritis susceptibility. Nat Genet. 2010;42(6):515-9. 18. Diarra D, Stolina M, Polzer K, Zwerina J, Ominsky MS, Dwyer D, et al., Dickkopf-1 is a master regulator of joint remodeling. Nat Med. 2007;13(2):156-63. 19. Dell’Accio F., De Bari C., MF El Tawil N. et al. Activation of WNT and BMP signaling in adult human articular cartilage following mechanical injury. Arthritis Res Ther. 2006;8(5):R139. PMC1779445 20. Diarra D., Stolina M., Polzer K. et al. Dickkopf-1 is a master regulator of joint remodeling. Nat Med. 2007 Feb;13(2):156-63. Epub 2007 Jan 21. PMID: 17237793 21. Schett G., Zwerina J., David J.P. The role of Wnt proteins in arthritis. Nat Clin Pract Rheumatol. 2008 Sep;4(9):473-80 PMID: 18756273 21 22. Polzer K., Diarra D., Zwerina. Inflammation and destruction of the joints--the Wnt pathway. Joint Bone Spine. 2008 Mar;75(2):105-7. PMID: 18313347 23. Поворознюк В.В., Григорьева Н.В. Антиостеопоротические препараты в лечении остеоартроза у женщин в постменопаузальном периоде. // Боль. Суставы. Позвоночник. 2011. №4 (04) 24. Joseph J. Pinzone, Brett M. Hall, Nanda K. Thudi, Martin Vonau, Ya-Wei Qiang, Thomas J. Rosol, John D. Shaughnessy. The role of Dickkopf-1 in bone development, homeostasis, and disease. Blood. 2009 January 15; 113(3): 517–525. 25. Clevers H. Wnt/beta- catenin signaling in development and disease. Cell. 2006;127:469– 480. 26. Yamamoto H, Sakane H, Yamamoto H, Michiue T, Kikuchi A. Wnt3a and Dkk1 regulate distinct internalization pathways of LRP6 to tune the activation of beta- catenin signaling. DevCell. 2008;15:37–48. 27. Glinka A, Wu W, Delius H, Monaghan AP, Blumenstock C, Niehrs C. Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction. Nature. 1998;391:357–362. 28. Mao B, Wu W, Davidson G, et al. Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta-catenin signalling. Nature. 2002;417:664–667. 29. Baksh D, Tuan RS. Canonical and non-canonical Wnts differentially affect the development potential of primary isolate of human bone marrow mesenchymal stem cells. J Cell Physiol. 2007;212:817–826. 30. Hu H, Hilton MJ, Tu X, Yu K, Ornitz DM, Long F. Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development. Development. 2005;132:49–60. 31. Baksh D, Boland GM, Tuan RS. Cross-talk between Wnt signaling pathways in human mesenchymal stem cells leads to functional antagonism during osteogenic differentiation. J CellBiochem. 2007;101:1109–1124. 32. Boland GM, Perkins G, Hall DJ, Tuan RS. Wnt 3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells. J CellBiochem. 2004;93:1210– 1230. 33. Etheridge SL, Spencer GJ, Heath DJ, Genever PG. Expression profiling and functional analysis of wnt signaling mechanisms in mesenchymal stem cells. StemCells. 2004;22:849–860. 34. Day TF, Guo X, Garrett-Beal L, Yang Y. Wnt/beta-catenin signaling in mesenchymal progenitors controls osteoblast and chondrocyte differentiation during vertebrate skeletogenesis. Dev Cell. 2005;8:739–750. 35. Ross SE, Hemati N, Longo KA, et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science.2000;289:950–953. 36. Morvan F, Boulukos K, Clement-Lacroix P, et al. Deletion of a single allele of the Dkk1 gene leads to an increase in bone formation and bone mass. J BoneMinerRes. 2006;21:934–945. 37. Christodoulides C, Laudes M, Cawthorn WP, et al. The Wnt antagonist Dickkopf-1 and its receptors are coordinately regulated during early human adipogenesis. J CellSci. 2006;119:2613– 2620. 38. Cheng SL, Shao JS, Cai J, Sierra OL, Towler DA. Msx2 exerts bone anabolism via canonical Wnt signaling. J BiolChem. 2008;283:20505–20522. 39. Enomoto-Iwamoto M, Kitagaki J, Koyama E, et al. The Wnt antagonist Frzb-1 regulates chondrocyte maturation and long bone development during limb skeletogenesis. DevBiol. 2002;251:142–156. 40. Wang S, Krinks M, Moos M., Jr Frzb-1, an antagonist of Wnt-1 and Wnt-8, does not block signaling by Wnts -3A, -5A, or -11. Biochem Biophys Res Commun. 1997;236:502–504. 41. Chen Y, Whetstone HC, Youn A, et al. Beta-catenin signaling pathway is crucial for bone morphogenetic protein 2 to induce new bone formation. J BiolChem. 2007;282:526–533. 42. Gong Y, Slee RB, Fukai N, et al. LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development. Cell. 2001;107:513–523. 22 43. Baron R, Rawadi G. Targeting the Wnt/beta-catenin pathway to regulate bone formation in the adult skeleton. Endocrinology. 2007;148:2635–2643. 44. Glass DA, Bialek P, 2nd, Ahn JD, et al. Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controls osteoclast differentiation. DevCell. 2005;8:751–764. 45. Glass DA, Karsenty G., 2nd In vivo analysis of Wnt signaling in bone. Endocrinology. 2007;148:2630–2634. 46. Holmen SL, Giambernardi TA, Zylstra CR, et al. Decreased BMD and limb deformities in mice carrying mutations in both Lrp5 and Lrp6. J BoneMinerRes. 2004;19:2033–2040. 23
