МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Бузулукский гуманитарно–технологический институт
(филиал) федерального государственного бюджетного образовательного
учреждения высшего профессионального образования
«Оренбургский государственный университет»
Кафедра биологии
Кожакин П.А.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ВЫПОЛНЕНИЮ
ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ ПО ДИСЦИПЛИНЕ «БОЛЬШОЙ
ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ»
Рекомендовано к изданию Редакционно-издательским советом Бузулукского
гуманитарно–технологического
института
(филиала)
федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего
профессионального образования «Оренбургский государственный университет» в
качестве методических указаний к выполнению лабораторных работ по дисциплине
«Большой лабораторный практикум» для студентов специальности 020201.65 –
Биология.
Бузулук
2013
УДК 612
ББК 28.707
К 58
Рецензент: кандидат биологических наук Н.А. Коршикова
Кожакин, П.А.
К 58 Методические указания к выполнению лабораторных работ по
дисциплине «Большой лабораторный практикум»/ П.А.Кожакин: БГТИ
(филиал) ОГУ – Бузулук, 2013. - 82с.
Методические указания включают указания по выполнению лабораторных
работ, вопросы для самоконтроля и к зачёту.
Предназначено для студентов очной формы обучения по специальности
020201.65 – Биология.
УДК 612
ББК 28.707
© Кожакин П.А., 2013
© БГТИ (филиал) ОГУ,2013
2
Содержание
Раздел 1. Введение……………………………………………………………….
Лабораторная работа 1. Техника безопасности при работе в биохимической
лаборатории………………………………………………………………………..
Раздел 2. Белки и их обмен……………………………………………………..
Лабораторная работа 1.Аминокислоты. Обнаружение аминокислот в
биологических жидкостях……………………………………………………….
Лабораторная работа 2. Пептиды, белки. Строение, свойства. Методы
обнаружения……………………………………………………………………….
Лабораторная работа 3. Физико-химические свойства белков………………...
Лабораторная работа 4. Переваривание белков в желудочно-кишечном
тракте……………………………………………………………………………….
Лабораторная работа 5. Промежуточный обмен аминокислот………………...
Лабораторная работа 6. Обмен аммиака в организме. Биосинтез мочевины…
Лабораторная работа 7. Белки плазмы крови……………………………………
Раздел 3. Углеводы и их обмен…………………………………………………
Лабораторная работа 1 Структура, свойства, функции углеводов…………….
Лабораторная работа 2. Переваривание углеводов в ж. к. т……………………
Лабораторная работа 3. Расщепление глюкозы по гликолитическому
дихотомическому пути……………………………………………………………
Лабораторная работа 4. Расщепление глюкозы по пентозофосфатному пути.
Глюконеогенез……………………………………………………………………
Лабораторная работа 5. Биохимические изменения при нарушении обмена
углеводов…………………………………………………………………………..
Раздел 4. Липиды и их обмен…………………………………………………...
Лабораторная
работа
1.
Структура
и
функции
липидов………………………...
Лабораторная работа 2. Промежуточный обмен высших жирных кислот……
Лабораторная работа 3.Обмен холестерина в организме человека……………
Лабораторная работа 4. Обмен липопротеинов…………………………………
Лабораторная работа 5. Биохимические изменения в организме человека при
нарушении обмена липидов. Метаболизм кетоновых тел……………………...
Лабораторная работа 6. Биологические мембраны. Перекисное окисление
липидов……………………………………………………………………………
Раздел 5. Биохимия крови………………………………………………………
Лабораторная работа 1. Биохимия крови. Ферменты крови……………………
Лабораторная работа 2. Биохимия эритроцитов………………………………...
Лабораторная работа 3. Гемоглобин, строение, свойства, функции. Обмен
железа………………………………………………………………………………
Лабораторная работа 4. Буферные системы крови……………………………...
Лабораторная работа 5. Свертывание крови. Антисвертывающие системы….
Раздел 6. Биохимия гепатопанкреатодуодеальной области………………..
Лабораторная работа 1. Биохимия печени………………………………………
3
5
5
12
12
14
15
16
18
20
21
26
26
28
29
30
30
33
33
35
36
37
38
40
42
42
43
44
47
50
52
52
Лабораторная работа 2.Биохимия поджелудочной железы…………………….
Раздел 7. Биохимия нервной ткани……………………………………………
Лабораторная работа 1. Биохимия нервной ткани……………………………...
Раздел 8 Биохимия мышц………………………………………………………
Лабораторная работа 1. Биохимия скелетных мышц…………………………...
Лабораторная работа 2. Биохимия миокарда……………………………………
Раздел 9 Биохимия соединительной и костной ткани………………………
Лабораторная работа 1. Биохимия соединительной и костной ткани…………
Раздел 10 Биохимия воспалительного процесса……………………………..
Лабораторная работа1. Биохимия воспалительного процесса…………………
Раздел 11 Витамины и методы их обнаружения……………………………..
Лабораторная работа 1. Жирорастворимые витамины и методы их
обнаружения……………………………………………………………………….
Лабораторная работа 2. Водорастворимые витамины и методы их
обнаружения……………………………………………………………………….
Раздел 12. Гормональная регуляция обмена веществ и функций в
организме человека……………………………………………………………...
Лабораторная работа 1. Гормоны - белки, гормоны – пептиды………………..
Лабораторная работа 2. Гормоны - производные аминокислот………………..
Лабораторная работа 3. Стероидные гормоны и механизм их действия……...
Лабораторная работа 4. Гормоны половых желез………………………………
Раздел 13.Водиоэлектролитный обмен и его регуляция……………………
Лабораторная работа 1. Фосфатно-кальциевый обмен в организме человека..
Раздел 14 Биохимия выделительной системы……………………………….
Лабораторная работа 1. Биохимия выделительной системы. Биохимия почек.
Лабораторная работа 2 Роль почек в поддержании КОС и осмотического
давления. Биохимия мочи………………………………………………………...
Лабораторная работа 3. Патологические компоненты в моче…………………
Список литературных источников………………………………………………
Вопросы к зачёту………………………………………………………………….
4
53
57
57
57
57
60
62
62
64
64
66
66
69
73
73
74
75
76
77
77
79
79
81
84
85
86
Раздел 1. Введение
Лабораторная
работа
1
Техника
безопасности
при
работе
в
биохимической лаборатории
Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории:
1
Проводите опыты, только предусмотренные преподавателем, соблюдая
правила безопасности.
2
Будьте особенно осторожны в обращении с концентрированными
растворами кислот, щелочей, огнеопасными и ядовитыми веществами.
3
В химической лаборатории не ешьте, не пробуйте вещества на вкус, не
наклоняйтесь над склянкой с реактивами.
4
Определяя вещества по запаху, не делайте глубокого вдоха. Осторожно
направляйте к себе газ или пар рукой.
5
Наливайте или насыпайте реактивы только над столом. Пролитые или
рассыпанные реактивы немедленно удалите по указанию преподавателя. Не
оставляйте открытыми склянки с жидкостями и банки с сухими реактивами.
Участки кожи или одежды, на которые попал реактив, сначала тщательно смойте
водой, затем протрите нейтрализующим веществом.
6
Для опыта берите вещество в количествах, указанных в руководстве или
преподавателем. Оставшиеся вещества не сливайте и не ссыпайте в сосуд, из
которого они были взяты, а собирайте только в специально предназначенную для
этого посуду. Убирайте свое рабочее место, не оставляйте посуду с остатками
вещества.
Правильно пользуйтесь нагревательными приборами и строго соблюдайте
правила безопасности при нагревании:
1
Зажигайте спиртовку спичкой или лучинкой, гасите спиртовку,
накрывая пламя колпачком.
2
Нельзя нагревать вещества в толстостенной посуде.
3
Отверстие открытого сосуда (пробирки) при нагревании в нем жидкости
5
направляйте в сторону от себя и своих товарищей, не наклоняйтесь над
нагреваемым сосудом.
4
В пробирке нагревайте только небольшие количества вещества,
жидкость должна занимать не более 1/3 объема пробирки.
5
Пробирку с веществом слегка прогрейте всю, затем нагревайте в нужном
месте, не вынимая из пламени спиртовки. Нагревайте пробирку ниже уровня
жидкости в ней.
6
Поджигайте испытуемые газы и пары после их проверки на чистоту.
7
После нагревания немедленно гасите пламя.
Лабораторная посуда.
В практикуме по биохимии применяют следующую лабораторную посуду:
1
Колбы — круглодонные, плоскодонные, мерные (от 25 мл до 5,0 л).
2
Химические стаканы — различных объемов (от 50 мл до 2,0 л).
3
Пробирки — цилиндрические и конические.
4
Цилиндры — от 10 мл до 2,0 л.
5
Мензурки — от 50 мл до 1,0 л.
6
Пипетки — емкостью от 0,1 мл до 100 мл — градуированные и пипетки
Мора.
7
Бюретки (иногда микробюретки).
8
Промывалки.
9
Фарфоровые тигли.
10
Фарфоровые чашки.
11
Фарфоровые ступки.
12
Эксикаторы.
13
Воронки.
14
Посуда дли взвешивания - часовые стекла, бюксы, тигли.
15
Стеклянные палочки, лопаточки.
Основные
методы
разделения
смесей
веществ
на
индивидуальные
компоненты. Количественное определение веществ.
1
Хроматография. Метод впервые предложен в 1903 году М. С. Цветом
6
как средство для изучения растительных пигментов. Хроматография применяется
для разделения различных смесей на составляющие их компоненты.
Применяют в основном четыре вида хроматографии.
Информационная колоночная хроматография. Если растворимые вещества,
которые необходимо разделить, способны существовать в виде ионов, то
используют
ионообменную
хроматографию.
Неподвижной
фазой
являются
вещества, которые называются ионообменниками. Ионообменники представляют
собой
смолы,
являющиеся
полимерными
органическими
соединениями.
Ионообменники состоят из двух каркасов: неподвижного и подвижного. Если
подвижный каркас содержит остатки серной кислоты, карбоксильных групп, т. е.
содержит
подвижные
положительно
заряженные
ионы,
которые
могут
обмениваться, то такая смола называется катионообменником. Анионообменники
представляют собой хлоропроизводные аминов. В данном случае отрицательно
заряженный хлор обменивается на анионы анализируемого образца. При движении
раствора смеси веществ происходит обмен подвижных ионов смолы на ионы,
содержащиеся в смеси, и движение ионов замедляется. Степень связывания зависит
от
заряда
каждого
компонента
смеси.
Чем
больше
заряд,
тем
больше
взаимодействие со смолой и медленнее будет двигаться вещество по колонке. Одни
вещества задерживаются на колонке, а другие — нет. Осажденные вещества на
колонке снимают, применяя растворы с различными значениями pH. Жидкость,
вытекающую
из
колонки,
называют
элюатом.
Сбор
элюатов
производят
автоматическим коллектором.
Высокоэффективная
хроматографический
микроскопические
жидкостная
метод.
частицы,
В
что
хроматография.
качестве
резко
неподвижной
В
основе
фазы
лежит
используют
повышает взаимодействие
веществ,
движущихся через колонку с твердой фазой. Поскольку плотная упаковка снижает
скорость подвижной фазы, то необходимо приложить давление. Этот метод
обладает высокой разрежающей способностью и позволяет за короткое время (10—
15 мин) разделить смесь практически любых соединений.
Хроматография
распределительная.
7
Смесь
веществ
делится
на
индивидуальные компоненты, потому что эти вещества по-разному растворяются
(распределяются) в подвижном и неподвижном растворителях в зависимости от
величины радикала и наличия функциональных (гидрофильных) групп.
На полоску хроматографической бумаги в 1 см от нижнего края или на тонкий
слой силикагеля наносят кашпо смеси веществ и помещают в хроматографическую
камеру, на дне которой находится подвижный растворитель — чаще всего
органический растворитель. Атмосфера камеры насыщена парами воды, которые
адсорбируются на носителе, образуя неподвижный (полярный) растворитель.
Подвижный растворитель движется вверх по носителю, смоченному водой, увлекая
с собой гидрофобные вещества, а гидрофильные вещества останутся почта у места
нанесения, растворяясь в воде. Для каждого вещества после проявления его
соответствующим раствором вычисляют коэффициент Rf — индивидуальный
показатель, с помощью которого по таблице можно идентифицировать это вещество
или использовать стандарты веществ при хроматографии. Газожидкостная
хроматография подробно описана в разделе «Промежуточный обмен ВЖК в
организме».
Аффинная хроматография (хроматография сродства). Метод основан на
свойстве белков специфически связываться с определенным соединением. Обычно
специфически связываемым веществом является антитело, для которого белок —
антиген. Методически метод похож на колоночную хроматографию: колонка
наполняется твердой полимерной фазой, к которой предварительно было «пришито»
антитело. По мере движения смеси белков по колонке выявляется единственно
отстающий белок— тот, который связывается с антителом. Все остальные белки, не
обладающие этой способностью, без задержки проходят через колонку. Гельхроматография. В качестве стационарной фазы используют гель в виде крошечных
гранул, т. е. такую неподвижную фазу можно рассматривать как молекулярные сита.
Гранулы геля изготовлены из полимера со сшитой структурой, подобной ситу. В
качестве такого полимера используется декстран или полиакриламид. В водной,
среде полимерный материал сорбирует воду и
набухает, превращаясь в
гелеподобные гранулы, сохраняющие пористую структуру, причем размер пор
8
такого набухшего материала определяется степенью сшивки полимера. Нанесенные
на колонку соединения начинают взаимодействовать с гранулами геля, проникая в
объем гранулы через поры, что замедляет движение растворенного вещества по
колонке. Молекулы небольшого размера совсем не будут проникать в объем гранул
и просто пройдут через колонку. Каждый компонент разделяемой смеси
описывается объемом элюирования, который равен объему элюата, собранного до
момента, соответствующего максимуму пика. Если при разделении получается
только один пик (максимум поглощения в УФ-области), то это указывает на чистоту
исходного препарата. Таким образом делят белки с различной молекулярной
массой.
2
Электрофорез применяется для разделения молекул, несущих заряды,
исследуемую смесь веществ наносят на хроматографическую бумагу, которая
служит инертным носителем. Концы бумаги должны быть опущены в буферный
раствор, который служит средой для электрического поля, когда приложено
напряжение. Под влиянием Напряжения отдельные молекулы в разделяемой смеси
Движутся к (+) или к (-) заряженному полюсу в зависимости от их относительных
масс, знака и величины зарядов. Подвижность заряженной частицы в электрическом
поле называется электрофоретической подвижностью. Она увеличивается с
уменьшением массы и увеличением заряда молекулы.
Гель-электрофорез применяется для анализа, разделения смесей, выделения
макромолекул. В качестве носителей используют гели из агара, крахмала, ацетата
целлюлозы, полиакриламида. Исследуемый раствор образца вводят в колонку или
тонкий слой геля, затем гель погружают в подходящий буфер и накладывают
электрическое поле, подсоединяя электроды к обоим концам геля. Разные ионы
начинают мигрировать в геле с различными скоростями и их локализацию в геле в
конце опыта можно определить по окрашиванию колонки или геля. С помощью
данного метода можно анализировать белковый состав сыворотки крови,
спинномозговой жидкости, ЛП крови.
Изоэлектрическое фокусирование в градиенте pH. Метод основан на том, что
любой биополярный ион в зависимости от значений pH меняет свой заряд. При
9
изоэлектрической точке он нейтрален, следовательно, не движется в электрическом
поле. Следовательно, в геле с различными значениями pH по длине колонки данный
белок при наложении электрического поля будет двигаться до достижения слоя геля
с pH, отвечающим pJ данного белка.
Иммуноэлектрофорез. Электрофорез проводят в слое агарового геля,
заряженного отрицательно. По обеим сторонам слоя, параллельно движению смеси,
прорезают полоски и наполняют раствором антител, специфических к белкам,
разделяемым данным методом. В результате каждая реакция антигена с антителом
сопровождается образованием полосы преципитации. Группу белков с одной и той
же электрофоретической подвижностью можно разделить на компоненты благодаря
реакции с антителами.
3
Потенциометрические
методы
основаны
на
намерении
разности
потенциалов между парой подходящих электродов, погруженных в анализируемый
раствор. Необходимая для этого установка содержит индикаторный (определения)
электрод, электрод сравнения, прибор для измерения потенциала — потенциометр.
Потенциал электрода может изменяться при изменении концентрации одного или
нескольких веществ в растворе, в который погружен. Т. е., измеряя потенциал
электрода, можно количественно определить содержание вещества в растворе. К
индикаторным относят электроды, которые изменяют значение потенциала при
изменении концентрации определяемого иона или вещества. При определении pH
раствора
пользуются
водородным,
в
качестве
хингидронным.
Для
индикаторных
электродов:
определения
концентрации
стеклянным,
ионов
—
ионселективными электродами.
Электрод сравнения должен в данных условиях иметь постоянный потенциал.
Можно использовать один из двух электродов сравнения: хлорсеребряный,
каломельный.
4
Фотоэлектроколориметрические методы анализа основаны на сравнении
интенсивности окраски исследуемого раствора с окраской раствора, концентрация
которого известна (стандартного раствора). При колориметрических определениях
используют реакции, в результате которых определяемое вещество переводят в
10
окрашенное соединение. Интенсивность окраски полученного раствора измеряют на
фотоэлектроколориметре (ФЭКе). Она прямо пропорциональна концентрации
окрашенного
раствора
и
толщине
рассматриваемого
слоя.
Чем
больше
интенсивность окраски, тем выше оптическая плотность. Графически зависимость
представляется градуированным графиком, в котором по оси абсцисс откладывают
концентрацию вещества в моль/л, (С) на оси ординат — оптическую плотность (D)
раствора.
Условием
применимости
метода
является
прямо
пропорциональная
зависимость между D и С. Для этого экспериментальным путем находят
оптимальные условия для получения устойчивого окрашенного соединения.
Принцип работы ФЭКа: световая энергия с помощью фотоэлемента
преобразуется в электрическую. Возникающий ток регистрируется гальванометром.
Отклонение стрелки гальванометра пропорционально освещенности фотоэлемента,
которая изменяется в зависимости от интенсивности окраски исследуемого раствора
при соответствующей длине волны (подбор с помощью фильтров).
5
Спектрофотометрические
методы
анализа.
Спектрофотомерия
—
определение количества вещества в растворе или твердой среде по измерению
светопоглощения волн строго определенной длины. Светопоглощение измеряют с
помощью фотоэлемента по изменению силы тока, возникающего в нем, при падении
на фотоэлемент светового потока, прошедшего через контрольный, а затем через
исследуемые растворы или образцы.
Измерение светопоглощения производится в приборе спектрофотометре,
кварцевая призма которого выявляет монохроматические пучки спектра, поэтому
прибор
отличается
большой
чувствительностью
и
точностью.
Используя
спектрофотометр, можно работать как в видимой области спектра, так и в
ультрафиолетовой области: от 220 до 650 нм — ультрафиолетовая область спектра;
от 600 до 1100 нм — видимая область спектра.
Контрольные вопросы к разделу 1:
1
Назовите основные методы разделения смесей веществ на индивидуальные
компоненты.
11
6
Принципы хроматографического метода исследования.
7
Укажите виды хроматографии.
8
Принцип
фотоэлектроколориметрического метода анализа.
9
Принцип
потенциометрического метода анализа.
10 Принцип метода электрофорез.
11 Принцип спектрофотометрического метода анализа.
Раздел 2. Белки и их обмен
Лабораторная работа 1 Аминокислоты. Обнаружение аминокислот в
биологических жидкостях
Опыт 1 Нингидриновая реакция
К 5—10 каплям раствора гликола добавляют 6—10 капель 0,2%-го раствора
нингидрина. Нагревают до кипения. Появляется фиолетово-синее окрашивание за
счет образования дикетогидриндилидена-дикетогидрйндамина (ЦИДА) — продукта
конденсации нингидрина с аминокислотой. Запишите в тетрадь две стадии
уравнения этой реакции. Сделайте вывод.
Эту реакцию широко используют в биохимической лаборатории для
количественного определения аминокислот в биологических жидкостях (кровь,
моча, спинномозговая жидкость и др.), а также для количественного определения
белков и пептидов:
12
Опыт 2 Ксантопротеиновая реакция
К
0,5
мл
биологической
жидкости
прибавляют
5—6
капель
концентрированной азотной кислоты. Осторожно нагревают. При наличии в
растворе циклических аминокислот или белков, в которых присутствуют эти
аминокислоты, появляется желтое окрашивание за счет нитрования бензольного
кольца. Запишите в тетрадь уравнение реакции нитрования тирозина, сделайте
вывод.
Опыт 3 Реакция Фоля на серосодержащие аминокислоты
В пробирку наливают 5 капель биологической жидкости, затем прибавляют 5
капель 30% -го раствора едкого натра и 1 каплю 5% -го раствора уксуснокислого
13
свинца. При длительном нагревании жидкость, содержащая серосодержащие
аминокислоты (цистеин, цистин, метионин) и белки, в которых присутствуют эти
аминокислоты, буреет, и выпадает черный осадок сернистого свинца. Реакция
протекает в два этапа: 1-й этап — переход серы из органического соединения в
неорганическое; 2-й этап — качественное обнаружение серы в растворе. Запишите в
тетрадь уравнения этих реакций, сделайте вывод.
а) на первом этапе происходит отщепление SH-групп
аминокислоты и переход серы из органического соединения в
неорганическое:
Реакция характерна на цистеин, цистин, метионин или на белки, в которых эти
аминокислоты присутствуют.
Лабораторная работа 2 Пептиды, белки. Строение, свойства. Методы
обнаружения
Опыт 1 Обнаружение белков и пептидов в растворах
К 1 мл биологической жидкости прибавляют 1 мл 10% -го раствора едкого
натрия и 2 капли 1% - го раствора сернокислой меди. В присутствии белков и
пептидов (начиная с трипептидов) появляется розово-фиолетовое окрашивание.
Реакция
основана
на
образовании
хелатного
(внутрикомплексного)
соединения ионов меди (И) с двумя пептидными связями, выступающими в роли
полидентатных лигандов:
14
внутрикомплексное соединение
Лабораторная работа 3 Физико-химические свойства белков
Опыт 1 Влияние растворителя на набухание ВМС
Кусочек каучука и небольшое количество желатина помещают в две пробирки
с водой и в две пробирки с толуолом. Оставляют на 1 ч. Через час отмечают, в какой
жидкости произошло набухание. Зарисовать результаты. Сделать вывод.
Опыт 2 Устойчивость растворов ВМС
В пробирку наливают 1 мл золя гидроокиси железа, в другую — 1 мл 0,5% -го
раствора желатина. В обе пробирки добавляют раствор сернокислого аммония до
наступления коагуляции (образования мутности). Записывают число капель,
добавленных в первую и вторую пробирки; сделать вывод.
Опыт 3 Защитное действие растворов высокомолекулярных соединений
В две пробирки наливают по 1 мл золя гидроокиси железа, затем в первую
пробирку добавляют 1 мл 0,5% -го раствора желатина, а во вторую — 1 мл
дистиллированной воды. Пробирки встряхнуть, в каждую пробирку добавлять по
15
каплям раствор сернокислого аммония до появления мутности (коагуляции).
Записать число капель, необходимых для наступления коагуляции. Объяснить
результат и сделать вывод.
Лабораторная работа 4 Переваривание белков в желудочно-кишечном
тракте
Опыт 1 Качественные реакции на свободную соляную кислоту в
желудочном соке
Нормальный желудочный сок всегда содержит свободную соляную кислоту.
Ее можно обнаружить по сильнокислой реакции (pH ниже 3,0). Для открытия
свободной соляной кислоты обычно пользуются индикаторами: конго красным
(зоны перехода окраски pH = 3,0—5,2),парадиметиламиноазобензолом (зоны
перехода окраски pH = 2,9-4,2).
Ход работы:
На красную бумагу конго наносят стеклянной палочкой каплю раствора
соляной кислоты. Развивается синее окрашивание.
Проделывают эту реакцию с желудочным соком. Синее окрашивание
указывает на присутствие свободной соляной кислоты.
Несколько капель раствора соляной кислоты помещают в пробирку и
добавляют 1—2 капли индикатора парадиметиламиноазобензола. Наблюдается
появление красного окрашивания. Проделывают эту реакцию с желудочным соком.
В присутствии свободной соляной кислоты развивается красное окрашивание.
Органические кислоты могут давать с индикатором оранжевый цвет.
Опыт 2 Качественная реакция на молочную кислоту в желудочном соке
Ход работы:
К 15 мл фенола добавляют несколько капель хлорного железа и взбалтывают.
16
Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет. Реактив разводят водой до слабофиолетовой окраски.
В три пробирки помещают во 2 мл этого реактива, затем в 1-ю пробирку —
раствор молочной кислоты по каплям, во 2-ю — желудочный сок, в 3-ю — раствор
соляной кислоты. В первой пробирке появляется зелено-желтое окрашивание во
второй — только в том случае, если в желудочном соке присутствует молочная
кислота, в третьей пробирке раствор обесцвечивается.
Молочная кислота является патологической составной частью желудочного
сока (например, при раке желудка). Кроме того, при отсутствии соляной кислоты в
желудке развиваются процессы брожения (под влиянием микроорганизмов), что
также приводит к появлению молочной кислоты.
Опыт 3 Определение общей кислотности, свободной и связанной соляной
кислоты в одной пробе желудочного сока
Принцип определения.
Раздельное титрование желудочного содержимого в одной пробе достигается
путем применения индикаторов с разными зонами перехода окраски.
Ход работы
Отмеривают пипеткой в колбу 10 мл профильтрованного желудочного сока.
Добавляют 1—2 капли парадиметиламиноазобензола и 2 капли фенолфталеина.
Титруют 0,1 н. раствором едкого натра до желтовато-красноватого окрашивания
(цвет семги) (первый пункт, рН=2,9), далее продолжают титрование до лимонножелтого цвета (второй пункт рН= 4,0), продолжают титрование до появления
розового окрашивания (третий пункт, рН=8,0).
Первый пункт соответствует свободной соляной кислоте, так как при рН=2,9
оттитровывается практически вся свободная соляная кислота (почти 99%). Среднее
арифметическое между вторым и третьим пунктами титрования считают
соответствующим. Третий пункт соответствует общей кислотности желудочного
сока. Исходя из полученных данных, строят график титрования желудочного
17
содержимого, откладывая на оси абсцисс количество мл, пошедшего на титрование
0,1 н. раствора едкого натра, а на оси ординат — значение pH среды. Находят по
графику числовые значения для общей кислотности, связанной, свободной и общей
соляной кислоты. Затем пересчитывают полученные цифры на 100 мл желудочного
сока.
Пример расчета. Допустим, что на титрование от начала затрачено 0,1 н.
раствора едкого натра: до первого пункта - 4,1мл, до второго
третьего
—
4,44
мл,
до
—6,36 мл.
Среднее арифметическое между вторым и третьим пунктом
(4,44 + 6,36)/2=5,40
Следовательно: свободная соляная кислота — 4,1x10 = 41, общая соляная
кислота — 5,4 х 10 = 54, связанная соляная кислота— 54-41 = 13, общая кислотность
— 6,36 х 10 = 63,6.
Сделайте вывод о характере исследованного желудочного сока.
Лабораторная работа 5 Промежуточный обмен аминокислот
Опыт
1
Экспресс-метод
определения
повышенного
содержания
определении
повышенного
фенилаланина в крови (по Ф. Б. Левину)
Принцип методики исследования
Метод
основан
на
хроматографическом
содержания фенилаланина в минимальном объеме крови. Этот метод может найти
широкое
применение
для
ранней
диагностики
фенилкетонурии,
тяжелого
наследственного заболевания, связанного с нарушением обмена фенилаланина. При
фенилкетонурии с мочой выводится большое количество (до 2000 мг/сут.)
фенилпировиноградной кислоты. Нарушение обмена фенилаланина, наблюдаемое
при врожденном слабоумии (фенилпировиноградная олигофрения), сочетается с
высоким содержанием фенилаланина в крови (15—63 мг/100 мл). Поэтому
определение повышенных количеств фенилаланина крови является надежным
18
диагностическим тестом для выявления фенилкетонурии у новорожденных детей
первых двух месяцев. Метод радиальной хроматографии позволяет разделить
аминокислоты сыворотки или плазмы крови.
Ход работы
В смоченную раствором гепарина или цитрата натрия микропробирку вносят
3—4 капли исследуемой крови и центрифугируют 2 мин при 2000—2500 об/мин.
Образовавшуюся плазму (ее можно получить также отстаиванием) в количестве 0,02
мл наносят микропипеткой в центр диска из хроматографической бумаги и
высушивают на воздухе в течение 10 мин. Диск помещают на чашку Петри. Из
небольшого треугольника фильтровальной бумаги скатывают фитилек и вставляют
его в отверстие в центре диска, проделанное иглой. Нижний конец фитилька должен
касаться дна чашки, в которую наливают 10—15 мл растворителя (смесь: бутанол—
уксусная кислота—вода). Разделение проводят до тех пор, пока фронт растворителя
не пройдет расстояние 5 см. Затем хроматограмму сушат в сушильном шкафу при
80°С, проявляют раствором нингидрина, слегка подсушивают на воздухе и вновь
помещают в сушильный шкаф на 10 мин. Параллельно с опытной пробой ставят 2
контрольных стандарта:

с плазмой (0,02 мл) заведомо здорового человека (ребенка), содержащей
примерно 1 мг/100 мл фенилаланина.

с этой же плазмой, на высушенное пятно которой наносят 0,02 мл
стандартного раствора фенилаланина с концентрацией 6 мг/100 мл. Концентрация
этого стандарта соответствует, таким образом, 7 мг/100 мл, и образцы исследуемой
плазмы, дающие окраску такой же иди большей интенсивности, считаются
положительными.
В стандарте №1 (норма) результат отрицательный, так как содержание
фенилаланина здесь ниже 7 мг/100 мл, окрашивается только пятно нанесенной
плазмы и небольшая окружающая часть.
В стандарте №2 и в пробах, взятых у больных фенилкетонурией,
обнаруживается
четкий
ореол
фенилаланина,
центрального ядра.
19
отделенный
просветом
от
В случае положительной пробы целесообразно приводить идентификацию
фенилаланина
повторным
хроматографированием.
Наиболее
близкие
к
фенилаланину по подвижности аминокислоты — ЛЕЙ, ВАЛ, МЕТ — окрашиваются
нингидрином в лилово-красный цвет, который при нагревании хроматограммы
переходит в оранжево-розовые тона, в то время как фенилаланин имеет устойчивую
сине-фиолетовую окраску.
Лабораторная работа 6 Обмен аммиака в организме. Биосинтез мочевины
Опыт 1 Определение мочевины в моче уреазным методом
Сущность
методики
исследования.
Мочевина
под
влиянием
уреазы
разлагается на аммиак и углекислый газ. Аммиак оттитровывают раствором соляной
кислоты.
Ход работы
В две колбы на 100 мл вносят по 5 мл раствора уреазы, одну из них
(контрольную) нагревают до кипения и кипятят в течение 2 мин. Затем в колбы
добавляют по 5 мл фосфатного буфера рН=7,0 и по 5 мл профильтрованной и
разведенной в 10 раз мочи.
Колбы оставляют стоять при комнатной температуре на 1 ч. Затем в обе колбы
прибавляют по 10 капель индикатора метилового красного и титруют 0,1 н.
раствором соляной кислоты до появления оранжевого цвета.
1 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты соответствует 3 мг мочевины. Количество
мочевины, выделяемое из организма за сутки с мочой, рассчитывают по формуле 1:
(1)
где А — количество раствора соляной кислоты, затраченной на титрование;
В — количество раствора соляной кислоты, затраченной на титрование
контрольной пробирки;
10 — разведение мочи;
20
1500 — количество мочи, выделяемое за сутки из организма человека.
мочевина
В сутки с мочой выделяется у человека 25—30 г мочевины и зависит от
количества белка, принимаемого с пищей. При заболеваниях печени суточное
количество мочевины, выводимой мочой, уменьшается.
Лабораторная работа 7 Белки плазмы крови
Опыт 1 Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза
Исследование соотношения белков в сыворотке крови используется с
диагностическими и прогностическими целями.
Распространенным методом разделения белков сыворотки крови является
электрофорез. В настоящее время существуют высокоэффективные разновидности
электрофореза: диск-электрофорез в полиакриламидном геле, электрофорез в
крахмальном блоке, иммуноэлектрофорез. Самым простым по технике выполнения
является электрофорез на бумаге, посредством которого можно разделить белки
сыворотки крови на 5 фракций: альбумины, α1-, α2-, β- и γ-глобулины. Необходимо
помнить, что в каждую фракцию входят несколько индивидуальных белков,
сходных по физико-химическим свойствам.
Сущность метода.
Электрофорезом называется
процесс передвижения
заряженных частиц под действием электрического поля. Разделение белков
основано на различной скорости перемещения белков в электрическом поле в
зависимости от знака и величины электрического заряда и молекулярной массы
белка.
21
Ход работы
На полоске хроматографической бумаги отметить карандашом на концах + и -,
в середине провести поперечную линию. По этой линии нанести микропипеткой
0,01 мл сыворотки крови. Полоску поместить в камеру для электрофореза так, чтобы
+ и - на бумаге соответствовали + и - прибора. Бумагу смочить буферным раствором
с pH = 8,6. В такой же раствор погружены электроды и концы бумаги. Камеру
закрыть крышкой, подключить к электросети. Условия для электрофореза:
напряжение электрического тока 400В, сила тока 10—12А, время разделения 1—1,5
ч. Затем ток отключить, крышку снять, полоску бумаги извлечь из камеры и
высушить в сушильном шкафу при 100— 150°С, чтобы зафиксировать белки на
бумаге. Окраска белковых фракций: бумагу поместить в сосуд с краской (бромфеноловый или амидошварц) на 5 мин, затем избыток краски смыть, опуская
полоску бумаги в разбавленную уксусную кислоту до тех пор, пока промывная
жидкость не будет бесцветной. На бумаге выявляется ряд окрашенных полос,
соответствующих фракциям белков.
Зарисуйте электрофореграмму:
место нанесения сыворотки крови
Рисунок 1 – электрофореграмма с таблицей средней массы и рН белков.
Опыт 2 Определение общего белка в сыворотке крови (по Лоури)
В сыворотке крови здорового человека содержится 65 — 85 г/л белка.
Снижение общего количества белка в сыворотке крови — гипопротеинемия.
Причины гипопротеинемии:
22
1 Снижение процесса биосинтеза белков крови в печени.
2 Недостаток поступления белка пищи.
3 Потеря белка организмом.
Повышение
общего
количества
белка
в
сыворотке
крови
—
гиперпротеинемия.
Причины гиперпротеинемии:
1 Сгущение крови из-за потери жидкости.
2 За
счет
усиления
синтеза
иммуноглобулинов
при
хронических
инфекционных заболеваниях.
3 Появление патологических белков.
Сущность исследования.
В основе определения белка по методу Лоури лежит реакция восстановления
реактива Фолина медными производными белка с образованием окрашенных
продуктов реакции. Максимальная окраска развивается при рН=10. При этом
реактив Фолина реакционно способен несколько секунд, поэтому при добавлении
его в пробу необходимо немедленное перемешивание смеси.
Метод чувствительный, специфичный и удобный. Чувствительность метода
Лоури — 0,2 мкг в 0,005 мл.
Ход работы.
К 0,2 мл сыворотки крови, разведенной физиологическим раствором в 500 раз,
добавляют 1 мл щелочного раствора сернокислой меди. Смесь перемешивают и
через 10 мин добавляют 0,1 мл реактива Фолина, разведенного перед опытом в 2
раза (опытная проба).
В контрольной пробе исследуемую жидкость заменяют физиологическим
раствором. Через 30 мин пробы колориметрируют по правому барабану против
дистиллированной воды в кюветах, толщиной 3 мм, при 750 нм с красным
светофильтром (№8 на ФЭКН-57 или №4 на ФЭК-М).
Расчет.
Вычитают из величины экстинции (экстинции— величины, характеризующие
способность различных веществ поглощать электромагнитные колебания и
23
заменяющие молярные коэффициенты пoгашения для соединений с неизвестными
молекулярными весами) опытной пробы величину экстинции контрольной пробы и
определяют количество белка в пробе по заранее построенной калибровочной
кривой.
Построение калибровочной кривой.
Для построения калибровочной кривой можно использовать раствор любого
белка с известной концентрацией. Готовят основной раствор лиофилизированной
лошадиной сыворотки в 0,9% -м растворе поваренной соли, содержащей 0,5 мг
белка в 1 мл. Из основного раствора путем разведения готовят растворы с
концентрацией белка: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мг в 1 мл. Реакцию Лоури проводят по
описанной выше схеме со стандартными растворами белка и колориметрируют их.
На
основании
данных
колориметрирования
стандартных
растворов
строят
калибровочную кривую, откладывая на оси абсцисс известные концентрации в
миллиграммах в 1 мл, а по оси ординат — значения оптической плотности.
Количество белка в сыворотке крови выражают в процентах и рассчитывают
по формуле 2:
(2)
С — концентрация белка в пробе в миллиграммах на 1 мл;
В — разведение сыворотки крови, в данном случае в 500 раз;
10 — коэффициент пересчета для выражения полученных данных в %.
Определение
содержания
белка
в
сыворотке
крови
и
построение
калибровочной кривой проводят в одинаковых условиях, используя ту же пару
кювет, с помощью которых проводилось построение калибровочной кривой, тот же
ФЭКН-57, то же соотношение реактивов.
Опыт 3 Определение общего белка в сыворотке крови по биуретовой
реакции
24
Сущность метода.
Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием
соединений, окрашенных в фиолетовый цвет (биуретовая реакция).
Ход работы
К 0,1 мл сыворотки прибавляют 5,0 мл рабочего биуретового реактива,
смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (и не позднее, чем через час)
измеряют оптическую плотность на ФЭКе в кювете, толщиной 10 мм, при длине
волны 540—560 нм (зеленый светофильтр) против контроля.
Контроль. К 5,0 мл рабочего биуретового реактива прибавляют ОД мл 0,9% го раствора хлористого натрия, далее обрабатывают как опыт.
Расчет ведут по калибровочному графику. Построение калибровочного
графика.
Таблица 1 – концентрация растворов для построения графика
№ Калибровочный 10%-й
1
2
3
раствор белка
0,4 мл
0,6 мл
0,8 мл
4
1,0 мл
0,9%-й раствор
хлористого натрия
0,6 мл
0,4 мл
0,2 мл
Концентрация белка в
%
4
6
8
10
Из каждого разведения берут 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5,0 мл
рабочего биуретового реактива, через 30—60 мин измеряют на ФЭКе, как в опыте,
против контроля. По полученным данным строят калибровочный график.
Норма 6,5—8,5% (или 65—85 г/л).
Примечание: При содержании белка в сыворотке 10 % сыворотку разводят
физиологическим раствором, а результаты умножают на коэффициент разведения.
Контрольные вопросы к разделу 2:
1
Из каких субстратов и в каких реакциях образуется NH3 в организме
человека? Напишите уравнения этих реакций.
2
Приведите уравнения реакций основных путей обезвреживания аммиака в
клетках тканей (кроме гепатоцитов).
25
3
Напишите уравнения реакций, ведущих к биосинтезу мочевины в
гепатоцитах печени. Назовите ферменты процесса.
4
Принципы методов определения мочевины в биологических жидкостях.
5
Каков
принцип
метода
разделения
белков
сыворотки
крови
электрофорезом?
6
Укажите основные причины распада белков в организме человека.
7
Что называют катепсинами?
8
Какие катепсины относятся к экзопептидазам?
9
Какие катепсины относятся к эндопептидазам? Механизм их действия.
10 Принцип метода количественного определения белка в сыворотке крови по
методу Лоури.
11 Принцип метода количественного определения белка в сыворотке крови
биуретовой реакцией.
Раздел 3 Углеводы и их обмен
Лабораторная работа 1 Структура, свойства, функции углеводов
Опыт 1 Доказательство восстанавливающей способности у глюкозы и
отсутствие ее у фруктозы
а)
Реакция Троммера
В большую пробирку поместите 0,5 мл 0,5%-го раствора глюкозы и 6—8
капель 2н. NaOH. Затем по каплям добавляйте 0,2н. раствор C11SO4 пока не
прекратится его растворение. Осторожно нагрейте пробирку на спиртовке. Голубой
не растворимый в воде осадок гидрата окиси меди постепенно переходит в желтый,
а затем в красный осадок закиси меди. Аналогичный опыт проделайте с 0,5% -м
раствором фруктозы.
26
красный цвет
б)
Реакция «серебряного зеркала»
В большую пробирку поместите 3 капли 0,2 н. раствора AgN03, 5 капель 2 н.
NaOH и добавляйте по каплям 2 н. NH4OH до полного растворения образующегося
осадка. Полученный бесцветный раствор — аммиачный раствор гидрата окиси
серебра:
AgN03 + NaOH — AgOH + NaN03,
AgOH + 2 NH4OH -> [Ag(NH3)
2
]OH + H20, аммиачный раствор серебра
[Ag(NH3)2]OH + 3H20 — Ag20 + 4 NH4OH.
Затем к аммиачному раствору гидрата окиси серебра добавьте 3—4 капли
0,5% -го раствора глюкозы и слегка подогрейте на спиртовке. Металлическое
серебро выделится либо в виде осадка черного цвета, либо в виде блестящего
зеркального налета, если стенки пробирки химически чисты (пробирки помыты с
помощью «хромовой смеси», а не моющими синтетическими средствами
порошками).
Аналогичный опыт проделайте с 0,5%-м раствором фруктозы.
Опыт 2 Открытие фруктозы (р. Селиванова)
27
В первую пробирку вносят 10 капель 0,5% -го раствор ра фруктозы, во вторую
пробирку — 10 капель 0,5% -ш раствора глюкозы. В обе пробирки добавляют в
равных объемах свежеприготовленный реактив Селиванова (0,5% -й раствор
резорцина в 20%-ой соляной кислоте). Осторожно нагрейте на спиртовке. В
пробирке с фруктозой постепенно возникает красное окрашивание.
На первой стадии образуется оксиметилфурфурол, который во второй стадии,
конденсируясь с резорцином, дает красное окрашивание:
2
Во второй стадии реакции оксиметилфурфурол, конденсируясь с
резорцином, дает красное окрашивание.
Лабораторная работа 2 Переваривание углеводов в ж. к. т.
Опыт 1.Кислотный гидролиз крахмала
В большую пробирку с пипеткой помещают 1 мл 0,1% -го раствора крахмала и
20 капель 2 н. раствора серной кислоты.
Нагреть на водяной бане в течение 10 мин, отбирая пипеткой каждые 2 мин в
маленькие пробирки 3—4 капли гидролизата и добавляя в них по 1 капле йода.
Обратить внимание на изменение окраски гидролизата с йодом в ходе
гидролиза. К последней пробе в большой пробирке добавить 2 капли 2 н. раствора
сульфата меди, а затем добавлять по каплям 2 н. раствора гидроксида натрия до
образования растворимого темно-синего соединения. О чем говорит эта реакция?
Далее полученный раствор нагреть (реакция Троммера). Появляется желтокрасное окрашивание (положительная реакция Троммера). О чем говорит эта
реакция? По результатам реакций сделать заключение в строении крахмала.
28
Опыт 2 Выделение гликогена из печени
Ход работы.
0,5.г печени животного помещают в ступку, добавляют 3 мл 5% -го раствора
ТХУ и растирают пестиком 10 мин. Затем к экстракту добавляют 5 мл
дистиллированной воды, суспензию перемешивают и фильтруют через бумажный
фильтр, смоченный водой. С фильтратом проделывают реакцию с раствором
Люголя. Сделать соответствующий вывод.
Лабораторная работа 3
Расщепление глюкозы по гликолитическому
дихотомическому пути
Опыт1
Определение концентрации глюкозы в крови бензокаиновым
методом
Концентрация глюкозы определяется по оптической плотности окрашенного
раствора,
образующегося
при
взаимодействии
глюкозы,
содержащейся
в
безбелковом фильтрате крови, с бензокаиновым реактивом.
Ход работы
0,1 мл безбелкового фильтрата крови переносят микропипеткой в сухую
пробирку, приливают 2 мл бензокаинового реактива с помощью градуированной
пробирки (соблюдать осторожность, так как реактив содержит концентрированную
уксусную кислоту), нагревают в кипящей водяной бане 15 мин. Развивается желтокоричневая окраска.
После охлаждения раствора определяют его оптическую плотность на
фотоэлектроколориметре против дистиллированной воды при синем светофильтре,
в кюветах толщиной 5 мм. Используя калибровочный график, построенный по
стандартному раствору глюкозы, определяют концентрацию глюкозы в исследуемой
крови.
Делают заключение о количестве глюкозы в исследуемой пробе крови.
29
Лабораторная работа 4 Расщепление глюкозы по пентозофосфатному
пути. Глюконеогенез
Опыт 1 Качественная реакция на рибозу
Ход работы
К 0,5 мл 0,1%-го раствора РНК добавляют равный объем орцинового реактива
(1 г орцина в 500 мл 30% -го НСl + 5 мл 10% -го FeCl). Кипятят 10 мин. на кипящей
водяной бане.
В присутствии рибозы развивается зеленое окрашивание.
Под влиянием концентрированной НС1 от рибозы отщепляются 3 молекулы
воды и образуется метилфурфурол, который с орцином дает зеленое окрашивание.
Лабораторная работа 5 Биохимические изменения при нарушении обмена
углеводов
Опыт 1 Исследование функции поджелудочной железы методом сахарной
нагрузки
Определение количества глюкозы в крови имеет огромное значение. Оно
производится для диагностики сахарного диабета.
Цель работы — проследить за содержанием глюкозы в крови в динамике
после сахарной нагрузки, т. е. изучить толерантность организма к глюкозе.
Ход работы
Натощак берут 0,1 мл крови из пальца и определяют в ней содержание
глюкозы бензокаиновым методом (см. ниже).
30
Затем дают выпить раствор глюкозы или тростникового сахара из расчета
1,0—1,5 г на 1 кг массы тела обследуемого.
Через 30, 60 и 120 мин после приема сахара снова определяют содержание
глюкозы бензокаиновым способом: 0,1 мл безбелкового фильтрата крови переносят
микропипеткой в чистую сухую пробирку, приливают 2 мл бензокаинового реактива
с помощью градуированной пробирки (соблюдать осторожность, так как реактив
содержит уксусную кислоту), нагревают в кипящей водяной бане 15 мин.
Развивается
желто-коричневое
окрашивание.
После
охлаждения
раствора
определяют его оптическую плотность на фотоэлектроколориметре против дистиллированной воды при светофильтре №4. Используя калибровочный график,
построенный по стандартному раствору глюкозы, определяют концентрацию
глюкозы в исследуемой крови.
Результаты вносят в таблицу и на их основании строят сахарные кривые,
откладывая на оси абсцисс время взятия крови, а на оси ординат — найденное
содержание Сахара в крови (ммоль/л):
Таблица 2 – образец таблицы для построения сахарных кривых
Метод
Масса
Концентрация глюкозы в крови
количественного принятой
до
после нагрузки глюкозой
определения
глюкозы нагрузки
через
через
через
глюкозы
глюкозой
30 мин 60 мин 120 мин
При анализе сахарных кривых обращают внимание на следующие параметры:
а)
начальное содержание сахара в крови;
б)
быстроту и высоту подъема;
в) продолжительность гиперглюкоземии и характер ее
снижения.
Кривая здорового человека отличается быстрым подъемом, максимальный
подъем наблюдается около 30 мин, количество сахара может при этом удвоиться.
При сахарной болезни уровень сахара в крови возрастает дольше и достигает
максимума через 3(У—60) мин или еще позднее, причем достигает очень высоких
цифр — до 14 ммоль/л и более.
Понижение кривой имеет также диагностическое значение. У здоровых людей
31
количество сахара уменьшается быстро и через 1,5—2,5 ч возвращается к исходной
величине, а иногда оказывается и низке ее. При диабете повышение держится 5—7 ч
и возвращается к исходной величине очень медленно. При сахарном диабете
происходит снижение толерантности организма к глюкозе.
График 1 - динамика изменений концентрации глюкозы в крови в норме.
Контрольные вопросы к разделу 3:
1
Какие виды гиперглюкоземии вам известны?
2
Каковы причины патологической гиперглюкоземии?
3
В чем причина возникновения инсулинзависимого сахарного диабета?
4
Каковы биохимические изменения углеводного обмена ври голодании?
5
Каковы
биохимические
причины
возникновения
наследственных
заболеваний: а) гликогеиозов?
б)
агликогенозов? в) фруктоземии? г) галактоземии?
6 Принцип метода определения толерантности к глюкозе.
7
Напишите структурными формулами реакции окислительной ветви ПФП.
8
Укажите необратимые реакции и ферменты глюконеогенеза.
9
Принцип обнаружения рибозы в растворе.
10 Напишите структурными формулами схемы: а) аэробного гликолиза (10
стадий)? б) анаэробного гликолиза (11 стадий)?
11 Назовите 3 фермента, регулирующих необратимые реакции гликолиза.
32
12 Какова судьба лактата в организме человека?
13 Принцип
метода
количественного
определения
глюкозы
в
крови
бензокаиновым методом.
14 Назовите основной углевод пищи человека. Его строение?
15 Какова роль гликогена в организме человека?
16 В чем сходство и различие в строении крахмала и гликогена?
17 Принципы методов обнаружения: а) крахмала в растворе? б) гликогена? в)
продуктов гидролиза крахмала?
Раздел 4. Липиды и их обмен
Лабораторная работа 1 Структура и функции липидов
Опыт 1 Определение непредельности высших жирных кислот
Ход работы
В маленькую пробирку поместите 8—10 капель бромной воды и 2—3 капли
подсолнечного масла (содержит большое количество непредельных жирных
кислот). Взболтайте. Происходит обесцвечивание бромной воды:
Степень непредельности жиров, обусловленную присутствием непредельных
жирных кислот, количественно определяют по присоединению галогенов по месту
двойной связи (йода, брома).
Опыт 2 Омыление жиров
Ход работы
33
В небольшую фарфоровую чашечку поместите 0,5 мл касторового масла и 4
капли 35%-го раствора едкого натрия. Стеклянной палочкой хорошенько
размешайте щелочь с маслом до получения однородной эмульсии. Затем поставьте
чашечку на электрическую печь и при незначительном подогревании продолжайте
помешивать, пока не получится однородная, прозрачная, слегка желтоватая
жидкость. Затем добавьте 2 мл дистиллированной воды и вновь нагрейте, тщательно
перемешивая до полного упаривания воды. Снимите чашечку с электрической
печки.
Получится кусочек твердого белого мыла.
Опыт 3 Обнаружение желчных кислот в моче
Проба Гея
Сущность реакции: желчные кислоты являются поверхностно-активными
веществами (ПАВ), снижающими поверхностное натяжение мочи, поэтому порошок
серы, помещенный на поверхность мочи, тонет.
Ход работы
В пробирку налить 3—5 мл мочи, добавить 1 лопаточку порошка серы. Не
взбалтывать!
В присутствии желчных кислот в моче порошок серы тонет.
Проба Петенкоффера
Сущность реакции: проба основана на образовании окрашенного продукта при
взаимодействии желчных кислот и оксиметилфурфурола. Последний образуется из
сахарозы при действии концентрированной серной кислоты.
Ход работы
34
В пробирку налить 5 мл мочи, добавить 10 капель 5%-го раствора сахарозы и
осторожно, по стенке пробирки, добавить 10 капель концентрированной H2S04. Не
взбалтывать! Оставить на 10—15 мин пробирку в штативе.
При наличии в моче желчных кислот на границе раздела жидкостей
образуется красно-фиолетовое кольцо.
Лабораторная работа 2 Промежуточный обмен высших жирных кислот
Опыт 1 Экстракция липидов сыворотки крови
Цель: усвоить метод извлечения липидов из сыворотки и ознакомиться с
ходом анализа. Липиды сыворотки экстрагируют органическими растворителями.
Метод заключается в разрушении липидно-белковых комплексов полярным
растворителем
(например,
метанолом),
что
способствует
последующему
экстрагированию липидов неполярным растворителем (петролейным эфиром,
этиловым
эфиром,
хлороформом).
Полярные
и
неполярные
растворители
комбинируются в смеси (например, хлороформ: метанол или этанол: эфир).
1 мл сыворотки помещают в пробирку размером 15x250 мм, заливают 20 мл
смеси хлороформ: метанол (2:1) и тщательно встряхивают в течение часа. Затем
производят расслоение смеси на хлороформную и метаноловую фазы, добавляя в
нижнюю часть пробирки 0,2 объема воды или солевого раствора (0,1% -го раствора
NaCl или СаС12);
При использовании для разделения солевого раствора в верхнюю фазу
переходят все нелипидные примеси и 1 % ганглиозидов, а при использовании воды
— все нелипидные примеси, 95% ганглиозидов и незначительное количество других
липидов. В нижней хлороформной фазе содержатся все липидные компоненты.
После полного расслоения, которое длится 12—15 часов, верхнюю фазу осторожно
отсасывают пипеткой при помощи водоструйного насоса. Нижнюю фазу переносят
в пробирку или в колбу с притертой пробкой. Липидный экстракт в дальнейшем
может быть использован для количественного определения липидных компонентов.
35
Лабораторная работа 3 Обмен холестерина в организме человека
Опыт 1 Определение общего холестерина в сыворотке крови, основанное
на реакции Либермана—Бурхарда (метод Илька)
Принцип метода.
При
добавлении
к
сыворотке
крови
уксусного
ангидрида
и
концентрированной серной кислоты жидкость окрашивается последовательно в
красный, синий и, наконец, зеленый цвет. Реакция обусловлена образованием
сульфокислоты холестерилена зеленого цвета.
Ход определения.
В сухую пробирку помещают 2,1 мл реактива Либермана—Бурхарда
(содержит уксусный ангидрид и серную кислоту), очень медленно по стенке
пробирки добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови, энергично
встряхивают пробирку, термостатируют 20 мин при 37°С. Развивается изумруднозеленая окраска, которую колориметрируют на ФЭКе при красном светофильтре
(630—690 нм) против реактива Либермана— Бурхарда. Полученную на ФЭКе
оптическую плотность используют для определения концентрации холестерина по
стандартному калибровочному графику.'
Калибровочный
график
строят
по
величинам
оптической
плотности
приготовленных стандартных растворов холестерина, которые обрабатывают так
же, как исследуемую сыворотку крови.
36
Лабораторная работа 4 Обмен липопротеинов
Опыт 1 Разделение липопротеинов сыворотки крови методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле
Принцип метода.
Разделение
липопротеинов
(ЛП)
основано
на
их
различной
электрофоретической подвижности, определяемой величиной заряда апобелков, а
также размерами частиц ЛП, которые по-разному проходят через трехслойное
молекулярное сито полиакриламидного геля (ПААГ). Чем выше заряд и меньше
размер ЛП, тем быстрее он перемещается в электрическом поле в ПААГ сверху
вниз. Характеристика геля. Прозрачный гидрофильный гель ПАА с pH = 8,9
получают полимеризацией двух мономеров акр ил амида и метиленбисакриламида в
присутствии катализаторов и буферного раствора. Полимер геля готовят в
стеклянных трубочках, поставленных в штативе вертикально, в виде трех слоев с
разной концентрации ей полимера: нижний гель — 10%, средний — 5, верхний 3%.
Концентрация
полимера
обусловливает
разный
размер
пор,
образуя
трехслойное молекулярное сито: верхний гель задерживает самые крупные ЛП —
хиломикроны (ХМ), на границе верхнего и среднего гелей задерживаются ЛОНП
(пре-Р-ЛП), на границе среднего и нижнего гелей задерживаются ЛНП (Р-ЛП), в
нижний гель проходят ЛВП и НЭЖК + альбумины (узкая, самая подвижная
фракция).
37
Подготовка сыворотки крови. 0,3 мл сыворотки крови в пробирке смешивают
с 0,15 мл красителя Судана черного и 0,5 мл раствора сахарозы, выдерживают 1 ч
при комнатной температуре. Для исследования помещают 0,05 мл окрашенной
сыворотки в одну трубочку на верхний гель. Судан черный, адсорбируясь на
липидах, окрашивает ЛП в сине-черный цвет.
Прибор
для
диск-электрофореза
состоит
из
двух
камер,
которые
устанавливают одну над другой. В дне верхней камеры имеются отверстия, в
которых герметически укрепляют трубочки с гелем и сывороткой крови таким
образом, чтобы нижние концы трубочек опустились в нижнюю камеру. В верхнюю
и нижнюю камеры наливают электродный буфер с pH = 8,9, чтобы верхние и
нижние концы трубочек были погружены в буфер на 2—3 см и чтобы в них не было
пузырьков воздуха. В центре камер укрепляют платиновые электроды: верхний — () катод, нижний — (+) анод. Подключают камеру к блоку электропитания из расчета
5—6 мА на одну трубочку. Электрофорез длится 1—1,5 ч, за это время окрашенные
липопротеины располагаются так, как изображено на рисунке.
Количественный анализ ЛП проводят путем денситометрии (по плотности
окраски) прибором денситометром. Ориентировочную оценку липопротеинограммы
можно провести визуально.
Лабораторная работа 5 Биохимические изменения в организме человека
при нарушении обмена липидов. Метаболизм кетоновых тел
Опыт 1 Качественные реакции на кетоновые тела в моче Проба Либена
Реакция основана на свойстве ацетона превращаться в йодоформ в
присутствии йода в щелочной среде.
К 1 мл исследуемой мочи добавляют
несколько капель раствора Люголя (йод в растворе йодистого калия) и несколько
капель 10% -го раствора гидроксида натрия. При наличии ацетона в моче появляется
помутнение за счет образования йодоформа, имеющего характерный запах:
38
Проба Легаля
Реакция основана на том, что ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной
среде образуют с нитропруссидом натрия комплексные анионы оранжево-красного
цвета, переходящего в вишнево-красный при подкисленная концентрированной
уксусной кислотой.
К 1 мл мочи добавляют несколько кристаллов нитропруссида натрия и 3—4
капли 10% -го раствора гидроксида натрия. При кетонурии появляется оранжевое
окрашивание, которое превращается в вишневое, при добавлении 5—8 капель
концентрированной уксусной кислоты.
Проба Герхардта
Енольная форма ацетоуксусной кислоты, взаимодействуя с хлорным железом,
образует комплексное соединение вишнево-красного цвета.
К 1 мл мочи добавляют несколько капель хлорного железа. При наличии в
моче ацетоацетата появляется вишнево-красное окрашивание.
39
Лабораторная работа 6 Биологические мембраны. Перекисное окисление
липидов
Опыт 1 Количественное определение активности каталазы крови (по
Баху и Зубковой)
Каталаза — антиоксидантный фермент, гемопротеин, разлагает пероксид
водорода на воду и кислород.
Активность каталазы выражается каталазным числом — количеством мг
перекиси водорода, которое может разложить 1 мкл крови. В норме каталазное
число равно 10—16 ед. Активность каталазы снижается при некоторых
заболеваниях печени, в частности при злокачественных новообразованиях.
Существует редкое наследственное заболевание акаталазия, связанное с отсутствием
фермента каталазы в организме. Клинические проявления наблюдаются со стороны
слизистой полости рта — альвеолярная пиорея и пародонтоз. Проявлений со
стороны крови не наблюдается, так как пероксид водорода может также разлагаться
глутатионпероксидазой.
Сущность
метода.
Раствором
перманганата
калия
оттитровывают перекись водорода, оставшуюся после действия каталазы. Общее
количество взятой в опыт перекиси водорода определяют в контрольной пробе,
поставленной в тех же условиях, что и опыт, но с каталазой, денатурированной при
кипячении. По разности двух титрований определяют количество перекиси
водорода, разложенное каталазой.
Ход работы
В мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды, вносят
туда 0,1 мл исследуемой крови, предварительно обтерев кончик пипетки от остатков
крови. Доливают колбу до метки водой и перемешивают содержимое; этот основной
раствор крови (1:1000) используют для определения.
В две колбы наливают по 7 мл дистиллированной воды и отмеряют в них по 1
мл основного раствора крови. Содержимое контрольной пробы кипятят 2 —3 мин. В
обе колбы вносят по 2 мл 1% -го раствора перекиси водорода и оставляют при
40
комнатной температуре на 30 минут. Затем приливают в каждую пробу по 5 мл 10%го раствора серной кислоты и оттитровывают содержимое их 0,1 ммоль/л раствором
перманганата калия до появления розового цвета.
Расчет.
1 мл 0,1 ммоль/л раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг перекиси
водорода. Умножая эту величину на разность в результатах титрования контроля
и опыта, получают количество мг перекиси водорода, которое было разложено
1 мкл крови.
Контрольные вопросы к разделу 4:
1
Каков механизм образования АФК в организме человека?
2
Каково значение ПОЛ в биологический процессах в организме человека?
3
Каково
значение
усиления
ПОЛ
в
патологических
процессах
(атеросклероз, канцерогенез, радиационные поражения и др.)?
4
Что представляют собой ферментная и неферментная антиоксидантные
системы? Механизмы их действия.
5
Каков принцип метода определения активности каталазы крови?
6
Каково биологическое значение ХС в организме человека?
7
Напишите
схему
биосинтеза
ХС
в
организме
человека,
указав
регуляторный фермент.
8
Каково биологическое значение, ЛХАТ? АХАТ?
9
Приведите схему метаболизма ХС в организме человека.
10 Принцип метода определения общего ХС в сыворотке крови.
11 Каково диагностическое значение количественного определения ХС в
сыворотке крови человека?
41
Раздел 5 Биохимия крови
Лабораторная работа 1 Биохимия крови. Ферменты крови
Опыт 1 Микрометод определения активности липазы сыворотки крови
Активность липазы возрастает при острых воспалительных процессах
поджелудочной железы, хронических панкреатитах, опухолях поджелудочной
железы.
Субстратом в опыте являются эмульсии масел.
Ход работы
В две пробирки наливают по 0,25 мл воды, по 0,3 мл стабилизированной
эмульсии оливкового масла или суспензии сухих сливок и по 0,1 мл трисбуфера для
создания pH в среде 8,0. В опытную пробирку добавляют 0,1 мл сыворотки крови.
Вторая пробирка служит контролем. Содержимое пробирок перемешивают и
помещают в термостат при 37°С на 60 мин. После этого в обе пробирки наливают по
0,3 мл 95% Аго этанола для прекращения действия фермента, а в контрольную
пробирку—0,1 мл сыворотки крови. Вводят по 1 капле тимолфталеина,
перемешивают и титруют освободившиеся жирные кислоте 0,05 н. раствором едкого
натра до светло-голубой окраски. Активность липазы находят по разности в
количестве щелочи, пошедшей на титрование опытной и контрольной проб по
формуле 3:
(3)
х — единицы активности липазы в 1 мл сыворотки крови;
А — количество миллилитров 0,05 н. раствора едкого натра, пошедших на
титрование опыта;
В — количество миллилитров 0,05 н. раствора едкого натра, пошедших на
титрование контроля;
0,1.—взятое в опыт количество сыворотки крови.
У здорового человека активность липазы составляет от 0,5 до 1,5 единицы.
42
Лабораторная работа 2 Биохимия эритроцитов
Опыт 2 Спектральный анализ пигментов крови
Сущность методики исследования.
Если видимый свет проходит через слой окрашенного вещества, то последнее
избирательно поглощает лучи определенной длины волны и проходящий свет дает
характерный спектр поглощения. Определенные полосы спектра поглощения
представляются в виде темных полос, соответствующих лучам, которые поглотил
исследуемый пигмент. Так как определенному пигменту соответствует и
определенный спектр поглощения, то он может служить для целей анализа на
присутствие того или иного пигмента. Для опыта оснащение: спектроскоп.
Ход работы
Берут микропипеткой 0,2 мл крови из пальца и выливают в пробирку,
содержащую 9,8 мл дистиллированной воды, разливают полученный раствор крови
в 4 пробирки:
Содержимое первой пробирки разбавляют вдвое водой и наблюдают спектр
поглощения оксигемоглобина. Видны 2 полосы (темные) в желто-зеленой части
спектра. Зарисовать.
Во вторую пробирку прибавляют 2—3 капли реактива Стокса. Двухвалентное
железо, являющееся действующим началом реактива Стокса, легко окисляется,
отнимая от оксигемоглобина кислород, превращая его в гемоглобин. Наблюдают
одну широкую полосу в желто-зеленой части спектра, характерную для
гемоглобина. Зарисовать.
В
третью
пробирку
добавляют
2—3
капли
свежеприготовленного,
насыщенного раствора железосинеродистого калия. Жидкость приобретает краснобурую окраску. Наблюдают 3 полосы поглощения: две в желто-зеленой, одну — в
краевой, характерных для метгемоглобина. Зарисовать.
В четвертой пробирке через раствор крови пропускают в течение 10 мин (под
тягой) светильный газ, который обычно содержит в своем составе оксид углерода
43
(U). Образовавшийся карбоксигемоглобин придает крови цвет красной смородины.
Его спектр поглощения имеет две полосы в желто-зеленой части спектра, сдвинутые
по сравнению со спектром поглощения оксигемоглобина к фиолетовой части
спектра. В отличие от оксигемоглобина при добавлении реактива Стокса
образование восстановленного гемоглобина не происходит.
Лабораторная работа 3 Гемоглобин, строение, свойства, функции. Обмен
железа
Опыт 1 Определение гемоглобина в крови гемоглобинцианидным
методом
Принцип метода:
Взаимодействие гемоглобина с ацетонциангидрином и красной кровяной
солью в щелочной среде приводит к образованию комплекса оранжевого цвета,
концентрация которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина.
Состав трансформирующего реактива:
 Ацетонциангидрин (нитрил-2-оксиизомасляная кислота);
 K3[Fe(CN)6] — красная кровяная соль;
 Na2СО3 —гидрокарбонат натрия.
Ход работы
Перед определением тщательно взбалтывают кровь и отбирают в чистую
пробирку микропипеткой 0,02 мл крови. Затем вносят с помощью мерной пробирки
5 мл трансформирующего реактива, тщательно перемешивают и через 10 мин
измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны
500—560 нм (зеленый светофильтр) в кюветах толщиной 1 см, против контрольной
пробы — дистиллированной воды, так как экстинкция воды практически равна
экстинкции трансформирующего реактива. Концентрацию гемоглобина определяют
по калибровочному графику.
Сделать заключение о количественном содержании гемоглобина в крови.
44
Опыт 2 Бензидиновая проба на кровь
Гемоглобин обладает способностью разлагать перекись водорода на воду и
атомарный кислород, который является активным окислителем. В присутствии
кислорода бензидин окисляется с образованием продуктов, имеющих синюю или
зеленую окраску.
Бензидиновая проба возможна при большом разведении крови, однако она
недостаточно специфична.
Ход работы
В пробирку приливают 5 капель разведенной дефибринированной крови и
такое же количество раствора бензидина, затем добавляют 5 капель раствора
перекиси водорода. Появляется синее или зеленое окрашивание.
Опыт 3 Получение кристаллов гемина
При действии на гемоглобин кислот небелковая часть — гем — отщепляется и
в присутствии солей переходит в гемин, в котором железо трехвалентное.
Характерный вид кристаллов гемина служит признаком присутствия гемоглобина.
Цель работы.
Изучить условия получения кристаллов гемина и научиться обнаруживать их
под микроскопом. Сущность методики исследования О наличии кровяного пятна
судят по образованию из гемоглобина, в присутствии ледяной уксусной кислоты и
хлористого натрия после нагревания, — мельчайших, ромбоидальных кристаллов
гемина бурого цвета, иногда сложенных в виде звездочек, чаще разбросанных в виде
палочек.
Ход работы.
45
Наносят на предметное стекло каплю крови, размазывая ее по стеклу (или
берут несколько крупинок сухой крови).
Осторожно подсушивают кровь (если взята капля), держа стекло высоко над
пламенем. Прибавляют к подсушенной крови 1—2 капли ледяной уксусной
кислоты, накрывают покровным стеклом и осторожно нагревают до закипания.
Вводят пипеткой под покровное стекло еще 1—2 капли ледяной уксусной
кислоты и рассматривают выделившиеся кристаллы гемина под микроскопом при
большом увеличении (не менее 500 раз).
Опыт 4 Количественное определение кальция в сыворотке крови
комплексонометрическим методом
В
сыворотке
здоровых
людей
содержится
2,29-2,99
ммоль/кальция.
Содержание кальция в сыворотке понижается при рахите и гипофункции
паращитовидных желез Оно повышается при остеомиелите, в некоторых случаях
пародонтоза. Быстрым методом количественного определения кальция является
комплексонометрический. В качестве комплексона при определении кальция
применяют натриевую соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) (эту соль называют
также трилон Б):
Наиболее доступным индикатором для определения кальция является
мурексид. В присутствии ионов кальция мурексид окрашен в оранжевый цвет, а
после того как весь кальций оттитрован — в сине-фиолетовый. Недостатком этого
индикатора является не очень четкий переход окраски в точке эквивалентности.
Сущность методики исследования.
Метод основан на титровании кальция растворами комплексонов, которые
связывают кальций в практически недиссоциирующий комплекс. Момент полного
связывания кальция узнается по изменению цвета индикатора. При определении
46
кальция применяют двухцветные индикаторы. В присутствии ионов кальция они
окрашены в один цвет, а в отсутствии их — в другой. Изменение цвета такого
индикатора при титровании указывает на точку эквивалентности. Зная объем
раствора комплексона, израсходованный на титрование, и его нормальность, легко
вычислить содержание кальция в сыворотке крови.
Ход работы
В колбу наливают 25 мл воды и вносят пипеткой 0,25 мл 9 м раствора едкого
натра. Шпателем добавляют немного мурексида. Пипеткой вносят в колбу 1 мл
исследуемой сыворотки. Титруют из бюретки 0,002 м раствором ЭДТА до перехода
окраски из оранжевой в сине-фиолетовую. Содержание кальция в сыворотке
вычисляют по формуле 4:
(4)
0,002 — молярность раствора ЭДТА,
40,08 — атомный вес кальция,
25 - коэффициент для перехода к ммол/л,
1- объем сыворотки, взятой для анализа, мл,
А - объем ЭДТА, израсходованный на титрование, мл.
Лабораторная работа 4 Буферные системы крови
Опыт 1 Приготовление буферных систем
Ход работы.
В пять пробирок помещают различные объемы 0,1н раствора уксусной
кислоты и 0,1 н. раствора уксуснокислого натрия, как указано в таблице № 1.
Для каждого приготовленного раствора рассчитывают pH теоретически по
формуле 5:
(5)
где рК уксусной кислоты — 4,7.
47
Полученные данные вносят в таблицу.
Затем pH приготовленных ацетатных буферных смесей измеряют на рН-метре
(или колориметрическим методом Михаэлиса). Полученные данные вносят в
таблицу. Сделать выводы о зависимости величины pH буферного раствора от
соотношения взятых компонентов.
Таблица 3 – зависимость величины рН буферных растворов
№ пробирки
1
2
3
4
5
Кол-во 0,1 н.
уксусной
кислоты
0,5
1
5
9
9,5
Кол-во 0,1н.
ацетата
натрия
9,5
9
5
1
0,5
рН
теоретически
рН
практически
Опыт 2 Свойства буферных растворов
Ход работы
Влияние разбавления на pH буферных систем.
а)
В три пробирки наливают по 1 мл буфера с одним и тем же значением
pH. Затем во вторую пробирку добавляют 1 мл воды, а в третью пробирку 2 мл
воды. Затем во все три пробирки добавляют по 1 капле универсального индикатора
из расчета 1 капля на 1 мл раствора. Обратить внимание на окраску индикатора во
всех трех пробирках. Результаты оформить в виде таблицы:
Таблица 4 - образец таблицы для записи результатов
№
пробирки
1
2
3
б)
Кол-во
буферного
раствора,
мл
1
1
1
Кол-во
воды, мл
1
2
Разбавление,
Кол-во
Полученная
раз
универсального
окраска
индикатора,
капли
1
2
2
3
3
Взять 3 колбочки на 100 мл. В первую колбу внести 10 мл буферного
раствора, во вторую — 2 мл буферного раствора, в третью — 1 мл буферного
48
раствора, затем в первую колбу — 10 мл воды, во вторую — 18 мл поды, в третью
— 99 мл воды. Измерить pH полученных смесей на рН-метре. Данные внести в
таблицу:
Таблица 5 – рН полученных смесей
№ колбы
1
2
3
Кол-во
буферного
раствора, мл
10
2
1
Кол-во воды,
мл
Разбавление,
раз
10
18
99
2
10
100
рН раствора
Сделать соответствующие выводы о влиянии разбавления на pH буферных
смесей.
Действие небольших количеств сильных кислот и щелочей на pH буферных
растворов.
Ход работы.
В три стаканчика вносят по 20 мл буферного раствора с одним и тем же
значением pH. Затем во второй стаканчик добавляют 1 мл 0,01 н. раствора НС1, в
третий стаканчик — 1 мл 0,01 н. раствора NaOH. Измеряют pH полученных смесей
на рН-метре. Аналогичные опыты проделывают, взяв вместо буферного раствора
водопроводную воду.
Таблица 6 - данные для получения смеси
№ стакана
1
2
3
4
5
6
Кол-во
буферного
раствора, мл
20
20
20
-
Кол-во
0,01н.
0,01н.
рН
водопроводной соляная
гидроксид растворов
воды, мл
кислота, мл натрия,
мл
1
20
20
1
20
1
Сделать соответствующий вывод.
49
Опыт 3 Определение буферной емкости сыворотки крови
Ход работы
Берут две колбы, в одну из них наливают 2 мл сыворотки крови, разведенной в
10 раз водой, во вторую— 2 мл фосфатного буфера pH = 7,4, разведенного в 10 раз
водой. Затем в обе колбы добавляют по 2 капли индикатора фенолфталеина.
Содержимое колбы с фосфатным буфером титруют 0,1 н. NaOH до появления
малиново-красного окрашивания (pH = 9,0). Содержимое колбы с сывороткой
титруют 0,1 н. NaOH до достижения такой же окраски. Расчет производят по
формуле 6:
(6)
А — мл сильной щелочи, пошедшей на титрование;
10 — разведение сыворотки;
н — молярная масса эквивалента щелочи;
рНо — водородный показатель до начала титрования (рНо=7,4);
рНх— водородный показатель после окончания титрования (pHх = 9);
2 - объем взятой сыворотки.
Сравнить буферную емкость сыворотки крови с буферной емкостью
фосфатного буфера и сделать соответствующие выводы.
Лабораторная работа 5 Свертывание крови. Антисвертывающие системы
Опыт 1 Свертывание крови (по Сухареву)
В капилляр для определения СОЭ набирают кровь до метки. Наклонными
плавными движениями перемещают кровь по капилляру. По секундомеру отмечают:
начало свертывания крови — появление первых нитей фибрина; окончание
свертывания крови — полное свертывание крови (кровь не движется по капилляру
50
при его перемещении).
У здорового человека; начало свертывания — 2 мин, окончание свертывания
— 5 мин.
Сделать
заключение
о
состоянии
первичного
гемостаза
у
данного
обследуемого.
Контрольные вопросы к разделу 5:
1
Что называют «буферными системами»? Их биологическое значение.
Примеры.
2
Какие буферные системы находятся в крови человека? Напишите их
формулы.
3
Какие
показатели
характеризуют
кислотно-основное
состояние
в
организме человека?
4
Что называют: а) метаболическим ацидозом? б) респираторным ацидозом?
в) метаболическим алкалозом? г) респираторным алкалозом? Примеры заболеваний
с нарушениями КОС.
5
Принцип метода определения буферной емкости сыворотки крови.
6
Каково строение молекул: а) гемоглобина? б) миоглобина? Их роли в
организме человека.
7
Что называют «кооперативным аллостерическим эффектом»?
8
Типы гемоглобинов. Укажите сродство к кислороду различных типов
гемоглобинов. Биологическое значение этого явления.
9
Каковы причины различных видов гемоглобинопатии: а) талассемия? б)
серповидно-клеточной анемии? в) метгемоглобинемии?
10 Принципы методов количественного определения гемоглобина в крови и
качественных проб обнаружения гемоглобина.
51
Раздел 6. Биохимия гепатопанкреатодуодеальной области
Лабораторная работа 1 Биохимия печени
Опыт 2 Качественное обнаружение «прямого» и «непрямого» билирубина
в сыворотке крови
Ход работы
а)
Обнаружение «прямого» билирубина.
На часовое стекло, под которое подложен лист белой бумаги, наносят каплю
сыворотки
крови,
содержащей
«прямой
билирубин»,
добавляют
3
капли
свежеприготовленного диазореактива и перемешивают стеклянной палочкой.
Образуется характерное для билирубина красное окрашивание.
б)
Обнаружение «непрямого» билирубина.
В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови, 2 мл этилового спирта и
фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива
— появляется красно-розовое окрашивание.
Лабораторная работа 2 Биохимия поджелудочной железы
52
Опыт 1 Количественное определение активности амилазы мочи
Амилаза крови частично выделяется с мочой. Изменение содержание этого
фермента в моче чаще всего встречается при заболевании поджелудочной железы,
особенно при острых панкреатитах.
Амилазную активность выражают в миллилитрах 0,1%-го раствора крахмала,
гидролизуемого одним миллилитром неразведенной мочи при 45° С в течение 15
мин. В моче здорового человека активность амилазы составляет 16—64 мл (единиц).
Ход работы
Берут 6 пронумерованных пробирок и приливают в каждую по 1 мл
физиологического раствора. Далее в первую пробирку приливают 1 мл исследуемой
мочи, перемешивают содержимое и 1 мл смеси переносят во вторую пробирку,
перемешивают содержимое и 1 мл смеси переносят в третью пробирку и т, д. Из
шестой пробирки 1мл смеси выливают. Таким образом получают следующие
разведения мочи: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16 и т.д. Затем в каждую пробирку наливают по 2
мл. крахмала, взбалтывают и все пробирки помещают в термостат при 45°С на 15
минут
Через 15 мин пробирки вынимают из термостата, охлаждают холодной водой
и ставят в штатив по порядку. Добавляют в каждую пробирку по 1 капле йода в
йодистом калии. В пробирке, где жидкость окрашивается в синий цвет, расщепление
не произошло. Для расчета принимают во внимание последнее разведение, в
котором после добавления крахмала не появился синий цвет по формуле 7.
Например, это третья пробирка, а в четвертой уже синее окрашивание, тогда
разведение мочи соответствует 1/8. Расчет: 1/8 мл мочи расщепляет 2 мл0,1% -го
крахмала:
(7)
Следовательно, 1 мл нёразведенной мочи расщепляет за 15 мин 16 мл 0,1%-го
53
раствора крахмала
Опыт 2 Качественное обнаружение амилазы в вытяжке поджелудочной
железы
α-Амилаза — фермент, содержащийся в секретах слюнных, поджелудочной
желез и слизистой тонкого кишечника.
По характеру действия этот фермент является гидролазой, расщепляющей 1,4глюкозидную
связь
крахмала
с
образованием
мальтозы
или
глюкозы.
Промежуточными продуктами могут быть различные декстрины. Степень гидролиза
крахмала можно контролировать, используя реакцию с йодом. Крахмал дает с йодом
синее окрашивание, декстрины в зависимости от размеров молекул окрашиваются
йодом в разные цвета (фиолетовый, красно-бурый). Второй контрольной пробой
может быть реакция Троммера, указывающая на наличие свободных альдегидных
групп (в мальтозе или глюкозе).
Ход работы.
В большую пробирку помещают 2 мл 0,1 % -го раствора крахмала и
добавляют 1 мл вытяжки поджелудочной железы. Пробирку оставляют стоять при
комнатной температуре, отбирая пипеткой в отдельные пробирки каждые 2 мин 8
капель гидролизата и добавляя в них по одной капле йода. Обратить внимание на
изменение окраски гидролизата с йодом в ходе гидролиза. Отбор проб производить
до прекращения изменения окраски. К последней пробе в большой пробирке
добавить 6—8 капель 10% -го раствора гидроксида натрия, а затем добавлять по
каплям 2% -й раствор сульфата меди, пока не прекратится его растворение.
Полученный раствор осторожно нагреть на спиртовке. Появление желто-красного
окрашивания говорит о положительной реакции Троммера.
Опыт 3 Количественное определение активности амилазы в сыворотке
54
крови (по Вольгемуту) при панкреатитах
Ход работы
1 мл сыворотки крови разводят дистиллированной водой в 10 раз. В 10
пронумерованных пробирок наливают из бюретки по 1 мл воды. В первую пробирку
пипеткой отмеривают 1 мл разбавленной в 10 раз сыворотки крови, перемешивают
содержимое путем втягивания и выпускания жидкости с помощью пипетки.
1
мл
полученного
разведения
переносят
во
вторую
пробирку,
перемешивают указанным способом и 1 мл из второй пробирки переносят в третью
и т. д. Таким образом, получают 10 разведений слюны, причем концентрация
амилазы в каждой пробирке в 2 раза меньше, чем в предыдущей. Из 10-й пробирки 1
мл жидкости отбрасывают. Затем, начиная с 10-й пробирки, из бюретки добавляют
по 2 мл 0,1% -го раствора крахмала и по 1 мл воды, тщательно перемешивают и
помещают в термостат при 37°С на 30 мин.
Через 30 мин пробирки вынимают, охлаждают под краном с водой,
расставляют по порядку в штативе, прибавляют в каждую пробирку по 1 капле
раствора йода в йодистом калии и перемешивают. Отмечают получившуюся в
пробирках окраску. Синий цвет указывает на присутствие нерасщепленного
крахмала, красно-бурый — на промежуточные продукты расщепления —
декстрины, желтый — на наличие декстринов, не дающих окраски с йодом, и
мальтозы.
Для вычислений амилазной активности в ряду пробирок отбирают ту, в
которой произошло полное расщепление крахмала при максимальном разведении
сыворотки. Зная разведение сыворотки и количество добавленного крахмала,
вычисляют по формуле 8, сколько крахмала мог бы расщепить 1 мл неразведенной
сыворотки крови.
Пример расчета Допустим, что в пятой пробирке произошло полное
расщепление крахмала, в которой разведение сыворотки соответствует 1: 320. 1/320
мл сыворотки расщепляет 2 мл 0,1 % -го раствора крахмала, 1 мл неразведенной
сыворотки расщепит X мл 0,1% -го раствора крахмала, следовательно, активность
55
амилазы сыворотки равна:
(8)
Клинико-диагностическое значение определения активности амилазы в
биологических жидкостях (в сыворотке крови):
Повышение — острый панкреатит, обострение хронического панкреатита,
перфорация язвы двенадцатиперстной кишки, рак поджелудочной железы, болезни
слюнных желез, паротит, камни в слюнных железах.
Снижение — некроз поджелудочной железы, тиреотоксикоз, болезни печени и
почек.
Контрольные вопросы к разделу 6:
1 В чем заключается: а) эндокринная функция поджелудочной железы? б)
экзокринная функция поджелудочной железы?
2 Каковы
химическая
природа
и
биологическая
роль
соматостатина
природа
и
биологическая
роль
вазоактивного
панкреатического?
3 Каковы
химическая
интестинального полипептида (ВИП)?
4 Каковы химическая природа и биологическая роль панкреатического
полипептида
(ПП)?
Принцип
метода
определения
амилазной
активности
биологических жидкостей.
Раздел 7 Биохимия нервной ткани
Лабораторная работа 1 Биохимия нервной ткани
Опыт 1 Качественное обнаружение витамина В1 (аневрина)
Реакция основана на окислении тиамина в тиохром, под действием
железосинеродистого калия. Тиохром дает синюю флюоресценцию при облучении
ультрафиолетовыми лучами (ртутнокварцевая лампа).
56
В пробирку вносят 2 капли раствора витамина В1, (тиамина) или исследуемой
биологической жидкости, добавляют 10 капель 10% -го раствора едкого натрия и 2
капли 5% -го раствора железосинеродистого калия. Перемешивают, нагревают до
появления
желтого
окрашивания.
Затем
через
пробирку
пропускают
ультрафиолетовые лучи ртутно-кварцевой ламп». В пробирке появляется голубая
флюоресценция.
Контрольные вопросы к разделу 7:
1 Какие вещества способны проникать через гематоэн-цефалический барьер?
Их структурные формулы.
2 Напишите структурные формулы липидов, входящих в состав нервнойткани: цереброзидов, ганглиозидов, сфингомиелинов, фосфолипидов, ХС.
3 Какие пептиды участвуют в метаболизме нервной ткани? Состав их.
4 Напишите схему образования аммиака в нервной клетке («пуриновый»
цикл). Укажите соответствующие ферменты.
5 Какие аминокислоты принимают участие в обмене в клетках нервной
системы? Напишите схему, подтверждающую обмен этих аминокислот.
6 Укажите
биохимические
основы
возникновения:
а)
миастении;
б)
шизофрении; в) депрессивных состояний.
7 Каков принцип определения каталитической активности холинэстеразы в
сыворотке крови?
Раздел 8 Биохимия мышц
Лабораторная работа 1 Биохимия скелетных мышц
Опыт 1 Качественное обнаружение молочной кислоты в экстрактах из
скелетных мышц.
Молочную кислоту обнаруживают по появлению зелено-желтой окраски с
раствором фенола, содержащим хлорное железо (реакция Уффельмана).
57
Сущность реакции.
При смешивании хлорного железа с фенолом появляется фиолетовое
окрашивание благодаря образованию комплекса фенолята железа. В присутствии
молочной кислоты образуется соль железа и окраска становится зелено-желтой.
Ход работы.
Реактив: к 15 мл раствора фенола добавляют несколько капель хлорного
железа и взбалтывают, жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.
В первую пробирку вносят 2 мл реактива и по каплям добавляют экстракт из
мышечной ткани. Во вторую пробирку — 2 мл реактива и раствор молочной
кислоты.
В первой и второй пробирках развивается зелено-желтое окрашивание.
молочная кислота
Опыт 2 Открытие креатинина в моче
Креатинин образуется из креатина или из фосфокреатина путем отщепления
фосфорной кислоты и выделяется с мочой в количестве около 2 г в сутки:
Между содержанием в мышце фосфокреатина и количеством выделяемого
креатинина имеется прямая зависимость. В некоторых случаях при беременности, в
послеродовом периоде, при диабете, кахексии, голодании и др., кроме креатинина, с
58
мочой выделяется и креатин. Креатин и креатинин in vitro в водно-щелочном
растворе легко переходят друг в друга:
Наиболее характерными реакциями для креатинина являются реакция
образования нитрозокреатинина и реакция образования хорошо растворимой соли
пикрата креатинина, окрашенной в красный цвет.
Нитропруссидная реакция (реакция Вейля). При добавлении нитропруссида
натрия [Na2Fe(CN)5NO] к щелочному раствору креатинина жидкость приобретает
красную окраску, быстро исчезающую, особенно после добавления уксусной
кислоты.
Реакция обусловлена образованием нестойкого нитрозокреатинина.
Ход работы.
К 10 каплям мочи прибавляют 1 каплю 5% -го свежеприготовленного раствора
нитропруссида натрия и 1 каплю 10% -го раствора едкого натра. Моча окрашивается
в красный цвет, быстро переходящий в желтый.
Реакция с пикриновой кислотой (реакция Яффе). При добавлении пикриновой
кислоты к щелочному раствору креатинина жидкость окрашивается в оранжевокрасный
цвет.
Реакция
обусловлена
образованием
пикрата
креатинина.
Интенсивность окраски усиливается при стоянии в течение нескольких минут и
сохраняется долгое время:
59
Ход работы.
К 10 каплям мочи добавляют 5 капель 10%-го раствора пикриновой кислоты и
столько же 10% -го раствора едкого натра. Моча окрашивается в оранжево-красный
цвет от образования пикрата креатинина.
Лабораторная работа 2 Биохимия миокарда
Опыт
1
Неферментативная
диагностика
инфаркта
миокарда.
Количественное определение пептидов в сыворотке крови (средних молекул,
СМ)
Принцип работы: в сыворотке крови раствором 10%-го ТХУ осаждают все
белки; оставшиеся в растворе пептиды (средние молекулы) определяют на
спектрофотометре при 254 нм после разведения.
Ход работы
Пастеровской пипеткой (или тонкой иглой) обвести сгусток крови в пробирке;
пробирки уравновесить и отцентрифугировать при одной тыс. оборотов (15—20
мин).
Сыворотку слить или отсосать в маленькую пробирку или центрифужную
пробирку; из нее пипеткой отмерить 1 мл сыворотки (или 0,5 мл и добавить 0,5 мл
дистиллированной воды, если мало сыворотки) в пластмассовую пробирку. Затем
добавить 0,5 мл 10%-го ТХУ, тщательно перемещать легким постукиванием и
поместить в центрифугу, отцентрифугировать при 6—8 тыс. оборотов в течение 30
мин.
Надосадочную
жидкость
Осторожно из нее набрать 5мл
слить
в
маленькую
стеклянную
пробирку.
центрифугата и внести в пробирку на 7—8 мл,
затем добавить 2,8 мл Н2О дист, общий объем должен быть 3,3 мл.
Контроль. В пробирку на 7—8 мл внести 0,17 мл 10%-го ТХУ и 3,13 мл
дистиллированной воды - общий объем 3,3 мл. Полученные после разведения пробы
спектрофотометрируем при 254 нм. Результаты измерения оптической плотности
60
проб против контроля на спектрофотометре умножаем на 1000 (если крови 1 мл) или
на
2000
при
количестве
крови
0,5
мл;
получаем
условные
единицы,
характеризующие количественное содержание пептидов. Норма 180—240 единиц.
При инфарктах миокарда всегда повышается уровень пептидов (уровень
средних молекул — УСМ), причем по величине УСМ можно судить о глубине и
распространенности повреждения миокарда, о тяжести клинического течения и
вероятном прогнозе данного заболевания.
Контрольные вопросы к разделу 8:
1
В
чем
отличие
миокарда
от
скелетных
мышц
по
субстратам,
поставляющим энергию для сокращения?
2
Какие процессы являются ведущими для получения АТФ в миокарде?
3
Какие ферменты преобладают в миокарде?
4
Какие витамины участвуют в метаболизме миокарда?
5
Принцип метода определения каталитической активности АсАТ.
6
Принцип метода определения каталитической активности ЛДГ.
7
Что является основным субстратом, окисление которого (как аэробное, так
и анаэробное) приводит к получению АТФ в скелетной мышце?
8
Возможно ли получение АТФ в скелетной мышце путем окисления
лактата? Объясните.
9
Судьба лактата в скелетной мышце.
10 Какие белки в скелетной мышце выполняют: а) сократительную функцию?
б) регуляторную функцию?
Раздел 9 Биохимия соединительной и костной ткани
Лабораторная работа 1 Биохимия соединительной и костной ткани
Опыт 1 Определение активности фосфатазы в сыворотке крови
61
Фосфатазы (фосфомоноэстеразы) — группа ферментов, которые в норме
поступают в кровь из печени, костного мозга, селезенки, почек, а при заболеваниях
— из предстательной железы и других органов.
В клинической практике обычно определяют суммарную активность
щелочных фосфатаз (фосфомоноэстераза I—3.1,3.1, оптимум pH 8,5—9,0) и кислых
фосфатаз (фосфомоноэстераза II— 3.1.3.2, оптимум pH 4,5— 4,9), объединяя эти
анализы одним термином «определение активности фосфатазы». При заболеваниях
печени (механических желтухах) активность щелочной фосфатазы возрастает в 5—
10 раз, особенно резко при рахите, в меньшей степени она повышается при острых
гепатитах, холангитах, циррозах, при различных заболеваниях костной системы.
Определение
активности
кислой
фосфатазы
в
сыворотке
крови
имеет
исключительно важное значение при диагностике заболеваний предстательной
железы, особенно при раковых опухолях простаты. Гормональная активность
щелочной фосфатазы сыворотки крови у женщин равна 0,74—2,10; мужчин — 0,9—
2,29 единиц Боданского.
Сущность методики исследований щелочной фосфатазы.
Метод основан на определении фосфора, отщепляемого при участии фермента
от субстратов, например от глицерофосфата согласно реакции гидролиза:
За единицу активности фосфатазы принимают 1 мг фосфора на 100 мл
сыворотки за 1 ч.
Реактивы:
β-Глицерофосфат, 0,5% -й щелочной раствор (в вероналовом буфере) (pH 8,6), трихлоруксусная кислота, 10%-й раствор.
Ход работы
Для определения щелочной фосфатазы в опытную пробирку вносят 0,1 мл
62
сыворотки, 1 мл щелочного раствора (3-глицерофосфата (рН=8,5—9,0) и помещают
ее на 1 ч в термостат при 37° С. В контрольную пробирку наливают 0,1 мл
сыворотки, 1 мл щелочного β-глицерофосфата, 0,9 мл 10%-й трихлоруксусной
кислоты и также помещают в термостат при 37°С на 1 ч. Через час пробирки
охлаждают и в опытную пробирку прибавляют 0,9 мл ТХУ для осаждения белков.
Содержимое обеих пробирок фильтруют. Осадки на фильтрах промывают 3 мл воды
и в опытном и контрольном фильтратах определяют количество неорганического
фосфора.
В опытную и контрольную пробирки добавляют по 0,5 мл 5%-го раствора
молибдата аммония. 2 мл воды, 0,5 мл 2%-го раствора аскорбиновой кислоты. Смесь
перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре 10 мин.
Опытную пробу фотометрируют на ФЭКе против контрольной пробы при
красном светофильтре в кюветах толщиной слоя в 1 см. Содержание фосфора в 0,1
мл сыворотки определяют по калибровочному графику. Активность щелочной
фосфатазы рассчитывают по формуле: А=СР * 1000, где А — активность щелочной
фосфатазы Ср- содержание фосфора (в мг) в 0,1 мл сыворотки крови; 1000 —
коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки крови. Клинико-диагностическое
значение.
Повышение активности щелочной фосфатазы наблюдается при:
 опухоли костей (остеогенная саркома);
 первичной или вторичной гиперфункциях паращитовидной железы;
 новообразованиях печени;
 остеомаляции (витамин D-зависимый рахит).
Снижение активности наблюдается при:

нарушении роста кости;

дефиците аскорбиновой кислоты;

гипотиреозе
Контрольные вопросы к разделу 9:
1 Каковы особенности метаболизма веществ в костной ткани?
2 Каково влияние на минеральный обмен в костной ткани: а) паратгормона? б)
63
кальцитриола? в) кальци-тонина? г) половых гормонов? д) тироксина? е) соматотропина? ж) кортикостероидов?
3 Какова влияние витаминов D3, А, С, Вг, Вб и РР на метаболизм веществ в
костной ткани?
4 Принцип
метода
определения
каталитической
активности
фосфатазы.
Диагностическое значение.
Раздел 10 Биохимия воспалительного процесса
Лабораторная работа 1 Биохимия воспалительного процесса
Опыт 1 Количественное определение белка в моче с азотной кислотой
Метод основан на образовании тонкого кольца осадка белка при наслоении
мочи на азотную кислоту. Если при взаимодействии крепкой азотной кислоты и
слоя мочи образование кольца происходит между второй и третьей минутами, то в
моче содержится приблизительно 0,033 г/л белка. Поэтому готовят порции мочи с
разным разведением.
Ход работы
Готовят ряд пробирок с разведенной мочой. Для этого берут пять пробирок,
нумеруют их, наливают в каждую по 2 мл дистиллированной воды. В первую
пробирку приливают 2 мл мочи, содержимое перемешивают и 2 мл смеси переносят
во вторую пробирку и т. д.' Из пятой пробирки также берут 2 мл смеси и
отбрасывают их, таким образом получают пробы мочи с разведением в 2, 4, 8,16 и
32 раза.
Берут пять пробирок и наливают в каждую по 1 мл 50%-го раствора азотной
кислоты. Затем осторожно, по стенке, наслаивают такое же количество мочи.
Отмечают, в какой пробирке между второй и третьей минутами появилось белковое
кольцо.
Чтобы вычислить содержание белка в исследуемой моче, необходимо 0,033 г/л
64
умножить на степень разведения в этой пробирке.
Опыт 2 Количественное определение белка в моче реакцией с
сульфосалициловой кислотой
Метод основан на том, что белок при взаимодействии сульфосалициловой
кислотой дает помутнение, интенсивность которого пропорциональна концентрации
белка.
Ход работы.
В пробирку наливают 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3% м
раствором
сульфосалициловой
кислоты,
перемешивают,
спустя
5
мин
колориметрируют на ФЭКе с синим светофильтром (длина волны 490 нм) против
контроля.
Контроль готовят следующим образом: к 1,25 мл профильтрованной мочи
добавляют раствор хлорида натрия до 5 мл. Находят по калибровочному графику
содержание белка в пробе, затем рассчитывают содержание белка (в г/л).
Контрольные вопросы к разделу 10:
1 Что относят к клеточным медиаторам воспаления? Напишите их структурные
формулы. Каков механизм их действия?
2 Что относят к гуморальным медиаторам воспаления? Каков механизм их
действия?
3 Каковы физико-химические изменения в очаге воспаления?
4 Назовите белки острой фазы воспаления в сыворотке крови. Их значение.
5 Принцип метода количественного определения белка в моче.
Раздел 11 Витамины и методы их обнаружения
Лабораторная работа 1. Жирорастворимые витамины и методы их
обнаружения
65
Опыт 1 Качественные реакции на витамин А
Цель: ознакомление с реакциями обнаружения витамина А. Витамин А в
присутствии хлороформного раствора треххлористой сурьмы приобретает синюю
окраску. Механизм реакции неизвестен. При добавлении концентрированной серной
кислоты витамин А дает красное окрашивание, переходящее в красно-бурое, а при
реакции с сульфатом железа (II) в кислой среде дает красно-розовое соединение.
Реакция с треххлористой сурьмой. В сухую пробирку вносят две капли
масляного раствора витамина А (свежего рыбьего жира) и добавляют 2—3 капли
33% -го хлороформного раствора треххлористой сурьмы; при смешивании
содержимое пробирки окрашивается в синий цвет.
Реакция Друммонда с концентрированной серной кислотой. В сухую
пробирку по стенке опускают 3 капли
масляного раствора витамина А или рыбьего жира. Вслед за этим сюда же
осторожно опускают каплю серной кислоты. В месте соприкосновения витамина А
с серной кислотой появляется фиолетовое окрашивание, переходящее в вишневокрасное.
Реакция с сульфатом железа (II). В пробирку к 2 каплям, масляного раствора
витамина А или рыбьего жира приливают 5—10 капель ледяной уксусной кислоты,
насыщенной сульфатом железа (И), 1—2 капли концентрированной серной кислоты.
Появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в красно-розовое.
Каротины дают при этой реакции зеленое окрашивание.
Опыт 2 Количественное определение витамина А в рыбьем жире
Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окраски,
которая образуется при реакции витамина А с треххлористой сурьмой в
присутствии уксусного ангидрида. Материал исследования: рыбий жир —
66
хлороформ (1 : 10).
Ход работы.
В пробирку к 0,4 мл хлороформного раствора рыбьего жира прибавляют 1-2
капли уксусного ангидрида (для предупреждения появления мути) и 4 мл 33%-го
раствора треххлористой сурьмы в хлороформе. Спустя 10 мин фотометрируют при
620 нм (красный светофильтр) против раствора треххлористой сурьмы.
Концентрацию витамина А в рыбьем жире находят по калибровочному
графику, где каждому значению найденной экстинкции соответствует определенное
содержание витамина А в 0,4 мл раствора.
Построение калибровочного графика производится с помощью стандартного
концентрата витамина А в рыбьем жире. Если содержание витамина А в 1 мл
концентрата
составляет
500
ед.
(интернациональные
единицы),
то
для
приготовления первоначального раствора берут 10 мл рыбьего жира и растворяют в
50 мл хлороформа. Из 1 мл этого раствора готовят разведения таким образом, чтобы
в 0,4 мл этого раствора содержалось от 20 до 80 ед. витамина А. Стандартные
растворы обрабатывают треххлористой сурьмой и определяют оптическую
плотность. Полученные данные используют для построения калибровочного
графика. Сопепжание витамина А в 1 мл рыбьего жира определяют по формуле 9:
(9)
С — содержание витамина А в 1 мл рыбьего жира (в ед.)
а — количество витамина А в 1 мл исследуемого раствора — для этого
количество витамина А, найденное по графику в 0,4 мл раствора, разделить на 0,4 (в
ед.),
У — общий объем исследуемого хлороформного раствора рыбьего жира (мл),
Q — взятое на анализ количество рыбьего жира (мл).
Опыт 3 Качественная реакция на витамин D
В сухую пробирку к 2 мл витамина D доливают 0,2 мл насыщенного раствора
67
хлорида сурьмы (V). Наблюдается появление желтого окрашивания.
Опыт 4 Качественная реакция на витамин К
В пробирку к 2 мл спиртового раствора витамина К прибавляют 2 мл 5% -го
раствора диэтилдитиокарбамата и 0,5 мл 2%-го раствора гидроксида натрия в
этаноле. Раствор приобретает голубое окрашивание.
Опыт 5 Качественная реакция на витамин Е
Взаимодействие а-токоферола с концентрированной азотной кислотой
приводит к окрашиванию реакционной смеси в красный цвет. Это обусловлено тем,
что
продукт
окисления
взаимодействии
с
а-токоферол
хлорным
железом
имеет
(Ш)
хиноидную
а-токоферол
структуру.
окисляется
При
до
а-
токоферилхинона — соединения, окрашенного в красный цвет.
Ход работы
Реакция с азотной кислотой. В сухую пробирку вносят 5 капель спиртового
раствора витамина Е и добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты.
Пробирку интенсивно встряхивают и наблюдают постепенное появление красного
окрашивания.
Реакция с хлорным железом. В сухую пробирку вносят 0,5 мл спиртового
раствора а-токоферола, затем
6
мл 1% -го раствора хлорного железа (III) и тщательно перемешивают
содержимое пробирки. Наблюдают появление красного окрашивания.
Лабораторная работа 2
Водорастворимые витамины и методы их
обнаружения
Опыт 1 Реакция с диазореактивом на тиамин (витамин В1)
68
В основе реакции лежит способность витамина B1 в щелочной среде с
диазореактивом (смесь солянокислого или сернокислого раствора сульфаниловой
кислоты с раствором нитрита натрия) образовывать сложное комплексное
соединение оранжевого или красного цвета.
Ход работы.
В пробирку приливают 1 мл раствора сульфаниловой кислоты и 1 мл раствора
нитрита натрия. Образуется диазореактив (см. в «Приложениях»), Сюда же вносят
небольшое количество (на кончике шпателя) порошка или 0,5 мл раствора тиамина
и по стенке пробирки осторожно добавляют 1 мл 20%-го раствора бикарбоната
натрия.
На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета или красного
цвета.
Опыт 2 Реакция восстановления рибофлавина (витамина В2)
Образующийся при добавлении металлического цинка к концентрированной
соляной кислоте водород восстанавливает желтый рибофлавин сначала в
родофлавиы (промежуточное соединение) красного цвета, а затем в бесцветный
лейкофлавин.
Ход работы.
В пробирку приливают 1 мл раствора витамина В6, 0,5 мл концентрированной
соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Выделяющийся
водород реагирует с рибофлавином, восстанавливая его, и жидкость постепенно
окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается. При взбалтывании
обесцвеченного раствора лейкофлавин вновь окисляется, кислородом воздуха в
рибофлавин.
Опыт 3 Реакция на витамин РР (антипеллагрический)
При нагревании витамина РР с раствором ацетата меди. Образуется плохо
растворимый синий осадок медной соли витамина РР.
Ход работы.
69
В пробирку помещают 5—10 мг витамина РР и растворяют при нагревании в
1—2 мл 10% -го раствора уксусной кислоты. К нагретому до кипения раствору
прибавляют такой же объем 5%-го раствора ацетата меди. Жидкость становится
мутной, окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает синий осадок медной
соли никотиновой кислоты.
Опыт 4 Реакция на пиридоксин (витамин В6)
При взаимодействии пиридоксина с раствором хлорида железа жидкость
окрашивается в красный цвет вследствие образования комплексной соли типа
фенолята железа.
Ход работы.
В пробирке смешивают 1 мл водного раствора пиридоксина и 2 капли 5%-го
раствора хлорида железа (III). Смесь встряхивает. Наблюдают окрашивание
жидкости в красный цвет.
Опыт 5 Реакция на цианокобаламин (витамин В12).
При действии сильного окислителя на витамин В12 происходит его
разрушение. Кобальт, входящий в состав витамина, при этом высвобождается. Его
обнаружение производят с помощью α-нитрозо-β-нафтола, с которым кобальт
образует комплексное соединение оранжево-красного цвета.
Ход работы.
Половину содержимого витамина В12 из ампулы переносят в фарфоровый
тигель, выпаривают досуха и прокаливают на небольшом огне. После охлаждения
доливают 1 мл концентрированной азотной кислоты и 3 мл концентрированной
соляной кислоты и кипятят в вытяжном шкафу до полного испарения жидкости и
охлаждают. Растворяют осадок в капле воды, прибавляют 1 каплю ацетонового
раствора α-нитрозо-β-нафтола. и каплями раствор гидрофосфата натрия до
слабощелочной реакции (по лакмусу). При наличии ионов кобальта появляется
70
буро-красное окрашивание, если ионов кобальта нет, окрашивание — желтозеленое.
Опыт6 Реакции на витамин Р (витамин проницаемости, цитрин, рутин)
Хлорид железа (III) образует с рутином комплексные соединения, окрашенные
в изумруднозеленый цвета. Концентрированная серная кислота образует с
флавонами и флавонолами флавилиевые соли, растворы которых имеют яркожелтую окраску, При кислотном гидролизе рутина отщепляется молекула рутинозы.
Затем
рутиноза
распадается
на
глюкозу
и
рамнозу,
которые
обладают
восстанавливающими свойствами.
Ход работы
Реакция рутина с хлоридом железа (III) К 2 мл насыщенного водного раствора
рутина прибавляют несколько капель 5%-го раствора FeCl3. Наблюдают появление
зеленого окрашивания.
Реакция рутина с концентрированной серной кислотой.
К 2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по cтенке пробирки
доливают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе двух жидкостей
возникает окрашенное в желтый цвет кольцо. Реакция рутина с реактивом Фелинга:
к 0,5 г рутина прибавляют 5 мл 20%-го раствора соляной кислоты, кипятят в течение
1 мин, затем фильтруют. К фильтрату доливают 3 мл 20%-го раствора гидроксида
натрия и 3 мл свежеприготовленного реактива Фелинга. Снова нагревают до
кипения. Наблюдают образование красного осадка закиси меди.
Опыт7
Количественное
определение
витамина
С
методом
йодометрического титрования
Аскорбиновая кислота является сильным восстановителем и может быть
определена йодометрически при определенном значении pH раствора (например, pH
71
= 7). При титровании йодом аскорбиновая
кислота окисляется, образуя
дегидроаскорбиновую кислоту.
Подготовка экстракта из пищевых продуктов для определения витамина С.
1 г капусты или картофеля натереть на терке в чашке Петри или мелко
порезать и растереть в ступке с небольшим количеством толченого стекла или
песка. Затем, если измельчали на терке, собрать массу из чашки Петри в стаканчик,
если в ступке — прямо в ступку добавить 10 мл 2%-го раствора НС1. Хорошо
перемешанную массу отфильтровать через стеклянную воронку с ватой в
коническую колбу на 50—100 мл. Массу на фильтре промыть несколькими каплями
воды. В фильтрат прилить 1 мл 0,5%-го раствора крахмала и титровать рабочим
раствором 0,003 н. Ь до появления синего окрашивания.
При расчете содержания витамина С в продукте использовать формулу 10
определения массы при помощи титра по определяемому веществу;
(10)
н. — молярная концентрация эквивалента йода;
Э - молярная масса эквивалента аскорбиновой кислоты в г, равная в данном
случае 88 г;
V — объем пошедшего на титрование йода, в мл.
Для пересчета на содержание витамина С в 100 г продукта использовать
формулу 11:
(11)
Полученный результат сравнить с нормой: содержание витамина С в капусте
45 мг%, в картофеле —20 мг%.
Контрольные вопросы к разделу 11:
1 Каково химическое строение и биологическая роль витаминов A, D, Е, К, F? Их
суточная потребность в организме человека.
2 Принцип метода количественного определения витамина А.
3 Принципы методов качественного обнаружения витаминов A, D, Е, К.
72
Раздел 12. Гормональная регуляция обмена веществ функций в
организме человека
Лабораторная работа 1 Гормоны - белки, гормоны – пептиды
Опыт 1 Обнаружение инсулина биуретовой реакцией
В пробирку к 5 каплям раствора инсулина прибавляют 5 капель 10% -го
раствора едкого натра и 1 кашпо 1% -го раствора сернокислой меди. Перемешивают,
встряхивают.
Наблюдают
появление
фиолетового
окрашивания.
Объяснить
механизм реакции, сделать выводы.
Опыт 2 Обнаружение инсулина реакцией с сульфосалициловой кислотой
В пробирку вносят 1 мл раствора инсулина, добавляют 5 капель 20% -го
раствора сульфосалициловой кислоты» Наблюдают выпадение осадка белого цвета.
Объяснить механизм реакции, сделать вывод.
Опыт 3 Обнаружение инсулина реакцией Фоля
В термостойкую пробирку вносят 5 капель раствора инсулина, 5 капель 30% го раствора едкого натра и 1—2 капли 5%-го раствора уксуснокислого свинца. При
длительном нагревании жидкость в пробирке буреет и выпадает черный осадок
сернистого свинца. Объяснить механизм реакции, сделать вывод.
Опыт 4 Реакция Геллера на инсулин
К 10 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке
73
пробирки приливают равный объем (10 капель) раствора инсулина. Пробирку
наклоняют под углом 45° так, чтобы жидкости не смешивались. На границе двух
жидкостей образуется белый аморфный осадок в виде небольшого кольца.
Лабораторная работа 2 Гормоны - производные аминокислот
Опыт 1 Качественные реакции обнаружения адреналина
а)
Реакция с хлоридом железа (III).
В пробирку вносят 1 мл адреналина (1:1000), прибавляют 1 каплю 3% что
раствора хлорида железа (III) и перемешивают. Появляется изумрудно-зеленое
окрашивание, затем добавляют 1 каплю 10%-го раствора едкого натра — возникает
вишнево-красное окрашивание. Объясните механизм реакции, сделайте вывод
б)
Реакция с диазореактивом,
К 1 мл 1%-й сульфаниловой кислоты прибавляют 1 мл 5%-го раствора нитрита
натрия (получается диазореактив). К диазореактиву добавляют ,15 мл раствора
адреналина (1:1000) и 1мл 10%-го раствора карбоната натрия. Перемешивают.
Раствор окрашивается в синий цвет.
Объясните механизм реакции, сделайте вывод.
Опыт 2 Реакция на гормоны щитовидной железы (тироксин)
В фарфоровой ступке измельчают 5 таблеток тиреоидина или 100 мг
высушенной щитовидной железы. Образованную массу переносят в колбу с
помощью 5 мл воды, добавляют 5 мл 10% -го раствора едкого калия и кипятят 15
мин на электрической печи с асбестовой сеткой. К 3 мл охлажденного гидролизата
добавляют 10% -й раствор серной кислоты до кислой реакции по лакмусу. Затем
приливают 5 капель 1 % -го раствора крахмала и 1 мл раствора йодата калия для
окисления йодида калия. Молекулярный йод, который выделяется, дает синее
окрашивание с крахмалом.
74
Сделайте вывод.
Лабораторная работа 3 Стероидные гормоны и механизм их действия
Опыт 1 Качественное обнаружение 17-кетосте-роидов в моче с помощью
m-динитробензола
В пробирку помещают 5 капель мочи, 5 капель 30% -го раствора едкого натра
и 5 капель 2% -го спиртового раствора (в этаноле) m-динитробензола.
Перемешивают. При стоянии появляется красное окрашивание за счет образования
продуктов конденсации циклопентанопергидрофенантрена с m-динитробензолом.
Опыт 2 Качественная реакция на кортизол
К 1 мл спиртового раствора кортизола добавляют 0,25 мл раствора
гидроксидатетраметиламмония и 0,25 мл раствора синего тетразолия. Содержимое
пробирки встряхивают и оставляют в темноте на 25 мин. Жидкость окрашивается в
розовый цвет.
Реакция используется в колориметрическом методе для количественного
определения содержания кортикостероидов в биологических жидкостях и основана
на восстановлении синего тетразолия за счет оксикетонной группы у 17-го
углеродного атома циклопентанпергидрофенантренового ядра.
Лабораторная работа 4 Гормоны половых желез
Опыт
1
Качественная
реакция
концентрированной серной кислотой.
75
на
фолликулин
(эстрон)
с
В маленькую пробирку наливают 20 капель спиртового раствора фолликулина
и помещают ее в кипящую водяную баню на 5—10 мин для удаления спирта. К
оставшемуся в пробирке фолликулину добавляют 20 капель концентрированной
серной кислоты и помещают пробирку вновь в кипящую водяную баню на 5—10
мин. Появляется соломенно-желтое окрашивание, переходящее при нагревании в
оранжевое и
имеющее зеленую флюоресценцию. С масляным раствором
фолликулина реакцию проводят при комнатной температуре.
Опыт 2 Качественная реакция на ароматическую группу фолликулина
К 2 каплям фолликулина приливают 1 каплю 30% -го раствора щелочи и 1
каплю реактива Фолина. Появляется синее окрашивание, обусловленное наличием
фенольной группировки.
Контрольные вопросы к разделу 12:
1
Представьте последовательность реакций биосинтеза женских и мужских
половых гормонов из ХС. Укажите ферменты биосинтезов.
2
Каковы пути регуляции биосинтеза женских и мужских половых
гормонов?
3
Каков механизм действия половых гормонов на клетки-мишени?
4
Влияние женских половых гормонов на метаболизм и репродуктивную
функцию женщины.
5
Влияние мужских половых гормонов на метаболизм и репродуктивную
функцию мужчины.
6
Принципы
методов
обнаружения
фолликулина
в
биологических
жидкостях.
7
В клетках каких тканей имеются белки-рецепторы для взаимодействия с
глюкокортикоидами?
8
Каков механизм действия глюкокортикоидов на клетки-мишени?
9
Каково влияние глюкокортикоидов на ферменты обмена: а) углеводов в
печени и скелетных мышцах? б) белков? в) липидов?
76
10 Принципы методов обнаружения в биологических жидкостях кортизола и
17-кетостероидов.
Раздел 13.Водиоэлектролитный обмен и его регуляция
Лабораторная работа 1 Фосфатно-кальциевый обмен в организме
человека
Опыт 1 Определение концентрации ионов кальция в сыворотке крови
колориметрическим методом
Принцип метода: раствор мурексида образует с кальцием в щелочной среде
комплекс красного цвета, который определяют фотометрически (при 540 нм).
Ход работы.
В чистую пробирку вносят 1,0 мл дистиллированной воды, 0,02 мл сыворотки
крови и 0,5 мл раствора гидроксида натрия с С = 0,4 моль/л. Раствор перемешивают
и через 5—10 мин добавляют 2,0 мл раствора реактива (мурексида). Параллельно
готовят эталон и раствор сравнения по нижеописанной схеме. Все растворы опять
перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы и эталона против раствора
сравнения. Измерение проводят в 1 см кювете при длине волны 540 нм не раньше,
чем через 5, но не позднее, чем через 15 мин после добавления раствора реактива.
Таблица 7 - Схема определения
В пробирках
Проба
Компоненты
Дистиллированная вода, мл
Биологический материал, мл
1,00
0,02
77
Раствор
сравнения
1,02
—
Эталон
1,00
—
Калибровочный раствор, мл
Г идроксид натрия, мл
—
0,50
—
0,50
0,02
0,50
Раствор реактива (мурексида), мл
2,00
2,00
2,00
Оценка результатов
По оптической плотности пробы (А) и эталона (Б) рассчитывают содержание
кальция (х) в ммоль/л биологического материала по формуле
х=2,5*А/В; ммоль/л.
Нормальные величины содержания кальция в: сыворотке крови — 2,29—2,99
ммоль/л; спинномозговой жидкости — 1,37—1,50ммоль/л.
Клинико-диагностическое
значение
определения
концентрации
Са2+
в
сыворотке крови.
Повышение содержания кальция наблюдается при:
—
злокачественных новообразованиях;
—
остеолизе в результате первичных очагов или метастазов, новообразований в
костной ткани;
—
первичной гиперфункции паращитовидных желез;
—
передозировке витамина D3;
—
миеломе.
Понижение при:
—
гипофункции паращитовидных желез;
—
хирургическом вмешательстве;
—
переливании большого количества цитратной крови;
—
лекарственной гипокальцием ии (кальцигонин; ЭДТА);
—
хронической почечной недостаточности.
Контрольные вопросы к разделу 13:
1
Каково значение минеральных веществ в организме человека?
2 Назовите гормоны, регулирующие обмен ионов кальция и фосфатов в организме
человека, локализацию их биосинтеза, химическую природу и механизм действия.
3 Каков принцип метода определения концентрации ионов кальция в сыворотке
78
крови?
Раздел 14 Биохимия выделительной системы
Лабораторная работа 1 Биохимия выделительной системы. Биохимия
почек
Опыт 1 Количественное определение мочевины в моче
Метод основан на том, что мочевина образует с диацетилмонооксимом в
присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенное
соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию
мочевины в моче.
Ход работы.
Перед определением профильтрованную мочу разводят 1:200. Готовят 3
чистые сухие пробирки: в одну отмеривают 0,5 мл разведенной мочи, во вторую —
0,5 мл стандартного раствора мочевины (в 0,5 мл раствора — 0,2 мкмоль мочевины),
в третью — 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку добавляют по 5 мл
цветного реактива (5 ммоль/л диацетилмонооксима, 0,9 ммоль/л тиосемпкарбазида,
0,9 моль/л серной кислоты, 25 мкмоль/л соли тре хвале нгного железа)
Содержимое пробирки перемешивают, пробирки' помещают в кипящую баню
на 20 мин, затем их охлаждают и колориметрируют опытную и стандартные пробы
против контроля с зеленым светофильтром. Расчет проводят по формуле 12:
(12)
где X — содержание мочевины в суточной моче, ммоль/л;
Еоп — показание ФЭК для опытной пробы;
Ест — показание ФЭК для стандартной пробы;
А ст, — содержание м очевины в стандартной пробе (в 0,5 мл), равное 0,2 м
79
кмоль;
Vс — суточный объем мочи;
Von— объем мочи, взятый для анализа (0,5 мл),
К —- раз веде ние м очи (К = 200).
Сделать вывод о содержании мочевины в моче обследуемого.
Опыт 2 Качественное определение индикана в моче
В кишечнике под влиянием гнилостных процессов триптофан подвергается
разложению с образованием индола, скатола.
К 2—3 мл мочи приливают такое же количество концентрированной соляной
кислоты, 2—3 капли 2%-го раствора марганцовокислого калия и 2 мл хлороформа,
пробирку плотно закрывают пробкой и смешивают. При наличии индикана
хлороформ окрашивается в синий цвет.
При добавлении 2 мл хлороформа и нескольких капель марганцовокислого
калия индоксил окисляется в синее индиго по схеме:
Синее индиго хорошо растворимо в хлороформе и окрашивает его в синий
цвет. Интенсивность полученной окраски служит до некоторой степени показателем
количества индикана в исследуемой моче.
Опыт 3 Экспресс-метод определения глюкозы в моче с помощью
глюкотеста (по В. К. Городецкому и И. С. Лукомской)
Во взятую натощак свеженабранную мочу погружают полоску глюкотеста так,
чтобы желтая полоса, имеющаяся на полоске, была полностью смочена. Быстро
извлекают бумажку из исследуемой мочи, кладут смоченным концом на
80
пластмассовую пластинку и выдерживают в таком положении около 2 мин. В случае
присутствия глюкозы в моче желтая полоса окрашивается в различные оттенки
зеленого цвета в зависимости от концентрации глюкозы; при отсутствии глюкозы
цвет полосы не меняется. Точно через 2 мин (не снимая бумажки с пластинки)
сравнивают окраску цветной полосы с окраской цветной шкалы. Содержание
глюкозы в моче в процентах определяют по цвету полоски, наиболее совпадающему
со шкалой. В состав наборов глюкотеста входят наряду с инструкцией
пластмассовая пластинка и цветная шкала с градациями 0; 0,1; 0,5; 1,0; 2%глюкозы
и выше.
Лабораторная работа 2 Роль почек в поддержании КОС и осмотического
давления. Биохимия мочи
Опыт 1 Реакция на белок в моче
К 1мл мочи добавляют 6—8 капель сульфосалициловой кислоты. При наличии
белка выпадает белый осадок.
Опыт 2 Определение глюкозы в моче (реакция Троммера)
К 1 мл мочи добавляют б—8 капель 10% -го раствора NaOH и по каплям 2%-й
раствор сульфата меди до прекращения растворения. Смесь нагревают 2—3 мин.
При наличии глюкозы темно-синяя окраска переходит в красно-оранжевую.
81
Опыт 3 Определение кетоновых тел в моче
а) Обнаружение ацетона (реакция Легаля)и ацетоуксусной кислоты.
К 2 мл мочи добавляют 3 капли 10% -го раствора нитропруссида натрия и 2
капли 10%-го раствора гидроксида натрия. При наличии ацетона или ацетоуксусной
кислоты появляется красно-бурое окрашивание.
б)Обнаружение ацетона (проба Либена).
К 2 мл мочи добавляют 3 капли 10% -го раствора гидроксида натрия и затем
по каплям добавляют раствор Люголя до слабо-желтого окрашивания. При наличии
ацетона появляется осадок йодоформа бледно- желтого цвета, имеющий запах
«зубного кабинета».
в) Проба Герхардга (на ацетоуксусную кислоту)
Енольная форма ацетоуксусной кислоты, взаимодействуя с хлорным железом,
образует комплексное соединение вишневого цвета.
К 1 мл мочи, содержащей ацетоуксусную кислоту, добавляют несколько
капель 10% -го хлорного железа; появляется вишнево-красное окрашивание.
Опыт 4 Обнаружение желчных кислот в моче (проба Гея)
Проба Гея основана на том, что появление желчных кислот приводит к
понижению поверхностного натяжения мочи, поэтому порошок серы, помещенный
на поверхность мочи, тонет.
В пробирку с исследуемой мочой добавляют серный цвет (порошок серы).
Если присутствуют желчные кислоты и их соли, то порошок тонет.
Опыт 5 Количественное определение хлоридов в моче но методу Мора
Суточная потребность хлоридов составляет 2—7 г в основном за счет
хлористого натрия. Хлориды выделяются с мочой в виде хлористых солей, главным
образом натрия (10—15 г за сутки) и в меньшей степени калия, аммония, кальция и
82
магния. Понижение содержания хлоридов в моче говорит о потере их организмом,
которая может наблюдаться при усиленном потоотделении, частой рвоте
(неукротимая рвота беременных, пищевые отравления), поносах (дизентерия),
отеках всего тела (микседема) и водянке брюшной полости, когда в отечной
жидкости задерживается много хлоридов.
Выведение хлористого натрия с мочой повышается при гипофункции
надпочечников
(снижение
биосинтеза
альдостерона).
Выведение
хлоридов
увеличивается но выздоровлении от пневмонии, при рассасывании экссудатов,
содержащих хлористый натрий.
При бессолевой диете выделение хлоридов с мочой резко снижается и может
дойти до 1 г. Обычно бессолевую диету назначают при заболевании почек,
гипертонической болезни.
Определение хлоридов в моче основано на осаждении хлора титрованным
раствором азотнокислого серебра в присутствии индикатора хромовокислого калия
(К2СrО4)
Хромовокислый калий вступает в реакцию с азотнокислым серебром после
осаждения всех хлорид-ионов, присутствующих в моче, и образуете серебром
осадок кирпично-красного цвета.
Реакции протекают так:
Ход работы
В колбочку отмеривают точно 1 мл мочи, приливают 5 мл воды и 3 капли 5% го раствора хромовокислого калия К£г0 4 в качестве индикатора и титруют 0,1 н.
раствором азотнокислого серебра. Выпадает белый творожистый осадок хлорида
серебра. Продолжают титровать азотнокислым серебром до кирпично- красного
цвета. Для вычисления содержания хлоридов в моче результат титрования
83
азотнокислым серебром умножают на 3,55 (количество миллиграммов хлора,
соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора азотнокислого серебра) и на суточное
количество мочи. Если количество хлоридов надо выразить в пересчете на хлорид
натрия, то вместо коэффициента 3,55 берут коэффициент 5,85 (молекулярный вес
хлора равен 35,55, а хлорида натрия — 58,5).
Лабораторная работа 3 Патологические компоненты в моче
Опыт 1: Контрольная задача по теме: «Патологические компоненты мочи»
Каждый студент получает контрольную задачу по теме «Патологические
компоненты мочи» и проводит исследование на наличие патологических составных
частей мочи. Полученные данные необходимо внести в таблицу и сделать
заключение о возможном характере заболевания.
Таблица 8 – таблица для результатов задачи «Патологические компоненты
мочи»
№ задачи
Белок
Глюкоза
Кетоновые
Желчные
тела
кислоты
Контрольные вопросы к разделу 14:
1
Что называют «клиренсом »?
2
Диагностическое значение определения величины клиренса.
3
Каковы в норме общие свойства мочи?
4
Принципы методов обнаружения патологических компонентов в моче.
5
Представьте 3 схемы, подтверждающие механизмы поддержания КОС
почками.
6
Каков механизм образования мочи в почках?
7
Чем обусловлено образование первичной мочи?
8
Химический состав первичной мочи.
9
Каков механизм реабсорбции: а)в проксимальных канальцах? б) в
дистальных канальцах?
84
10 Гормональная регуляция реабсорбции.
11. Каковы особенности метаболизма в почечной ткани?
11 Принцип метода количественного определения мочевины в моче.
12 Принцип метода обнаружения индикана в моче.
13 Каков состав окончательной мочи?
Список литературных источников
1 Комов, В.П. Биохимия/ В.П.Комов, В.П.Шведова . - М.: Дрофа, 2008. - 638
с. - ISBN: 978-5-358-04872-0.
2 Цыганов А.Р., Практикум по биохимии/ А.Р.Цыганов, И.В.Сучкова,
И.В.Ковалева. - М.: ИВЦ Минфина, 2007. - 152с. - ISBN 978-985-6847-30-4.
3 Проскурина, И.К. Биохимия /И.К.Проскурина. - М.: Академия, 2012. 336с.
- ISBN 978-5-7695-7482-5.
4 Никулин Б.А., Пособие по клинической биохимии».- М.: ГЭОТАР-медиа,
2007. - 256с. - ISBN 978-5-9704-0358-7.
5 Гринский А., Гринский Б., «Наглядная биохимия». - М.: ГЭОТАР-мед.,
2000.
85
Вопросы для подготовки к зачету
1
Роль белков в организме человека.
2
Переваривание белков в желудочно-кишечном тракте. Азотистый баланс.
3
Анализ желудочного сока.
4
Исследование желудочного сока. Качественные реакции на свободную
соляную кислоту в желудочном соке. Качественная реакция на молочную кислоту в
желудочном соке.
5
Определение общей кислотности, свободной, связанной в 1-ой пробе
желудочного сока.
6
Промежуточный обмен аминокислот. Клиническое значение определения
активности трансаминаз.
7
Особенности обмена фенилаланина и тирозина.
86
8
Принцип экспресс- метода определения повышенного содержания
фенилаланина в крови (по Левину).
9
Обмен аммиака.
10
Биосинтез мочевины. Клиническое значение определения аммиака.
11
Остаточный азот крови.
12
Принцип метода определения мочевины в моче уреазным методом.
13
Принцип метода определения мочевины в сыворотке крови.
14
Физиологическая роль белков плазмы крови.
15
Клинические значение исследования общего белка и белковых фракций
крови.
16
Определение белков сыворотки крови методом электрофореза.
17
Распад и обновление белков, ферменты распада, их значение.
18
Принцип метода определение общего белка в сыворотке крови (по
Лоури).
19
Принцип метода определения общего белка в сыворотке крови по
биуретовой реакции.
20
Функции углеводов в организме.
21
Переваривание углеводов в желудочно-кишечном тракте.
22
Принцип
метода
определения
концентрации
глюкозы
в
крови
безокаиновым методом.
23
Основные пути поступления глюкозы в кровь.
24
Основные пути расходования глюкозы крови.
25
Основные пути нарушения углеводов.
26
Основные причины гипергликемии.
27
Основные причины гипогликемии.
28
Биохимические изменения сахарном диабете.
29
Принцип метода исследования функций поджелудочной железы методом
сахарной нагрузки.
30
Функции липидов в организме.
31
Переваривание и всасывание липидов в желудочно-кишечном тракте
87
32
Обмен холестерина.
33
Принцип метода определения общего холестерина в сыворотке крови
34
Обмен липопротеинов.
35
Биохимические изменения в организме человека при нарушении обмена
липидов.
36
Метаболизм кетоновых тел.
37
Качественные реакции на кетоновые тела.
38
Гормоны, их биологическая роль.
39
Общие свойства гормонов, виды, механизм действия.
40
Гормоны белки. Инсулин, его биологическое действие.
41
Глюкагон, его биологическое действие.
42
Биохимическая картина инсулин - зависимого сахарного диабета
(причины, биохимические нарушения).
43
Качественные реакции на инсулин обнаружение инсулина биуретовой
реакцией.
44
Обнаружение инсулина реакцией с сульфосалициловой кислотой.
45
Обнаружение инсулина реакцией Фоля.
46
Обнаружение инсулина реакцией Геллера.
47
Общие свойства мочи.
48
Химический состав мочи.
49
Принцип метода определения кетоновых тел в моче.
50
Принцип метода определения глюкозы в моче.
51
Определение желчных кислот в моче.
52
Реакция на белок в моче.
53
Функции крови.
54
Состав, свойства крови, основные показатели крови.
55
Ферменты плазмы крови.
56
Принцип метода определения активности липазы в сыворотке крови.
57
Биохимия эритроцитов.
58
Гемоглобин, строение, свойства, функции.
88
59
Принцип метода определения концентрации гемоглобина.
60
Свертывание крови.
89
Скачать

Кожакин П.А. МУ к лаб раб по БЛП, 2013