кислородно-перекисная концепция апоптоза
advertisement
Успехи современной биологии, 2005, том 125, № 6, с. 567-578 УДК 576.32/36:576.385 КИСЛОРОДНО-ПЕРЕКИСНАЯ КОНЦЕПЦИЯ АПОПТОЗА: ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ АРГУМЕНТАЦИИ И РАЗВИТИЯ Б. Н. Лю, М. Б. Лю Казахский научно-исследовательский институт онкологии и радиологии, Алматы, Казахстан Некоторые новые публикации по апоптозу содержат информацию, существенную для совершенствования и дальнейшего развития его кислородноперекисной концепции. Принципиально важным, в частности, представлен факт перекисного окисления и утраты кардиолипина во внутренней мембране митохондрий в результате продукции в них активных форм О2 (АФК). Как одна из необходимых первичных акций она ведет к высвобождению ассоциированного с легкоокисляемым кардиолипином цитохрома с, устойчивому поддержанию в клетке «апоптогенного» уровня окислительного стресса. Обращено внимание на все большее количество фактов индукции апоптоза опухолевых клеток как при снижении, так и возрастании «канцерогенезного» уровня окислительного стресса при воздействии на них соответственно анти- и прооксидантных агентов и факторов. Это косвенно указывает на существование разных «специализированных, апоптогенных» уровней указанного стресса. Значение данных фактов для практической онкологии очевидно. Различные АФК, пероксиды липидов и белков, как сигнальные молекулы, играют ключевую роль не только на начальном «митохондриальном» этапе апоптоза, но и на последующих стадиях, влияя на активность ряда исполнительных звеньев (онкобелков, факторов транскрипции, протеинкиназ, эндонуклеаз, каспаз и др.). Это значительно повышает аргументацию в пользу того, чтобы концепцию апоптоза называть «кислородно-перекисной». В широком научно-теоретическом аспекте эти данные и представления еще предстоит оценить. НЕКОТОРЫЕ ИСХОДНЫЕ ФАКТЫ И ПОЛОЖЕНИЯ Количество самых различных агентов и факторов, индуцирующих апоптоз клеток, постоянно увеличивается, и это обстоятельство усиливает и без того сложившееся мнение о неимоверной сложности данного процесса. Тем не менее, основное положение о начальных этапах индукции апоптоза вследствие нарушения митохондриального дыхания и возникновения окислительного стресса остается пока неизменным. Более того, в ряде исследований обнаружены весьма существенные «детали», подтверждающие кислородно-перекисный механизм апоптоза [7, 8]. Так, во многих апоптозных нейронах в период развития у позвоночных нервной системы происходит утрата кардиолипина –легкоокисляемого фосфолипида, входящего в состав внутренней мембраны митохондрий. 1 Показано, что содержание кардиолипина снижается перед исчезновением в этих клетках митохондрий, причем к моменту утраты кардиолипина масса митохондрий уменьшается незначительно. А тот факт, что исчезновение кардиолипина конкурентно связано с продукцией митохондриями активных форм кислорода (АФК) и увеличением пероксидации липидов указывает на участие в этих процессах свободных кислородных радикалов [35]. Со сказанным хорошо коррелирует сообщение принципиальной важности о двухстадийности процесса освобождения цитохрома с из митохондрий апоптотических клеток. На первой стадии наблюдается отделение цитохрома с от внутренней мембраны митохондрий, где он ассоциирован с кардиолипином за счет электростатического и/или гидрофобного взаимодействия. Это отделение происходит после окислительной модификации кардиолипина. Последующее повышение проницаемости внешней мембраны митохондрий под действием онкобелка Bax приводит к высвобождению цитохрома с из митохондрий [55]. Об утрате молекулярного взаимодействия между цитохромом с и кардиолипином, обусловленной перекисным окислением липидов (ПОЛ), несколько раньше сообщали и другие исследователи [см., например,66]. Именно модификация кардиолипина в условиях ПОЛ индуцирует выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль, что является одним из важных начальных этапов апоптоза. Здесь в первую очередь нас интересует не то, в каких далее процессах и в какой роли участвует выделившийся цитохром с, а сам факт высвобождения его из митохондрий. С нашей точки зрения, этот простой, на первый взгляд, акт очень важен, так как в качестве положительной обратной связи поддерживает нарушение транспорта электронов в дыхательной цепи, снижает утилизацию О2 митохондриями и, следовательно, способствует накоплению его в клетке и устойчивости необходимого для апоптоза состояния окислительного стресса сначала в 2 митохондриях, затем в цитоплазме и внутри всей клетки. К тому же, положительная обратная связь по поддержанию окислительного стресса в клетках реализуется, очевидно, и по другим каналам. Одним из них является АФК-зависимое повреждение митохондриальной ДНК (мтДНК) с образованием и накоплением, в частности, 8-гидрокси-2- дезоксигуанозина. Правда, это окислительное повреждение мтДНК в какой-то степени репарируется [18]. Другой канал такой обратной связи может действовать путем окислительного повреждения мтДНК- полимеразы, что должно приводить к уменьшению репликации мтДНК [29] и соответственно ослаблению митохондриальной базы. Таким образом, в митохондриях существуют разные способы подержания возникшего в них окислительного стресса не ниже какого-то определенного уровня. В связи с указанным примечателен и факт установления специфичного для митохондрий жизненно необходимого гена тиоредоксина-2 (Tpx-2), регулирующего апоптоз. Тиоредоксин входит в систему защитных механизмов клетки и при окислительном стрессе активность его повышается [31]. Путем клонирования кДНК Tpx-2 курицы были получены на основе линии В-клеток условно дефектные по Tpx-2 клетки. Последние подвергаются апоптозу в ответ на репрессию Tpx-2 из-за накопления активного внутриклеточного кислорода [74]. Указанное означает, что необходимый для апоптоза начальный уровень окислительного стресса в митохондриях в какой-то мере регулируется (ограничивается) тиоредоксином, выполняющим фактически роль антиоксиданта, а проапоптотический сигнал может возникнуть лишь в случае возрастания окислительного стресса в митохондриях сверх некоторых пороговых значений. Некоторые коррективы в митохондриальную модель апоптоза вносит работа [15], в которой показано, что в иммортализованных гепатоцитах крысы трансформирующий фактор роста β1 одновременно со стимуляцией 3 образования АФК митохондриями стимулирует их образование и цепью переноса электронов при участии цитохрома Р450. Ингибирование одного из этих источников АФК нарушает развитие апоптоза, свидетельствуя о необходимости обоих путей для завершения апоптоза, индуцированного указанным фактором роста. Эти результаты в какой-то мере «оправдывают» приводимые в обзорной работе [51] странные данные о том, что культивируемых клетках, в которых отсутствует митохондриальная ДНК, нарушены дыхательные процессы, но не происходит типичный апоптоз. Поэтому физиология митохондрий, по мнению авторов этого обзора, не играет существенной роли в гибели клеток, и вопрос о механизме участия митохондрий в сложном процессе апоптоза в значительной степени спорный и требует дополнительного изучения. Нам, однако, представляется, что в указанных случаях причастность митохондрий к кислородно-перекисному механизму апоптоза просто сведена к минимуму, так как они для реализации типичного апоптоза практически отсутствуют, а микросомы для этой цели ничем не активированы. Привлекают внимание также материалы, в частности, о апоптозиндуцирующих свойствах митохондрий в возрастном аспекте и о некоторых особенностях индукции апоптоза вообще. Для анализа этих данных придется напомнить последовательности дисбалансов Δ условных (ПО-АО) о введенной нами в рассмотрение «специализированных» между их прооксидантными диапазонов (ПО) и антиоксидантными (АО) составляющими в клетке: ΔИ(ПО-АО)<ΔП(ПОАО)<ΔА1(ПО–АО)<ΔК(ПО-АО)<ΔА2(ПО–АО)<ΔЦ(ПО-АО) или в сокращенной записи: ΔИ<ΔП<ΔА1<ΔК<ΔА2 < ΔЦ. При дисбалансах ΔИ, ΔП, ΔК и ΔЦ реализуются соответственно интерфаза (состояние покоя), пролиферация в норме (окислительный митогенез), канцерогенез и окислительный цитолиз в клетке, а в диапазоне дисбалансов ΔА1 и ΔА2 индуцируются соответственно апоптозы типа А1 и А2 [7, 8]. 4 Высокая вероятность существования указанной последовательности диапазонов дисбалансов аргументировалась тем, что в ходе длительной биологической эволюции, в условиях постепенного возрастания в земной атмосфере свободного О2, клетки адаптировались к токсическому действию этого сильного окислителя и его активных форм. В одних случаях «изобретались» различные антиоксиданты и органеллы, заметно снижавшие в клетке уровень О2 и его активных форм. Среди таких органелл наиболее важную роль играют митохондрии, утилизирующие, по разным оценкам, до 95-99 % поступившего в клетку О2. В других случаях, когда дисбаланс Δ (ПО–АО) в клетке оказывался все же дестабилизирующим фактором и приводил к серьезному нарушению в ней каких-то регуляторных и синтетических процессов, несовместимых с нормальным выполнением необходимых функций, природа пошла на радикальный акт: запрограммировала гибель таких дефектных клеток. К числу последних отчасти относятся клетки стареющего организма и подверженные различным, прежде всего, «оксистрессовым» болезням (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.), вызванных дисфункцией митохондрий [61]. На разных этапах эволюции указанная «адаптивная» ситуация возникала, вероятно, неоднократно, и мы предположили, что существуют, по крайней мере, 2 разных типа апоптоза, которые реализуются, скорее всего, по сходным, но всё же несколько различным механизмам в диапазонах дисбалансов ΔА1 (ПО–АО) и ΔА2 (ПО–АО). Старение клеток и связанные с ним возрастные патологии происходят в основном при окислительном стрессе, хотя и оказывающим токсическое действие на многие структуры и функции клеток, но все же при дисбалансе меньшем, чем ΔА1. Чем старее клетка, тем выше уровень окислительного стресса и соответственно вероятность перехода в ней дисбаланса на ближайший к нему диапазон ΔА1, т. е. индукции апоптоза А1. В этом плане нам понятны результаты изучения влияния возрастных особенностей нарушений энергетической функции митохондрий на их 5 способность индуцировать апоптоз в модельных системах [11]. Действительно, в этой работе показано, что при старении крыс апоптогенность митохондрий из их печени увеличивалась независимо от механизма, детерминирующего нарушение митохондриального дыхания. В стареющем сердце происходит потеря миоцитов за счет апоптоза, при этом из их митохондрий освобождается цитохром с [57], что, как отмечалось выше, связано с окислительной модификацией ассоциированного с ним кардиолипина. Примечательно, что указанные эффекты выявлены даже у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Их старые материнские клетки, но не молодые, содержат АФК, расположенные в митохондриях. Относительно большая доля этих состарившихся клеток проявляет фенотипические маркеры апоптоза. Эти данные обнаруживают физиологическую роль апоптоза у дрожжевых клеток, не подвергнутых стрессу [42]. Проблема апоптоза при старении клеток затронута и в работе [28], Автор ее ссылается на известные данные о развитии в клетках стареющего организма окислительного стресса и решающей роли последнего для индукции апоптоза и в то же время высказывает сомнение в значимости окислительных повреждений митохондрий в процессе старения, ввиду отсутствия массового апоптоза у стареющих индивидуумов. Поэтому им предложена теоретическая, спекулятивная как он называет, версия, «согласно которой существует небольшая вероятность того, что накопление повреждений в митохондриях постепенно снижается, так как уменьшается продукция гидроксильных радикалов». Кроме того, он полагает, что «в клетках стареющих организмов изменяется внутрисистемное рспределение фаголизосом, которые элиминируют поврежденные митохондрии». Не соглашаясь с подобным мнением, в порядке возражения повторим сказанное нами выше: митохондриальная теория старения достаточно обоснована, но значения дисбаланса и изменения, вызываемые окислительными повреждениями, не достигают 6 того уровня, чтобы индуцировать в массовом порядке апоптоз А1 стареющих, в общем случае гетерогенных по составу, клеток. Из указанной выше последовательности «специализированных» диапазонов дисбалансов вытекают различные возможности для апоптоза нормальных и опухолевых клеток при постепенном изменении в них значений дисбаланса: для нормальных (неопухолевых) клеток вследствие переходов ΔИ→ΔА1 или ΔП→ΔА1, а для опухолевых клеток из-за переходов ΔА1←ΔК или ΔК→ΔА2. Фактов гибели нормальных клеток по механизму апоптоза достаточно в литературе. Одним из них является, в частности, апоптоз клеток скелетных мышц цыпленка вследствие окислительного стресса, обусловленного недостаточностью антиоксидантов (селена, витамина Е) в корме [53]. Но более привлекательным представляется двоякий путь апоптоза клеток неоплазмы противоположно действующими анти- и прооксидантными агентами и факторами. Это принципиально важный момент в плане выбора стратегии и тактики лечения онкологических заболеваний. Оба пути апоптоза подтверждены многими экспериментальными фактами. К таковым, в дополнение к приведенным в [7,8], можно привести и другие, преимущественно «прооксидантные», опубликованные в научной литературе позднее. Среди них интересными представляются, в частности, следующие. АПОПТОЗ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ АНТИОКСИДАНТНЫХ И ДРУГИХ К-СНИЖАЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ Антиоксиданты разного уровня действия (антикислородные, антирадикальные, антиперекисные) и агенты, так или иначе снижающие ПО-составляющую дисбаланса ∆ (ПО – АО) в различных типах опухолевых клеток, вызывают их апоптоз [58], обозначенный нами как А1 (см. выше). Клетки MCF-7 человека, обработанные генистеином (флавоноидом, содержащимся в соевых бобах) в концентрации 50 мкМ в течение более 48 ч, подвергались апоптозу. О нем судили по протеолитическому расщеплению поли(ADP-рибоза)полимеразы (ранний 7 маркер апоптоза) и фрагментации яДНК (поздний маркер апоптоза). Выраженность апоптоза и подавление роста клеток MCF-7 возрастали при более продолжительной инкубации их с генистеином [80]. Тот же антиоксидант генистеин ингибирует индуцированный канцерогенами рак у животных in vivo, а также ангиогенез и опухолевые метастазы; модулирует in vitro экспрессию генов, ответственных за клеточный цикл и апоптоз. А в странах Востока, традиционно употребляющих в пищу соевые бобы, наблюдается значительно меньшая заболеваемость раком молочной и предстательной желез [63]. Кроме того, по данным авторов этой работы, генистеин ингибирует активацию сигнальных путей NF-kB и Akt, что косвенно указывает на АФК-зависимую активацию этих путей. Фенретинид, противоопухолевое средство и мощный индуктор апоптоза клеток линии HeLa, угнетал ПОЛ микросом печени крысы с большей результативностью, чем витамин Е, являясь, по-видимому, эффективным антиоксидантом [72]. Введение мелатонина, одного из наиболее мощных стимулировало и апоптоз универсальных клеток эндогенных аденокарцином антиоксидантов, толстой кишки, индуцируемых 1,2-диметилгидразином [17]. А по данным работы [46], на линии трансформированных клеток MEF и папиллом 308 серосодержащие антиоксиданты (N-ацетилцистеин, димеркаптопропанол) индуцировали апоптоз. Этот эффект не наблюдался в нормальных клетках. Указанные антиоксиданты повышали в клетках содержание тиолов, увеличивали экспрессию онкобелка р53 путем ускорения трансляции мРНК р53. В линиях раковых клеток человека FaDu и Jurkat, а также в мезенхимных клетках мышей Balb/c-3T3, трансформированных v-Ki-Ras, апоптоз индуцировала α-липоевая кислота; в нетрансформированных клетках она вызывала лишь обратимый блок клеточного цикла в фазе G0/G1, увеличивая при этом посттрансляционно содержание ингибитора циклин-зависимой киназы p27Kip1 [76]. Эти данные также можно связать с тем, что α-липоевая кислота как антиоксидант снижает в раковых клетках 8 ΔК до апоптозного уровня ΔА1, а в нормальных клетках – ΔП до ΔИ. Антиоксидант кверцетин индуцировал апоптоз лейкозных клеток HL-60, причем при его действии на них не наблюдалось накопления перекисей, а линии зрелых моноцитов ТНР-1 не подвергались апоптозу [65]. Эти данные отчетливо указывают на реализацию здесь именно перехода ΔА1←ΔК, при котором вследствие снижения уровня дисбаланса ΔК и не должно происходить накопления перекисей, а воздействие кверцетина на нормальные клетки (моноциты) при относительно низком в норме уровне у них дисбаланса ΔИ или ΔП никак не может быть апоптогенным. Апоптозиндуцирующее действие кверцетина как антиоксиданта на различные типы раковых клеток показано раннее и рядом других исследователей [см. 8, п. 7.2.1]. Как известно, липо- и циклооксигеназный пути окисления арахидоновой кислоты связаны с продукцией АФК и липопероксидацией, способствующих реализации кислородно-перекисных механизмов апоптоза и канцерогенеза путем повышения в нормальных клетках дисбаланса .∆ (ПО-АО) соответственно до ∆А1 и ΔК. [8]. Ингибиторы липои циклооксигеназ должны противодействовать этим процессам в нормальных клетках; напротив, в опухолевых клетках такие ингибиторы могут приводить к апоптозу А1, снижая дисбаланс ∆К до ∆А1. Например, исследование влияния ингибиторов NADPH-оксигеназы, ксантиноксидазы и липооксидаз (ЛО) на опосредуемый катионными липосомами апоптоз макрофагов RAW 264.7, показало, что ингибиторы ЛО предотвращают снижение содержания ДНК, фрагментацию ДНК и образование АФК, вызванные липосомами. Из этого сделан вывод о существенной роли ЛО в образовании АФК, которое необходимо для индукции апоптоза [73]. Cпецифические ингибиторы 5- и 12-липооксигеназ (5-ЛО, 12-ЛО) вызывали апоптоз клеток лимфолейкоза Р388. Концентрации ингибиторов АА861 для 5-ЛО и бакалейна для 12-ЛО, вызывающие 50%-ное снижение выживаемости, составляли 50 мкМ. Избыток простагландина Е2 также 9 подавлял пролиферацию клеток Р388 и индуцировал их апоптоз [2]. Этот простагландин приводит, по-видимому, в действие последовательность процессов: активация аденилатциклазы – повышение уровня в клетке циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) – активация цАМФ митохондриального дыхания и утилизации О2 митохондриями – снижение концентрации О2 в клетке и соответственно дисбаланса ∆К до ∆А1. Кстати, известен патент на способ селективной индукции апоптоза опухолевой клетки посредством ингибирования 12-ЛО [75]. Авторы работы [32] справедливо отмечают, что при лечении опухолей слабое внимание уделяется синтетазе жирных кислот (ЖК), несмотря на высокий уровень экспрессии в клетках неоплазмы, в отличие от нормальных клеток, ферментов, синтезирующих ЖК. Изучая влияние ингибитора синтетазы ЖК церуленина (линия LoVo), они обнаружили в опухолевых клетках типичные для апоптоза морфологические изменения при действии названного ингибитора. Если клетки нормальных тканей в основном используют липиды пищи и поэтому относительно устойчивы к цитотоксическим эффектам церуленина, то клетки LoVo, подобно многим другим человеческим опухолям, зависимы от биосинтеза ЖК de novo и поэтому чувствительны к ингибированию синтеза ЖК. Указанные наблюдения интересны, в какой-то степени принципиальны и с точки зрения кислородно-перекисных концепций канцерогенеза и апоптоза поддаются достаточно аргументированному объяснению того, какой из типов апоптоза (А1 или А2) здесь имеет место. Наши доводы склоняются в сторону апоптоза А1. Действительно, согласно тех же концепций перекиси липидов и образующиеся в ходе пероксидации АФК являются одними из активно действующих промежуточных агентов процессов канцерогенеза и апоптоза [см. 8, п. 2.1 и 7.1]. Повышение их уровня в опухолевых клетках в условиях пероксигеназного стресса прямо зависит, естественно, и от содержания в них ЖК как субстрата, особенно ненасыщенных ЖК. Увеличение же количества последних инициировано, 10 скорее всего, в порядке недостаточностью компенсации митохондриального возросшего дыхания их и расхода, последующим устойчивым поддержанием в этих клетках состояния гипероксии. В такой ситуации введение в опухолевые клетки ингибитора синтетазы ЖК должно привести к падению уровней ЖК (липидов) и соответственно цитотоксических продуктов их перекисного окисления и АФК, а также к снижению в целом дисбаланса ∆К до, прежде всего, ближайшего к нему апоптозного в диапазоне ∆А1. Эти суждения наши носят предварительный характер и нуждаются, конечно, в экспериментальной проверке. Безусловный интерес вызывают материалы о защитном действии белков теплового шока (hsp), в частности hsp70, от различных цитотоксических факторов, в том числе и от вызывающих апоптоз, учитывая известные данные о hsp70 как антиоксистрессовом факторе. В нормальных клетках, например в лимфоцитах, окислительный стресс увеличивает экспрессию этих защитных белков [67]. В опухолевых клетках возможны различные исходы в зависимости от содержания в них hsp70 (избыток или дефицит) противоопухолевыми и того, препаратами в комбинации с какими (прооксидантными или антиоксидантными) он применяется. С позиций наших представлений, увеличение внутриклеточного содержания hsp70, независимо от того, каким образом это достигается, должно приводить клетки опухоли к апоптозу А1. Одним из способов получения такого результата является внедрение в опухолевые клетки онколитических микроорганизмов (бактерий, вирусов), экспрессирующих белки hsp. Такие микроорганизмы или содержащие их составы предлагается вводить больным в опухоли, где они могут селективно расти и лизировать опухолевые клетки. К тому же, «в лизированных клетках опухоли высвобождаются антигены, что приводит к индукции иммунного ответа против опухолевых клеток и киллингу метастатических опухолей» [22]. Клетки мышиной мастоцитомы Р815, трансфицированные геном мембранносвязанного белка hsp70, 11 вводили мышам DBA/2. Такие клетки отторгались 50% мышей, а клетки без hsp70 приживались у 100% мышей [23]. Здесь клетки мастоцитомы, экспрессирующие антиоксидантный hsp70, скорее всего, просто подвергались апоптозу А1. Напротив, истощение пула белка hsp70, например, вследствие трансфекции антисмысловых кДНК hsp70 может привести к возрастанию в клетках неоплазмы дисбаланса ΔК до ΔА2 и их апоптозу А2. Такой эффект получен, по всей видимости, в культурах клеток рака молочной железы MDA-MB-468, MCF-7, BT-549 и SK-BR-3. На жизнеспособность же нетуморогенных эпителиоцитов HBL-100 молочной железы или фибробластов WI-38 указанная трансфекция не влияла. Кроме того, апоптозная гибель опухолевых клеток происходила независимо от каспаз и белка-супрессора р53, а противоапоптозные белки bcl-2 и bcl-XL не спасали от гибели, вызванной антисмысловыми кДНК hsp70 [54]. В случае воздействия белком hsp70 на опухолевые клетки после обработки их прооксидантными апоптотическими агентами и факторами следует ожидать предотвращения перехода ΔК → ΔА2 и апоптоза А2. Действительно, обработка клеток Jurkat перекисью водорода вызывала гибель клеток, а трансфекция белка hsp70 препятствовала развитию таких ранних апоптозных проявлений как деполяризация митохондрий, высвобождение из них цитохрома с и др. [26]. Сходные результаты, похоже, получены в работе, где клетки миелоидного лейкоза человека U937 обрабатывали противоопухолевыми препаратами адриамицином и этопозидом. Повышение в них уровня экспрессии hsp70 с помощью легкого теплового воздействия или путем трансфекции клеток геном человека hsp70 приводило к торможению процесса апоптоза клеток. Авторы данного исследования [6] полагают, что белок hsp70 может подавить ферментативный цикл каспаз-3 и –7. В общем же, на наш взгляд, hsp70, будучи защитным средством от окислительного стресса, противодействует апоптозу А2 опухолевых 12 клеток, но может при достаточно высоком содержании снизить в них «канцерогенезный» дисбаланс ΔК до уровня, соответствующего апоптозу А1; при истощении hsp70 создаются реальные условия для индукции апоптоза А2 опухолевых клеток; угнетение синтеза hsp70 в нормальных клетках может в принципе привести к повышению в них дисбаланса ΔП до ΔА1 или даже до ΔК; напротив, увеличение в этих клетках содержания белка hsp70 должно препятствовать возрастанию в них нормального дисбаланса до ∆А1. Такой вариант развития событий, похоже, изложен в работе [4]. Здесь лимфоциты ряда культивируемых линий, тимоциты и клетки селезенки мышей захватывали экзогенные молекулы белка hsp70, которые быстро проникали внутрь клеток и усиливали их устойчивость к апоптозу. АПОПТОЗ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ ПРООКСИДАНТНЫХ И ДРУГИХ ∆К-ПОВЫШАЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ За последние десятилетия накоплено много информации по одному из самых эффективных способов лечения рака – фотодинамической терапии (ФДТ), основанной на способности порфиринов и некоторых других веществ генерировать в фотовозбужденном состоянии АФК. С точки зрения кислородно-перекисной концепции апоптоза, ФДТ является наиболее показательным и очевидным приемом повышения в опухолевых клетках дисбаланса ΔК до ΔА2 или даже до цитолизного ΔЦ. При ФДТ уже на ранней стадии происходит выброс цитохрома с из митохондрий, приводящий к ингибированию дыхания [77]. Авторы работы [10], применившие ФДТ для лечения аденокарциномы ободочной кишки человека линии НТ29, полагают, что «значение апоптотических событий в гибели клетки фотосенсибилизатора должно в быть отдельности». установлено для Действительно, каждого вызываемая различными фотосенсибилизаторами интенсивность апоптоза будет для 13 каждого из них чем-то отличаться, но главное – все сенсибилизаторы в принципе, независимо от их типа, апоптогенны для опухолевых клеток. 15-липооксигеназа-1 (15-ЛО-1), ведущая в реакциях с ее участием к образованию АФК и липопероксидации, оказывает противоопухолевое действие при раке прямой кишки человека. При трансплантации клеток НСТ-16 прямой кишки, трансфицированных 15-ЛО-1, бестимусным мышам nude опухоли были по размерам меньше, чем просто от клеток НСТ-16. Если в нормальной ткани 15-ЛО-1 локализовалась в эпителии слизистой, то в опухолевой она распространена по всей ткани, располагаясь в основном в воспалительных клетках стромы [52]. Очевидно, здесь 15-ЛО-1, проявляя прооксидантный эффект, способствует переходу ΔК → ΔА2 и соответственно развитию апоптоза А2 клеток рака прямой кишки. 15-ЛО является одним из ферментов, участвующих в радиационном апоптозе тимоцитов, причем действующим агентом здесь показана 15-гидроксиэйкозатетраеновая кислота – продукт 15-ЛО. Авторы этого исследования [3] полагают, что повышение активности 15-ЛО после облучения обусловлено как увеличением ее количества, так и непосредственной активацией предсуществующего фермента. Несколькими годами раньше на клетках рака толстой кишки было показано, что экспрессия 15-ЛО-1, индуцированная нестероидными противовоспалительными средствами, предшествует апоптозу указанных клеток, а ингибирование 15-ЛО-1 блокирует их программированную гибель. Используя ингибитор NS-398 циклооксигеназы-2 (ЦО-2), установили также независимость апоптоза клеток рака толстой кишки от ЦО-2 [68]. Способность различных гидропероксидов, генерируемых 5-ЛО, 12-ЛО и 15-ЛО, индуцировала время- и дозозависимо апоптоз клеток лейкоза К562 и нейробластомы СНР100 человека. Конечные продукты каскада арахидоновой кислоты – лейкотриены, простагландины и тромбоксаны – не проявляли цитотоксических свойств [49]. По тому же, вероятно, сценарию фенретинид индуцирует апоптоз А2 в клетках 14 нейробластомы. Исследование путей образования АФК при действии его на эти клетки показало, что первичным источником образования АФК служит активность 12-ЛО [47]. По данным работы [43], селенит натрия вызывал окислительный стресс и зависимый от времени и дозы апоптоз клеток NB4 человеческого острого промиелоцитарного лейкоза. При этом образование АФК в клетках NB4 (определяли хемилюминесцентным методом) увеличивалось в 17 раз по сравнению с контрольной группой и сопровождалось уменьшением внутриклеточного GSH. Окислительный стресс и апоптоз ингибировались антиокисдантом N-ацетилцистеином. По результатам этих исследований селенит натрия рекомендуется для лечения злокачественных опухолей путем индукции апоптоза, который в данном случае относится, по нашим понятиям, к типу А2. Привлекают внимание и данные об апоптогенезе кадмия, учитывая причастность его к дисфункции митохондрий и пероксигеназному стрессу. Эти качества кадмия, связывавшиеся нами с его проканцерогенезными эффектами [9], могут теперь привлечены и для понимания индукции им апоптоза А2 раковых клеток путем повышения в них дисбаланса ΔК до ΔА2. Сказанное подтверждают следующие факты. Инкубация гепатоцитов радужной форели с Cd2+ в концентрации 1-10 мкМ сопровождалась возникновением признаков апоптоза. А при совместной инкубации клеток с Cd2+ и соединением со свойством ловушки свободных радикалов (приводится его формула) проявления апоптоза были незначительными. В этой связи обсуждена роль генерации АФК в цитотоксичности Cd2+ [62]. Инкубация с CdCl2 клеток U937 снижала мембранный потенциал митохондрий, индуцировала апоптоз этих клеток, о чем судили по изменению морфологии и фрагментации ДНК [45]. В условиях in vitro кадмий дозозависимо (0,1-100 мкМ) вызывал также апоптоз клеток HL-60, сопровождавшийся повышением в цитозоле содержания цитохрома с. 15 Высвобождение последнего кадмий (25 мкМ) стимулировал и из изолированных митохондрий [39]. Из корней Sophora subprostrata выделен индуктор апоптоза, названный софораноном. Он ингибировал рост клеток и индуцировал апоптоз различных клеточных линий солидных опухолей человека и клеток лейкоза На U937. начальных стадиях воздействия софоранона происходило образование АФК, открытие митохондриальных пор и высвобождение цитохрома с из митохондрий. Из-за сильных ростингибиторной и апоптоз-индуцирующей активностей софоранон причислен к уникальным противораковым средствам, воздействующим на митохондрии [34]. Авторы данного исследования сравнивают эффекты софоранона с действием других флавоноидов, в частности кверцетина, что, по нашему мнению, не совсем корректно, так как кверцетин, в отличие от прооксиданта софоранона, является антиоксидантом и вызывает апоптоз А1 раковых клеток (см. выше). Весьма убедительны факты апоптогенного действия витаминов группы К, особенно витамина К3 (менадиона), на опухолевые клетки вследствие еще большего повышения в них уровня окислительного стресса. В проявлении такого эффекта витамина К3 важным считают его свойство быть именно индуктором окислительного стресса [5], и это подтверждено в ряде других исследований. Так, методом хемилюминесценции показано, что стимуляция некоторых В- и Тлимфоидных клеток человека менадионом приводит к генерации АФК, которые обнаруживаются уже через 20 сек после введения стимулятора, а ингибитор NADPH-оксидазы подавляет продукцию АФК [71]. Менадион (1 мМ) индуцировал в плазме крови крыс выработку АФК посредством неферментативной реакции с белковыми тиолами плазмы, N- этилмалеимид же (10 мМ) почти полностью нормализовал резко сниженный их уровень в присутствии менадиона. Кроме того, цитотоксическое действие последнего на тромбоциты усиливалось при 16 наличии плазмы, а супероксиддисмутаза и каталаза снижали расход О2, повышенный под действием менадиона [24]. Связь апоптогенного действия витамина К3 с его прооксидантным действием особенно четко показана в следующих работах. В клетках MCF7 витамин К3 индуцировал окислительный стресс, сопровождавшийся образованием свободных радикалов и разрывами яДНК, в клетках же лимфомы человека (линия Jurkat) он приводил к снижению экспрессии гена c-myc, ингибированию репликации ДНК и к активации программы апоптоза, которые подавлялись при добавлении в культуральную среду GSH [21]. Сильное цитотоксическое действие витамин К3 оказывал на клеточные линии глиомы человека, а также индуцировал их апоптоз, увеличивая образование в клетках АФК и усиливая экспрессию Fas/APO-1 [70]. В высокой концентрации (100 мкМ) менадион вызывал быструю гибель клеток линии рака молочной железы крыс AR4-2J (90 %) путем некроза, а низкие его уровни (10-20 мкМ) приводили к апоптозу, опосредованному белком р53, причем антиоксидант GSH частично ингибировал действие менадиона [64]. Здесь явно просматриваются вызываемые менадионом эффекты: при высокой его концентрации – окислительный цитолиз за счет возрастания дисбаланса ΔК сразу до ΔЦ, а при малой концентрации – апоптоз А2 (переход ΔК на более низкий, чем ΔЦ, уровень ΔА2.). Различные гомологичные аналоги витамина Е (α-,γ-и δ-токоферолы) индуцировали апоптоз клеток гепатомы человека HepG2, причем наибольшей рост-ингибирующей и апоптоз-индуцирующей активностью обладал δ-токоферол [50]. Эти эффекты токоферолов мы хотели бы связать прежде всего с известным действием их как антиоксидантов, которые в данном случае должны снижать внутриклеточный дисбаланс ΔК до ΔА1. Однако указание авторов рассматриваемой работы о том, что различие в природе и эффективности антиракового действия токоферолов не коррелировало с их антиоксидантной активностью, вынуждает искать 17 возможное альтернативное объяснение полученного результата. Оно может быть связано, в частности, со способностью токоферолов к самоокислению. Они, в отличие от большинства синтетических фенольных антиоксидантов, обладают значительным сродством к перокси-радикалам, а образующиеся из токоферолов радикалы высоко стабильны в реакциях рекомбинации и продолжения цепи окисления [1]. В этой ситуации токоферолы могут способствовать возрастанию дисбаланса ΔК в опухолевых клетках до ближайшего апоптозного ΔА2, а не снижения до ΔА1 как в случае чисто антиоксидантного их действия. Привлекательным представляется соединение сукцинат-α-токоферол (СТ) – эфир α-токоферола и янтарной кислоты, проявляющий различные биологические эффекты, в том числе усиливающий образование в клетках NO и О 2 . В этой связи интересны данные о большей подверженности апоптозу, вызванному СТ, клеток рака молочной железы мыши линии С127, чем нормальные супероксиддисмутаза и клетки α-токоферол той же железы, ингибируют причем повреждение морфологической структуры. Эти результаты предполагают, что О 2 и другие АФК причастны к СТ-индуцированной токсичности и что в раковых клетках защитная антиоксидантная система слабее [14]. Авторы этой же работы показали и другое: «введение в/в везикулы СТ полностью подавляло рост клеток меланомы В16-F1, привитой на спины лысых мышей, и увеличивало их продолжительность жизни». Данные о том, что как избыток, так и дефицит железа (Fe) повреждают митохондрии и митохондриаьную ДНК [78], дают нам повод для утверждения: тип индуцируемого свободным Fe апоптоза (А1 или А2) раковых клеток будет зависеть от содержания этого «прооксидантного» металла. С одной стороны, избыток Fe вызывает окислительный стресс, интенсификацию процессов ПОЛ, возникновение неоплазм [см. 8, п. 2.1.5] и далее, по нашей логике, апоптоз А2 их клеток. В случае же дефицита Fe тип индуцируемого апоптоза опухолевых клеток не так уж очевиден. 18 Недостаточное содержание Fe должно, на первый взгляд, приводить к снижению уровня окислительного стресса и повышению вероятности индукции апоптоза А1. Здесь, однако, возможен вариант и с апоптозом А2, если удастся обосновать механизм усиления окислительного стресса и возрастание дисбаланса ΔК до ΔА2 при дефиците Fe. Такой вариант развития событий может быть в принципе реализован в случае заметного ослабления функций зависимых от Fe ферментов дыхательной цепи митохондрий. Это обстоятельство должно приводить к снижению потребления О2 митохондриями, возрастанию уровней внутриклеточной гипероксии и дисбаланса ΔК, т. е. к созданию условий для апоптоза А2 даже при дефиците железа. Кстати, по той же причине дыхательной недостаточности при длительном дефиците Fe возможен и переход ΔП→ΔК в нормальных клетках, чем, по-видимому, и объясняется увеличение риска канцерогенеза [60]. Об индукции апоптоза чувствительных к содержанию Fe раковых клеток было сообщено, например, в работе [40], где высвобождение цитохрома с, Apaf-1 и AIF из митохондрий при дефиците Fe никак не связывалось с введенной нами градацией апоптоза на А1 и А2 в зависимости от внутриклеточного уровня окислительного стресса [7]. Приведенные выше факты касаются, в основном, апоптоза А2, индуцируемого усилением ПО-составлящей дисбаланса ΔК (ПО-АО). Данных же о повышении этого дисбаланса до ΔА2 (ПО-АО) путем уменьшения его АО-составляющей сравнительно мало. Одним из стимулов такого рода может быть лишение опухолевых клеток глутатиона. В обзорной статье на эту тему [79] представлены данные о возможности селективной индукции снижения глутатиона в клетках неоплазмы и о создании индукторов апоптоза, действующих через лишение этих клеток глутатиона. Перечень экзогенных факторов, индуцирующих апоптоз, и эндогенных соединений в клетке, изменяющихся в процессе его развития (реализации), достаточно велик. Некоторые из них, судя по известным зафиксированным 19 эффектам, тоже можно было бы рассматривать и интерпретировать в рамках разрабатываемой нами модели процесса апоптоза. Однако ограничения на объем данной статьи исключили такую возможность. Обратим теперь внимание на весьма актуальный и принципиальный вопрос: может ли апоптотическая опухолевая клетка вырабатывать сигнал для индукции, подобно цепному процессу, апоптоза соседних клеток неоплазмы? Такая постановка вопроса вызвана существованием мнения о том, что программа апоптоза после активации в отдельно взятой клетке не может, как при инфекции, инициировать возбуждение той же программы в других окружающих ее клетках. Иными словами, каждая клетка должна быть подготовлена к суициду самостоятельно и определять свою судьбу независимо от состояния соседних клеток. Однако это положение, пока в общем-то спорное, некоторыми исследованиями, похоже, подвергается сомнению. Например, оригинальными представляются эксперименты с одиночными клетками остеосаркомы человека. В одной группе таких клеток митохондрии нагружали фотоактивируемым индуктором свободных радикалов, а митохондрии другой группы таких же клеток не подвергали этой процедуре. Анализ апоптозных процессов в митохондриях после облучения показал, что фотоповрежденные митохондрии индуцируют сигнал, ведущий к поражению митохондрий в соседних, не нагруженных фотосенсибилизатором клетках. В последних происходили быстрая деполяризация митохондрий и задержанный во времени выброс цитохрома с, причем «в реализации и передаче апоптозного сигнала от клетки к клетке не участвуют каспазы и Bax, но эта реакция зависит от ионов кальция» [48]. Нам представляется, что в указанном случае носителем сигнала являются, скорее всего, АФК и перекисные продукты, которые как сигнальные молекулы в избытке образуются и частично высвобождаются при апоптозе фотосенсибилизированных клеток. В соседних клетках эти сигнальные молекулы усиливают, вероятно, окислительный стресс, 20 повышая в них дисбаланс К до ближайшего к нему уровня А2, и индуцируют апоптоз А2, что особенно реально в гипероксических условиях in vitro. Кстати, несколько раньше идея транслокации апоптотических сигнальных молекул в форме свободных радикалов О2 от одних клеток к другим была высказана в работе [41]. Здесь нормальные и трансформированные клетки (ЗТЗМ×А и ЗТЗМ×С11 соответственно) содержали в одной питательной среде, не допуская контакта между ними. Апоптоз-индуцирующий сигнал в присутствии фактора TGF-β вначале формируется в нормальных клетках, затем сигнальные молекулы транспортируются от них к трансформированным, которые после этого подвергаются апоптозу, причем все этапы реализуются с участием свободных кислородных радикалов. В принципе данные этого исследования можно интерпретировать и по другому [см. 8, п. 7.7.7]. Согласно изложенным нами материалам и в соответствии с кислородно-перекисной концепцией апоптоза [7, 8], ключевую роль на различных стадиях этого процесса, как и при канцерогенезе и ряде других патологий, играют АФК и некоторые перекисные продукты. Они, по данным исследований двух последних десятилетий, выполняя функцию сигнальных молекул, участвуют в активации определенных факторов транскрипции и в модификации экспрессии многих генов, в том числе протоонкогенов [13, 37]. В результате прямого или косвенного влияния АФК, перекисей липидов и белков на синтетические и регуляторные процессы заметно изменяется спектр экспрессируемых белков, индуцируется активация или инактивация целого ряда ферментов, причастных к реализации исполнительных звеньев апоптоза. Однако тонкие «детали» его механизма остаются пока не разгаданными ДИСБАЛАНСЫ ∆А1, ∆К, ∆А2 И ИСПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЗВЕНЬЯ АПОПТОЗА Изложенные выше факты и наше их понимание представляют лишь вводную часть кислородно-перекисной концепции апоптоза. Гораздо 21 важнее, естественно, знать механизмы действия исполнительных, демонтирующих клетку звеньев процесса апоптоза, «запускаемого» при соответствующих дисбалансах ∆ (ПО-АО). Здесь возникают трудные и достаточно принципиальные вопросы, например, такие: почему опухолевые клетки с дисбалансом ∆К внутри них в большинстве случаев не подвергаются апоптозу самостоятельно, а требуют вмешательства извне для перевода их в апоптогенные условия – снижения ∆К до ∆А1 или повышения ∆К до ∆А2? Каковы причины того, что исполнительные звенья апоптоза начинают «срабатывать» почти автоматически при более низких или, наоборот, более высоких, чем ∆К, дисбалансах ∆А1 и ∆А2? Индуцирует ли каждый из множества самых различных агентов и факторов апоптоз клеток строго по своему индивидуальному специфическому плану или, в конечном счете, все сводится к какому-то единому глобальному механизму? Как представляется нам, в ходе развития жизни на Земле, биологические организмы эволюционировали, поэтапно адаптируясь к постепенно возраставшей концентрации О2 в земной атмосфере. На каждом этапе одни белки или группы белков стали выполнять функцию защиты, ингибиторов токсического окислительного действия О2 и его активных форм, а другие укрепились в роли разрушителей молекул, структурных образований и целых клеток, если они не соответствовали общему направлению эволюционного развития и в этом смысле могли считаться дефектными. Обе группы белков действовали только в пределах сложившихся к определенному этапу развития диапазону дисбалансов ∆ (ПО-АО) внутри клеток, подчиняя свою активность задачам данного эволюционного этапа. На последующих этапах эволюции подобные им белки возникали и адаптировались к новым уровням дисбалансов ∆ (ПОАО) с целью выполнения тех же или даже других задач этапа. Следуя указанной логике, можно думать, что дисбаланс ∆К способствует не только трансформации нормальных клеток в опухолевые, 22 но и ограничивает активность каких-то проапоптотических белков путем АФК-зависимой инактивации или мутации их генов, в частности гена белка-супрессора р53 [69]. Тот же дисбаланс ∆К может быть причастным к возрастанию синтеза антиоксистрессового белка теплового шока hsp70, содержание которого повышено во многих злокачественных опухолях по сравнению с нормальными тканями [6], что должно препятствовать их апоптозу А2. Широко известны также антиапоптозное действие фактора транскрипции NF-kB, активируемого АФК [13, 16], и необходимость высокого конститутивного уровня для NF-kB жизнеспособности опухолевых клеток [12]. Эти и некоторые другие данные указывают на то, что в клетках опухоли включается множество механизмов, чтобы нарушить апоптоз. Механизмы этого нарушения служат, естественно, мишенью действия противоопухолевых препаратов [81] – проблемы, привлекшей внимание большого числа спецалистов-онкобиологов во многих странах. Различия в исполнительных звеньях при апоптозах А1 и А2 пока неизвестны. Скорее всего, дисбалансы ∆А1 и ∆А2 приводят к активации или инактивации сходных наборов про (Bax, Bak, Bid и др.)- и антиапоптозных (Bcl-2. Bcl-XL, Mcl-1 и др.) онкобелков, но различающихся изоформами и их соотношением. Это касается и каспаз, и участвующих на промежуточных этапах апоптоза различных протеинкиназ. При этом некоторые из указанных исполнительных звеньев, в частности онкобелки и каспазы, могут прямо или косвенно активироваться или инактивироваться, по-видимому, только в диапазоне дисбалансов ∆А1 или ∆А2 действующими в этих пределах уровнями АФК, перекисей липидов и белков. Одним из примеров такого рода может служить инактивация каспаз в лизатах апоптотических клеток Jurkat пероксидами, образованными под действием кислорода из содержащих тирозин и триптофан пептидов. Считают, что в клетках, где образуются пероксиды белков, они могут влиять на течение апоптоза [30]. Вероятно, это происходит 23 при «канцерогенезном» дисбалансе ∆К, что должно быть еще одной причиной (в дополнение к указанным выше) относительной резистентности опухолевых клеток в апоптозу. Кстати, не исключено, что ограничение окислительного стресса в митохондриях при апоптозах А1 и А2 тоже определяется разными изоформами тиоредоксина (см. выше), «настроенными» на различные уровни окислительного стресса. Тогда и начальные сигналы для апоптозов А1 и А2 должны возникать в митохондриях лишь в случае превышения в них этих соответственно неодинаковых пороговых значений стресса. В большинстве публикуемых материалов об индукции апоптоза нормальных и опухолевых клеток самыми разными по строению и свойствам веществами нет сведений о том, что они предварительно вызывают внутриклеточный окислительный стресс, который затем как-то влияет на действия и исполнительных звеньев апоптоза. Причин тут несколько. Одни исследователи, не разделяя положения кислородноперекисной концепции, разрабатывают и проверяют свои представления об этом феномене, а другие ставят перед собой частные задачи разобраться с механизмом апоптоза сразу, вне связи с начальными этапами изменений в биоэнергетике клетки, на уровне отдельных исполнительных звеньев (анти- и проапоптозных онкобелков, каспаз, эндонуклеаз, протеинкиназ и др.). Множественность последних и не простые их взаимоотношения между собой, усугубляемые к тому же значительным числом обратных и перекрестных связей, исполнительных звеньев, затрудняют, естественно, эффекты которых выявление непосредственно определяются уровнями АФК и дисбаланса ∆ (ПО-АО) или которые, наоборот, сами влияют на эти уровни. Возможно, также просто маскирование функции таких звеньев другими, не имеющими к апоптозу прямого отношения биохимическими проявлениями. Тем не менее, учитывая все более возрастающий перечень связанных с АФК, как сигнальными молекулами, установление указанных различных двух внутриклеточных типов 24 исполнительных процессов, звеньев представляется весьма вероятным и важным шагом в направлении раскрытия деталей механизма апоптоза. Впрочем, некоторые факты на этот счет известны. Так, имеются данные о косвенном влиянии онкобелка р53 на уровень окислительного стресса в клетке [56] и ответственности повышенного уровня АФК за мутации в гене р53 [69]. Прооксидант пероксинитрит в глиомах человека опосредует нитрозилирование и агрегацию белка р53. Такие посттрансляционные модификации могут быть существенными для инактивации функций р53 при канцерогенезе [25] и р53-зависимом апоптозе. Представлены данные об участии АФК в активации онкогена ras [19], играющего ключевую роль в регуляции пролиферации и роста клеток. А известный антиоксидант кверцетин одинаково эффективно ингибирует экспрессию белков K-, H- и N-ras в клетках рака толстой кишки человека и колоректальных опухолей [59]. К числу активаторов фактора транскрипции NF-kB относятся АФК [13]. Онкобелок Bcl-2, функционируя как антиоксидант, способен подавлять образование и токсическое действие кислородных радикалов [20]; при фосфорилировании же белка Bcl-2 его роль в защите клетки от апоптоза снижается, а уровень ПОЛ повышается [27]. В определенных концентрациях Н2О2, основной медиатор окислительного стресса, вызывает быструю деградацию высокоcтруктурированного хроматина путем активации эндонуклеазы, которая катализирует расщепление петель хроматина и петлевых олигомеров в местах их прикрепления к матриксу [38]. Такое непрямое повреждение хроматина перекисью водорода происходит, вероятно, и при кислородно-перекисном механизме апоптоза. А одна из нуклеаз (эндонуклеаза G), активируемая апоптотическими стимулами, обнаружена в митохондриях фибробластов мышиного эмбриона. Эта новая нуклеаза после высвобождения из митохондрий транслоцируется в ядро, где и расщепляет хроматиновую ДНК на нуклеосомальные фрагменты [44]. 25 Обработка гладкомышечных клеток аорты экзогенным Н2О2 на фармакологическом уровне вызывает их апоптоз и индуцирует экспрессию протоонкогенов egr-1, fra-1 и c-jun. Обсуждая механизм этой экспрессии в ответ на Н2О2, авторы работы [33] отмечают, правда, что указанные эффекты носят косвенный характер: они обусловлены Н2О2- опосредованным фосфорилированием остатков тирозина тирозиновой протеинкиназы и стимуляцией ее активности, а ингибиторы тирозинкиназы супрессируют экспрессию протоонкогенов. Некоторые каспазы, как уже отмечалось, инактивируются под действием О2, образующим пероксиды белков из содержащих тирозин и триптофан пептидов [30], а каспаза-9, наоборот, активируется под действием АФК без участия цитохрома c [36]. Можно надеяться, что в ближайшем будущем усилиями исследователей разных стран будут получены другие факты о взаимосвязи окислительного стресса и исполнительных звеньев канцерогенеза и апоптоза. Они должны показать важную роль дисбалансов ∆А1, К и ∆А2, АФК и продуктов пероксигенации липидов и белков в запуске и реализации этих сложных биохимических процессов. В случае успешного выявления новых фактов такого рода (а не только изменений на начальных «митохондриальных» этапах) значительно возрастает аргументация в пользу того, чтобы концепции канцерогенеза и апоптоза называть «кислородно-перекисными», согласно которым скрытые пока еще АФК- и пероксид-зависимые эффекты проявляются как составные части глобальных процессов окислительного митогенеза, канцерогенеза и апоптоза. 26 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Бурлакова Е. Б., Крашаков С. А., Храпова Н. Г. //Биол. мембраны. 1998. Т. 15. № 2. С. 137. 2. .Гриченко О.Е., Шапошникова В.В., Кудрявцев А.А., Корыстов Ю.Н. //Изв.. РАН. Сер. биол. 2004. № 3. С. 274. 3. Гриченко О.Е., Шапошникова В.В., Левитма М.Х., Кудрявцев А.А., Корыстов Ю.Н. //Радиац. биол. Радиоэкол. 2004а. Т. 44. № 1. С. 27. 4. .Гусарова Г. А., Тарасенко Т. П., Пономарев А. Д., Мурашко Д. А., Сапожников А. М. //Мед. иммунол. 2003. Т. 5.. № 3-4. С.199. 5. Коваленко Д. В., Зеленин А. В. //Биохимия. 1999. Т. 64. № 4. С. 558. 6. Комарова Е.Ю. Маргулис Б.А., Гужова И.В //Цитология. 2004, Т. 46. № 6. С. 550. 7. Лю Б. Н. //Успехи соврем. биол. 2001 Т.121. № 5, с. 488. 8. Лю Б. Н. Старение, возрастные патологии и канцерогенез (кислородно-перекисная концепция). Алматы: Деуир, 2003. 808 с. 9. Лю М. Б., Подобед И. С., Едыгенова А. К., Лю Б. Н. //Онкология и радиология Казахстана. 2003. № 3. С. 14. 10. Маршал С., Бездетная Л., Гимя Ф. //Биохимия. 2004. Т. 69. № 1. С 57. 11. Мозжухина Т. Г., Бажинова А. И., Литошенко А. Я. //Клин. геронтол. 2003. Т. 9. № 9, с. 170. 12. Смирнов А. С., Буданов А. В., Рузов А. С., Иванов А.В., Прохорчук А.В., Гнучев Н.В., Прохорчук Е.Б. //Молекул. биол. 2000. Т. 34. № 5. С. 775. 13. Турпаев К. Т. //Биохимия. 2002. Т. 67. № 3. С. 339. 14. Фукузава К., Когуре К., Морита М., Хама С., Манабе С., Токумура А. //Биохимия. 2004. Т. 69. № 1. С. 64. 15. Albright C. D., Salganik R. I., Ckaciunesku C. N., Mar M.-H., Zeisel S. H. //J. Cell. Biochem. 2003. V. 89. № 2. Р. 254. 16. Allen R. G., Tresini M. //Free Radic. Biol. and Med. 2000. V. 28. № 3. Р. 463. 17. Anisimov V. N., Popovich I. G., Shtylik A. V. //Exp. Toxicol. Pathol. 1999. V. 51. P. 1. 18. Bohr V. A., Stevnsner T., de Souza-Pinto N. C //Gene. 2002. V. 286. № 1. Р. 127. 19. Bolton J. L., Trush M. A., Penning T. M., Dryhurst G., Monks T. J. //Chem. Res. Toxicol. - 2000. V. 13. № 3. Р. 135. 20. Bruce-Keller A. J., Begley J. G., Fu W., Butterfield, D. A., Bredesen, D. E., Hensley, K., Mattson, M. P //J. Neurochem. 1998. V.70. № 1. Р. 31. 21. Caricchio R., Kovalenko D., Kaufmann W. K., Cohen P. L. //J. Invest. Med. 1998. V. 46. P. 229A. 27 22. Chen S., Hu F. Theoncolytic microorgsnisms expressing HSP and uses thereof.: Заявка 1435387 ЕПВ, МПК7 С12N 1/21./ Hangzhou Conquer Biotech Co. Ltd. – № 012745253; Заявл. 12.12.01; Опубл. 07.07.04. Бюл. № 04/28. 23. Chen X., Tao Q., Yu H., Zhang L., Cao X. //Immunol. Lett. 2002. V. 84. № 2. Р. 81. 24. Chung S.-H., Chung S.-M., Lee J.-Y., Kim S.-R., Park K.-S., Chung J.-H. //FEBS Lett. 1999. V. 449. № 2-3. Р. 235. 25. Cobbs Ch. S., Samanta M., Harkins L. E.,Gillespie G. Y., Merrick B. A., MacMillan-Crow L. A.. //Arch. Biochem. Biophys., 2001. V. 394. № 2. - Р. 167. 26. Creagh E. M., Carmody R. J., Cotter T. G. //Exp. Cell Res. 2000. V. 257. № 1. Р. 58. 27. Das U. N. //Prostagland., Leukotrienes and Essent. Fatty Acids. 1999. V. 61. № 3. Р. 157. 28. Gershon D. //Exp. Gerotol. 1999. V. 34. №5, Р. 613. 29. Graziewicz M. A., Day B. J., Copeland W. C. //Nucl. Acids Res. 2002. V. 30. №13. Р. 2817. 30. Hampton M. B., Morgan P. E., Dsvies M. E. //FEBS Lett. 2002. V. 527. № 1-3. Р. 289. 31. Higashikubo A., Tanaka N., Noda N., Maeda I., Yadi K., Mizoguchi T., Nanri H. //Biol. and Pharm. Bull. 1999. V. 22, № 9. Р. 900. 32. Huang P. L., Zhu S. N., Lu S. L., Dai Z. S., Jin Y. L. //World J. Gastroenterol. 2000. V. 6. № 2. Р. 295. 33. Jin N., Hatton N. D., Harrington M. A., Xia X., Larsen S. H., Rhoades R. A. //Free Radic. Biol. and Med. 2000. V. 29. № 8. Р. 736. 34. Kajimoto S., Takanashi N. ,Kajimoto T., Xu Man, Cao J., Masuda Y., Aiuchi T., Nakajo Sh., Ids Y., Nakaya K. //Int. J. Cancer. 2002. V. 99. № 6. Р. 879. 35. Kikland R. A., Adiphatla R. M., Hatcher J. F., Franklin J. L. //Neuroscience. 2002. V. 115. № 2. Р.587. 36. Kim J.-Y., Park J.-H. //FEBS Lett. 2003. V. 549. № 1-3. Р. 94. 37. Klaunig J. E., Kamendulis L. M. //Annual Review of Pharmacology and Toxicology. Vol. 44. 2004. – Palo Alto (Calif.), 2004. P. 239. 38. Konat G. W. //J. Biosci. 2003. V. 28. № 1. Р. 57. 39. Kondoh M., Ogasawara S., Araragi S., Higashimoto M., Sato M. //J. Health Sci. 2001. V. 47. № 1. Р. 78. 40. Kovar J., Koc M., Stybrova H., Truksa J., Ehrlichova M. //Cell Proliferat. 2002. V. 35. № 5. Р. 298. 41. Langer Ch., Jürgensmeier J. M., Bauer G. //Exp. Cell Res. 1996. V. 222. № 1. Р.117-124. 42. Laun P., Pichova A., Madeo F., Fuchs J. Ellinger A., Kohlwein S., Dawes I., Frőhlich K.U., Breitenbach M. //Mol. Microbiol. 2001. V. 39. № 5. Р. 1166. 28 43. Li J., Zuo L., Shen T., Zhang Z.-N. //Yaoxue xuebao = Acta Pharm. Sin. 2002. V. 37. № 9. Р. 677. 44. Li L.Y., Luo X., Wang X. //Nature (Gr. Brit.). 2001. V. 412. № 6842. Р. 95. 45. Li M., Kondo T., Zxao Q.-L., Li F.-J., Tanabe K., Arai Y., Zhou Z.-C., Kasuya M. //J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 50. Р. 39702. 46. Liu M., Pelling J. C., Ju J., Chu E., Brash D. E. //Cancer Res. 1998. V. 58. № 8. Р. 1723. 47. Lovat P. E., Ranalli M., Corazzari M., Raffaghello L., Pearson A. D. J., Ponzoni M., Piacentini M., Melini G., Redfem Ch. P. F. //J. Cell. Biochem. 2003. V. 89. № 4. Р. 698. 48. Lum M.-G., Nagley P //J. Cell Sci. 2003. V. 116. № 8. Р. 1437. 49. Maccarrone M., Ranalli M., Bellincampi L., Salucci M. L., Sabatini S., Melino G., Finazzi-Agro A. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 272. № 2. Р. 345. 50. Min J., Guo J., Zxao F., Cai D. //Weisheng yanjui = J. Hyg. Res. 2003. V. 32. № 4. Р. 343. 51. Newmeyer D. D., Ferguson-Miller Sh. //Cell. 2003. V. 112. № 4, р. 481. 52. Nixson J. B., Kim K.-S., Lamb P. W., Bottone F. G., Eling Th. E. //Prostagland., Leukotrienes and Essent. Fatty Acids. 2004. V. 70. № 1. Р. 7. 53. .Nunes V. A., Gozzo A. J., Juliano M. A., Cerquueira C.M., Sampaio M. U., Sampaio C. A. M., Araujo M. S. //Braz. J. Med. and Biol. Res. 2003. V. 36. № 8. Р. 1047. 54. Nylandsted J., Rohde M., Brand K. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 14. Р. 7871. 55. Ott M., Robertson J. D., Gogvadze V.,Zhivotovsky B., Orrenius S. //Proc. Nat/ Acad. Sci. USA. 2002, V. 99. №3. Р. 1259. 56. Pani, G., Bedogni, B., Anzevino, R, Colavitti, R., Palazzotti, B., Borrello, S., Galeotti, T. //Cancer Res. 2000. V. 60. № 16. Р. 4654. 57. Phaneuf S., Leeuwenburgh Ch. //Amer. J. Physiol. 2002. V. 2. № 2, Ч. 2. Р. R423. 58. Prasad K. N., Cole W. C., Prasad J. E. //Z. Onkol. 1999. V. 31. № 4. Р. 101. 59. Ranelletti F. O., Maggiano N., Serra F. G. Ricci R., Larocca L. M., Lanca P., Scambia G., Fattorossi A., Capelli A., Piantelli M. //Int. J. Cancer. 2000. V. 85. № 3. Р. 438. 60. Rao J., Jagadeesan V. //Free Radic. Biol. and Med. 1996. V. 21. № 1. Р. 103. 61. Rego A. C., Oliveira C. R. //Nurochem. Res. 2003. V. 28. № 10. Р. 1563. 62. Risso de F.C., Devaux A., Lafaurie M., Girard J. P., Bailly B., Rahmani R. //Aquat. Toxicol. 2001. V.53. № 1. Р. 65. 63. Sarkar F. H., Li Y. //Cancer Invest. 2003. V. 21. № 5. Р. 744-757. 64. Sata N., Klonowski-Stumpe H., Han B. //Free Radic. Biol. Med. 1997. V. 23. № 6. Р. 844. 29 65. Shen S.-C., Chen Y.-C., Hsu F.-L., Lee W.-R. //J. Cell. Biochem. 2003. V. 89. № 5. Р. 1044. 66. Shidolji Y., Hayashi K., Komura S., Ohishi N., Yagi K. //Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1999. V. 264. № 2.Р. 343. 67. Shinkai M., Shinomiya N., Kanoh S., Motoyoshi K., Kobayashi H. //Aviat., Space and Environ Med. 2004. V. 75. № 2. Р. 109. 68. Shureiqi I., Chen D., Lotan R., Yang P., Newman R. A., Fischer S. M., Lippman S. M. //Cancer Res. 2000. V. 60. № 24. Р. 6846. 69. Souici A. C., Mirovitch J., Hausel P., Keefer L. K., FelleyboskoE. //Carcinogenesis. 2000. V. 21. № 2. 281. 70. Sun L.-K., Yoshii Y., Miyagi K. //J. Neuro-Oncol. 2000. V. 47. № 1. Р. 31. 71. Suzuki Y., Ono Y. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 255. № 2. Р. 262. 72. Takahashi N. //Biol. and Pharm. Bull. 2000. V. 23. № 2. Р. 222. 73. .TakanoS., Aramaki Y., Tsuchiya S. //Biochem. and Biophys. Res. Commun. 2001. V. 288. № 1. Р. 116. 74. Tanaka T., Hosoi F., Yamagichi-Iwai Y., Nakamura H., Masutani H., Ueda S., Nishiyama A., Takeda S., Wada H., Spyrou G., Yodoi J. //EMBO Journal. 2002. V. 21. № 7. Р. 1695. 75. Tang D. G., Honn K. V. Патент 5861268 США, МПК6 С12Q1/26. Заявл. 23.05.96; опубл. 19.01.99. 76. Van der M. K., Chen J. S., Steliou K., Perrine S. P., Faller D. V. //J. Cell.Physiol. 2003. V. 194. № 3. Р. 325. 77. Varnes M. E., Chiu S. M., Xue L. Y., Oleinick. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 255. Р. 673. 78. Walter P. B., Knutson M. D., Paler-Martinez A., Lee S., Xu Y., Viteri F. E., Ames B. N. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 4. Р. 264. 79. Wang J.-L., Zhao L.-X., Jing Y.-K. //Zhngguo yaowu huahue zazhi = Chin. J. Med. Chem. 2003. V. 13. № 6. Р. 361. 80. Xu J., Loo G. //J. E. Mitchell Sci. Soc. 1999. V. 115. № 3. Р. 177. 81. Zawel L. //J. Cell. Biochem. 2004. V. 92. № 4, Р. 651. Переписку просим вести через Лю Марину Борисовну по адресу: 480012, г.Алматы, ул. Амангельды, кв. 15. Республика Казахстан. Дом. тел. 67-57-03 и Сотовый тел. 8-300-372-18-18 Электронный адрес: mlyu@mail.ru 30 КИСЛОРОДНО-ПЕРЕКИСНАЯ КОНЦЕПЦИЯ АПОПТОЗА: ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ АРГУМЕНТАЦИИ И РАЗВИТИЯ Б. Н. Лю, М. Б. Лю Казахский научно-исследовательский институт онкологии и радиологии, Алматы, Казахстан Некоторые новые публикации по апоптозу содержат информацию, существенную для совершенствования и дальнейшего развития его кислородно-перекисной концепции. Принципиально важным, в частности, представлен факт перекисного окисления и утраты кардиолипина во внутренней мембране митохондрий в результате продукции в них активных форм О2 (АФК). Как одна из необходимых первичных акций она ведет к высвобождению ассоциированного с легкоокисляемым кардиолипином цитохрома с, устойчивому поддержанию в клетке «апоптогенного» уровня окислительного стресса. Обращено внимание на все большее количество фактов индукции апоптоза опухолевых клеток как при снижении, так и возрастании «канцерогенезного» уровня окислительного стресса при воздействии на них соответственно анти- и прооксидантных агентов и факторов. Это косвенно указывает на существование разных «специализированных, апоптогенных» уровней указанного стресса. Значение данных фактов для практической онкологии очевидно. Различные АФК, пероксиды липидов и белков, как сигнальные молекулы, играют ключевую роль не только на начальном «митохондриальном» этапе апоптоза, но и на последующих стадиях, влияя на активность ряда исполнительных звеньев (онкобелков, факторов транскрипции, протеинкиназ, эндонуклеаз, каспаз и др.). Это значительно повышает аргументацию в пользу того, чтобы концепцию апоптоза называть «кислородноперекисной». В широком научно-теоретическом аспекте эти данные и представления еще предстоит оценить. The oxygen-peroxide conception of apoptosis: increase level of its argumentation and development B. N. Lyu, M. B. Lyu Some new publications according to apoptosis are containing essential information for prefect and further development its oxygen-peroxide conception. The fact of peroxidation and loss of cardiolipin at inside mitochondria membranes as a result production in there active forms O2 (AOF) is a principal important. As one of the necessary primary action it is lead to release from cytochrome c associating with easy oxygenate cardiolipin, and also to stable support of “apoptogenic” level of the oxidative stress in cell. Pay attention to everything great facts of induction of the tumors cells apoptosis, both at reduction and increase “cancerogenesise’ level oxidative stress at influence on they accordingly anti- and prooxidant agents and factors. This is indirectly show on existence different “specializing, apoptogenical’ levels of oxidative stress. Importance of the given present facts for practical oncology is obvious. Different AOF, peroxides of lipids and proteins as signal molecules, has principal role not only on initial “mitochondrial” stage of apoptosis. But on next stages, influencing on activity series executive links (oncoproteins, transcription factors, proteinkinase, endonuclease, kaspase and others). This is considerably increasing an argumentation to profit that conception of apoptosis named “oxygen-peroxide”. This data and ideas still are must estimate in scientifictheoretical aspect. 31