1 - программа президиума РАН «Фундаментальные науки
advertisement
Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума РАН ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ Конференции и семинары по научным направлениям Программы в 2011 году МОСКВА 2011 УДК 6+61+615.47+615.012.6 ББК 28.7+52+53 Ф947 Фундаментальные науки – медицине. Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2011 году. М.: Фирма «Слово», 2011. – 340 с. В сборник включены тезисы докладов ученых, заслушанных на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» в 2011 году. Сборник представляет интерес для ученых и специалистов, занимающихся проблемами теории и практики медицины. Составители: М.В.Угрюмов, А.А.Макоско, В.В.Круговых ISBN 978-5-4348-0001-3 © Российская академия наук, 2011 © Фирма «Слово», 2011 3 ПРЕДИСЛОВИЕ Программа Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» разработана и осуществляется на основе: Постановления Президиума РАН от 30 октября 2001 г. № 263 «О состоянии академического здравоохранения (представление Комиссии РАН по медицинским учреждениям)»; Постановления Общего собрания РАН от 14 ноября 2001 г. № 29 «О деятельности Президиума Российской академии наук в 1996–2001 годах» в части п. 6: «Рекомендовать Президиуму РАН вместе с медицинскими учреждениями РАН и при сотрудничестве с Российской академией медицинских наук разработать комплексную программу «Наука – медицине», активно используя достижения фундаментальной науки для улучшения здоровья населения. Принять необходимые меры для сохранения и укрепления собственной медицинской базы РАН»; Постановления сессии совместного Общего собрания РАН и РАМН с участием РАСХН и РАХ от 18 декабря 2003 г. «Наука – здоровью человека»; Распоряжения Президиума РАН от 23 сентября 2008 г. № 10104-653 «Об утверждении Порядка формирования Программ фундаментальных исследований РАН»; Постановления научной сессии Общего собрания Российской академии наук от 16 декабря 2009 г. № 42 «Мозг: фундаментальные и прикладные проблемы». Постановлением Президиума РАН от 18.01.2011 г. № 10 Программа «Фундаментальные науки – медицине» включена в перечень программ РАН, направленных на реализацию пяти стратегических направлений технологического прорыва, определенных Президентом Российской Федерации Д.А.Медведевым 18 июня 2009 г. (направление «Медицинские технологии, прежде всего, диагностическое оборудование, а также лекарственные средства»). Основной целью Программы является проведение фундаментальных исследований, ориентированных на решение ряда приоритетных проблем медицины, и внедрение основных достижений в практику медицинских учреждений Российской академии наук. 4 Задачи Программы: исследование этиологии и патогенеза ряда распространенных и социально значимых заболеваний; разработка новых медицинских технологий на основе результатов фундаментальных исследований – методов диагностики, медицинских приборов, материалов медицинского назначения и лекарственных препаратов; привлечение медицинских учреждений РАН к научным исследованиям, научно-техническим разработкам и клиническим испытаниям, оказание им материально-технической помощи; внедрение (в том числе с помощью Координационного совета по инновационной деятельности РАН) апробированных результатов программы в российское здравоохранение в целом и в медицинские учреждения РАН в частности, повышая, таким образом, уровень и качество медицинского обслуживания сотрудников РАН. Перед медицинскими учреждениями РАН, помимо традиционных задач – профилактики, диагностики и лечения заболеваний, стоит и специфическая задача – борьба с преждевременным старением и продление творческого долголетия ученых. Основной организационной идеей Программы является объединение усилий научно-исследовательских институтов, входящих в состав различных отделений РАН, на решение актуальных задач теоретической и практической медицины и внедрение достижений естественных и точных наук – биологии, химии, физики и математики в клиническую практику. Программа носит междисциплинарный характер и сформирована на конкурсной основе. Важнейшим условием успешной реализации Программы представляется обеспечение методического и научно-практического взаимодействия с медицинскими учреждениями РАН. Научно-организационное руководство Программой осуществляется координатором – вице-президентом РАН академиком А.И. Григорьевым и Научным советом, в состав которого входят наиболее квалифицированные специалисты РАН, в том числе 11 академиков РАН, 5 академиков РАМН и 4 членакорреспондента РАН. Основными исполнителями программы являются институты РАН и привлекаемые ими медицинские учреждения, включая учреждения Медицинского центра РАН. 5 В соответствии с поставленными задачами исследования проводились в рамках 10 научных направлений: 1. Этиология и патогенез 2. Диагностика 3. Биофотоника 4. Информатика 5. Лекарственные препараты 6. Проблема сознания в клинике 7. Нейродегенеративные заболевания 8. Атмосфера и здоровье 9. Материалы 10. Приборы. Эти научные направления отражены в Плане фундаментальных научных исследований РАН на 2008-2012 гг. (Приложение № 2 к Программе фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2008-2012 гг., пункты: 4, 7, 9, 22, 25, 28, 30, 34, 37, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 50, 52, 53, 65, 71). Важнейшим условием успешной реализации Программы стало обеспечение научно-методического руководства и научнопрактического взаимодействия с медицинскими учреждениями РАН. С 2005 г. реализуется отдельный блок проектов, направленный на решение актуальных практических задач, стоящих перед ЦКБ РАН (комплексный проект «Исследование, разработка, клинические испытания и внедрение новых медицинских технологий на базе ЦКБ РАН»). В течение года координаторы научных направлений Программы провели конференции и семинары в рамках курируемых проблем. В связи с этим в настоящий сборник включены тезисы докладов по проектам Программы, которые были подготовлены для выступлений на указанных мероприятиях. Тезисы докладов сгруппированы по близости тематики исследований и публикуются в том виде, как их представили авторы. В списке авторов руководители проектов указаны первыми. Сборник представляет интерес для ученых и специалистов, занимающихся проблемами теории и практики медицины. 6 Общие проблемы этиологии и патогенеза ИССЛЕДОВАНИЕ ПУСКОВЫХ МЕХАНИЗМОВ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ХРОМОСОМНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КАНЦЕРОГЕННЫХ РИСКОВ И ИСХОДОВ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ С.Г.Андреев1), А.В.Алещенко1), И.В.Сальников1), Ю.А.Эйдельман1), А.В.Севанькаев2), И.К.Хвостунов2), В.С.Пятенко2), О.Н.Коровчук 2) 1) Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва 2) Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития, Обнинск В 2011 году были продолжены работы по исследованию механизмов комбинированного действия радиации и нерадиационных факторов, модифицирующих хромосомную нестабильность (ХН). Ранее было обнаружено усиление ХН в клетках CHOK1 при увеличении времени между пересевами после облучения. Т.к. при таких условиях эксперимента достигается высокая степень конфлуентности, необходимо оценить роль ограничений пролиферации (ингибирования синтеза ДНК и/или возрастания доли покоящихся клеток) в проявлении ХН. Была проведена серия экспериментов с варьированием условий культивирования: ограничение пролиферации достигалось за счет увеличения (*) размера колоний; (**) времени пребывания в конфлуентности. Клетки высевались перед облучением в дозе 3 Гр с низкой плотностью (~100 выживших клеток на флакон), выдерживались без пересева в течение 10 суток, после чего определялся уровень дицентриков. Частота дицентриков совпала с ранее измеренной при стандартной схеме культивирования (пересев каждые 2 суток). Затем клетки пересевались; на 11-е сутки частота дицентриков возрастала в 2 раза. Таким образом, нахождение клеток в покое за счет ограничений роста в пределах колонии не изменяет ХН по сравнению со стандартной схемой, в которой практически все клетки делящиеся. В то же время кратковременная стимуляция пролиферации (при пересеве) облученных клеток 7 существенно усиливает ХН. Наиболее вероятная интерпретация заключается в делении ранее покоившихся клеток с аберрациями, однако роль байстендер-взаимодействий также не может быть исключена. Для исследования роли ограничения пролиферации за счет конфлуентности была проведена серия экспериментов по альтернативной схеме: клетки высевались при высокой плотности (106 на флакон), как и при стандартном варианте, и 10 суток выдерживались без пересева, при этом ~6 суток находились в состоянии конфлуентности. Далее клетки культивировались с пересевом через 3 суток, и аберрации измерялись через сутки после каждого пересева. Обнаружено, что частота дицентриков более чем в 4 раза превышает таковую при стандартной схеме на всех временах после облучения. В этой схеме эксперимента, в отличие от предыдущей, усиление ХН вызвано не стимуляцией, а подавлением пролиферации. Таким образом, обнаружены сложные взаимоотношения между стимуляцией и ингибированием деления клеток и уровнем ХН. Этот парадоксальный результат нуждается в дальнейшем исследовании. Ранее нами было показано, что кратковременное ингибирование эксцизионной репарации однонитевых разрывов ДНК в первом клеточном цикле приводит к усилению радиационноиндуцированной ХН на временах до 10 суток. В данной работе исследовался вопрос, какую роль в формировании ХН играет репарация двунитевых разрывов ДНК. Использовали кратковременное ингибирование (2 ч) ключевого фермента негомологичной репарации, каталитической субъединицы ДНК-протеинкиназы, селективным ингибитором NU7026 (в концентрации 10 µМ). Показано существенное возрастание частоты дицентриков (до 2 раз) и хроматидных аберраций (до 20 раз) после облучения в дозе 3 Гр в присутствии NU7026. Этот эффект имеет место на ранних временах (до 3 суток) и не наблюдается при действии NU7026 в отсутствие облучения. Таким образом, 2-часовое ингибирование ДНК-ПКкс вызывает на временах до трех суток всплеск нестабильности, которая затем спадает и в последующих клеточных поколениях не отличается от чисто радиационно-индуцированной. 8 СИСТЕМНЫЙ ПОДХОД К АНАЛИЗУ МЕХАНИЗМОВ ПАТОГЕНЕЗА ИНФЕКЦИИ ВИРУСАМИ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1) В.А.Черешнев , Г.А.Бочаров2), С.И.Бажан3), Б.А.Бахметьев4), И.А.Гайнова5), А.В. Ким6) Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург 2) Институт вычислительной математики РАН, г. Москва 3) ГН Центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», г. Новосибирск 4) Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь 5) Институт математики им. С.Л. Соболева СО РАН, г. Новосибирск 6) Институт математики и механики УрО РАН, г. Екатеринбург 1) Инфекция, вызванная вирусами иммунодефицита человека ВИЧ-1 типа, представляет собой системное заболевание. Понимание механизмов иммунопатогенеза ВИЧ является основной предпосылкой для решения задачи поиска и оптимизации режимов применения противовирусных, иммунокорригирующих и вакцинных препаратов для лечения и профилактики ВИЧ-инфекции. Завершен систематический анализ данных о процессах развития инфекции вирусами иммунодефицита человека на различных уровнях реализации, включая: 1) молекулярно-биологические механизмы репликации ВИЧ, 2) иммунологические процессы при ВИЧ инфекции и 3) изменение эндокринной регуляции иммунофизиологических процессов организма. Проведенный нами анализ позволил (1) выделить ключевые стадии размножения вируса в CD4+ Т-лимфоцитах и макрофагах, которые являются потенциальными мишенями для действия противовирусных препаратов и (2) определить направленность изменений нейроэндокринной регуляции, обмена веществ и иммуногенеза при ВИЧ инфекции. Установлены возможные механизмы реализации влияния ВИЧ инфекции на процессы регуляции в эндокринной системе. Эти процессы являются критическими с точки зрения прогнозирования регенеративного потенциала иммунной системы. Выявление подобных механизмов создает предпосылки для новых подходов к влиянию на процесс взаимодействия ВИЧ с организмом человека, на основе системных терапевтических воздействий и, в перспективе, основу для полноценного контроля инфекции ВИЧ-1. 9 Сформулирована блочная структура многомасштабной математической модели ВИЧ инфекции. Разработаны блоки, моделирующие (1) репликацию вирусов в клетке с помощью генетических алгоритмов и (2) кинетику взаимодействия в системе «вирус/антиген-презентирующие клетки/CD8+ Т лимфоциты». Разработана детальная геометрическая модель лимфатического узла. С помощью стохастических версий модели вирусной инфекции выполнен анализ чувствительности динамики инфекции к действию случайных факторов. Оценены характеристики спонтанного выведения вируса в зависимости от типа случайных возмущений и их интенсивности. 1. В.А. Черешнев, С.И. Бажан, Б.А. Бахметьев, И.А. Гайнова, Г.А. Бочаров (2012). Системный анализ патогенеза ВИЧ инфекции. Успехи современной биологии (в печати). 2. G. Bocharov, J. Quiel, T. Luzyanina, H. Alon, E. Chiglintsev, V.Chereshnev, M. Meier-Schellersheim, W. Paul, Z. Grossman (2011). Feedback regulation of proliferation versus differentiation explains the dependence of antigen-stimulated CD4 T-cell expansion on precursor number. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(8): 3318-23. 3. Г.А.Бочаров, А.А.Данилов, Ю.В.Василевский, Г.И.Марчук, В.А.Черешнев, Б.Людевиг (2011). Моделирование защитного поля интерферона в лимфоидных органах с учетом их структурнофункциональной организации. ДАН «Физиология», Т. 439, № 3. С. 413-415. 4. M.A. Alvarez, Patricia Arbelaez, Francisco Ignacio Bastos, Ben Berkhout, Basudev Bhattacharya, G. Bocharov, V. Chereshnev, et al. (2011). Research Priorities for HIV/M. Tuberculosis Co-Infection. The Open Infectious Diseases Journal, 5, (Suppl 1-M2): 14-20. СПОСОБНОСТЬ ЖИВЫХ КЛЕТОК К ГЕНЕРАЦИИ РАДИКАЛОВ МОЖЕТ БЫТЬ ИЗУЧЕНА МЕТОДОМ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ НА СРЕЗАХ УЧАСТКОВ МОЗГА Ю.А.Владимиров1), А.М.Полимова1), Е.В.Проскурнина2), Г.Р.Хакимова3), М.В.Угрюмов3) Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва 2) Факультет фундаментальной медицины МГУ, Москва 3) Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва 1) 10 Дегенерацию нервных клеток головного мозга при нейродегенеративных болезнях (НДГ), включая болезни Альцгеймера и Паркинсона, обычно объясняют повреждением этих клеток под действием свободных радикалов. Между тем существует очень мало методов прямого обнаружения радикалов в изолированных живых клетках и тканях человека и животных. Одним из них может быть хемилюминесценция (ХЛ) в присутствии активаторов, таких как люцигенин, чувствительный к супероксидному анион-радикалу (САР), люминол, чувствительный к активным формам кислорода или, наконец, физические активаторы, в первую очередь кумариновое производное С-252, усиливающие сверхслабое свечение при реакциях цепного окисления липидов. В нашей работе была изучена ХЛ тонких срезов (300 мкм толщиной и весом 2-3 мг) участков ткани мозга в области substantia nigra и striatum мелких лабораторных животных (мышей). Использовали хемилюминометр SmartLum (DISoft, Россия), объединенный с перистальтическим насосом для аэрации и перемешивания инкубационной жидкости в кювете прибора. При использовании люцигенина в качестве зонда на САР ХЛ регистрировалась при помещении одного среза в кювету, но обычно мы использовали 2-3 среза одновременно. ХЛ в присутствии люминола была очень слабой, а ХЛ в присутствии С-525 нам в этих условиях зарегистрировать не удалось. Активируемая люцигенином ХЛ определялась исключительно самими срезами мозга, а не омывающим раствором. В отсутствие аэрации и перемешивания свечение не развивалось. Включение аэрации приводило к развитию ХЛ с выходом на плато в течение 2-5 мин, которое может быть объяснено накоплением люцигенин катионов в матриксе митохондрий при их энергизации. Прекращение аэрации приводило к кратковременной вспышке ХЛ с последующим её снижением до уровня фона, которое связано с потреблением кислорода срезами ткани. При включении и выключении насоса для аэрации и перемешивания, наряду с циклами развития и спада свечения, имело место медленное, в течение десятков минут, нарастание общей интенсивности ХЛ, связанное с усилением радикалпродуцирующей способности клеток при инкубации. 11 Измерение срезов участков мозга в стандартных условиях давало хорошо воспроизводимые результаты в серии здоровых животных (средний разброс данных от 10 до 20 %). Однако при анаэробной инкубации срезов более полутора часов после их приготовления происходило снижение способности срезов к хемилюминесценции. Миметики СОД и разобщитель окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенол подавляли ХЛ в концентрациях 0,1–1,0 мМ. Это подтверждает предположение о том, что за люцигенин-зависимую ХЛ тканей ответственны супероксидные радикалы, образуемые при работе дыхательной цепи и выделяемые в матрикс митохондрий. По нашему мнению, предложенный метод изучения образования радикалов в срезах тканей имеет преимущество перед весьма трудоемким и дорогостоящим методом, используемым японскими исследователями (Sasaki T. и сотр. (2006, Brain Res. 1077, 161–169), которые для измерения свечение срезов использовали не фотоумножитель, как в хемилюминометре SmsrtLum, а высокочувствительную охлаждаемую фотоматрицу. РЕАКЦИЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА НА ВНЕШНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ СО СТОРОНЫ ТРЕХ ОКРУЖАЮЩИХ СРЕД. СОПОСТАВИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ А.Г.Гамбурцев1), О.И.Аптикаева1), А.В.Сигачев2) УРАН Институт физики Земли РАН, Станция скорой медицинской помощи г. Москвы 1) 2) Фундаментальная научная цель проекта: понять закономерности динамики различных процессов в разных сферах, продвинуться по пути решения проблемы прогнозирования будущих явлений и процессов. Практическая цель: способствовать выживанию, оздоровлению, безопасности и социальному благополучию населения России, ее устойчивому развитию. Одна из важнейших задач в рамках взятого направления является задача развития системного медикоэкологического мониторинга. Для того чтобы продвинуться во взятом направлении, необходимо изучить и проанализировать 12 особенности фонового и аномального протекания природных процессов без участия и с участием антропогенных воздействий, установить причинно-следственные связи между процессами. Мы пытаемся изучить закономерности динамики процессов в трех окружающих нас средах, особенно влияющие на здоровье и качество жизни людей, и свойства динамики медицинских временных рядов. Нами сформулированы основные закономерности динамики процессов. Они являются общими для природных социальных и других гуманитарных процессов, в том числе для динамики медицинских показателей. В то же время имеют место особенные черты динамики гуманитарных процессов, в частности для динамики медицинских показателей. Они связаны с человеческим фактором – со стороны медиков, самих больных и их окружения. Наши подходы к решению поставленных задач заключаются в анализе фактических данных о временных и пространственно-временных процессах в природе и обществе. Остановимся на некоторых результатах. Рождественские каникулы (РК). Сопоставление вызовов скорой помощи (ВСП) в течение 3-10 января до и после введения РК для работающих людей показало существенную разницу в числе суточных ВСП. Обострение гипертонической болезни в дни РК заметно возрастает по сравнению с теми же календарными днями в годы до введения РК. Аномально жаркое лето 2010 г. Динамическая картина ВСП в Москве сильно изменилась по сравнению с летними периодами других лет. Это вызвано, по мнению медиков, небывало продолжительной и сильной жарой в июле-августе. Получены и уже обрабатываются интересные фактические данные. В частности, в отдельные дни июля-августа значительно увеличилось число ВСП по случаям инсульта, гипотензии, ангины, пневмонии – до 50–100 % и более. Эта картина подтверждается данными о смертных случаях во Франции аномально жарким летом 2003 г. Но многие заболевания на эту аномалию не прореагировали. Детальный анализ данных по ВСП планируем провести в 2012 г. ВСП летом и зимой. В некоторых работах предполагается, что увеличение числа вызовов скорой помощи в зимнее время связано с тем, что в это время увеличивается солнечная и геомагнитная активность. По-видимому, это не так, потому что сопоставление 13 данных о смертности в северном и южном полушарии показывает, что в зимнее время как в одном, так и в другом полушарии смертность увеличивается. Предложение. Продолжаем считать, что необходимо начать проводить широкомасштабные междисциплинарные исследования с целью создания обоснованного системного комплексного экологомедицинского мониторинга, в котором участвовали бы РАН, Минздравсоцразвития, Росгидромет, Минприроды, МЧС, Минобороны и ряд других ведомств. Наши предложения были озвучены еще в 1997 г. на совместном заседании двух Межведомственных комиссий СБ РФ; было принято положительное решение, носившее, однако, рекомендательный характер. ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА В МОЗГЕ ПРИМАТОВ М.С.Гельфанд1,2), П.В.Мазин2,3), P.Khaitovich3) Институт проблем передачи информации им. А.А.Харкевича РАН, Москва 2) Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ, Москва 3) Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Шанхай, Китай 1) Исследованы данные высокопроизводительного секвенирования транскриптома двух областей мозга (префронтальная кора и мозжечок) трех приматов (человек, шимпанзе, макака-резус). В первом наборе данных были секвенированы парные риды длиной 75 нуклеотидов. Для каждого сочетания ткань/вид было исследовано два образца (новорожденные, взрослые), каждый из которых содержал смесь материала из пяти индивидуумов. Во втором наборе (только кора) были секвенированы одиночные риды с известной цепи для 13-14 индивидуальных образцов возрастов от нескольких дней до десятков лет. Картирование на геномы проводили программой Tophat без использования аннотации, разрешали не более 3 несовпадений. Уникально картировалось 60-69 % ридов, причем множественные совпадения были, где возможно, разрешены при помощи второго 14 рида из пары. Сборку генов проводили с учетом ограничений на минимальное покрытие и его непрерывность. Аннотация экзонинтронной структуры генов шимпанзе и макаки была проведена путем проекции на эти геномы известных генов человека. В результате было получено 26594 гена, содержавших 59105 конститутивных экзона, 21134 альтернативных сегментов и 23528 удержанных интронов. Было показано хорошее согласование с генами, описанными в базе данных Ensemble. Значимые различия в уровнях включения сегментов определяли при помощи биномиальной модели. Оказалось, что, хотя наиболее существенные различия, как и ожидалось, наблюдались между видами, для 20 % генов было показано изменение альтернативного сплайсинга с возрастом. Для нескольких генов была проведена количественная ПЦР, которая подтвердила сделанные наблюдения. Паттерны возрастных изменений альтернативного сплайсинга в трех приматах заметно различались. Однако после коррекции на физиологический возраст путем привязки к маркерам возраста (прорезывание зубов, появление коренных зубов, половое созревание и т.п.) паттерны существенно сблизились. АКТИВНАЯ СТРАТЕГИЯ ПОВЕДЕНИЯ КАК ФАКТОР РИСКА ДЕПРЕССИИ Д.А.Жуков1), Е.П.Виноградова2) 1) 2) Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург Санкт-Петербургский государственный университет, биологопочвенный факультет, Санкт-Петербург Депрессия является одной из актуальнейших проблем современности, являясь самым распространенным психическим заболеванием. Эндогенная депрессия человека успешно моделируется в экспериментах на животных, подвергаемых неконтролируемому стрессу, особый интерес представляют собой модели стресса повседневности. В ранних исследованиях нами было показано, что у линейных крыс с активной стратегией поведения после неконтролируемого электроболевого раздражения формируются депрессивноподобные расстройства. 15 Целью данной работы было сравнительное изучение влияния введения окситоцина и антидепрессантов для компенсации последствий хронического умеренного неконтролируемого стресса (ХС), вызывающего депрессивноподобное состояние у крыс. По результатам выработки условного рефлекса активного избегания из 160 животных были отобраны 40 животных с активной стратегией поведения (группа А) и 40 – с пассивной (группа Б). У крыс двух групп были определены уровень тревоги и двигательная активность в тесте приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ); время неподвижности при принудительном плавании как показатель уровня депрессивности; потребление раствора сахарозы как показатель гедонистического поведения. После этого животных подвергали процедуре ХС. Данное воздей-ствие производилось ежедневно в течение 30 дней. Стресс созда-вали ежедневными изменениями привычных условий существо-вания: лишение корма, лишение воды, наклон клеток, инверсия светового режима, влажная подстилка, скучивание, изоляция. По завершении ХС поведенческие тесты были повторены. У крыс группы А, в отличие от крыс группы Б, не увеличивалось количество условно-рефлекторных реакций, увеличивалось время неподвижности при принудительном плавании и снижалось потребление глюкозы, у крыс группы Б происходило только патологическое снижение уровня тревожности и слабое снижение потребления раствора сахарозы. После этого животным опытной группы вводили либо интраназально окситоцин (50 мкг) перед каждым из поведенческих тестов, либо антидепрессант бупропиона (в/б, 10 мг/кг ежедневно в течение 14 дней), контрольным – физиологический раствор тем же способом. У животных группы А ни в одном из тестов не показано изменения поведения под влиянием окситоцина, в то время как у животных группы Б не изменял поведение антидепрессант. У крыс группы Б окситоцин нормализовал уровень тревожности. У крыс группы А показатели тревоги, депрессивности и гедонистического поведения восстанавливались после введения антидепрессанта бупропиона. Таким образом, у крыс группы А после ХС выявлена классическая триада депрессии: агедония, нарушение обучаемости 16 и двигательное торможение, которая исчезает после двухнедельного введения антидепрессанта. У крыс группы Б изменения поведения, вызванные ХС, имеют другую структуру и компенсируются введением окситоцина, а не антидепрессанта. Следовательно, окситоцин играет ключевую роль в нейрохимических механизмах восстановления после стресса только у животных с пассивной стратегией поведения. Восстановительная терапия после действия неконтролируемого хронического стресса должна определяться в зависимости от стратегии поведения индивида. ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ММР-1, -2, -9 В КОЖЕ ПРИ ТЕРАПИИ ПАЦИЕНТОВ С ПСОРИАЗОМ С ПОМОЩЬЮ НИЛИ И.М.Корсунская1), Э.С.Пирузян2), В.В.Соболев2), С.А.Брускин2), М.Т.Миннибаев1), А.Л.Пирузян1) ЦТП ФХФ РАН Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова 1) 2) Используя метод ПЦР в реальном времени, мы изучали изменение уровня экспрессии генов ММР-1, -2, -9 в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной у 12 больных до и после лечения лазерным излучением низкой интенсивности (НИЛИ) с длиной волны 1,27 мкм (коротковолновая часть инфракрасного диапазона). После лечения методом НИЛИ уровень экспрессии гена ММР-1 оказался ниже, чем до лечения, – от 0.8 до 13.3 раза выше контроля. При сравнении экспрессии гена ММР-1 до и после лечения наблюдалось достоверное снижение у всех пациентов, кроме пациента 7 (уровень экспрессии гена после лечения оказался недостоверно выше). Достоверность отличий между выборками составила p<0.005. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 4.1±1.0 раза, в среднем уровень экспрессии гена снизился по данной выборке в 3.6–9.6 раз. Увеличения экспрессии гена ММР-2 после лечения у пациентов не было обнаружено, а у 45 % наблюдалось снижение. В среднем 17 уровень экспрессии гена увеличился по данной выборке в 1.1–2.2 раза, однако отличие между выборками не является достоверным (p=0.10). Воздействие лазерным излучением низкой интенсивности снижает уровень экспрессии гена ММР-9 в псориатической коже по сравнению с видимо непораженной кожей от 0.13 до 2.7 раза выше контроля. При сравнении экспрессии гена ММР-9 до и после лечения наблюдалось достоверное снижение у всех пациентов, кроме 6-го и 8-го пациентов (уровень экспрессии гена после лечения оказался недостоверно повышен). Значимость отличий между выборками составила p<0.05. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена после лечения оказалось повышенным в 1.2±0.2 раза, в среднем уровень экспрессии гена снизился по данной выборке в 1.7–4.5 раза. При сравнении изменения экспрессии генов ММР-1 и ММР-9 после воздействия на кожу низкоинтенсивного лазерного излучения наблюдалось достоверное снижение (р<0.05) экспрессии этих генов, в среднем в 6 и 3 раза соответственно. Уровень экспрессии ММР-2 повысился, но достоверного отличия не было обнаружено (p=0.10). Полученное нами повышение экспрессии генов ММР-1 и ММР9 может быть связано с наличием в промоторах их генов сайтов связывания транскрипционного фактора NF–kB [Fanjul-Fernández M., 2010], отличающегося повышенной активностью при воспалительном псориатическом процессе. После лечения уменьшается активность NF–kB и, соответственно, снижается экспрессия генов матриксных металлопротеаз. ИЗУЧЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГАЗОВОЙ ЭМБОЛИИ, СВЯЗАННОЙ С БАРОТРАВМОЙ ЛЕГКИХ ПРИ ВЗРЫВНОЙ ТРАВМЕ А.Р.Куссмауль1), Н.Б.Павлов2), М.В.Баранов3), М.Е.Тихомирова1) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН 2) ФГУЗ Клиническая больница 119 ФМБА России 3) НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН 1) 18 Взрывная травма связана с действием на организм как продуктов детонации взрывчатого вещества, осколков и частей взрывного устройства, так и ударной волны. Повреждающее действие ударной волны особенно выраженно на границах воздушной среды и тканей органов, имеющих воздушные полости, поэтому баротравма легких, как и баротравма уха и придаточных пазух носа, является частым компонентом сочетанной травмы, полученной при взрыве. Основной особенностью баротравмы легких (в отличие от механической травмы легкого) является высокая вероятность формирования в первые часы после получения травмы смертельно опасного осложнения – артериальной газовой эмболии. Цель работы: обосновать способ решения проблемы газовой эмболии сосудов методами барофизиологии, создать экспериментальную модель для объективизации морфологической картины пораженных тканей и отработки лечебно-диагностического подхода при газовой эмболии. Задачи: 1) Провести анализ имеющегося клинического материала о пациентах, прошедших лечение по режимам лечебной рекомпрессии в условиях барокомплекса ГВК 250. 2) На основе полученных данных и общих теоретических представлений предложить путь решения проблемы лечения газовых эмболий. 3) Смоделировать воздушную эмболию сосудов головного мозга у лабораторных животных. Методика и результаты С 1998 по 2011 год в отделении барофизиологии и водолазной медицины КБ 119 на базе ГНЦ РФ – ИМБП РАН проходили лечение 27 пациентов с тяжелыми формами баротравмы легких и декомпрессионной болезни, сопровождающимися аэронейропатией, аэромиелопатией, вплоть до тетраплегии, дыхательных расстройств и утраты сознания. Все рассматриваемые пациенты поступили на ГВК 250 в отсроченном периоде (от 3 до 18 суток после манифестации клинических проявлений заболевания). При позднем поступлении и предшествующем неэффективном лечении, с использованием режима лечебной рекомпрессии длительного пребывания в кислородно-азотно-гелиевой среде, удалось в двух случаях добиться полного выздоровления, а в остальных случаях – значительного улучшения состояния, возвращения к работе или 19 радикального снижения степени инвалидизации. Таким образом, создание максимально безазотной газовой среды под давлением на основе кислорода и гелия эффективно при газовых эмболиях даже в отсроченном периоде. Предлагается: 1) При выявлении подозрений на баротравму легких и отсутствии клинических проявлений аэроэмболии рекомендовать кислородно-гелиевую терапию. 2) При наличии клинических проявлений аэроэмболии пациент должен быть немедленно подвергнут лечебной компрессии в барокамере по режиму ДП с кислородно-гелиевой средой. Для объективизации морфологической картины и дальнейшей отработки лечебных методик смоделировали воздушную эмболию у 15 крыс линии Wistar путем введения 0,3 мл воздуха в общую сонную артерию. Получили развитие выраженной неврологической симптоматики, однако у 50 % животных кровотечение из места пункции остановить не удалось, что указывает на необходимость дальнейшего совершенствования методики. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ И ВНУТРИВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВАГИНАЛЬНЫХ ЛАКТОБАЦИЛЛ И ЛАКТОФАГОВ С ЦЕЛЬЮ РАСШИФРОВКИ ЭТИОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА И ОПТИМИЗАЦИИ МЕТОДОВ ЕГО ЛЕЧЕНИЯ А.В.Летаров1), А.С.Исаева1), Е.Н.Ильина2), В.В.Муравьёва, А.С.Анкирская3) Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН 2) Институт физико-химической медицины МЗСР РФ 3) Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова МЗСР РФ 1) Нарушения состояния микробиоценоза влагалища у женщин, в том числе анаэробный бактериальный вагиноз, являются одним из наиболее частых поводов обращения за гинекологической медицинкой помощью. Ведущим фактором, определяющим возможность колонизации влагалища патогенными микроорганизмами и возникновения клинически выраженного 20 инфекционного процесса, является нарушение естественной микрофлоры, основной компонент которой – представители рода Lactobacillus. Продуцируя молочную кислоту, которая создаёт во влагалище кислую среду с ph 3,8–4,6, и перекись водорода, лактобациллы эффективно подавляют рост патогенных бактерий. Нарушение лактобациллярной флоры влагалища в результате действия экзогенных или эндогенных факторов приводит в некоторых случаях к колонизации данного экотопа анаэробными микроорганизмами, однако природа этиологического агента, вызывающего падение численности лактобацилл, до сих пор не установлена. Проведённые нами в 2011 году исследования позволили выработать критерии для дифференциации штаммов лактобацилл, в частности, проведённые дополнительные исследования физиологической вариабельности белковы спектров лактобацилл позволили применить для дифференциации штаммов не только методы ПЦРфингерпринтинга, но и использовать напрямую данные MALDITOF спектроскопии тотальных клеточных экстрактов, которые использовались в нашей работе для видовой идентификации изолятов лактобацилл. С применением усовершенствованной методологии дифференциации штаммов нами проведён эксперимент по мониторингу стабильности индивидуальных популяций лактобацилл у 7 женщин-добровольцев в течение 3 месяцев. Полученные данные свидетельствуют, что ассоциация макроорганизма с доминирующими штаммами лактобацилл является стабильной во времени у большинства исследованных индивидуумов. Доминирующие штаммы успешно сохраняют свои популяционные уровни в течение нескольких менструальных циклов. Мы планируем провести дополнительное обследование этой же группы добровольцев в 2012 г. для получения данных о долговременной (в течение года) стабильности индивидуальных популяций лактобацилл. Однако уже в настоящее время можно утверждать, что наличие стабильных ассоциативных связей между макроорганизмом и конкретными штаммами симбиотических бактерий свидетельствует в пользу целесобразности индивидуального подбора пробиотических культур, оптимально совместимых с конкретной пациенткой. 21 Проведённый ПЦР-скрининг части полученной коллекции изолятов лактобацилл на присутствие профагов подтвердил наличие у ряда штаммов генов фаговой интегразы, идентичных ранее описанным, однако получить экспериментально индукцию лизогенов с выходом жизнеспособного, детектируемого на применённых тест-культурах фага, нам не удалось. Полученные данные согласуются с результатами Martin et al. (2009), свидетельствующими о пониженной частоте истинной лизогении у вагинальных изолятов лактобацилл по сравнению с латобациллами из других местообитаний (например, со штаммами, выделенными из молочных продуктов). НОВЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОРАКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: МИКОЛИКОПИН И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В МЕДИЦИНЕ Е.П.Феофилова1), Я.Э.Сергеева1), А.С.Меморская1), И.С.Мысякина1), Л.А.Галанина1), А.С.Алехин2), Н.Г.Гончаров2), Л.М.Дулькин 2) Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва 2) Центральная клиническая больница РАН, Москве 1) В настоящее время интерес в лечении рака предстательной железы (РПЖ) начинает перемещаться на создание препаратов, обладающих высокой антиоксидантной активностью и не требующих гормонтерапии, дающей побочные эффекты. Этим требованиям удовлетворяет природный препарат Миколикопин, получаемый по новой технологии из мицелиальных грибов в ИНМИ РАН (патент РФ № 2115678). Способность Миколикопина подавлять РПЖ подтверждена трехлетними испытаниями на животных – крысах-самцах линии ACI с перевитой опухолью аденокарциномы предстательной железы, полученной из индуцированных новообразований по методике, разработанной в лаборатории экспериментальной эндокринной терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Для сравнения использовали пептидный гормон – аналог люлиберина – сурфагон. Установлено, 22 что торможение роста опухоли (ТРО) Миколикопином близко к показателю ТРО для сурфагона. Следовательно, Миколикопин по показателю ТРО представляет несомненный интерес для его использования при лечении рака простаты. В основе разработки лежат 3 патента РФ. В опытах на мышах по программе скрининга модификаторов биологических реакций в лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ РАМН подтверждено противоопухолевое действие Миколикопина и высказано предположение, что его опухолеингибирующий эффект реализуется за счет иммуномодификации. Установлена нетоксичность препарата по данным суб- и острой токсичности. Создана лекарственная форма Миколикопина в желатиновых капсулах, содержащих профилактическую суточную дозу (5 мг) ликопина. Установлены сроки годности субстанции и лекарственной формы (3 года) и созданы проекты временных фармстатей на субстанцию Миколикопин и его лекарственную форму. Получены новые данные о механизме действия Миколикопина на рак простаты. Установлено, что процент анеуплоидных клеток и индекс пролиферации достоверно снижаются в фазах S и G2 +M, что может свидетельствовать о влиянии Миколикопина на опухолевые клетки именно в эти фазы их развития. В Аккредитованном испытательном центре ООО НБЦ «Фармбиомед» по данным тестов Эймса и учета доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей установлено, что Миколикопин не обладает мутагенной активностью. Получены также данные об отсутствии у препарата аллергенной способности. Составлен проект инструкции по медицинскому применению Миколикопина и определена валидность метода учета его активного начала. Для сбора документации, необходимой для выхода на клинические испытания, определены: 1) технические параметры производства Миколикопина, 2) оптимизирована биотехнология получения активного спорового материала и условия сохранения производственных штаммов Blakeslea trispora, 3) уточнен механизм действия (трансляция матриц на рибосомы или транскрипция) стимулятора ликопинообразования МАП, используя ингибитор синтеза белка (циклогексимид) и нуклеиновых кислот 23 (актиномицин D). Эти исследования позволили увеличить выход ликопина на 10–13 %. 24 СПОСОБНОСТЬ НЕКОНКУРЕНТНЫХ БЛОКАТОРОВ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ NMDA ТИПА ПРЕДУПРЕЖДАТЬ РАЗВИТИЕ ИНСУЛЬТА МОЗГА КРЫС, ВЫЗВАННОГО ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИЕЙ Л.Г.Магазаник1),С.В.Калеменев1,2), О.Е.Зубарева2), Н.Я.Лукомская1) Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, 2)Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН2), г. Санкт-Петербург 1) Блокада глутаматных рецепторов NMDA может стать одним из эффективных путей борьбы с прогрессирующим развитием инфаркта мозга, вызванного внезапно возникшей локальной ишемией. Од-нако до сих пор специфические антагонисты NMDA рецепторов не нашли применения в клинике. Основная причина – обязательное участие NMDA рецепторов в осуществлении большинства нормально протекающих нервных функций и отсутствие антагонистов, способных избирательно действовать в патологических очагах, что обусловливает побочные эффекты (общетоксические, двигательные и психические нарушения), способные свести на нет лечебное Действие. Это диктует необходимость поиска новых лучше переносимых NMDA блокаторов. Проведено сравнение нейропротекторного действия двух производных адамантана: нового неконкурентного антагониста NMDA рецепторов, ИЭМ-1957, и мемантина. В качестве экспериментальной модели фокальной ишемии головного мозга применялась перманентная окклюзия левой среднемозговой артерии крысы. Окклюдер (нейлоновая нить) вводился через общую сонную артерию так, чтобы запиреть кровоток в средней мозговой артерии у опытных и не нарушить у ложнооперированных крыс. Препараты вводились внутрибрюшинно через 2 часа после начала окклюзии или ложной операции (в период так называемого терапевтического окна – острой фазы развития инсульта). Эксперименты выполнены на нескольких группах животных (общее число 114): окклюзия без лечения (введение физиологического раствора), введение мемантина (10 мг/ кг) или ИЭМ-1957 (3 мг/кг или 30 мг/кг) на фоне окклюзии. Ложно оперированным крысам вводили те же вещества в тех же дозах. Окклюзия без применения неконкурентных блокаторов NMDA рецепторов вызывала гибель 87 % 25 животных к концу 3-х суток. Проведенное исследование выявило высокую эффективность блокаторов. Значительное снижение смертности (до 0-10 %) в те же сроки наблюдалось как при введении обеих доз ИЭМ1957, так и мемантина. Для исследования последствий ишемии и, в частности, действия препаратов на поведение применяли тест «Открытое поле» за сутки до операции и на 3-й день после нее. Оценивали двигательную активность (число пересеченных квадратов, время локомоции и движения на месте, время полной неподвижности), тревожность (время грумминга, число вертикальных стоек), исследовательскую активность (число и время обследования норок и стоек с упором). Мемантин (10 мг/кг) повышал уровень двигательной и исследовательской активности у ишимизированных крыс, но понижал у ложнооперированных. Введение крысам, перенесшим окклюзию, 30 мг/кг ИЭМ-1957 вызывало уменьшение показателей исследовательской активности и удлинение времени паттерна «сидит» на фоне низкой тревожности. Та же доза ИЭМ-1957 снижала время полной неподвижности ложнооперированных крыс. В наибольшей степени контрольной группе соответствовали крысы, которым на фоне как окклюзии, так и ложных операций вводили низкую дозу ИЭМ-1957 (3 мг/кг). Таким образом, оба применявшихся блокатора NMDA рецепторов оказывали выраженное лечебное действие при развитии ишемического инсульта. Высокой эффективностью и отсутствием побочного действия на поведение обладал ИЭМ-1957 в дозе 3 мг/кг, что делает его перспективным для более подробных исследований. ПРЕКЛИНИЧЕСКАЯ СТАДИЯ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА: КОМПЕНСАТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ Р.Р.Нигматуллина1),2), Т.С.Федосеева2), С.Н.Земскова2), А.Е.Медведев3), О.А.Бунеева3), Г.Р.Хакимова4), Е.А.Козина 4) Казанский институт биофизики и биохимии КазНЦ РАН, Казань; 2) Казанский государственный медицинский университет; 3)НИИ биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН, Москва; 4) Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва 1) Цель работы: изучение адренергической регуляции сократимости миокарда, концентраций адреналина, норадреналина, 26 дофамина в плазме крови и левом желудочке и развития компенсаторных механизмов в мозге у мышей в моделях досимптомной (ДСП) и ранней симптомной стадий паркинсонизма (РССП). Модель досимптомной стадии паркинсонизма – через две недели после двукратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг веса; модель ранней симптомной стадии паркинсонизма – через две недели после четырехкратного введения МФТП в дозе 12 мг/кг веса (Угрюмов М.В. и др., 2009). Исследование проведено на мышахсамцах линии С57BL/6 в возрасте 2,5-3 месяца, весом 22–26 г. Результаты: В ДСП в плазме крови концентрация дофамина снижается на 28 % (р < 0,05), не изменяются концентрации адреналина (Адр), норадреналина (НА). При переходе от ДСП к РССП концентрация НА увеличивается на 46 %, Адр на 44 % и дофамина в три раза. В миокарде левого желудочка (ЛЖ) в ДСП наблюдается снижение концентрации НА, а в РССП – увеличение, концентрации Адр и дофамина в миокарде ЛЖ не изменяются. Сила сокращений ЛЖ в ДСП существенно не изменяется, однако на Гистологических срезах выявляется миолиз отдельных кардиомиоцитов. В РССП происходит снижение массы ЛЖ на 19 % по сравнению с контролем. Реакция силы сокращения ЛЖ на норадреналин в ДСП повышается, что может быть следствием снижения концентрации НА в миокарде. Однако в РССП НА вызывает снижение силы сокращений ЛЖ на 25-60 % в зависимости от концентрации. Эти результаты свидетельствуют о существенном нарушении в адренергической регуляции сократимости миокарда при переходе от досимптомной к ранней симптомной стадии паркинсонизма. В ДСП в стриатуме и черной субстанции обнаружено снижение уровня мРНК МАО Б, а в черной субстанции отмечено практически четырехкратное снижение уровня мРНК МАО А (p<0,01) и двукратное увеличение уровня мРНК МАО А в стриатуме (p<0,001). Активность МАО Б в стриатуме на 33 % ниже (р<0,05) по сравнению с контролем, в черной субстанции статистически значимых изменений активности МАО Б не отмечено. Активность МАО А в обоих исследованных отделах существенно не изменялась. В РССП основные изменения были отмечены в стриатуме. Так, уровень мРНК МАО Б был более чем в 7 раз ниже, чем в контроле (p<0,01). При этом снижение активности МАО Б было незначительным (и не достигало уровня статистической 27 значимости). В то же время в стриатуме отмечено существенное, более чем полуторократное увеличение активности МАО А (p<0,05) при отсутствии статистически значимых сдвигов в уровне мРНК этого фермента. В черной субстанции четырехкратное введение МФТП не вызывало столь значимых сдвигов. Полученные результаты свидетельствуют о сложных нарушениях в экспрессии и активности моноаминоксидаз черной субстанции и стриатума, происходящих в ДСП и РССП, индуцированной у мышей введением нейротоксина МФТП. Увеличение активности МАО А, обнаруженное в РССП, свидетельствует о необходимости включения ингибиторов активности этого фермента в терапевтические схемы лечения этого заболевания. Как следует из наших результатов, терапия селективными ингибиторами МАО А будет воздействовать на одно из патогенетических звеньев, способствующих истощению эндогенного дофамина, а не только как терапия депрессивных состояний, сопровождающих БП. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЗАЩИТНЫХ СИСТЕМ КЛЕТКИ ПРИ СИСТЕМНОМ ВОСПАЛИТЕЛЬНОМ СИНДРОМЕ И СЕПСИСЕ У МЫШЕЙ. ПОИСК НОВЫХ НАПРАВЛЕНИЙ ЛЕЧЕНИЯ Е.Г.Новоселова1),О.В.Глушкова1), С.М.Лунин1), М.О.Хренов1), Т.В.Новоселова1), С.Б.Парфенюк1), С.А.Соодаева2) УРАН Институт биофизики клетки, Пущино, ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА РФ, Москва 1) 2) Очевидно, что изучение механизмов ответа клетки на бактерииальные токсины целесообразно проводить с использованием современных представлений о роли ряда каскадов внутриклеточной сигнализации в формировании резистентности клеток к повреждающим агентам. Среди этих каскадов в первую очередь следует исследовать путь активации NF-κB, а также стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK, которая активируется многими типами экстраклеточных сигналов. Кроме того, актуально исследовать пути активации рецептора TLR4, ответственного за связывание 28 эндотоксина с клеткой-мишенью. Наконец, очень важно провести поиск подходов для снижения последствий действия токсических факторов на клетку. В этом плане представляются актуальными исследования закономерностей функционирования защитных систем клетки, учитывая общее состояние цитокиновой сети (продукция про- и антивоспалительных цитокинов), уровень экспрессии белков теплового шока БТШ70 и БТШ90, и уровня активации каскадов сигнальной трансдукции NF-κB, SAPK/JNK и TLR4 при действии бактериальных токсинов, включая ингибиторы отдельных участков путей сигнализации. Исследовали закономерности воздействия in vitro (на клетках RAW 264.7) двух ингибиторов активации сигнального каскада TLR4 на уровень провоспалительного ответа клетки в условиях действия липополисахарида (ЛПС) из E. coli путем оценки продукции цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1α, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-γ), белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, оксида азота, а также оценивали эффект снижения активации сигнальных каскадов NF-κB и SAPK/JNK. Использовали специфические ингибиторы рецептора TLR4, при этом один из них CLI-095, известный также как TAK242, представляет собой новый метаболит циклогексена, который избирательно ингибирует сигнальный каскад TLR4, подавляя продукцию оксида азота и провопалительных цитокинов. Он действует исключительно через внутриклеточный домен трансмембранного рецептора, не затрагивая его внеклеточный домен. Другой ингибитор TLR4 рецептора, Oxpapc, представляет собой смесь окисленных фосфолипидов, содержащую фрагментированные или полноцепочечные окисленные sn-2 остатки. Этот ингибитор отличается тем, что он взаимодействует с липидной частью бактериальных токсинов, блокируя активность TLR4. Показали, что при воздействии на клетки бактериального токсина наблюдается ожидаемое увеличение продукции ФНО-, при этом, заблокировав рецептор TLR4 с использованием CLI-095 (1-й ингибитор), установили достоверное снижение продукции данного цитокина примерно в 2 раза. Интересно, что при использовании ингибитора OxPAPC наблюдали почти полное блокирование продукции ФНО-, что подтверждает тот факт, что ЛПС способен вызывать повышение продукции провоспалительных цитокинов не только через TLR4, но и через TLR2. Кроме того, оба 29 ингибитора подавляли активность сигнальных каскадов NF-κB и SAPK/JNK, оказывая защитное действие на клетки RAW 264.7. Таким образом, доказана эффективность блокирования экспрессии рецептора TLR4 в условиях токсического стресса путем применения ингибиторов как экстраклеточного, так и внутриклеточного доменов этого трансмембранного рецептора. В перспективе целесообразно исследовать антивоспалительную эффективность ингибиторов разных ступеней каскада сигнализации NF-κВ и SAPK/JNK. РОЛЬ ДЕФЕНСИНОВ В МОДУЛЯЦИИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ А.Д.Ноздрачев, Ю.Н.Андрианов, И.В.Рыжова, Т.В.Тобиас Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН Дефенсины представляют собой группу антибактериальных пептидов, обладающих широким спектром антибактериальной активности, а также демонстрирующих иммунорегуляторные свойства. Роль дефенсинов в механизмах сенсорной трансдукции остается малоизученной. Работа явилась продолжением исследований механизма действия дефенсинов и роли в этих процессах опиоидных пептидов и конкретно дельта-подтипа опиатных рецепторов. В работе использовался изолированный препарат вестибулярных органов лягушки, оценивалась импульсная активность вестибулярного нерва, которую регистрировали on-line с помощью персонального компьютера и специальной программы с последующим анализом по окончании эксперимента. Аппликация дефенсина в концентрации 0,0001–10 нM угнетала фоновую активность и возбуждающие ответы, вызванные Lглутаматом. Для большинства единиц пороговая концентрация дефенсина составляла 0,0001 нM. Возбуждающие реакции на аппликацию агонистов L-глутамата AMПА, НМДА и АЦПД значимо снижались в присутствие 1 нM дефенсина, что доказывает существование тормозной модуляции дефенсином ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов. Для определения присутствия дельта-подтипа опиатных рецепторов использовались 30 специфический дельта-агонист опиатных рецепторов ДСЛЕТ в концентрации 10-6–10-10 М и специфический дельта-антагонист налтриндол в концентрации 10-5–10-8 М. Аппликация ДСЛЕТ вызывала незначительное (менее 10 %) увеличение уровня фоновой активности вестибулярного нерва, величина которого не зависела от концентрации вещества и статистически не отличалась от уровня фоновой активности. Специфический антагонист опиатных рецепторов налтриндол не оказывал значимого влияния на фоновую активность афферентов и не влиял на тормозные эффекты дефенсина. Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать об отсутствии дельта-опиатных рецепторов в вестибулярном сенсорном эпителии. Поскольку ранее нами было установлено, что действие дефенсина практически прекращается после блокирования опиоидной системы антагонистами каппа- или мюопиатных рецепторов, можно предполагать, что взаимодействие молекул дефенсина с опиоидной системой осуществляется с помощью мю- и каппа-, но не дельта-опиатных рецепторов. ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЛОКАЛЬНЫХ УЧАСТКОВ КОСТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ОСТЕОПОРОЗА 1) В.С.Оганов , И.А.Скрипникова2), В.Е.Новиков1), А.С.Абирова2), Л.М.Мурашко1), О.В.Косматова2), О.Е.Кабицкая1) 1) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва; 2) ФГБУ ГНИЦ профилактической медицины Минздравсоцразвития РФ, Москва Исследованиями, проведенными в ГНЦ РФ – ИМБП РАН, было установлено, что потери минеральной плотности кости (МПК) здоровыми людьми в экстремальных условиях, как и последующее восстановление, неравномерно распределены по скелету и индивидуально специфичны. Практика лечения остеопороза (ОП) позволяет предполагать аналогичную ситуацию в клинике. Существующие в настоящее время классы препаратов для лечения ОП отличаются по механизму действия, влиянию на МПК в разных участках скелета и эффективности предотвращения переломов. 31 Лечение установленного ОП занимает продолжительное время. В России пока не накоплен опыт длительного приема этих препаратов. Целью данного исследования было оценить восстановительные возможности в разных участках скелета (по показателям МПК и развитию переломов костей) при длительной антирезорбтивной терапии. Проведены непрямые сравнительные исследования по оценке влияния длительной антирезорбтивной терапии препаратами разных классов на показатели МПК и развитие клинических переломов костей у женщин (старше 60 лет) с постменопаузальным ОП. Все пациенты получали также кальций с витамином Д3. Терапия алендронатом (Фосамакс) в дозе 70 мг 1 раз в неделю проведена у 45 человек, из них 19 принимали этот препарат в течение 6 месяцев, 24 пациентки – в течение 12 месяцев. По сравнению с контрольной группой (n=12), получавшей только кальций с витамином Д3, прирост МПК составил +7,4 % (р=0,001) в позвоночнике и +3,6 % (р<0,05) в шейке бедра. Достоверное снижение в крови уровня остеокальцина – маркера костного формирования на 43 % и С-телопептида (β-crosslaps) – маркера костной резорбции на 42 % уже к 3-му месяцу терапии свидетельствовало о неполном подавлении костного обмена и возвращению его к пременопаузальному уровню. Применение золедроновой кислоты (Акласта) у 78 человек в течение 36 месяцев способствовало увеличению МПК бедра на 6,0 % и позвонков на 6,7 % по сравнению с плацебо (р<0,001). При этом отмечено снижение риска переломов: позвонков – на 70 %, новых множественных переломов (≥2) позвонков – на 89 % (р<0,001) и переломов проксимального отдела бедра – на 41 %, всех остальных периферических переломов – на 25 % (р<0,001). Препарат двойного механизма действия, снижающий резорбцию и повышающий образование кости – стронция ранелат (Бивалос) в течение 12 месяцев получали 45 пациенток с ОП, в виде саше 2 г в сутки. Прирост МПК в позвоночнике составил 6,6 % (р<0,0001), в шейке бедра – 1,9 % (р<0,05), в проксимальном отделе бедра – 3,2 % (р<0,001) по сравнению с исходным уровнем. По сравнению с контрольной группой прирост МПК составил 6,9 % в позвоночнике, 2,5 % в шейке бедра, 4,2 % в проксимальном отделе бедра (р<0,001). 32 Исследования по данной теме, проведенные нами ранее, показали, что назначение лазофоксифена (селективного модулятора эстрогенных рецепторов – СМЭР) достоверно повышает МПК только в позвоночнике, не влияя на МПК бедра. Установлено, что при лечении постменопаузального остеопороза восстановительные процессы в различных участках скелета распределены неравномерно и зависят от класса препарата. Так, лечение бисфосфонатами (пероральной или инфузионной формой) и стронция ранелатом достоверно повышает МПК как в позвоночнике, так и в шейке бедра, тогда как СМЭР достоверно повышают МПК только в позвоночнике, не влияя на МПК бедра. ГИПОКСИЯ НОВОРОЖДЕННЫХ И ЕЕ ПОСЛЕДСТВИЯ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕСЯ В ОНТОГЕНЕЗЕ В.А.Отеллин, Л.И.Хожай, Л.А.Ватаева Институт им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург Современная неонатология уделяет существенное внимание периоду ранней новорожденности. В процессе родов и в первые дни после рождения организм новорожденных адаптируется к воздействию новых для него факторов среды, которые в значительной мере опосредуются гипоксически-ишемическими влияниями на все органы и их системы, и, в первую очередь, на нервную систему. Острая гипоксия плода является одной из основных причин возникновения патологии головного мозга, определяемой клиницистами как перинатальная энцефалопатия (ПЭП). Клиническая картина ПЭП проявляется в виде моторных, психоэмоциональных и когнитивных отклонений в последующем онтогенезе. ПЭП диагностируется у 5 % новорожденных детей, составляет более 60 % всей неврологической патологии детского возраста Отдаленные последствия перинатальной патологии обусловливают основные неврологические нарушения – задержку моторного, психического, речевого развития, расстройства процессов памяти, внимания, эмоций, сна – и занимают первое место среди всех заболеваний нервной системы в детском возрасте. Экспериментальные работы по изучению влияния нормобарической гипоксии на доношенных новорожденных индивидуумов, 33 что актуально для клиники, поскольку практически все дети при родах подвергаются воздействию гипоксии, нам не встретились. Изучение этого вопроса представляется обоснованным с позиций современной нейробиологии, поскольку дают возможность установить механизмы, а также динамику адаптивных и деструктивных процессов и их влияние на дальнейшее структурное и функциональное развитие головного мозга. Задача настоящей работы состояла в: 1) оценке влияния гипоксии в ранний послеродовый период на соматическое, моторное и неврологическое развитие крыс в период вскармливания; 2) изучении влияния гипоксии аналогичных параметров на структурно-функциональные характеристики неокортекса и гиппокампа. В проведенном экспериментальном исследовании показано, что острая гипоксия у новорожденных приводит к нарушению процессов становления структур головного мозга, поведенческих реакций и научения в последующем онтогенезе. Однократная нормобарическая гипоксия на 2-е сутки жизни вызывает отставание такого интегративного показателя общего развития и роста, как масса тела в период вскармливания (на41% на 4-е сут, 20 % к 30-м сут). У таких животных через 2 сут выявлены существенные нарушения сенсорно-двигательного развития, которые проявлялись задержкой развития рефлекторных реакций переворачивания на плоскости, отрицательного геотаксиса и избегания обрыва. Обнаружено также влияние воздействия гипоксии на реакцию удержания на натянутой бечевке (проявление мышечной слабости). В аналогичных экспериментах морфологически установлено, что все исследованные функциональные зоны неокортекса (моторная, сенсомоторная, слуховая, зрительная) реагируют стереотипно на ранние постнатальные воздействия гипоксии. Разные поля гиппокампа, созревающие у млекопитающих, включая человека, после рождения обнаруживают характерную для нее реакцию на гипоксическое воздействие. После экспериментальных воздействий у животных, достигших зрелости, также имеет место ряд структурных и функциональных отклонений, которые нуждаются в специальном изучении. 34 Обсуждается возможность создания и обоснования оригинальной модели перинатальной энцефалопатии с минимально выраженными мозговыми дисфункциями у детей, открывающей путь к разработке новых методов лечения. КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ПЕРЕДАЧИ ГОРМОНАЛЬНЫХ СИГНАЛОВ В ТКАНЯХ НЕРВНОЙ, СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ И РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМ И В ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ М.Н.Перцева1), А.О.Шпаков1), В.М.Бондарева1), О.В.Чистякова1), К.В.Деркач1), Л.А.Кузнецова1), С.А.Плеснева1), В.Н.Шипилов1), И.Б.Сухов1), И.В.Мойсеюк1), М.Ф.Баллюзек2), Е.А.Манова2) Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург 2) Клиническая больница РАН, Санкт-Петербург 1) Проект посвящен актуальной проблеме современной эндокринологии – изучению молекулярных основ развития сахарного диабета (СД) и его осложнений, затрагивающих ЦНС, щитовидную железу (ЩЖ), сердечно-сосудистую и репродуктивную системы, а также разработке подходов для коррекции нарушений в гормональных сигнальных системах, как ключевых причин СД, с помощью терапии интраназальным инсулином (ИИ) и серотонином (ИС). Установлено, что чувствительность к гормонам аденилатциклазной и гуанилатциклазной сигнальных систем (АЦСС и ГЦСС) в тканях крыс с экспериментальными моделями СД 1-го и 2-го типов (Т1СД и Т2СД), а также в эритроцитах и лимфоцитах людей, страдающих Т2СД и ожирением, в значительной степени меняется, причем эти изменения характеризуются рецепторной и тканевой специфичностью. В ЩЖ и репродуктивных тканях крыс с Т2СД снижена регуляция аденилатциклазы (АЦ) тиреотропином, хорионическим гонадотропином и некоторыми другими гормонами. 35 В крови крыс-самцов с Т2СД снижены уровни свободного тироксина и тестостерона. Обнаружено ослабление влияния гипоталамических рилизинг-факторов на синтез и секрецию тиреотропина и гонадотропинов. Эти данные свидетельствуют о нарушениях в гипоталамо-гипофизарно-гонадной и гипоталамогипофизарно-тиреоидной осях, возникающих при Т2СД, и позволяют разработать эффективные подходы для лечения осложнений Т2СД со стороны ЩЖ и репродуктивной системы. Лечение ИИ крыс с неонатальной моделью Т2СД и пролонгированным Т1СД частично или полностью восстанавливало регуляторные эффекты биогенных аминов и пептидных гормонов на АЦ и стимулирующие эффекты натрийуретических пептидов на гуанилатциклазу в мозге и периферических тканях диабетических животных. В наибольшей степени восстанавливались эффекты агонистов 5-HT1B-серотониновых, D2-дофаминовых и Som1/2соматостатиновых рецепторов, сопряженных с АЦ через G-белки ингибирующего типа. Лечение крыс с Т2СД с помощью ИС позитивно влияло на функциональную активность АЦСС и ГЦСС в мозге, но было малоэффективным в периферических тканях. ИИ повышал чувствительность тканей крыс с Т2СД к периферическому инсулину, что улучшало гликемический контроль. С помощью расширенной версии водного теста Морриса показано, что у диабетических крыс ИИ восстанавливает пространственную память и когнитивные функции, сниженные в условиях Т1СД и Т2СД, в то время как ИС улучшает в основном долговременную память. Совокупность полученных данных свидетельствуют о том, что терапия крыс с Т1СД и Т2СД с помощью ИИ и ИС восстанавливает функционирование АЦСС и ГЦСС, их чувствительность к гормонам и позитивно влияет на биохимические и физиологические процессы у диабетических животных. Продолжена разработка диагностического АЦ теста, для чего изучена АЦСС в лимфоцитах людей с Т2СД и ожирением, и показано, что эффекты инсулина, инсулиноподобного фактора роста-1, -агонистов и других гормонов на АЦ лимфоцитов снижаются. Степень выявленных нарушений положительно коррелирует с глубиной и выраженностью патологических изменений в органах и тканях при Т2СД. 36 АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ КИСЛОТНОЩЕЛОЧНОГО РАВНОВЕСИЯ В ЖИВОТНОЙ МОДЕЛИ НЕКОМПЕНСИРОВАННОГО АЛКАЛОЗА А.Г.Петренко, И.Е.Деев, О.В.Серова, Н.В.Попова, Д.И.Ржевский, А.А.Берчатова, А.Н.Мурашев Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва Ключевой функцией живых организмов является поддержание постоянства гомеостаза, в частности кислотно-щелочного равновесия. Изменения рН крови и внеклеточной жидкости как в сторону снижения (ацидоз), так и в сторону увеличения (алкалоз) происходят вследствие различных патологических процессов либо в результате особой диеты и прежде всего связаны с развитием почечной или легочной недостаточности. Нарушение правильной физиологической компенсации сдвигов кислотно-щелочного баланса представляет непосредственную угрозу жизни. Нами ранее было открыто свойство сиротского тирозинкиназного рецептора ИРР (рецептор, подобный рецептору инсулина) активироваться слабощелочной внеклеточной средой. ИРР экспрессируется в отдельных популяциях клеток тканей, способных секретировать основания, в частности бета-вставочных клеток почек, выстилающих дистальные канальцы нефронов. Для анализа потенциальной роли ИРР в регуляции кислотно-щелочного равновесия была получена линия мышей с генетически инактивированным геном ИРР. Мы провели определение 11 параметров крови мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена ИРР (по восемь животных в группе), содержавшихся в обычных условиях. Оказалось, что у нокаутных мышей были выше, чем у животных дикого типа, концентрация бикарбоната в крови (22.9 ± 1.0 мМ против 19.9 ± 0.6, p < 0.05), а также рН (7.29 ± 0.03 против 7.21 ± 0.02, p < 0.05) и гематокрит (54 ± 1.1 против 50 ± 1.0, p < 0.05). Остальные параметры крови практически не отличались. Во второй серии опытов у двух групп животных (10 мышей дикого типа и 12 нокаутных) индуцировали метаболический алкалоз внутривенным введением 1.3 % раствора NaHCO3 (200 мкл/10 г веса мыши). Параметры крови определяли в начале опыта, через 5 и 15 мин после щелочной нагрузки. Через 5 мин после инъекции 37 щелочного раствора динамика изменения концентрации бикарбоната и рН крови у мышей с нокаутом ИРР была такой же, как и у мышей дикого типа, т.е. наблюдалось повышение рН (от 7.24 ± 0.03 до 7.34 ± 0.02, p < 0.05 у мышей дикого типа и от 7.33 ± 0.01 до 7.36 ± 0.02, p < 0.2 при нокауте ИРР), а также содержания бикарбоната (в диком типе от 19.25 ± 0.98 до 23.47 ± 1.06, p < 0.05 у мышей дикого типа и от 23.64 ± 0.63 до 26.43 ± 0.53, p < 0.05 при нокауте). У мышей обеих групп через 15 мин после индукции алкалоза рН крови стал несколько ниже, чем через 5 мин (7.33 ± 0.03 у мышей дикого типа и 7.35 ± 0.02 при нокауте). Однако у нокаутных мышей через 15 мин снижение рН проходило наряду с существенным повышением концентрации бикарбоната наряду с увеличением парциального давления СО2 в крови в отличие от мышей дикого типа, у которых нормализация рН крови происходила за счет удаления избыточного бикарбоната. Таким образом, животные дикого типа и нокаутные по ИРР по-разному реагировали на острый экспериментальный алкалоз, вызванный введением бикарбоната в кровь. Можно заключить, что существуют как минимум два физиологических механизма компенсации алкалоза, один из которых связан с функцией бета-вставочных клеток почек экскретировать основания в виде бикарбоната, а второй с регуляцией функции легких удерживать кислоты в виде СО2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БИОМАРКЕРОВ ПСОРИАЗА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕТОДОВ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОГО ЛЕЧЕНИЯ И МОДЕЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЯ Э.С.Пирузян, С.А.Брускин, В.В.Соболев, А.Г.Соболева, А.А.Николаев, Л.В.Волкова, М.В.Мокрякова, А.Д.Золотаренко, М.В.Филимонова Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва Проблемы псориаза продолжают оставаться весьма актуальными и волнуют мировое дерматологическое сообщество и близких к нему специалистов в высочайшей степени, свидетельством чему являются ежегодные Всемирные конференции по псориазу и псориатическому артриту. Так, в 2008 году на 38 ежегодном совещании GRAPPA (Group for Research and Assessment of Psoriasis and Psoriatic Arthritis (Группа по изучению и оценке псориаза и псориатического артрита)) был установлен курс на развитие биомаркеров при псориазе. Биомаркер (биологический маркер) – это, как правило, субстанция, используемая в качестве индикатора биологического состояния. Биомаркеры могут быть генетическими, клеточными, цитокиновыми и физиологическими. Целью данной работы явилась идентификация генов и белков, перспективных в качестве биомаркеров, определяющих персонифицированные методы лечения и необходимых для создания клееточных и животных моделей сложных многофакторных заболеваний на примере псориаза. В связи с этим необходимо было решить следующие задачи: 1) Провести комплексный биоинформационный анализ транскриптомных и протеомных данных, выявить биомаркеры и механизмы регуляции их экспрессии; 2) Верифицировать выявленные маркеры и сигнальные пути на клиническом материале – биопсиях пораженной псориазом кожи; 3) Создать тест-систему на основе выявленных маркеров для разработки методов персонифицированной терапии и создания клеточных и животных моделей псориаза. Разработать критерии индивидуализированной терапии псориаза на основании созданной тест-системы. В своих биоинформационных исследованиях мы использовали базу данных GEO DataSets (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), в которой в виде электронных таблиц собраны результаты экспериментов оценки уровня экспрессии генов на биочипах. В результате мы построили сеть, показывающую пути передачи сигнала от лигандов и их рецепторов через транскрипционные факторы к регулируемым ими генам-мишеням, экспрессия которых была повышена при псориазе. Кроме того, мы определили более 20 рецепторов и лигандов, которые ранее никогда не связывали с псориазом. Часть выявленных маркеров, на следующем этапе нашей работы, была верифицирована на клиническом материале. Используя метод полимеразной цепной реакции в реальном времени, был проведен анализ уровня экспрессии 10 генов в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной у 18 больных. В результате проведенного эксперимента было выявлено, что экспрессия всех 10 генов (EPHA2, FCER1G, EPHB2, S100A9, 39 S100A8, PBEF, LILRB2, PLAUR1, LTB, WNT5A) повышена по отношению к контролю в образцах кожи, пораженной псориатическим воспалением. Так же было изучено изменение экспрессии данных генов до и после PUVA-терапии. После лечения уровень экспрессии всех исследуемых генов значительно снизился. В целом, повышенная экспрессия изученных генов у всех обследованных пациентов до лечения и снижение экспрессии этих генов после лечения позволяют сделать вывод о возможной ключевой роли их в патогенезе псориаза. На основании теоретического анализа и проведенных экспериментальных данных нами была разработана тест-система на основе праймеров и зондов для количественной ПЦР с целью оценки характера экспрессии биомаркеров псориаза и ключевых регуляторов сигнальных путей, определяющих экспрессию данных маркеров. ВЫЯСНЕНИЕ РОЛИ НОВОГО АМИЛОИДНОГО БЕЛКА ГЛАДКИХ МЫШЦ СМИТИНА В ПАТОГЕНЕЗЕ АМИЛОИДОЗОВ С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ МЕТОДОВ ИХ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ И КОРРЕКЦИИ. З.А.Подлубная1), Л.Г.Бобылёва1), А.Г.Бобылёв1), А.Б.Гехт2), Т.В.Гордиенко3), А.А.Федюшин3) Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Моск. области; 2)Российский Государственный медицинский университет, Москва; 3)Больница Пущинского научного центра РАН, Пущино, Моск. области. 1) Амилоидные отложения, неограниченно растущие в разных органах и тканях, – основной признак амилоидозов, от которых страдают миллионы пациентов. Доклиническая диагностика амилоидозов, их предупреждение или своевременное эффективное лечение являются главными задачами. Один из подходов к решению этих задач – изучение амилоидогенеза in vitro. В рамках программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» при изучении амилоидогенеза in vitro нами были открыты 4 новых амилоидных белка семейства тайтина скелетных и сердечной мышц (тайтин, С-, Х- и Н-белки), возможных участников 40 амилоидозов in vivo. Обнаружено сходство свойств их амилоидных фибрилл с таковыми Аβ-пептидов мозга, наблюдаемых при болезни Альцгеймера. Определена динамика формирования амилоидных агрегатов белками семейства тайтина и Аβ-пептидами 25-35 и 1-42 мозга. Установлено разрушающее действие тетрациклина на эти амилоиды и предотвращающее их образование. Антиамилоидное действие препаратов было подтверждено на клеточных культурах ПМЯЛ и нервных клеток по увеличению в их присутствии выживаемости клеток. При дальнейшем изучении амилоидоза in vitro мы открыли новый амилоидный белок смитин в гладких мышцах. Были найдены условия, в которых смитин формировал аморфные агрегаты, подобные амилоидным агрегатам белков семейства тайтина и Аβ-пептидов мозга. Их амилоидная природа была подтверждена специфическими красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т. С помощью электронной микроскопии (ЭМ) было показано антиамилоидное действие на амилоиды смитина, Х-белка и Аβ-пептидов мозга гидратированного фуллерена С60 и его растворимых производных: натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С60, фуллеренола, комплексов фуллерена С60 с поливинилпирролидоном (ПВП), а также нитропроизводных фуллерена С60. По данным ЭМ эти вещества разрушали амилоиды смитина, Х-белка и пептидов мозга и предотвращали образование новых агрегатов. Их антиамилоидный эффект был подтвержден флуоресцентным методом. На культуре клеток карциномы гортани человека HEp-2 была проверена токсичность антиамилоидных препаратов. Натриевая соль поликарбоксильного производного фулерена С60 оказалась токсичной. Среди исследованных производных фуллерена C60 были отобраны фуллеренол и комплексы фуллерена С60 с ПВП как наиболее эффективные и нетоксичные антиамилоидные вещества, на основе которых могут быть созданы антиамилоидные препараты. Метод определения токсичности позволяет проверить на токсичность не только амилоиды на разных стадиях их формирования и сами препараты, но и фрагменты распада амилоидов, что также отвечает требованиям практики. Такой подход в комплексе с визуальной оценкой с помощью высокоразрешающей ЭМ позволяет осуществлять подбор наиболее ценных лекарственных средств борьбы с разными амилоидами и амилоидозами, что является задачей дальнейших наших 41 исследований вместе с поисками и изучением амилоидных свойств у других мышечных белков. СТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА КРЫСЫ В.Р.Самыгина1), А.В.Соколов2), Т.С.Ситник1), Е.В.Родина1), М.О.Пулина2), Е.Т.Захарова2), В.Б.Васильев2) Институт кристаллографии РАН, Москва ГУ НИИ экспериментальной медицины, Санкт-Петербург 1) 2) Церулоплазмин (ЦП, ферро-О2-оксидоредуктаза) – медьсодержащая оксидаза плазмы крови, белок острой фазы воспаления. Церулоплазмин является мультифункцинальным белком и обладает несколькими ферментативными активностями: ферроксидазной, купроксидазной, супероксиддисмутазной и пероксидазной. ЦП препятствует образованию активных форм кислорода. ЦП используется в терапии как антиоксидант, стимулятор гемопоэза при иммунодепрессии и интоксикации. ЦП млекопитающих обладает высокой гомологией, однако этот белок из различных источников имеет ряд особенностей. Крыса представляет собой удобную модель в физиологии, фармакологии, трансплантологии, иммунологии, онкологии и изучении старения и сердечно-сосудистой системы. В последние годы появился интерес к изучению церулоплазмина крыс [1]. В связи с этим представляется актуальным сравнение церулоплазмина крысы и человека, поскольку важны не только результаты исследования патологий, проводимых на данной модели, но и правильная экстраполяция результатов. С целью проведения рентгеноструктурного анализа нами были проведены работы по кристаллизации церулоплазмина крыс. Кристаллизация ЦП крысы проводилась методом диффузии в парах. Для широкого скрининга начальных условий использовались коммерческие скриниги фирмы Hampton Research. Для проведения эксперимента использовались роботы Москито и Текан. Кристаллизация проводилась при температуре 4 градуса. В 42 результате были получены голубые гексагональные кристаллы размером 0.02 мм. Кристаллы были протестированы при 100К на станции синхротронного излучения ID 14-1, ESRF, Гренобль, Франция. Пространственное разрешение, до которого рассеивали кристаллы, составляло 20 Å. Поскольку дифракционное качество кристаллов не позволяло произвести рентгеноструктурный анализ, была изменена методика выделения и очистки церулоплазмина. Был разработан новый, двухэтапный метод очитки ЦП на основе его взаимодействия с неомецином. На первом этапе плазма крови с добавлением к ней ЭДТА и 6-аминокапроновой кислоты очищалась на колонке UNOQ-Sphere, на второй стадии использовали колонку с неомицин-агарозой. Продолжены работы по оптимизации условий кристаллизации ЦП, полученного по новой методике. Для предварительного анализа структуры ЦП крысы было проведено математическое моделирование белка с использованием программы Розетта. Было проведено сравнение полученной модели со структурой ЦП человека. Выявлено, что в целом структура ЦП крыс очень близка к структуре ЦП человечека, однако биоинформационный анализ позволил выявить различия в сайте связывания фенилдиамина и азида. ЦП крысы содержит в данном сайте треонин вместо важного для связывания Trp669 у ЦП человека. Также Нis667, вероятно образующий стекинг с Trp669 в этом центре связывания у ЦП человека, в ЦП крысы заменен на лейцин. Ser622 церулоплазмина консервативен, но у ЦП крысы, видимо, уже не играет стабилизирующей роли при связывании субстратов. Из полученных данных можно сделать вывод о более слабом связывании фенилдиамина и азида с ЦП крысы и соответственно более низкой оксидазной активности фермента по отношению к субстратам в данном сайте, что подтверждает биохимические данные. [1] Lane DJ, Robinson SR, Czerwinska H, Bishop GM, Lawen A. Biochem. J. (2010) 432 pp.123–132. 43 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ТРОМБОЦИТАРНЫХ Р2РЕЦЕПТОРОВ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ АНТИАГРЕГАНТНОЙ ТЕРАПИИ, ВЗАИМОСВЯЗЬ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИЕЙ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИМИ НАРУШЕНИЯМИ ТРОМБОЦИТАРНОГО РЕЦЕПТОРА ДЛЯ ФАКТОРА ВИЛЛЕБРАНДА О.В.Сироткина1,2), А.Е.Тараскина1), А.Б.Ласковец2), Н.О.Зайцева2), П.М.Асадуллаева2), С.М.Туаршева2), В.В.Голдобин2), Т.В.Вавилова2) Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова, Гатчина 2) Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова 1) Реакции активации Р2-рецепторов координировано запускаются после активации тромбоцитарных рецепторов фактора Виллебранда GPIba при повреждении эндотелия сосудов. Цель исследования: проанализировать генетические варианты рецептора фактора Виллебранда GPIbа и количество зрелых комплексов GPIb-IX-V на мембране тромбоцитов пациентов с различными сердечнососудистыми заболеваниями и здоровых доноров. В исследование были включены 315 человек, в том числе 123 пациента с цереброваскулярной патологией (41 – с ишемическим инсультом вследствие макроангиопатии, 41 – с лакунарными инсультами, 41 – с патологической извитостью церебральных артерий), 98 пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) и 94 добровольца без сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний в анамнезе. У всех включенных в исследование были проанализированы полиморфизм рецептора фактора Виллебранда Thr145Met GPIbа методом ПЦР-ПДРФ и количество рецепторов GPIbа на поверхности тромбоцитов методом проточной цитометрии, а также показатели активности тромбоцитарного гемостаза – АДФ-индуцированная агрегация (Т (%) при 2,5; 5 и 10 мкМ АДФ), средний объем тромбоцитов (MPV), число тромбоцитов, количество рецептора для фибриногена GPIIb-IIIa и экспрессия Р-селектина с помощью стандартной агрегатометрии, 44 гематологического анализатора и проточной цитометрии, соответственно. Количество GPIba достоверно коррелирует у обследованных пациентов с показателем MPV – R=0,27 (p=0,004) в группе с цереброваскулярной патологией и R=0,51 (p<0,001) у больных с ОКС. Аналогичная зависимость наблюдается для рецептора GPIIbIIIa и MPV – R=0,41 (p<0,0001) в группе с цереброваскулярной патологией и R=0,65 (p<0,001) у больных с ОКС. Количество GPIbα также достоверно коррелирует с изменением экспрессии Рселектина на поверхности тромбоцитов до и после индукции АДФ – R=0,25 p=0,006 и R=0,36 p=0,00004, соответственно, в группе с цереброваскулярными заболеваниями, что свидетельствует о прямой зависимости между количеством рецептора для фактора Виллебранда и активацией тромбоцитов в сосудах головного мозга. Более того, у пациентов с ишемическим инсультом вследствие макроангиопатии функциональная активность тромбоцитов зависела от полиморфизма Thr145Met GPIbа – степень АДФиндуцированной агрегации (5 мкМ АДФ) была выше у носителей аллеля 145Met GPIbа по сравнению с нормальным генотипом ThrThr (68±6 % против 62±10 %, соответственно, p=0,06). Во всех исследованных группах на активность тромбоцитов оказывало влияние количество рецептора GPIIb-IIIa – корреляция с АДФиндуцированной агрегацией составила R=0,22 (p=0,002) у пациентов с цереброваскулярной патологией, R=0,36 (p=0,02) у больных с ОКС в отсутствие антиагрегантной терапии и R=0,51 (p=0,002) у здоровых доноров. Следует отметить, что у пациентов на фоне приема антиагрегантов (аспирин+клопидогрел) функциональная активность тромбоцитов не зависела от вышеназванных показателей, что можно оценивать как эффективное подавление тромбоцитарной функции. В то же время между количеством рецепторов GPIIb-IIIa и числом тромбоцитов наблюдается обратная корреляция – R = -0,27 (p = 0,003). Такой же характер и направленность связи отмечены между MPV и числом тромбоцитов – R = -0,44 (p = 0,000001). Полученные данные позволяют предположить, что, чем менее активен каждый отдельный тромбоцит, тем больше клеток циркулирует в крови, и, наоборот, поддерживая баланс тромбоцитарного гемостаза. 45 ИНИЦИИРОВАННЫЕ ИМПУЛЬСНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ 308 НМ АГРЕГАЦИЯ И ПОСТАГРЕГАЦИЯ БЕЛКОВ 1) Л.В.Соустов , Н.М.Битюрин1), Н.В.Сапогова1), А.И.Коган1), А.А.Болдырев2), М.А.Островский3) Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород; 2)Международный биотехнологический центр при МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва; 3)Институт биохимической физики, Москва 1) Исследованы инициированные УФ излучением процессы агрегации и постагрегации основных белков хрусталика глаза: альфа-, бета-кристаллинов и их комбинации при различных концентрациях альфа-кристаллина и при различных режимах УФ облучения. Появление и рост высокомолекулярных агрегатов (образование таких агрегатов в хрусталике глаза является причиной развития катаракты) в процессе и после воздействия УФ (при постагрегации) контролировалось по изменению мощности Р рассеянного в растворах белков пробного пучка HeNe лазера (633 нм). Обнаруженный нами эффект постагрегации заключается в том, что после прекращения воздействия на растворы белков УФ излучения с некоторой экспозицией D0 может происходить самостоятельное образование крупных высокомолекулярных агрегатов. Исследование этого эффекта позволяет получить информацию о поведении агрегатов в отсутствие внешних денатурирующих факторов. Исследования агрегации и постагрегации бета-кристаллина и его смеси с альфа-кристаллином при концентрации каждого белка 0,5 мг/мл показали, что в достаточно широком диапазоне изменения D0 происходит постагрегация. При этом мощность Р монотонно возрастает после окончания УФ облучения. Исследована постагрегация альфа-кристаллина в растворах с концентрациями белка 0,5 и 1,0 мг/мл. При малых значениях D0 мощность рассеянного излучения пробного пучка быстро выходит на стационарный уровень и не меняется в течение нескольких часов. С увеличением D0 появляется постагрегация. Так, при воздействии УФ излучения с плотностью энергии 7,8 Дж/см2 за 1 минуту при частоте повторения лазерных импульсов 2 Гц на раствор с концентрацией белка 1,0 мг/мл рассеяние начинает расти 46 при дозе 650 Дж/см2. При экспозиции D0 = 830 Дж/см2 мощность рассеянного излучения резко (за 2 минуты) увеличивается в 3 раза, что существенно превышает скорость роста рассеяния в процессе УФ облучения. Зависимость мощности рассеянного излучения близка к шестой степени от размеров рассеивающих частиц, поэтому можно считать, что резкое увеличение рассеянной мощности обусловлено резким увеличением размеров белковых агрегатов. Мы полагаем, что одной из возможных причин такого скачка может являться конкуренция процессов агрегации и фотолиза. К моменту прекращения УФ воздействия (при дозе меньше D0) образуются большие агрегаты, в которых могут образовываться связи с энергией меньше 4 эВ, что меньше энергии кванта излучения 308 нм (4эВ). Это приводит к появлению фотолиза, который замедляет процесс агрегации. При выключении УФ излучения процесс фотолиза прекращается, и происходит резкий рост рассеянного излучения за счет эффекта постагрегации – самопроизвольного образования агрегатов больших размеров. Построена теоретическая модель УФ индуцированной агрегации бета-кристаллина, в которой было сделано предположение о конечном времени жизни агрегатов, образованных двумя исходными молекулами белка. Нами было учтено, что через некоторое время происходит диссоциация этих агрегатов на исходные молекулы. В рамках такой усовершенствованной модели получено хорошее согласование теоретических расчетов с экспериментальными данными. В настоящее время начаты исследования влияния широкого класса коротких пептидов, синтезированных в Международном биотехнологическом центре при МГУ им. М.В.Ломоносова, на процессы агрегации и постагрегации кристаллинов. ОСОБЕННОСТИ ДОФАМИНОВОЙ ТЕОРИИ ШИЗОФРЕНИИ В СВЕТЕ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ АНТИПСИХОТИКОВ В.Б.Стрелец, Ж.В.Гарах, В.Ю.Новотоцкий-Власов Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН В настоящее время в научной литературе особое внимание уделяется проблемам нарушения когнитивных процессов у больных 47 шизофренией (Gruzelier J., 1999; Strelets V.B., 2002, Sehatpour P. et al., 2010, Dale C.L. et al., 2010 и др.). Однако нарушения процесса обработки вербальной информации при данном заболевании являются на сегодняшний момент недостаточно изученными, а также практически отсутствуют электрофизиологические исследования, характеризующие изменение познавательных функций у больных шизофренией под влиянием новой медикаментозной терапии. В 2011 г. исследованы временны́е (латентность) и амплитудные характеристики ранних компонентов вызванного потенциала – волн Р100 и N170 при восприятии смысловой (слова) и бессмысленной (псевдослова) вербальной информации у здоровых испытуемых (46 человек) и больных шизофренией с преобладанием позитивной (32 человека) и негативной симптоматики (32 человека). Показано, что при пассивном восприятии слов латентность компонента Р100 у больных шизофренией с преобладанием позитивной симптоматики была меньше, чем у здоровых испытуемых в левой затылочной области. Латентность N170 в этих же условиях у всех больных шизофренией была значимо меньше, чем у здоровых испытуемых в париетальных областях. Латентность этого компонента у больных с преобладанием позитивной симптоматики была меньше, чем у здоровых испытуемых еще в левой затылочной области, а у больных с преобладанием негативных симптомов в правых затылочной и заднее-височной областях. Анализ латентностей компонентов P100 и N170 при пассивном восприятии псевдослов, а также в условиях, когда релевантными были слова, не выявил достоверных межгрупповых различий. В условиях, когда релевантными были псевдослова, латентность компонента N170 у больных с преобладанием позитивной симптоматики была меньше, чем у здоровых испытуемых, в левой теменной области, а у больных с преобладанием негативной симптоматики – в правой. Анализ амплитудных характеристик ВП показал, что у больных с преобладанием позитивной симптоматики этот показатель снижен по сравнению со здоровыми испытуемыми лишь в компоненте Р100 в условиях пассивного восприятия вербальной информации. Напротив, у больных с преобладанием негативных симптомов наблюдалось снижение амплитудных характеристик компонентов Р100 и N170 во всех экспериментальных ситуациях (и при 48 пассивном восприятии вербальной информации, и при наличии лексического задания). Так, при межгрупповом сравнении амплитуды компонентов ВП у больных с преобладанием позитивной симптоматики этот показатель был выше, чем у больных с преобладанием негативной симптоматики. Дополнительно проведено исследование характеристик ВП у 10 больных шизофренией с преобладанием негативной симптоматики до и после лечения антипсихотиками нового поколения (через 6–18 месяцев после первого обследования). Показано, что при пассивном восприятии смысловой вербальной информации (слова) после лечения у больных увеличивалась латентность компонента Р100 в левой затылочной области, а также в задневисочных областях симметрично, что приближало данные показатели к норме. Однако у этих испытуемых не выявлено достоверных изменений латентности компонента N170, а также амплитудных характеристик ВП, хотя незначительное увеличение амплитуды после лечения наблюдалось. Таким образом, выявлены некоторые различия нейрофизиологических механизмов, лежащих в основе проявлений негативной и позитивной симптоматики, а также показано влияние атипичных антипсихотических средств на когнитивные функции у больных шизофренией. РОЛЬ КОЛЛАГЕНА ПРИ ПАТОЛОГИИ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ В.Г.Туманян1), М.В.Молдавер1), Е.С.Котовская2), И.В.Филатов1), Л.Е.Рогулина3), В.А.Намиот4), Ю.В.Мильчевский1), Н.Г. Есипова1) ИМБ РАН, 2)ФГУ ГБМСЭ по г. Москве, 3)МФТИ, 4)НИИЯФ МГУ 1) Была продолжена проверка идеи о связи кардиопатий с наследственными и наследственно-обусловленными патологиями соединительной ткани. Доводы в пользу такой зависимости могли бы внести вклад в представления об этиопатогенезе сердечнососудистых заболеваний – основной причине смертности в развитых странах – и наметить новые терапевтические генотерапевтические подходы. 49 Согласно современным данным патология соединительной ткани часто возникает как следствие мутационных изменений на генетическом уровне (несинонимических однонуклеоидных пролиморфизмов), приводящих к изменениям на молекулярном уровне, вызывающем нарушения вплоть до тканевого уровня. Референтная группа, на которой был проведен генетический анализ, включала выборку из социально-значимой категории детейинвалидов, проходящих ежегодную медико-социальную экспертизу в г. Москве. Для пациентов, принадлежащих к референтной группе, характерна крайняя степень выраженности аномалий сердечнососудистой системы и в ряде случаев отягощенность синдромами Элерса-Данлоса и Марфана. Был проведен анализ кодирующей нуклеотидной последовательности, кодирующей коллаген III типа (ранее мы исследовали несинонимические замены в шестой цепи коллагена IV типа). У семьи из пяти человек (мать и четверо детей), страдающих различными сердечно-сосудистыми заболеваниями, произведен забор крови. Из образцов крови выделена ДНК, подобраны и синтезированы праймеры к 52 экзонам последовательности гена COL3A1. У трех пациентов (трех детей) обнаружена гетерозиготная замена в 30 экзоне G24983→A, что соответствует замене аланина на треонин А698Т в аминокислотной последовательности белка. Для фрагмента коллагена III, включающего трипептид с заменой, проведены априорные расчеты трехмерной структуры по последовательности аминокислот (с использованием программ молекулярной механики ICM и Tinker). Проведена оценка изменений энергии и параметров спирали, сопряженных с аминокислотной заменой. С помощью сервера DFIRE рассчитаны ΔΔG, соответствующие обнаруженной аминокислотной замене (G24983→A). Получен положительный знак приращения свободной энергии ΔΔG. Обсуждается интерпретация патологического эффекта мутаций (с учетом клинических проявлений) в терминах изменения локальных и глобальных свойств макромолекул коллагенов, приводящих к нарушениям процесса фибриллогенеза. Сделаны выводы о возможной связи структурных и энергетических последствий аминокислотных замен и характерных изменений в соединительной ткани. Основной причиной негативных 50 последствий является изменение характера контактов в пространственной структуре с треонином вместо аланина (Gly-GlyAla→Gly-Gly-Thr), что приводит к изменению свободной энергии, гидратации, а, следовательно, потенциалов взаимодействия трехцепных молекул коллагена. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕЙРОКОГНИТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЗАВИСИМОГО ПОВЕДЕНИЯ И МОТИВАЦИОННЫХ РАССТРОЙСТВ И.Б.Ушаков1), Ю.А.Бубеев1), Т.И.Котровская1), С.В.Квасовец2), А.В.Иванов2) ГНЦ РФ – ИМБП РАН, 2)ФГНУ «ГНТЦ НАУКА» 1) Разработан метод ритмосуггестивной коррекции состояния (РСКС), учитывающий закономерности мозговой организации неосознаваемых механизмов регуляции. Метод интегрирует такие способы оптимизации состояния, как ритмическая стимуляция, бинауральные биения, вербальные внушения. Процедуры являются индивидуально-специфичными, так как в них учитывается текущий характер функционального взаимодействия полушарий мозга, индивидуальные особенности реагирования на суггестивную информацию и индивидуальные особенности психологической защиты. Смысловые суггестивные паттерны комбинируются с ритмическими сенсорными воздействиями, а сам суггестивный сигнал модулируется по определенному алгоритму. За счет этого управляемое изменение активности полушарий и различных областей головного мозга сочетается с эффективной формой суггестивного воздействия. Проведена оценка эффективности РСКС путем организации серии коррекционных процедур на двух группах пациентов, имеющих признаки мотивационно-стрессового расстройства. Пять из них участвовали в проведении серии ритмосуггестивных процедур (по три процедуры каждый), а другие пять – в серии процедур аудиовизуальной стимуляции, во всем аналогичной первой, за исключением специально организованной суггестии. После формирования состояния релаксации частота стимуляции 51 левого и правого поля зрения формировалась таким образом, чтобы увеличить степень активации правого полушария и понизить левого. Затем по левому и правому аудиоканалу предъявлялись суггестивные формулы. Одновременно создавались бинауральные биения с помощью двух различных несущих частот. Аудиосигналы, содержащие суггестивную информацию, фотостимуляционные последовательности, частота бинауральных биений и несущие частоты бинауральных биений автоматически настраивались и объединялись в единые стимуляционные паттерны таким образом, чтобы обеспечить наилучшую синхронизацию суггестивной информации с активностью того полушария, которому она была адресована. Общая длительность процедуры составляла 20 минут. Для оценки эффективности коррекционных процедур использовалась методика анализа вызванных потенциалов при предъявлении эмоционально-значимых изображений из набора IAPS – International Affective Picture Systems (CSEA-NIMH, 1999). Для получения интегральных оценок аффективной интенсивности различных групп стимулов учитывались нормативные данные методики IAPS, определяющие принадлежность стимулов к группе высоко- или низкоинтенсивных. При помощи этой группировки, с использованием нейросетевых классификаторов, исходные показатели вызванных потенциалов, возникающих при предъявлении эмоционально-значимых изображений, преобразовывались в показатель, отражающий степень аффективности конкретного стимула, т.е. степень близости реакции к тем, что имеют место при предъявлении высоко- или низкоаффективных стимулов. Эти локальные показатели аффективности по каждому отведению использовались при проведении дальнейшей статистической обработки. Смысл локального показателя аффективности в том, что его увеличение в каком-либо отведении при предъявлении стимула означает, что данная область мозга связана с механизмами оценки этого стимула как высокоаффективного. Продемонстрирована бóльшая эффективность метода ритмосуггестии РСКС. Показано, что регулярное, неоднократное повторение ритмосуггестивных программ позволяет оптимизировать состояние и формировать устойчивые психологические установки. 52 ЯЗВЕННАЯ БОЛЕЗНЬ ЖЕЛУДКА И ГЛЮКОКОРТИКОИДНЫЕ ГОРМОНЫ: РОЛЬ ГОРМОНОВ В УСЛОВИЯХ УЛЬЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ Л.П.Филаретова1), Т.Р.Багаева1), О.Ю.Морозова1), Т.Т.Подвигина1), А.К.Ефимова2) Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург 2) Клиническая больница РАН, Санкт-Петербург 1) Нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП) – распространенные лекарственные средства, однако побочные эффекты серьезно осложняют их использование. Помимо наиболее известного ульцерогенного действия на желудок, НСПВП могут также оказывать вредное влияние на кишечник и сердечнососудистую систему. До сих пор все побочные эффекты НСПВП исследуются изолированно друг от друга, даже в отношении желудка и кишечника, что ограничивает успех в понимании механизмов патологического действия НСПВП и в разработке подходов, предупреждающих эту патологию. Цель работы заключалась в проверке гипотезы о том, что введение НСПВП даже однократно в ульцерогенной для желудка дозе может сопровождаться побочными влияниями на кишечник и сердечнососудистую систему, и что адекватная глюкокортикоидная терапия может ослаблять развитие патологического действия НСПВП в отношении всего организма. Гипотеза проверялась в экспериментах на крысах с использованием такого распространенного НСПВП, как индометацин. Через 4 ч после однократного введения индометацина в дозе 35 мг/кг в желудке крыс появлялись эрозии, которые заживали в течение первых двух суток. Далее мы впервые обнаружили, что заживление индуцированных индометацином эрозий в желудке сопровождается появлением повреждений в кишечнике. Кроме того, заживление эрозий в желудке сопровождалось потерей циркадного ритма частоты сердечных сокращений («с выходом» этого показателя на постоянный максимум), ухудшением общего состояния организма (уменьшением двигательной активности, снижением температуры тела) вплоть до смертельных исходов. Глюкокортикоидная терапия 53 ослабляла развитие патологического действия НСПВП в отношении всего организма. Полученные результаты подтверждают нашу гипотезу и свидетельствуют о необходимости интегративного подхода к изучению нежелательных побочных эффектов НСПВП на организм и об эффективности гормональной терапии в этих условиях в отношении всего организма. Filaretova L. Glucocorticoids are gastroprotective under physiological conditions. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 2011. Vol. 2. N 5. P. 333-342. Filaretova L. Activation of hypothalamic-pituitary adrenocortical axis as a gastroprotective component of stress response. Chapter in book: «Peptic Ulcer Disease». Jianyuan Chai (Ed). Intech. Croatia. 2011. P. 209-224. Подвигина Т.Т., Багаева Т.Р., Морозова О.Ю., Филаретова Л.П. Чувствительность слизистой оболочки желудка к ульцерогенному воздействию индометацина в разные сроки развития стрептозотоцининдуцированного диабета у крыс. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2011. Т. 97. № 8. С. 69-78. Filaretova L.P., Bagaeva T.R., Morozova O.Yu., Zelena D. The healing of NSAID-induced gastric lesion may be followed by small intestinal and cardiovascular side effects. J. Physiol. Pharmacol. (in press). Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» 2011. РАЗРАБОТКА ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ХРОНОАДАПТАЦИИ С ПОЗИЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА Л.Г.Хетагурова1), И.Р.Тагаева1), Ф.С.Датиева1), Л.Т.Урумова1), Н.О.Медоева1), Л.А.Мерденова1), С.Г.Пашаян1), С.Ч.Мамиева2), С.К.Кочиева2) УРАН Институт биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства РСО-Алания, 2 ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в РСО-Алания, Владикавказ, Россия 1 Современные методы диагностики и профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы (ССС) предусматривают изучение аллельных вариантов протромботических полиморфизмов факторов 54 гемостаза и стрессустойчивости у молодых лиц для установления генетических детерминант, участвующих в формировании предрасположенности к гемодинамическим нарушениям. Целый ряд известных сегодня аллельных полиморфизмов генов, в том числе определяющих адаптационные ресурсы, способны стать причиной острого территориального тромбоза или блокады терминального сосудистого русла микротромбами и фибрином. Проведен поиск генетических предикторов возникновения заболеваний ССС, личностно-характерологических и психотипологических особенностей, оценка взаимосвязи клинико-анамнестических, генетических, фенотипических и психотипологических признаков в контексте возможностей прогнозирования на 80 студентах СОГМА. Ингибитор активаторов плазминогена 1-го типа (PAI-1) является основным антагонистом тканевого активатора плазминогена и урокиназы, которые активируют плазминоген, способствуя фибринолизу. Выявленные у студентов генотипы полиморфных маркёров Glu298Asp гена NOS3 при ПЦР-диагностике генов-кандидатов, регулирующих микроциркуляцию, сосудистый тонус и процесс тромбообразования, в зависимости от варианта являются предиктором гипертонической и ишемической болезней сердца; маркеры 4G/5G PLANH1 (ингибитора активатора плазминогена 1) – PAI-1 в сочетании с 4G/4G и маркеры ТТ и СТ протеина С способствуют развитию неблагоприятного течения сердечно-сосудистых осложнений, развитию плацентарной недостаточности; вариант GG в полиморфизме гена HTRA2, способствующий развитию нарушений адаптации. У обследуемых студентов с десинхронозом выявлены и фенотипические характеристики, способствующие в прогнозе развитию осложнений сердечно-сосудистой системы: низкая граница роста волос, неодинаковая длина бровей, вросшие ногти, более 4 и, особенно, более 7 стигм дисэмбриогенеза, гиперстеническое телосложение, рост менее 170 см у мужчин и 160 см у женщин; II группа крови. Личностно-характерологический профиль части студентов характеризовался рядом достоверных отличий характеристик: снижением интеллектуальных функций, низкой способностью к обучению, меньшей эмоциональной устойчивостью, внутренней озабоченностью, чувствительностью, циклоидным и истероидным психотипами, сочетающейся с невротической депрессией, тревогой и истерическим реагированием, характеризующим степень выра55 женности психопатологической симптоматики. У большинства обследуемых более 70 % родителей имели в анамнезе заболевания ССС, метаболические нарушения, сахарный диабет. Проведенный регрессионный анализ показал высокую вероятность развития осложнений заболеваний ССС в возрасте 45±4 лет, что может служить теоретической базой для разработки конституционально-ориентированной тактики и стратегии первичной и вторичной профилактики осложненной патологии ССС в группах риска. Новые знания в области генетики (полиморфизм генов) – NOSI, NOS3, DARPP-32 играют важную роль при создании новых инновационных способов хронодиагностически, хронопрофилактики и хронотерапии СС заболеваний и их осложнений, обеспечивая новый методологический подход к решению медицинских проблем. ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РИСКА РАЗВИТИЯ ПАРАНОИДНОЙ ШИЗОФРЕНИИ, УНИПОЛЯРНОЙ ДЕПРЕССИИ И БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА Э.К.Хуснутдинова, И.М.Хидиятова, А.Э.Гареева, Г.Н.Ахмадеева Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа Целью настоящего исследования являлась репликация результатов полногеномных анализов ассоциации (GWAs) с параноидной шизофренией (ПШ) и болезнью Паркинсона (БП) на выборках больных и контрольных лиц – жителей Республики Башкортостан. На основе созданной коллекции ДНК 607 больных параноидной шизофренией русских (310) и татар (297) и соответствующего контроля (603 индивида) проведен анализ ассоциации 15 полиморфных локусов 11 генов-кандидатов, принадлежащих к семейству транспортеров моноаминов, рецепторов нейротрансмиттеров, генов, играющих важную роль в образовании и функционировании синапсов, генов системы главного комплекса гистосовместимости, семейства транспортных белков и глутаматергической системы: DISC1, PRSS16 (MHC), RELN, ZNF804A, PLXNA2, GRIN2B, NRG1, SLC18A1, DAOA, CHRNA7, APBA2 с риском развития ПШ. В результате анализа распределения частот аллелей, генотипов и 56 гаплотипов изученных полиморфных локусов этих генов были выявлены: 1) генетические маркеры повышенного риска развития ПШ а) у русских и у татар: генотип PRSS16*T/*T (OR=1,69), аллель PRSS16*T (OR=1,64) полиморфного локуса rs13219354 гена PRSS16; генотип SLC18A1*A/*A (OR=1,68) и аллель SLC18A1*A (OR=1,26) полиморфного локуса rs2270641 гена SLC18A1. б) у русских: аллель G72*C (OR=1,49) полиморфного локуса rs3918342 гена G72 (DAOA); генотип ZNF804A*A/*A (OR=2,23) полиморфного локуса rs1344706 гена ZNF804A. в) у татар: гаплотип GRIN2B*T*C*C (OR=2,32) по полиморфным локусам rs1805247, rs1805502, и rs1805482 гена GRIN2B; генотип GRIN2B*T*/*T (OR=2,35) и аллель GRIN2B*T (OR=2,39) полиморфного локуса rs1805247 гена GRIN2B. 2) генетические маркеры пониженного риска развития ПШ а) у русских и татар: аллель PRSS16*C (OR=0,61) полиморфного локуса rs13219354 гена PRSS16. б) у татар: аллель GRIN2B*С (OR=0,41) и генотип GRIN2B*С/*С (OR=0,07) полиморфного локуса rs1805247 гена GRIN2B. С целью поиска генетических маркеров риска развития БП проведен анализ полиморфизма трех локусов (rs356219, rs356165, rs2737020) гена альфа-синуклеина (SNCA) у 382 пациентов с БП (143 – русских, 157 – татар, 72 – башкир, 10-метисов и лиц других этнических групп) и 530 здоровых индивидов, соответствующих выборке больных по полу и возрасту (133 – русских, 307 – татар, 88 – башкир, 2 – метисов). Ассоциация с развитием БП установлена для локусов rs356219 и rs356165. В результате сравнительного межэтнического анализа частот генотипов и аллелей для каждого из этих локусов выявлено достоверное различие по частоте аллелей только между контрольными выборками русских и татар (р=0,02). При сравнении обобщенных по этносу выборок больных и контроля в каждом из этих локусов выявлены генотипы и аллели, ассоциированные с заболеванием: в локусе rs356219 генетическим маркером риска развития БП является аллель *G (OR=2,02), частота которого в выборках больных и контроля составляет 0,45 и 0,39, соответственно; протективными маркерами в отношении развития БП являются генотип *A*A (OR=0,71) и аллель *A (OR=0,73); в локусе rs356165 маркерами риска являются аллель *G (OR=1,36) и генотип *G*G (OR=1,51), протективным маркером – аллель *A (OR=0,73). При сравнении этнически подразделенных выборок 57 больных c соответствующими контрольными группами аналогичные ассоциации с достоверным уровнем значимости (p<0,05) выявлены только для башкир, в то время как для русских и татар они проявляются только на уровне тенденции. НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МОЗГЕ МЫШЕЙ С ДОСИМПТОМНОЙ МОДЕЛЬЮ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА В.И.Цетлин1), Е.В.Крюкова1), И.В.Шелухина1), Е.А.Козина2), М.В.Угрюмов2) Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва, 2) Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва 1) Основным нейрохимическим признаком болезни Паркинсона (БП) является дегенерации нейронов стриатума и черной субстанции (ЧС), а также снижение уровня дофамина (ДА) и дофаминергических рецепторов в мозге пациентов. Показано, что при этом уменьшается содержание никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) в стриатуме пациентов с БП, а также у грызунов и обезьян в соответствующих моделях (Quik M et al., 2007). Клинические проявления болезни свидетельствуют о необратимых изменениях нейронов. Эта стадия БП с трудом поддается лечению. Лечение, начатое на преклинической стадии, характеризующейся биохимическими изменениями в мозге, но отсутствием изменений двигательной активности, позволило бы замедлить переход в клиническую стадию. Целью данной работы являлось создание модели досимптомной стадии БП и исследование сопровождающих ее нейрохимических изменений. Эта модель была создана путем двукратного подкожного введения мышам самцам линии C57Bl/6 (возраст 2,5-3 месяца) 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) в дозе 12 мг/кг веса тела с 2-часовым интервалом. Через 2 недели после введения МФТП проводили: (а) исследование моторного поведения животных; (б) оценку метаболизма ДА в черной субстанции и в стриатуме; (в) анализ числа дофаминергических 58 нейронов в ЧС и терминалей их аксонов в стриатуме, идентифицируемых иммуноцитохимически по наличию тирозингидроксилазы (ТГ); (г) определение с помощью радиолигандного анализа количества нАХР в гомогенатах стриатума и ЧС. Для проведения радиолигандного анализа использовался 125I-α-бунгаротоксин (125I-Bgt), высокоэффективный лиганд гомомерных нейрональных α7 и α9 нАХР, и 3H-эпибатидин, связывающийся с гетеромерными нейрональными нАХР, состоящими из α3–α6 и β2–β4 субъединиц. Полученная модель БП характеризовалась отсутствием у животных двигательных нарушений, снижением на 56 % концентрации ДА и дегенерацией дофаминергических аксонов в стриатуме, а также уменьшением на 25 % числа ТГиммунореактивных нейронов компактной части ЧС. Обнаружено статистически значимое снижением содержания нАХР, связывающих [3H]-эпибатидин в стриатуме мышей, получавших МФТП. Разницы в содержании токсин-связывающих участков 125IBgt в гомогенатах стриатума опыта и контроля не было обнаружено. Разница в содержании [3H]-эпибатидин-связывающих участков в ЧС оказалась статистически не значимой. В результате проведенных экспериментов установлено, что уменьшение концентрации ДА, дегенерация дофаминергических нейронов и снижение уровня чувствительных к эпибатидину нАХР в стриатуме предшествуют развитию клинических проявлений БП. ФОСФОРИЛСОДЕРЖАЩИЕ ТЕТРАПИРРОЛЫ И ПОДАНДЫ – ПЕРСПЕКТИВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЕМОСОРБЕНТОВ: СИНТЕЗ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА А.Ю.Цивадзе1), В.Е.Баулин1, 2),И.П.Калашникова1, 2), Д.В.Баулин1), И.С.Иванова1), Е.Н.Пятова1, 2) Учреждение Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН, г. Москва 2) Учреждение Российской академии наук Институт физиологически активных веществ РАН, г. Черноголовка 1) 59 Создание специфических гемосорбентов, способных эффективно и селективно извлекать из крови ионы токсичных металлов и биогенных аминов, белковые, липидные и другие соединения за счет присутствующего на поверхности матрицы-носителя комплексообразующего соединения является важной научно-практической задачей. В таких сорбентах в качестве активного компонента используются нетоксичные органические лиганды природного или синтетического происхождения. Выбор и оптимизация химической структуры лигандов ведется на основе фундаментального изучения эффекта связывания «гость-хозяин» с использованием современных физико-химических подходов. Данная работа посвящена комплексному изучению фосфорилсодержащих тетрапиролов и подандов и включает синтез, изучение физико-химических свойств и противоопухолевой активности этих соединений. В рамках данной работы нами были разработаны удобные методы синтеза фосфорилсодержащих тетапирролов и подандов, по которым были наработаны опытные партии этих соединений. Другим направлением работ стало изучение физико-химических свойств синтезированных соединений, в частности исследованы процессы комплексообразования фосфорилподандов как с рядом токсичных катионов (Cs+, Sr2+, Ba2+, Сu2+, Cd2+, Pb2+, UО22+,Th4+), так и с катионами, присутствующих в живых организмах (Li+ Na+, K+, Ca2+), являющихся «металлами жизни». Противоопухолевая активность синтезированных соединений изучалась совместно с Национальном институте рака США (NCI). Предварительное тестирование проводили в рамках одной дозы на трех видах опухолевых клеток: MCF7 (рак груди), NCI-H460 (рак легкого) и SF-268 (рак ЦНС) при концентрации исследуемых соединений 10-4 М. Более детальное исследование выявленных «активных веществ» проводили по стандартной методике на культурах 60 линий опухолевых клеток девяти групп рака, таких как лейкемия, меланома, рак легких, толстого кишечника, ЦНС, яичников, почек, предстательной и молочной желез. Тестирование, которое проводили при пяти различных концентрациях, показало, что наибольшей активностью обладают фосфорилподанды с 2-дифенилфосфорилфенильными концевыми группами и полиэфирной цепью, содержащей не менее чем 3 этиленгликолевых звеньев. На основании результатов проведенных исследований были выявлены 60 соединения с высокой активностью и определены пути дальнейшей оптимизации их структур с точки зрения повышения противоопухолевой активности и регулирования растворимости в физиологических средах наиболее активных соединений. В рамках разработки технологии иммобилизации органических лигандов на поверхность полимерного носителя исследовано влияние ПАВ (катионного – гексадецилтриметиламмоний бромида, анионного – додецилсульфата натрия и полиэлектролита – натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы) на агрегацию тетрапирролов в водной среде. Определены условия существования макроциклических тетрапирролов в водных средах в неагрегированном состоянии, которое способствует образованию фотодинамически активных мономерных пленок на поверхности полимерного носителя. АНАБОЛИЧЕСКИЕ И КАТАБОЛИЧЕСКИЕ СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ В МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКНАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ Б.С.Шенкман1), Е.А.Лысенко1), О.Е.Зиновьева2), Ю.Н.Ломоносова1), Э.Г.Алтаева1), Ю.В.Казанцева2) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова, Москва 1) 2) Хроническая алкогольная интоксикация у большинства пациентов сопровождается тяжелыми поражениями скелетных мышц. Ранее было показано, что глубокая атрофия преимущественно мышечных волокон II быстрого типа у алкоголизированных животных развивается, главным образом, за счет инактивации анаболических сигнальных систем, в основном каскада mTOR [Lang et al., 2004]. При этом в экспериментах этого автора не наблюдалось существенного усиления экспрессии маркеров протеолитических процессов [Lang et al., 2005]. На предыдущем этапе наших исследований нами было показано значительное снижение содержания и уровня фосфорилирования субстрата mTOR рибосомальной киназы p70S6K в латеральной головке четырехглавой мышцы пациентов, страдающих 61 хронической алкогольной интоксикацией, а также рибосомальной киназы p90RSK [Лысенко и др., 2010]. Целью настоящего исследования было проведение анализа состояния сигнальных маркеров катаболических и анаболических путей у пациентов с запущенными формами хронической алкогольной интоксикации. Биоптатные пробы m. Vastus lateralis были получены у пациентов-мужчин, страдающих тяжелой формой алкогольной интоксикации (ежедневное потребление алкоголя в пересчете на абсолютный этанол 200 мл) в течение 5-20 лет. Пациенты были разделены на 3 группы на основании результатов морфометрического исследования мышечной ткани: группа без очевидных признаков атрофических изменений: группа с преимущественной атрофией волокон II быстрого типа и группа пациентов, у которых наблюдалась атрофия волокон обоего типа. Наряду с вышеописанными изменениями рибосомальных киназ, у всех пациентов было обнаружено почти двукратное увеличение фосфорилирования элонгационного фактора eEf-2, что обычно связывают с ингибированием элонгационного процесса на рибосомах. Исследование экспрессии протеолитических ферментов с помощью qRT-PCR показало, что у пациентов без атрофии проявлялась выраженная тенденция к повышению содержания мРНК Е3 убиквитинлигаз (MAFbx/atrogin-1и MuRF-1), ответственных за убиквитинизацию и распад как структурных, так и регуляторных белков. В то же время сколько-нибудь существенных изменений (по сравнению со здоровыми добровольцами) по этому параметру у пациентов с атрофированными мышечными волокнами не было обнаружено. Эти результаты вполне согласуются с данными исследования содержания убиквитин-конъюгированных белков методов вестерн-блоттинга: во всех группах пациентов нет достоверных изменений этого параметра по сравнению со здоровыми добровольцами. Таким образом, нами впервые при исследовании пациентов были обнаружены свидетельства нарушений как элонгационных, так и инициаторных сигнальных маркеров синтеза белка при хронической алкогольной интоксикации. При этом, как и в экспериментах на животных, заметных изменений маркеров катаболических процессов не было обнаружено. 62 Работа выполнена в рамках Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине». 2. Вопросы диагностики ДОЛГОВРЕМЕННЫЙ ДОНОЗОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ЗА ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫМИ ЛЮДЬМИ. ПРОБЛЕМА ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ Р.М.Баевский, А.П.Берсенева, Г.А.Зенченко, Е.С.Лучицкая, А.М.Мерзлый, А.Г.Черникова ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва Хроническое стрессорное воздействие условий окружающей среды, включая производственные, социально-бытовые, геофизические факторы, вызывает напряжение механизмов регуляции и повышенное расходование энергетических и метаболических ресурсов, что ведет к росту риска развития заболеваний. Поэтому долговременный донозологический контроль функционального состояния представляет как научный, так и практический интерес. Целью проводившихся исследований являлось получение научно обоснованных данных о естественной динамике показателей функционального состояния организма в течение длительного наблюдения и сравнение этих данных с результатами аналогичных исследований в 520-суточном эксперименте по программе «Марс-500». В исследование включены 12 контрольных групп в различных регионах мира: в России (Москва, Воронеж, Сыктывкар, Екатеринбург, Ижевск, Магадан), Белоруссии (Минск), Казахстане (Алмааты), Чехии (Пльзен), Германии (Штутгарт), Канаде (Торонто) и США (Поулсбо). Группы практически здоровых людей – испытателей численностью 10–15 человек (мужчины в возрасте 25–50 лет) в каждой из контрольных групп отобраны на основе анамнестических данных и поликлинического медицинского осмотра. Для проведения медико-экологических исследований использовался аппаратно-программный комплекс «Экосан-2007», аналогичный такому же комплексу, применяемому в основном эксперименте в гермокамере для обследований членов «марсианского» экипажа. Была разработана и активно использовалась специализированная база данных для сбора, хранения и анализа поступающих от 63 различных групп материалов. Был создан специальный сайт в Интернете (www.iki.rssi.ru/mars500) В течение всего периода исследований с июня 2010 г. по ноябрь 2011 г проведены долговременные медико-экологические исследования в различных регионах страны и мира. В ходе этих исследований осуществлены записи параметров, характеризующих сердечно-сосудистый гомеостаз, вегетативную регуляцию и самочувствие испытателей. Установлено, что имеется четкая сезонная динамика указанных параметров, а их исходные значения связаны с экологическими условиями. Показано, что индивидуальная динамика физиологических показателей в значительной мере зависит от влияния факторов окружающей среды. В большинстве случаев максимальные уровни риска развития патологии наблюдаются в осенний период, однако у практически здоровых людей они не превышают безопасного порога. Динамика изменений функционального состояния и отдельных его показателей у испытателей, находящихся в условиях гермообъекта, была более стабильной, чем в контрольных группах, живущих и работающих в естественной социально-производственной обстановке. Заключение. Долговременный донозологический контроль функционального состояния практически здоровых людей, проводившийся в различных регионах мира одновременно с экспериментом «Марс-500», показал, что уровень риска развития патологии во многом зависит от изменений экологических условий (климатические, производственные, социально-психологические факторы). Показано, что показатели вегетативной регуляции могут быть успешно использованы в качестве чувствительных индикаторов риска развития патологии. АНТИГЛИКАНОВЫЕ АНТИТЕЛА КАК МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Н.В.Бовин, О.Е.Галанина, Н.В.Шилова, И.М.Белянчиков Институт биоорганической химии РАН, Москва Ранняя онкодиагностика, в частности диагностика рака молочной железы, в затруднены из-за низкого уровня онкомаркеров в крови. De novo синтезированные опухолью гликаны в качестве 64 маркеров имеют преимущество перед другими молекулами благодаря их разнообразию, в настоящее время их насчитывают несколько десятков. Тем не менее циркулирующих в крови гликоконъюгатов на ранних стадиях малигнизации недостаточно для практической диагностики. Наша гипотеза состоит в том, что выявление не самих глико-молекул, а антител к ним даст значительно лучшие результаты, так как иммунная система работает как усилитель, значительно увеличивая сигнал, «записанный» в структуре гликанов, а кроме того, позволяя его значительно более удобно определять – непосредственно в крови пациента. Целями проекта была проверка этой гипотезы, выявление диагностически значимых антител, а также разработка нового подхода к диагностике и прогностике онкологических заболеваний. Для выявления диагностически значимых антител был разработан микрочип, в состав которого входит 300 гликанов – углеводных цепей человеческих гликопротеинов и гликолипидов, некоторые из которых являются известными опухолеассоциированными антигенами, например SiaLea (CA-19.9), TF и SiaTn. Сыворотка крови пациента наносится на чип, и специфически связанные с углеводами антитела далее выявляются с помощью флуоресцентномеченых вторичных антител (анти-IgG, анти-IgM, анти-IgA). Уникальным преимуществом этого подхода является то, что все маркеры представляют собой иммуноглобулины, благодаря чему они могут определяться одновременно на одном и том же чипе одними и теми же реагентами. С помощью чипа мы выявляем несколько, обычно около десятка, наиболее чувствительных к данному заболеванию типов антител; только их совокупность (signature) позволяет с высокой специфичностью выявлять заболевание. Множественность маркеров позволяет нивелировать индивидуальные особенности конкретного пациента, связанные с его возрастом, гетерогенностью опухоли, особенностями диеты, наличием других заболеваний и т.д. В данной работе мы исследовали сыворотки крови пациентов с раком молочной железы. Оказалось, что: 1) signature, достаточная для диагностической цели, состоит из 8–10 антител; 2) ни одно из диагностических антител не было направлено к известным гликанам-онкомаркерам; 3) все эти антитела есть и у здоровых доноров (но в другом количестве), то есть они относятся к естественным, а не к адаптивным антителам; 65 4) уровень некоторых антител достоверно меньше, чем у здоровых лиц, то есть они выполняют опухоль-надзорную функцию, что дает основание считать их потенциальными ранними прогностическими маркерами. С помощью гаптен-специфической хроматографии на гликане LeC одно из антител было выделено, и его меченая биотином форма была испытана (Н.Н.Тупицын, Онкологический центр, Москва) в качестве специфического гистохимического реагента, позволившего дифференцировать клетки рака молочной железы и соответствующие нормальные клетки. ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФОРМ НУКЛЕОФОЗМИНА Н.М.Владимирова1), М.А.Писарева1), Н.А.Потапенко1), Е.В.Ахидова1), О.М.Вольпина1), Т.И.Булычева2), Н.Л.Дейнеко2) Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва 2) Гематологический научный центр Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Москва 1) Согласно современным представлениям нуклеофозмин является полифункциональным белком, участвующим в биогенезе рибосом, регуляции клеточного цикла, апоптоза, пролиферации и малигнизации клеток. Показано, что малигнизация клеток сопровождается не только сверхэкспрессией нуклеофозмина, приводящей к подавлению апоптоза, но и появлением его аномальных структурных форм. Образование таких форм связано как с изменениями его гена, так и с посттрансляционными модификациями самого белка. Задачей данного проекта является выявление и характеристика опухолеспецифических форм нуклеофозмина. Понимание характера структурных изменений нуклеофозмина при малигнизации клеток невозможно без анализа его структуры в нормальных клетках. Такой анализ представляет собой более трудную задачу, поскольку содержание нуклеофозмина в них 66 несоизмеримо ниже, чем в опухолевых клетках. В работе помимо гомогенатов тканей трехдневных крыс (мозга, печени, почек, сердца, легких) были использованы выделенные из этих тканей ядра, наиболее обогащенные нуклеофозмином. Иммунохимический анализ позволил не только установить, что наиболее обогащенными нуклеофозмином препаратами являлись мозг и печень, но и впервые выявить, что в отличие от других тканей, включая наиболее обогащенную нуклеофозмином печень, препараты мозга содержали не только мономеры, но и олигомеры нуклеофозмина. Особый интерес представляет дифференцированный анализ состояния нуклеофозмина в клетках глии и нейронах, содержащихся в мозге, поскольку, судя по литературным данным, наиболее частыми злокачественными заболеваниями мозга являются глиомы, нейробластомы же встречаются довольно редко и лишь в детском (до 5 лет) возрасте. Иммунохимический анализ с применением полученных нами уникальных противопептидных антител позволил установить, что наиболее обогащенными нуклеофозмином подотделами мозга являются мозжечок и гиппокамп. В обоих препаратах наряду с мономерной детектировалась SDS-устойчивая олигомерная форма белка. Для ответа на вопрос, какие клетки (нейроны или глия) содержат олигомеры, мы провели иммунохимический анализ нуклеофозмина в препаратах первичных культур клеток глии и нейронов. Было впервые показано, что нейроны и клетки глии сильно отличаются не только по содержанию нуклеофозмина, но и по его структурному состоянию. В глиальных клетках содержалась как мономерная, так и олигомерная форма нуклеофозмина в отличие от нейронов, содержащих только следовые количества мономеров. Начаты работы и получены первые данные по структурному состоянию нуклеофозмина в глиомах и нейробластомах. Анализ нуклеофозмина в лимфоидных клетках здоровых доноров, больных со злокачественными и незлокачественными заболеваниями крови позволил выявить, что при злокачественных заболеваниях основные изменения касаются пула белка, детектируемого противопептидными антителами, выявляющими олигомеры, локализованные в ядрышке. Увеличение содержания этих олигомеров коррелировало с содержанием Ki-67 позитивных клеток. Сделано предположение, что полученные нами антитела 67 могут быть использованы для диагностики злокачественных заболеваний крови. ИССЛЕДОВАНИЕ ОТНОШЕНИЙ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ И ЯДЕРНОЙ ДНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ ОБЛУЧЕННЫХ МЫШЕЙ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ПАЦИЕНТОВ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ РАДИОТЕРАПИИ С ЦЕЛЬЮ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ ОЦЕНКИ РАДИАЦИОННЫХ ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ НАГРУЗОК 1) А.И.Газиев , Э.В.Евдокимовский1), Г.П.Снигирева2), И.Ю.Стрелкова1), С.А.Абдуллаев1), Н.П.Сирота1), Г.О.Шайхаев3), В.Г.Безлепкин1) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино; 2) ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Минздравсоцразвития РФ, Москва; 3) Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва 1) Исследования по созданию молекулярных биомаркеров ретроспективной оценки воздействия ионизирующих излучений и других генотоксических агентов на человека остаются актуальными. Такие биомаркеры могут быть инструментами для мониторинга режима терапии опухолей, а также для выявления лучевой реакции организма при случайных радиационных инцидентах. Значительный интерес представляет исследования циркулирующих ядерной ДНК (яДНК) и митохондриальной ДНК (мтДНК) в плазме крови и других биологических жидкостях. В предыдущих этапах по теме проекта было показано, что в плазме крови облученных мышей и пациентов после сеансов радиотерапии опухолей резко повышается содержание циркулирующей (внеклеточной) мтДНК с точечными мутациями, определяемых методом расщепления CEL-I нуклеазой гетеродуплексов, получаемых из ПЦР-ампликонов участков мтДНК. Эти результаты послужили основанием для продолжения работы. Мы анализировали количественные изменения внеклеточных мтДНК и яДНК, а также их соотношения в плазме крови облученных мышей и пациентов с раком легких после прохождения курса 68 радиотерапии. Для определения мтДНК и яДНК использовали образцы общей ДНК из плазмы крови мышей, после их облучения (через 1,0; 5,0; 24,0 часов и 5; 15 суток) рентгеновским излучением (в дозах 0,5; 1,0; 5,0 Гр), а также общей ДНК плазмы 9 здоровых доноров, 13 пациентов до и после проведения сеансов радиотерапии. Анализы проводились методом ПЦР в реальном времени с подбором праймеров и проб, специфичных к участкам мтДНК (ND1) и яДНК (β-actin), избегая амплификации последовательностей NUMT-псевдогенов в яДНК. Результаты исследований показали, что в плазме облученных мышей, по сравнению с контролем, значительно повышается уровень мтДНК и яДНК. Уровень повышения содержания ДНК в плазме облученных мышей зависит от дозы их облучения. При этом если максимум повышения яДНК регистрируется к 5 часам, то максимальное повышение мтДНК наблюдается к 24 часам после облучения животных при всех дозах. Более того, повышенный уровень мтДНК (хотя не очень большой), в отличие яДНК, в плазме облученных мышей сохраняется еще до 15 суток пострадиационного времени. Отношение фрагментов мтДНК/яДНК в 1,5–4,5 раза выше в плазме облученных (0.5; 1.0 Гр) мышей, по сравнению с контролем, и также сохраняется в течение 15 суток после облучения. Результаты анализов яДНК и мтДНК в плазме онкологических пациентов показывают значительный количественный разброс данных, получаемых от индивидуальных пациентов. Вместе с тем в плазме у 10 пациентов после проведения сеансов радиотерапии наблюдается увеличение, в разной степени индивидуально, содержания мтДНК и яДНК. При этом отношение мтДНК/яДНК повышается в 1,5–2,5 раза относительно данных, полученных до прохождения ими радиотерапии. Пострадиационное повышение содержания мтДНК, яДНК и их соотношения в плазме мышей, а также в плазме пациентов после сеансов радиотерапии можно рассматривать как результат клеточной гибели. В повышение фрагментов мтДНК в плазме, возможно, также вносит вклад избирательная митофагия поврежденных митохондрий. 69 РАЗРАБОТКА МЕТОДА И ЭЛЕМЕНТОВ ПРОГРАММНОАППАРАТНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ДЫХАНИЯ ЧЕЛОВЕКА К УГЛЕКИСЛОМУ ГАЗУ А.И.Дьяченко1,2,3), Ю.А.Шулагин1), Е.С.Ермолаев1), А.О.Гончаров3), А.В.Демин1) ГНЦ РФ – ИМБП РАН, г. Москва; 2)Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, г. Москва; 3)МФТИ (ГУ), г. Долгопрудный 1) Хеморефлекторная регуляция дыхания играет основную роль в подстройке вентиляции легких человека к метаболическим запросам и изменениям содержания CO2 и O2 во вдыхаемом воздухе. Во время кратковременных космических полетов и в положении лежа вентиляционная реакция (ВР) на гипоксию снижается, а ВР на гиперкапнию немного увеличивается [Prisk, 2000]. В длительных космических полетах ВР человека на гипоксию и гиперкапнию не исследовали. В известных методиках исследования ВР используется дыхание гипероксической газовой смесью из баллона со сжатым кислородом, поэтому такие методики малопригодны в условиях космического полета. Кроме того, влияние невесомости на чувствительность дыхания человека к углекислому газу может проявиться не в ВР, а в других параметрах дыхания. Необходимо определить параметры дыхания, управление которыми может измениться в невесомости. Целью настоящей работы была разработка модифицированного метода и элементов программно-аппаратного комплекса (ПАК) для оценки чувствительности дыхания человека к углекислому газу для применения в гравитационной физиологии, а также апробация некоторых методик предлагаемого метода на примере перехода человека в антиортостатическое положение (АНОП) тела. Разработанный нами макет ПАК включает дыхательный контур, набор физиологических датчиков, компьютер и программы для сбора и обработки данных. Дыхательный контур макета включает мягкий мешок, находящийся в жесткой емкости. Испытуемый выполняет возвратное дыхание в воздушное пространство между мешком и стенками емкости. Мешок сообщается с внешним пространством через датчик воздушного потока (система «bag in box»). Во время дыхания объем мешка изменяется, поэтому поток 70 атмосферного воздуха, равный потоку ДГС, проходит через датчик потока. Измеряли содержание СО2 и О2 в конечно-выдыхаемом воздухе. В исследовании участвовали 8 здоровых добровольцев, выполнявших по 4 серии экспериментов: 1) Возвратное дыхание гиперкапнически-гипоксической ДГС, начиная с дыхания комнатным воздухом, в положении сидя. 2) Возвратное дыхание гиперкапнически-гипоксической ДГС в АНОП лежа на спине под углом -12,5о. 3) Возвратное дыхание гипероксической ДГС в положении сидя. Гипероксическую ДГС создавали с помощью мембранного оксигенатора. 4) Возвратное дыхание гипероксиической ДГС в АНОП лежа на спине под углом -12,5о. Кроме ВР, в каждой серии оценивали реакцию дыхательного объема. В результате проведенных исследований установили, что наклон реакции дыхательного объема на СО2 при гипоксической стимуляции в АНОП достоверно (c вероятностью 99 %) увеличивается по сравнению с положением сидя. Различия наклонов ВР на СО2 в АНОП и положении сидя были недостоверны. Таким образом, нами предложен модифицированный метод оценки чувствительности дыхания человека к углекислому газу и элементы ПАК, позволяющие измерить влияние положения тела на чувствительность дыхания человека к углекислому газу. Работа поддержана Программой Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине». ВОЗМОЖНОСТИ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ДАННЫХ ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ В РЕАБИЛИТАЦИИ БОЛЬНЫХ РМЖ А.Л.Журавлев, Н.В.Тарабрина, М.С.Курчакова, М.А.Падун, Н.Е.Шаталова Институт психологии РАН, Москва Актуальным направлением в достижении эффективности комплексных социально-психологических реабилитационных мер, направленных на восстановление нарушений психики, вызванных соматическими болезнями, в том числе и угрожающими жизни, к которым относятся онкологические заболевания, является 71 разработка научно обоснованных и практически апробированных методов медико-психологической помощи. Результаты комплексного междисплинарного исследования психологических последствий стресса у больных раком молочной железы (РМЖ), выполненного сотрудниками ИП РАН совместно с кафедрой онкологии и лучевой терапии МГМСУ, подтвердили данные зарубежных исследователей о том, что диагностирование РМЖ может выступать в качестве интенсивного психотравмирующего стрессора, воздействие которого приводит к развитию у некоторой части (24 %) больных женщин посттравматического стрессового расстройства (ПТСР). Исследование проводилось с помощью комплекса психометрических методик и психофизиологической методики анализа вызванных потенциалов при предъявлении изображений, имеющих отношение к эмоционально-значимым и психотравмирующим ситуациям. Установлено, что показатели оценки субъективной значимости эмоциональных изображений адекватно отражают особенности психотравмирующей ситуации. Для больных РМЖ это информация, связанная с болезнью, угрозой смерти, возможным нарушением сексуальных и семейных отношений. При предъявлении изображений, связанных с психической травмой, значения показателей в различных областях мозга сопряжены с определенными характеристиками эмоционального реагирования. Увеличение показателей в задних отделах правого полушария соответствует эмоциональной напряженности. Увеличение показателей в передних отделах левого полушария соответствует тревоге, а уменьшение – избеганию. Обнаружены два типа изменений показателей, связанные с защитными механизмами. Во-первых, это уменьшение показателей при возрастании времени экспозиции стимулов (при увеличении их осознанности). В первую очередь такая реакция связана с левой лобной областью и коррелирует с защитным механизмом «подавление». Во-вторых, это уменьшение величины показателей ниже значений, имеющихся при предъявлении нейтральных стимулов, т.е. повышение порога реагирования на значимые стимулы. Такая реакция в наибольшей степени коррелирует с защитным механизмом «отрицание» (Тарабрина и др., 2010). 72 Данные исследования использовались для построения индивидуальной психокоррекционной работы с больными женщинами. В целом, анализ результатов исследования позволяет сделать вывод о том, что они могут служить основой прогнозирования динамики психического состояния больного, а также для профилактики возникновения посттравматическкого стрессового расстройства. Полученные в исследовании результаты имеют значение для разработки индивидуальных программ психологической реабилитации больных, своевременного выявления среди больных пациентов, имеющих риск развития постстрессовых состояний и для определения психотерапевтических стратегий при работе с больными. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЗВОНОЧНИКА С ПОМОЩЬЮ СОВРЕМЕННЫХ ПРЕЦИЗИОННЫХ МАТРИЧНЫХ ИНФРАКРАСНЫХ СИСТЕМ. Г.Р.Иваницкий1), А.А.Деев1), Е.П.Хижняк1), Л.Н.Хижняк2) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Клиника Московской медицинской фкадемии им. И.М.Сеченова 2) Центр реабилитации Медицинского центра Управления делами Президента РФ (Кубинка) 1) 2) Проводимые в работе исследования были направлены на разработку неинвазивных методов ранней диагностики заболеваний позвоночника на базе использования современных прецизионных матричных инфракрасных систем. Выполнение программы базируется на накопленном нами 10-летнем опыте использования современного тепловизионного анализа для ранней диагностики различных социально-значимых заболеваний, включая поражение сосудов конечностей, рак молочной железы у женщин, респираторные заболевания. Актуальность темы связана с тем, что заболевания позвоночника получили в настоящее время самое широкое распространение, независимо от возраста: 15 % всех людей страдают хроническими болями в спине, а 80 % хотя бы один раз испытывали подобные трудности. Свыше 60 % всех 73 трудопотерь связано с заболеваниями позвоночника. 75 % населения России, включая старших школьников и студентов, страдают от последствий малоподвижного образа жизни. Отсутствие широко доступных и распространенных методов ранней диагностики заболеваний позвоночника часто приводит к развитию запущенных форм болезни с формированием межпозвонковых грыж, развитием остеохондрозов, протрузии и дистрофическому изменению позвоночника, что приводит к необходимости проведения сложных и дорогостоящих хирургических операций. Таким образом, ранняя диагностика отклонений работы позвоночника от нормы является весьма актуальной задачей. В текущем году проводимые нами работы были связаны с созданием и накоплением базы экспериментальных термографических данных пациентов и здоровых людей. Эти исследования проводились на базе медицинских учреждений, в частности Факультетской хирургической клиники Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова и в Центре реабилитации Медицинского центра Управления делами Президента РФ (Кубинка), с использованием специально разработанной нами прецизионной термографической методики. Важным условием проведения исследований на данном этапе было подробное информационное обеспечение базы данных на основе записей из историй болезней пациентов. К настоящему времени нами с помощью термографического метода обследовано более 50 пациентов. Анализ полученных термографических изображений высокого разрешения проводился с помощью разработанного нами программного обеспечения на основе алгоритмов дифференциального сравнения с использованием статистических и корреляционных методов. Полученные результаты для заболеваний позвоночника, несмотря на их вариабельность и различную этиологию, свидетельствуют о перспективности выбранного метода диагностики подобных заболеваний. 74 КОМПЛЕКСНЫЙ КОМПЬЮТЕРНЫЙ МЕТОД ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВЕСТИБУЛОПАТИИ В СУБКЛИНИЧЕСКОЙ ФАЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ Л.Н.Корнилова1), И.А.Наумов1), Г.А.Екимовский1), Е.В.Дрынкина1), Е.С.Акарачкова2), В.И.Фёдорова2) 1) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН 2) НИЦ ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова В ходе предшествующего этапа работ была выявлена возможность использования компьютерных методов в диагностике головокружения и нарушения равновесия. Проведенные клинические исследования позволили установить совокупность показателей (диагностических критериев), позволяющих статистически достоверно различать группы больных, страдающих различными формами вестибулопатии. У больных с органической вестибулопатией точность диагностики, подтвержденной результатами МРТ, составила 90 % для периферических и 75 % для церебральных вестибулопатий. В случае психогенной формы заболевания, подтвержденной специальным психоневрологическим анкетированием и МРТ, точность диагностики составила 72 %. С целью повышения эффективности диагностики и дифференциации церебральных (сочетанных церебральнопериферических) и психогенных форм вестибулопатии представлялось необходимым расширение набора стимуляционных программ и создание законченного, целостного алгоритма компьютерного метода дифференциальной диагностики вестибулопатии в субклинической фазе заболевания. В качестве дополнительного диагностического приёма для выявления и дифференциации органических и функциональных нарушений ЦНС был использован метод определения точности зрительного слежения на фоне зрительных помех – ретинальной оптокинетической стимуляции (РОКС). Эффективность применения РОКС была продемонстрирована ранее при обследованиях космонавтов и спортсменов высокой квалификации. Корреляционный анализ (критерии Пирсона и Спирмена с коэффициентом доверия α=0.05) показателей зрительного слежения в отсутствии и на фоне РОКС выявил статистически значимые 75 отличия (p < 0.05) между всеми исследуемыми показателями при сравнении групп больных с органической и психогенной формами вестибулопатии. С целью создания единой компьютерной методики определения типа вестибулопатии у отдельного индивидуума был проведен дискриминантный анализ выявленных ранее диагностических критериев и показателей зрительного слежения в отсутствие и на фоне РОКС. Анализ проводился по результатам клинических обследований трех групп пациентов (от 18 до 24 человек в каждой), страдающих вестибулопатиями органического (церебрального или периферического) и психогенного генеза. Результатом явилось построение нескольких классификационных функций, позволяющих определить тип вестибулопатии индивидуума по диагностическим показателям, значения которых определяются в ходе его обследования. Применение искомых классификационных функций показало повышение точности выявления всех форм вестибулопатии: психогенной – до 81.0%, церебральной – до 88.9 % и периферической – до 95.8 % соответственно. Полученные результаты позволили создать законченный, целостный алгоритм комплексного компьютерного метода для дифференциальной диагностики вестибулопатии в субклинической фазе заболевания у отдельного больного без проведения дополнительных клинических обследований нейровизуальными и инструментальными средствами. Результаты клинической апробации метода продемонстрировали рост точности диагностики до 92.3 % в случае органической вестибулопатии и до 81.0 % при психогенной вестибулопатии. СОЗДАНИЕ НОВОГО ИСТОЧНИКА С ИТТЕРБИЕМ-169 ДЛЯ ВЫСОКОДОЗОВОЙ БРАХИТЕРАПИИ Л.В.Кравчук1), С.В.Акулиничев1), В.Н.Васильев1), Ю.К.Гаврилов1), В.И.Держиев2), Д.В.Держиев2), В.И.Ильин1), Д.А.Коконцев1), Д.Б.Лазебник1), В.М.Скоркин1) Институт ядерных исследований РАН, г. Москва, ООО «Медицинские стерилизационные системы», г. Химки, МО 1) 2) В настоящее время высокодозовая брахитерапия (ВДБ) с использованием иттербиевых источников привлекает все большее 76 внимание медиков и медицинских физиков. В ряде центров России и за рубежом были осуществлены попытки продвижения в технологии производства и использования этих источников. Возможность проводить радикальную радионуклидную терапию в обычных медицинских кабинетах без специальной биологической защиты, которую предоставляет этот вид брахитерапии, является принципиальным преимуществом данного направления в радиотерапии. Коллектив авторов проекта обладает эксклюзивными правами интеллектуальной собственности в области технологии лазерного выделения стартового изотопа иттербий-168 и освоил ряд последующих этапов в изготовлении иттербиевых источников. В отчетном году работа велась в основном в следующих направлениях: отработка технологии производства из ранее наработанного иттербия-168 внутренних титановых капсул с радионуклидом, восстановление на новом месте в ИЯИ РАН в г. Троицке, модернизация уникальной установки лазерного выделения иттербия и подготовка стенда и технологии пробного облучения источников на установках Экспериментального комплекса ИЯИ РАН. По первому направлению работ были созданы опытные образцы внутренних титановых капсул источников с материалом, удовлетворяющие требованиям как импортных терапевтических аппаратов ВДБ наиболее известных производителей медицинской техники, так и отечественного многоканального аппарата ВДБ «АГАТ-ВТ». Эти капсулы были подвергнуты пробному облучению на потоках тепловых нейтронов от реактора. Исследование излучения активированных капсул показало, что спектр излучения удовлетворяет требованиям ВДБ. По второму направлению работ была подготовлена площадки для размещения установки лазерного разделения в новом специализированном помещении ИЯИ РАН. Были проведены проектные работы по размещению уникального оборудования и начаты работы по подготовке к монтажу этого оборудования. По третьему направлению работ провели расчеты активностей иттербиевых капсул, достижимых при их облучении тепловыми нейтронами на установках нейтронного комплекса ИЯИ РАН. Был подготовлен стенд облучения на радиационной установке РАДЕКС. Был также подготовлен стенд для измерения спектров облученных образцов. Пробное облучение планируется провести в 77 течение одного из ближайших сеансов работы сильноточного ускорителя протонов ИЯИ РАН. КАРТРИДЖИ-МИКРОЧИПЫ ДЛЯ МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ В.Е.Курочкин1), О.С.Антонова1), А.Л.Буляница1), Т.А.Лукашенко1), Г.Е.Рудницкая1), А.Н.Тупик1), А.И.Цымбалов1), А.А.Евстрапов1), А.Б.Четверин2), Е.В.Четверина2), А.А.Гордеев2), И.В.Маринкина2), Я.И.Алексеев3), Ю.С.Аляпкина3), Д.А.Варламов3), Д.Г.Сочивко3) Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург; 2) Институт белка РАН, Пущино; 3) ЗАО «СИНТОЛ», Москва 1) Метод молекулярных колоний (ММК), разработанный российскими учеными (Институт белка РАН, чл-корр. А.Б.Четверин), способен радикально усовершенствовать количественную молекулярную диагностику таких социально значимых заболеваний, как вирусные и бактериальные инфекции (в том числе туберкулез), онкологические заболевания. В рамках проекта создана необходимая основа приборного обеспечения для ММК: разработана конструкция картриджа-микрочипа (КМЧ), изготовлена экспериментальная и опытная партии КМЧ, проведены лабораторные испытания полученных изделий, создан макет скоростного устройства термоциклирования (термоциклера) для КМЧ. Новая топология стеклянной пластины для КМЧ содержит четыре реакционных кАмеры для проб объемом 30 мкл, в каждой из которых находится полиакриламидный гель. Исследуемая проба с реагентами вводится в реактор с помощью дозатора, внешние каналы КМЧ герметизируются, и устройство помещается в термоциклер, в котором осуществляется амплификация пробы. Для КМЧ разработан и изготовлен макетный образец скоростного термоциклера. Изготовлена партия опытных образцов КМЧ (40 штук). Продемонстрирована их пригодность для реализации ММК при определении возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis в мокроте человека и присутствия в крови человека мРНК AML1ETO – маркера острого миелоидного лейкоза. Молекулярные колонии обнаруживали по наличию флуоресценции, генерируемой 78 в результате переноса энергии между двумя зондами, которые гибридизируются с размноженной в результате проведения полимеразной цепной реакции в геле ДНК-мишенью. Испытания осуществлялись на базе Института белка РАН (лаб. член-корр. А.Б.Четверина). В исследованиях были использованы наборы реагентов, производимые ЗАО «СИНТОЛ», Москва. Эксперименты показали, что для надежного и достоверного обнаружения возбудителя туберкулеза методом молекулярных колоний необходима доработка и оптимизация наборов зондов для специфичного проведения ПЦР. Дальнейшим развитием этого направления молекулярной диагностики, связанным с совершенствованием приборного обеспечения, может явиться создание более дешевых и доступных КМЧ из оптически прозрачных полимерных материалов, разработка отечественных моделей флуоресцентных сканеров и скоростных устройств термоциклирования для КМЧ. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФНЫХ ИНСЕРЦИЙ ALU-РЕТРОЭЛЕМЕНТОВ ПРИ ОСТРОМ ЛИМФОБЛАСТНОМ ЛЕЙКОЗЕ Ю.Б.Лебедев 1), А.Ю.Комков 1,2), М.А.Масчан 3), А.А.Курносов1), И.З.Мамедов 1) Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва 2) Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В.Ломоносова, Москва 3) Российская детская клиническая больница, Москва 1) Одной из актуальных задач современной функциональной геномики, определяющей темпы развития персонифицированной медицины, является изучение индивидуальной вариабельности генома человека при различных патологических состояниях организма. Острые лейкозы объединяют группу неопластических заболеваний гематопоэтической системы, имеющих клональную природу. Субстрат опухоли представлен потомками одной активно пролиферирующей перерожденной бластной клетки кроветворной 79 системы, утратившей способность к дальнейшей дифференцировке. Для получения преимущества в пролиферации опухолевый клон должен накопить ряд генетических изменений, затрагивающих гены системы регуляции клеточного деления и дифференцировки. Вместе с тем спектры характеристических нарушений генома и транскриптома могут значительно различаться для разных типов опухолевых заболеваний. Первые результаты сравнительного анализа транскриптомов опухолей и прилежащих здоровых тканей, публикуемые нами и многими другими исследовательскими группами, подтверждают гипотезу о существенной роли активируемых копий мобильных элементов, в первую очередь видоспецифических групп AluY, L1Hs и LTR повторов, в формировании как структурных изменений генома, так и функциональных особенностей транскриптома малигнизированных клеток организма. В настоящей работе проведен функциональный анализ 31 полиморфной инсерции Alu-ретроэлементов, ранее идентифицированных нами в интронных областях генов человека, кодирующих регуляторные белки проведения сигналов дифференцировки и пролиферации клеток. Основным объектом исследований стали образцы одноядерных клеток крови и пунктатов костного мозга, полученные от пациентов с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и контрольной выборки здоровых доноров центрального региона России. По результатам проведенного сравнительного анализа показано аллельспецифичное снижение содержания первичных транскриптов генов для 21 интронной инсерции Alu-элементов. Сильно выраженным ингибиторным эффектом на транскрипцию аллеля в одноядерных клетках крови здоровых доноров и В-лимфобластов от пациентов с ОЛЛ обладают 10 инсерций. Частоты встречаемости аллелей, несущих две из таких инсерций в гене MEF2C и одну в гене TAX1BP1, значимо различаются в выборках здоровых доноров и доноров с ОЛЛ. На примере гена TARBP1 показано влияние интронной инсерции Alu на уровень зрелой мРНК в клетке. В результате проведенных исследований нами разработан первый вариант набора функциональных молекулярно-генетических маркеров (фМГМ), предназначаемый для ранней диагностики и прогноза риска развития онкологических заболеваний крови. 80 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ДНК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ, ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ НА ХИМИОТЕРАПИЮ ЦИСПЛАТИНОМ С.А.Лимборская1), А.В.Хрунин1), Д.В.Хохрин1), А.А.Моисеев2), В.А.Горбунова2), Ф.Г.Иванова3) Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва 2) Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН, Москва 3) ГУ Якутский Республиканский онкологический диспансер, Якутск 1) Соединения платины (II) до сих пор остаются одними из наиболее активных цистостатиков и входят в схемы химиотерапии многих злокачественных новообразований. При этом больные азиатского происхождения (японцы, китайцы и др.) являются более чувствительными, в сравнении с европеоидами, к токсическому действию препаратов платины. С использованием ДНК микрочипов на основе APEX-технологии нами проведено исследование взаимосвязи между полиморфизмом более 100 генов (гены метаболизма ксенобиотиков, гены системы репарации ДНК, а также ряд генов передачи сигнала и регуляции клеточного цикла) и эффективностью и токсичностью химиотерапии на основе цисплатина (схема CP: цисплатин 100 мг/м2 + циклофосфамид 600 мг/м2) у больных раком яичников женщин из Якутии, являющихся этническими якутами – типичными представителями населения Северной Азии. Выраженная взаимосвязь (p < 0.05) между генотипом и интервалом времени жизни больных без прогрессирования была отмечена для полиморфных локусов генов CDKN1B, EPHX1, CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1 и CASP3. Полиморфизм генов CYP1A1 и CYP1A2 был значимым также и для общей выживаемости пациентов. Корреляции с общей выживаемостью были отмечены для полиморфных локусов генов ADH2, BRCA2 и ATM. Распределение полиморфных генотипов по генам CYP1A1 и CDKN1B в группе пациентов с полными ремиссиями достоверно 81 отличалось от наблюдаемого у остальных больных, у которых такого результата достичь не удалось. Проведенные сравнения также позволили выявить ряд статистически значимых ассоциаций между полиморфизмом отдельных генов и побочными действиями химиотерапии. В случае одного из наиболее характерных побочных действий терапии цисплатином – нефротоксичности – такими генами были GSTT1, COMT и MTHFR. Сравнение распределений генотипов в группах больных с нормальным уровнем слуха и больных, у которых в процессе лечения было зарегистрировано его ухудшение, выявил статистические значимые различия в случае полиморфных локусов генов CYP2D6, EPXH1, RAD51 и TP53BP1. Для анализировавшихся проявлений гематологической токсичности были отмечены ассоциации с полиморфизмом следующих генов: а) тромбоцитопения – CYP1B1, RAD52; б) нейтропения – LIG4, CDKN1A, PARP1; в) анемия – BARD1, RFC1. Различия в распределении полиморфных генотипов между группами в зависимости от тяжести рвоты выявлено для генов ADH2, LIG4, NBS1 и CYP2E1. Для нейротоксичности отмечены корреляции с полиморфизмом генов ATM и RFC1. Сопоставление полученных данных с результатами аналогичного исследования, проведенного в группе больных женщин восточнославянского происхождения, не выявило общих корреляций ни по одному из тестируемых генов. Данный факт позволяет предполагать наличие этноспецифических особенностей в молекулярных механизмах реакций, определяющих чувствительность пациентов к химиотерапевтическому воздействию препаратов платины, и требует их дальнейшего изучения на более широком спектре генов. 82 АСИММЕТРИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ПРИНЦИПИАЛЬНО НОВЫХ РАДИОТРЕЙСЕРОВ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ОПУХОЛЕЙ С ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ТРАНСПОРТЕРОВ НОРЭПИНЕФРИНА МЕТОДОМ ПЭТ1 1) В.И.Малеев , Ю.Н.Белоконь1), З.Т.Гугкаева1), Т.Ф.Савельева1), Е.Г.Ситникова1), В.А.Тускаев2), В.В.Орловская3), О.С.Федорова3), Р.Н.Красикова3) Учреждение Российской академии наук, институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН (ИНЭОС РАН), Москва 2) Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, Москва 3) Учреждение Российской академии наук, институт мозга человека им. Н.П.Бехтеревой РАН (ИМЧ РАН), С.-Петербург 1) В результате выполнения проекта впервые разработана химическая стратегия получения нового радиотрейсера – 3-(2[18F]фтор-4,5-дигидроксифенил)серина (L-трео-6-[18F]FDOPS), фторированного аналога L-threo-3,4-дигидроксифенилсерина (L-DOPS), предшественника в синтезе норэпинефрина. L-трео-6-[18F]FDOPS, содержащий короткоживущий радиоактивный изотоп фтора-18 (T1/2 110 мин.), является перспективным агентом для ПЭТ диагностики опухолей с повышенной экспрессией транспортеров норэпинэфрина (феохромоцитом, нейробластом) и выявления дисфункции симпатической системы сердца, где норэпинефрин является основным нейромедиатором. В ходе проекта разработан метод получения двух энантиомеров: L-трео-6-[18F]FDOPS и D-эритро-6[18F]FDOPS; предложены механизмы, определяющие их взаимопревращение на стадии реакции конденсации. Продолжаются работы по подбору условий, обеспечивающих преимущественное образование целевого L-трео изомера, и разработке метода его В 2011 г. результаты докладывались на международных симпозиумах в Турку (XII Turku PET symposium), устный доклад и в Амстердаме (19th Int. Symposium on Radiopharmaceuticals Sciences), стендовый доклад). 1 83 выделения из реакционной смеси с помощью полупрепаративной ВЭЖХ. Для получения клинически значимых доз L-трео-6[18F]FDOPS и проведения последующих доклинических испытаний разрабатывается автоматизированная технология синтеза. Важным этапом проекта явилась разработка нового метода получения (2R,3S)-2-амино-3-(2-фтор-4,5-дигидроксифенил)-3-гидроксипропионовой кислоты (L-трео-6-FDOPS), содержащего стабильный изотоп фтор-19, в качестве хроматографического стандарта для идентификации меченого аналога. Ввиду наличия у 6-[18F]FDOPS четырех стереоизомеров задача получения целевого трео-изомера в энантиомерно чистой форме является нетривиальной, тем не менее она была успешно решена. Второй задачей проекта была разработка метода получения как изотопно меченного, так и «холодного» 6-фтор-норадреналина. Нерадиоактивный синтез, проведённый практически в полном объеме, показал наличие серьёзных отличий в стереодифференцирующей способности классических образцов катализаторов, применяемых для асимметрического синтеза промежуточного TMS-производного целевого циангидрина. В настоящий момент проводится работа по созданию более эффективных каталитических систем, для проведения этой стадии. Стандартным катализатором являются комплексы ванадия (V) в виде ванадил иона с двухзарядным тетрадентатным хиральным лигандом, представляющим собой основание Шиффа (1R,2R)-1,2диаминоциклогексана с 3,5-ди-трет-бутил-салициловым альдегидом. Для повышения эффективности и стереодифференцирующей способности катализатора были синтезированы и изучены изоструктурные комплексы с различными противоанионами. Данное направление модификации каталитической системы позволило повысить эффективность катализа, но стереодифференцирующая способность не изменилась. Для решения этой задачи в настоящее время синтезированы и интенсивно изучаются комплексы и на основе более стерически нагруженных замещённых (3-фенил, 3-аллил) салициловых альдегидов. 84 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФОРМАТИВНЫХ МКГ-ПАРАМЕТРОВ ДЛЯ ПАЦИЕНТОВ С ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ НА ОСНОВЕ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА ХАРАКТЕРИСТИК МАГНИТНОГО ПОЛЯ СЕРДЦА НА ИНТЕРВАЛАХ QRS И ST-T Ю.В.Масленников 1,3), С.Ю.Кузнецова2), М.Л.Сасонко2), М.А.Примин3), И.В.Невойда3), Г.Г.Иванов4) Институт радиотехники и радиоэлектроники им. В.А.Котельникова РАН; 2) Центральная клиническая больница РАН, Москва; 3) ООО «Научно-производственное объединение КРИОТОН», Троицк; 4) Первый МГМУ им. И.М.Сеченова, Москва 1) На данном этапе работы исследовались де- и реполяризационные показатели магнитокардиограммы у пациентов с артериальной гипертонией, оценивались их диагностические возможности для выявления электрической гетерогенности миокарда и сопоставлялись с методом стандартной электрокардиографии. Был проведен анализ наиболее информативных параметров магнитокардиограммы, разделяющих группы «условной нормы» и «артериальной гипертонии». В исследование было включено 162 человека (99 женщин и 63 мужчин) в возрасте от 35 до 65 лет. Из них 73 здоровых участника (М/Ж – 50/23, средний возраст 47,3+0,66) и 89 пациентов с АГ (49/40, средний возраст 57,3+0,63). У условно здоровых участников отсутствовали в анамнезе указания на какиелибо перенесенные заболевания, они не предъявляли жалоб, и по результатам клинического и лабораторно-инструментального обследования у них не было каких-либо значимых отклонений от нормы со стороны сердечно-сосудистой системы). В группе с АГ полный комплекс обследований с использованием ЭКГ- и МКГметодов был выполнен для 31 пациента. При анализе показателей МКГ у пациентов с гипертонической болезнью сердца при магнитокардиографическом обследовании программный комплекс автоматически рассчитывал более 100 параметров, характеризующих зарегистрированные распределения магнитного поля сердца пациентов и восстановленные, после решения обратной задачи, распределения векторов плотности тока в миокарде. Были выделены 4 наиболее диагностически значимых показателя у больных АГ по данным магнитокардиографии. 85 Полученное в ходе выполнения анализа МКГ решающее правило включало следующие параметры: 1) показатель направления токов (ПНТ), характеризующий гомогенность процесса реполяризации желудочков; 2) параметр «энтропия» (ПЭ), который характеризует степень отличия пространственного распределения векторов плотности токов на интервале QRS в «норме» и у обследуемого пациента; 3) параметр синхронности и корреляций (ПСК) МКГ во всех 36 точках плоскости измерений на ST-T интервале; 4) показатель оценки средней вариабельности магнитного поля (ПСВМП) за период реполяризации желудочков. Первичная классификация результатов показала различие выбранных параметров у пациентов с АГ по сравнению с данными контрольной группы. Нами был проведен анализ показателей МКГ и определены с использованием построения ROC-кривых пороговые значения, разделяющие «норму» и «патологию» у обследованных пациентов по указанным выше параметрам МКГ, которые обладают наибольшей чувствительностью и специфичностью в отношении диагностической ценности во всех представленных характеристиках МКГ. Интегральной использование всех четырех информативных параметров МКГ позволило разделить группу АГ и здоровых с чувствительностью 86 % и специфичностью 98 %, что существенно превышало аналогичные параметры, полученные традиционными методами ЭКГ. НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ НА ОСНОВЕ ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА СПЕКТРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ Д.Г.Матишов1), В.А.Тарасов1), М.И.Коган2), Д.И.Водолажский1), Е.Ф.Шин1), А.Ю.Голиков1), Д.В.Зимаков1), Т.Н.Белова1), Н.В.Бойко1), Е.Н.Черкасова1), М.Б.Чибичян 2) УРАН Российской академии наук Институт аридных зон ЮНЦ РАН, Ростов-на-Дону; 2)Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону 1) Интерес к исследованию протеолитического профермента плазминогена в значительной степени обусловлен тем, что на его 86 основе в клетках формируются белковые продукты (ангиостатин, плазмин), которые играют существенную роль в развитии злокачественных опухолей. В настоящее время до конца не ясны механизмы регуляции процессов посттрансляционных модификаций молекулы плазминогена и формирования его производных, играющих заметную роль при “озлокачествлении” опухолевых клеток. Цель нашего исследования заключалась в изучении спектров изоформ плазминогена на разных стадиях развития опухолевого процесса в предстательной железе у человека. Образцы плазмы крови были взяты у пациентов (мужчин) в возрасте от 61 до 70 лет: 16 условно здоровых доноров (контроль), 17 больных локальным (стадия Т1-Т2) и 20 больных распространенным раком простаты (стадия Т3-Т4). Анализ изоформ плазминогена включал следующие стадии: хроматографическое разделение с использованием аффинного сорбента лизин-сефароза, двумерное электрофоретическое разделение целевых белков, MALDI-TOF-масс-спектрометрическая идентификация. При оценке статистически значимых различий между частотой возникновения отдельных изоформ плазминогена в контроле и в опытных образцах использовался метод χ2. Исследование динамики изменений спектра изоформ плазминогена в зависимости от стадии развития новообразования в простате проводили с помощью дискриминантного анализа в соответствующих модулях пакета программ Statistica 7.0. Сравнительный анализ спектров изоформ плазминогена в опытных группах по сравнению с контролем показал, что наблюдаемые изоформы от П-1 до П-11 (диапазон значения изоэлектрической точки (pI 7.01–7.64)) присутствовали во всех опытных и контрольной группах. Различия касались группы спектров изоформ от П-12 до П-16, имеющих молекулярный вес (MW) ~112 kDa и диапазон pI 7.68-7.85. Использование дискриминантного анализа продемонстрировало, что спектры изоформ от П-12 до П-15 в различных их комбинациях характерны для локального рака, а спектры изоформ от П-12 до П-16 в различных их комбинациях – для распространенного. При этом значимость прогноза менялась при переходе одного спектра изоформ к другому, а также зависела от типа учитываемой 87 патологии. При этом прогностическая эффективность для локального и распространенного рака составила 65-70 %, соответственно. Таким образом, полученные результаты дают основание полагать, что вышеуказанные спектры изоформ плазминогена являются перспективными кандидатами на роль маркера в общей системе идентификации стадии развития процесса новообразования простаты у человека, на основе которого возможно создание диагностической тест-системы. КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ПРИ АТАКСИИ-ТЕЛЕАНГИЭКТАЗИИ. НОВЫЕ ДАННЫЕ О РОЛИ БЕЛКА АТМ В КЛЕТКЕ В.М.Михельсон, М.Л.Куранова, И.М.Спивак Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Атаксия-телеангиэктазия (АТ) является тяжелым наследственным нейродегенеративным заболеванием, имеющим выраженные черты повышенной радиочувствительности и хромосомной нестабильности, а также ускоренного старения на клеточном уровне. Белок АТМ (ataxia-telangiectasia mutated), неактивный или отсутствующий в клетках больных АТ, является протеинкиназой, способной к автофосфорилированию и активированию своей киназной активности в ответ на возникновение конформационных изменений хроматина после появления двунитевых разрывов ДНК и быстрому последующему фосфорилированию различных белков мишеней (Shiloh, 2003, Lavin, 2008). Ген АТМ лежит на 11 хромосоме – 11q23, имеет размер примерно 150 т.п.н. и содержит 66 экзонов (Savitsky et al., 1995, Pulverer, 2003). Хотя к настоящему времени он полностью секвенирован, оказалось, что каждая детально исследованная АТ-семья несет свою собственную мутацию, что требует полного сиквенса исследуемого гена и существенно осложняет диагностику (Sandoval et al., 1999). Часто диагноз АТ ставят детям в самом раннем возрасте при наличии атаксии неясной этиологии в сочетании с различными другими неврологическими нарушениями. В нашей лаборатории при исследовании фибробластов кожи, полученных от пациентов, был разработан метод быстрого и надежного подтверждения диагноза АТ. Для этого клетки 88 больных АТ, больных ХР, больных СS и здоровых доноров облучали в дозе 5 Гр и через 30 мин окрашивали антителами к фосфорилированной форме белка АТМ, которые затем визуализировали вторыми антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями. В клетках больных АТ никакого флуоресцентного сигнала не было, а в клетках как здоровых доноров, так и больных с другими наследственными синдромами выявлялись яркие фокусы, свидетельствующее о появлении фосфорилированной (активированной) АТМ. Таким образом, нами был снят диагноз АТ у трех больных из Харьковского медико-генетического центра АТ2КН, АТ3КР и АТ5КН и больной АТ7SP из СанктПетербурга. Изменение диагноза является крайне важным для дальнейшей терапии этих пациентов. Также этот метод может быть использован в спорных случаях и при пренатальной диагностике. С каждым годом в литературе описывается все большее количество белков, являющихся прямыми или опосредованными мишенями протеинкиназы АТМ. В настоящее время их число близко к 600 (Lavin, 2008). Для выяснения роли АТМ в адаптации организма к внешним воздействиям нами было предпринято исследование, позволившее определить, участвует ли АТМ в реакции клеток на экранирование магнитного поля Земли (ЭМПЗ). Для исследования клеточного ответа на ЭМПЗ клетки больной АТ и здорового донора помещались в специально сконструированную экранирующую камеру. Методом непрямой иммунофлуоресценции были исследованы белки Р53, 53ВР1 и Р21. Клетки здорового донора в условиях ЭМПЗ демонстрировали картину, подобную той, которая возникает при повреждении ДНК (DDR response), то есть повышалось количество белков Р53 и Р21, формировались фокусы 53ВP1. В первичных фибробластах больных АТ никаких видимых изменений обнаружено не было. Полученный результат подтверждает теоретическое представление о том, что белок АТМ является ключевым в процессе реакции клетки на изменение внешних условий и поддержания клеточной стабильности и расширяет наши знания о реакции клетки на геомагнитное поле. Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Биологические науки – медицине» Lavin M.F. 2008. Ataxia-telangiectasia: from a rare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 759-69. 89 Pulverer, B. 2003. ATMachine. Nature Cell Biol, 5:96. Sandoval, N., Platzer, M., Rosenthal, A., Dork, T., Bendix, R., Skawran, B., Stuhrmann, M., Wegner, R.-D., Sperling, K., Banin, S., Shiloh, Y., Baumer, A., Bernthaler, U., Sennefelder, H., Brohm, M., Weber, B.H.F., Schindler, D. 1999. Characterization of ATM gene mutations in 66 ataxia telangiectasia families. Hum. Mol. Genet. 8:69-79. Savitsky, K., A. Bar-Shira, S. Gilad, G. Rotman, Y. Ziv, L. Vanagaite, D. Tagle, S. Smith, T. Uziel, S. Sfez, M. Ashkenazi, I. Pecker, M. Frydman, R. Harnik, S.R. Patanjali,A. Simmons, G.A. Clines, A. Sartiel, R. A. Gatti, L. Chessa, O. Sanal, M.F. Lavin, N.G.J. Jaspers, A.M.R. Taylor, C.F. Arlett, T. Miki, S.M. Weissman, M. Lovett, F.S. Collins, Y. Shiloh. 1995. A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science 268:17491753. Shiloh Y. 2003. ATM and related protein kinases: safeguarding genome integrity. Nature Reviews/Caner, 3:155-168. РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ЖИТЕЛЕЙ РЕСПУБЛИКИ КАРЕЛИЯ Н.Н.Немова1), Л.В.Топчиева1), С.Н.Коломейчук1), И.Е.Малышева1), И.В.Курбатова1), Э.В.Гуров1), Н.Л.Рендаков1), В.А.Корнева2) Учреждение Российской академии наук Институт биологии Карельского научного центра РАН, г. Петрозаводск 2) МУЗ Больница скорой медицинской помощи г. Петрозаводска 1) Для исследования роли генетических факторов в развитии ССЗ у жителей Карелии, проживающих в условиях нестабильного климата и светового режима Европейского Севера, проведено типирование по генам, полиморфные варианты которых, предположительно, могут вносить вклад в формирование этих заболеваний. Основное внимание было сосредоточено на генах, кодирующих белки ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) (ангиотензинпревращающего фермента, ангиотензиногена, альдостеронсинтазы (АЛДС)), аполипопротеина Е (АпоЕ) и циркадного гена CLOCK. Выявлена ассоциация полиморфных вариантов генов АЛДС и АпоЕ с развитием сердечно-сосудистых заболеваний (эссенциальная артериальная гипертензия (ЭАГ), ишемическая болезнь сердца (ИБС), обширный инфаркт миокарда (ОИМ)) у жителей Республики Карелия. У носителей аллеля Т и 90 генотипа ТТ гена АЛДС, полиморфного в позиции –344 промотора, значительно повышен риск возникновения ЭАГ (OR=1,76), ОИМ (OR=1,87) и ИБС (OR=2,01). Показано, что женщины, имеющие в генотипе аллель Т в гомозиготном состоянии, меньше подвержены риску кардиоваскулярных расстройств, чем мужчины. Относительный риск возникновения ЭАГ у мужчин-носителей генотипа ТТ составляет 6,12, у женщин – 1,37. Уровень гормона альдостерона был выше у лиц с генотипом ТТ по сравнению с лицами, имеющими генотипы СС и СТ по данному полиморфному маркеру. Впервые показано, что наличие в генотипе аллеля 4 гена АпоЕ почти в 1,5 раза повышает риск развития ССЗ у жителей Карелии (OR=1,45). Женщины, носители аллеля 4, подвержены риску развития кардиоваскулярных расстройств больше, чем мужчины. Не обнаружена связь между полиморфным вариантом гена ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) и развитием сердечно-сосудистых патологий у жителей Карелии. Показаны достоверные различия в распределении аллелей и частот полиморфного маркера A/G -6 гена ангиотензиногена среди здоровых и больных CCЗ мужчин. Впервые обнаружена связь между полиморфными маркерами 3111 Т/С 3’-НТО и 843 Т/С 9 экзона циркадного гена CLOCK и развитием ЭАГ, ИБС у населения Карелии. У мужчин-носителей генотипа СС по этим полиморфным маркерам достоверно повышен риск возникновения ЭАГ (OR=1,49 и 2,26) и ИБС (OR=1,57 и 2,17). Для исследования механизмов, посредством которых указанные однонуклеотидные замены в гене CLOCK влияют на развитие сердечно-сосудистых патологий, в сыворотке крови определяли концентрацию кортизола. Оказалось, что концентрация кортизола у людей из контрольной группы была значительно выше у носителей ТТ генотипа, а у пациентов с ЭАГ, напротив, у носителей СС генотипа по полиморфному маркеру 3111ТС. Определяли уровень экспрессии гена CLOCK и ARNT1 у людей с разными генотипами по полиморфному маркеру 3111 Т/С 3’-НТО. У людей, гетерозиготных по маркеру 3111 Т/С, уровень экспрессии гена CLOCK практически не изменялся в период с 9 ч утра до 17 часов дня. У носителей генотипа ТТ содержание транскриптов этого гена постепенно повышалось с максимальным значением в 17 часов. У людей, гомозиготных по аллелю С, относительный уровень экспрессии 91 повышался до 13 ч и затем снижался до уровня, характерного для 9 ч утра. Динамика экспрессии гена ARNT1 у людей, имеющих аллели Т и С в гомозиготном состоянии, не отличалась между собой, тогда как у гетерозигот по маркеру 3111 Т/С наблюдали достоверное снижение концентрации транскриптов этого гена к 17 ч. Таким образом, динамика относительной экспрессии этих генов зависит от генотипа по полиморфному маркеру 3111 Т/С 3’-НТО. АНАЛИЗ БЕЛКОВОГО СОСТАВА КОНДЕНСАТОВ ВОЗДУХА И МОЧИ ЧЕЛОВЕКА, НАХОДЯЩЕГОСЯ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОЙ ИЗОЛЯЦИИ Е.Н.Николаев1), В.С.Курова, Э.Х.Анаев, А.С.Кононихин1), О.А.Валеева2), И.В.Доброхотов2), Л.Х.Пастушкова2), И.А.Попов1), К.Ю.Федорченко, С.Д.Варфоломеев1), А.Г.Чучалин, И.М.Ларина 2) Институт биохимической физики им. Н.М.Эммануэля РАН, Москва, 2)ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 1) Выполнена оценка динамики изменения в моче предполагаемых белков-маркеров неосмотического депонирования натрия у 6 здоровых добровольцев во время их жизнедеятельности в изолированном гермообъекте в течение 1-й стадии 500-суточного эксперимента (105 суток) в рамках программы «МАРС-500». Сбор и подготовка к анализу образцов осуществлялись согласно стандартному протоколу, после чего проводился хромато-массспектрометрический анализ образцов мочи на гибридном массспектрометре ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье LTQ FT MS фирмы Thermo. Были идентифицированы более 900 белков. Выявлены белки-маркеры активизации депонирования натрия в соединительной ткани, такие как синдекан IV – 21628,03Da, дерматопонтин – 24559,01Da, Basement membranespecific heparan sulfate proteoglycan core protein – 479247,56Da и ряд других. С помощью программы ANDCell были построены сети взаимодействий, а именно, проведена автоматическая реконструкция ассоциативных связей между белками, динамически отвечающими на изменение потребляемого испытателями натрия, и 92 основными компонентами соединительной ткани, участвующими в его депонировании. Для решения этой задачи использовался подход к реконструкции ассоциативных генных сетей на основе автоматического анализа текстов публикаций и извлечения информации из баз данных с помощью системы ANDCellANDVisio. Исходными данными для компьютерного анализа был набор белков, для которых наблюдалась динамика появления и исчезновения в ходе эксперимента. Для классификации белков по сходству динамики их появления и исчезновения был проведен иерархический кластерный анализ. Для выявленных кластеров были реконструированы ассоциативные интерактомные сети, характеризующие функциональные отношения генов. В результате для исследуемых белков были обнаружены как прямые связи (белок-белок), так и воссозданы связи через одного посредника (белок-компонент соединительной ткани-белок). РАЗРАБОТКА НОВЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ КРИТЕРИЕВ ОЦЕНКИ КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА С УЧЕТОМ ТИПОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА И НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ У БОЛЬНЫХ С ОСТРЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ, НАХОДЯЩИХСЯ НА ПОСТЕЛЬНОМ РЕЖИМЕ И.А.Ничипорук1), М.П.Рыкова1), Е.Н.Антропова1), Г.Ю.Васильева1), Т.А.Берендеева1), Ю.Л.Пескин2) Учреждение Российской академии наук Государственный научный центр РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 2) Дорожная клиническая больница им. Н.А.Семашко на станции «Люблино» ОАО «РЖД», Москва 1) В исследованиях приняли участие больные обоего пола с острыми заболеваниями сердечно-сосудистой системы (ССС) – нестабильной стенокардией, нарушениями ритма, гипертоническими кризами, инфарктами миокарда, поступившие в отделение кардиореанимации в период обострения и находившиеся на строгом постельном режиме от 48 до 168 часов. Оценка выраженности 93 изменений со стороны ССС выявила, что у пациентов с острыми нарушениями коронарного кровотока и инфарктом миокарда отмечались более высокая частота сердечных сокращений, сниженное периферическое сопротивление сосудов и преобладание активности парасимпатического отдела вегетативной нервной системы по сравнению с лицами, имеющими проявления нестабильной стенокардии, нарушения ритма или гипертонический криз. Кроме того, при инфаркте миокарда регистрировались самые низкие значения минутного объема кровообращения при высоком среднединамическом давлении крови. При этом определение взаимосвязи показателей психофизиологического статуса с тяжестью заболеваний ССС показало следующие особенности: более выраженная патология была отмечена у неконформных интровертированных обследуемых с высокими уровнями личностной тревожности, склонных к независимому поведению, переменчивости настроения, с недостаточной эмоциональной устойчивостью. Ожидаемо у таких обследуемых отмечалось большее беспокойство, неуверенность в себе, фрустрированность, страх и депрессия, однако при этом они характеризовались высоким уровнем самоконтроля на фоне апатии, вялости и нерешительности в намерениях и поступках. Результаты оценки в отчетный период иммунологического статуса с учетом выраженности симптомов и тяжести заболевания ССС показали достоверное снижение значений иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8) у больных с инфарктом миокарда за счет снижения процентного и абсолютного содержания хелперных и цитотоксических Т-клеток. Выявлены наиболее выраженные кросс-корреляции для тиреоидных гормонов с тревожностью, конформностью и доминантностью, свидетельствующие, что более высокий уровень обмена веществ был характерен для лиц с меньшей тревожностью, более устойчивых к стрессорным воздействиям, более смелых и решительных в суждениях и поступках, более консервативных и зависимых от мнения окружающих. Важно отметить, что при оценке среднегрупповых значений иммунологических показателей было выявлено уменьшение в группе с инфарктом миокарда содержания CD3+CD25+ Т-лимфоцитов, свидетельствующее о снижении активности Т-клеточного звена иммунной системы, а также увеличение содержания в крови CD4+CD25+Bright-Т-клеток 94 – т.е. высокий риск развития и хронизации инфекционных процессов. Исходя из полученных данных следует указать на необходимость профилактики неблагоприятных изменений иммунного статуса не только у экстравертированных пациентов (было выявлено на предшествующих этапах работы), но и у интровертов с тяжелыми формами и проявлениями заболеваний сердечно-сосудистой системы. ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТИЯ МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНОГО БЕЛКА YB-1 (р50) В ПРОГРЕССИИ ОПУХОЛЕЙ И РАЗРАБОТКА ТЕСТА ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ Л.П.Овчинников1), Т.П.Стромская2), Н.И.Моисеева2), Е.Ю.Рыбалкина2), А.В.Вайман2), Д.Н.Лябин1), С.Г.Гурьянов1), И.А.Елисеева1), Г.П.Генс3), А.А.Ставровская2) Институт белка РАН, Пущино; 2)НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 3) Кафедра онкологии и лучевой терапии МГМСУ, Центральная клиническая больница им. Н.А.Семашко № 2 ОАО «РЖД», Москва 1) Наши предыдущие исследования, выполненные в рамках программы ФНМ, показали, что анализ содержания мРНК многофункционального белка YB-1 в клетках рака молочной железы (РМЖ) и его внутриклеточного распределения может служить тестом на множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) этих клеток. В отчетном году эта работа продолжалась. В общей сложности содержание мРНК YB-1 было проанализировано в 98 образцах опухолей РМЖ, и 72 образца были протестированы на внутриклеточное распределение YB-1. Результаты этого анализа, сопоставленные с особенностями применяемого лечения, позволили предположить, что предоперационная (нео-адьювантная) терапия может приводить к перемещению белка YB-1 в ядра опухолевых клеток, где он может функционировать в качестве фактора транскрипции. В опытах с культурами опухолевых клеток разного гистогенеза показано, что химиотерапевтические препараты индуцируют перемещение YB-1 в ядра клеток и что при этом повышается экспрессия генов нескольких АВС транспортеров и возникает множественная лекарственная устойчивость. 95 На культурах опухолевых клеток также показано, что добавление сыворотки после сывороточного голодания приводит к тому же результату – транслокации белка YB-1 из цитоплазмы в ядра клеток. Это перемещение зависит от активности киназы Akt. Сывороточное голодание приводит к снижению количества мРНК YB-1. В части культур это сопровождается снижением количества мРНК АВС транcпортера ABCC1. Таким образом, ядерная локализация YB-1 отражает реакцию опухолевых клеток на разные внешние воздействия. Очевидно, что перемещение YB-1 в ядра клеток может обеспечивать временную адаптацию опухоли к неблагоприятным воздействиям. При длительном воздействии антиракового препарата нового поколения, протеосомного ингибитора бортезомиба, на культуры клеток хронического миелолейкоза человека К562/i-S9, гиперэкспрессирующих транспортер АВСВ1, селективное преимущество получают клетки с конститутивно активированным сигнальным каскадом PI3K/Akt. При этом отбираются клетки с гиперэкспрессией генов АВСВ1 и СD34, т.е. клетки с признаками стволовых клеток опухоли, обеспечивающие дальнейшее развитие новообразования. Показано, что добавление экзогенного белка YB-1 к культивируемым опухолевым клеткам приводит к стимуляции пролиферации этих клеток и к усилению их подвижности, но не влияет на степень чувствительности клеток к химиотерапевтическим препаратам. В работе зарубежных исследователей было показано, что белок YB-1 может секретироваться иммунными клетками крови. Наши данные могут свидетельствовать об участии YB-1 в воспалительных процессах в опухолях. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ КОМПОНЕНТНОГО СПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА КАРТИНЫ АУТОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ГЛАЗНОГО ДНА М.А.Островский1), Т.Б.Фельдман1), М.А.Яковлева1), П.М.Арбуханова2), К.О. Муранов1), С.А.Борзенок2), Х.П.Тахчиди2) Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, 2) ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н.Федорова Росмедтехнологии, Москва 1) 96 Аутофлуоресценция глазного дна – новый неинвазивный метод диагностики старческих изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки. Источником аутофлуоресценции являются флуорофоры липофусциновых гранул (ЛГ), локализованных в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Флуорофорами ЛГ являются продукты превращения свободного полностью-трансретиналя, т.н. бис-ретиноиды. Насущной задачей является анализ состава и спектральных характеристик бис-ретиноидов ЛГ в норме в зависимости от возраста человека и при патологии. Нами выполнено обширное исследование, касающееся состава и спектральных характеристик флуорофоров ЛГ в норме. Исследование выполнено на уникальном материале – РПЭ, выделенном из кадаверных глаз человека разных возрастов без видимых глазных патологий. Кадаверные глаза с соответствующим протоколом предоставлялись Глазным банком МНТК «Микрохирургия глаза». Основные результаты исследования сводятся к следующему: 1. Опыты in vitro. В хлороформном экстракте из ЛГ, согласно данным хроматографического и спектрального исследований, содержится более десятка флуорофоров, спектральный диапазон флуоресценции которых лежит от ультрафиолетовой до красной (540-630 нм) области спектра. Методом масс-спектрометрии, совмещенной с хроматографией, получены предварительные данные о химической структуре отдельных флуорофоров ЛГ. Показано, что основной по содержанию в ЛГ бис-ретиноид А2Е в хлороформном экстракте не является доминирующим флуорофором. Важно, что в ЛГ с повышением возраста накапливаются как неокисленные (менее полярные), так и окисленные (более полярные) флуорофоры, максимумы спектров флуоресценции которых смещены в более коротковолновую область спектра по сравнению с неокисленными формами флуорофоров. 2. Опыты in situ. Разработана оригинальная методика выделения ткани РПЭ из глазного бокала кадаверных глаз (подана заявка на изобретение № 036051/2011124360 от 17.06.2011 «Способ выделения и фиксации клеток ретинального пигментного эпителия трупных глаз человека»). Непосредственно в клетках РПЭ, выделенных с помощью этой методики из кадаверных глаз разных возрастов (от 20 до 80 лет) и без видимых глазных патологий, 97 проведён дифференцированный флуоресцентный анализ ЛГ (конфокальный лазерный сканирующий микроскоп «Leica TCS SP5»). Установлено, что при длине волны возбуждения флуоресценции 488 нм, используемой в офтальмоскопе HRA-2 (Heidelberg, Германия), соотношение интенсивностей флуоресценции в более коротковолной области видимого спектра (окисленные формы флуорофоров) по сравнению с более длинноволной (неокисленные формы) оставалось практически неизменным. Если в ходе дальнейших исследований окажется, что в патологическом кадаверном глазу это соотношение меняется, то оно может стать важным диагностическим параметром компонентного спектрального анализа картины аутофлуоресценции глазного дна человека. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ БОЛЬНЫХ ЛИМФОМОЙ ХОДЖКИНА. ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ И.И.Пелевина1), А.В.Алещенко2), М.М.Антощина3), Н.Ю.Воробьева1), О.В.Кудряшова1), О.Е.Лашкова3), E.Ю.Лизунова1), А.Н.Осипов1), Н.И.Рябченко3), А.М.Серебряный2), В.В.Павлов3) 1) Учреждение Российской академии наук Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, Москва 2) Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва 3) ФГБУ Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, Обнинск Лимфома Ходжкина (ЛХ) – лимфопролиферативное заболевание. Большинство больных ЛХ после курсов химио- и лучевой терапии излечиваются, однако ~ 10 % опухолей оказывается весьма резистентными, что приводит к гибели больных (Павлов и др., 2006). В задачи проекта 2011 г. входило исследование уровня одно- и двунитевых разрывов ДНК, количества ДНК-белковых сшивок (ДБС), частоты клеток с микроядрами (МЯ), концентрации 98 активных форм кислорода (АФК) в лимфоцитах периферической крови тех больных, для которых есть индивидуальные данные как до, так и во время лечения (21 человек). Одновременно было продолжено исследование всей когорты больных до и после лечения. По сравнению с лимфоцитами крови контрольных доноров у больных до лечения не изменяется частота клеток с МЯ, повышается уровень ОР и ДР ДНК, существенно возрастает (в среднем) концентрация АФК. Следует отметить высокую степень гетерогенности – повышение содержания АФК обусловлено высокими показателями у части популяции (8 человек из 21). У остальных индивидуумов значения АФК не отличаются от таковых в лимфоцитах контрольных доноров. По сравнению с лимфоцитами контрольных доноров количество ДБС в лимфоцитах больных не изменяется. При проведении лечения и сравнении результатов с данными до лечения было обнаружено резкое падение концентрации АФК (в основном за счет высоких значений), существенное возрастание частоты клеток с МЯ, но не изменяется уровень ОР ДНК и несколько снижается уровень ДР ДНК (за счет увеличения количества ДНК-белковых сшивок), возрастает количество ДБС и повышется радиочувствительность лимфоцитов. Исследование коррелятивных связей обнаружило наличие зависимостей между исходным уровнем клеток с МЯ и радиочувствительностью лимфоцитов (r = 0,55; p = 0,022) (сохраняющуюся при лечении) и между радиочувствительностью лимфоцитов и концентрацией АФК (r = 0,56; p = 0,013). Обе эти связи отсутствуют у здоровых доноров. Данные настоящего этапа проекта в основном подтверждают результаты прежних лет и, в общем, дают основание полагать, что: 1. Высокий уровень цитогенетических повреждений в лимфоцитах крови больных ЛХ может свидетельствовать об их чувствительности к последующей лучевой и химиотерапии; 2. Высокая концентрация АФК у части больных до лечения также является показателем чувствительности к последующей терапии. Таким образом, из большого комплекса исследованных показателей можно сделать вывод о наличии некоторых свойств, 99 коррелятивных связей, не определяющихся в лимфоцитах здоровых доноров и представляющих большое значение для прогноза эффективности лечения. СИСТЕМА ПОДДЕРЖКИ РЕШЕНИЙ ВРАЧА-АЛЛЕРГОЛОГА. ФАЗА-4. ВЕБ-ПРОТОТИП В.С.Переверзев-Орлов1), Е.А.Ващенко1), М.А.Витушко1), И.И.Стенина1), В.П.Афиногенова2), С.Ю.Конаныхина2) Институт проблем передачи информации им. А.А.Харкевича РАН 2) НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН 1) На данном этапе проекта «Система поддержки решений врачааллерголога. Фаза-4. Веб-прототип» нами развивалась возникшая несколько ранее идея, кардинально влияющая на возможности, трудозатраты и сроки создания Партнерских систем для медицины (ПС), основанная на использовании «смысловых модулей», из которых требуемая для конкретного применения Партнерская система может собираться потенциальным пользователем за считанные дни или даже часы вместо многих месяцев, как это было раньше. Смысловой модуль соответствует в какой-то мере минимальному структурному элементу медицинского знания или, расширяя его понимание, иной проблемной области. В качестве иллюстрирующего примера смыслового модуля можно привести модуль «Лабораторный анализ крови». Такой модуль содержит входной интерфейс для диалогового или автоматического получения описания как статических, так и динамических значений параметров исследуемой ситуации, генератор текстового описания ситуации по этим измерениям и базу знаний для формирования разного рода содержательных гипотез. Выходы смыслового модуля могут использоваться в качестве входов для модулей более высокого уровня. По сути, смысловой модуль рассматривается нами как микро-ПС, позволяя активно использовать наработанные ранее для создания ПС технологии. На примере аллергологических заболеваний исследовались варианты смысловых модулей. Реализована программная система для поддержки разработки и применения микро-ПС для настольных и карманных компьютеров. Начата работа по созданию интерфейса, помогающего пользователю осуществлять сборку желаемой системы из модулей. Начата работа по созданию программного 100 инструментария, помогающего выделять и оформлять смысловые модули из ранее разработанных нами медицинских партнерских систем. Совместно с Лабораторией прикладной логики Венгерской академии наук (ALL – Applied Logic Laboratory, prof. Tamas Gergrly) реализована возможность переноса в Интернет системы применения микро-ПС. При дальнейшем развитии этого проекта в первую очередь предполагается - завершение уже начатых разработок инструментальных средств, позволяющих реализовать технологию смысловых модулей, - наработка смысловых модулей за пределами тех областей медицины, где нам уже кое-что удалось сделать (главным образом кардиология, нефрология, пульмонология, аллергология), - выход с технологией смысловых модулей в Интернет - поддержка многоязычности создаваемых систем - организация смыслового доступа к обширной медицинской справочной информации, принятой медицинским сообществом в мире. МЕТОДОЛОГИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ ЦЕНТРАЛЬНЫХ ДИСФУНКЦИЙ МОТОРНОЙ (НЕРВНОЙ) СИСТЕМЫ С.П.Романов1), З.А.Алексанян2), А.Ф.Гурчин3) Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург; 2) Институт мозга человека им. Н.П.Бехтеревой РАН, СанктПетербург; 3)Клиника ИМЧ РАН, Санкт-Петербург 1) Для расширения критериев экспресс-диагностики синдрома паркинсонизма и болезни Паркинсона продолжали анализ интегративной активности ЦНС по параметрам произвольно управляемого изометрического усилия на пациентах клиники ИМЧ им. Н.П.Бехтеревой РАН и на здоровых добровольцах. Поддержание изометрического усилия сопровождается произвольным пропорционально удерживаемой силе повышением в нейронных структурах мозга активности, отражение свойств которой в параметрах моторного выхода позволяет выявить особенности нисходящих команд к мотонейронам сегментарного уровня. Так как нисходящая активность зависит от 101 функционального состояния ЦНС, то амплитудно-частотные параметры изометрического усилия характеризуют эту нисходящую к мотонейронам по пирамидному пути и экстрапирамидным трактам активность. Корреляты этой активности позволяют выявить различия в функциональном состоянии центральной (моторной) нервной системы здоровых индивидов, а также служат диагностическими критериями патологических состояний ЦНС. Разработанная методология фундаментальных исследований в области физиологии движений позволяет, кроме дифференциальной диагностики двигательных патологий центрального происхождения, неинвазивным методом изучать на человеке механизмы организации взаимодействия структур моторной системы, обеспечивающие построение движений. В рамках выполнения проекта разработаны необходимые протоколы тестирования и математическая база методов анализа и выделения амплитудно-частотных параметров интегративной активности моторной системы, включающая стандартный статистический анализ произвольного усилия и непроизвольной компоненты изометрического усилия, спектральный анализ Фурье, авто- и кросскорреляционный анализ, а также специально разработанные для наших результатов тестирования процедуры разложения на главные компоненты последовательных временных рядов, т.е. регистрируемого 30 с изометрического усилия. Амплитудно-частотные параметры 10-7 последовательных главных компонент с вкладом более 5 % в исходный временной ряд дают дополнительные дифференциальные критерии диагностики. Паттерны значений максимумов главных компонент относительно частоты разложения, полученные при разных величинах изометрического усилия, являются дополнительными критериями дифференциальной диагностики поражений ЦНС. Соответственно организации моторной системы огибающую первой главной компоненты, дающую наибольший вклад (%) в исходный временной ряд и имеющую максимум на наибольшей частоте, относим к активности сегментарного уровня. Вторая главная компонента характеризует активность пирамидного тракта, остальные относим к поведению подкорковых структур, участвующих в формировании экстрапирамидных трактов. 102 Паттерны главных компонент уже являются модельным представлением функциональной организации центральной активности моторной системы и могут быть параметрами для верификации поведения предлагаемых моделей взаимодействия структур базальных ганглиев при БП. Для понимания механизмов структурно-функциональной организации моторной системы в норме, а также механизмов развития патологических состояний и восстановления двигательной функции под действием различных видов терапии необходимо продолжение исследований для накопления и систематизации анализируемых параметров моторного выхода не только на пациентах с центральными нарушениями различной этиологии в системе управления движениями, но и на здоровых испытуемых. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ДЕВИАНТНЫМ ФОРМАМ АГРЕССИВНОГО ПОВЕДЕНИЯ А.П.Рысков1), М.Л.Бутовская2), В.А.Васильев1), Е.М.Суходольская1), Д.В.Шибалев1), В.Н.Буркова2), А.М.Куликов3), О.Е.Лазебный3) Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН, Москва; 2)Учреждение Российской академии наук Институт этнологии и антропологии РАН, Москва;3)Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития РАН, Москва 1) Изучение психогенетических основ агрессивного поведения является одним из важнейших современных направлений мировой науки. Показано, что наследственный компонент по агрессивному поведению у человека составляет от 44 до 72 %. Однако из-за разнообразных стрессовых воздействий в современных цивилизациях трудно вычленить взаимосвязь генетических и поведенческих факторов агрессии. Нами предположено, что агрессивное поведение человека формировалось в процессе эволюции и контролировалось отбором в доиндустриальных обществах. В данной работе впервые проведен комплексный анализ генотипов и фенотипов в двух африканских контрастных культурах – эгалитарной (хадза) и военизированной (датога), существующих вне контактов с западной цивилизацией и характеризующихся разным уровнем культурно допус103 тимой агрессии. Выявлены коррелятивные связи между аллельными вариантами генов андрогенового рецептора (AR), гена рецептора дофамина DRD4 (локус DRD4E3), генов дофаминового и серотонинового транспортеров (локусы DAT1 и Stin2), гена моноаминоксидазы А (локус MAOA VNTR) и антропологическими и поведенческими показателями, а также социальным статусом у мужчин хадза и датога Северной Танзании. Эти результаты оригинальны, а их интерпретация в русле нашей концепции не имеет аналогов в литературе. Инновационный характер результатов состоит в разработке неинвазивной методики ранней молекулярной диагностики и оценки риска развития девиантного агрессивного поведения, что может быть использовано для психокоррекции агрессивного поведения у детей и взрослых, тестирования профпригодности, подбора кадров для спецподразделений и работ в экстремальных условиях. РАЗВИТИЕ КОМПЛЕКСА ДЭКАРТО ДЛЯ СРАВНИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ КАРДИОЦИКЛОВ Л.И.Титомир, В.Г.Трунов, Э.А.И.Айду, Е.В.Сидорова Учреждение Российской академии наук Институт проблем передачи информации им. А.А.Харкевича РАН, Москва Разрабатываемый компьютерный алгоритмический комплекс дипольной электрокардиотопографии (ДЭКАРТО) основан на принципиально новом подходе к представлению и анализу электрокардиографической информации, а именно на картировании электрофизиологических процессов и характеристик сердца с привязкой к анатомическим ориентирам [1]. В рамках работы над проектом разработаны новые эффективные критерии для диагностики и локализации ряда патологических состояний сердца (например, [2]). Составлена электронная версия атласа клинической дэкартографии (ДЭКАРТО-Атлас), являющаяся справочником и учебным пособием по дипольной электрокардиотопографии. Разрабатываемый компьютерный комплекс дополнен программмными модулями для сравнительного диагностического анализа последовательностей кардиоциклов, который необходим для выявления патологических изменений при анализе длительных записей и при поиске прецедента в архиве, в частности в ДЭКАРТО-Атласе. 104 Разработаны алгоритмы сопоставления ЭКГ как векторфункций, зависящих от времени, а также алгоритмы сопоставления ВКГ как пространственных кривых, инвариантных относительно вариаций скорости электрических процессов в миокарде, что, в частности, оказывается полезным при оценке влияния экстракардиальных факторов на форму ЭКГ (дыхательные движения, изменения позы, гемодинамические изменения и др.). Сравнивать между собой имеет смысл не только кардиоциклы в целом, но также их фрагменты, соответствующие различным физиологически значимым фазам. Апробация разработанных программных модулей проводилась на материале двух клинически верифицированных выборок. В первой – ВКГ кардиоциклы для 74 случаев нормы, 60 и 179 случаев гипертрофии левого и правого желудочков. При поиске прецедентов архивная ВКГ с верным диагнозом всегда входила в первую тройку ближайших. Другая выборка содержит 10-секундные записи ВКГ для 20 случаев нормы и 20 случаев гипертрофии левого желудочка. Для каждого из этих случаев первый кардиоцикл выбирался в качестве эталона, а QRS петли остальных кардиоциклов аппроксимировались линейными преобразованиями эталона с точностью лежащей в пределах измерительных шумов. При таком же сравнении кардиоциклов разных случаев ошибка аппроксимации была значительной. Существенные изменения процесса деполяризации желудочков сердца могут быть обнаружены по степени нелинейности аппроксимирующего преобразования петли QRS. Характеристики преобразования могут быть использованы как показатели изменения состояния сердца [3]. Разработанные программные модули и дальнейшее их исследование на реальных ЭКГ будут способствовать упрощению и ускорению процесса принятия сложных диагностических решений. 1. Л.И.Титомир, П.Кнеппо, В.Г.Трунов, Э.А.И.Айду Биофизические основы электрокардиотопографических методов. – М.: Физматлит, 2009.–224 с. 2. Leonid I.Titomir, Vladimir G.Trunov, Eduard A.-I.Aidu, Tamara A. Sakhnova, Elena V.Blinova, et al. Electrocardiographic diagnosis of left ventricular hypertrophy on the basis of dipole electrocardiotopography method. – J. Electrocardiology, v. 41, 2008, 697.e1-697.e6. 3. Айду Э. Аппроксимация пространственных кривых и анализ векторкардиограмм. LAP LAMBERT Academic Publishing, 2010, 116 c. 105 ИССЛЕДОВАНИЕ НОСИТЕЛЬСТВА ГЕНОТИПА СС ПО ПОЛИМОРФИЗМУ C/T-13910 В РЕГУЛЯТОРНОМ УЧАСТКЕ ГЕНА ЛАКТАЗЫ LCT КАК ФАКТОРА РИСКА РАЗВИТИЯ ОСТЕОПОРОЗА В РОССИЙСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ Н.К.Янковский 1), С.А.Боринская1), Д.В.Ребриков 1), А.В.Сафонова2), С.Д.Арутюнов2), А.Н.Петрин2) 1) 2) Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития России, Москва Одним из важнейших средовых факторов риска развития остеопороза, вляющим также и на состояние зубов, является недостаточное потребление кальция. Основным источником кальция в европейских популяциях является молоко и молочные продукты. Однако для части взрослого населения возможность потребления цельного молока ограничена в связи с первичной гиполактазией – генетически детерминированным возрастным снижением активности гена LCT, кодирующего кишечный фермент лактазу. Как было показано ранее, первичная гиполактазия в российских популяциях обусловлена носительством генотипа СС по полиморфизму в регуляторном участке гена лактазы LCT*C/T-13910, а способность к синтезу лактазы у взрослых и потреблению цельного молока детерминирована носительством аллеля Т по данному полиморфизму При обследовании 300 здоровых мужчин (270 русских, 30 – украинцы, белорусы и другие национальности) показана ассоциация минеральной плотности костной ткани (МПКТ) и состояния зубов, оцениваемого по индексу КПУ (кариес-пломба-удалены), с генотипами индивидов по полиморфизму C/T-13910 в регуляторном участке гена лактазы LCT. При этом у индивидов старшего возраста с генотипом C/C по данному полиморфизму количество утраченных зубов выше, чем у мужчин того же возраста – носителей аллеля Т. Показано, что МПКТ и сохранность зубов у носителей аллеля 106 Т имеют более благоприятную возрастную динамику при регулярном употреблении молока, тогда как у носителей генотипа C/C потребление молока не влияет на данные показатели. Частота встречаемости генотипа C/C в выборке 270 русских мужчин составила 45.9 %. Помимо проведенного анализа ассоциации полиморфизма гена лактазы LCT*C/T13910 с важными для здоровья признаками, проведено исследование генетических факторов, влияющих на воспалительные и деструктивные процессы в полости рта, которые могут сказываться на скорости утраты зубов. Для этого был проведен анализ 16 полиморфизмов в генах цитокинов. Показана ассоциация степени выраженности воспалительных процессов в полости рта с полиморфизмом – 174G/C в регуляторном участке гена интерлейкина 6 IL6. 3. Биофотоника ЛАЗЕРНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА РАЗВИТИЕ СТВОЛОВЫХ И ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК В.Н.Баграташвили, Н.Н.Воробьева, О.А.Воробьева, А.П.Свиридов, Ф.Х.Тамбиев, О.Ф.Филенко, Р.К.Чайлахян, В.И.Юсупов Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, г. Троицк, МО Исследование воздействия лазероиндуцированной гидродинамики на соединительные ткани. Проведены исследования, направленные на оценку вклада лазероиндуцированных гидродинамических процессов в механизм действия лазерного излучения умеренной мощности. Показано, что при лазерном воздействии водонасыщенная биоткань активно насыщается микропузырьками, которые заполняют все трещины и пустоты в области вблизи торца оптического волокна. Изучение степени влияния изменения оптических характеристик водных растворов под действием лазерного излучения на распределение 107 излучения показало, что оно может быть существенным и приводить, например, к возникновению вблизи торца оптического волокна упорядоченных структур из микропузырьков. Исследование процессов воздействия лазерного излучения низкой и умеренной интенсивности на нормальные и угнетенные мизенхимальные стволовые клетки. Показано, что поле лазероиндуцированной гидродинамики (ЛИГ) может оказывать значительное позитивное воздействие на развитие мезенхимальных стволовых клеток, причем эффект особенно выражен при воздействии на «ослабленные» клетки. Сравнение с воздействием на те же стволовые клетки низкоинтенсивным излучением гелий-неонового лазера, широко используемым в медицинской практике, показало, что НИЛИ в данном случае достоверно не способствовало увеличению пролиферации как «нормальных», так и «ослабленных» стволовых клеток. Исследование действия низкоинтенсивных излучений в УФ, видимом и ближнем ИК диапазонах на эмбриональное развитие Данио-рерио, дафний и сперматозоидов серого морского ежа. Показано, что кратковременное облучение эмбрионов Данио Рерио излучениями гелий-неонового лазера (633 нм), излучением, прошедшим через экран с люминофором (626 нм) и светодиодным излучением 650 нм приводит к задержке в начальной стадии вылупления личинок. Сочетанное воздействия ультрафиолетового излучения и излучения гелий-неонового лазера на эмбрионы Daphnia magna показали, что результат зависит от последовательности воздействий. При последовательности НИЛИ – УФ наблюдается положительное воздействие, при последовательности УФ – НИЛИ различие с контролем не регистрируется. Показано, что кратковременное облучение НИЛИ He-Ne лазера (633 нм, 0,16 мВт/см2) обладает протекторным действием на эмбрионы Daphnia magna. Эксперименты, проведенные в условиях, приближенных к натуральным, со сперматозоидами серого морского ежа Strongylocentrotus intermedius, показали, что низкоинтенсивные излучения гелий-неонового лазера (633 нм) с интенсивностью 1200 мкВт/см2 и светодиодной матрицы (650 нм) с интенсивностью~80, 250 и 750 мкВт/см мкВт/см2 негативно воздействует на сперматозоиды, вызывая их гибель. При этом показано, что негативное воздействие 108 на сперматозоиды излучения светодиодной матрицы (650 нм) имеет выраженный дозозависимый характер. ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КАК МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗМЕНЕНИЙ КОНФОРМАЦИЙ МОЛЕКУЛЫ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ПСИХИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВАХ А.А.Комар1), Т.И.Сырейщикова1), В.П.Свербиль1), Г.Е.Добрецов2), Н.В.Смолина2), М.Г.Узбеков3), Э.Ю.Миссионжник3), Н.М.Максимова3) Физический институт им. П.Н.Лебедева РАН ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА РФ 3) ФГУ МНИИ психиатрии Росздрава 1) 2) В 2011 г. коллективом авторов были продолжены исследования на установке с импульсным пикосекундным лазером в направлении использования поляризованных световых пучков, которое в сочетании с методикой флуоресцентных зондов могло бы способствовать разработке более эффективных способов оценки состояний больных с психическими расстройствами и индивидуального подбора оптимальных лекарственных доз. На 1-м этапе были проведены исследования воздействия различных параметров среды, в которой происходит флуоресценция зондов, присоединенных к молекуле альбумина, на величину конформации последней. Измерения производились на обезжиренном препарате альбумина (ЧСА). Подвергались изменению температура и рН раствора, регистрировались кинетика затухания и деполяризация флуоресценции зонда К-35. Целью было установление физических параметров среды, к которым конформация молекулы альбумина наиболее чувствительна. В диапазоне изменения температур от 17 до 45 0С при физиологических условиях не обнаружено каких-либо структурных переходов в конформациях молекулы альбумина. Однако анализ изменения с температурой амплитуд затухания флуоресценции зонда с помощью уравнения Вант-Гоффа позволил получить новые данные о характере сил связывания зонда в каждом центре альбумина. При изменении рН были изучены два основных перехода между кон109 формациями молекулы альбумина: N-F (рН 3-4,5), и N-B (рН 6,58,5). Для обоих переходов наблюдались значительные изменения всех параметров флуоресценции зонда: суммарного счета, амплитуд, времен затухания флуоресценции и времен вращательной корреляции. Эти исследования позволяют надеяться, что при исследовании психических заболеваний в клинических условиях такие внешние воздействия могли бы способствовать увеличению чувствительности метода к нарушениям конформации молекулы альбумина при психических заболеваниях. На 2-м этапе метод работы с поляризованных пучками от лазера был перенесен на анализ альбуминовых проб, полученных от больных с психическими расстройствами, в данном случае шизофреников. Эти больные при лечении получали новое лекарство рисперидон. Известно, что рисперидон переносится по организму альбумином, однако молекулярная картина его взаимодействия с альбумином до сих пор не изучалась. Проведенные исследования сывороток 7 больных до и после нескольких недель лечения показали, что рисперидон активно связывается с молекулой альбумина в том же «лекарственном» центре, что и используемый флуоресцентный зонд К-35 и тем самым конкурирует с зондом за связывание. Лечение рисперидоном привело к стабильному уменьшению выхода флуоресценции зонда К-35 в сыворотках всех исследованных больных (во всех временных центрах связывания зонда с альбумином), в отличие от увеличения флуоресценции в процессе лечения больных депрессией. Одним из возможных объяснений полученных результатов может быть предположение о том, что флуоресцентная методика регистрирует накопление лекарства в крови пациента. Если это так, то для оценки состояния больного с шизофренией по степени изменения конформации молекулы альбумина (по сравнению с началом лечения) потребуется изменить принятую процедуру взятия проб крови у больных (в ходе лечения) и сделать перерыв в лечении на несколько дней для обеспечения полного выведения рисперидона из организма. Можно сделать и другое заключение, если данные по лечению больных рисперидоном подтвердятся на большей статистике. Использование флуоресцентной методики могло бы привести к чрезвычайно важному для клиники результату – к оценке реальной 110 концентрации рисперидона у данного пациента на данной стадии лечения, то есть определить оптимальные лечебные дозы. РАЗРАБОТКА ГОЛОГРАФИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ КОМПОНЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ И МЕТОДОВ ОПТИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ СВОЙСТВ СЕНСОРОВ А.В.Крайский1), В.А.Постников2),Т.Т.Султанов1), Т.В.Миронова1), А.А.Крайский1), М.А.Шевченко1) Учреждение Российской академии наук Физический институт им. П.Н.Лебедева РАН, Москва 2) ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России, Москва 1) Голографические сенсоры (ГС) на основе серебряных эмульсий предназначены для анализа компонентов растворов [1]. ГС представляют собой матрицу на основе полимерного гидрогеля, в которую внедрены наноразмерные твердотельные зерна, среднее расстояние между которыми много меньше длины волны видимого света так, что образуется периодическая слоистая структура. Такая структура при освещении белым светом отражает узкополосное излучение. На основании изменения длины волны отраженного света в результате набухания матрицы при взаимодействии специальных веществ, встроенных в нее, и тестируемого компонента раствора (ТК) можно судить о концентрации ТК. В качестве поддерживающей среды для фоточувствительных эмульсий синтезировали гидрогелевые матрицы на основе сополимеров акриламида с N-акрилоил-м-аминофенилборной кислотой и N-акрилоил-глюкозамином, сшитые N,N’-метилен-бисакриламидом различного состава, иммобилизованные на поверхность предметных стекол. Модельные растворы (1-20 мМ/л) глюкозы готовили в 0,01 М растворе глицина. Для анализа содержания глюкозы в плазме крови больных диабетом использовали образцы сенсоров размером ~2,5 см2, помещенные в специальную ячейку, позволяющую одновременно вводить 24 образца плазмы по 50 мкл. Изменение длины волны отраженного света при помещении сенсоров в растворы глюкозы контролировали поточечно малогабаритным оптоволоконным спектрометром FSD-8 или по цифровой фотографии на основе специально разработанного колориметрического метода [2]. 111 Область проявления отклика сенсоров зависит от длины волны лазера, используемого при записи голограмм (632,8 нм, 532 нм), и состава гидрогелевых матриц. Так, для He-Ne лазера (632,8 нм) при увеличении содержания глюкозы отклик лежит в видимой области спектра (450–700 нм). В модельных условиях отклик на изменения концентрации глюкозы достигает 40 нм/мМ. В образцах плазмы крови наблюдается линейная зависимость отклика от концентрации глюкозы с чувствительностью порядка 4 нм/мМ, что хорошо детектируется спектрометрически. Была проведена адаптация колориметрического метода для полупрофессиональных форматов цифровых изображений (RAW), что позволило существенно расширить спектральный диапазон его работы. На основании характера спектра пропускания голографиического слоя было установлено, что его спектр формируется, в основном, на основании рэлеевского рассеяния и удалось получить информацию о характерном размере рассеивающих центров, составившим порядка 15 нм. Работа поддержана грантом в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН “Фундаментальные науки – медицине”. 1. А.В.Крайский, В.А.Постников и др. Квантовая электроника, 40, № 2 (2010), с.178–182. 2. А.В.Крайский, Т.В.Миронова, Т.Т.Султанов. Квантовая электроника, 40, №7 (2010), с. 652–658. КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПОРФИРИНОВ И КИСЛОРОДА В СВЯЗИ С ПРОБЛЕМАМИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ И ЛАЗЕРНОЙ ТЕРАПИИ А.А.Красновский1), А.С.Козлов1), О.Б.Любитский2), А.Н.Осипов2) Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН; 2) ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава 1) Известно, что фотодинамическая терапия (ФДТ) определяется синглетным кислородом (СК) и свободными радикалами, которые генерируются главным образом триплетными молекулами красителей, возникающими при поглощении красителями световой энер112 гии. Наиболее эффективным методом скрининга фотосенсибилизирующей активности красителей является определение квантового выхода фотосенсибилизированного образования СК, поскольку этот процесс прямо указывает на фотохимическую активность триплетных состояний, которая определяется сочетанием трех факторов – временем жизни, квантовым выходом и эффективностью взаимодействия с кислородом. Молекулярный кислород проявляет фотохимическую активность также при прямом лазерном возбуждении. За отчетный период нами усовершенствован комплекс методов регистрации СК при фотосенсибилизированном и прямом возбуждении молекул кислорода в органических и водных средах в гомогенных и гетерогенных средах. В комплекс входит измерение фотосенсибилизированной красителями собственной инфракрасной (1270 нм) фосфоресценции СК с помощью собранного в лаборатории наносекундного лазерного импульсного спектрометра, а также несколько методов, основанных на применении ловушек СК, среди которых наиболее информативны 1,3-дифенилизобензофуран (ДФИБФ), мочевая кислота (МК) и темпидон. Об образовании СК судили по падению оптической плотности ДФИБФ или МК. В случае темпидона при реакции с СК образуется стабильный радикал ТЕМПО, который регистрировали ЭПР спектрометром. Освоенный комплекс позволяет анализировать системы любой сложности. Работа развивалась по двум направлениям: (1) оптимизация разработанных методов и детальный кинетический анализ реакций, лежащих в их основе; (2) применение разработанных методов к изучению систем, важных для задач фотомедицины. Наиболее важные результаты состоят в следующем. Показано, что, хотя метод, основанный на измерении собственной фосфоресценции кислорода, наиболее информативен, он на три порядка менее чувствителен, чем метод, основанный на применении ДФИБФ, поэтому для фосфоресцентного анализа требуется на три порядка более высокая энергия лазерного возбуждения. Разработана новая улучшенная методика применения ДФИБФ к анализу СК, не требующая учета константы скорости реакции. Установлено, что темпидон тушит СК в основном физически, а выход радикала ТЕМПО составляет ~10-3. Поэтому темпидон малочувствителен и его имеет смысл применять лишь в тех случаях, когда спектрофотометрические измерения невозможны. Оптимизи113 рованные методы применены к изучению образования СК при прямом лазерном возбуждении кислорода. Определены молярные коэффициенты поглощения кислорода в водных и органических средах в естественных условиях, которые позволяют количественно оценивать скорость образования СК в тканях при ИК лазерной терапии. Совместно с ГНЦ НИОПИК определена фотосенсибилизирующая активность водных суспензий синтетических фталоцианинов, ковалентно связанных с силикагелем, синтезированных с целью применения для фотообеззараживания воды и биологических жидкостей (плазмы, сыворотки крови). Совместно с Московской государственной академией тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова проведен скрининг фотодинамической активности конъюгатов хлорина с бис-дикарболлидом кобальта, пригодных для бор-нейтронозахватной (БНЗТ) терапии рака. Показано, что ряд конъюгатов можно использовать одновременно для ФДТ. Данные представлены на нескольких научных конференциях и в научной периодической печати. НОВЫЕ СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ ДНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЯМИ ОРГАНОВ КРОВООБРАЩЕНИЯ В.А.Кузьмин1), О.А.Рогинко2), А.И.Алехин2), А.А.Юдин2), Н.Н.Вейко3), Е.С.Лисицына1), Н.А.Дурандин1), Л.В.Литвинкова1), А.М.Виноградов1), В.А.Волнухин1), А.В.Шибаева1) 1) Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва 2) Центральная клиническая больница РАН, Москва 3) Медико-генетический научный центр, РАМН, Москва Высокая концентрация экстрацеллюлярной ДНК в крови пациентов с болезнями органов кровообращения (ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда) обусловлена нарушением клеточного апоптоза. В крови пациентов появляются крупные фрагменты ДНК, из которых впоследствии в результате межнуклеосомной деградации формируются более мелкие фрагменты ДНК. Высокая концентрация экстрацеллюлярной ДНК в 114 крови больных свидетельствует о тяжести заболевания и отражает степень повреждения органа при ишемическом повреждение ткани. В проекте разрабатываются новые флуоресцентные методы определения внеклеточной ДНК в сыворотке крови больных с заболеваниями органов кровообращения и устанавливаются корреляции с различными биохимическими параметрами для использования этих данных в клинической практике. Решение задачи отбора новых флуорофоров, специфичных к последовательностям, обогащенным АТ- или GC-парами, для детектирования внеклеточной ДНК проведено спектральнокинетическими методами – флуоресцентная и абсорбционная спектроскопия, импульсный фотолиз, метод однофотонного счета для определения времен жизни синглетно-возбужденных комплексов краситель–ДНК. Для анализа экстрацеллюлярной ДНК были использованы комплексы, содержащие молекулы двух или трех разных красителей, обеспечивающих индуктивно-резонансный перенос энергии. Перенос энергии между двумя красителями в комплексах с АТ- и GC-богатыми сайтами внутри одной молекулы ДНК позволяет выявить абсолютные концентрации различных теломерных повторов в нуклеиновых кислотах. Увеличение содержания GC-ДНК в составе вкДНК является хорошим маркером развития в организме скрытой патологии, сопровождающейся интенсификацией процесса гибели клеток. В составе вкДНК по сравнению с яДНК содержание ТОрДНК при патологии (ишемическая болезнь сердца у пожилых людей) выше в 10 раз. При исследовании сыворотки 40 больных острым инфарктом (ОИМ) было установлено, что концентрация вкДНК увеличена в несколько раз по сравнению со здоровыми донорами и больными хронической формой ИБС. Повышение количества вкДНК наблюдается только в сыворотке больных ОИМ, когда в короткий срок происходит гибель большого числа клеток организма. Концентрация маркера GC-ДНК (рибосомного повтора, ТОрДНК) в крови здоровых людей варьирует от 0,2 до 1,2 нг/мл сыворотки. У больных ИБС концентрация ТОрДНК в крови повышается. Особенно высокие количества ТОрДНК (7–10 нг/мл) детектируются в сыворотке больных ОИМ. Общее содержание антител существенно выше в сыворотке больных ИБС, чем в сыворотке здоровых доноров. В комплексе с 115 вкДНК больных ИБС находится ~ 60 % антител, вырабатываемых против суммарной ДНК, и ~ 70 % антител против фрагментов оксиДНК. Полученные данные позволили установить, что свойства вкДНК при сердечно-сосудистых заболеваниях значительно изменены и коррелируют с тяжестью патологии. Таким образом, вкДНК и системы ее элиминации – это новые потенциальные цели терапии при сердечно-сосудистой патологии. СОЗДАНИЕ БИОСЕНСОРА ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ГЛЮКОЗЫ НА ОСНОВЕ СТЕКЛОКОМПОЗИТОВ С СЕРЕБРЯНЫМИ НАНОЧАСТИЦАМИ А.В.Нащекин1), П.А.Образцов1), О.А.Подсвиров2), А.И.Сидоров3), О.В.Степаненко4), К.К.Туроверов4), О.А.Усов1) Физико-технический институт им. А.Ф.Иоффе РАН, С.-Петербург; 2) СПб Государственный политехнический университет, С.-Петербург; 3) СПбГУ информационных технологий, механики и оптики, С.-Петербург; 4) Институт цитологии РАН, С.-Петербург 1) В настоящее время можно назвать множество подходов к решению важной проблемы современной медицины – обнаружения и количественного анализа широкого ряда биологически активных веществ. Одним из устройств, позволяющих эффективно и с высокой чувствительностью решить эту задачу, являются оптические биосенсоры (БС) [1], работающие на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (ППР). В общем случае БС состоят из чувствительного элемента – биологически активного соединения, специфически взаимодействующего с аналитом (лиганд-связывающим белком, антителом, энзимом и т.д.), и трансдуктора – устройства, позволяющего фиксировать изменения сигнала в результате взаимодействия. Одним из перспективных трансдукторов являются стекла с металлическими наночастицами (НЧ), обладающие эффектом локализованного ППР. Успешная разработка и применение таких устройств позволит повышать 116 чувствительность БС, значительно усиливать сигналы флуоресценции, а также удешевлять технологию и миниатюризировать БС. В работе представлена технология создания подложек БС на основе фототерморефрактивных (ФТР) стекол с серебряными НЧ [2], исследование их оптических, структурных свойств и анализ взаимодействия НЧ с аналитом. Показано, что НЧ имеют размеры порядка 5 нм, располагаются слоями в приповерхностной области стекла, их концентрация в слое достигает 6∙1016 см-3. Характерные пики в спектрах оптического поглощения, связаные с ЛПР в НЧ, лежат в диапазоне 410-450 нм, положение и ширина линии чувствительны к размеру, форме, материалу и окружающей НЧ матрице. Положение пика, ширина и форма спектральной линии адекватно описываются с помощью обобщенной модели рассеяния света Ми [3]. В качестве чувствительного элемента разрабатываемого БС на глюкозу нами была получена мутантная форма D-галактоза/Dглюкоза связывающего белка (GGBP) с присоединенным флуоресцентным красителем баданом. Этот белок был успешно иммобилизован на поверхность ФТР стекол. При взаимодействии GGBP с глюкозой, добавленной в буферный раствор с pH 7.4, наблюдается значительное увеличение интенсивности флуоресценции красителя в области 420 нм и гашение флуоресценции на длине волны порядка 560 нм. Таким образом, показано, что вблизи слоев серебряных наночастиц на частоте ППР наблюдается значительное усиление регистрируемого сигнала, при этом тушение флуоресценции, по-видимому, связано с эффектом резонансного переноса энергии флуоресценции между флуоресцентным белком и наночастицами серебра. Работа поддержана грантом Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», а также частично в рамках Гос. контракта, шифр «2011-1.2-512-034-078». 1. J. Homola, Chem. Rev. 108, 462-493 (2008). 2. Vostokov et al. Technical Physics Letters, 35(17), 35-40 (2009). 3. Kreibig U. et al. Optical properties of metal clusters. SpringerVerlag, Berlin (1995). 117 ФУРОГИДРОХИНОЛИНЫ – НОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ФОТОТЕРАПИИ Т.Д.Некипелова1), В.А.Волнухин1), А.А.Веденеев1), О.Н.Лыго1), Л.И.Мазалецкая1), В.А.Тартаковский2), Е.Н.Ходот2), А.И.Алехин3), А.А.Юдин3) Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва; 2)Учреждение Российской академии наук Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН, Москва; 3)Учреждение Российской академии наук Центральная клиническая больница РАН, Москва 1) Аутоиммунные кожные заболевания (псориаз, витилиго и др.) достаточно широко распространены в мире. В настоящее время для их лечения широко используется метод PUVA терапии, основанный на способности производных фурокумаринов (псораленов) связываться с тиминовыми основаниями ДНК под действием ближнего УФ-облучения. В связи с тем, что при использовании псораленов возможны нежелательные побочные явления, в том числе канцерогенез, в мире проводятся поиски новых препаратов для PUVA терапии на основе модификации известных псораленов. В рамках настоящего проекта были разработаны методики синтеза различных фуродигидрохинолинов с использованием доступных исходных соединений и наработаны следующие соединения: 7,7,9триметил-6,7-дигидро[3,2-f]хинолин (1), N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофурo[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид (2), 7,7,9-триметил-4-нитро-6,7-дигидрофуро[3,2-f]хинолин (3) и 4,6,6-триметил-6,7-дигидробензо[h]фуро[3,2-f]хинолин (4) для их тестирования на возможность использования в качестве препаратов для фотодерматологии. На основании исследования конечных и промежуточных продуктов фотолиза фуродигидрохинолинов 1–4 показано, что введение фуранового кольца в структуру 1,2-дигидрохинолина уменьшает выход радикальных и ионных интермедиатов и продуктов их превращения при резком увеличении выхода триплетного состояния. Методом лазерного импульсного фотолиза (λвозб = 353 нм) была исследована реакция триплетного состояния синтезированных фуродигидрохинолинов с тимидинмонофосфатом (ТМР). Показано, что ТМР взаимодействует с триплетом фуродигидрохинолинов 1–4 с константой скорости 2 × 109 л/моль с, близкой к диффузионной. 118 Проведенное исследование на цитотоксичность на клетках линии рака толстой кишки НСТ116 показало, что фуродигидрохинолины 1–4 не проявляют темновой токсичности в концентрациях до 50 мкМ при инкубации в течение 72 час. При обработке клеток соединениями 1 и 2 в концентрации 10 мкМ с последующим облучением диодным лазером λirr = 365 нм, дозовая мощность 15 мW в течение 15 мин для обоих соединений наблюдали гибель клеток по механизму апоптоза. При этом эффект был сильнее для соединения 2. Гибель клеток наблюдали только при сочетанном действии фуродигидрохинолинов и облучения. Облучение отдельно не приводит к гибели клеток. Предварительные испытания на Контрольных животных (морские свинки) показали, что в отсутствие поражения кожи применение 8-метоксипсоралена (стандартный препарат для фотодерматологии) и УФА-облучения (λобл = 365 нм) приводит к сильной эритеме, в то время как в случае фуродигидрохинолинов 1 и 2 появление эритемы наблюдали при существенно более высоких дозах облучения даже при применении меньших концентраций препарата. Проведенное исследование фотофизических, фотохимических и фототоксических свойств фуродигидрохинолинов, синтезированных в рамках настоящего проекта, показало перспективность продолжения исследования соединений этого класса in vivo с целью выявления наиболее эффективных препаратов для фототерапии при минимизации нежелательных побочных явлений, связанных с образованием диаддуктов. РАЗРАБОТКА МЕТОДА МОНИТОРИНГА КИСЛОРОДНОГО СТАТУСА НОВООБРАЗОВАНИЙ НА ОСНОВЕ ОПТИЧЕСКОЙ ДИФФУЗИОННОЙ ТОМОГРАФИИ А.Г.Орлова1), А.В.Масленникова2), Г.Ю.Голубятников1), Т.И.Пряникова1,3), И.И.Иванова2), Т.В.Смирнова3), В.А.Каменский1), И.В.Турчин1) Учреждение Российской академии наук Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород; 2)Нижегородская государственная медицинская академия; 3)Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского 1) Кислородный статус опухоли рассматривается в настоящее время как один из ключевых факторов, определяющих прогноз 119 заболевания и эффективность проводимого лечения. Оценка динамики уровня оксигенации в зоне патологии может иметь существенное значение при исследовании ответа новообразования на действие терапии, а также при тестировании агентов, искусственно повышающих кислородный статус гипоксичных опухолей с целью преодоления их резистентности в отношении лечебных воздействий. В настоящей работе для мониторинга экспериментальных новообразований был предложен метод оптической диффузионной томографии (ОДТ), позволяющий определять пространственное распределение концентраций окисленной (HbO2) и восстановленной (HHb) форм гемоглобина, и, соответственно, оценивать параметр, отражающий кислородный статус ткани – степень насыщения крови кислородом (StO2). В исследовании использовалась экспериментальная опухолевая модель лимфосаркомы Плисса. ОДТ проводилась на установке, разработанной в ИПФ РАН (Нижний Новгород). С целью изучения динамики уровня оксигенации экспериментальной опухоли в ходе ее естественного роста проводили серию последовательных сканирований каждые 24 часа в течение шести суток. По мере роста опухоли выявлено снижение уровня оксигенации опухоли, происходящее за счет увеличения концентрации дезоксигемоглобина и уменьшения концентрации оксигемоглобина. С целью изучения динамики кислородного статуса опухолевых моделей под воздействием ионизирующего излучения животные подвергались облучению однократно в дозе 10 Гр. ОДТисследование проводилось перед процедурой лучевой терапии, а также через 2, 5, 24 часа после облучения и, в дальнейшем, каждые 24 ч в течение 4 суток. Для верификации данных ОДТ проводилось прямое полярографическое исследование парциального давления кислорода в тканях (pO2). После лучевого воздействия в ткани новообразования было выявлено временное повышение уровня оксигенации, которое детектировалось как с использованием метода ОДТ, так и полярографии. Максимальное повышение оксигенации опухоли наблюдалось через 48–72 часа. Указанные изменения происходили за счет роста содержания HbO2 и снижения уровня HHb в данный временной период. В результате выполнения работы впервые были продемонстрированы возможности метода оптической 120 диффузионной томографии для неинвазивной оценки параметров, характеризующих динамику оксигенации экспериментальной опухоли в ходе ее естественного роста и после лучевого воздействия. Результаты ОДТ-исследования были подтверждены с использованием прямого измерения рО2 тканей. С использованием метода ОДТ были выявлены различия в причинах изменения уровня оксигенации экспериментальной опухоли в ходе ее естественного роста и при действии лучевой терапии. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ СКРИНИНГА АГЕНТОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ РАКА IN VIVO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦВЕТНЫХ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ БЕЛКОВ А.П.Савицкий1), И.Г.Меерович1), Н.И.Казачкина1), А.В.Закладная2), Е.М.Трещалина3), А.Ю.Барышников3) 1) Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва 2) МИТХТ им. М.В.Ломоносова, Москва 3) ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина, Москва Для достижения цели проекта решалась задача разработки методики скрининга фотосенсибилизаторов для ФДТ рака, характеризующихся интенсивным поглощением в области длин волн > 700 нм, высоким квантовым выходом синглетного кислорода и низкой флуоресценцией (например, окта-4,5-децилтио-окта-3,6хлорофталоцианин цинка (“Октасенс”), метилового эфира Oэтилоксима N-этоксициклоимида бактериохлорина p), in vivo с использованием цветных флуоресцирующих белков. Предварительно проводился in vitro скрининг фототоксического действия исследуемых ФС на используемые для создания опухолевых моделей флуоресцирующие клетки mel Kor-TurboRFP. Было показано, что вышеупомянутые ФС в липосомальной форме проявляют эффективное фототоксическое действие по отношению к флуоресцирующим клеткам mel Kor-TurboRFP при времени инкубации 20-24 часа. 121 Для выбора оптимального времени для облучения сенсибилизированных опухолей изучалась фармакокинетика фотосенсибилизаторов в организме мышей линии BalbC/Nu (ЭДиТО ГУ РОНЦ) с перевитыми флуоресцирующими опухолями при помощи волоконного спектроанализатора Lesa-01-Biospec. Для мышей с опухолями mel Kor-TurboRFP было показано, что накопление липосомальной формы метилового эфира O-этилоксима Nэтоксициклоимида бактериохлорина p в опухоли mel Kor-TurboRFP является максимальным в интервале 2,5-5 часов после введения, при этом максимальный контраст накопления по сравнению со здоровыми тканями наблюдается примерно через 3,5 часа после введения и достигает 5; накопление липосомального “Октасенса” в опухоли достигает максимума через сутки после внутривенного введения ФС, в этот момент удается достичь контраста накопления, равного 5. После введения мыши с опухолью A549-TagRFP липосомального “Октасенса” максимум накопления наблюдается после суток с момента введения. Путем диффузной флуоресцентной томографии было показано уменьшение объема опухоли после ФДТ опухоли mel Kor-TurboRFP, сенсибилизированной липосомальным “Октасенсом”. При использовании нефлуоресцирующих фотосенсибилизаторов флуоресцентные изображения флуоресцирующей опухоли позволяют рационально выбрать границы зоны облучения опухоли. В ходе проекта были получены клеточные линии, экспрессирующие дальнекрасный флуоресцирующий белок mKate2. C этой целью клетки различных опухолевых клеточных линий (человеческие mel Kor, Hep2, A549 и мышиная меланома B16) подвергались липосомальной трансфекции соответствующей эукариотической плазмидой с последущей селекцией и клонированием. Были получены два клона на основе mel Kor, которые сохраняли экспрессию mKate2 в течение 10 пассажей без селектирующего антибиотика G-418, и один клон на основе Hep-2, сохранявший экспрессию mKate2 в течение 8 пассажей без G-418. Для животного с перевитой флуоресцирующей опухолью Hep2mKate2 была получена зависимость накопления липосомального “Октасенса” в опухоли и нормальной ткани. 122 РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПОДХОДОВ К ПРОВЕДЕНИЮ ЛАЗЕРНОЙ ТЕРАПИИ В.В.Смирнов 1), Т.В.Мачнева 2), Е.А.Буравлев 2), Н.Н.Булгакова1), А.Н.Осипов 2) Институт общей физики им. А.М.Прохорова РАН, Москва Российский Государственный медицинский университет, Москва 1) 2) В последние десятилетия лазерная терапия ран и воспалительных процессов различных локализаций широко применяется в практическом здравоохранении [1]. Однако корректное применение лазерного излучения в клинике часто сопряжено с трудностями выбора индивидуальной дозы, мощности и способа облучения, т.к. до настоящего времени не разработано научно обоснованной стратегии применения данного метода. В 1994 году была сформулирована гипотеза о трех основных механизмах действия низкоинтенсивного лазерного излучения [2]. Один из них предполагает, что лазерное излучение красного диапазона спектра (632.8 нм) обладает фотодинамическим действием на мембраны фагоцитов и что первичными акцепторами излучения в этом случае могут выступать эндогенные порфирины. В рамках выполнения проекта была разработана методика определения и проведены измерения наномольных концентраций эндогенных порфиринов в биологических жидкостях. Для проведения измерений был использован обладающий высокой чувствительностью волоконно-оптический спектрометр FS-003V (ООО «Кластер», Москва). Для возбуждения флуоресценции использовали излучение диодного лазера с длиной волны 407 нм вблизи максимума поглощения порфиринов. Применение разработанной методики и аппаратуры позволило получить данные [3, 4], подтверждающие гипотезу о роли эндогенных порфиринов как первичных акцепторов в эффектах низкоинтенсивного лазерного облучения красного диапазона спектра. С учетом полученных результатов была проведена модификация спектрометра FS-003V, которая позволяет создать прототип специализированного медицинского прибора для определения и контроля световой дозы. Мониторинг с помощью такого прибора эндогенных порфиринов в малых объемах биологических жидкостей, включая плазму крови, и в раневых поверхностях 123 пациентов in vivo открывает принципиально новые возможности повышения эффективности фототерапии на основании определения индивидуальной чувствительности пациентов к терапевтическому действию лазерного излучения. Таким образом, результаты, полученные в рамках выполнения проекта, позволяют разработать и реализовать в клинической практике научно обоснованный алгоритм проведения низкоинтенсивной лазерной терапии с учетом индивидуального подхода, основанного на оценке содержания эндогенных порфиринов в крови пациентов. 1. В.Т.Пальчун, А.С.Лапченко и А.Г.Кучеров, Лечебное дело, № 2, 20(2005). 2. Ю.А.Владимиров. М., Институт биомедицинской химии РАМН, 1994, 66 c. 3. Т.В.Мачнева, Н.Н.Булгакова, Ю.А.Владимиров, А.Н.Осипов, Биофизика, 2010, том. 55, вып. 3, с. 467-472 . 4. Т.В.Мачнева, Е.А.Буравлев, Н.Н.Булгакова, Ю.А.Владимиров, А.Н.Осипов. Биофизика, 2011, том. 56, вып.4, с. 705-713. КОМПОЗИТНЫЕ ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЙ В ТЕРАНОСТИКЕ Н.Г.Хлебцов1),2), Б.Н.Хлебцов1), Е.В.Панфилова1), В.А.Ханадеев1), О.А.Бибикова2), С.А.Староверов1), А.А.Широков1), Л.Ю.Матора1), Л.А.Дыкман1), В.А.Богатырев1), Г.С.Терентюк2), И.Л.Максимова2), Е.С.Тучина2), В.В.Тучин2), В.Д.Румянцева3), А.В.Иванов4), И.П.Шилов5), А.В.Рябова6), В.Б.Лощенов6) Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов; 2 ФГБОУ ВПО Саратовский госуниверситет им. Н.Г.Чернышевского, Саратов; 3 ФГБОУ ВПО Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова, Москва; 4 Учреждение Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва; 5 Учреждение Российской академии наук Фрязинский филиал Института радиотехники и электроники им. В.А.Котельникова РАН, Фрязино, МО; 6 Центр естественнонаучных исследований Учреждения Российской академии наук Институт общей физики им. А.М.Прохорова РАН, Москва 1 Многофункциональные наноструктуры, совмещающие диагностические и терапевтические и свойства в одной частице, являются 124 основой нового направления нанобиотехнологии – тераностики [1]. Для этой новой области науки перспективными представляются наноструктуры, которые совмещают уникальные оптические свойства частиц с плазмонным резонансом и преимущества пористых частиц SiO2, функционализованных молекулами фотосенсибилизатора [2]. В работе получены композитные наночастицы, состоящие из золото-серебряных наноклеток, золотых нанооболочек или наностержней, покрытых мезопористой оболочкой из двуокиси кремния и функционализованных фотосенсибилизаторами (ФС) гематопорфирином (HP) и Yb-2,4диметоксигематопорфирином (YB-HP) и красителем индоцианином зеленым (ICG). Положение плазмонного резонанса исходных наночастиц в области 435-970 нм контролировалось осевым отношением Au стержней, структурой и размером Au/Ag наноклеток и SiO2/Au нанооболочек, а толщина мезопористой силикатной оболочки варьировалась от 10 до 50 нм. Кроме плазмонного резонанса, синтезированные композитные наночастицы имеют характерные полосы видимой флуоресценции и ИК-люминесценции (в случае связанного Yb-HP), способны генерировать синглетный кислород и тепловую энергию. Эти свойства позволяют использовать их для имиджинга, фотодинамической терапии и термотерапии. Для мышей с привитой карциномой Эрлиха методами ИК люминесценции, атомноадсорбционной спектроскопии и ИК-термографии исследованы биораспределение и фототермические эффекты при лазерном облучении опухолей, здоровых тканей и модельных систем. Исследовано индуцированное лазерным ИК излучением фототоксическое действие конъюгатов плазмонно-резонансных наночастиц с ICG и HP на бактерии St. aureus 209 Р. Разработан мультиплексный вариант дот-иммуноанализа с использованием мультицветных меток на основе конъюгатов золото-серебряных наноклеток с молекулами-зондами. 1. L.A.Dykman, N.G.Khlebtsov // Acta Naturae, 2011, 3 (2), 34–55. 2. B.Khlebtsov, E.Panfilova, V.Khanadeev et al. // ACS Nano, 2011, 5 (9), 7077–7089. 125 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МОНИТОРИНГА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ ОПТИЧЕСКОГО БИОИМИДЖИНГА Н.М.Шахова1,2, И.В.Балалаева3,1, А.А.Брилкина3, Л.В.Дубасова3, Д.Д.Елисеева2, О.В.Качалина2, В.И.Плеханов1, Е.А.Сергеева1,3, Е.И.Сергеева3, И.В.Турчин1 Институт прикладной физики РАН (ИПФ РАН) Нижегородская государственная медицинская академия (НижГМА) 3) Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского (ННГУ) 1) 2) Введение. Динамично развивающийся в последние годы метод фотодинамической терапии (ФДТ) провоцирует создание новых фотосенибилизаторов (ФС), максимально отвечающих требованиям современной медицины. Так, появление генетически кодируемых ФС открывает новую страницу в ФДТ [Bulina ME, et al., 2006;]. Скрининг создаваемых агентов для ФДТ включает несколько этапов и является трудоемкой и дорогостоящей процедурой [M.C.Butler et al., 2009], что делает актуальным развитие новых подходов к исследованиям свойств разрабатываемых препаратов. Другим направлением развития ФДТ является разработка и апробация новых направлений ФДТ в клинической практике, что также требует применения современных методов контроля. Материалы и методы. Для скрининга фармакокинетики и фармакодинамики новых ФС нами используется комплексный подход, включающий несколько методов. Анализ цитотоксичности проводился методом МТТ. Суточную динамику накопления фотосенсибилизаторов исследовали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). Внутриклеточную локализацию выявляли с помощью лазерной сканирующей системы Carl Zeiss Axiovert 200 M LSM 510 META с системой жизнеобеспечения клеток. Фотосенсибилизаторы тестировались на культурах нормальных (гепатоциты Chang Liver) и опухолевых (аденокарцинома печени SK-HEP-1, карцинома мочевого пузыря Т 24) клеток. В предварительных экспериментах по оценке механизмов действия использован флуоресцентный сенсор 126 перекиси водорода HyPer. В клинических работах в качестве метода мониторинга ФДТ применяли оптический когерентный томограф «ОКТ-1300У» в скоростной модификации, который позволяет получать изображения в режиме видеокадра (8-10 кадров в секунду), что делает обследование зоны интереса информативным с дополнительной функциональной точки зрения. Объектами исследования были ФС различных классов, в том числе и генетически кодируемые. Результаты. Нами показано, что вновь разрабатываемые препараты фталоцианинового ряда обладают наименьшей темновой токсичностью из всех применяемых в настоящее время ФС. Что касается внутриклеточного распределения наиболее перспективным для реализации механизма гибели клеток через апоптоз являются протопорфирины (накопление в митохондриях и аппарате Гольджи (АГ) и хлорины (накопление в митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме и АГ). Необходимо отметить, что новые разрабатываемые фталоцианиновые ФС накапливаются не только в мембранах, но и в АГ. В клинической практике нами разработан диагностический алгоритм с использованием ОКТ, позволяющий планировать и контролировать фотодинамическую терапию ранних неоплазий шейки матки. Заключение. Работа демонстрирует возможности разработанного нами подхода для комплексного исследования прижизненных свойств ФС в экспериментальных исследованиях и неинвазивного мониторинга ФДТ в клинической практике. В перспективе планируется проведение комплексных исследований по прижизненной оценке механизмов действия с использованием сконструированного малогабаритного излучателя для экспонирования планшетов с клеточными культурами. В качестве маркера воздействия планируется использование флуоресцентного сенсора перекиси водорода. 127 4. Информатика ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ СЛЕДОВЫХ СУБСТРАТОВ НАРУШЕНОЙ ПАМЯТЬ К.В.Анохин1,2,4), Е.А.Амельченко1,2,4), Д.П.Ветров2,3), С.В.Зворыкина2,4) 1) Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН 2) РНЦ Курчатовский институт 3) Факультет вычислительной математики и кибернетики МГУ 4) НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН Нейродегенеративные заболевания, в частности болезнь Альцгеймера (БА), сопровождающаяся глубокими нарушениями памяти, являются одними из самых затратных и социально тяжелых заболеваний. Однако наши предыдущие исследования показали, что в ряде случаев нарушенная память поддается восстановлению с помощью процедур реактивации ее дезинтегрированных, но не полностью утраченных фрагментов. В настоящей работе были отработаны алгоритмы статистического параметрического картирования (statistical parametric mapping, SPM), используемого в нейровизуализации у человека, для картирования активности мозга экспериментальных животных, память которых была нарушена блокадой синтеза белка в мозге. Это позволило задать вопрос, где в мозге сохраняются следы нарушенной, но восстанавливаемой памяти. В ходе эксперимента мыши линии C57Bl/6 были обучены классическому условно-рефлекторному замиранию на фоне введения физиологического раствора или ингибитора белкового синтеза циклогексимида (100 мг/кг). Через 24 часа проводили напоминание кратким электрокожным раздражением в новом для животных контексте и через 90 минут после напоминания брали образцы головного мозга для иммуногистохимического выявления с-Fos-позитивных нейронов в различных структурах мозга. Также анализ экспрессии с-Fos проводили на срезах мозга животных, взятых для декапитации из домашних клеток одновременно с 128 мышами экспериментальных групп (пассивный контроль) и животных, получавших инъекцию физиологического раствора и напоминание, но не проходивших обучение (активный контроль). Топографическая картина активности мозга, оцениваемая по экспрессии транскрипционного фактора c-Fos, различалась при реактивации нормальной и реинтеграции нарушенной памяти. В поле СА3 гиппокампа и в прелимбической коре мышей максимальная индукция c-Fos обнаружена при реактивации нормальной памяти. В базолатеральном ядре миндалины и цингулярной коре высокий уровень экспрессии наблюдался у животных, получавших напоминание, независимо от их предварительного опыта. Кроме того, достоверное увеличение количества с-Fos-позитивных клеток относительно уровня пассивного контроля был обнаружено в центральном и базолатеральном ядрах миндалины у животных, обученных на фоне циклогексимида, но не получавших напоминание. Достоверное повышение количества с-Fos-позитивных нейронов после напоминания было обнаружено поле СА1 и зубчатой фасции гиппокампа мышей с нарушенной, но не с нормальной памятью, что говорит о вовлечении данных структур мозга в реинтеграцию нарушенной памяти в модели условно-рефлекторного замирания. Таким образом, данным методом функционального картирования удалось: а) обнаружить отличия в активности мозге животных с нарушенной, но восстанавливаемой памятью от мозга необученных животных, б) определить предполагаемые нервные субстраты сохранения следовых субстратов нарушенной памяти. Полученные результаты имеют значение для поиска новых стратегий терапии нарушений памяти при нейродегенеративных заболеваниях. Работа поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» 129 МНОГОФАКТОРНАЯ ОПТИМИЗАЦИЯ СВОЙСТВ МОЛЕКУЛ ПРИ РАЗРАБОТКЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИАЛЬНЫХ АЛГОРИТМОВ КОМПЬЮТЕРНОГО АНАЛИЗА МУЛЬТИПАРАМЕТРИЧЕСКИХ ДАННЫХ К.В.Балакин, Я.А.Иваненков, Е.В.Бовина Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка Инструменты, позволяющие осуществлять многофакторную оптимизацию свойств молекул (таких как биомишень, токсичность, биодоступность, физико-химические свойства) на ранних этапах разработки лекарств, способны существенно интенсифицировать современные подходы к созданию новых лекарственных препаратов. Для решения этой задачи в ходе настоящего проекта был создан ряд глобальных моделей на основе алгоритмов компьютерного анализа мультипараметрических данных, связывающих структуру физиологически активных субстанций и их фармакологические и физико-химические параметры. Были использованы современные методы анализа мультипараметрических свойств объектов (в качестве объектов выступали молекулы, а в качестве параметров – расчетные свойства объектов, молекулярные дескрипторы), основанные на алгоритмах проецирования – самоорганизующиеся карты Кохонена и нелинейные карты Сэммона. Целью исследования явилось выявление универсальных многоразмерных пространств свойств молекулярных объектов, наиболее адекватно описывающих заданные анализируемые параметры, такие как мишень-специфичная активность (молекулярная биомишень для действия препарата), степень острой токсичности, проникаемость через биологические мембраны (оральная биодоступность, эффективность проникновения через гематоэнцефалический барьер). Принципиальная сложность такого подхода связана с тем, что различные наборы свойств молекул и соответствующих молекулярных дескрипторов определяют фармакологические свойства молекул. В то же время возможность описания некоторого ряда ключевых фармакологических свойств химических соединений в единой системе координат (дескрипторов) дает возможность чрезвычайно удобной и быстрой оценки молекул при 130 отборе соединений-кандидатов для синтеза и биологических испытаний. Был проведен анализ топологии указанных пространств свойств с целью обнаружения кластеров, соответствующих конкретным молекулярным признакам. Результатом стал отбор нескольких пространств свойств (наборов молекулярных дескрипторов, описанных соответствующими моделями нелинейного проецирования), которые могут быть использованы для решения практических задач. Построенные модели были интегрированы в созданный ранее в рамках программы «Фундаментальные науки медицине» программный комплекс, позволяющий аккумулировать экспериментальные и расчетные данные «структура-активность» химических соединений и прогнозировать их свойства. Был осуществлен сравнительный анализ глобальных моделей по дискриминирующей способности между различными группами соединений (по заданным свойствам). Оптимальные модели были валидированы с использованием выборки лекарственных соединений с известными свойствами. СОЗДАНИЕ БАНКА ДНК-ДАННЫХ ПО НАСЕЛЕНИЮ РОССИИ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ Л.А.Животовский, Б.А.Малярчук, М.В.Деренко, И.С.Цыбовский, Э.К.Хуснутдинова, В.В.Жиркова, С.А.Федорова, В.Л.Ахметова Институт общей генетики им Н.И.Вавилова РАН (г. Москва) Институт биологических проблем Севера ДВО РАН (г. Магадан) Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра республики Башкоркостан (г. Уфа) Якутский научный центр комплексных медицинских проблем Российской академии медицинских наук (г. Якутск) Институт проблем криминологии, криминалистики и судебной экспертизы Министерства юстиции республики Беларусь (г. Минск) 131 В целях идентификации личности и определения родства при расследовании уголовных преступлений, установлении отцовства, восстановлении семей и др. биологические образцы генотипируют по ДНК-маркерам, в первую очередь микросателлитам (STR). Затем полученные ДНК-данные интерпретируют в соответствии с имеющимися версиями по данному делу и определяют требуемые вероятностные статистики. Эти статистики основаны на частотах встречаемости генотипов и аллелей и напрямую определяются тем, какая группа населения выбрана в качестве референтной популяции. Поэтому в мире создаются национальные банки ДНКданных по этническим группам и иным когортам населения. Большое этническое разнообразие населения России диктует необходимость создания банков данных по ДНК-маркерам, используемым в судебно-медицинских экспертизах. Заложены основы для создания общего банка данных по микросателлитным ДНК-маркерам с целью оценки генетического разнообразия населения России и определения «судебно-генетических» статистик. В рамках проекта ФНМ за последние годы нами было исследовано русское население из различных городов европейской части России, население Белоруссии и частично Украины, различные этнические группы респ. Саха (Якутия), Саяно-Алтайского и Волго-Уральского регионов. Показано значительное разнообразие этнических групп даже в пределах одного региона и необходимость их дифференцированного использования при формировании референтных популяций при проведении генетических экспертиз. Полученные таблицы частот аллелей по каждой из когорт населения могут быть использованы в судебно-медицинской практике. Результаты исследований опубликованы в отечественных и зарубежных журналах: «Молекулярной биологии», «Forensic Science International» и др. В.В.Жиркова, С.А.Федорова, В.Л.Ахметова, Л.А.Животовский, Э.К.Хуснутдинова. 2011. Аллельный полиморфизм шести микросателлитных локусов ДНК в популяциях республики Саха (Якутии). Молек. биология 45: 249-257. И.С.Цыбовский и др. (и Л.А. Животовский). Доклады НАН Беларуси (в печати). Pereira L., L. Zhivotovsky et al. (25 co-authors). 2010. International Journal of Legal Medicine DOI 10.1007/s00414-010-0472-2. 132 Цыбовский И.С. и др. (и Л.А. Животовский). 2009. Молекулярная и прикладная генетика, Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси, изд. «Право и экономика», т. 9: 103-113. Zhivotovsky L.A. et al. 2009. Forensic Science International (Genetics) 3: e107-e109. Zhivotovsky L.A. et al. 2009. Forensic Science International (Genetics) 3: e111-e116. Zhivotovsky L.A. et al. 2009. Forensic Science International (Genetics) 3: e133-e136. РАЗРАБОТКА АЛГЕБРО-ЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ОЦЕНКИ ФАКТОРОВ РИСКА В КАРДИОЛОГИИ, НЕЙРОХИРУРГИИ И ОНКОЛОГИИ Ю.И.Журавлев1), И.Б.Петров2), В.В.Рязанов1), О.В.Сенько1) Учреждение российской академии наук Вычислительный центр им. А.А.Дородницына РАН, Москва 2) Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный 1) В 2011 году проведены исследования по разработке алгебрологических методов прогноза заболеваний и оценки факторов риска в кардиологии, нейрохирургии и онкологии. Созданы алгоритмы восстановления значений факторов риска. Локальный алгоритм основан на объединении метода к-ближайших соседей и итерационной процедуры. Глобальный алгоритм состоит в минимизации функционала, выражающего соответствие расстояний в подпространствах известных значений признаков пар объектов их расстояниям в заданном пространстве признаков. Методы успешно апробированы на данных Медицинского центра Банка России (задача прогноза риска инсульта). Разработаны две процедуры прогноза кардиологических и онкологических заболеваний по факторам риска с нахождением линейных зависимостей между факторами. Первый метод состоит в поиске информативных слабокоррелированных линейных комбинаций пар признаков и применении стандартных методов поиска логических закономерностей. Второй метод состоит в прямом оптимизационном поиске конъюнкций линейных 133 комбинаций признаков. Точность прогноза моделей с линейными зависимостями признаков повышается в среднем на 5 %. Продолжено исследование модели выбора метода лечения дегенеративных заболеваний поясничного отдела позвоночника, найдены информативные факторы для модели и каждого метода. Разработаны и реализованы сеточно-характеристические гибридные вычислительные методы повышенного порядка точности для численного моделирования волновых процессов в системе черепмозг человека. При помощи разработанных методов исследованы волновые процессы, происходящие в системе череп-мозг при динамических нагрузках. Численно получены области поражения мозговой ткани при динамическом нагружении головы человека. Создана модификация метода поиска статистически верифицированных закономерностей, позволяющая описывать различия между эффектами различных прогностических показателей на прогнозируемую величину. Это позволяет оценивать различия между влиянием биомедицинских факторов на возникновение и ход патологий в группах пациентов с различными вариантами одного из генов. По базе данных НКЦ «Геронтология» Росздрава проведены исследования влияния вариантов гена, кодирующего ангиотензинпревращающий фермент, на тяжесть течения дисциркуляторной энцефалопатии, а также исследование влияния вариантов гена, кодирующего фермент липопротеинлипаза, на возникновение инсультов. 1. Ю.И.Журавлев, Г.И.Назаренко, В.В.Рязанов, Е.Б.Клейменова Новый метод анализа риска развития ишемической болезни сердца на основании геномных и компьютерных технологий. Кардиология, 2011, № 2, стр. 19-25. 2. И.Б.Петров, А.В.Васюков. Компьютерное моделирование механических факторов черепно-мозговых травм сеточно-характеристическим численным методом. Информационные технологии, № 5, 2011, с. 58-62. ПОИСК ГЕНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ВСТАВКИ И СКЛЕЙКИ Е.В.Коротков, Ю.М.Суворова, В.М.Руденко, Ф.Е.Френкель Центр «Биоинженерия» РАН, Москва 134 Развитие методов секвенирования последовательностей оснований ДНК сделало возможным развитие так называемой индивидуальной медицины. Одной из задач этого направления является поиск тех генов, которые отвечают за индивидуальную чувствиительность к лекарствам. Такими генами в первую очередь являются гены, которые накопили определенные мутации, в первую очередь вставки фрагментов ДНК, или представляющие собой склейку частей двух других генов. В данной работе для поиска генов со вставками или поиска склеенных генов мы использовали существование триплетной «волны» в генах, которая выражена в виде неравномерного использования оснований по позициям триплетного периода. Триплетная организация последовательностей ДНК, кодирующих белки, является общим свойством всех известных на настоящее время живых систем, и она привязана к рамке считывания, существующей в гене (1, 5). Если на фоне триплетной периодичности в гене произойдет вставка фрагмента ДНК с длиной не кратной трем основаниям, то это можно будет заметить, так как произойдет сдвиг фазы триплетной периодичности (1, 2). Присутствие такого сдвига фазы триплетной периодичности в нуклеотидной последовательности может служить указанием на присутствие вставки фрагмента ДНК в анализируемом гене. Если же произойдет склейка двух генов, то это можно заметить по наличию так называемой точки разладки в гене (3, 4, 6). В точке разладки триплетная периодичность резко меняет свои свойства. Мы разработали оригинальный компьютерный метод для поиска сдвига фазы триплетной периодичности и провели анализ генов, собранных в базе данных Kegg-46 (более 4 миллионов генов). Для расчетов использовался компьютерный кластер Центра «Биоинженерия» РАН, состоящий из 110 процессоров. Результаты исследования показали, что примерно 18 % прокариотических генов содержат сдвиг фазы триплетной периодичности, обусловленный вставками фрагментов ДНК. Для склеек мы обнаружили, что около 10 % генов из базы Kegg-46 содержат склейки триплетной периодичности, которая может указывать на то, что данный ген представляет собой последовательность, состоящую из частей двух различных генов. Частично полученные результаты были подтверждены поисками подобий для аминокислотных последовательностей, которые кодируются склеенными генами. 135 Было показано, что встречаются белки, для которых подобие наблюдается либо до, либо после места склейки. Данное исследование открывает новые возможности для поиска генов, интересных с точки зрения персональной медицины для предсказания индивидуальных эффектов воздействия лекарственных препаратов. Публикации: 1. В.М.Руденко, Е.В.Коротков «Применение метода Монте-Карло для поиска потенциальных сдвигов рамки считывания в генах», Математическиая биология и биоинформатика, том 6, с. 79-91, 2011. 2. V.M.Rudenko, Yu.M.Suvorova, E.V.Korotkov “Detection of possible reading frame shifts in genes using triplet frequencies homogeneity”, Austrian Journal of Statistics, v. 40, № 1-2, pp. 137-146, 2011. 3. Е.В.Коротков, В.М.Руденко «Поиск скрытой периодичности в финансовых временных рядах методом циклического разложения», Прикладная информатика, № 3, 2011. 4. V.M.Rudenko, Yu.M.Suvorova, E.V.Korotkov Detection change points of triplet periodicity of gene. Gene, v. 491, 58-64, 2012. 5. E.V.Korotkov, A.A.Shelenkov “LEPSCAN—a web server for searching latent periodicity in DNA sequences. Briefings in Bioinformatics (Impact Factor 9.3), accepted for publication in 2011. http://bib.oxfordjournals.org/content/early/2011/07/22/bib.bbr044.short?rss=1 6. E.V.Korotkov, M.A.Korotkova Detection of insertions in genes with help of triplet periodicity phase shifts. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2011, accepted for publication. ВРЕМЕННОЙ АНАЛИЗ И СЖАТИЕ ДАННЫХ В МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Н.А.Кузнецов, Ф.Н.Григорьев, К.В.Семенихин, Н.А.Гречишкина Институт радиотехники и электроники им. В.А.Котельникова РАН Развитие компьютерных методов электро- и магнитоэнцефалографии делает актуальной проблему разработки интеллектуальных алгоритмов обработки цифровых записей, представляющих собой протокол проведения медицинских исследований по диагностике, выявлению и лечению патологических состояний. Однако разработка методов принятия решений в медицинской практике (продолжение данного вида терапии, его изменение, прекращение и т.п.) возможна только на 136 основе решения другой принципиально важной проблемы - задачи идентификации математической модели ЭЭГ- и МЭГ-сигналов. Практика математической обработки электроэнцефалограмм показывает, что на небольшом промежутке времени соответствующие сигналы удовлетворительно описываются моделями регулярных стационарных случайных процессов. Благодаря этому становится возможным эффективно оценивать моментные и спектральные характеристики этих процессов. В рамках этой гипотезы для ЭЭГ-сигналов предполагается оценить параметры линейного стохастического дифференциального уравнения, представляющего собой модель суперпозиции нескольких колебательных звеньев. Тем не менее гипотеза стационарности справедлива только для установившегося режима и не подходит для идентификации модели ЭЭГ-записей, содержащих артефактные явления, для анализа тестовых воздействий на пациента. Поэтому для решения указанных задач предлагается методика адаптивной фильтрации, которая способна учесть смену структуры дифференциального уравнения при возникновении вызванных потенциалов. На основе современных методов теории оценивания параметров стохастических дифференциальных уравнений разработаны методы и алгоритмы оценивания ЭЭГ и вызванных потенциалов. Разработаны компьютерные программы и проведена их апробация на реальных ЭЭГ. Разработаны методы идентификации параметров ЭЭГ, построены алгоритмы идентификации параметров энцефалограмм с помощью методов «отбеливания» шума в сигнале разностной ошибки и построения фундаментальной матрицы системы дифференциальных уравнений, описывающей сигналы ЭЭГ. Разработаны методы сжатия многомерных сигналов энцефалограмм и созданы соответствующие алгоритмы сжатия. Состоятельность описанных методов доказана исследованиями, проводившимися в 2011 г. совместно с НИИ нейрохирургии им. Н.Н.Бурденко РАМН. Это позволит в будущем провести усовершенствование имеющихся алгоритмов обработки измерительной информации с целью повышения их эффективности. Результаты работ доложены на Второй международной научнопрактической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», 26137 28 октября 2011 г., Санкт-Петербург (Кузнецов Н.А., Григорьев Ф.Н., Гречишкина Н.А. «Статистические критерии диагностики заболеваний на примере болезни Паркинсона по данным ЭЭГ»), на научном семинаре в ИРЭ им. В.А.Котельникова РАН совместно с Институтом высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН и НИИ нейрохирургии им. Н.Н.Бурденко РАМН, 02 июня 2011 г., Москва (Григорьев Ф.Н., Кузнецов Н.А. «Статистический критерий диагностики болезни Паркинсона на основе ЭЭГ») и представлены к публикации в журнале ««Технологии живых систем»» (Григорьев Ф.Н., Кузнецов Н.А., «Статистический критерий диагностики болезни Паркинсона по данным ЭЭГ»). МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ГОМЕОСТАЗА Г.И.Марчук, А.А.Романюха, В.Н.Анисимов, Т.Е.Санникова УРАН Институт вычислительной математики РАН Увеличение частоты онкологических заболеваний в старших возрастных группах подтверждается многочисленными клиническими и экспериментальными данными. Считается, что рост частоты онкологических заболеваний обусловлен комплексом причин, среди которых выделяются ослабление общего и противоопухолевого иммунитета, кумулятивный эффект соматических мутаций, истощение регенераторного потенциала тканей из-за сокращения длины теломер и уменьшения количества стволовых клеток, нарушения свойств соединительной ткани и ухудшение питания клеток, изменение гормональной регуляции и ряд других механизмов. Одним из факторов, влияющим на возрастную динамику канцерогенеза, является состояние энергетического обмена. Результаты эпидемиологических и экспериментальных исследований показывают, что избыточное питание, увеличенный вес, ожирение сопровождаются увеличением частоты опухолей различной локализации. Ограничение калорийности питания, физические упражнения уменьшают частоту образования опухолей. Аналогичный эффект дает применение метформина. В качестве 138 фактора, определяющего частоту образования опухолей, рассматривается повышенная продукция окислительных радикалов. Целью работы является исследование возрастных изменений энергетического гомеостаза и скорости канцерогенеза, влияния на них калорийности питания. Исследования проводились с помощью математической модели энергетического гомеостаза с использованием данных, полученных на экспериментальных животных. Модель явно учитывает принципы и ограничения физиологических и метаболических систем многоклеточных организмов: зависимость скорости повреждения клеток от интенсивности функциональной нагрузки и точности поддержания гомеостаза; различные приоритеты доступа к энергетическим субстратам физиологических систем организма. Уравнения модели описывают расход энергии на поддержание гомеостаза внутренней среды, регенерацию повреждений метаболической машины, регенерацию тканей, физическую активность и размножение. По литературным и экспериментальным данным проведена оценка параметров модели. Настройка модели проводилась последовательно физиологическим процессам и системам: регуляция гомеостаза внутренней среды включая уровень глюкозы и СЖК (быстрый процесс), регуляция резервов и регенерации метаболических систем (медленные процессы). Вычислительные эксперименты показали, что модель описывает возрастное снижение функционального резерва систем поддержания гомеостаза, кахексию, увеличение скорости образования опухолей. Снижение калорийности питания на 30 % приводило к увеличению продолжительности жизни на 12 % и снижению скорости образования опухолей. Динамика старения и онкогенеза зависят от величин параметров доступа к энергетическим субстратам физиологических систем организма, которые также определяют размножение и физическую активность. Можно предположить, что возрастная динамика канцерогенеза и старения являются результатом эволюционной адаптации и соотношение между процессами поддержания и 139 размножения, соответствуют максимуму относительной приспособленности. Проверка этой гипотезы является задачей дальнейших исследований. ИССЛЕДОВАНИЯ И РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ АНАЛИЗА ДИНАМИКИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОЗГА С.А.Никитов1), Б.П.Безручко2), А.А.Морозов1), Ю.В.Обухов1) Институт радиотехники и электроники им. В.В.Котельникова РАН 2) Саратовский филиал Института радиотехники и электроники им. В.В.Котельникова РАН 1) В рамках проекта была разработана и программно реализована информационная технология статистического анализа магнитоэнцефалографических (МЭГ) сигналов, полученных с использованием парадигмы вызванного отклика, направленная на выделение источников сигналов в моторных областях коры мозга. Задача выделения источников сигналов в моторных областях мозга является крайне актуальной в нейрофизиологии, так как расположение моторных зон мозга необходимо учитывать при нейрофизиологических операциях, и любая информация о физическом расположении этих зон позволяет существенно снизить риск хирургического вмешательства и минимизировать побочные последствия. Исследованы и разработаны статистические методы анализа сигналов магнитного энцефалографа (МЭГ), направленные на разделение сигналов, поступающих из разных зон коры мозга. МЭГ – данные были получены в МЭГ-центре Московского городского психолого-педагогического университета, который является партнёром ИРЭ им. В.А.Котельникова РАН. Для получения данных использовалась парадигма вызванного отклика, при этом одновременно с МЭГ (306 каналов) производилась запись миографических сигналов, сигналов акселерометров и др. Таким образом, экспериментальные данные являются гетерогенными и представляют собой тензор третьего ранга. Разработанные нами методы обработки сигналов основаны на обобщённом методе 140 главных компонент (декомпозиция Такера), факторном анализе с прямоугольным и косоугольным методами вращения. Исследовались также подходы на основе комплексного представления сигналов, полученных с ортогональных градиометров МЭГ-системы, и соответствующие методы комплексного анализа. Разработанная информационная технология реализована программно и в настоящее время проходит апробацию в МЭГ-центре МГППУ. Требуется дальнейшее тестирование и доводка технологии на клинических данных. Результаты планируется внедрить в МЭГ-центре МГППУ и НИИ нейрохирургии им. академика Н.Н.Бурденко. Проведено исследование динамики различных областей головного мозга крыс линии WAG/Rij (моделей абсансной эпилепсии – неконвульсивной формы эпилепсии с непредсказуемым наступлением припадков) в различных состояниях и получены количественные показатели перехода от нормальной динамики к патологической. Анализ проводился по экспериментальным данным, которые представляли собой записи локальных потенциалов из лобной и затылочной коры, ретикулярного и вентропостеромедиального ядер таламуса. Известно, что три из этих четырех областей (все, кроме затылочной области коры) принимают активное участие в формировании эпилептического (пик-волнового) разряда. При анализе строились индивидуальные прогностические модели в форме линейных и нелинейных процессов авторегрессии с оценкой ошибки прогноза и оптимальной размерности модели – показателей предсказуемости и «сложности» процессов. А также исследовались взаимодействия между исследуемыми областями мозга на основе оценки причинности по Грейнджеру. При статистической обработке результатов анализа нескольких сотен эпилептических разрядов от пяти животных обнаружено, что в среднем имеет место упрощение динамики (уменьшение размерности оптимальной модели и ошибки ее прогноза) перед пик-волновым разрядом по сравнению с фоновой активностью. Аналогичным образом установлено усиление влияния ядер таламуса на лобную кору и уменьшение влияния других структур мозга на ретикулярное ядро перед разрядом. 141 НОВЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДАННЫХ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ С УЧЕТОМ КОМПЛЕКСНЫХ ПРОФИЛЕЙ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ДЛЯ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ К.В.Рудаков1), И.Ю.Торшин2), О.А.Громова3) Вычислительный центр РАН, Москва Московский физико-технический институт, Москва 3) Международный сателлитный центр ЮНЕСКО, Москва 1) 2) За отчетный период был разработан формализм для поиска сложных закономерностей и решения задач классификации в разнородных признаковых описаниях. Важной областью применения такого рода формализма является анализ данных биомедицинских исследований. Разработаны основы формализма для анализа данных индивидуальных пациентов, включающих результаты современных диагностических методов, таких как профили микроэлементов и генетических полиморфизмов. Разработанные на основе алгебраических критериев разрешимости методы отбора наиболее информативных значений признаков позволили установить сочетания признаков, наиболее приемлемые для построения эпсилонкорректных функций-предикторов для отнесения пациентов к исследуемым классам патологий. Произведены вычислительные эксперименты на выборке более чем из 700 пациентов и более 40 патологий, позволившие получить результаты, весьма интересные с точки зрения экспертов в проблемной области. В частности, была получена и обоснована ранжировка различных факторов риска артериальной гипертонии и атеросклероза, включая эффекты микронутриентого состава биосубстратов и генетических полиморфизмов. Полученные результаты имеют значение для диагностики и профилактики различных групп заболеваний и, прежде всего, ишемического инсульта – одной из основных причин смертности жителей России в среднем и пожилом возрасте. Некоторые публикации: Ю.И.Журавлёв, К.В.Рудаков, И.Ю.Торшин. Алгебраические критерии локальной разрешимости и регулярности как инструмент исследования 142 морфологии аминокислотных последовательностей. Труды МФТИ, 2011, Т. 3, № 4, с. 67-76. К.В.Рудаков, И.Ю.Торшин Анализ информативности мотивов на основе критерия разрешимости в задаче распознавания вторичной структуры белка. Информатика и её применения, Т. 5, № 4, 2011, с. 40-50. И.Ю.Торшин, О.А.Громова, К.В.Рудаков Систематический анализ молекулярных механизмов воздействия омега-3 полиненасыщенных жирных кислот на аритмию, Кардиология, 2011, № 5, – С.37-49. Е.Ю.Егорова, И.С.Юргель, О.А.Назаренко, М.С.Философова, И.А.Альпер, И.Ю.Торшин, Н.В.Юдина, Т.Р.Гришина, О.А.Громова Рандомизированное контролируемое исследование эффективности препарата Прогепар у пациентов с хроническим алкогольным гепатитом. РМЖ, – 2011, №12, том 753 К.В.Рудаков, И.Ю.Торшин Об отборе информативных значений признаков на базе критериев разрешимости в задаче распознавания вторичной структуры белка. ДАН, 2011, Т. 441, № 1, с.1-5. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И АЛГОРИТМОВ ЛОКАЛИЗАЦИИ И ОЦЕНИВАНИЯ ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ВНУТРИЧЕРЕПНОГО ИНОРОДНОГО ТЕЛА ПО РЕНТГЕНОГРАФИЧЕСКИМ ИЗОБРАЖЕНИЯМ В.А.Сойфер, Н.Ю.Ильясова, А.В.Куприянов, А.Г.Храмов Учреждение Российской академии наук Институт систем обработки изображений РАН, Самара Знание точного расположения и размеров внутричерепного инородного тела позволяет определить наиболее рациональную тактику хирургического лечения и уменьшить количество тяжёлых осложнений при проведении операций на мозге человека. Для локализации инородных тел используется рентгеновское исследование, которое позволяет зарегистрировать изображения рентгеновских проекций черепа и инородного тела (боковой и прямой). Достоинствами рентгеновского метода исследования являются высокая информативность о взаимоотношении инородного тела и окружающих тканей, быстрота и безболезненность исследования, возможность проведения его в ранние сроки после травмы, выявление материала инородных тел. Разработан и реализован метод моделирования рентгеновского изображения объекта, основанный на использовании механизмов 143 взаимодействия рентгеновского излучения с веществом, а также методах описания исследуемого объекта и расчета вероятностных параметров распределения фотонов по направлениям. Моделирование процессов взаимодействия рентгеновского излучения с объектами является одним из вспомогательных средств проверки методик анализа рентгеновских снимков. Разработанный метод позволил получить рентгеновские изображения и продольные срезы распределения интенсивности для двух видов источников излучения: точечный источник и источник параллельных лучей. Проведён анализ погрешностей работы алгоритма и временных затрат, необходимых для моделирования изображения. Разработан метод локализации объектов на рентгенографических изображениях, границы которых могут быть описаны замкнутыми параметрическими кривыми произвольного порядка. Он основан на использовании модифицированного преобразования Хоу. Предложено модифицировать подынтегральную функцию преобразования с использованием градиента исходного изображения. С целью повышения вычислительной эффективности данного метода используются элементы стохастической геометрии. Одним из достоинств предложенного подхода является возможность контроля знака искомой области (введено понятие ориентированной области и знака области), что позволило повысить эффективность работы метода. Произведено численное моделирование объекта локализации и вносимых искажений на основе предложенной стохастической модели. Проведен вычислительный эксперимент, который показал высокую эффективность разработанного метода и его устойчивость по отношению к различным видам искажений. Результаты исследований отражены в следующих публикациях: монография [Ильясова Н.Ю. Информационные технологии анализа изображений в задачах медицинской диагностики / Ильясова Н.Ю., Куприянов А.В., Храмов А.Г // М., Радио и связь, принята к публикации, грант РФФИ на издание книги № 11-07-07016. – 2011, 468 с.], доклад [Zascanov S.G. Method of modeling of images which are formed during the interaction between x- radiation and materials / S.Zascanov, N.Ilyasova, A.Kupriyanov // Proceedings of 8th Open German-Russian Workshop «pattern recognition and image understanding» OGRW-8-2011, November 21-26, Nizhny Novgorod, The Russian Federation, 2011], статья [ Ильясова Н.Ю. Исследование свойств внутриглазного инородного тела на основе анализа 144 рентгенографических изображений черепа/Ильясова Н.Ю., Куприянов А.В., Устинов А.В. // Сб. Компьютерная оптика. Т. 35, N 2,2011.–265-271]. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНТЕРФЕЙСА МОЗГ–КОМПЬЮТЕР ДЛЯ РЕАБИЛИТАЦИИ БОЛЬНЫХ С ДВИГАТЕЛЬНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ А.А.Фролов1), Л.А.Черникова2), В.Ю.Рощин1), А.М.Бадаква3) Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва; 2)Научный центр неврологии РАМН, Москва; 3) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 1) Известно, что повторяющиеся активные целенаправленные движения значительно способствуют восстановлению двигательных функций. Практически этот подход в течение последних 10 лет реализован в таких эффективных методах реабилитации, как тренировка в условиях виртуальной реальности и в условиях, когда движения облегчаются экзоскелетоном. Однако этот подход требует сохранения возможности совершать активные движения больной рукой или ногой и, следовательно, требует частичного сохранения двигательных функций. Если эти функции не сохранились, то перспективным методом стимулирования пластичности мозга остается только воображение движений. Как показано во многих работах, воображение движений подчиняется тем же принципам двигательного контроля и поэтому может стимулировать те же пластические механизмы мозга, что и их реальное исполнение. Именно на этом основаны ожидания высокой эффективности интерфейса мозг–компьютер (ИМК) как средства двигательной реабилитации. В 2011 г. в экспериментах с использованием ИМК, основанного на классификации паттернов ЭЭГ при воображении движений рук, участвовали 4 здоровых испытуемых в возрасте от 50 до 70 лет и 4 постинсультных больных в возрасте от 40 до 70 лет. Все испытуемые продемонстрировали способность управлять ИМК, сравнимую с показателями исследованной ранее группы испытуемых в возрасте от 20 до 30 лет. По данным ЭЭГ и фМРТ исследований выявлены основные источники активности мозга, обеспечивающие высокую эффективность управления ИМК. Показано, что эти источники расположены в глубине центральной борозды в области представительства рук. У трех из четырех больных тренировка с 145 использованием ИМК в течение 9–12 дней привела к улучшению движений паретичной руки в 3-5 раз по показателю ARAT, что является очень обнадеживающим результатом для оценки эффективности ИМК в реабилитации постинсультных больных. Другая возможность использования ИМК – социальная реабилитация больных с полной потерей двигательных функций. В этом случае ИМК может оказаться наиболее эффективным средством восстановления их контакта с внешним миром. Естественно, что принципиальные вопросы его разработки и исследования решаются в экспериментах на обезьянах. Исследования 2011 г. проведены на 2 обезьянах Macaca mulatta. Животные были обучены выполнению двигательной задачи управления курсором на экране компьютера с помощью джойстика. В 2011 г. разработано техническое и программное обеспечение многоканальной регистрации нейронных сигналов в полосе 1-10000 Гц и программное обеспечение для классификации паттернов низкочастотной, мультиклеточной и спайковой активности с целью формирования команд управления курсором непосредственно сигналами мозга без использования джойстика. Проведенные эксперименты позволили приступить к изготовлению действующего макета ИМК, с помощью которого в 2012 г. будет осуществляться тренировка обезьян ментальному управлению курсором и будет проведено сравнение эффективностей классификаторов, настроенных на анализ разных типов активности мозга. ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПОЛИГРАФИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС НА БАЗЕ УСТРОЙСТВА «ПОЛИГРАФ-СИНХРОНИЗАТОР ЛБМИ-001»: РАЗРАБОТКА ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТЫ ПО РАСПОЗНАВАНИЮ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЧЕЛОВЕКА Р.М.Юсупов1), Е.Л.Вассерман1)2)3) О.В.Жвалевский1), Н.К.Карташев1), С.Б.Рудницкий1) Санкт-Петербургский ин-т информатики и автоматизации РАН, Санкт-Петербург; 2)Санкт-Петербургский государственный ун-т, Санкт-Петербург; 3)Российский государственный педагогический ун-т им. А.И.Герцена, Санкт-Петербург 1) 146 В процессе создания измерительного комплекса для диагностики функционального состояния (ФС) человека на основе комплексной обработки биометрических данных мы столкнулись с проблемой организации синхронной регистрации физиологической информации с помощью закрытых программно-аппаратных комплексов разных производителей и персонального компьютера (ПК), работающего под управлением операционной системы с разделением времени. Преодолеть её удалось, доработав измерительный комплекс и включив в его состав новое, разработанное нами устройство с уникальным набором функций — синхронизатор, формирующий импульсы для подачи на свободные входы медицинской аппаратуры, или, если таких входов нет, для подмешивания к измеряемому аппаратурой сигналу. Готовое устройство получило наименование «Полиграф-синхронизатор ЛБМИ-001»; сейчас мы располагаем тремя экземплярами этого устройства, которых достаточно для параллельно осуществляемых экспериментальных и экспериментально-клинических исследований. Изначально «Полиграф-синхронизатор ЛБМИ-001» был предназначен для синхронизации электроэнцефалографа, видеокамеры и диктофона, однако для расширения возможностей его использования в набор выходов синхронизации мы включили несколько вакантных каналов с настраиваемыми характеристиками. Кроме этого, в нем теперь реализована оцифровка электрокардиограммы, пульсоксиметрического сигнала, пневмограммы, кожно-гальванической реакции и сигнала от кнопок отметки событий. Также в устройстве предусмотрено несколько вакантных входных каналов и канал оцифровки внешнего аудиосигнала. В конструкцию и электрическую схему устройства мы заложили возможность каскадирования с одновременным подключением нескольких экземпляров устройства к одному ПК и обеспечением синхронизации всех экземпляров между собой на аппаратном уровне. По результатам испытаний устройства «Полиграф-синхронизатор ЛБМИ-001» было доработано системное программное обес-печение и разработано полнофункциональное пользовательское, в котором все органы управления ходом измерительного экспери-мента сосредоточены в единой программной оболочке. Были также предложены и программно реализованы подходы, позволяющие конечному пользователю 147 самостоятельно задавать план проведения эксперимента и возможные его сценарии. Для проведения экспери-ментов по дихотическому предъявлению звуковых стимулов с синхронной регистрацией электроэнцефалограммы (ЭЭГ) были модифицированы разработанные нами ранее оригинальные программы «Дихотик» [свид. о регистрации ОФАП № 11777] и «EEG Editor» [свид. о регистрации ФИПС № 2011616539], а также техническая реализация стимульного материала. Была проведена пилотная серия экспериментов по дихотическому предъявлению вербальных звуковых стимулов с синхронной регистрацией ЭЭГ, ответов испытуемого и последующим автоматическим распознаванием ЭЭГ-паттернов, отражающих стереотипное кратковременное изменение ФС коры полушарий большого мозга в виде активации слухоречевых зон в процессе распознавания речевых стимулов. Асимметрия паттернов позволяет судить о преимущественной латерализации речевых функций у испытуемого. Для распознавания ФС использовался мажоритарный принцип применительно к результатам сопоставления полученного набора ЭЭГ-паттернов с эталонами и алгоритмы ограниченного перебора. 5. Лекарственные препараты МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА С S-ЛИГАНДАМИ – СТРУКТУРНЫМИ АНАЛОГАМИ ПИРИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ ДНК С.М.Алдошин1), Н.А.Санина1), О.С.Жукова2), А.А.Терентьев1) Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка 2) РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 1) Поиск новых эффективных доноров монооксида азота (NO) класса сера-нитрозильных комплексов железа (СНКЖ) и изучение молекулярно-генетических механизмов их действия на расширенной панели линий опухолевых клеток человека и экспериментальных животных являются необходимыми этапами 148 создания перспективных инновационных NO-препаратов для химиотерапии злокачественных образований. В ИПХФ РАН cинтезированы и охарактеризованы физикохимическими методами новые нитрозильные комплексы железа cостава [Fe2(SR)2(NO)4] с R-тиолилами – структурными аналогами пиридиновых оснований ДНК ряда фенола, тиопиридина, тиопиримидина и их аминопроизводных. Выполнено тестирование цитоксической активности синтезированных комплексов стандартным МТТ-тестом на опухолевых клетках человека различного генеза: линии A549 (немелкохклеточный рак легкого), SCOV-3 (карцинома яичника), LS-174T (карцинома толстого кишечника), H1299 (немелкоклеточная карцинома легкого человека), MCF7 (аденокарцинома молочной железы человека) и HeLa (аденокарцинома шейки матки человека). Нитрозильные комплексы железа с различными функциональными лигандами-антиметаболитами пиридиновых оснований ДНК продемонстрировали различный антипролиферативный эффект, при этом наиболее широкий спектр цитотоксической активности выявлен для комплекса с R=2-аминофенолилом (значения IC50, мкМ составляют 27 (SCOV3), 37 (LS174T), 74 (MCF7) и 25 (A549)). Цитотоксичность СНКЖ может определяться NO, генерируемым ими при гидролизе, а также серосодержащими тиолилами, входящими в состав комплексов и образующимися при их распаде. Для выявления роли лигандов в общей цитотоксичности СНКЖ проведен сравнительный анализ цитотоксичности синтезированных комплексов и потенциальных продуктов их распада. Комплексы с 2аминотиофенолом и тиофенолом обладают сходной цитотоксичностью, при этом дозы IC50 для этих комплексов вдвое превышает цитотоксичность соответствующих лигандов. По данным масс-спектрометрии, в водных растворах происходит полный распад комплексов: из 1 моля комплекса высвобождается 2 моля соответствующего лиганда. Двукратное превышение цитотоксичности СНКЖ над цитотоксичностью их лигандов хорошо согласуется с моделью полного распада комплексов до цитотоксичных лигандов. С другой стороны, обнаружены существенные (более чем в 5 раз) различия в цитотоксичности нитрозильного комплекса железа с 4-аминотиофенолом и его 149 лигандом. Комплекс проявляет высокую активность на клетках HeLa. Предположительно, основным активным веществом при действии на опухолевые клетки является генерируемый комплексом NO. По данным окрашивания клеток FITC-меченным аннексином V и йодистым пропидием с использованием проточной цитофлуориметрии установлено, что комплекс с 4-аминотиофенолом вызывает апоптотическую гибель клеток. Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН “ Фундаментальные науки – медицине”. ПОИСК НОВЫХ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПРЯМЫХ ИНГИБИТОРОВ ТРОМБИНА Ф.И.Атауллаханов1,2), Е.И.Синауридзе1,2), И.В.Грибкова1,2), А.С.Горбатенко1) 1) Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва; 2) ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития РФ, Москва Цель и задачи работы: Целью работы является разработка новых прямых низкомолекулярных ингибиторов тромбина для создания отечественных антитромботических препаратов и улучшения антитромботической терапии. Ранее нами были сконструированы, синтезированы и протестированы на способность прямо ингибировать тромбин в чистом буферном растворе новые низкомолекулярные лиганды нескольких классов. Были отобраны соединения, имеющие максимальную ингибирующую активность. Однако способность того или иного соединения ингибировать работу системы свертывания в плазме (т.е. его антикоагулянтная активность, непосредственно связанная с антитромботическими свойствами) определяется не только его способностью прямо ингибировать тромбин, но также возможными взаимодействиями этого соединения с другими факторами свертывания и белками плазмы. В задачи данной работы входило тестирование антикоагулянтной активности лучших из ранее синтезированных нами ингибиторов тромбина in vitro. 150 Методы: состояние системы свертывания при определении антикоагулянтного действия исследуемых соединений оценивали, используя тест генерации тромбина и измеряя тромбодинамику (т.е. скорость роста сгустка в пространстве) в присутствии различных концентраций данных соединений. Активацию свертывания в обоих тестах проводили по внешнему пути с помощью тканевого тромбопластина: либо добавленного в гомогенную систему (тест генерации тромбина), либо иммобилизованного на поверхности неподвижного локального активатора при измерении тромбодинамики. Результаты: 1) Тест генерации тромбина позволяет оценить суммарное количество активного тромбина, образующегося в образце плазмы в ответ на стандартную активацию. В качестве параметра для оценки этого количества была выбрана площадь под кривой зависимости концентрации тромбина в пробе от времени (эндогенный тромбиновый потенциал (ЭТП)). Генерацию тромбина измеряли в образцах нормальной плазмы, а также в той же плазме в присутствии различных концентраций исследуемых ингибиторов. Эффективность антикоагулянтного действия определяется эффективностью снижения ЭТП в присутствии ингибитора. Для характеристики этой эффективности были определены концентрации ингибиторов, вызывающие 50 % снижение ЭТП (IC50 ЭТП). Для лучших из исследованных соединений эти величины оказались лежащими в интервале 0.1– 0.26 мкМ и были ниже, чем аналогичная величина у единственного, применяемого в клинике для внутривенных инъекций, низкомолекулярного ингибитора тромбина – аргатробана (0.65 мкМ). 2) По результатам измерения влияния новых ингибиторов на ЭТП было отобрано 8 наиболее эффективных соединений. Затем было подробно исследовано влияния этих соединений на пространственную динамику свертывания крови. Измерения были проведены на оригинальной установке, сконструированной в лаборатории физической биохимии Гематологического научного центра. Концентрации различных ингибиторов, вызывающие снижение стационарной скорости роста сгустка в 2 раза (IC50 сгустка), находились в интервале 7.5–100 мкМ (аналогичная величина для аргатробана составляет 9.0 мкМ). 151 Выводы: Полученные результаты показали, что лучшие из новых прямых ингибиторов тромбина являются высокоэффективными антикоагулянтами в плазме, сравнимыми или превосходящими по показателям применяемый в клинике аргатробан. Работа выполнена в рамках проекта «Фундаментальные науки – медицине». НАНОРАЗМЕРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПОЛИМЕР-ПОРФИРИН – НОВАЯ ФОРМА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ГНОЙНЫХ РАН И НОВООБРАЗОВАНИЙ КОЖИ А.А.Берлин 1), А.Б.Соловьева1), Н.А.Аксенова1), Н.Н.Глаголев1), П.И.Толстых2), А.В.Иванов3) Институт химической физики им.Н.Н.Семенова РАН, Государственный научный центр лазерной медицины 3) Российский онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина 1) 2) Фотодинамическая терапия (ФДТ), наиболее органощадящий метод лечения рака, основана на способности порфириновых фотосенсибилизаторов накапливаться в патологических клетках и тканях и передавать энергию фотовозбуждения молекулярному кислороду, переходящему при этом в синглетное 1О2 состояние. 1О2 – активный окислитель, при взаимодействии с клетками вызывает их необратимые изменения, что приводит к их гибели. Однако эффективность ФДТ остается невысокой, поскольку время жизни 1 О2 в клетке не превышает 10 мкс. Кроме того, накопление достаточной концентрации ПФС в очаге поражения обычно сопровождается его высоким содержанием во всем организме, что является причиной повышенной светочувствительности пациентов в течение длительного времени. Поэтому увеличение эффективности и снижение доз фотосенсибилизаторов является важнейшей задачей дальнейшего развития ФДТ. Ранее нами было показано, что комплексообразование некоторых амфифильных полимеров, не содержащих фотоактивные группировки (АП), в том числе плюроника F-127, поливинилпирролидона (ПВП) и поливинилового спирта (ПВС) с водорастворимыми ПФС, повышает эффективность воздействия ФДТ на опухолевые клетки в культуре и опухоли у экспериментальных 152 животных в 10–30 раз, что позволяет более чем на порядок снизить концентрации фотосенсибилизаторов. [Патент РФ 2314806, 2008]. В рамках выполнения проектов (2009–2011 гг.) по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» было обнаружено, что комплексы амфифильных полимеров с фотодитазином (N-метил-ди-D-глюкаминовая соль хлорина е6) – препаратом, применяемым сейчас в клинической практике, высокоэффективны при фотодинамическом воздействии на инфицированные огнестрельные раны у лабораторных животных и гнойные раны у пациентов на всех стадиях раневого процесса (патент РФ 2396994). Было обнаружено также, что в модельных условиях в процессе фотоокисления триптофана в водной фазе добавление указанных полимеров увеличивает активность водорастворимых ПФС разной структуры, в том числе карборанзамещенного тетрафторфенилпорфирина, хлорина е6 и димегина (динатриевой соли протопорфирина). Обнаруженный феномен, определяемый как «полимерный эффект», согласно данным ПМР и флуоресцентной спектроскопии, обусловлен образованием комплексов АП-ПФС, предотвращающих обычно происходящую в водных растворах агрегацию порфиринов, снижающую фотосенсибилизирующую активность ПФС. Комплексы АП-ПФС оказались также высокоактивны при фотодинамической терапии осложненных ожогов у детей. В этих случаях использовались комплексы фотодитазина с ПВП и ПВС. При этом наблюдалось ускоренное очищение ран от раневого детрита с уменьшением микробной обсемененности, происходило ускорение перехода воспалительной фазы раневого процесса в репаративную. Происходило сокращение сроков заживления на 7-9 суток по сравнению с традиционным методом лечения и с обработкой осложненных ожогов методом ФДТ с использованием растворов или коммерческих гелей с той же концентрацией фотодитазина (на 2-3 суток). В дальнейшем планируется установить биологический механизм обнаруженного эффекта. 153 БОР- И АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ ЦИКЛИЧЕСКИЕ И КАРКАСНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ: ВИРУССТАТИЧЕСКОЕ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ Ю.Н.Бубнов1), М.М.Зубаиров2) Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН, Москва;2)ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, Покров, Владимирская обл. 1) Грипп – тяжелая вирусная инфекция, по скорости своего распространения (в виде эпидемий и пандемий) заметно опережающая все другие инфекционные заболевания. Эпидемии гриппа случаются каждый год и поражают до 15 % населения земного шара. Грипп и ОРВИ составляют 95 % всех инфекционных заболеваний в мире. Ежегодно в мире заболевают до 500 млн. человек, 2 миллиона из которых умирают. В России ежегодно регистрируют от 27 до 40 млн. заболевших гриппом и другими ОРВИ. Ранее в результате биологических испытаний ряда производных 1-бораадамантана (впервые синтезированного нами) были выявлены два препарата-лидера БГ-122 и БГ-44, обладающие лечебным и профилактическим действием против R'NH2 различных штаммов гриппа домашней птицы и человека, включая Н5N1 и H1N1. R B В 2011 г. нами были продолжены исследования антивирусного действия препарата БГ-122 в составе липосом. Этот препарат активно адсорбируется на поверхности липосом, причем оптимальными БГ-122 БГ-44 концентрациями являются дозы 1–10 мкг/мл (10-6– 10-7 М). Установлено, что размножение вируса чумы птиц существенно снижается в присутствии липосом, содержащих БГ-122, причем вирусингибирующее действие препарата обусловлено нарушением целостности мембран вирионов в результате изменения фазовых свойств липидов, входящих в состав мембран. Для расширения круга новых бор-содержащих соединений, обладающих антивирусным действием, нами синтезирована (на основе созданной в ИОХ и ИНЭОС РАН «борной» методологии) серия новых комплексов 1-бораадамантана с диалкиламинами, производным пиридина (аминами, кислотами, их солями, гидразидами и др.), с дейтифорином, бензимидазолом и другими азотистыми 154 основаниями. Выяснилось (10-дневные куриные эмбрионы, вирус гриппа А птиц H5N1, штамм А/курица/Курган/1/05), что только комплекс 2-метил-1-бораадамантана с дейтифорином обладает сравнимой с БГ-122 активностью. В поисках технологичных способов получения 1-бораадамантановых препаратов мы разработали новую методологию, основанную на конденсации триаллилборана со смесью метилацетилена и аллена (сжигаемая в факелах фракция углеводородов С-3 нефти некоторых месторождений). THF RNH2 )3B + H2C C CH2 + MeC CH 1. 145 °C B RNH2 B 2. MeOH 3. H3.B THF Работа выполнена при поддержке Президента РФ (грант НШ7946.2010.3), Президиума РАН (программы акад. А.И.Григорьева и акад. В.А.Тартаковского) и ОХНМ РАН (программа ОХ-09, координатор акад. Н.С. Зефиров). НОВЫЕ ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ КЛАССА ОКСАЗОЛОВ ДЛЯ РАДИОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ Е.Б.Бурлакова1), Ф.С.Духович 2), Г.П.Жижина1), Т.М.Заварыкина1), Ю.А.Трещенкова1), Л.Д.Фаткуллина1 Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва 2) ФГУП ГНИИ органической химии и технологии, Москва 1) Важнейшей проблемой развития лучевой радиотерапии злокачественных опухолей является подбор препаратов, селективно повышающих радиочувствительность опухолей по сравнению с окружающими нормальными тканями. Целью настоящего проекта является выявление таких свойств у препаратов из класса производных оксазола, способных трансформировать энергию ионизирующей радиации (ИР) в световую и тепловую формы энергии. Наибольшей эффективностью трансформировать энергию ИР обладают два соединения из класса оксазолов: 2,5-дифенил155 оксазол (ДФО) и 1,4-ди[2-(5-фенилоксазолил)]бензол (ДФОБ). Ранее было показано, что эти соединения в зависимости от их дозы проявляют радиозащитное или радиосенсибилизирующее действие при рентгеновском облучении мышей. Введение 20 мг/кг и 30 мг/кг ДФОБ на 2-е сутки после перевивки аденокарциномы Акатол (латентный период) не влияет на среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей линии Balb/с и скорость роста опухоли. Облучение в дозе 2 Гр (75 сГр/мин) снижает СПЖ мышей на 15 % и незначительно тормозит рост этой солидной опухоли. Совместное действие 20 мг/кг или 30 мг/кг ДФОБ и облучения в дозе 2 Гр, а также 20 мг/кг ДФОБ и облучения в дозе 3 Гр сильнее тормозит рост опухоли Акатол, увеличивая СПЖ мышей. При воздействии на медленно растущую солидную опухоль – меланому мышей – сочетанное действие ДФОБ и ИР более эффективно. Это указывает на возможность селективной радиосенсибилизации опухоли при повторных введениях препарата ДФОБ и облучении дозами, не превышающими величину доз (3-4 Гр), используемых при радиотерапии людей, больных раком. Применение каждого препарата требует знания его фармакодинамики, поэтому изучено изменение биохимических и биофизических характеристик тканей после введения ДФОБ на 6 сутки роста опухоли. Как было показано ранее, мыши с опухолью Акатол в латентный период (2–6 сутки) характеризуются повышением количества МДА в эритроцитах, снижением активности СОД и глутатион-пероксидазы в клетках печени, что указывает на снижение АО статуса мышей, и увеличением количества двунитевых разрывов (ДР) ДНК селезенки. Наблюдается также снижение микровязкости мембран эритроцитов в липидном бислое и в прибелковых липидах и повышение в 3 раза активности ЛДГ (гликолиза) в клетках мозга. В период активного роста опухоли (11– 15 сутки) количество ДР ДНК продолжает повышаться, но активность ЛДГ в опухолевых клетках снижается на 40 %. Введение мышам 20 мг/кг ДФОБ сопровождается незначительным влиянием на ДНК и нормализацией параметров ПОЛ (содержание МДА и гемолиз эритроцитов) в крови. Совместное действие ИР в дозе 2 Гр и 20 мг/кг ДФОБ, введенного до облучения, повышает содержание МДА, активность ЛДГ и количество ДР ДНК селезенки, снижая микровязкость мембран эритроцитов, т.е. прояв156 ляет сенсибилизирующий эффект. Комбинация 30 мг/кг ДФОБ и облучения в дозе 2 Гр, вызывающая уменьшение уровня ПОЛ в крови, активности ЛДГ в клетках мозга и количество повреждений структуры ДНК, снижает характеристики, повышающиеся с ростом опухоли, т.е. оказывает радиозащитное действие. Получены результаты, позволяющие предположить, что тщательный подбор доз препарата ДФОБ и доз облучения ИР позволит получить разнонаправленное действие на опухоль и организм, т.е. сенсибилизировать опухоль с наименьшим влиянием на организм опухоленосителя при кратных сеансах радиотерапии. НОВЫЕ ОБЕЗБОЛИВАЮЩИЕ СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ АНАЛЬГЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ Е.В.Гришин, С.А.Козлов, Ю.В.Королькова, С.Г.Кошелев, И.В.Мошарова, А.А.Василевский, М.Ю.Сачкова, Д.И.Осмаков, П.Б.Опарин, Я.А.Андреев Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Чувствительные рецепторы сенсорных нейронов (TRPV1, TRPA1, TRPV3, ASIC3 и P2X) являются важными фармакологическими мишенями для коррекции различных патологических состояний. Модуляторы активности этих рецепторов являются перспективными с точки зрения создания лекарственных препаратов нового поколения. Вещества природного происхождения (низкомолекулярные органические соединения и пептиды) являются уникальными молекулярными инструментами для фундаментальных исследований клеточных рецепторных систем и каналов. Пептиды, выделенные из ядов различных животных, проявляют совершенно уникальную специфичность действия, что позволяет использовать их либо как лекарственные средства, либо как основу для создания препаратов-пептидомиметиков. Изучение влияния полипептидных модуляторов TRPV1 рецептора (АРНС1, АРНС2, АРНС3) на токи, вызываемые различными активаторами данного рецептора, показало, что эти молекулы обладают уникальной особенностью по-разному влиять на различные варианты активации рецептора. В тестах in vivo (горячая пластина, CFA-тест, формалиновый тест и т.д.) была выявлена значительная анальгетическая активность полипептидов АРНС1-3. 157 Причем эффективность каждого полипептида в конкрет-ной in vivo модели боли или воспаления зависела от его ингибирующего влияния на определенный тип активации TRPV1. Таким образом, набор полипептидов с различными свойствами может послужить основой для создания антагонистов TRPV1 с нужными свойствами. Проведено тестирование различных природных образцов на присутствие в них компонентов, способных модулировать активность рецепторов ASIC3, экспрессированных в ооцитах лягушки Xenopus laevis. В ходе работы были обнаружены низкомолекулярный компонент из экстракта чабреца (Thymus sp.) и пептидный компонент камчатской морской анемоны Utricina grebelny, ингибирующие активность ASIC3 рецептора. Была установлена структура этих компонентов, а также структура кДНК кодирующая пептидных компонент. Особенностью новых ингибиторов ASIC3 рецептора от единственного уже известного селективного антагониста APETx2 является способность ингибировать не только быструю компоненту ответа рецептора, но и длительную компоненту, которая, как предполагается, играет основную роль в развитии боли при патологических состояниях. Таким образом, была проведена более детальная функциональная характеристика анальгетических пептидов АРНС1–3. А также получены новые природные молекулы ингибирующие ASIC3 рецептор. КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ И СКРИНИНГ ИНГИБИТОРОВ СЕРИН-ТРЕОНИНОВОЙ ПРОТЕИНКИНАЗЫ STREPTOMYCES PK17 – МОДУЛЯТОРОВ ПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ АКТИНОБАКТЕРИЙ. В.Н.Даниленко, Д.А.Маслов, О.Б.Беккер, М.Г.Алексеева, Д.А.Мавлетова Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва, Россия Современный подход в борьбе с инфекционными заболеванииями предполагает целенаправленное поражение механизмов обеспечения жизнедеятельности клеток микроорганизмов. Ингибирование этих механизмов индуцирует программированную гибель (ПГ). Серин-треониновые протеинкиназы (СТПК) эукариотического типа 158 идентифицированы у большинства актинобактерий, в том числе у патогенных видов Mycobacterium, Streptococcus и др. Эти ферменты участвуют в фенотипах вирулентности, патогенности, лекарственной устойчивости бактерий. ПГ описана для различных групп бактерий, в том числе рода Streptomyces [1, 2, 3]. Ингибиторы СТПК, конкурентно замещающие АТФ в аденин-связывающем кармане, могут быть потенциальными лекарствами нового механизма действия. Проведена классификация СТПК эукариотического типа по аминокислотной последовательности аденин-связывающего кармана каталитического домена, в результате которой протеинкиназы разделены на 20 групп. В группу гомологов протеинкиназы AfsK, предположительно участвующих в процессе ПГ [2], входят СТПК таких патогенов, как Frankia и Nocardia [4]. В 2010 году нами была сконструирована и валидирована тестсистема E. coli lpk17/aphVIII, ключевым элементом которой является аминогликозидфосфотрансфераза типа 8 (APHVIII), придающая клеткам устойчивость к аминогликозидному антибиотику каннамицину [5, 6, 7]. В гене aphVIII была модифицирована область фосфорилирования S-146 с целью приблизить ее последовательность к последовательности сайта автофосфорилирования СТПК LPK17 S. lividans. Недостатком полученной конструкции являлся недостаточно большой диапазон устойчивости к канамицину клеток, содержащих ген aphVIII и протеинкиназы, и клеток, несущих только ген aphVIII, что связано с низким уровнем экспрессии гена aphVIII. Были созданы новые генетические конструкции в векторе pET32a, в которых под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага T7 были поставлены ген aphVIII и нуклеотидная последовательность каталитического домена lpk17, слитая с последовательностью тиоредоксина. Каждый ген имел свой энхансер и сайт связывания с рибосомой. Полученные новые конструкции E. coli aphVIII/lpk17 оказались устойчивыми к канамицину в концентрациях на два порядка превышающих предыдущие. Для валидации тест-системы использованы стандартные ингибиторы СТПК класса индолилмалеимидов [5]. В результате скрининга были отобраны ингибиторы СТПК, вызывающие программированный лизис S. lividans. Сконструированная тест-система может быть использована для отбора ингибиторов протеинкиназы LPK17 S. lividans, а также протеинкиназ патогенных бактерий рода Frankia и Nocardia [4]. 159 1. Прозоров А. А. и Даниленко В.Н. Микробиология, 2010, т. 79, № 2, с. 147-159. 2. Manteca A. et al. Proteomics. 2006. V. 6. N22. P. 6008-6022. 3. Беккер О. Б. и др. Микробиология. 2012. В печати. 4. Zakharevich N. V. et al. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2011, in press. 5. Danilenko V. et al. Journal of Medicinal Chemistry. 2008. V. 51. N 24. P.7731-7736. 6. Danilenko V.N. et. al. Current Topics in Medicinal Chemistry 2011. V. 11. N. 11. P.1352-69. 7. Беккер О. Б. и др. ActaNature 2010, т. 2 № 3(6), 126-39. НОВЫЕ ВАРИАНТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С.М.Деев, О.А.Стремовский, С.В.Лукаш, Ю.М.Ходарович Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Рекомбинантные антитела, направленные против опухолеассоциированных антигенов, являются сравнительно новым и эффективным классом противоопухолевых препаратов. Однако рекомбинантное антитело не всегда способно эффективно воздействовать на опухоль, даже если на поверхности опухолевых клеток есть соответствующий антиген. Это связано в значительной степени с тем, что некоторые опухоли вырабатывают механизм подавления антителозависимой цитотоксичности. Так, существующий в настоящее время препарат "Герцептин" содержит антитело против рецептора HER2/neu, который гиперэкспрессирован в 30 % опухолей молочной железы. Применение препарата существенно улучшает результаты лечения опухоли, однако часть HER2/neu-положительных опухолей проявляют резистентность к этому препарату. Для преодоления устойчивости опухолей к стандартным антителам нами было сделано два новых варианта антитела. Первое антитело представляет собой полноразмерное антитело - аналог "Герцептина" IgE изотипа. Мы ожидаем, что антитела IgE изотипа, связанные с опухолью, будут запускать реакцию эффекторных клеток, таких как Th2 клетки, моноциты, эозинофилы и базофилы, и, таким образом, будут стимулировать воспалительный процесс, направленный против опухоли. Была продемонстрирована эффективная экспресс160 сия этого антитела в культурах клеток эукариот и получены стабильные линии – продуценты антитела. Показано, что антитело связывается с антигеном с константой диссоциации 0.7 нМ, что примерно соответствует константе диссоциации герцептина (0.1 нМ). В настоящее время проводится изучение цитотоксических свойств антитела на культуре клеток аденокарциномы яичника человека SKOV3. Второй вариант антитела представляет собой иммуноконъюгат мини-антитела с рибонуклеазой барназой. В предварительных исследованиях нами было показано, что подобный иммуноконъюгат, называемый иммуноРНКазой, сконструированный на основе мини-антител и рибонуклеазы барназы и полученный в бактериальной экспрессирующей системе, обладает селективностью антитела и высокой цитотоксичностью, обусловленной действием рибонуклеазы. Нами была создана генно-инженерная конструкция, предназначенная для экспрессии и секреции иммуноРНКазы в культуре клеток млекопитающих. Было показано, что барназа сохраняет рибонуклеазную активность в составе иммуноРНКазы, а сама иммуноРНКаза секретируется из клеток. Данная конструкция была использована для трансфекции линии клеток SKOV-3. Клетки SKOV-3 гиперэкспрессируют на своей поверхности рецептор HER2/neu и, таким образом, должны быть чувствительны к действию иммуноРНКазы. Было показано, что в отличие от чистой барназы иммуноРНКаза не оказывает заметного цитотоксического действия. Причины более низкой цитотоксичности иммуноРНКазы в настоящее время изучаются. ФУНКЦИОНАЛЬНОЗАМЕЩЕННЫЕ ФУЛЛЕРЕНЫ В СИНТЕЗЕ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ У.М.Джемилев, А.Р.Туктаров, А.Р.Ахметов, И.Р.Яруллин Институт нефтехимии и катализа РАН, Уфа В развитие проводимых в Институте нефтехимии и катализа РАН фундаментальных и прикладных исследований по разработке и продвижению в медицинскую практику нового поколения лекарственных препаратов на основе функциональнозамещенных производных углеродных кластеров (фуллеренов С60 и С70) продолжены работы по созданию перспективных для практического 161 применения методов синтеза имино-, азидо- и аминофуллеренов, представляющих интерес для получения потенциальных биологически активных веществ с широким спектром фармакологического действия. Согласно литературным данным у производных С60-фуллерена выявлена способность встраиваться в полость ВИЧ-протеазы. Учитывая, что каталитический сайт последней содержит два остатка аспарагиновой кислоты (Asp25 и Asp125), можно было предположить, что введение в фуллереновый кор основных имино-, азидо- и аминогрупп приведет к их взаимодействию с аминокислотными остатками фермента. При этом расчетными методами показано, что высокую анти-ВИЧ активность будут проявлять аминофуллерены, в которых аминогруппы непосредственно связаны с фуллереновым остовом. К моменту начала наших исследований в мировой литературе отсутствовали препаративные методы синтеза аминофуллеренов. В результате реализации программы работ в рамках данного проекта нам удалось разработать эффективный одностадийный метод синтеза иминофуллеренов (незамещенных фуллероазиридинов) циклоприсоединением азотистоводородной кислоты, генерируемой in situ взаимодействием NaN3 с H2SO4, к фуллерену С60 в условиях термической (60 оС, 3 ч) и фотохимической (hv 300 nm, 500 W, 25 мин, толуол) реакций. Установлено, что с понижением температуры реакции с 60 до 40 оС удается осуществить синтез ранее не описанного N-незамещенного фуллеротриазолина с выходом ~15 %. При этом показано, что полученное [3+2]производное С60 малоустойчиво даже при комнатной температуре и постепенно разлагается с выделением N2 с образованием незамещенного фуллероазиридина. В продолжение этих исследований мы изучили реакцию фуллерена С60 с галогеназидами (IN3, ClN3, BrN3). В результате впервые удалось осуществить синтез 1,2-диазидофуллерена с достаточно высокими выходами (~80 %). Структура последнего доказана с помощью масс- и ИК-спектроскопии, а также путем химических трансформаций азидофуллерена. Так, при взаимодействии 1,2-азидофуллерена с трифенилфосфином происходит экструзия двух молекул азота и образование соответствующего иминофосфорана. Восстановление азидогруппы 162 молекулярным водородом на Pd/C дает труднорастворимый осадок в органических растворителях, масс-спектр MALDI TOF которого показал наличие двух аминогрупп, связанных непосредственно с каркасом фуллерена. В настоящее время институтом (ИНК РАН) проводятся исследования по изучению области приложения разработанных методов синтеза имино-, азидо- и аминофуллеренов и физикохимических свойств последних, а также наработке перспективных образцов для фармакологических испытаний. ОЦЕНКА ПРИРОДНЫХ АНТИМУТАГЕНОВ (РАСТИТЕЛЬНЫЕ ЭКСТРАКТЫ, АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ) КАК ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ЧЕЛОВЕКА К МУТАГЕНАМКАНЦЕРОГЕНАМ Г.Д.Засухина1), Т.И.Одинцова1), И.М.Васильева1), В.Ф.Михайлов2), Ж.М.Шагирова2), И.А.Кадников3), М.В.Воронин3) Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН; 2)Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И.Бурназяна; 3) Учреждение Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт фармакологии им. В.В.Закусова РАМН 1) Гетерогенность популяции человека по критерию различной чувствительности к мутагенам (тяжелые металлы, радиация), с одной стороны, и возрастание загрязнения окружающей среды – с другой, подчеркивает высокую значимость проблемы разработки подходов к поддержанию стабильности организма. Антимутагены, большая часть которых обладает антиканцерогенными и адаптогенными свойствами, можно рассматривать как профилактические (для людей, контактирующих с радиацией или химическими веществами) и лечебные (для корреляции этиопатогенетического звена при некоторых наследственных заболеваниях) препараты. Наиболее перспективными антимутагенами являются растительные препараты и их фракции, которые характеризуются многовекторностью действия. Особое значение имеют антимикробные пептиды, в состав некоторых из них входит всего 45 аминокислот. Было проведено сравнение антимутагенной активности -пуротионина Тк163 АМР-ВР, дефензина и экстракта из проростков пшеницы T. kiharae, характеризующейся повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям. Антимутагенную активность оценивали по коэффициенту защиты, определяемому по количественному соотношению возникновения разрывов ДНК в клетках человека при воздействии хлорида кадмия. Оказалось, что -пуротионин обладает самой высокой антимутагенной активностью (коэффициент защиты составлял 85–88 % при концентрации пептида 20–80 мкг/мл), тогда как коэффициент защиты второго пептида при максимальной концентрации (80 мкг/мл) не превышал 79 %, а экстракта проростков – 73 % ( при концентрации 6 мг/мл). Механизм действия тионина был изучен в двух аспектах. Во-первых, исследованы структурные изменения в молекуле пуротионина при непосредственном взаимодействии с хлоридом кадмия: определялся спектр кругового дихроизма пептида в присутствии хлорида кадмия и было показано, что содержание элементов вторичной структуры в молекуле пуротионина не изменялось в присутствии солей кадмия, что свидетельствует об отсутствии предполагаемого взаимодействия. Второй аспект – изучение антирадикальных свойств пуротионина и экстракта проростков пшеницы в бесклеточной радикал-генерирующей системе Fe2+ + H2O2 люминол-зависимой хемилюминисценции. Были выявлены выраженные антирадикальные свойства тионина, но несколько ниже, чем антирадикальные свойства экстракта проростков пшеницы. Более высокая антирадикальная активность экстракта безусловно связана с наличием в экстракте большего числа компонентов (например, витаминов), обладающих антирадикальной активностью. Таким образом, нами разрабатывается новый класс антимутагенов – антимикробных пептидов, выделенных из растений. Антимикробные пептиды могут быть использованы для повышения устойчивости организма у людей, контактирующих с радиацией или химическими веществами, а также для лечения некоторых наследственных заболеваний, связанных, например, с нарушениями репарации ДНК. СОЗДАНИЕ МУЛЬТИТАРГЕТНЫХ (МИШЕНЬ ОРИЕНТИРОВАННЫХ) ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ 164 ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ СВОЙСТВАМИ Н.С.Зефиров1) , Н.В.Зык2), О.Н.Зефирова 1), Е.В.Нуриева 2) Институт физиологически активных веществ РАН Химический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова 1) 2) В проекте продолжены работы по синтезу и изучению соотношений «структура – активность» в рядах гибридных (двойных) соединений, объединяющих в своей молекуле колхицин – известный ингибитор полимеризации тубулина, а также замещенный или незамещенный адамантановый фрагмент (или его аналог). Ингибирующий эффект синтезированных соединений на пролиферацию клеток карциномы легких человека A549 был изучен в MTT тесте. Найдена структура-лидер, на порядок более активная, чем колхицин, и сравнимое по цитотоксичности с таксолом. ПОИСК ЭФФЕКТИВНЫХ МИШЕНЬ-ОРИЕНТИРОВАННЫХ НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ И АНТИНЕОПЛАСТОВ В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ ПРИРОДНЫХ АЛКАЛОИДОВ И АНТИБИОТИКОВ АНТРАЦИКЛИНОВОГО РЯДА, ОБЛАДАЮЩИХ МИТОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ С.Г.Клочков, Е.Ф.Шевцова, М.Е.Неганова, С.В.Афанасьева, А.Б.Ерматова, Е.С.Чудинова Учреждение Российской академии наук Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка При изучении триптаминовых производных секуринина и цитизина в качестве потенциальных нейропротекторов нами были получены данные об ингибировании кальций-индуцированного скачка митохондриальной проницаемости, что позволяет предположить возможность митопротекторного эффекта этих соединений. Для детального исследования активности синтезированных соединений необходимо было преодолеть основной их недостаток – плохую растворимость. Для этого были синтезированы водораст165 воримые и транспортные формы. Все полученные соединения исследованы на выживаемость, митохондриальный потенциал и ряд других характеристик первичных культур нейронов при глутаматной эксайтотоксичности и терт-бутилгидроксипероксид-вызванной гибели клеток. Дополнительно была проведена модификация антрациклиновых противораковых антибиотиков природными алкалоидами и сесквитерпеновыми лактонами. Преимуществами такой модификации является снижение кардиотоксичности, повышение растворимости и проницаемости соединений, возможность перорального применения. Поскольку для модификации использовались природные и модифицированные алкалоиды и сесквитерпеновые лактоны, проявляющие митопротекторную и цитотоксическую активность и эффективные в отношении одного из ключевых ферментов апоптоза – фарнезилтрансферазы, можно ожидать и повышения эффективности действия за счет дополнительного действия на новые биохимические мишени. Проведен скрининг полученных соединений в тестах ингибирования перекисного окисления липидов (ПОЛ), радикал-связывающей, металл-хелатирующей активности, изучено влияние ряда производных на функции митохондрий, изучена цитостатическая, цитотоксическая и фунгицидная активности, антибактериальная активность в отношении ряда грамм-положительных и граммотрицательных штаммов (Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Escherichia coli), влияние производных на жизненный цикл клеток HeLa, в том числе на цитотоксичность и цитоскелет клетки. Показано, что, хотя исходные лактоны не обладают антиоксидантной активностью, ряд производных проявляет антиоксидантную активность в низких концентрациях (менее 1мМ), синтезированные производные ингибируют ПОЛ и являются хелаторами Fe2+, проявляют радикал(ДФПГ)-связывающую активность и ингибируют активность липоксигеназы. Среди полученных производных антрациклиновых антибиотиков выявлены соединения с цитотоксической, фунгицидной и бактериостатической активностью. Детальное изучение их активности на клетках HeLa позволило предположить, что их действие помимо ингибирования образования онкогена ras связано с влиянием на механизм формирования цитосклета клетки. 166 Полученные данные свидетельствуют о наличии активности у синтезированных соединений и необходимости проведения исследований возможности их использования в качестве потенциальных нейропротекторов и антинеопластов с митопротекторным действием. 167 НА ПУТИ К СОЗДАНИЮ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АФФЕКТИВНЫХ РАССТРОЙСТВ И НАРУШЕНИЙ СНА НА ОСНОВЕ НОВОГО МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ДЕПРЕССИИ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ НА МЫШАХ: ПОИСК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ БИОМАРКЕРОВ В.М.Ковальзон1), Т.В.Стрекалова2),3), Н.С.Холод2),3), С.О.Бачурин2) Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН, Москва; 2)Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка; 3) Институт общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва 1) Ранее нами была разработана новая экспериментальная модель депрессивно-подобного состояния у мышей линии C57Bl/6, которое оценивается по снижению предпочтения подслащенного раствора в сравнении с обычной водой в ходе процедуры хронического комбинированного эмоционального стресса. Считается, что такое снижение указывает на развитие состояния, подобного агедонии – одного из ключевых симптомов депрессии у человека. Использованная модель предполагает возникновение агедонии лишь у части стрессированных животных; остальные мыши рассматриваются как устойчивые к стресс-индуцированной агедонии. Устойчивая группа животных представляет собой «функциональный контроль» эффектов стресса. Важным фактором формирования депрессивно-подобного состояния и стресса являются изменения активности гиппокампа, включающие морфологические нарушения и пролиферацию клеток. В рамках данного проекта мы предприняли попытку выяснить, как изменяется в нашей модели генная экспрессия в ткани гиппокампа у агедоничных мышей (в данной серии они составляли 54 % всех животных, подвергавшихся стрессу) – с одной стороны, и эмоционально-устойчивых – с другой, по сравнению с контрольными животными, не подвергавшимися стрессу. По окончании 2недельного периода стрессирования все животные были забиты, мозг извлечен и из ткани гиппокампа выделена мРНК. С помощью микрочипов исследован общий профиль генной экспрессии более 13 000 генов. У «депрессивных» мышей обнаружено усиление экспрессии 278 и подавление 174 генов, причем преобладающий характер наблюдавшихся генных изменений имел отношение к 168 эмоционально-негативным и тормозным процессам, таким, как предымпульсное торможение, долговременная и синаптическая депрессия и психологические нарушения. У «устойчивых» мышей наблюдалась повышенная экспрессия 924 генов и пониженная – лишь 29 генов. Здесь гены, повышавшие свою экспрессию, в основном имели отношение к биогенезу, образованию, росту и развитию клеток, нейритов и органелл, усилению метаболических процессов и выделения нейропередатчиков и активному поведению. Удалось определить также ряд генов, которые экспрессируются только у «агедоничных» мышей и потому могут являться кандидатами в биомаркеры депрессии. К этим генам относятся Insulin growth factor 2 (IGF-2) (нейротрофический фактор, вовлеченный в механизмы регенерации и консолидации гиппокамп-зависимой памяти), SERT (транспортер серотонина, ключевой регулятор серотонинергической системы мозга и индивидуальной устойчивости к депрессии у человека), PKA и Calmoduline kinase 4 (протеинкиназы, ключевые факторы гиппокамп-зависимой пластичности, предположительно связанные с механизмами агедонии). Продолжается идентификация и верификация еще ряда генов, на измененную экспрессию которых указали вышеприведенные данные оценки глобальной генной экспрессии. Обнаружено также разнонаправленное изменение в активности митохондриальных ферментов окислительного фосфорилирования в гиппокампе: «устойчивые» мыши проявили активацию их экспрессии, тогда как «агедоничные» – угнетение. ВЛИЯНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА КСИМЕДОН НА АКТИВАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ КЛЕТОК КРОВИ А.И.Коновалов1), И.Г.Мустафин2), Г.В.Черепнев3), В.С.Резник1) Институт органической и физической химии им. А.Е.Арбузова КНЦ РАН, Казань; 2)Казанский государственный медицинский университет, Казань; 3) Республиканская клиническая больница № 2 МЗ РТ, Казань 1) Отечественное лекарственное средство, негликозидный аналог пиримидин-нуклеозидов, ксимедон обладает регенерирующей, системной иммуномодулирующей, m-зависимой антиапоптогенной и нейрорегенерирующей активностью. 169 Раннее нами было установлено, что ксимедон регулирует m/BCL-2/BAG-1-зависимый механизм митохондриального пути индукции апоптоза. Был получен положительный эффект применения ксимедона у части больных ВИЧ-инфекцией, проявившийся в стабилизации основных показателей иммунной системы, «вирусной нагрузки», улучшении клинического статуса. Ксимедон в составе комплексной терапии больных ВИЧ-инфекцией обеспечивал выраженный иммунореабилитирующий эффект, заключающийся в стимуляции лейкопоэза и лимфопоэза с повышением содержания CD4+ лимфоцитов и снижением активации субпопуляций Т лимфоцитов (CD4+DR+, CD8+DR+, CD8+CD38+). Препарат повышал устойчивость лимфоцитов к спонтанному апоптозу (цитопротекторный эффект) и достоверно редуцировал частоту побочных эффектов ВААРТ (анемия, дислипопротеинемия, нейропатия). Учитывая полученный нами эффект снижения активации лимфоцитов лишь у части больных ВИЧ-инфекцией, находившихся на комплексной терапии с ксимедоном, мы провели исследование влияния препарата на активационные процессы клеток крови in vitro. Инкубация лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и тромбоцитов с ксимедоном в концентрации 10-4 и 10-6 M не вызывает in vitro активацию клеток и не изменяет экспрессию рецепторов. При моделировании in vitro ситуации, аналогичной in vivo, а именно, повышенное содержание клеток с признаками активации, было проведено активирование лимфоцитов (Лф) цитокинами (IL-2, IL-7, TNF-). В опыте, параллельно с добавлением в культуру Лф цитокинов, вносили ксимедон в концентрации 10-4 и 10-6 M. Активацию субпопуляций лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии по экспрессии маркеров CD38 и HLA-DR. Результаты исследования показали, что в ряде экспериментов ксимедон ингибировал активацию Лф, вызванную цитокинами, а в других опытах увеличивал активацию клеток. Было проведено моделирование продуктивного инфицирования лимфоцитов человека ВИЧ-1 in vitro. Для активации лимфоцитов клетки будут преинкубированы цитокинами (IL-2, IL-7, TNF-). В опыте, параллельно с добавлением в культуру клеток цитокинов, вносили ксимедон в конечной концентрации 10-4 и 10-6 M. Методом проточной цитофлуориметрии изучали активационный статус 170 CD4+- и CD8+-лимфоцитов и процент продуктивно инфицированных клеток по определению внутриклеточного белка ВИЧ р24. Результаты исследования показали, что ксимедон в ряде экспериментов ингибировал активацию лимфоцитов. При этом снижалось индуцированная цитокинами репликация ВИЧ-1, тогда как при повышении активации лимфоцитов и их субпопуляций было отмечено усиление вирусной продукции. Таким образом, были получены данные о разнонаправленном действии препарата ксимедон на цитокининдуцированную активацию лимфоцитов. Ксимедон, обладая способностью стабилизировать клеточные мембраны, снижает активацию и образование микровезикул лимфоцитами in vitro в условиях активации клеток цитокинами только в ряде случаев, что полностью согласуется с раннее полученными клиническими данными о разном типе ответа больных ВИЧ-инфекцией на комплексную терапию. НОВЫЕ АГЕНТЫ ПРОТИВОРАКОВОЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ С.В.Костров, А.В.Шубин, Н.А.Лунина, А.А.Комиссаров, И.В.Демидюк Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва Развитие противораковой генной терапии даёт надежду на разработку новых эффективных методов лечения рака. Лекарственные средства, созданные в рамках этой стратегии, в настоящее время находятся на разных стадиях испытаний, однако несколько препаратов уже допущены к применению в клинике. В то же время раковые опухоли многообразны, и не представляется возможным найти одно универсальное средство для лечения всех онкологических заболеваний. Задачей проекта является изучение возможности использования в качестве агентов противораковой терапии генов ряда протеолитических ферментов, которые могут стать основой для создания новых средств лечения онкологических заболеваний. На предыдущих этапах работы на модели двух клеточных линий рака легкого человека A549 и Calu-1 было протестировано цитотоксическое действие набора генов протеолитических 171 ферментов и показано, что ген протеазы 3С вируса гепатита А человека (3Cpro) эффективно вызывает клеточную гибель. На данном этапе работы была проведена оценка динамики гибели опухолевых клеток, экспрессирующих 3Cpro. После введения гена в течение всего времени эксперимента (8 суток) наблюдалось снижение количества живых клеток. Было обнаружено, что часть экспрессирующих 3Cpro клеток гибнет с проявлением морфологических признаков, характерных для апоптоза (приобретение округлой формы и «блеббинг» цитоплазматической мембраны), в то время как другая часть демонстрирует интенсивную цитоплазматическую вакуолизацию. Оценка индуцируемых 3Cpro путей клеточной гибели показала, что невакуолизированные клетки проявляют характерные для апоптоза конденсацию хроматина, кариорексис, активацию каспаз и изменение локализации фосфатидилсерина. Вакуолизированные клетки, напротив, демонстрируют незначительную конденсацию хроматина без признаков кариорексиса, при этом не наблюдалось активации каспаз и изменения локализации фосфатидилсерина. Полученные результаты указывают на каспазонезависимый характер гибели вакуолизированных клеток. Характеристика типа гибели вакуолизированных клеток была проведена путем оценки состояния субклеточных структур – эндоплазматического ретикулума, эндосомально-лизосомального компартмента, а также митохондриальной сети и аутофагосом. Обнаружено, что наблюдаемые вакуоли представляют собой увеличенные в размерах аутолизосомы, внутри которых находятся многократно секвестированные аутофагосомы. Полученные результаты позволяют предположить, что гибель вакуолизированных клеток происходит в результате нарушений аутофагии. Для дальнейшей характеристики цитотоксического эффекта 3Cpro нами был сконструирован экспрессионный вектор, в составе которого находится ген белка слияния 3Cpro с жёлтым флуоресцентным белком. Такая система позволит проводить оценку цитотоксического действия 3Cpro на широкий спектр опухолевых клеток. Таким образом, полученные результаты позволяют рассматривать ген 3Cpro в качестве перспективного агента противораковой генной терапии, способного индуцировать каспазонезависимую гибель клеток. 172 ИСПЫТАНИЯ МИКОБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ НЕИЗВЕСТНЫХ РАНЕЕ СТРУКТУРНЫХ АНАЛОГОВ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОГО ПРЕПАРАТА I РЯДА – ЭТАМБУТОЛА К.А.Кочетков1), М.А.Галкина1), Л.А.Свиридова2), Г.А.Голубева2) А.М.Мороз3), И.Р.Дорожкова3) Институт элементоорганических соединений имени А.Н.Несмеянова РАН, 2)Химический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, 3) Московский научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения Москвы 1) В связи с напряженной эпидемической ситуацией проблема борьбы с туберкулезом сохраняет свое первостепенное значение для здравоохранения России и всего мира. Эффективность лечения больных во многом зависит от разработки и промышленного производства новых лекарственных средств, обладающих высокой бактериостатической и бактерицидной активностью в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ). Устойчивые к действию известных лекарственных средств МБТ могут длительно находиться в остаточных очагах туберкулезной инфекции в метаболически неактивном состоянии персистирования, сохраняя способность к размножению и реверсии в исходные бактериальные формы. Это приводит к реактивации инфекционного процесса, развитию рецидива и прогрессированию заболевания. Поиск новых противотуберкулезных препаратов, активно воздействующих непосредственно на МБТ и не вызывающих побочных реакций, является необходимым условием в борьбе с туберкулезной инфекцией. К числу противотуберкулезных препаратов I ряда относится этамбутол, эффективность которого в последнее время снижается в связи с развитием лекарственной устойчивости. Цель работы – поиск и доклинические испытания in vitro новых структурных аналогов этамбутола, обладающих противотуберкулезной активностью, в том числе в отношении возбудителя туберкулеза с лекарственной устойчивостью к этамбутолу. В ходе выполнения проекта разработан подход к синтезу недоступных ранее аналогов этамбутола – диаминоспиртов и триаминов, в том числе гетероциклического ряда. В соответствии с рабочей программой проведен лабораторный синтез 7 новых соединений ряда аминоспиртов и полиаминов и получены 173 необходимые физико-химические характеристики. Получены, выделены и очищены также 6 новых растворимых потенциально физиологически активных солей 1-(6-бром-2-хлорхино-3-лил)-4-диметиламино-2-(нафтален-1-ил)-1-фенилбутан-2-ола для проведения сравнительных испытаний их противотуберкулезной активности. В МНПЦБТ с новыми аналогами этамбутола (ТЛК-14 − ТЛК-25) поставлены серии экспериментов по изучению противотуберкулезной активности девяти концентраций каждого из указанных соединений в отношении стандартного международного штамма M. tuberculosis, чувствительного к критическим концентрациям этамбутола. При испытании образцов установлено, что в наивысшей исследованной концентрации (80 и 160 мкг/мл) у ряда образцов (ТЛК-14; ТЛК-18) отмечены признаки слабой активности. Представляется перспективным повторить опыты и продолжить испытания указанных образцов в целях определения уровня минимальной ингибирующей концентрации (МИК) каждого из них. В настоящее время воспроизводимость данных экспериментов проверяется, а также испытываются модифицированные по более ранним результатам экспериментов соединения ТЛК-18 и -25, являющиеся тиокислотами изоиндольного ряда, содержащими необходимые фармакофорные группы. В дальнейшем будут наработаны необходимые количества веществ для прохождения всего цикла преклинических испытаний in vitro и выбраны оптимальные соединения, отвечающие требованиям медикобиологических испытаний, синтезированы и испытана их противотуберкулезная активность. ПРИМЕНЕНИЕ ВНЕШНЕМЕМБРАННЫХ ВЕЗИКУЛ LYSOBACTER SP. XL1 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И СТАФИЛОКОККОВОГО СЕПСИСА И.С.Кулаев 1), Н.А.Шишкова 2), Н.В.Васильева 1), Л.А.Ледова 1), И.М.Цфасман 1), О.А.Степная 1), Л.И.Маринин 2) 1) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино; 2) Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск Проблема антибиотикорезистентности микроорганизмов в настоящее время носит характер глобальной угрозы и требует 174 разработки новых антибиотических препаратов с оригинальным механизмом действия и новых неантибиотических способов воздействия на инфекционный процесс. Бактерия Lysobacter sp. XL1 продуцирует внешнемембранные везикулы, содержащие литиические ферменты. Везикулы демонстрируют широкий спектр антимикробного действия. Целью настоящей работы являлось исследование возможности использования везикул для лечения сибиреязвенной инфекции животных, вызванной вирулентным штаммом B. anthracis Ч-7, а также экспериментальной стафилококковой инфекции, вызванной метициллинустойчивым штаммом стафилококка (MRSA). Показана возможность профилактического лечения везикулами нелинейных белых мышей и золотистых хомяков при подкожном заражении споровой и вегетативной суспензией вирулентного штамма B. anthracis Ч-7. Доказана 100 % эффективность воздействия везикул на экспериментальную сибиреязвенную инфекцию при введении препарата в ранние сроки после инфицирования. Разработана модель стафилококковой инфекции у мышей. Заражение проводили введением в ретроарбитальный синус культуры метициллинустойчивого Staphylococcus aureus 55, (любезно предоставлен Абаевым И.В.). При таком способе заражения у мышей стабильно формировалась стафилококковая инфекция – стафилококк выделялся из печени и селезенки, самое большое количество обнаруживалось в почках, покрытых гнойниками. В эксперимент брали мышей весом 18-20 г, которых разделили на 4 группы. Первая – контрольные мыши, не получавшие лечение, вторая – препарат везикул вводили внутрибрюшинно за 3 часа до заражения, третья – препарат везикул вводили за 24 часа до заражения, четвертая – везикулы вводили через 3 и 24 часа после заражения. Эксперимент шел 25 дней. На 4-е сутки после заражения из каждой группы отбирали животных, делали отпечатки из органов на чашки с питательным агаром. Также оценивали внешний вид и вес животных. Контрольная группа не прибавила в весе, внешний вид болезненный, в почках до последнего дня эксперимента обнаруживалось сильное обсеменение стафилококком. В группе, получавшей профилактическое лечение за 3 часа до заражения, к 11-му дню эксперимента наблюдалась полная элиминация стафилококка из внутренних органов, животные 175 хорошо выглядели и прибавили в весе до 40 г. Профилактическое лечение за 24 часа до заражения: к концу эксперимента печень и селезенка чистые, из почек высеваются отдельные колонии, внешний вид хороший, прибавка в весе до 36 г. Лечение двумя инъекциями везикул: с 11 дня все органы чистые, внешний вид здоровый, прибавка в весе до 38 г. Вывод: внешнемембранные везикулы, содержащие литические ферменты, можно успешно применять для превентивного лечения экспериментального стафилококкового сепсиса и сибирской язвы. СОЗДАНИЕ НОВОГО КЛАССА ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ АНТИТУБЕРКУЛЕЗНЫХ АГЕНТОВ НА ОСНОВЕ ВЫСШИХ ТЕРПЕНОИДОВ, ИХ ГЛИКОЗИДОВ И ПОЛИСАХАРИДОВ В.Ф.Миронов1), В.Е.Катаев1), О.Б.Казакова2), С.Г.Фаттахов1), Р.В.Честнова3) УРАН Институт органической и физической химии им. А.Е.Арбузова КазНЦ РАН, Казань; 2)УРАН Институт органической химии УНЦ РАН, Уфа; 3)Республиканский клинический противотуберкулезный диспансер МЗ РТ, Казань 1) В отчетном году поиск новых антитуберкулезных агентов продолжался в трех направлениях: (1) химическая трансформация ди- и тритерпеноидов; (2) создание композиций терпеноидов и сахаридов с противотуберкулезным препаратом изониазидом; (3) синтез производных амидов и гидразидов тиогликолевой кислоты. В рамках первого направления продолжен синтез производных дитерпеноида изостевиола и обнаружено, что макроциклизация соединения с двумя энт-бейерановыми каркасами, соединенными себацинатным спейсером, увеличивает туберкулостатическую активность до уровня изониазида. Синтезирована серия аналогичных производных на основе дитерпеноида энт Здесь и далее, если не оговорено особо, имеется в виду туберкулостатическая активность на штамме H37Rv in vitro. 176 кауранового ряда стевиола. Установлено, что смена энтбейерановой геометрии дитерпеноидного каркаса на энткаурановую изменяет зависимость активности от длины спейсера, соединяющего дитерпеноидные каркасы, а также ухудшает активность макроциклической системы. Синтезирована и передана на испытания новая серия терпеноидов даммаранового, лупанового, олеананового и урсанового рядов. У всех соединений величины МИК превышали 10 мкг/мл. Модификацией одного из соединенийлидеров прошлого года удалось понизить его МИК с 10 до 5 мкг/мл. Дополнительное изучение соединений-лидеров прошлого года показало, что три из них проявляют туберкулостатическую активность в отношении штаммов M. Tuberculosis, резистентных к этамбутолу, канамицину, стрептомицину и 4-аминосалициловой кислоте при МИК в диапазоне 0.16–0.31 мкг/мл. В рамках второго направления было синтезировано и изучено 224 композиции противотуберкулезного препарата изониазида с терпеноидами различного строения. Величины МИК 40 композиций находились в интервале 0.31–1.3 мкг/мл, а композиция-лидер продемонстрировала МИК = 0.06 мкг/мл при значительном синергизме активностей входящих в нее изониазида и терпеноида. Среди композиций изониазида с олиго- и полисахаридами лидером оказалась одна из его композиций с сахарозой (МИК = 0.03 мкг/мл), которая также продемонстрировала значительный синергизм активностей входящих в нее компонентов. В рамках третьего направления у соединений-лидеров прошлого года, проявивших высокую (МИК = 0.05–1 мкг/мл) активность и низкую (ЛД50 > 2000 мкг/мл) токсичность, но получаемых по не технологичной схеме и плохо растворимых в воде, изоциануратная (триазиновая) группировка была заменена на алициклическую. Синтезированная серия соединений проявила активность на уровне изониазида, а соединение-лидер, кроме того, оказалось активным и в отношении штаммов, резистентных к изониазиду, рифампицину, офлоксацину, стрептомицину и этамбутолу при МИК = 0.1 мкг/мл, обладало низкой (ЛД50 > 4000 мг/кг) токсичностью (крысы, внутрижелудочно), не влияло на репродуктивные качества животных и не обладало кумулятивными свойствами. 177 СОЗДАНИЕ НОВЫХ СТРУКТУРНЫХ АНАЛОГОВ КЛАДРИБИНА И РАЗРАБОТКА ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ПОДХОДОВ ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА КАК АУТОИММУННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ А.И.Мирошников1, О.Г.Кулакова2, И.Д.Константинова1, И.С.Музыка1, И.В.Фатеев1, Е.Ю.Царева2, С.Г.Щур2, А.Н.Бойко2, О.О.Фаворова2 1 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН), Москва; 2ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России, Москва Введение. Модифицированный нуклеозид 2-хлор-2’дезоксиаденозин (Кладрибин, CdA) в настоящее время применяют при лечении рассеянного склероза (РС) и относят к группе препаратов, изменяющих течение РС (ПИТРС). В 2010 г. Росздравнадзор зарегистрировал таблетированную форму Кладрибина (Мовектро®, Merck Serono) для лечения пациентов с ремиттирующим РС. При этом Комиссия по лекарствам и пищевым продуктам США отклонила, как неполную, заявку на регистрацию перорального препарата Кладрибин для лечения РС, что связано с выявлением 4 случаев рака у пациентов, получавших препарат в рамках клинического исследования. Поиск новых аналогов Кладрибина, обладающих бóльшим терапевтическим индексом, и создание лекарственных препаратов на их основе – задача современной науки. Целью данного проекта являются исследования по созданию новых структурных аналогов Кладрибина ряда 2’-дезокси-3’аминорибозы и оценка их терапевтического потенциала, в сравнении с Кладрибином и полученными ранее его аналогами, в культурах мононуклеарных клеток (МК) здоровых доноров и больных различными формами РС. Разработка стратегии прогнозирования эффективности терапии больных РС иммуномодулирующими препаратами (Кладрибином, Копаксоном). Материалы и методы. Фармацевтическая субстанция Кладрибина и два его принципиально новых структурных аналога (9-β-D-(3’-амино-2’,3’-дидезоксирибозил)-2-фтораденин, amino-FdA 178 и 9-β-D-(3’-амино-2’,3’-дидезоксирибозил)-2-хлораденин, aminoCdA) получены в ИБХ РАН биотехнологическим способом с использованием генно-инженерных ферментов. С помощью модифицированного для суспензионных клеток МТТ-теста проведено сравнительное исследование влияния различных доз препарата Кладрибин и его структурных аналогов на активированные фитогемагглютинином (10 мкг/мл) и покоящиеся МК, выделенные из крови здоровых доноров и больных РС. Больные РС, получавшие лечение Копаксоном (285 чел.) не менее 2 лет, на основании унифицированных критериев оценки эффективности лечения были разделены на две группы: больные с улучшением течения РС после лечения, больные, не ответившие на лечение. Проведен анализ вклада полиморфизмов генов CCR5, TNF, IFNB1, IFNAR1, TGFB1, IFNG, IL7RA, CTLA4 и HLA-DRB1 генов в эффективность терапии Копаксоном больных РС. Результаты. Выявлено цитотоксическое действие аналогов Кладрибина на делящиеся и покоящиеся лимфоциты больных РС и здоровых доноров. Сравнение новых аналогов Кладрибина с исследованными ранее по мере убывания средних концентраций, вызывающих 50 %-ную гибель покоящихся МК здоровых доноров и больных РС, позволило выстроить их в следующий ряд CdA ≈ 2-FdA < F-Ara-A < FMP ≤ Cl-Ara-A < OH-Ara-A ≈ 2-ОМе-dA < AminoFdA < F,F-BI-dR ≈N-оксим-CdA ≤ Iso-CdA ≤ Amino-CdA, а вызывающих 50% ингибирование пролиферации активированных МК - CdA ≈ 2-F-dA < F-Ara-A < FMP ≤ Cl-Ara-A < Amino-FdA ≤ OH-Ara-A ≈ 2-ОМе-dA < F,F-BI-dR ≈N-оксим-CdA ≤ Iso-CdA< Amino-CdA. Выявлен вклад полиморфных вариантов генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1, IL7RA в формирование ответа на лечение Копаксоном. Аллели генов CCR5 и DRB1 значимо ассоциированы с эффективностью терапии по отдельности. Совместное носительство сочетаний аллелей генов CCR5, DRB1, IFNG, TGFB1, IFNAR1, IL7RA может быть использовано для прогноза эффективности лечения больных РС. Заключение. Полученные результаты позволяют определить дальнейшую перспективу для дизайна новых лекарственных препаратов на основе производных Кладрибина, а также открывают возможность проведения расширенных клинико-генетических 179 исследований новых препаратов, перспективных для терапии РС и других аутоиммунных заболеваний. СОЗДАНИЕ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ Н.Ф.Мясоедов Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН), Москва Важная роль пептидов в регуляции физиологических процессов в организме в настоящее время не вызывает сомнений. Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГ/МСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины. Эксперименты, проведенные нами в 2010 г., показали, что фрагмент АКТГ15-18 (KKRR) и его синтетический аналог KKRRPGP снижают повышенную тревожность животных, вызванную острым стрессогенным воздействием. В 2011 г. было исследовано влияние АКТГ15-18 и его модифицированного аналога на уровень тревожности и степень депрессивности животных, не подвергавшихся стрессогенному воздействию. Показано снижение тревожности крыс под действием указанных пептидов, наличие у данных кортикотропинов анксиолитического и антидепрессантного действия. При этом выраженность и продолжительность антистрессорных эффектов, вызванных введением KKRRPGP, значительно превышает аналогичные показатели, характерные для его природного прототипа. Таким образом, АКТГ15-18 PGP можно рассматривать в качестве кандидатной молекулы для создания анксиолитиков пептидной природы. Получены новые данные по биодеградации пептидов в различных биологических средах (крови, назальной слизи), подтверждающие преимущество интраназального способа введения и позволяющие заключить, что, несмотря на меньшую (чем в крови) активность ферментов, процесс протеолиза в назальной слизи носит более упорядоченный и целенаправленный характер, что связано, по-видимому, с обеспечением правильной работы систем внешней и внутренней биологической сигнализации в организме. В 2011 г. были продолжены исследования по взаимодействию исследуемых пептидов с основными рецепторными системами 180 клетки. В работе были использованы: кортикотропины (5 пептидов), селанк и глипролины (4 пептида), нейротензинподобные (3 пептида) и дерморфин-подобные пептиды (3 пептида). Для каждого конкретного регуляторного пептида (из указанных групп) методом радиолиганд-рецепторного анализа была определена степень влияния на специфическое связывание синтезированных радиоактивно меченых эффекторных молекул, рассчитана величина возможного сродства пептидного регулятора к тому или иному типу известных рецепторов. В работе были использованы: агонист ванилоидных рецепторов дигидрокапсаицин [3H]2HCapsaicin, неселективный агонист дофаминовых рецепторов [3H]Dopamine, селективные агонисты (D2-like) дофаминовых рецепторов второго подтипа [G-3H]-7-OH-DPAT и [3H]Sulpiride, лиганд бензодиазепинового сайта рецептора ГАМК [3H]Diazepam, антагонист NMDA рецепторов [3H]MK-801. Установлено существование высокой модуляторной активности пептидов в отношении различных рецепторных систем организма, показано существование уникального спектра действия, характерного для каждой конкретной биологически активной пептидной молекулы, но сходного по характеристикам для родственных пептидов (принадлежащих к одной группе). Полученные данные показывают перспективность дальнейших исследований различных регуляторных пептидов с целью создания новых лекарственных препаратов на их основе. РАЗРАБОТКА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕРРОЦЕНА Ю.С.Некрасов1), Л.В.Снегур1), А.А.Сименел1), В.Н.Бабин, Ю.А.Белоусов1), А.Н.Родионов1), Е.Ю.Осипова 1), К.Я.Жеребкер1), Н.С.Сергеева2), В.И.Борисов2), Л.А.Островская3) Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН, Москва; 2) Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена; 2) Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва 1) 181 Современная химиотерапия онкологических заболеваний основана на применении высокотоксичных препаратов, длительное применение которых часто приводит к тяжелым осложнениям. Другой подход основан на поиске малотоксичных соединений, действие которых направлено не на уничтожение опухолевых клеток, а на их нормализацию. В отличие от нормальных клеток, которые гибнут после определенного числа делений (апоптоз), опухолевые клетки способны преодолевать порог репродуктивной гибели. Согласно механизму апоптоза, концевые участки генома – теломеры укорачиваются при каждом акте деления клетки. При достижении критического размера теломеры нормальная клетка перестает делиться и гибнет. Однако в опухолевых клетках «работает» РНК-содержащий фермент – теломераза, который способен восстанавливать теломерную ДНК до приемлемой длины, в результате чего опухолевые клетки приобретают бессмертие на популяционном уровне. Поэтому для включения механизма репродуктивной гибели опухолевых клеток необходимо экранировать теломеры от действия теломеразы и/или дезактивировать теломеразу. По структурным соображениям эту роль могут сыграть молекулы ферроценилазолов, которые способны связываться с ДНК за счет лабильных ковалентных, водородных, координационных, ионных и интеркаляционных связей 1. Основываясь на этой модели, разработаны удобные препаративные методы синтеза таких соединений, содержащих в своем составе нетоксичные и широко распространенные в фармакологии азотистые гетероциклы и ферроценильный фрагмент. С помощью этих методов получен ряд новых ферроценовых производных пиримидинов и пиразолопиримидинов. В опытах in vitro на бактериальных культурах показано, что физиологическая активность производных ферроцена обусловлена действием на репликативные и репаративные процессы в ДНК. В экспериментах in vivo исследована противоопухолевая активность одного из полученных соединений. Торможение роста опухолей достигало 85 %, что сопоставимо с действием используемого в клинике препарата цисплатин при более чем на порядок низкой токсичности. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о 182 принципиальной возможности и перспективности использования производных ферроцена для создания нового семейства малотоксичных высокоэффективных противоопухолевых препаратов для лечения онкологических заболеваний. Работа выполнена при финансовой поддержке комплексной программы Президиума РАН "Фундаментальные науки медицине" и программы фундаментальных исследований ОХНМ РАН «Медицинская и биомолекулярная и химия». 1. Л.В.Снегур, В.Н.Бабин, А.А.Сименел, Ю.С.Некрасов, Л.А.Островская, Н.С.Сергеева. Противоопухолевая активность соединений ферроцена. Изв. РАН, сер. хим. 2010, № 12, 2113. ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БЕЛКА YB-1 В КАЧЕСТВЕ МИШЕНИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ АНТИРАКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ С.В.Никонов 1), Е.Р.Ким1), С.Г.Гурьянов1), В.Г.Кляшторный1), А.А.Панищева2), А.А.Ставровская2) Институт белка РАН, Пущино, НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Блохина РАМН, Москва 1) 2) Многофункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) позвоночных участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. Повышенная концентрация YB-1, его фосфорилирование киназой Akt, его процессинг протеасомой и ядерная локализация протеолитически укороченного YB-1 часто являются неблагоприятными факторами, способствующими раковой трансформации клеток и агрессивности опухолей. Детальному исследованию этих факторов посвящен данный проект. 1. Для исследования влияния концентрации YB-1 на фенотип раковых клеток нами была получена малая шпилечная РНК (shRNA) против участка мРНК YB-1 (NM_004559) 1065-1083 н. Эксперименты показали, что в клетках, трансфецированных shRNA, происходит уменьшение количества мРНК YB-1 через 24 часа. Однако полного выключения YB-1 добиться не удалось. Поэтому 183 для трансфекции эукариотических клеток и длительного синтеза в них малых шпилечных РНК мы дополнительно получили плазмидные конструкции против еще четырех участков мРНК YB-1 на основе вектора pSilencer4.1. С данными конструкциями в настоящее время проводятся эксперименты по выключению синтеза YB-1 в культивируемых раковых клетках и исследуется их влияние на фенотип раковых клеток. 2. Киназа Akt фосфорилирует YB-1 по аминокислотному остатку Ser102 домена холодового шока (CSD) и, возможно, Ser209 С-концевого домена. Использование методов молекулярной динамики позволило построить модели фосфорилированной формы домена холодового шока белка YB-1 как в свободном, так и в связанном с «кэпированной» мРНК состояниях и показать, что фосфорилирование приводит к изменению конформации его длинной петли. Исследование мутантных форм YB-1 с заменами по Ser102 и Ser209 показало, что фосфомиметические замены этих остатков (Ser на Asp) не влияют ни на РНК-связывающие свойства YB-1, ни на его расщепление 20S протеасомой. Замена Ser102Asp, часто используемая для имитации фосфорилирования, приводит к подавлению способности YB-1 ингибировать кэп-зависимую трансляцию в бесклеточной системе трансляции. Однако модели, построенные методами молекулярной динамики, демонстрируют разные конформации длинной петли в мутантной и фосфорилированной формах CSD. 3. Ингибирование расщепления YB-1 20S протеасомой является одним из возможных путей снижения выживаемости раковых клеток при химиотерапии. Однако отсутствие структуры Сконцевого фрагмента белка не дает возможности предложить подходящий ингибитор расщепления. В текущем году мы выделили С-концевой фрагмент YB-1, соответствующий ранее предложенной нами теоретической модели, и исследовали его различными физическими и биохимическими методами. К сожалению, найти условия, при которых фрагмент приобретает устойчивую глобулярную конформацию, пригодную для определения его структуры методом ЯМР, пока не удалось. Эти работы будут продолжены. Таким образом, полученные в ходе выполнения проекта данные показывают, что направленное воздействие на YB-1 может 184 привести к подавлению развития опухолей, и позволяют считать этот белок перспективной мишенью для создания нового поколения антираковых препаратов. НАПРАВЛЕННЫЙ ПОИСК ИННОВАЦИОННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И ЭФФЕКТИВНОЙ ТЕРАПИИ ФОРМ ФРОНТОТЕМПОРАЛЬНОЙ ДЕМЕНЦИИ С НАРУШЕННЫМ МЕТАБОЛИЗМОМ TDP-43 НА ОСНОВЕ ОРИГИНАЛЬНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ – ЛИНИИ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ С ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ МУТАНТНОЙ ФОРМЫ TDP-43 БЕЛКА ЧЕЛОВЕКА. Н.Н.Нинкина, И.В.Хританкова, А.А.Устюгов Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка Прогресс в изучении молекулярных механизмов нейродегенеративных процессов позволил выявить новые факторы, имеющие важное значение в патогенезе целого ряда распространенных заболеваний и, в частности, возрастных деменций. При ряде форм фронтотемпоральной деменции (ФТД) патологический процесс обусловлен нарушением функции ядерных ДНК/РНК связывающих белков, регулирующих метаболизм РНК. Белки TDP-43 и FUS, которые имеют схожую доменную структуру и выполняют в клетке схожие функции, способны агрегировать и образовывать патогенные цитоплазматические включения, выявляемые при патогистологическом анализе в мозге пациентов ФТД, что позволило рассматривать TDP-43 и FUS как потенциальные молекулярные мишени при разработке новых лекарственных препаратов для эффективной терапии форм ФТД с нарушенным метаболизмом TDP-43 и FUS. Нами была поставлена задача создать линию трансгенных мышей с повышенной экспрессией мутантной формы TDP-43 белка человека. Были сконструированы экспрессирующие плазмиды, содержащие мутaнтные формы белка TDP-43 и FUS человека, агрегационные свойства которых проверены в культурах клеток нейробластомы человека SH-SY5Y. Делеции участков белковой молекулы, содержащих сигнал ядерной локализации, приводили к нарушению компартментализации TDP185 43 и FUS, накоплению их в цитоплазме и формированию патогенных включений подобных тем, что выявляются при ФТД. Ранее нами было показано, что отечественный препарат Димебон, обладающий способностью влиять на содержание и/или стабильность агрегатов, формируемых амилоидогенными белками, существенно снижает число детектируемых в цитоплазме трансфецированных клеток нейробластомы TDP-43 позитивных включений. Таким образом, определено направление для поиска инновационных препаратов, мишенью которых будут являться промежуточные и конечные продукты агрегации белка TDP-43. Создание животных моделей, воспроизводящих молекулярную патологию TDP-43 и FUS в трансгенных мышах, позволит существенно повысить эффективность работ по направленному поиску и изучению механизмов действия такого рода соединений. СОЗДАНИЕ НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ, СПЕЦИФИЧНЫХ ДЛЯ ТКАНЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА И СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЫ, КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ ПРОЛОНГИРОВАНИЯ ДЕЙСТВИЯ НЕЙРОМЕДИАТОРА АЦЕТИЛХОЛИНА Е.Е.Никольский1,2), К.А.Петров1,3) , А.Д.Никиташина1,3) , Э.А.Бухараева 1,2), В.В.Зобов3), В.С.Резник3) 1) Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, 2) Казанский государственный медицинский университет, 3) Институт органической и физической химии им. А.Е.Арбузова КазНЦ РАН На сегодняшний день ингибиторы ацетилхолинэстеразы (АХЭ) являются наиболее распространенными препаратами для лечения болезни Альцгеймера, миастении Гравис и единственным средством терапии большинства врожденных миастенических синдромов. Кроме того, ингибирование АХЭ в нервно-мышечных синапсах – обычная практика, применяемая анестезиологами для 186 ускорения выхода мышц из курарного блока. Однако использованию существующих антиАХЭ препаратов в клинике препятствует один недостаток, присущий всем без исключения ингибиторам – полное отсутствие избирательности по отношению к ферменту разных органов и тканей. Вследствие чего, одновременно с воздействием на орган, требующий фармакологического вмешательства, происходит ингибирование фермента и в тех органах, функционирование которых коррекции не требует. Поэтому, наряду с положительным (терапевтическим) действием, ингибиторы АХЭ всегда вызывают и побочные эффекты, связанные в основном с гиперактивацией холинорецепторов вегетативной нервной системы, гладкой мускулатуры и миокарда. Недавно при изучении нового класса ингибиторов АХЭ – алкиламмониевых производных 6-метилурацила – впервые появились основания говорить о возможности создания ингибиторов АХЭ, мало затрагивающих активность этого фермента в гладкой мускулатуре и миокарде по сравнению с АХЭ скелетных мышц, что делает их возможными средствами для лечения синдромов патологической мышечной слабости. Кроме того, на основе поведенных исследований появилась возможность создания ингибиторов АХЭ, более эффективных в нервной ткани по сравнению с гладкой мускулатурой, что сделает их перспективными средствами терапии нейродегенеративных заболеваний. В рамках выполнения проекта по программе «Фундаментальная наука – медицине» нами было синтезировано 16 новых алкиламмониевых производных 6-метилурацила, восемь из которых показали способность ингибировать АХЭ. Одно соединение (№ 7) проявляло избирательность в отношении скелетной мускулатуры по сравнению с гладкой мышцей. Это соединение было протестировано на способность устранять симптомы заболевания в экспериментальной модели миастении Гравис. Установлено, что однократная внутрибрюшинная инъекция соединения № 7 в дозе 0,3 мг/кг полностью устраняла симптомы миастении. Об этом свидетельствовало восстановление до нормы динамики последовательных потенциалов действия скелетной мышцы, возникающих при раздражении двигательного нерва с частотой 40 Гц. Таким образом, данное соединение представляется перспективным как возможное 187 лекарственное средство для лечения симптомов патологической мышечной слабости. РАЗРАБОТКА ОНКОВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ КОНЪЮГАТОВ ОНКОСПЕЦИФИЧЕСКИХ УГЛЕВОДНЫХ АНТИГЕНОВ N-АЦЕТИЛ- И N-ГЛИКОЛИЛНЕЙРАМИНИЛЛАКТОЗЫ С БЕЛКАМИ-НОСИТЕЛЯМИ Н.Э.Нифантьев1), Е.А.Хатунцева1), Ю.Е.Цветков1), О.Н.Юдина1), М.Л.Генинг1), Р.Н.Степаненко2), Р.Я.Власенко2), Е.М.Новикова2), М.В.Киселевский3), Н.Ю.Анисимова3) Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН, Москва 2) Институт иммунологии ФУМБЭП МЗ РФ, Москва 3) Институт иммунологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 1) Работы по проекту в 2011 г. продолжили наше исследование, направленное на разработку гликоконъюгатных онковакцинных препаратов на основе трисахаридов 3'-N-ацетил- и 3'-(N-гликолилнейраминил)лактозы (N-AcSL и N-GcSL – углеводные цепи онкоассоциированного ганглиозида GM3 и онкоспецифического ганглиозида N-Gc-GM3) и иммуноадъювантного белка-носителя KLH – гемоцианина моллюска Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin). Задачей работ было дальнейшее совершенствование метода синтеза конъюгатов лигандов N-AcSL и N-GcSL и носителя KLH, а также проведение их иммунологических испытаний. Усовершенствован метод синтеза конъюгатов углеводных лигандов и белка-носителя KLH, который позволяет теперь присоединять не 300, а около 500 лигандов, что специально подтверждено с помощью химического анализа. Кроме этого, проводились синтезы с другими белками-носителями, испытания которых предпологается начать на следующих этапах проекта. Иммунологическая часть работ включала эксперименты in vitro и in vivo (на мышах) для изучения иммуногенности полученных конъюгатов усовершенствованного типа в зависимости от режима иммунизации и использованного адъюванта. Поэтому для поиска наиболее эффективных условий иммунизации нами продолжены модельные эксперименты при использовании адъювантов разных типов с детальным анализом типов классов и субклассов генерируемых иммуноглобулинов и их углеводной специфичности. Кроме этого проведено исследование механизма активации 188 вакцинными конъюгатами дендритных клеток (наиболее эффективные антигенпрезентирующие клетки иммунной системы) и образование их комплексов. Проведены серии экспериментов на лабораторных мышах с перевитыми опухолями (меланома), которые показали, что в результате вакцинации происходит эффективная выработка специфичных антител, в том числе иммуноглобулинов IgG3, что подтверждает развитие «иммунной памяти». Кроме этого происходит и индукция Т-клеточного ответа, что приводит к торможению роста опухоли, а также снижению развития метастазов и рецидивов возникновения опухолей. Полученные результаты свидетельствуют о противоопухолевой активности разрабатываемого типа онковакцины и целесообразности проведения её полнообъёмных испытаний. Публикации по результатам проекта: Р.Н.Степаненко, Р.Я.Власенко, Ю.Е.Цветков, Е.А.Хатунцева, Е.М.Новикова, И.К.Вернер, Н.Э.Нифантьев, Р.В.Петров «Гуморальный иммунный ответ мышей на конъюгат синтетических углеводных фрагментов опухольассоциированного антигена ганглиозидной природы с белком гемоцианином – прототипа противоопухолевой вакцины». Иммунология (2010). С. 86-92. Н.Ю.Анисимова, Р.Я.Власенко, М.В.Киселевский, О.В.Козырева, Ю.Е.Цветков, Е.А.Хатунцева, Н.Э.Нифантьев, Р.Н.Степаненко «Дендритные клетки – адъювант для индукции иммунного ответа на синтетический углеводный фрагмент, конъюгированный с белком». Иммунология (2011), в печати. ДИЗАЙН И ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ ФОСФОРНЫХ И АЦИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И НОВЫХ ПРИРОДНЫХ БИОРЕГУЛЯТОРОВ Э.Е.Нифантьев1), Т.С.Кухарева2), М.П.Коротеев2), А.Т.Телешев2), Г.З.Казиев2), И.Ю.Кудрявцев1), О.С.Жукова3), В.П.Зинченко4), Н.Л.Шимановский4) Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН; 2)Московский педагогический государственный университет; 3) Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва;4)Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова 1) 189 За 2011 г. существенно расширены исследования по химической модификации флавоноида дигидрокверцетина. Большое внимание было уделено дизайну гидрофосфорильных производных дигидрокверцетина и превращению их в соответствующие фосфаты и фосфонаты, не исследованные ранее. Начаты широкомасштабные синтетические исследования по получению разнообразных по структуре олигоацильных систем, включающих дигидрокверцетиновую матрицу и обладающих противоопухолевым, ангиопротекторным и противовоспалительным действием. Среди новых ацильных производных дигидрокверцетина найдены вещества, имеющие антимутагеннную и антиоксидантную активность. Родственной линией работы явилось выделение с использованием кавитатора из зеленого абхазского чая кверцетиновой фракции, обеспечивающей снятие усталости человека. В настоящее время этот продукт стал использоваться пловцами, проходящими подготовку перед соревнованиями. РОЛЬ ПРОТЕИНКИНАЗ C В КОНТРОЛЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ: ФЕРМЕНТСПЕЦИФИЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ГЕРОПРОТЕКТОРЫ И ИНСЕКТИЦИДЫ Е.Г.Пасюкова1), А.В.Симоненко1), Н.В.Рощина1), О.Ю.Рыбина1), О.Б.Беккер2), М.Г.Алексеева2), Д.В.Муха2) Институт молекулярной генетики РАН, Москва Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН 1) 2) Протеикиназы С (ПКС) играют важную роль в развитии нервной системы у различных организмов, в том числе у дрозофилы и человека. Активная работа ПКС во время развития и в молодом возрасте является необходимым условием правильного функционирования организма, однако можно предположить, что в старости снижение активности ПКС окажется благоприятным для торможения процессов старения и увеличения продолжительности жизни (ПЖ). В связи с этим представлялось перспективным исследование роли ПКС в контроле ПЖ и поиск геропротекторов на основе их ингибиторов. 190 В 2009–2010 годах было проведено исследование влияния низкомолекулярных ингибиторов ПКС класса индолилмалеимидов на ПЖ самцов и самок изогенной линии w1118 Drosophila melanogaster. Опыты проводили на питательной среде, на поверхность которой было нанесено по 100 мкл тестируемого вещества в выбранных концентрациях. Результаты оценивали, сравнивая средние значения ПЖ (t-тест) и кривые выживания (тест Каплана-Мейера). Было показано, что добавление к пище растворов ингибиторов № 1086 и № 1237 в концентрации 5 нМ оказало положительное влияние на ПЖ девственных самок, увеличив ее примерно на 10 %. Положительное влияние данных ингибиторов на ПЖ девственных самцов, а также самцов и самок, участвовавших в скрещиваниях, выявлено не было. В 2011 году было дополнительно изучено влияние ингибитора № 1086 в узком диапазоне концентраций, 50 нМ, 5 нМ и 0,5 нМ на ПЖ девственных самок с целью уточнения наиболее эффективной концентрации. Существенной разницы в эффектах разных концентраций выявлено не было. В описанных выше опытах мухи получали ингибиторы начиная с первого дня жизни имаго. В 2011 г. была закончена проверка предположения о различном влиянии ингибиторов ПКС на мух разного возраста. Полученные данные позволили сделать окончательный вывод о том, что добавление ингибитора в пищу не с начала жизни, а в более позднем возрасте (30-50 дней) не влияет на ПЖ. Полученные результаты противоречат исходному предположению о том, что именно в старости снижение активности ПКС окажется благоприятным для торможения процессов старения. У постмитотического организма – дрозофилы – положительный эффект ингибиторов наблюдается только в том случае, если воздействие начинается по крайней мере в начале стадии имаго. В 2011 году было закончено исследование влияния мутаций в генах, кодирующих различные формы ПКС, на ПЖ дрозофилы. В гетерозиготном состоянии две мутации в гене aPKC, одна из которых связана с потерей функционального фермента, привели к увеличению ПЖ самок. На основании анализа действия мутаций и совместного действия мутаций и ингибитора № 1086 выдвинуто предположение о взаимосвязи между уровнем экспрессии гена aPKC и ПЖ. 191 На основании полученных данных в целом можно заключить следующее. Добавление в пищу ингибиторов ПКC может увеличивать ПЖ самок и самцов дрозофилы. Влияние ингибиторов ПКС на ПЖ зависит от пола и физиологического статуса мух. Положительный эффект ингибиторов ПКС на ПЖ наблюдается только в том случае, если воздействие начинается по крайней мере в начале стадии имаго. Мутации в гене, кодирующем aПКС, увеличивают ПЖ самок дрозофилы. НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 1,2,4-ТИАДИАЗОЛА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРЫ: ПОДХОД К СОЗДАНИЮ БИОДОСТУПНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Г.Л.Перлович1), Т.В.Волкова1), Ч.Буи Конг 1), А.Н.Прошин2), Л.Н.Петрова2), С.О.Бачурин2) Институт химии растворов РАН, Иваново Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка 1) 2) Болезнь Альцгеймера является общей формой деменционного расстройства, которая характеризуется прогрессирующим нарушением памяти и высших мозговых функций, что, в конечном итоге, приводит к полной деградации интеллектуальной и познавательной деятельности. Нарастание нарушений по альцгеймерскому типу вызывает разрушение нервных клеток и их рецепторов, в связи с чем направленный поиск лекарственных препаратов, подавляющих нейродегенерацию, является актуальной задачей медицинской химии. В связи с этим в качестве объектов для исследований были выбраны производные 5-амино-[1,2,4]-тиадиазолов, обладающие широким спектром физиологической активности. Разработаны методики синтеза 5-амино-[1,2,4]-тиадиазолов и создана библиотека из 30 соединений, охватывающая широкий спектр биологических и физико-химических свойств. Нейропротекторное действие соединений исследовано на Р2-фракции синаптосом коры мозга крыс как удобной модели in vitro для оценки 192 способности различных соединений влиять на захват ионов кальция в нервные окончания (K43/21, %). Разработана методика и получены мембраны на основе наноразмерных фосфолипидных везикул для изучения проницаемости синтезируемых соединений. Получены P кажущиеся значения проницаемости ( app ). Изучены процессы распределения производных 5-амино-[1,2,4]-тиадиазолов в системах, моделирующих биологические среды: н-гексан/буфер (pH hex/buf ) 7.4) (D (гематоэнцефалический барьер) и н-октанол/буфер (Doct/buf) (pH 7.4) (кишечно-желудочный тракт). Был проведен корреляционный анализ и определены корреляционные уравнения, связывающие функцию log K 43 / 21 с физико-химическими дескрипторами HYBOT. Показано, что взаимодействие между изученными веществами и рецептором зависит от специфических и неспецифических сил. Более того, было продемонстрировано, что значение биологической активности существенно определяется топологией изучаемых молекул и природой заместителей в фенильном кольце 1,2,4-тиадиазола. Геометрия рецептора такова, что максимальную активность проявляют ди-производные фенила с заместителями 2-CH3-3-Cl- (30 %) и 3-CH3-4-Cl- (47 %). С другой стороны, активности соединений с теми же самыми заместителями 3-Cl-4-CH3- и 3-Cl-5-CH3- приблизительно одинаковы (88 %) и более чем в два раза меньше по сравнению с наиболее активным oct /buf D ) соединением. Был проведен корреляционный анализ log( hex /buf D ) и log( с физико-химическими дескрипторами HYBOT с использованием разбиения пространства на кластеры, включающие структурно подобные соединения. Получены корреляционные модели, позволяющие предсказывать анализируемые величины. Кроме этого было детально проанализировано взаимное влияние заместителей в фенильном кольце 1,2,4-тиадиазола на значения рассматриваемых коэффициентов распределения. Аналогичный P app анализ был проведен для . На основе полученного корреляционного уравнения и метода ближайших соседей был предложен алгоритм для предсказания коэффициентов проницаемости данного класса соединений, основываясь только на знании их структурных формул. 193 Предложена классификация и алгоритм отбора перспективных соединений данного класса, основанная на анализе свойств «проницаемость–активность». ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ФУЛЛЕРЕНЫ С60 ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ТЕРАПИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И.Я.Подольский1), Е.Г.Макарова 1), Р.Я.Гордон2), В.В.Воробьев2), Л.Г.Бобылева 1), А.Г.Бобылев1), З.А.Подлубная1), А.Б.Гехт3), О.А.Мишулина4) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2) Институт биофизики клетки РАН, Пущино 3) Российский Государственный медицинский университет, Москва 4) Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ, Москва 1) Создание лекарств для профилактики и лечения болезни Альцгеймера (БА) является важнейшим вызовом медикобиологическим исследованиям в XXI веке. Синтез водорастворимых фуллеренов и углеродных нанотрубочек открыл новое направление для создания лекарств, которое стремительно развивается в США, Европе и странах Азии. Обоснование проекта. Одним из ключевых звеньев патогенеза болезни Альцгеймера является повышенное образование в мозге агрегированных форм амилоидного β-пептида (1-42)(Aβ1-42). Создание антиамилоидных лекарств является ведущим направлением разработки терапии БА. Цель проекта исследовать антиамилоидные свойства стабильного молекулярно-коллоидного водного раствора фуллерена С60HyFn. Результаты. Методом трансмиссионной электронной микроскопии in vitro впервые на визуальном уровне было показано, что водорастворимые фуллерены С60 предупреждают и разрушают бета-амилоиды. Эти данные позволили сделать заключение, что фуллерен in vitro оказывает сильное антиагрегационное действие на амилоидные β-пептиды. Микроинъекция С60HyFn (0.46 nmol/μl) в гиппокамп значительно уменьшила β-амилоидные депозиты в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа и предупреждала нейродегенерацию нейронов. Флуоресцентная микроскопия 194 пирамидных нейронов гиппокампа с акридин оранжевым и микрофлуореметрический анализ позволили получить количественные данные о восстановлении белок синтезирующей активности в пирамидных нейронах гиппокампа, нарушенной Aβ. Микроинъекция C60HyFn (0.46 nmol/1μl) предупреждала нарушение пространственной памяти, вызванное введением в гиппокамп Aβ1−42 (1.6 nmol/μl). На переживающих срезах гиппокампа фуллерен повышал активность пирамидных нейронов и в опытах на крысах модифицировал ЭЭГ фронтальной коры, нарушенную Аβ1-42. Заключение. Функционализированные фуллерены С60 направленно действуют на одну из ключевых молекулярных мишеней болезни Альцгеймера, агрегированные амилоидные β-пептиды, и представляют чрезвычайный интерес для разработки терапии болезни Альцгеймера. Мы предполагаем, что в первой половине XXI века на базе фуллеренов будет разработана эффективная профилактика и терапия болезни Альцгеймера. Работа поддержана грантом Президиума РАН «Фундаментальные науки медицине» и государственным контрактом Министерства высшего образования и науки РФ № P1052. ПРИМЕНЕНИЕ НОВОГО МЕТОДА БОРЬБЫ С ПРОТОЗОЙНЫМИ ИНВАЗИЯМИ (LAMBLIA INTESTINALIS) В.Л.Свидерский1), С.С.Козлов2), В.С.Горелкин1), В.С.Турицин2) Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, Санкт-Петербург 2) Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова, Санкт-Петербург 1) При изучении сложных форм двигательного поведения простейших (ресничных инфузорий) нами была высказана идея о том, что при борьбе с инфузориями-паразитами (Balantidium coli), весьма патогенными для человека и некоторых домашних животных, нет необходимости стремиться к полному уничтожению этих простейших, используя дорогостоящие и к тому же токсичные для человека препараты. Для лишения способности балантидий внедряться в слизистую кишечника может оказаться достаточным 195 лишь нарушение их двигательной активности с помощью дешевых и нетоксичных для человека соединений. С этой целью мы перорально использовали слабые (до 5 мг/л) растворы ионизированного серебра, легко получаемые электролитическим путем. Опыты in vitro и in vivo, проведенные совместно с коллегами из Белоруссии (на базе клиники паразитологии и инвазионных болезней животных Витебской государственной ветеринарной академии) на свиньях, поставляемых одной из ферм, показали эффективность и перспективность нашего подхода. К сожалению, эти работы в силу ряда объективных причин нам продолжить не удалось. В 2010 г. мы исследовали эффективность использования растворов ионизированного серебра для борьбы с другими простейшими – жгутиконосцами лямблиями (Lamblia intestinalis). Этими простейшими были инвазированы лабораторные мыши. Опыты показали, что лямблии являются значительно более устойчивыми к действию серебра, чем балантидии. Поэтому в текущем году мы поставили перед собой две задачи: изучить действие повышенных доз ионизированного серебра на лямблий, а также проанализировать эффект комбинированного применения серебра с традиционно используемым при борьбе с лямблиями препаратом – метронидазолом в надежде добиться уменьшения применяемых доз метронидазола или укорочения сроков лечения препаратом. К сожалению, наши надежды ни в том, ни в другом случае не оправдались. Увеличение суточной дозы серебра до 3,75 мг/кг (более чем в 2 раза по сравнению с применяемой ранее) видимого эффекта на подвижность лямблий не оказывало даже на 5-й день наблюдения. При совместном применении растворов ионизированного серебра с метронидазолом кумулятивного эффекта также выявить не удалось. Полученные данные позволяют прийти к заключению о нецелесообразности применения растворов ионизированного серебра при борьбе с лямблиями. В то же время эти результаты никак не дискредитируют саму идею нашего подхода к борьбе со жгутиконосцами-лямблиями. Они лишь наводят на мысль о необходимости поисков с этой целью иных, более эффективно действующих, чем слабые растворы ионизированного серебра, соединений. 196 ХИМИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ НОВОГО НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНЫ – КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ В.А.Тартаковский1), Г.В.Крышталь1), Г.М.Жданкина1), С.Г.Злотин1), Э.П.Серебряков1), Б.Б.Смирнов1), А.Г.Коноплянников2), О.А. Коноплянникова2), Е.В.Агаева2), В.Н.Петров2), Л.В.Курсова2), Л.А.Лепехина2), А.В.Аверьянов3) Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского Российской академии наук, Москва; 2)ФГБУ Медицинский радиологический научный центр РФ, Обнинск; 3)Клиническая больница № 83 ФМБА РФ, Москва 1) Разработаны новые методы синтеза аналогов метапрогерола – эффективного ранозаживляющего препарата с выходом целевых продуктов в 3÷6 раз выше аналогичной характеристики метапрогерола. Некоторые из полученных не описанных ранее соединений в опытах на животных проявили сходную с метапрогеролом активность. Показано, что 2-(3-диметиламинопропил)-5-метилгекс-4-еновая кислота повышает эффективность лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов с помощью мезенхимальных стволовых клеток и полученных из них кардиомиобластов. На линейных мышах и крысах изучено терапевтическое действие системной (внутривенной) трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выращенных в культуре костного мозга этого вида животных, а также препарата метапрогерол, способного, как это было нами установлено, стимулировать активность стволовых клеток, применяемых для лечения подопытных животных раздельно или совместно. Описанные в литературе модели легочной эмфиземы и легочного фиброза вызывались воздействием фермента эластазы, химиотерапевтического агента блеомицина или локального облучения верхней половины туловища животного. Если без введения МСК или метапрогерола у подопытных животных развивалось морфологическое повреждение легких (усиление хемилюминесцентной активности перитонеальных макрофагов, что свидетельствует о наличии воспалительных процессов в тканях), то при отдельном и совместном применении МСК и метапрогерола это повреждение приобретало менее выраженный характер. Наилучший лечебный эффект совместного 197 использования двух лечебных агентов наблюдался при введении агентов через 1 неделю после введения эластазы. На модели легочного фиброза лечебный эффект совместного применения МСК и метапрогерола был выражен слабее и мало зависел от сроков начала лечения. Эффект системного введения животным одних только МСК во всех изученных группах был достоверно выше, чем эффект введения одного метапрогерола. Таким образом, выявлены хорошие перспективы системных трансплантаций МСК совместно с лекарственными агентами сопровождения (метапрогерол и его аналоги) для лечения больных с различными повреждениями легких, в первую очередь с повреждениями, вызванными курением и хроническими воспалительными заболеваниями. Очевидна необходимость расширить экспериментальное изучение эффекта МСК совместно с метапрогеролом и его аналогами на другие модели повреждения легочной ткани. СИНТЕЗ 1,2,4-ТРИАЗОЛОВ И ТЕТРАЗОЛОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИХ ПРОТИВОВИРУСНУЮ, ЦИТОСТАТИЧЕСКУЮ И НООТРОПНУЮ АКТИВНОСТЬ А.И.Кривченко1), В.А.Островский2), М.С.Мазур2), Е.А.Попова2), Р.Е.Трифонов2) Институт эволюционной физиологии и биохимии РАН, СанктПетербург; 2)Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) 1) Высокоазотистые гетероциклические соединения: 1,2,4-триазолы и тетразолы проявляют различные виды биологической активности до (до 20 видов). Согласно рекомендации ВОЗ одним из наиболее перспективных направлений создания новых лекарственных средств в рамках стратегии ABDD (Analogue-based Drug Discovery) является включение в структуру перспективных органических субстратов триазольных и тетразольных фрагментов. Следуя этой стратегии, мы синтезировали ряд производных 1,2,4-триазола и тетразола – аналогов активных фармацевтических ингредиентов известных лекарственных средств: ремантадина (противовирусное действие), фенибута (ноотропное действие), цис-платина (цитостатическая активность). Строение и индивидуальность всех сое198 динений были доказаны с помощью комплекса физико-химических методов, включая спектроскопию ЯМР 1Н и 13С, ИК спектроскопию, хромато-масс-спектрометрию и др. В качестве эталонов сравнения были подготовлены стандартные образцы ремантадина, фенибута и цисплатина. Все соединения были наработаны в количестве, достаточном для проведения комплекса испытаний in vivo, in vitro. Образцы указанных соединений переданы на испытания в ФГУП НИИ гриппа РАМН (противовирусная активность). Некоммерческое партнерство «Центр по разработке новых лекарственных препаратов «Орхимед» РАН (ноотропное действие), а также в Медицинский центр Венского университета (цитостатическая активность). НОВЫЕ ПОТЕНЦИАЛЬНО АНТИПАРАЗИТНЫЕ (ПРОТИВОМАЛЯРИЙНЫЕ) СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ПРОДУКТОВ ОЗОНОЛИЗА ТЕТРАГИДРОХИНОЛИНОВ, АННЕЛИРОВАННЫХ С ЦИКЛОПЕНТЕНОМ А.Г.Толстиков, Р.Г.Савченко, Е.С.Лукина, С.Р.Афонькина, Д.В.Недопекин, В.Н.Одиноков Институт нефтехимии и катализа РАН, Уфа Биоиспытания in vitro против возбудителя кишечного шистосомоза Мэнсона синтезированных нами ранее озонидов, полученных на основе замещённых тетрагидрохинолинов, аннелированных к циклопентену, выявили существенное влияние структуры озонида на его активность (от очень высокой до нулевой в зависимости от заместителя в 6-арильном радикале). С целью расширения круга тетрагидроциклопентахинолинов – предшественников соответствующих им озонидов и изучения влияния структуры последних на антипаразитарную активность в трёхкомпонентную конденсацию по реакции Поварова был вовлечён ряд новых компонентов. С использованием в качестве ароматических аминов доступных продуктов амино-Кляйзеновской перегруппировки – 2-(цикло-2пент-1-ил)анилина и его 4-метилпроизводного в реакции с мхлорбензальдегидом и циклопентадиеном были синтезированы 6(циклопент-2-ен-1-ил)-4-(м-хлорфенил)-3а,4,5,9b-тетрагидро-3Нциклопента[c]хинолин и его 8-метилпроизводное соответственно. 199 Их N-трифторацетилирование и последующий озонолиз открывают путь к соответствующим бисозонидам. Модернизирован разработанный ранее синтез метилового эфира 12-аминодегидроабиетиновой кислоты. Его конденсация с м-хлорбензальдегидом и циклопентадиеном и последующие N-трифторацетилирование и озонолиз позволят получить озониды сложной структуры. Их расщепление в организме малярийного плазмодия, как можно ожидать, приведёт к образованию серии радикалов, что способствует достижению кумулятивного действия и преодоления механизма защиты паразита от радикалов. В качестве альдегидной компоненты в трёхкомпонентную Гетероциклизацию были вовлечены формальдегид, ацетальдегид, офторбензальдегид, хроманилацетальдегид. Использование в кАчестве ен-компоненты наряду с циклопентадиеном 5-метилциклопентадиена и спиро[2,4]гепта-1,3-диена позволит получить озониды не только с новым остовом, но и модернизировать 1,2,4триоксолановый цикл. Конденсацией метилциклопентадиена, анилина и бензальдегида был синтезирован 2-метил-4-фенил3а,4,5,9b-тетрагидро-3Н-циклопента[c]хинолин, последующие Nтрифторацелилирование и озонолиз которого привели к озониду с метильной группой в 1,2,4-триоксолановом цикле при атоме С4. Строение синтезированных соединений установлено на основании анализа одно- и двумерных спектров ЯМР 1Н и 13С и в некоторых случаях подтверждены рентгено-структурным анализом. Изучение химии озонидов N-трифторацетил-3а,4,5,9b-тетрагидро-3Н-циклопента[c]хинолинов привело к обнаружению некоторых особенностей, не свойственных традиционным озонидам. При гидридном восстановлении синтезированных нами озонидов вместо ожидаемых альдегидов и диолов были получены соответствующие -лактоны, о чём сообщалось в отчёте предыдущего года. Столь же неожиданными оказались результаты восстановления этих озонидов диметилсульфидом и каталитического гидриирования (Pd/C). Вместо ожидаемой трансформации 1,2,4-триоксоланового цикла в 1,5-диальдегид было установлено образование 1,3диоксациклобутанового фрагмента, о чём свидетельствовали данные 1D и 2D ЯМР 1Н и 13С, а также присутствие соответствующих молекулярных ионов в масс-спектрах MALDITOF. Восстановлением диметилсульфидом исследуемых озонидов, 200 содержащих фенильный, о-фтор-, м-хлор- или п-хлорфенильный заместитель при атоме С6, получены соответствующие взятым озонидам соединения с 1,3-диоксациклобутановым фрагментом. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ФРАКЦИЙ ЭКСТРАКТА ИЗ ПЕЧЕНИ НЕОНАТАЛЬНОГО ПОРОСЕНКА И.В.Урываева 1), Р.И.Атауллаханов 2), А.В.Алесенко3), Э.И.Гальперин 4), Т.Г.Дюжева4), Т.М.Мельникова 5), Л.В.Платонова4), О.В.Рыжкова3) , Г.В.Делоне1) 1) Институт биологии развития РАН; 2) Институт иммунологии МЗ; 3) Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 4) Первый Московский медицинский университет им. И.М.Сеченова; 5)Институт органической химии РАН Цель проекта: создать для лечения повреждений и заболеваний печени лекарственный препарат, состоящий из набора естественных индукторов регенерации печени, образующихся в органе в период регенерации. Задачей этапа 2011 года являлось получение сведений об индивидуальных соединениях, обладающих биологической активностью, приготовленных из водных экстрактов печени неонатального поросенка. Результаты. Методом гельфильтрации на колонке TSK-50S экстракта печени неонатального поросенка получены в препаративных количествах три фракции (1, 2а, 4) с регенерирующим эффектом на модели токсического повреждения печени мышей. В текущий период детально изучена количественно доминирующая фракция 1, а также фракция 2а. Исследовали четыре образца фракции 1 (№ 17, 18, 19, 20). Содержание липидов в каждом образце колебалось от 10 до 20 % (образцы фракции 1: 11 % – образец № 19, 18 % - № 17, 20 % - № 18 и 20, а также 10 % – фракция 2а). В исходном экстракте и во всех образцах фракции 1 и 2а при анализе фосфолипидов были обнаружены фосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол и фосфатидилсерин, то есть практически полный спектр фосфолипидов, характерных для 201 печени млекопитающих. Все исследуемые образцы имели идентичный фосфолипидный состав. Различия были только в содержании общих липидов в пробе, но эти вариации были незначительны для образцов 17-20, однако в экстракте печени содержание общих липидов было выше в 3 раза по сравнению с этими образцами фракции 1, а проба 2а содержала минимальное количество липидов (10 %). Среди нейтральных липидов были обнаружены моно- и диглицериды, триглицериды и жирные кислоты, а также холестерин. Отмечено довольно высокое содержание жирных кислот и триглицеридов. Экстракт содержал больше нейтральных липидов, чем фракция 1 (образцы 17-20), а фракция 2а содержала минимальное количество нейтральных липидов, также как и фосфолипидов. Изучен белковый и нуклеиновокислотный (НК) состав фракции 1. УФ спектрофотометрия показала наличие пиков поглощения при 210 и 260 нм, что свидетельствует о наличии пептидов и НК. Однако агарозный гель-электрофорез и снижение оптической плотности в растворе при 260 нм после переосаждения спиртом показали отсутствие высокомолекулярных НК. Нуклеиновые кислоты представлены низкомолекулярными полинуклеотидами (не более 10 осн.) или же отдельными нуклеотидами. При переосаждении спиртом наблюдался довольно большой осадок, что может свидетельствовать о присутствии в пробе большого количества полисахаридов. Измерение концентрации белка по Брэдфорд показало наличие белка в образцах в концентрациях: 17 – 0,35 мг/мл, 18 – 0,34 мг/мл, 19 – 0,52 мг/мл, 20 – 0,46 мг/мл. В то же время при электрофорезе в ПААГ, окрашенном кумасси, высокомолекулярных белков нет. По всей видимости, в образцах присутствуют пептиды размером не более 10 кДа. Выводы. Активные фракции содержат липиды (до 20 %), в состав которых входят фосфолипиды и нейтральные липиды. Представлен полный спектр фосфолипидов, среди нейтральных липидов в наибольшем количестве жирные кислоты и триглицериды. Полипептидный и НК состав фракций представлен пептидами размером не более 10 кДа и полинуклеотидами (не более 10 осн.). Исследования продолжаются. 202 СИНТЕЗ НОВОГО ПРЕПАРАТА, АКТИВНОГО ПРОТИВ РЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА, И ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ДЛЯ НЕГО А.Р.Хохлов1), А.И.Барабанова1), Е.В.Корчагина2), И.Н.Федорова1), О.Е.Филиппова2), В.С.Вележева1) 1) Институт элементоорганических соединений им. Несмеянова РАН, Москва; 2) Физический факультет Московского государственного университета, Москва Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью в настоящее время является практически неизлечимым заболеванием по трем основным причинам: 1) отсутствие противотуберкулезных препаратов (ПТП), активных против резистентных штаммов микобактерий туберкулеза (M. tuberculosis); 2) высокая токсичность существующих ПТП и 3) отсутствие адресной доставки лекарственного вещества в места персистенции возбудителя туберкулеза (в макрофаги). Цель настоящего исследования состояла в синтезе потенциальных ПТП на основе халконов индольного ряда и/или пиридазино[4,3-b]индолов и разработке полимерного носителя на основе блок-сополимеров хитозана и полиэтиленгликоля (ПЭГхитозан), обеспечивающего пролонгированное выделение и направленный транспорт ПТП в макрофаги. В целях повышения противотуберкулезной активности была модифицирована структура хит-соединения GS-25 из ряда пиридазино[4,3-b]индолов и его 2-арилиден-3-индолинонового предшественника путем введения липофильных и гидрофильных заместителей у кольцевого атома азота и в арильном фрагменте пиридазиноиндольной и арилидениндолиноновой систем. Среди испытанных in vitro и ex vivo соединений найдено два соединения, активность которых сопоставима с активностью рифампицина – золотого стандарта противотуберкулезной активности. Высокая антимикобактериальная активность (МИК 1.37–2.53 μg/mL) и низкая токчичность в отношении человеческих клеток делает эти соединения перспективными кандидатами в ПТП. Получены лекарственные наноформы на основе блоксополимеров хитозана и ПЭГ с разным содержанием олигомерных 203 боковых цепей ПЭГ 0.07, 0,13, 1.0, 2.0 и 3.0 мол. %. Блоксополимеры самопроизвольно образуют наночастицы, ядро которых состоит в основном из хитозана, а оболочка – из цепей ПЭГ. Размеры наночастиц из ПЭГ-хитозанов определены методом динамического светорассеяния. Морфология ПЭГ-модифицированных наночастиц хитозана исследована методом просвечивающей электронной спектроскопии. Методом УФспектроскопии изучена солюбилизация гидрофобных Пир-индолов в наночастицах хитозана с разным содержанием ПЭГ и кинетика выделения Пир-индолов при физиологических условиях. Показано, что устойчивые наночастицы образуются при содержании в одной цепи хитозана не более 2 боковых групп ПЭГ, такие наночастицы эффективно абсорбируют Пир-индол. Таким образом, в результате проведения настоящих исследований были получены новые соединения с высокой противотуберкулезной активностью, обеспечивающие лечение туберкулеза, а также стабильная в среде организма лекарственная форма на основе биосовместимого и биоразлагаемого полимера природного происхождения для обеспечения направленной доставки нанокапсулированного препарата к биологическим мишеням и его пролонгированного выделения. РАЗРАБОТКА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ АУРЕОЛОВОЙ КИСЛОТЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИХ КОМПЛЕКСОВ С ДНК А.А.Штиль 1), А.Н.Тевяшова 2), Н.А.Дурандин 1), А.М.Виноградов1), Е.Н.Олсуфьева 2), М.Н.Преображенская 2), В.А.Кузьмин 1) Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва, 2 НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН, Москва 1 Противоопухолевый антибиотик оливомицин A (1) – производное ауреоловой кислоты. Цитотоксичность 1 обусловлена его взаимодействием с GC-богатыми областями в малой бороздке 204 ДНК и индукцией гибели клетки. Для выяснения роли отдельных фрагментов молекулы оливомицина в связывании с ДНК и цитотоксичности синтезирована серия производных с измененной боковой цепью агликона. При взаимодействии 1 с периодатом натрия получен продукт с карбоксильной группой (оливомицин SA; 2). Исследование антипролиферативных свойств новых соединений на линиях HCT116 (рак прямой кишки) и K562 (лейкемия) показали, что 2 существенно менее активно, чем исходный антибиотик 1. Амидирование соединения 2 привело к значительному увеличению активности; L-глутамат N,Nдиметиламиноэтиламид оливомицина SA (соединение 3) вызывал гибель опухолевых клеток в наномолярных концентрациях. Особенно важно, что 3 продемонстрировал высокую противоопухолевую активность на моделях агрессивных перевивных опухолей у мышей (лимфома P388 и меланома B16). Механизм повышения противоопухолевой активности изучен в экспериментах по комплексообразованию новых соединений с ДНК. Структура заместителей аминной группы влияла на связывание с ДНК новых производных. Наличие диметиламинного заместителя привело к ~6.4-кратному увеличению значения константы связывания соединения 3 по сравнению с 2. Таким образом, модификации боковой цепи, в частности, ее укорачивание до метоксиуксусного остатка с последующим блокированием свободной карбоксильной группы, позволяют получить производные оливомицина с высокой константой связывания с ДНК и перспективными терапевтическими характеристиками. 205 6. Проблема сознания в клинике ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО ВВЕДЕНИЯ АЛКОГОЛЯ НА ФОРМИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ И РАБОЧЕЙ ПАМЯТИ Ю.И.Александров 1), Б.Н.Безденежных 1) , С.В.Зворыкина 2) , К.В.Анохин 2,3). Институт психологии РАН, Москва; 2)НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН, Москва; 3)Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва 1) Известно, что пространственная память связана с активностью гиппокампа. Его повреждение, вызываемое ишемиями, травмами, вирусными и др. заболеваниями, сопровождается нарушением ориентации в пространстве. Для более тщательного исследования данной клинической патологии необходимо создать экспериментальную модель, имитирующую повреждение гиппокампа. Мы предполагали, что острое введение алкоголя может вызывать специфическое нарушение функций гиппокампа, имитируя повреждения этой структуры мозга у человека. Основанием для данного предположения были данные литературы о том, что острое введение алкоголя обратимо угнетает активность «нейронов места» гиппокампа (White, Best, 2000), а также полученные нами ранее в экспериментах с животными данные о том, что острое введение алкоголя в дозе 1 г/кг блокирует активность нейронов, гиппокампа и цингулярной коры, обеспечивающих наиболее высокие уровни системной организации поведения (Alexandrov et al., 1991, 1993). На животных оценка пространственной памяти, связанной с активностью гиппокампа, обычно проводится в лабиринтах Морриса и сравнивается с рабочей памятью, которая максимально проявляется в 8-рукавном радиальном лабиринте. В дальнейшем подобные исследования стали проводиться на человеке, осуществляющем перемещение уже в виртуальных лабиринтах, поддерживаемых специальными компьютерными программами. Для дифференцированной оценки функций памяти человека, зависящей от гиппокампа, и оценки влияния алкоголя на них, нами 206 была разработана система компьютерных тестов с навигацией испытуемого в виртуальной среде. Система состоит из трех основных модулей – задания протокола тестирования, теста с виртуальной средой и модуля визуализации траектории движения с сохранением результатов тестирования для последующего анализа. Мы использовали 2 вида виртуальных лабиринтов – Морриса и 8рукавный радиальный лабиринт. Система разработана на платформе Java, что позволяет разместить тесты на сайте в интернете для свободного доступа. Испытуемые (9 мужчин и 11 женщин в возрасте после 21 года, имеющие опыт потребления алкоголя) участвовали в экспериментах дважды с интервалом 3-6 месяцев в нормальном состоянии и в состоянии алкогольной эйфории (испытуемые выпивали 20 % раствор пищевого спирта из расчета 1 г на кг веса тела). В лабиринте Морриса они должны были научиться как можно быстрее находить скрытую под водой платформу и выбираться на нее. В 8-рукавном лабиринте нужно было научиться безошибочно находить подкрепление в 4 рукавах. Количество проб было 20 в обоих лабиринтах. Каждая проба начиналась со случайно выбранного участка в лабиринте. Порядок лабиринтов для прохождения, а также алкогольная и безалкогольная серии выбирались для каждого испытуемого случайно. Сравнивались время и путь прохождения от исходной точки до мишени, количество остановок, а также применяемые стратегии у испытуемых в двух состояниях и в двух лабиринтах. При обработке результатов применяли дисперсионный анализ. Показано, что испытуемые в состоянии алкогольного опьянения достоверно хуже справлялись с выполнением задачи в лабиринте Морриса, чем в нормальном состоянии. По этим же показателям достоверных различий выполнения задачи в 8-рукавном лабиринте в нормальном состоянии и состоянии алкогольного опьянения не выявлено. Таким образом, алкоголь существенно нарушает пространственную память, и, по-видимому, его действие на память может быть сопоставимо с расстройствами памяти при повреждении гиппокампа. Работа поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине». 207 СОЗДАНИЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧНЫХ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ТРАНСГЕННЫХ МОДЕЛЕЙ С НАПРАВЛЕННЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ЛОКАЛЬНЫХ ОБЛАСТЯХ МОЗГА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМОВ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ПАТОЛОГИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫМ ИЗМЕНЕНИЯМ П.М.Балабан, Н.В.Гуляева, В.А.Маркевич, С.В.Саложин, А.П.Большаков, М.Ю.Степаничев, Ш.С.Узаков, Е.П.Кулешова, Г.Р.Тухбатова Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН Ранняя стадия большинства нейродегенеративных заболеваний характеризуется нарушением работы определенных групп нервных клеток, поэтому существует потребность в терапевтическом подходе, позволяющем осуществлять локальное и специфическое действие на эти клетки. Возможность специфического и направленного действия представляют лентивирусные системы доставки генетической информации. В выполняемой работе исследуется нейропротекторный эффект трофических факторов, локально экспрессируемых в структурах мозга с помощью лентивирусных систем доставки. К настоящему моменту в институте проведены тестовые эксперименты на культуре клеток с использованием лентивирусных конструкций для экспрессии трофических факторов BDNF и GDNF. Методами иммуноцитохимии и Вестерн-блот анализа была продемонстрирована работоспособность полученных конструкций. Кроме того, были проведены исследования влияния увеличенной концентрации NGF (фактора роста нервов) на физиологические свойства нейронов при моделировании болезни Альцгеймера: суспензии лентивирусных частиц, полученные с плазмидных конструкция pCSC_CaMKII_hNGF-IRES-EGFP, несущей последовательность для экспрессии фактора роста нервов человека под контролем нейрон-специфичного промотора CaMKII, и контрольной конструкции pCSC_CaMKII_IRES-EGFP. Через 14-16 дней после введения суспензии в гиппокампе крыс наблюдалось увеличение концентрации NGF в гиппокампе на 50 % по сравнению 208 с образцами, полученными из контролькных животных. Усиление экспрессии NGF предотвращало ингибирующее влияние фрагмента бета-амилоида (25-35). Эти данные свидетельствуют о положительном влиянии повышенной экспрессии NGF на функциональное состояние нейронов гиппокампа при введении бА(25-35). В дельнейшей работе будет исследована зависимость продемонстрированного эффекта от действия NGF на активность холинергических нейронов, а также будет проведен сравнительный анализ действия различных трофических факторов при патологических воздействиях на ЦНС. ЭТНОГЕНОМНАЯ СТРАТИФИКАЦИЯ CNV И LOH В СЦЕПЛЕННЫХ С ДЕПРЕССИЕЙ И ШИЗОФРЕНИЕЙ РЕГИОНАХ К.Б.Булаева, Ф.Р.Гургенова, У.М.Гусейнова, О.А.Булаев Институт общей генетики им Н.И.Вавилова РАН Полногеномное исследование сцеплений с главной рекуррентной депрессией (ГРД) и шизфоренией (ШЗФ), впервые проведенное нами в этнически подразделенных изолятах, позволило установить инвариантные к подразделенности генетических изолятов и популяционно-специфические геномные сцепления. Полученные нами результаты воспроизводят данные предыдущих исследований по генетике ГРД в регионах 11p15, 12q23-24, 13q11-32, 18q22 и 22q1113. Межпопуляционную гомогенность в сцеплениях с ГРД мы установили в 1p36.1-p35.2, 2p13.2-p11.2, 6p22, 17q25.3, 18q22, 21q22 и 22q12.3, которая может быть связана с сохранившейся в «генетической памяти» современных больных блоков гаплотипов с патогенными локусами основателя (родоначальника) из общей для всех дагестанских народов пра-популяции, существовавшей около 300 поколений назад, в пользу существования которой свидетельствуют наши популяционно-генетические исследования коренных народов Дагестана. В сцепленных регионах локализованы гены, функции которых связаны с синаптическими механизмами нейротрансмиттеров и/или c функциями специфических регионов мозга: PLA2G2A1 и HTR6 (1p36.1-p35.2); TACR1, HTRA2, DCTN1, CTNNA2, LRRTM1 и LRRTM4 (2p13.2-p11.2 ); CSNK1D (17q25.3); DSEL (18q22), ApoL1-ApoL6 и SYN3 (22q12.3). В установленных 209 нами сцепленных с ГРД и ШЗФ регионах мы изучали полиморфизм одиночных нуклеотидов (AFFX SNP 5.0, 6.0), сканированных по всему геному у отобранных больных, всего по 500 тыс. SNPов у каждого больного. На основе этих данных мы анализировали наличие молекулярных аберраций в виде изменений числа копий ДНК (CNV) и потерь гетерозиготности (LOH). Мы обнаружили denovo микроделеции и микродупликации в сцепленных геномных регионах с генами-кандидатами ГРД и ШЗФ, а также воспроизвели ранее установленные редкие рекуррентные мутации, участвующие в патогенезе шизофрении. Общими для разных изолятов оказались геномные аберрации в виде CNV и/или LOH в 7 сцепленных с ГРД регионах и в 6 из 9 сцепленных с ШЗФ. 8 из 12 выявленных CNV у больных ГРД носят наследственный характер. В одном из изолятов у общего для всех современных больных ГРД родоначальника в 7-м поколении установлена делеция размером 120 кб внутри гена CTNNA2(2p12), полученная его 6 больными ГРД потомками. Аналогичные рекуррентные делеции и дупликации, полученные от общих предков, установлены для современных больных ГРД и ШЗФ в регионах 8p23, 1q21, 17p12, 20p13, 22q12. Наряду с этим выявлены спорадические CNV в одиночных случаях, не воспроизводящиеся ни у больных из того же или других изолятов, ни у здоровых. Ряд из выявленных молекулярных аберраций у больных ШЗФ и ГРД охватывает большие участки генома (от 500 до 4 тыс. кб) и охватывают много генов или являются межгенными (intergenic), другие – меньше по размерам и зачастую отражают делеции или дупликации внутри конкретных генов (интроны или экзоны). Изучение эффекта инбридинга на структуру и размеры таких вариаций показало, что LOH в существенной степени обусловлена геномной гомогенностью больных – потомков родственных браков во многих поколениях, традиционных для изучаемых изолятов. Обнаружен эффект инбридинга на размеры сегментов и типы вариаций числа копий (CNV). Полученные результаты исследования показывают важную роль этногеномной стратификации популяций человека в генетической архитектонике и в риске развития ШЗФ и ГРД. Это делает возможным проведение адекватной доклинической диагностики и своевременной профилактики ШЗФ и ГРД в соответствии с генетическим статусом 210 и этнической принадлежностью обратившегося в медучреждение больного. БЕСКОНТАКТНАЯ ДИАГНОСТИКА УМСТВЕННОГО УТОМЛЕНИЯ ОПЕРАТОРОВ ПРИ РАБОТЕ С КОМПЬЮТЕРОМ В.В.Дементиенко1), А.Н.Пучкова2), О.Н.Ткаченко2), В.Б.Дорохов2). Институт радиотехники и электроники им. В.А.Котельникова РАН, Москва; 2)Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва 1) Одним из путей предотвращения возможных катастроф в промышленности и на транспорте является использование компьютерных систем диагностики негативных функциональных состояний со сниженной работоспособностью по физиологическим показателям (Fatigue Detection System). В настоящее время большие надежды возлагаются на бесконтактный метод видеорегистрации движения глаз (eye tracking technology – видеотрекинга). Опыт разработок такого рода систем для водителей показал трудность надежной регистрации движения глаз у свободно движущегося водителя в кабине автомобиля. Однако есть много видов малоподвижной профессиональной деятельности по управлению сложными процессами, отражающимися на экране компьютера, что облегчает применение технология видеотрекинга для диагностики состояния утомления операторов. Нами была разработана методика моделирования умственного утомления в лабораторных условиях, позволяющая непрерывно регистрировать движения глаз и рук оператора. Согласно инструкции, испытуемые с максимальной скоростью и точностью решали появляющиеся на экране компьютера арифметические задачи. После вычисления ответа требовалось щелкнуть мышью по примеру и выбрать правильный ответ из двух появлявшихся на экране путем щелчка мышью по правильному ответу. Траектория движение взора испытуемого регистрировалось с помощью бесконтактной системы видеотрекинга (Eyegaze Development System, LC Technologies, USA), параллельно шла запись движений курсора мыши и электроэнцефалограммы (ЭЭГ). Такая схема позволяла одновременно анализировать динамику изменения 211 показателей координации зрительной и моторной систем, вызываемых умственным утомлением. В результате проведенных пилотных исследований (10 человек, 20 экспериментов) было показано, что оператор может поддерживать эффективность работы на стабильном уровне, однако в связи с недостаточным уровнем утомления заметных изменений в параметрах движений глаз не произошло. Тем не менее умственное утомление сказывалось на последующей деятельности, а степень восстановления зависела от типа отдыха. После часа спокойного бодрствования скорость работы постепенно снижалась, в то время как после сна работоспособность восстанавливалась и не снижалась в ходе второй сессии. Предварительные результаты были представлены на конференциях (Puchkova A.N. et al., 2011, 1, 2, 3). После проведения пилотных исследований методика была модифицирована для получения более выраженного умственного утомления за счет усложнения выполняемых задач и удлинения времени их выполнения. Литература 1) Puchkova A.N., Tkachenko O.N., Dorokhov V.B., Dementienko V.V. 2011. Evaluation of mental fatigue by eye and hand movement parameters // Abstracts of the 16th European Conference on Eye Movements, p. 172. 2) Puchkova A.N., Tkachenko O.N., Dorokhov V.B. 2011. Daytime nap recuperates psychomotor activity affected by mental fatigue // Abstracts of the 51st Annual Meeting of Society for Psychophysiological Research. Boston, MA. p. 133. 3) Пучкова А.Н., Ткаченко О.Н., Королева Н.В., Дорохов В.Б. 2011. Умственное утомление: восстановление зрительно-моторной координации после дневного сна // Материалы 6-й Российской (с международным участием) школы-конференции «Сон – окно в мир бодрствования». М., p. 89. ЭЛЕМЕНТЫ ОБРАТНОЙ ИНЖЕНЕРИИ НЕЙРОННЫХ СИСТЕМ НА УРОВНЕ БАЗОВЫХ ИНФОРМАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ В.Л.Дунин-Барковский, В.Б.Котов, И.А.Смирнитская, А.И.Жуков Научно-исследовательский институт системных исследований РАН, Москва 212 Одним из главных фокусов нейроисследований последнего времени становится уровень многонейронной интеграции при максимальном учёте биофизики составляющих нейронный ансамбль элементов. Проведенные в 2009–2011 гг. работы по проекту «Исследование соотношения сетевых и пейсмейкерных механизмов дыхательной ритмики в цикле бодрствование-сон» были направлены на сокращение разрыва между системным и нейронными уровнями анализа физиологических процессов. В частности, нами было показано, что возможна организация как пачечной ритмической активности отдельных нейронов, так и системная ритмическая активность нейронных групп, обусловленная взаимодействием процессов на наружной мембране нейрона и на мембране эндоплазматического ретикулума. Результаты получены при учёте свойств большого числа ионных каналов, встречающихся в нейронах продолговатого мозга. Для оценки возможностей реального взаимодействия моделирования с конкретными физиологическими данными мы провели цикл исследований по настройке нашей модели в соответствии с экспериментальными данными по регистрации нейронов B5 моллюска Helisoma trivolvis. Работа проводилась совместно с Л.Артинян и В.Редером из Отдела биологии Университета штата Джорджия (Атланта, США). Результаты позволили выдвинуть гипотезу о возможности посттормозной отдачи в нейронах без участия каналов, активирующихся при гиперполяризации. В связи с исследованием вопроса об эфферентных сигналах дыхательного центра мы рассмотрели проблему кодировании непрерывных и дискретных переменных в нейронных структурах. Частотное кодирования нейронами амплитуд воспринимаемых сигналов связано с синхронизацией и десинхронизацией нейронов с общей нагрузкой (например, мотонейронов одной мышцы). Интересен анализ множеств устойчивых состояний (аттракторов) в многонейронных системах. До недавнего времени считалось, что эти состояния формируются либо в процессах обучения под влиянием афферентных сигналов, либо за счёт связей, определяемых физическим расстоянием между телами нейронов (связи типа «мексиканская шляпа»). В последнее время появились данные о том, что межнейронные связи, обеспечивающие 213 аттракторные свойства нейронных сетей, могут формироваться в процессах онтогенеза с помощью молекулярных меток. Мы проанализировали ряд простых механизмов создания и распределения меток для нескольких видов нейронных аттракторов. В частности, исследовались правила создания наборов меток, обеспечивающих квазинепрерывные аттракторы для дискретных решёток для представления непрерывных переменных с размерностями d = 1, 2. 3. Кроме того, возможны наборы меток, создающие аттракторы размерности d = 0, то есть сети Хопфилда. Подключение аттракторов к выполнению реальных функций может достигаться обучением-настройкой афферентных и эфферентных связей нейронов с использованием алгоритмов типа персептронов и самоорганизующихся карт Кохонена. Понимание механизмов нейронного кодирования важно для fMRI и MEG. При существующих пространственных разрешениях этих методов регистрации нервных процессов разные паттерны активности нейронов сети должны быть неотличимы друг от друга, поскольку при оптимальном формировании аттракторов активные нейроны разных устойчивых состояний должны быть распределены равномерно и случайно в пространстве, занимаемом нейронной сетью (например, кортикальной гиперколонкой). НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ СОЗНАНИЯ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КЛИНИКЕ А.М.Иваницкий, Е.В.Шарова, Г.Н.Болдырева, В.Б.Стрелец, Э.А.Костандов Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН Электроэнцефалографическое исследование, проведенное на больных с глубоким угнетением сознания, здоровых взрослых и детях, показало, что у больных, находящихся в коме после черепномозговой травмы и поведенчески не реагирующих на внешние воздействия, сохранена электрическая реакция мозга на эмоционально значимые звуковые сигналы. Реакция на нейтральные и когнитивные стимулы при этом отсутствует. Изменения мощности ритмической активности мозга у больных с угнетением сознания 214 при предъявлении значимых стимулов наиболее сходны с реакциями детей. Наличие реакции на эмоциональные стимулы у больных с глубоким угнетением сознания представляет собой значимый положительный прогностический признак. Исследование прогностической значимости компонентов N 100, N 200 и P 300 акустического ВП при посттравматическом угнетении сознания в сопоставлении с МРТ-трактографией (данные сотрудников НИИ нейрохирургии им. Н.Н.Бурденко РАМН Н.Е.Захаровой и А.А.Потапова) выявило отсутствие всех компонентов АВП или наличие лишь N 100 и N 200 на стандартный тон при прослушивании звуков при хроническом бессознательном состоянии наряду с дегенерацией трактов мозолистого тела (вплоть до его полного “облысения”). У пациентов с восстановлением сознания еще при вегетативном состоянии все три компонента АВП выделяются на целевой тон при прослушивании звуков и с инструкцией считать их. Этому соответствует частичная сохранность трактов мозолистого тела, в частности в лобных отделах полушарий. Сопоставления ЭЭГ изменений и фМРТ-ответов, сопровождающих двигательную активность человека в норме и при церебральной патологии (опухоль, тяжелая травма мозга), имеют важное значение для уточнения структурного обеспечения двигательной функции и разработки подходов к компенсации двигательных нарушений. Исследования амплитудно-временных характеристик ранних компонентов зрительного вызванного потенциала – волн Р 100 и N 170 – при пассивном восприятии вербальной информации выявило их определенную значимость для постановки диагноза шизофрении: у больных людей при восприятии слов латентность этих компонентов снижена по сравнению с нормой в затылочнотеменных корковых областях левого полушария. Чем более выражена позитивная симптоматика, тем короче латентность, а чем более выражены негативные симптомы, тем ниже амплитуда ранних компонентов ВП. Кроме того, у больных шизофренией выявлен дефицит начальной стадии переработки смысловой информации и связь этих нарушений с выраженностью психопатологической симптоматики. Эти данные важны для диагноза и контроля за развитием заболевания на основе объективных показателей работы мозга. 215 Психофизиологические исследования влияния прошлого опыта на функцию восприятия и опознания лицевой экспрессии показали, что существуют различия между детьми дошкольного и младшего школьного возраста в формировании когнитивной установки на эмоционально-негативное выражение лица и в способности к ее смене при изменении ситуации. У дошкольников 5-6-летнего возраста установка достаточно ригидна, что связано с незрелостью фронто-таламической системы избирательного внимания. Лишь в 10-летнем возрасте, по мере морфологического созревания кортикогиппокампальной и фронто-таламической систем мозга, функция опознания негативной лицевой экспрессии становится похожей на взрослую. Полученные данные имеют практическое значение в сфере нормальной и коррекционной педагогики. ОСОБЕННОСТИ РЕГИОНАРНОГО ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ В ВЕГЕТАТИВНОМ СОСТОЯНИИ (ДЛИТЕЛЬНОЙ КОМЕ) КАК ОСНОВА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ПРОГНОСТИЧЕСКИХ КРИТЕРИЕВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СОЗНАНИЯ С.В.Медведев, Ю.И.Вайншенкер, И.М.Ивченко, А.Д.Коротков, Л.А.Мелючева, Г.В.Катаева Институт мозга человека им. Н.П.Бехтеревой РАН Проведен анализ данных комплексного структурного и функционального нейровизуализационного обследования 37 больных, находившихся в вегетативном состоянии (длительной коме) травматического или гипоксического генеза и сопоставление их с результатами динамического углубленного неврологического исследования. В ходе лечения (3-6 месяцев) и последующего наблюдения (до 2 лет) уровень сознания у 3 человек восстановился до ясного, у 12 – до малого сознания. У 13 человек уровень сознания остался без изменения, 6 человек умерли. Сопоставление влияния исходного уровня регионарного энергетического метаболизма по данным позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) на последующую степень восстановления сознания проводилось методом расчёта средних значений скорости метаболизма глюкозы (СМГ) в областях интереса, соответству216 ющих отдельным полям Бродмана (ПБ) и подкорковым структурам. При дисперсионном анализе полученных значений выявлено, что у пациентов, уровень сознания которых в ходе лечения восстанавливался при сравнении с больными, у которых такой динамики не отмечено на момент первичного ПЭТ-обследования, отмечался более низкий (р<0.05) уровень СМГ в мозжечке и стволе мозга, а также в ряде областей коры лобных долей (ПБ 1,2,3,4,10 и 11 левого большого полушария, и ПБ 9, 44 и 45 правого), правой височной доли (ПБ 28, 34, 35 и 38) и в передних подкорковых ядрах (бледный шар, подушка), а более высокий уровень СМГ – в коре затылочных долей (ПБ 17 и 18) и левой височной доли (ПБ 22, 29 и 30). Более низкий уровень СМГ в коре лобных и височных долей у пациентов с последующим лучшим восстановлением сознания соответствует представлениям о вегетативном состоянии как о проявлении устойчивого патологического состояния. Более высокий уровень СМГ в зрительной и слуховой, а также в ретроспленальной коре указывает на большую сохранность или более высокий уровень функциональной активности центрального звена зрительного и слухового анализаторов, а также элемента нейроанатомической системы, обеспечивающей память этой группы больных. Полученные результаты могут в дальнейшем явиться основой для разработки прогностических критериев восстановления сознания у больных в вегетативном состоянии. АЛЛЕЛИ ГЕНА CYP2E1*5B, ПОТРЕБЛЕНИЕ АЛКОГОЛЯ И СУИЦИД-ПОПУЛЯЦИОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Л.А.Радкевич, Л.А.Пирузян, А.В.Синцов, А.С.Кабанкин, К.С.Гюльазизова, И.С.Николаева, Д.А.Радкевич Учреждение Российской академии наук Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН Россия относится к странам с высоким уровней суицидов (25-42 чел./100 тыс.). Высокая смертность от суицидов в России вносит определенный вклад в общую смертность России. Ежегодно число самоубийств в мире составляет около 4 миллионов человек, в пять раз больше человек ежегодно совершают неудачные попытки самоубийства. Суицид часто связывают с депрессиями и 217 злоупотреблением алкоголем. До 70 % депрессивных больных обнаруживают суицидальные намерения. Показано, что от 30 до 66 % жертв суицидов имели в крови алкоголь. Анализ временных серий показал, что рост потребления алкоголя на душу населения на 1 л сопровождается ростом суицидов на 3 %. Для 31 этнической популяции проанализирована связь популяционной смертности от суицида с суточными нормами потребления алкогольных напитков и частотой встречаемости (ЧВ) аллелей гена CYP2E1*5B. С использованием рангового коэффициента корреляции Спирмена установлена значимая положительная корреляционная связь коэффициентов смертности (КС) от суицида с ежедневными нормами потребления алкогольных напитков (крепкого алкоголя, вина и пива) в различных возрастных группах мужчин и женщин. Кроме того, установлена значимая отрицательная корреляционная связь КС от суицида мужчин и женщин в различных возрастных группах с ЧВ полиморфных аллелей гена CYP2E1*5B (rs2031920 T и rs3813867 C). По степени корреляционной связи выявлены гендерные различия и различия между возрастными группами. Корреляционные связи у женщин ниже, чем у мужчин. В старших возрастных группах (после 50 лет) мужчин и женщин связь суицида с алкоголем ослабевает. С помощью пошагового множественного регрессионного анализа для КС от суицида мужчин и женщин построены статистически достоверные двухпараметрические регрессионные модели, содержащие в качестве независимых переменных норму потребления крепкого алкоголя и ЧВ аллеля rs3813867C гена CYP2E1*5B. Все регрессионные коэффициенты в обеих моделях статистически значимы. Доля объясненной популяционной изменчивости КС от суицида составляет для мужчин 64 % (R²= 0,6396; F(2,27)=23,96 p=0,000001) и для женщин 41 % (R²= 0,41; F(2,27)=9,452 p=0,00077). ЧВ аллелей rs2031920T и rs3813867C в популяциях россиян различны. Применение двухпараметрической регрессионной молели дает возможность учесть этот генетический фактор, что приводит в итоге к некоторым различиям в КС от суицида в различных российских популяциях. Чем выше в популяциях ЧВ аллеля rs3813867C, тем ниже КС от суицида. Так, КС от суицида мужчин и женщин у коми равен 56,8 и 13,83/100 тыс., у адыгейцев – 218 56,3 и 13,67 /100 тыс., у чувашей – 54,7 и 13,18 /100 тыс., у ханты – 53,9 и 12,92 /100 тыс., у якутов – 52,6 и 12,47/100 тыс. соответственно. Использование этих регрессионных моделей позволяет также определить влияние снижения российских суточных норм потребления алкогольных напитков на КС от суицида в России. Показано, что можно прогнозировать снижение КС от суицидов в России на 0,6 и 6,8 % в среднем при снижении популяционного потребления крепкого алкоголя на 1 и на 10 % соответственно. Ключевые слова: смертность от суицида, генетический полиморфизм CYP2E1*5B, аллели rs2031920T и rs3813867C, суточные нормы потребления этанола, вина, пива, корреляционный и регрессионный анализ. ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ ПСИХИЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ У ДОЛГОЖИТЕЛЕЙ И ИХ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КОРРЕЛЯТЫ Д.Л.Спивак1), А.Г.Захарчук2), В.А.Куприянова1), Т.Ю.Смирнова3), Г.С.Якупова3), И.М.Спивак3) Институт мозга человека РАН; 2)Городской гериатрический медико-социальный центр Санкт-Петербурга; 3)Институт цитологии РАН 1) В результате выполнения проекта в 2011 году, по данным комплексного обследования более 300 лиц пожилого, старшего возраста и долгожителей, проведенного на базе стационара Городского гериатрического медико-социального центра Санкт-Петербурга: - в рамках психологического блока проведено разделение психологических процессов у нормального человека при старении на процессы, непосредственно обеспечивающие противодействие возрастному стрессу (в лице прежде всего базовых психологических защит – отрицания, вытеснения, регрессии, компенсации, проекции, замещения, интеллектуализации, реактивного образования), и процессы, включенные в решение более общих задач (типа задействования скрытых резервов психики), которые оказываются также связанными с достижением и поддержанием активного долголетия. Данный результат представляется конструктивным при уточнении мишеней психокоррекционного воздействия у лиц пожилого и 219 старого возраста; в рамках генетического блока установлен факт непосредственной вовлеченности определенного (А2) аллеля гена серотонинового рецептора 5THR2A в достижение и поддержание активного долголетия. Как известно, носители данного аллеля чаще страдают различными психическими расстройствами (Abdolmaleky et al., 2004; Golimbet et al., 2007). Вместе с тем в последние годы накапливаются данные о том, что некоторые гены, вовлеченные в патогенез различных психических заболеваний, могут участвовать в поддержании повышенной творческой активности, что, по всей видимости, и способствует их сохранению в популяции на достаточно высоком (1–1.5 %) уровне (Cпивак, 2011; роль таких генов в процессе развития головного мозга в ходе эволюции человека в настоящее время активно обсуждается, ср.: Simeonova et al., 2005; Keri, 2009). На этом основании можно предположить, что выявленная нами связь А2 аллеля данного гена с вероятностью достижения активного долголетия является неслучайной. Кроме того, установлен факт качественно различного (практически инвертированного) распределения аллелей А1 и А2 гена серотонинового рецептора 5THR2A в популяции городских жителей Северо-Запада РФ, сравнительно с популяцией городских жителей США – а именно, 0.397(А1), 0.603(А2) для первых и 0.615(А1), 0.385(А2) для вторых (ср. Inayama et al., 1996). Наконец, получено подтверждение корреляции длин теломер, измеренных методом RT-PCR, с возрастом респондентов старшей возрастной группы. Данные результаты представляются конструктивными для уточнения генетических механизмов и коррелятов оптимальных стратегий продления жизни, а также структуры и дозировок лекарственных средств, мишенями которых является, в особенности, серотониновая система. Спивак И.М. Генетическая связь креативности и психических заболеваний // Ученые записки СПб ГМУ им. И.П.Павлова. 2011, Т. XVIII, № 4, с. 11-14. Abdolmaleky H.M., Faraone S.V., Glatt S.J., Tsuang M.T. Meta-analysis of association between the T102C polymorphism of the 5HT2a receptor gene and schizophrenia // Schizophr Res. 2004, Vol. 67, No. 1, p.53-62. Golimbet V.E., Lavrushina O.M., Kaleda V.G., et al. Supportive evidence for the association between the T102C 5-HTR2A gene polymorphism and 220 schizophrenia: A large-scale case-control and family-based study // Eur Psychiat. 2007, Vol. 22, No. 3, p. 167-170. Inayama Y., Yoneda H., Sakai T. et al. Positive association between a DNA sequence variant in the serotonin 2A receptor gene with schizophrenia // Am J Med Genet. 1996, No. 67, p. 103-105. Keri S. Genes for psychosis and creativity: A promoter polymorphism of the neuregulin 1 gene is related to creativity in people with high intellectual achievement // Psychol Sci. 2009, Vol. 20, p. 1070–1073. Simeonova D.I., Chang K.D., Strong C., Ketter T.A. Creativity in familial bipolar disorder // J Psychiatr. Res. 2005, Vol. 39, No. 6, p. 623-31. ПАТОГЕНЕЗ И ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФОРМАЦИОННОГО НЕВРОЗА НА РАННИХ СТАДИЯХ ЕГО РАЗВИТИЯ (ПЕРЕХОДНОГО СОСТОЯНИЯ ОТ НОРМЫ К ПАТОЛОГИИ) М.М.Хананашвили ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва Формированию экспериментальной информационной патологии поведения (информационной болезни – у человека) предшествуют изменения в высшей нервной (психической) деятельности, отражающие саморегуляционную функцию головного мозга, направленную на повышение устойчивости организма к факторам информационной триады. Установлено, что под влиянием неблагоприятного сочетания факторов информационной триады (объем информации, время, отведенное на обработку информации, включая этап принятия решения, и высокий уровень мотивации) возникают изменения в поведении, которые в течение длительного времени рассматривались как ранние симптомы патологии и, соответственно, устранялись (лечились). Считается, что «латентный период болезни» (так он называется в медицине) продолжается с момента начала действия патогенного раздражителя до появления патогенных симптомов. При этом совершенно не учитывается, что эти так называемые «патогенные» симптомы могут быть совсем не патологическими, даже наоборот, как правило, они являются защитными, предупреждают способность болеть. На самом деле, как показали наши 221 исследования, самые ранние изменения в поведении отражают защитную, саморегуляционную деятельность, которую необходимо не подавлять (подвергать лечению), а поддерживать и усиливать. Этим выводом открывается принципиально новый путь по профилактике болезни и по поиску средств, повышающих устойчивость организма к информационной патологии. В этом заключается большое практическое значение проведенного исследования. В теоретическом плане результаты исследования дают основание для предположения о формировании – в ответ на патогенный раздражитель – двух более-менее независимых систем, имеющих биологически положительное и биологически отрицательное значение, причем порог возникновения первой ниже порога возникновения второй системы. Формирование двух разных функциональных систем мозга подтверждается нейрофизиологическими исследованиями: в условиях возможности электрической самостимуляции лимбических структур головного мозга животное предпочитает стимуляцию перегородки (septum) головного мозга, которая, очевидно, является одной из центральных образований в мозговой системе регуляции адаптивного поведения. ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ МОДЕЛЬНОГО ОПИСАНИЯ РЕАКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ОСОЗНАНИИ СЕНСОРНЫХ СИГНАЛОВ (РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ПРОГРАММНЫХ МОДЕЛЕЙ, СИМУЛИРУЮЩИХ СОЗНАТЕЛЬНЫЕ И БЕССОЗНАТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ РАСПОЗНАВАНИЯ) В.Г.Яхно1), С.Б.Парин2), С.А.Полевая2), А.А.Тельных1), О.В.Шемагина1), И.В.Нуйдель1), В.А.Антонец1), В.А.Демарева2), Г.С.Радченко2), М.А.Чернова2), П.И.Коган2), А.В.Ковальчук1), М.Е.Соколов1), О.А.Санина1), А.Г.Санин1), Т.А.Яхно1) Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород; 2)Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского 1) Проведен дальнейший анализ архитектуры нейроноподобных программных моделей, ориентированных на создание элементов 222 «цифровой нервной системы» с функциями осознания сенсорных сигналов [1-4]. Разработаны программные модели детекторов выделения объектов на изображениях и определения их атрибутов, которые тестировались на примере лиц человека [2]. Проведено компьютерное моделирование процессов предобработки сенсорных сигналов в таламо-кортикальных сетях [4]. Продемонстрирована возможность использования устройства для анализа многокомпонентных жидкостей как сенсорного элемента симулятора живой системы [5-6]. С помощью разработанных ранее новых технологий психофизических измерений проводился набор следующих данных: психологические и психофизиологические особенности постстрессового состояния ветеранов боевых действий; показано, что левополушарная доминантность по показателям ЗЛФ представляет собой возможный маркер оптимального функционального состояния для решения тестов на английском языке школьниками; показатели работы когнитивной системы использовались для оценки профессиональных рисков у монтажников-высотников при периодическом медосмотре; и ряд других данных [7-8]. Результаты этих измерений предполагается использовать при оценке величин параметров в базовых математических и компьютерных моделях нейроноподобных систем. Разрабатываемые элементы системы необходимы для проведения индивидуальной диагностики функционального состояния каждого конкретного пациента (в том числе и «визуализация» причин его болезненных состояний). Версии программных реализаций, использующие алгоритмы с осознанием входного образа, используются в разработке биометрических систем. 1. С.Б.Парин, М.А.Чернова, С.А.Полевая. Адаптивное управление сигналами о рассогласовании в когнитивных процессах: роль эндогенной опиоидной системы. // Изв. вузов. Прикладная нелинейная динамика. 2011. Т. 19, № 6 (принято к печати). 2. N.Bellustin, Y. Kalafati, Kovalchuck, A. Telnykh, O. Shemagina, V.Yakhno, Abhishek Vaish, Pinki Sharma, Shirshu Verma, "Instant Human Face Attributes Recognition System", (IJACSA) International Journal of Advanced Computer Science and Applications, Special Issue on Artificial Intelligence, pp. 112-120. 3. Яхно В.Г. Основные динамические режимы осознания сенсорных сигналов в нейроноподобных базовых моделях. Проблемы на пути к 223 «нейроморфному» интеллекту. // Изв. вузов. Прикладная нелинейная динамика. 2011. Т. 19, № 6 (принято к печати). 4. Соколов М.Е., Кузнецова Г.Д., Нуйдель И.В., Яхно В.Г. Симулятор динамических процессов преобразования сенсорных сигналов в таламокортикальных сетях. // Изв. вузов. Прикладная нелинейная динамика. 2011. Т. 19, № 6 (принято к печати). 5. Т. Яхно. Кровь как полидисперсная система. Lambert Academic Publishing GmbH & Co, Germany. 2011, 313 С. 6. Санина О.А., Яхно Т.А., Санин А.Г. Устройство для анализа многокомпонентных жидкостей как элемент симулятора живой системы //Нелинейная динамика в когнитивных исследованиях – 2011: труды конференции /Рос. акад. наук, Ин-т приклад. физики. Нижний Новгород: ИПФ РАН, 2011.- с. 178-181. 7. Коган П.И. Психологические и психофизиологические особенности постстрессового состояния ветеранов боевых действий //Нелинейная динамика в когнитивных исследованиях – 2011: труды конференции / Рос. акад. наук, Ин-т приклад. физики. Нижний Новгород: ИПФ РАН, 2011.- с. 97-99. 8. Каратушина Д.И., Некрасова М.М. Использование показателей работы когнитивной системы для оценки профессиональных рисков у монтажников-высотников при периодическом медосмотре //Нелинейная динамика в когнитивных исследованиях – 2011: труды конференции / Рос. акад. наук, Ин-т приклад. физики. Нижний Новгород: ИПФ РАН, 2011.- с. 80-81. 7. Нейродегенеративные заболевания ЦИТОКИН- И ЛИПОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ДИМЕБОНА И РИВАСТИГМИНА А.В.Алесенко1), С.О.Бачурин2), , С.И.Гаврилова3), С.В.Гурьянова1), Д.А.Круговов1), О.В.Рыжкова1), Я.Б.Федорова3), Е.Ф.Швецова2), Л.Н.Шингарова1) Институт биохимической физики РАН, Москва; 2)Институт физиологически активных соединений РАН, Черноголовка; 3) Научный центр психического здоровья РАМН, Москва 1) В патогенезе многих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, деменция при СПИДе, церебральная ишемия, инсульты различной этиологии и др., ключевую роль играет фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) – полипептид, относящийся к 224 семейству провоспалительных цитокинов, который индуцирует воспалительные процессы в мозге при нейродегенерациях. Поиск новых перспективных препаратов для предупреждения и лечения нейродегенеративных патологий предполагает поиск новых адекватных мишеней. К таким мишеням относится фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α). В связи со значимостью ФНО-α при развитии нейропатологий различного генеза и его ролью при БА в наших экспериментах мы исследовали влияние нейропротектора димебона-(3,6-диметил-9-(2метил-пиридил-5)-этил-1,2,3,4-тетрагидро-карболина дигидрохлорида), синтезированного в ИФАВ РАН и предложенного в настоящее время для лечения болезни Альцгеймера. Исследовали димебон в качестве цитопротектора при токсическом действии рекомбинатного ФНО-α на культуру клеток мышиных фибробластов L929. Показано, что димебон защищает клетки от гибели в условиях предварительной обработки им клеток, в то время как его добавление к клеточной культуре после контакта с ФНО-α защитный эффект не наблюдался. Наши исследования предполагают, что цитопротекторное свойство димебона проявляется на уровне рецепторов ФНО-α. Из данного предположения следует, что хроническое применение димебона позволит защитить клетки мозга от токсического действия ФНО-α даже в условиях его непрерывного синтеза при развитии тех видов нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, рассеянный склероз и т.д.), в патогенезе которых провоспалительный цитокинфактор некроза опухоли играет ключевую роль. Была исследована способность димебона препятствовать нарушениям в липидном метаболизме мозга, вызванным ФНО-α. Для этого мышам внутрибрюшинно вводили ФНО-α (100 мкг на мышь), димебон (1 мг димебона) и их комбинацию в соответствующих концентрациях. В качестве контроля использовали животных, которым вводили физраствор на соответствующие сроки эксперимента. Исследовали изменение содержания гликозилцерамида, сфингомиелина, фосфатидилхолина, лизофосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина в гиппокампе, коре и мозжечке животных. Обнаружена способность димебона к нормализации уровня всех исследованных липидов во всех отделах мозга, отклонение от нормы которых вызвана введением ФНО-α. Методом хромато-масс-спектрометрии 225 проведено детектирование по молекулярным массам отдельных типов фосфолипидов и гликозилированных церамидов при введении ФНО-α, димебона и их комбинации. Показана избирательность действия индукторов на определенные молекулярные виды тех или иных липидов в различных отделах головного мозга мышей, однако димебон способствует нормализации спектра липидов, нарушение в котором вызвано цитокином. Методом хромато-масс-спектрометрии также было показано, что ривастигмин-ингибитор ацетилхолинэстеразы, применяемый в терапии болезни Альцгеймера и деменции при болезни Паркинсона, также нормализует молекулярных спектр фосфолипидов в плазме крови пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. Ривастигмин оказывает также антиоксидантную за-щиту, коррелирующую с уровнем полиненасыщенных кислот в молекулах фосфолипидов. Возможно, что кроме глутаматэрги-ческих рецепторов – мишени для димебона и ацетилхолинэстеразы – мишени для ривастигмина, ФНО-α и липидные компоненты мембран клеток мозга и крови могут быть объектами корректи-рующего влияния этих препаратов.при развитии нейропатологий. Это позволяет значительно расширить представления о механизме действия этих нейропротекторов за счет их способности корректировать липидный метаболизм как в модельных условиях, так и в клинической практике. ДОСИМПТОМНАЯ СТАДИЯ МФТП МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА У МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6: АНАЛИЗ ВОЗМОЖНЫХ КОМПЕНСАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ А.С.Базян, Н.Ю.Ивлиева, Н.В.Щеголевский, В.А.Коршунов Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва Нигростриатная дофаминергическая система выполняет специифическую функцию, она контролирует активность ГАМК и глутаматергической передачи дорзального стриатума. ГАМК и глутаматергическая системы дорзального стриатума участвуют в реализации поведения, осуществляя моторный контроль. Показано, что при БП под влиянием деградации нигростриарной дофамин226 ергической системы активность ГАМК и глутаматергической передачи меняется. На ранних стадиях паркинсонизма активность ГАМК и глутатаматергических систем увеличивается, при более поздних стадиях, наоборот, активность этих систем уменьшается. Предполагается, что именно уменьшение эффективности ГАМК и глутаматергической системы дорзального стриатума является причиной брадекинезии. Эта точка зрения обосновывается тем, что высокочастотная стимуляция коры, увеличивающая эффективность глутаматергической передачи в стриатуме, снимает брадекинезию. В то же время высокочастотная стимуляция globus pallidus, усиливающий ГАМКергический выход из стриатума, также снимает брадикинезию. L-DOPA, который широко используется при лечении паркинсанизма, препятствует усилению ГАМК и глутаматергической передачи на ранних стадиях и уменьшению ГАМК и глутаматергической передачи на поздних стадиях БП. Такая пластичная реакция ГАМК и глутаматергической систем дорзального стриатума позволяет предположить, что компенсаторные механизмы досимптомной фазы могут быть связаны с этими системами. В связи с этим целью работы 2011 года было исследование межклеточной концентрации ДА и его метаболитов ДОФУК и ГВК, серотонина (СТ) и его метаболита 5ОИУК, ГАМК и глутамата методом микродиализа в модели досимптомной стадии БП. Было показано, что двукратная инъекция МФТП в дозе 12 мг/кг с интервалом 2 часа не вызывает нарушения поведения у мышей через 14 суток. При этом межклеточная концентрация ДА уменьшается на 29 %. Межклеточная концентрация метаболитов ДА – ДОФУК и ГВК не меняется. Практически не меняется межклеточная концентрация СТ и его метаболита 5-ОИУК. Межклеточная концентрация ГАМКа и глутамата в дорзальном стриатуме мышей линии C57BL/6 остается без изменений через 14 суток после двукратная инъекция МФТП в дозе 12 мг/кг с интервалом 2 часа. Можно полагать, что устойчивое сохранение межклеточной концентрации ГАМКа и глутамата является одним из компенсаторных механизмов, препятствующих проявлению симптомов БП. Известно, что в начальных стадиях БП уменьшение концентрации ДА в стриатуме сопровождается повышением активности ДА рецепторов. Эти ДА рецепторы локализованы на 227 средних звездчатых нейронах дорзального стриатума, которые составляют 95 % от всей популяции нейронов дорзального стриатума. Сами средние звездчатые нейроны являются основным источником ГАМК в стриатуме, так как они ГАМКергические. Дендритное дерево этих нейронов получает глутаматергическую иннервацию от разных областей коры. Можно предположить логическую цепочку досимптомной стадии БП. Уменьшение концентрации ДА, повышение активности ДА рецепторов, компенсация регуляторных реакций средних звездчатых нейронов дорзального стриатума ДА. РАЗРАБОТКА ОРИГИНАЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (ПРОТЕИНОПАТИЙ) С ЦЕЛЬЮ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМА РАЗВИТИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ И ПОИСКА НА ЭТОЙ ОСНОВЕ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, ДЕЙСТВУЮЩИХ НА ПАТОГЕНЕЗ ЗАБОЛЕВАНИЯ С.О.Бачурин, В.С.Кохан, А.А.Болкунов, А.А.Устюгов, Н.Н.Нинкина, Т.А.Шелковникова Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка Патологическая aгрегация белков является критическим звеном патогенеза многих распространенных нейродегенеративных заболеваний человека, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, фронто-темпоральную деменцию, хорею Гентингтона, боковой амиотрофический склероз и ряд других. Одним из перспективных подходов к предупреждению и коррекции подобных заболеваний является разработка препаратов, способных препятствовать образованию агрегированных патогенных форм белков и/или активировать внутриклеточные защитные системы, осуществляющие контролируемую деградацию патогенных продуктов белковой агрегации. Использование линий трансгенных животных позволяет оптимизировать исследования по разработке и изучению такого типа болезнь-модифицирующих нейропротекторных лекарственных средств. В настоящем исследовании нами были использованы и охарактеризованы линии трансгенных мышей со сверхэкспрессией потенциальноамилоидогенных белков: тау, гамма-синуклеина и альфасинуклеина, у которыx с возрастом происходит накопление в тканях 228 нервной системы характерных гистопатологических структур. Исследованы разработанные в ИФАВ РАН новые препараты – биоизостерные аналоги препарат Димебон: Д2 и Д12. Нами было показано, чтo хроническое введение препаратов Д2 и Д12 статистически достоверно замедляет развитие симптомов нейродегенерации у модельных мышей, вызванной гаммасинуклеинопатией и тау-патией, причем эффективность действия новых производных по некоторым показателям выше оригинального препарата Димебон. В случае альфасинуклеинопатии Димебон и его производные оказались неэффективны. Таким образом, разработанные нами генетические модели нейродегенеративных заболеваний человека могут быть использованы при отборе новых препаратов, действующих непосредственно на патогенез протеинопатий. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К ЛЕЧЕНИЮ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА НА ОСНОВЕ ИММУНОКОРРЕКЦИИ И АКТИВАЦИИ КОМПЕНСАТОРНЫХ МЕХАНИЗМОВ Н.В.Бобкова1, Н.И.Медвинская1, И.В.Нестерова1, И.Ю.Александрова1, А.Н.Самохин1, О.М.Вольпина2, А.В.Камынина2, М.А.Орлов1, М.М.Панченко1, М.Б.Евгеньев1 1 Институт биофизики клетки РАН; 2 Институт биоорганической химии имени акад. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Наша работа явилась продолжением исследований, проводимых в рамках Программы Президиума РАН в 2009-2010 годах, и была посвящена разработке способов лечения болезни Альцгеймера (БА) путем воздействия на патогенетические механизмы ее развития. Одним из характерных признаков БА является гибель нейронов, опосредованная взаимодействием бета-амилоида (βА) с рядом нейрональных рецепторов, в частности с α7-ацетилхолиновыми (α7АХР) и прионными рецепторами (PrPc). В основу разрабатываемого нами иммунологического метода была положена идея протекции этих рецепторов от связывания с βА. Особое внимание уделено возможности использования аффинноочищенных антител к фрагментам α7АХР и прионового белка. 229 Исследование проведено на бульбэктомированных (ОБЭ) мышах с проявлениями нейродегенерации альцгеймеровского типа. Установлено, что в зависимости от дозы введенных аффинноочищенных антител ОБЭ мыши характеризовались разной степенью улучшения пространственной памяти, тестируемой в водном лабиринте Морриса. Наиболее эффективной оказалась четырехкратная иммунизация антителами к фрагментам α7АХР в дозе 2,5 мкг/мышь. При этом наблюдалась корреляция позитивного действия антител на память с улучшением морфофункционального состояния нейронов коры и гиппокампа ОБЭ мышей, которое оценивалось по выраженности патологических реакций в нейронах. Пассивная иммунизации аффинно-очищенными антителами к фрагменту PrPc в диапазоне доз от 0.8 мкг/мышь до 7.5 мкг/мышь также улучшала пространственную память ОБЭ мышей, при этом в мозге иммунизированных ОБЭ мышей было отмечено двукратное снижение содержания βА. Другим направлением работы явилось изучение возможности использования активации эндогенных протективных механизмов для сдерживания развития нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа, для чего мы исследовали отдаленные последствия применения белка теплового шока 70 (БТШ70). ОБЭ животные характеризовались хорошей пространственной памятью через 6 месяцев после окончания трехнедельного курса интраназального введения человеческого рекомбинантного БТШ70, нарабатываемого в бакуловирусной экспресссионной системе в клетках шелкопряда (Spodoptera), в то время как у нелеченых ОБЭ животных отмечено нарушение памяти. В последнее время все больший интерес исследователей и клиницистов вызывает возможность использования клеточной терапии в борьбе с нейродегенеративными заболеваниями, однако на пути внедрения этой технологии стоит ряд серьезных препятствий, в частности доставка и дальнейшее поведение клеток в мозге реципиента. Введенные в хвостовую вену прогениторные нейральные и мезенхимальные клетки человека проникали в мозг ОБЭ мышей, что было установлено в иммуногистохимических исследованиях с использованием антител к белку ядер клеток человека. Новым направлением исследования явился дифференцированный подход к выбору антидепрессантов для 230 лечения депрессивного состояния, наблюдаемого более чем у 50 % больных БА. Из шести изученных антидепрессантов наилучший эффект на память ОБЭ животных имели тразодон и флувоксамин – избирательные блокаторы обратного захвата серотонина. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования знаний фундаментальной науки для разработки новых подходов к лечению БА. Считаем целесообразным продолжение исследований в данном направлении. РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-ТЕСТА ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И ДРУГИХ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В.В.Вознесенская 1) , А.В.Амбарян 1), А.Е.Вознесенская 2), Н.А.Вознесенский 3), М.А.Ключникова 1), Е.И.Родионова 2) 1) Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН, Москва 2) Институт проблем передачи информации им. А.А.Харкевича РАН, Москва 3) Институт пульмонологии ФМБА РФ, Москва Для ряда неврологических заболеваний, таких, как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП) характерны такие ранние симптомы, как резкое падение остроты обоняния. Было показано нарушение обонятельной памяти при БА. Расстройства обоняния при БА являются двухсторонними и прогрессируют по мере развития болезни. При БП нарушение обонятельной функции обнаруживают более 95 % больных уже на самых ранних стадиях течения заболевания. В противоположность БА при БП обонятельная чувствительность снижается на ранних стадиях заболевания и далее остается на том же уровне. В настоящее время в США в клинической практике широко используются стандартизированные методы тестирования обонятельной функции для дифференциальной диагностики при неврологических расстройствах. Самым распространенным является Smell Identification TestTM (Sensonics, Inc., Haddon Heights, NJ), разработанный в Пенсильванском университете (ТПУ). ТПУ позволяет выявить большинство нарушений обоняния и исключить 231 симуляцию расстройств обоняния. Тест содержит 40 образцов различных запахов с вариантами ответа. Тест снабжен точным количественным расчетом показателей, свидетельствующих о развитии заболевания. Достоинством теста являются: надежность, низкая себестоимость, простота использования, возможность тестирования в любых условиях, даже самотестирования в домашних и полевых условиях. Тест отличает очень высокая воспроизводимость результатов (r=0.90-0.92). За высокой чувствительностью такого метода стоит патофизиология развития БА. Показано, что развитие болезни начинается именно со структур обонятельной системы: нейрофибриллярные клубки и бляшки появляются в энторинальной и трансэнторинальной областях мозга на самой ранней стадии. Разработка полного национального теста для оценки обонятельной функции населения значительным образом облегчила бы преклиническую диагностику нейродегенеративных заболеваний. Целью нашей работы являлась разработка российского варианта ольфакторного теста на основе ТПУ. Нами было протестировано 209 здоровых испытуемых, проживающих в мегаполисе и в сельской местности. В контрольную группу были включены здоровые испытуемые с известной историей болезней. Отсутствие аллергических воспалений контролировалось по уровню окиси азота, измеренному в носовой полости с помощью хемилюминесцентного анализатора (Logan Research-2149) . Не было обнаружено достоверных различий в ТПУ между городскими и сельскими жителями (33.85 0.24 и 33.59 0.74), испытуемыми со средним и высшим образованием (33.00 0.80 и 33.66 0.26), а также не выявлено влияния курения на показатели в тесте при сравнении соответствующих возрастных групп между собой. Полученные данные сопоставимы с таковыми для населения США. Причиной более низких значений в этом тесте для российского населения является использование малознакомых, а вследствие этого неузнаваемых запахов. При разработке теста одним из критериев включения в него того или иного одоранта был «процент узнаваемости» – 75 %. При адаптации мы пользовались той же условной границей. На основании этого произведена замена для 4 одорантов. Для этих целей фирмой Сенсоникс (США) предоставлены альтернативные образцы одорантов. Был доработан «ключ» теста с учетом произведенных замен. С разработчиками 232 американского варианта теста достигнута договоренность о выпуске пробной партии российского варианта теста в 2012 году для тестирования в российских клиниках. ИММУНОПРОТЕОСОМА КАК МИШЕНТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ИННОВАЦИОННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ А.Г.Габибов1, Н.А.Пономаренко1, В.Д.Кнорре1, А.А.Белогуров1, И.В.Смирнов1, И.Н.Куркова1, Д.Г.Илюшин1, Я.А.Ломакин1, А.В.Степанов1, А.А.Юдин2, А.И.Алехин2, О.П.Миронова2 Учреждение Российской академии наук институт биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН 2) Центральная клиническая больница РАН 1) Нейродегенеративные аутоиммунные процессы относятся к малоизученным патологиям как в плане патогенеза, так и терапии. Они затрагивают достаточно широкую группу взрослого трудоспособного населения. Одним из наиболее значимых патологий этой группы является рассеянный склероз, характеризующийся разрушением миелиновой оболочки, что в свою очередь приводит к деградации нервных волокон. Это заболевание носит хронический характер и сопровождается глубокой нейродегенерацией. До сих пор неизвестен триггерный механизм его запуска. Осуществлено выделение индивидуальных конститутивных 20S, 26S протеасом и иммунопротеосомы из тканей мышей хроматографическими методами: гель-фильтрация и ионообменная хроматография в режиме FPLC, аффинная хроматография на носителе с иммобилизованными антителами с применением ультрацентрифугирования на последних стадиях очистки. Разработанная методика не имеет аналогов в мировой литературе и позволяет достигать высоких степеней очистки протеасомы при минимальном числе стадий, что важно для нестабильного 26S комплекса. Проведена характеризация протеолитических свойств протеасом по коммерческим низкомолекулярным флуорогенным субстратам (химотриптическая, триптическая и каспазоподобная активность). С 233 помощью изотопно-меченых пептидов осуществлен анализ механизма деградации фрагментов основного белка миелина конститутивной и иммунопротеосомой, индуцированной в ходе развития аутоиммунного нейродегенеративного процесса экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ). Осуществлено изучение кинетических характеристик протеасом. Проведена стандартизация кинетических данных. Проведен скрининг субстратов для селективного определения активности стандартной 26S и иммунопротеосомы из библиотеки веществ, синтезированных в лаборатории-заявителе. Исследована каталитическая активность конститутивной и иммунопротеосомы с использованием различных О18 меченых фрагментов основного белка миелина (ОБМ). Предложены способы получения новых субстратов, наиболее подходящих для селективного определения конститутивной и иммунопротеосомы. Получена характеристика протеолитических свойств всех протеасом по белковому субстрату – основному белку миелина. Проведено определение сайтов и скорости протеолиза белка протеасомами трех типов. В научной литературе нет данных о сайтах деградации ОБМ протеасомой, отсутствуют сведения и о сравнении скоростей протеолиза разными протеасомами. Демонстрация количественных данных по «выщеплению» фрагментов энцефалитогенных пептидов с помощью протеасомы и сравнение с таковыми для иммунопротеосомы. Проведено изучение влияния убиквитинилирования основного белка миелина на скорость его протеолиза и на изменение положения сайтов протеолиза. Применение таких современных методов, как обращенно-фазовая ВЭЖХ и MALDI масс-спектрометрия, позволили впервые сравнить сайтспецифичность и скорость действия разных протеасом на убиквитинилированный и не убиквитинилированный ОБМ. Верификация полученных данных с помощью меченых фрагментов ОБМ. Продемонстрирована кроссреактивность антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулинов с нейроантигенами и вирусными белками. Высказана концепция индукции РС вирусными агентами. Представлены данные по дизайну генноинженерных векторов, направленных на элиминацию аутореактивных В-клеток. 234 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА НЕПРАВИЛЬНОГО СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКОВ И СВЯЗЬ ЭТОГО ПРОЦЕССА С БОЛЕЗНЯМИ, СВЯЗАННЫМИ С АМИЛОИДООБРАЗОВАНИЕМ О.В.Галзитская, Н.В.Довидченко, Н.С.Катина, В.А.Балобанов, Н.Б.Ильина, М.Ю.Суворина, А.К.Сурин, О.М.Селиванова, В.Е.Бычкова Институт белка РАН, Пущино Главная цель данного исследования – достигнуть более глубокого понимания молекулярных механизмов возникновения амилоидных болезней. Известными амилоидными болезнями являются: болезни Паркинсона, Гентингтона и Альцгеймера, синдромы Дауна, прионовые болезни, сосудистая деменция, множественная системная атрофия, миотропный латеральный склероз, эпилепсия и другие. Сочетание теоретических предсказаний с экспериментальными исследованиями является преимуществом данного проекта, что позволяет выявить факторы, которые влияют на неправильное сворачивание белковых структур. Существует много работ, посвященных изучению образования амилоидов разными белками в отличных друг от друга условиях. Однако до сих пор не удается построить подробную поэтапную картину перестроек, происходящих с белками во время образования амилоидных структур. Несмотря на интенсивные исследования фибриллогенеза инсулина, нет общепринятой схемы процесса формирования зрелых фибрилл. Основные сложности возникают при интерпретации данных о начале процесса фибрилляции. Полимеризация инсулина начинается при переходе нативной конформации мономера белка инсулина в частично развернутую амилоидогенную конформацию. Сильная зависимость процесса полимеризации от различных внешних воздействий приводит к образованию фибрилл инсулина разной морфологии, что усложняет однозначную интерпретацию способа полимеризации фибрилл. Нами предложена кинетическая модель для описания процесса амилоидообразования, включающая в себя нуклеационный механизм полимеризации с последовательным присоединением мономеров к олигомеру и автокаталитический рост амилоидных агрегатов, под которым подразумеваются все 235 типы экспоненциального роста: ветвление, дробление и рост с поверхности. Проведены компьютерные симуляции для двух типов экспоненциального роста: дробление и роста с поверхности. Нами изучен процесс амилоидообразования на примере рекомбинантного инсулина человека и его аналога (LysPro). Показано, что инсулин и его аналог LysPro (замена в цепи В остатков Pro28 и Lys29 местами) имеют похожую картину формирования амилоидных структур, что согласуется с теоретическими предсказаниями. В настоящей работе в выбранных нами условиях мы наблюдаем в конце лаг-периода фибриллы с диаметром 3-4 нм. Такие фибриллы ассоциируют друг с другом латерально (суперфибриллярная агрегация фибрилл), и при этом часто наблюдаются пучки с ровными краями (хорошо заметно на коротких фибриллах). В таких пучках отдельные фибриллы ровно уложены и имеют одинаковую длину. Это может указывать на то, что отдельная фибрилла формирует поверхность, которая провоцирует практически сразу сборку на ней следующей фибриллы. Аппроксимация экспериментальных данных показала, что модель корректно описывает наблюдаемые в эксперименте стадии роста амилоидных фибрилл и что присутствие члена, описывающего в модели стадию экспоненциального роста, критично для верного моделирования возникновения лаг-периода. Кинетика образования амилоидов мутантными формами апомиоглобина с заменами в положениях Leu115 и Glu109 изучена в условиях разрешенной для клетки температуры 40 оС. С помощью ЭМ выявлена морфология амилоидных структур. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ КОМПЕНСАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОМ ЗАБОЛЕВАНИИ – БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА С.Г.Георгиева1,2), А.Н.Краснов1), Е.Н.Набирочкина1), Ю.В.Шидловский1), М.М.Куршакова1), Н.Е.Воробьева1), Д.В.Копытова, 1) Н.В.Сошникова1) Институт биологии гена РАН, Москва; 2) Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва 1) Механизмы пластичности мозга играют важную роль на начальных стадиях нейродегенеративных заболеваний, компенси236 руя нарушения, связанные с дегенерацией ДА-ергических нейронов и тем самым экранируя проявления болезни Паркинсона на ранних стадиях. В результате в течение первых 20-30 лет болезнь развивается без проявления клинических симптомов, что делает крайне трудным ее выявление. С использованием экспериментальной модели развития прогрессирующей болезни Паркинсона у мышей, созданной (Ugrumov et al., 2011), был измерен уровень экспрессии тирозингидроксилазы – первого скорость-лимитирующего фермента синтеза ДА в нейронах в черной субстанции и в стриатуме на различных стадиях развития болезни. Полученные данные по сравнению экспрессии тирозингидроксилазы на поздней предсимптомной стадии и ранней симптоматической стадии развития болезни указывают на существование компенсаторного механизма при развитии болезни Паркинсона. Другим направлением являлся поиск периферических маркеров, отражающих процессы, происходящие на ранних стадиях развития заболевания. Было продолжено изучение периферических показателей в крови у пациентов в ранней стадии болезни Паркинсона. Сравнение новой выборки больных болезнью Паркинсона и контрольной группы подтвердило предыдущие полученные нами предварительные данные о снижении уровня экспрессии Д3 рецепторов к ДА в лимфоцитах у пациентов в ранней клинической стадии болезни. Продолжен набор материала и определение содержания Д3 и метаболитов ДА в крови у пациентов в ранней клинической стадии болезни. ПРОЦЕССЫ НЕЙРОВОСПАЛЕНИЯ В МЕХАНИЗМАХ СЕЛЕКТИВНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ГИППОКАМПА К НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ Н.В.Гуляева, А.К.Пискунов, А.О.Тишкина, И.П.Левшина, Н.А.Лазарева, Ю.В.Моисеева, М.Р.Новикова, М.Ю.Степаничев, М.В.Онуфриев Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН Развитие нейровоспаления (НВ) в настоящее время относят к ведущим звеньям нейродегенерации. Очевидно, что в основе участия НВ в гибели нейронов лежит трансформация адаптивных реак237 ций НВ в патологические. Принято считать, что гиппокамп относится к структурам мозга, селективно чувствительным к факторам, инициирующим нейродегенеративные процессы (гипоксии, стрессу, нейротоксинам и др.). В связи с этим нами была высказана рабочая гипотеза о том, что в основе селективной чувствительности нейронов гиппокампа лежат специфические особенности системы нейровоспалительных и соответствующих цитопротекторных механизмов. Экспериментальная проверка этой гипотезы была проведена на моделях интероцептивного стресса (острого и хронического эмоционально-болевого, ЭС) и экстероцептивного стресса (системное введение бактериального липополисахарида, ИС), вызывающих нейродегенеративные изменения в мозге крыс. Впервые показано, что при НВ, вызванном ИС или ИС, увеличивается экспрессия цитопротекторных белков (эритропоэтина – Epo, рецептора Epo, HIF-1); эти изменения отражают активацию потенциально адаптивных механизмов. На ранних этапах ИС уровень провоспалительного ИЛ-1β не различался в новой коре и гиппокампе крыс, однако через 24 ч уровень ИЛ-1β снижался в коре, но продолжал расти в гиппокампе. Острый ЭС вызывал увеличение экспрессии ИЛ-1β в мозге, достоверно более выраженное в гиппокампе в сравнении с новой корой; при хроническом ЭС регионарные различия усиливались. Рассогласование экспрессии Epo и ИЛ-1β, снижение экспрессии Epo, снижение экспрессии ламинина-1 и NCAM на поздних этапах ИЦ и при хроническом ЭС отражают ослабление потенциально адаптивных процессов, указывают на срыв регуляции воспалительных реакций в гиппокапме и структурные перестройки. Усиленная, по сравнению с контролем, экспрессия провоспалительного ИЛ-1β сохранялась в гиппокампе, но не в новой коре, спустя месяц после окончания хронического ЭС. Долговременный постстрессорный срыв регуляции процессов НВ в гиппокампе можно рассматривать как новый механизм, связывающий стресс и развитие патологических изменений в этой структуре. Усиление экспрессии ИЛ-1β в гиппокампе сопровождалось селективным усилением доставки глюкокортикоидов в этот отдел мозга. Отсутствие изменения доставки тестостерона в отделы мозга подтверждает селективность механизмов, связывающих избыточную доставку глюкокортикоидов с патологией гиппокампа. При хроническом ЭС, несмотря на повышенный уровень 238 глюкокортикоидов в гиппокампе, отсутствовали изменения (в сравнении с контролем) в экспрессии регулируемых ими генов (IGF-1 и CRF), что свидетельствует об изменении трансдукции сигнала глюкокорткоидов в этом отделе мозга. Таким образом, динамика процессов НВ при стрессе различной природы неодинакова в неокортексе и гиппокампе; в гиппокампе НВ продолжается в течение более длительного времени на фоне ослабления механизмов цитопротекции. Воспалительный ответ в гиппокампе сопровождается усиленной (в сравнении с корой) доставкой кортикостерона в ткань, что может запускать механизмы срыва адаптивных цитопротекторных механизмов в гиппокампе и делать его селективно чувствительным к нейродегенерации. Другим следствием избытка глюкокортикоидов в гиппокампе является подавление нейрогенеза, синергичный с описанным выше механизм развития нейродегенеративной патологии. Результаты исследования подтвердили рабочую гипотезу об участии нарушений про- и антивоспалительных процессов в селективной чувствительности гиппокампа к нейродегенеративным изменениям. РАЗРАБОТКА И РЕАЛИЗАЦИЯ МАТЕМАТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЙ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ДЛЯ АВТОМАТИЗАЦИИ ИССЛЕДОВАНИЯ МОДЕЛЕЙ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА И.Б.Гуревич1), А.А.Мягков1), Ю. А. Сидоров2), Ю.О.Трусова1), В.В.Яшина1) Учреждение Российской академии наук Вычислительный центр им. А.А.Дородницына РАН, Москва; 2)Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва 1) Проект посвящен разработке и экспериментальному исследованию новых математических методов извлечения из микроскопических изображений срезов мозга информации, необходимой для моделирования нейродегенеративных заболеваний. Основными задачами проекта являлись: 1) разработка и исследование новых математических методов выделения информативных объектов на биомедицинских изображениях и их 239 многоаспектная характеризация; 2) разработка, исследование и реализация стандартных и специализированных алгоритмических схем автоматизации извлечения информации из изображений, 3) экспериментальное исследование разработанных методов и оценка их точности и эффективности. В рамках проекта разработаны новые математические методы, обеспечивающие автоматизацию решения задачи выделения и характеризации нейронов и их аксонов на микроскопических изображениях, в т. ч. автоматизацию выбора начальных приближений параметров. Теоретический фундамент проекта составляют дескриптивный подход к анализу и пониманию изображений (ДП) (И.Б.Гуревич) и алгебраический подход к решению задач распознавания, классификации и прогнозирования (Ю.И.Журавлев). Разработанный математический аппарат предусматривает также использование методов математической морфологии и энтропийной техники. Новые методы позволяют находить и выделять информативные объекты на изображениях срезов мозга при условии задания ограничений на форму, размер, топологию и характеристики гладкости границы объектов. В результате исследований, посвященных разработке стандартных и специализированных алгоритмических схем автоматизации извлечения информации из изображений выявлены базовые дескриптивные алгебры изображений (ДАИ) для описания задач анализа медицинских изображений; проведена специализация ДАИ для описания этапов алгоритмических схем анализа изображений дофаминергических нейронов и их аксонов в различных функциональных состояниях; изучены возможности применения двухмерных алгоритмов распознавания, основанных на вычислении оценок, на этапе классификации и распознавания. При исследовании разработанных методов проведена экспериментальная оценка их точности и устойчивости сравненительно с другими современными подходами. Разработан программный продукт, предназначенный для извлечения и анализа дофаминергических нейронов на изображениях срезов мозга в области черной субстанции. Предварительные исследования предложенных методов подтвердили адекватность выбранной модели в рамках данной 240 задачи. Программная реализация разработанных математических методов позволит существенно ускорить исследования болезни Паркинсона за счет автоматизации наполнения преклинических моделей экспериментальными данными и автоматизации исследования моделей при помощи машинных экспериментов. Подготавливается патентная заявка (изобретение, полезная модель) для защиты интеллектуальной собственности на разработанный метод. Задача выделения нейронов на изображениях срезов ЧС поставлена сотрудниками Лаборатории гормональных регуляций Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. Ими же были предоставлены изображения для обработки и анализа. Экспериментальная проверка разработанного метода проведена совместно. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АМИЛОИД-ДЕГРАДИРУЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НЕПРИЛИЗИНА И РОЛЬ АМИЛОИДНОГО МЕТАБОЛИЗМА В ПАТОГЕНЕЗЕ КОГНИТИВНЫХ РАССТРОЙСТВ ПРИ МЯГКОМ КОГНИТИВНОМ СНИЖЕНИИ И РАЗВИТИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И.А.Журавин1), Н.Н.Наливаева1,2), С.А.Плеснева1), Н.Л.Туманова1), Д.И.Багрова1), Д.С.Васильев1), Н.М.Дубровская1), Е.Г.Кочкина1), А.Ю.Морозова1), С.И.Гаврилова2), Г.Ш.Бурбаева2), И.С.Бокша2), Я.Б.Федорова2), Н.З.Макова3), Н.Д.Беляев3), A.J.Turner3) Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова, РАН, Санкт-Петербург, 2) Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр психического здоровья РАМН, Москва, Россия, 3) Institute of Molecular and Cellular Biology, University of Leeds, U.K. 1) Целью проекта является изучения роли продуктов метаболизма предшественника амилоидного пептида (АРР) и изменения активности ферментов катаболизма амилоидного пептида (Аβ) в функционировании нервных клеток и формировании памяти, а также изучение механизмов развития мягкого когнитивного снижения (mild cognitive impairment – MCI) и болезни Альцгеймера (БА). 241 В серии экспериментов по изучению роли изоформ АРР в экспрессии амилоид-деградирующей пептидазы неприлизина (НЕП) посредством С-концевого фрагмента АРР (AICD) в клетках разного происхождения показано, что повышение экспрессии НЕП наблюдается только в нейрональных клетках, экспрессирующих АРР695 и имеющих повышенное содержание транскрипционно активного AICD в ядерном аппарате. Повышенная экспрессия АРР695 также приводит к изменению уровня активности и содержания АХЭ, но не влияет на характер секреции этого фермента и экспрессию PRiMA. Для восстановления сниженного (в среднем на 40 %) уровня активности НЕП, наблюдаемого после пренатальной гипоксии у взрослых крыс, проводили i.p. инъекции (200 мг/кг, ежедневно, 24 дня) ингибитора гистондеацетилаз вальпроата натрия (ВН) или i.c. инъекции антиоксиданта EGCG (2x10-3 M, 0.25 мкл /час, 28 дней). После введения ВН или EGCG крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, активность НЕП увеличивалась и не отличалась от уровня, полученного у контрольных животных. При этом наблюдалось увеличение количества правильных побежек у крыс в радиальном лабиринте и восстановление их кратковременной памяти в тесте «распознавание новых объектов», а также повышение количества лабильных шипиков в коре мозга (после введения ВН) и в гиппокампе (после введения EGCG). Изучено также влияние пониженного содержания продукта протеолиза АРР (sAPPα) на поведение животных и пластичность нервной ткани после длительного введения взрослым интактным крысам специфического ингибитора α-секретазы TAPI-2 (0.5 10-3 M, 0.25 мкл /час, 14 дней) с помощью осмотических минипомп. У таких животных не обнаружено изменений в количестве лабильных синаптоподин-позитивных шипиков в кортикальных отделах мозга и в поведении по сравнению с контролем. Сделан вывод, что одной из причин нарушения функций мозга после пренатальной гипоксии является изменение уровня активности ферментов, участвующих в метаболизме Аβ, приводящее к уменьшению количества межклеточных контактов и, как следствие, к нарушению пластичности нейрональных систем мозга и ухудшению памяти. Выявленные нарушения можно компенсировать путем специфи242 ческой эпигенетической и фармакологической регуляцией экспрессии амилоид-деградирующих ферментов. В совместных исследованиях с клиницистами охарактеризованы фазы доклинического снижения когнитивных функций и показаны возможности восстановления утраченных функций на стадии MCI. Выявлены биомаркеры, позволяющие идентифицировать это состояние. В частности, показано, что в плазме крови пациентов с диагностированным MCI активность НЕП (4,74±0,03 мкмоль/мин/мг) выше, чем у пациентов с БА (3,98±0,02), но ниже активности этого фермента у пациентов без нарушений внимания и памяти. Таким образом, данный показатель, наряду с изученными ранее, можно использовать для выявления начальных стадий развития заболевания. ПОИСК БЕЛКОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ АМИЛОИДОГЕНЕЗ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА С.Г.Инге-Вечтомов, А.А.Рубель, Т.А.Рыжова, А.П.Галкин Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики РАН им. Н.И.Вавилова БА связана с накоплением в межклеточном пространстве головного мозга нейротоксичных олигомеров амилоидного пептида β (Aβ). Недавно были опубликованы данные, согласно которым белок PrP (Prion Protein), заякоренный на мембране нейронов, является рецептором для патогенных олигомеров Aβ. Таким образом, белок PrP, конформационные изменения которого вызывают прионные заболевания, в нормальной клеточной изоформе может быть вовлечён в патогенез болезни Альцгеймера. Более того, было показано, что олигомеры Aβ индуцируют болезнетворную агрегацию PrP, также как прионные полимеры PrP инкорпорируют пептид Aβ и способствуют его агрегации. Известно, что за взаимодействие олигомеров Aβ с мономерами PrP отвечают два коротких эпитопа – PrP(23-27 аа) и PrP(95-110 аа). При делеции одного из этих эпитопов взаимодействия не происходит. Какие последовательности отвечают за взаимодействие полимеров PrP с пептидом Aβ, остаётся неизвестным. 243 Мы исследовали этот вопрос, используя в качестве модельного объекта дрожжи S. cerevisiae. Были сконструированы химерные гены, в которых последовательности PrP мыши и пептида Aβ человека слиты с последовательностями, кодирующими циановый (CFP) и жёлтый (YFP) флуоресцентные белки, соответственно. На первом этапе исследований мы показали, что химерные белки PrP(23-231)-CFP и Aβ-YFP формируют в дрожжевой клетке амилоидные агрегаты, сходные по ряду характеристик с агрегатами PrP и Aβ в мозге больных млекопитающих. Было установлено, что большая доля белка PrP(23-231)-CFP в дрожжах представлена в виде высокомолекулярных агрегатов, тогда как Aβ-YFP распределяется между растворимой и нерастворимой фракциями примерно поровну. С помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии мы показали, что химерные белки PrP(23-231)-CFP и Aβ-YFP образуют в цитоплазме дрожжевой клетки цитологически видимые агрегаты, которые не колокализуются с клеточными компартментами. При ко-экспрессии этих белков агрегаты белка PrP(23-231)-CFP в 100 % случаях колокализуются с Aβ-YFP. При помощи метода FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) мы показали, что колокализация агрегатов PrP(23-321)-CFP с белком и Aβ-YFP обусловлена их физическим взаимодействием. Для выявления последовательностей, ответственных за это взаимодействие, был проведён сравнительный анализ колокализации Aβ-YFP с агрегатами укороченных вариантов белка PrP (PrP(90-231)-CFP и PrP(110-231)-CFP). Колокализация агрегатов PrP(110-231)-CFP с Aβ-YFP отмечается лишь 55 ± 3 % случаев. Такое нерегулярное взаимодействие может быть обусловлено неспецифическим связыванием агрегатов PrP(110-231)-CFP и AβYFP за счёт случайного залипания β-структур. Вместе с тем агрегаты белка PrP(90-231)-CFP, также как и агрегаты PrP(23-231)CFP, в 100 % случаях колокализуются с Aβ-YFP. Таким образом, специфическое взаимодействие амилоидных полимеров PrP с пептидом Aβ опосредовано короткой последовательностью PrP с 90-й по 109-ю аминокислоту. На основании полученных данных можно заключить, что последовательность PrP(23-27), которая необходима для связывания мономерного PrP c олигомерами Aβ, не важна для связывания амилоидных полимеров PrP с пептидом Aβ. 244 245 ВЫЯВЛЕНИЕ РЕТИНАЛЬНЫХ АУТОАНТИТЕЛ В КРОВИ БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ Г.Р.Каламкаров, Т.Ф.Шевченко, А.Е.Бугрова, Т.С.Константинова, П.В.Аболтин Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН Рассеянный склероз (РС) – хроническое заболевание центральной нервной системы с непредсказуемым, часто с прогресссирующим течением. Этиология заболевания не установлена, однако основным представляется аутоиммунный процесс, протекающий по мере развития заболевания. Развитию клинических признаков рассеянного склероза часто предшествует развитие неврита зрительного нерва, причем по мере прогрессирования заболевания признаки неврита часто исчезают, что свидетельствует о вовлечении нейральной сетчатки и прежде всего ганглиозных клеток в этот процесс. Аутоиммунные процессы, протекающие с вовлечением сетчатки глаза, часто сопровождаются появлением антител к ретинальным антигенам как в тканях глаза, так и в крови. Настоящее исследование посвящено выяснению возможности разработки объективного метода прогнозирования развития и манифестации рассеянного склероза по появлению в крови больных антител к ретинальным антигенам – арестину (S-антитела) и межфоторецепторному ретинальпереносящему белку (М-антитела.) Оба антигена были выделены из сетчатки и межфоторецепторного матрикса в нашей лаборатории. Выявлялись антитела двух классов – IgG и IgM. В результате двухлетних исследований установлено, что в 45 % случаев у больных РС в крови выявляются S-антитела и в 30 % – Мантитела одного класса или обоих классов. У больных невритом без РС антитела выявлялись чаще. У больных рассеянным склерозом, сочетанным с невритом зрительного нерва, антитела выявлялись с той же частотой. Наблюдение отдельных больных в динамике показали, что величина иммунного ответа коррелирует с переходом заболевания в острую фазу. Так, в некоторых случаях при 246 манифестации заболевания величина иммунного ответа на Sантиген возрастала более чем в два раза. На стадии ремиссии, напротив, наблюдалось уменьшение величины иммунного ответа. Полученные результаты позволяют использовать тест на наличие описанных антител для предсказания развития обострения или ремиссии рассеянного склероза. Одной из причин дегенерации зрительного нерва является апоптоз или некроз ганглиозных клеток, вызванный общей или локальной ишемией. Для исследования механизмов развития механизмов дегенерации ганглиозных клеток нами разработана модель ишемии, основанная на лазерной коагуляции сосудов. Такой подход позволяет создавать как общее, так и локальное повреждение. Показано, что развитие ишемии сопровождается развитием апоптоза ганглиозных клеток. Как оказалось, необходимым фактором развития апоптоза при ишемии является наличие в клетках относительно высокой концентрации оксида азота. Показано, что снижение концентрации оксида азота с помощью ингибиторов NOсинтазы или его комплексонов предотвращает развитие апотоза ганглиозных клеток. Введение экспериментальным животным динитрозильных комплексов железа – соединений, являющихся нетоксичным источником окида азота, напротив, приводило к развитию апотоза ганглиозных клеток. На основе разработанной модели нами ведется поиск соединений-комплексонов оксида азота, могущих служить основой для создания препаратов, предотвращающих развитие апоптоза ганглиозных клеток. НОВЫЕ ПОДХОДЫ К РАННЕМУ ВЫЯВЛЕНИЮ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ ФИЗИОЛОГИИ ДВИЖЕНИЙ Ю.С.Левик1), М.Е.Курганская2), А.А.Фролов, М.Е.Иоффе2), А.В.Карабанов4), Л.А.Черникова4), Б.Х.Базиян4), Т.Б.Киреева1), О.Е.Хуторская3), Л.А.Чигалейчик4), В.Ю.Шлыков1) Институт проблем передачи информации им. А.А.Харкевича РАН, Москва; 2)Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва; 3)Институт проблем управления им. В.А.Трапезникова РАН, Москва; 4)ГУ НЦН РАМН, Москва 1) 247 Были проведены исследования кинематических особенностей выполнения наклонов в положении стоя у здоровых (23 человека), пациентов с болезнью Паркинсона (БП) в начальной стадии (36 человек) и больных с эссенциальным тремором (ЕТ) (14 человек). Обследуемые выполняли циклические движения корпусом в положении стоя: повороты и наклоны корпуса в каждой из трех анатомических плоскостей. Положение и ориентацию сегментов тела регистрировали при помощи электромагнитной системы регистрации движения Mini Bird. Вычисляли углы в голеностопном, тазобедренном суставах и в торсовом эквивалентном псевдосуставе. Псевдогармонический характер зависимости суставных углов от времени позволил перейти к интегральным характеристикам движения: частоте и амплитудам суставных углов. Дискриминантный анализ позволил установить, что амплитуда наклонов во фронтальной плоскости в торсовом псевдосуставе у пациентов с ЭТ превышает как норму, так и показатели пациентов с БП. Для выявления скрытых признаков нарушений постуральных механизмов при БП исследовались стабилографические показатели пациентов на ранней стадии БП до начала медикаментозного лечения. Хотя некоторые показатели стабилограммы на ранней стадии БП мало отличались от нормы, по другим показателям (КФР, КРИНД, устойчивость в усиленной позе Ромберга) наблюдались сильные отличия. При отслеживании перемещений мишени по экрану с помощью зрительной обратной связи у БП амплитуда движения, величина перерегулирования и скорость движения были меньше, чем в контроле. Полученные результаты дают основания полагать, что стабилографические методики могут быть перспективны с точки зрения ранней диагностики БП. С помощью разработанного в лаборатории нейрокибернетики НЦН РАМН аппаратно-программного комплекса (Базиян, патент РФ № 2146494, 2000) исследовали траектории автоматических саккадических движений глаз («автосаккады») у пациентов ранней стадии БП и здоровых испытуемых.. Регистрируемые и измеряемые при этом параметры (латентные периоды, частота, асимметрия, длительность каждой саккады) являются важным информационным показателем, по которому можно судить о механизмах возникновения моторной команды для осуществления саккады. Был проведен сравнительный анализ нормы и патологии при фиксации 248 светодиодных мишеней. Длительности горизонтальных саккад на 20 градусов при БП влево (157,6 мс) и вправо (169,1мс) достоверно увеличились по сравнению с аналогичными показателями (106,2 мс и 105,7 мс соответственно) в норме. Частота саккад значительно уменьшалась с 2-3/с в норме до 0,6–0,8/с. Наблюдали также асимметрию между саккадами. Уменьшалась также амплитуда саккад. С целью получения электромиографических признаков дифференциальной диагностики экстрапирамидных заболеваний со схожей симптоматикой проведено исследование 14 больных с диагнозом идиопатическая цервикальная дистония (ИЦД). Полученные в ходе исследования характеристики тремора больных с ИЦД в комбинации с клиническими данными могут быть полезными в дифференциальной диагностике ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕМОТОРНЫХ СИМПТОМОВ ПАРКИНСОНИЗМА В МОДЕЛИ ДОКЛИНИЧЕСКОЙ СТАДИИ У ЖИВОТНЫХ И ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА У ЧЕЛОВЕКА Ю.Ф.Пастухов1), И.В.Екимова1), К.А.Худик 1), В.В.Чернышев1), К.В.Лапшина1), И.В.Романова1), В.В.Коржова1), И.В.Гужова2) Учреждение Российской Академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург; 2) Учреждение Российской Академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург 1) «Ахиллесовой пятой» болезни Паркинсона (БП) является поздняя постановка диагноза – в клинической стадии, при манифестации моторных симптомов, когда гибель дофаминергических (ДА) нейронов черной субстанции (ЧС) достигает 50-60 % и полное излечение уже невозможно. Прогресс в лечении БП связывается с определением ранних немоторных симптомов в моделях доклинической стадии у животных [Угрюмов, 2010]. Нами создана такая модель у крыс на основе снижения функции убиквитин-протеасомной системы (УПС), которое приводит к накоплению токсичных белков и дегенерации клеток, в т.ч. ДА 249 нейронов ЧС, что рассматривается как ключевой механизм старения и развития БП [Mc Naught et al., 2010 и др.]. При изучении модели высказана гипотеза: увеличение общего времени быстрого сна является ранним немоторным маркером БП, отражающим сохранение компенсаторных резервов ДА [Пастухов и др., 2010]. Для обоснования гипотезы необходимо выяснить, сохраняются ли этот маркер и защитный потенциал шаперона Hsp70i при переходе в клиническую стадию. Для решения задач проекта сопоставлены иммуногистохимические, поведенческие и электрофизиологические показатели через 7 и 14 сут после двукратных (с интервалом 7 сут) микроинъекций в ЧС ингибитора протеасом лактацистина в дозах 0.4 мкг (стадия 1 – доклиническая) и 4 мкг (стадия 2 – ранняя клиническая). Установлено, что в стадии 2 потеря ДА нейронов ЧС составляет в среднем 60 %, а их аксонов в стриатуме 70 %, что типично для клинических стадий БП; потеря нейронов в стадии 1 в 2.5 раза меньше. Нарушения моторного поведения ни по одному из тестов в стадии 1 не найдены, а в стадии 2 определены сокращение времени «зависания» в тестах «перекладина» и «перевернутая решетка» и тенденция к уменьшению длины шага. Увеличение времени быстрого сна обнаружено не только в стадии 1, но и в стадии 2. Общий уровень тирозингидроксилазы (ТГ), косвенного показателя компенсаторных резервов ДА, в ткани ЧС и дорзального стриатума в стадии 1 не изменяется, а в стадии 2 снижается. При пролонгировании стадии 2 на 7 дней уровни ТГ и везикулярного транспортера моноаминов уменьшаются, а общее время быстрого сна не изменяется. У пациентов в клинической стадии БП обнаружено уменьшение быстрого сна. Все это указывает на то, что наша гипотеза «работает» только в доклинической стадии. Отличается ли в стадиях 1 и 2 нейропротективный потенциал шаперонной системы, которую относят к 1-й линии защиты при стрессе, старении и нейродегенеративных процессах? Выяснено, что при ослаблении функции УПС в стадии 1 теряется около четверти, а в стадии 2 – более половины ДА-нейронов ЧС, содержащих главный шаперон Hsp70. В стадии 1 в большинстве оставшихся нейронов и в ткани ЧС уровень этого защитного фактора возрастает [Пастухов и др., 2011], а в стадии 2 – падает. Полученные данные подтверждают и дополняют нашу гипотезу: увеличение квоты быстрого сна является ранним немоторным 250 маркером БП, отражающим сохранение компенсаторных и протективных резервов нигростриатной системы в доклинической стадии БП. Мы полагаем, что активация этих резервов путем применения природных и синтетических индукторов шаперонов и различных способов прекондиционирования может быть основой для разработки новой стратегии превентивной терапии с целью замедления или остановки нейродегенеративного процесса в доклинической стадии БП. МЕХАНИЗМЫ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ТЕРМИНАЛЬНО ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК СЕТЧАТКИ ГЛАЗА И ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ МЮЛЛЕРОВЫХ КЛЕТОК В РЕГЕНЕРАЦИИ СЕТЧАТКИ В.А.Тронов1,2, Ю.В.Виноградова2, М.Ю.Логинова3, В.А.Поплинская4, М.А.Островский2,3 1 Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, 2 Объединенный институт ядерных исследований, Дубна, 3 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва, 4 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, Москва Основу зрелой сетчатки млекопитающих составляют терминально дифференцированные клетки, утратившие свой регенеративный потенциал. Для них апоптоз представляется угрожающим существованию органа в целом. Вместе с тем в эмбриогенезе глаза апоптоз играет важную роль: по мере дифференцировки клеточных элементов сетчатки частота апоптоза снижается, и зрелая сетчатка приобретает высокую устойчивость к генотоксическому стрессу и связанному с ним апоптозу. Пострадиационная ретинопатия и когнитивные расстройства часто бывают нежелательными побочными эффектами радиотерапии при высоких кумулятивных дозах. Так, при радиотерапии опухолей носоглотки и глаза суммарная доза облучения превышает 50 Гр. При протонной радиотерапии меланомы глаза кумулятивная доза фракционированного облучения составляет 54–75 Гр. Цитотоксическая химиотерапия также вызывает офтальмо251 логические осложнения в виде обратимых и необратимых острых и хронических глазных заболеваний. Наследственная или вызванная внешним воздействием дегенерация сетчатки начинается с гибели фоторецепторов. Хотя доминирующей формой гибели фоторецепторов признается апоптоз, тем не менее связь повреждения ДНК с гибелью постмитотических клеток сетчатки на сегодняшний день не исследована. Целью нашей работы было исследование связи повреждения и репарации ДНК с дегенеративными изменениями в сетчатке после воздействия на мышей ионизирующей радиации (гамма-, протонного излучений) и генотоксического агента метилнитрозомочевины (МНМ). Гамма-излучение вызывает главным образом однонитевые разрывы ДНК, равномерно распределенные по всему геному. Протоны же более эффективны в индукции двунитевых разрывов, локализующихся в области трека частицы. Двунитевые разрывы являются летальным повреждением из-за их высокой эффективности в индукции апоптоза в делящихся клетках. Метилирующий агент метилнитрозомочевина вызывает в ДНК безразрывные дефекты – метилированные основания, апуриновые и апиримидиновые (АП) сайты Показано, что МНМ вызывает апоптоз фоторецепторов после однократного в/б введения животным в дозе >60 мг/кг. В нашей работе МНМ используется как позитивный контроль на апоптоз в сетчатке, а, кроме того, три используемых агента охватывают основные типы повреждений ДНК и механизмы их репарации. Оценивали морфологические изменения ткани, повреждение и репарацию ДНК в сетчатке, экспрессию 5 белков, участвующих в апоптозe, P53, АТМ, PARP, FasR и каспазы 3. Все измерения осуществлялись in vivo. Облучение в дозе 14 Гр равнотоксично по индукции однонитевых разрывов ДНК для гамма-излучения и протонов. Но протоны в 2 раза более эффективны в индукции двунитевых разрывов ДНК. Разрывы ДНК в сетчатке репарировались в течение ≤10 ч. Облучение увеличивало экспрессию P53 и АТМ. Однако в течение 7 дней после облучения не обнаруживались признаки клеточной гибели в сетчатке. После облучения протонами в дозе 25 Гр отмечались нарастающие во времени деструктивные изменения в сетчатке, затрагивающие 252 главным образом фоторецепторный слой. Изменения сопровождались увеличением экспрессии проапоптотических белков. Однократное введение мышам МНМ в дозе 70 мг/кг увеличивало уровень белков P53, PARP, FasR, каспазы-3 и сопровождалось деструктивными изменениями в сетчатке с признаками апоптоза фоторецепторов. Как и в случае с облучением, снижение дозы МНМ в два раза полностью отменяло цитотоксический эффект агента. В ДНК сетчатки обнаружен высокий уровень спонтанных повреждений в виде АП-сайтов. Полученные результаты свидетельствуют о генотоксическом пороге инициации гибели клеток сетчатки. Предполагается участие топоизомеразы 2 в реализации повреждений ДНК в цитотоксический эффект. Пролиферативный маркер BrUdR был успешно применен в нашем исследовании реакции мюллеровых клеток на супермутаген метилнитрозомочевину. Считается, что на химический стресс Мюллеровые клетки отвечают реакцией реактивным глиозисом, включающем в себя гипертрофию клеток, миграцию и пролиферацию. Вследствие пролиферации возможно включение пролифиративного маркера BrUdR в Мюллеровы клетки и определение внутриклеточных параметров. После нанесения химического стресса спустя 24 ч наблюдается увеличение численности и физических размеров Мюллеровых клеток, а также их миграция, достигающая фоторецепторов. В ходе исследования две особенности сетчатки обнаружены нами впервые. Значительная спонтанная поврежденность ДНК (в виде апуриновых и апиримидиновых сайтов). Вторая особенность – высокий гентотоксический порог сетчатки для достижения заметного цитотоксического эффекта in vivo. Это объединяет наши экспериментальные данные в одну цельную картину генотоксического порога, высокий спонтанный уровень поврежденности ДНК в сетчатке, активацию в ответ на геностресс Мюллеровых клеток. В последние дни нами проведены исследования ЭРГ сетчатки в ответ на введение МНМ, подтверждающие гипотезу о генотоксическом пороге сетчатки. 253 СИНТЕЗ ДОФАМИНА В НИГРОСТРИАТНОЙ СИСТЕМЕ НА МОДЕЛЯХ ПОЗДНЕЙ ДОСИМПТОМНОЙ И РАННЕЙ СИМПТОМНОЙ СТАДИЙ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА М.В.Угрюмов1,2), Е.А.Козина1,2), Г.Р.Хакимова1,2) Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН Институт нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН 1) 2) Прогрессивная дегенерация дофаминергических нейронов нигростриатной системы является ключевым компонентом в патогенезе болезни Паркинсона (БП), которая развивается в течение длительного времени в скрытой форме – без проявления двигательных нарушений. Существующая на сегодняшний день фармакологическая терапия БП, начинающаяся только после появления первых симптомов заболевания, имеет низкую эффективность. Поэтому одной из наиболее актуальных задач нейронаук является разработка доклинической диагностики и профилактического лечения, направленного на остановку или замедление процесса гибели нейронов и на активацию ряда компенсаторных процессов. Клиническим испытаниям методов диагностики и лечения должны предшествовать разработка и апробация этих технологий на адекватных экспериментальных моделях заболевания, которые позволят углубить имеющиеся знания о клеточных и молекулярных механизмах эндогенных компенсаторных процессов. Ранее в ходе наших исследований была найдена схема введения нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), при которой у мышей воспроизводились ранняя досимптомная, поздняя досимптомная и ранняя симптомная стадии БП, характеризующиеся разной степенью деградации нигростриатной системы и, как следствие, наличием (в случае модели симптомной стадии) или отсутствием (в случае модели досимптомной стадии) двигательных нарушений. На полученных экспериментальных моделях досимптомной и симптомной стадий БП был проведен детальный анализ основных показателей (экспрессия мРНК, уровень белка, ферментативная активность) ключевого фермента синтеза дофамина – тирозингидроксилазы в отделах нигростриатной системы – черной субстанции и стриатуме, а также в отдельных 254 выживших нейронах черной субстанции и аксональных терминалях стриатума. При сравнении симптомной стадии с досимптомной наблюдалось: (а) снижение содержание мРНК тирозингидроксилазы в черной субстанции; (б) увеличение содержания белка тирозингидроксилазы, а также ее активности в выживших нейронах черной субстанции; (в) неизменное содержание белка тирозингидроксилазы в выживших аксональных терминалях стриатума, а также ферментативной активности в черной субстанции и аксональных терминалях стриатума. Полученные в ходе проекта данные впервые свидетельствуют о том, что снижение дофамина в стриатуме на модели симптомной стадии БП по сравнению с досимптомной стадией не связано со снижением активности тирозингидроксилазы. Снижение дофамина на симптомной стадии может быть связано с изменением других функциональных характеристик, а именно высвобождения, обратного захвата, деградации дофамина, а также с изменением активности декарбоксилазы ароматических L-аминокислот – второго фермента синтеза дофамина. БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА И ДИСФУНКЦИЯ СИНАПСОВ A.Л.Шварцман 1,2), С.В.Саранцева 2), О.Л.Рунова 1), Е.И.Талалаева1), М.П.Витек 3) Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург; 2) Петербургский Институт ядерной физики, Гатчина, Ленинградская область; 3) Отдел неврологии, Медицинский центр Университета Дюка, Дурем, США 1) Подавляющее большинство ранних семейных форм болезни Альцгеймера (БА) вызваны мутациями в гене пресенилина 1 (PS1) и гене APP (АРР – аббревиатура, amyloid protein precursor). При этом одним из ранних патоморфологических признаков заболевания является потеря синапсов, которая предшествует образованию амилоида и нейродегенерации. Вместе с тем роль PS1 и APP в образовании и поддержании синапсов остается неясной. Анализ литературы позволяет предположить, что, по крайней мере, для наследственных форм БА первичный эффект мутаций в генах APP PS1 может быть связан не только с повышенной секрецией 255 олигомеров амилоидного пептида (Aβ), но и с нарушением клеточных функций этих белков, приводящих к дисфункции синапсов независимо от секреции Aβ. Понимание этих функций не только откроет новые возможности в терапии БА, но и определит фундаментальную роль APP и PS1 в процессах нейрогенеза и нейропластичности. Мы провели анализ внутриклеточного и экстраклеточного распределения АРР и PS1 в культурах эмбриональных нейронов. Показано присутствие обоих белков в составе межнейронных синапсов. Локализация PS1 в синапсах была независимо доказана трансфекцией эмбриональных нейронов с помощью кДНК PS1, содержащей последовательности зеленого флуоресцентного белка (GFP). Ранее было показано, что один из основных белков нейроадгезии N-кадхерин образует комплексы с PS1 в синаптических контактах. При этом PS1, будучи -секретазой, вызывает частичный протеолиз N-кадхерина (отщепление Сконцевого фрагмента). В наших экспериментах GFPиммунопреципитаты экстрактов трансфецированных нейронов содержали N-кадхерин, что доказывало участие GFP-PS1 в образовании синаптических контактов. Было проведено сравнение плотности пресинаптических терминалов, окрашиваемых синаптофизином, для единичного нейрона, в культуре нейронов дикого типа, в культуре нейронов полученных от мышей с нокаутом гена PS1, и в нейронах, трансфецированных кДНК GFP-PS1, содержащую мутацию G209V, обнаруживаемую при семейных формах БА. Показано значительное снижение числа пресинаптических терминалов, окрашиваемых антителами к синаптофизину, для единичного нейрона в PS1 -/- культуре и для нейронов, трансфецированных кДНК GFP-PS1 G209V. Обсуждая возможные функции АРР и PS1, мы обращаем внимание на принципиальное различие в локализации этих белков на поверхности нейронов. Если PS1 концентрировался лишь на поверхности конусов роста, то АPP не был обнаружен на поверхности мотильных структур, но был равномерно распределен на поверхности сомы и нейритов. Действительно, характер распределение АРР в нейронах и, описанное в литературе, взаимодействие с интегринами на поверхности аксонов и дендритов дает основание предполагать, что АРР в фокальных участках адгезии участвует во взаимодействие нейронов с клеточным 256 матриксом. Напротив, концентрация PS1 на поверхности мотильных элементов предполагает непосредственное участие этого белка в межклеточных взаимодействиях. В пользу этого предположения свидетельствует и образование специфических комплексов между PS1 и белками межклеточных контактов кадхеринами. 8. Атмосфера и здоровье ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ МАГНИТОСФЕРЫ И ПРИЗЕМНОЙ АТМОСФЕРЫ ПРИМЕНИТЕЛЬНО К ОЦЕНКЕ РИСКА РАЗВИТИЯ ПАТОЛОГИЙ У ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ ЛЮДЕЙ Т.К.Бреус1), Т.А.Зенченко1/2), Ю.И.Гурфинкель1/3), В.А.Ожередов1), А.М.Мерзлый1), Н.Г.Хорсева1/4) , А.Г.Рехтина5) Институт космических исследований РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН 3) ЦКБ № 1 ОАО "РЖД" 4) Институт биохимической физики РАН 5) Городская клиническая больница № 60 1) 2) В 2011 году были продолжены эксперименты по отработке методик и сбору данных длительного ежедневного мониторинга ряда новых физиологических показателей (ФП), отражающих функциональное состояние различных отделов сердечнососудистой системы у здоровых лиц. Были впервые выявлены следующие закономерности: 1) Чувствительность к воздействию геомагнитных возмущений по показателю артериального давления (АД) проявляют все группы населения, как больные, так и здоровые. При этом амплитуда реакции физиологических показателей на изменение магнитосферных и атмосферных факторов у здоровых людей остается в пределах физиологической нормы, в то время как для пациентов с артериальной гипертензией вызванные этими факторами подъемы уровня АД могут быть опасными. 257 2) Характер реакции всех исследованных физиологических показателей на изменение уровня геомагнитной активности (ГМА) имеет вид быстрых вариаций (в течение суток). В то же время их зависимость от атмосферных показателей проявляется как синхронизация медленных волн с периодом порядка нескольких суток, что позволяет в большинстве случаев разделить вклады этих двух групп факторов в вариации ФП. 3) Прямые показатели сосудистого тонуса (показатель микроциркуляции и скорость распространения пульсовой волны СРПВ – прибор «Тонокард») являются более чувствительными к вариациям ГМА, чем показатели АД, и их мониторинг позволяет получать качественно новую информацию о реакции различных отделов сердечно-сосудистой системы на действие ГМА 4) В результате четырехлетних наблюдений за постоянной группой здоровых волонтеров показано, что во время ГМА увеличивается уровень перфузии периферических тканей, приводящий к явлению венозного застоя крови в сосудах субкапиллярного сплетения. Частотный анализ динамики периферического кровообращения (метод лазерной доплеровской флоуметрии, ЛАКК-02) показывает, что происходит активизация механизмов управления состоянием микроциркуляторного русла (миогенного и нейрогенного). 5) Эксперименты по синхронному мониторированию вариаций геомагнитного поля и показателей нарушений электропроводимости различных участков миокарда (метод дисперсионного картирования ЭКГ (прибор «Кардиовизор» – метод основан на топологической модели микровибраций сигнала ЭКГ, величина которых составляет 3-5 % амплитуды R-волны и позволяет определить природу и степень изменений миокарда, не выявляемых обычно на ЭКГ) показали, что во время ГМА в частотном диапазоне 1–35 мГц (1–30 минут) в динамике как геофизического, так и физиологического показателя у испытуемых доминирующими являются периоды в 6–8 и 20–25 минут, причем выраженность этих периодов изменяется синхронно. Во время спокойных геомагнитных условий периоды физиологических флуктуаций не совпадают с геофизическими. 258 АТМОСФЕРНЫЕ РИСКИ ЗДОРОВЬЮ НАСЕЛЕНИЯ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ПОГОДНЫХ УСЛОВИЯХ: ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И РАЗВИТИЯ ГИПОКСИИ А.С. Гинзбург1), Д.Г.Замолодчиков2), В.В.Орлов3), Е.И.Федорова1) Институт физики атмосферы им. А.М. Обухова РАН, Москва; Центр по проблемам экологии и продуктивности лесов РАН, Москва; 3)ФГПУ «Объединенная больница с поликлиникой» УДП РФ, Москва 1) 2) Экстремальные погодные ситуации лета и зимы 2010 года в Московском регионе привлекли большое внимание к анализу основных причин возникновения и развития гипоксии. Такой анализ был проведен в 2011 году в рамках проекта «Разработка рекомендаций по снижению атмосферных рисков здоровью населения городов России в экстремальных погодных условиях». Количество кислорода в воздухе является одним из важнейших метеорологических факторов, влияющих на самочувствие людей. Это воздействие определяется не концентрацией кислорода (т.е. его относительной долей в газовом составе), а его весовым содержанием в единице объёма, называемым также парциальной плотностью и измеряемым в г/м3. При практически постоянной концентрации кислорода в атмосферном воздухе его парциальная плотность зависит от давления, температуры и влажности приземного воздуха. Отклонения от климатической нормы весового содержания кислорода в воздухе приводит к появлению симптомов гипоксии как при пониженных, так и при повышенных содержаниях кислорода. Во втором случае в организме человека развивается так называемая вторичная гипероксическая гипоксия. При этом с физиологической точки зрения человек легче адаптируется к недостатку весового содержания кислорода, чем к его избытку. В больших городах, особенно при застойных погодных условиях, к негативному воздействию аномального содержания кислорода добавляется влияние повышенного содержания угарного газа. Поскольку весовое содержание кислорода в приземном воздухе растет с ростом давления и с понижением температуры, то его содержание особенно высоко в устойчивых зимних антициклонических условиях. Летом, в устойчивом антициклоне высокая 259 температура в некоторой степени компенсирует повышенное атмосферное давление, поэтому весовое содержание кислорода в воздухе ближе к среднему. Соответственно, заметное снижение весового содержания кислорода должно быть, например, перед грозой, когда давление резко падает и у многих людей возникает ощущение затрудненного дыхания. Власти, метеорологические и экологические службы и органы здравоохранения Москвы и других больших городов России должны своевременно информировать население о неблагоприятных для дыхания людей метеорологических и экологических ситуациях. Основой для выработки рекомендаций по снижению атмосферных рисков здоровью населения могут служить комплексные индексы загрязнения воздуха, разработанные в рамках выполнения ОКР «МЕГАПОЛИС – Разработка методического, алгоритмического и программного обеспечения для сбора и предварительной обработки временных серий данных наземных наблюдений для оценки состояния и динамики изменения окружающей среды в крупных городах». Программный модуль расчета индивидуальных и комплексных показателей качества воздуха в мегаполисах разработан сотрудниками ИФА РАН на основе сравнительного анализа российских нормативов качества воздуха, а также разработок и рекомендаций ВОЗ, ЮНЕП, США и Евросоюза. Авторы благодарят А.И.Скорохода и В.А.Фалалееву за предоставленные алгоритмы и программное обеспечение. РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ МНОГОФАКТОРНОЙ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ГЛОБАЛЬНОГО ИЗМЕНЕНИЯ КЛИМАТА НА ЗДОРОВЬЕ НАСЕЛЕНИЯ РОССИИ. Создание интернет-сайта «Окружающая среда и здоровье» Г.С.Голицын1), А.А.Макоско1), А.А.Матешева1), М.А.Артамонова1), Л.О.Максименков1), О.В.Овсянникова1), 2), Ф.А.Погарский1), С.В.Ткачук1), 3) Институт физики атмосферы им. А.М.Обухова РАН; Центральная клиническая больница РАН; 3)Гидрометцентр России 1) 2) Для многофакторной оценки влияния глобального изменения климата на здоровье населения России в 2007–2010 гг. был 260 разработан комплексный Индекс патогенности погоды (ИПП). В этот индекс вошли 3 группы параметров, определяющих состояние атмосферы, ее чистоту и возмущение магнитного поля Земли. К первой группе относятся метеорологические параметры атмосферы, ко второй группе – параметры загрязнения атмосферы и к третьей группе – гелио-геомагнитные параметры. ИПП был разработан на основании данных, анализируемых для Медицинского прогноза погоды (МПП), который применялся в низкогорном курортном регионе Кавказских Минеральных Вод. Система МПП опиралась на метеорологическую и синоптическую информацию в данном регионе. На основании метеорологического прогноза давался медицинский прогноз самочувствия больных на курорте и рекомендации врачам по профилактике негативного воздействия погоды на здоровье пациентов. Для оценки воздействия городской воздушной среды на здоровье населения ИПП необходимо было расширить и ввести параметры загрязнения атмосферы. Для полноты оценки воздействия внешней среды на человека в ИПП были также включены параметры, характеризующие космическую погоду. В 2011 году в рамках настоящего проекта были продолжены работы по изучению биотропного влияния изменения состояния атмосферы на здоровье людей. Продолжено изучение сочетанного влияния биотропных факторов загрязнения атмосферы и метеорологических параметров на здоровье человека в условиях мегаполиса на примере г. Москвы и ближнего Подмосковья (Одинцовский район). Экстремальные значения температуры воздуха и уровня загрязнения атмосферы, наблюдавшиеся летом 2010 года, использованы для уточнения соответствующих коэффициентов ИПП. Проводился пересмотр набора параметров, входящих в ИПП. Был продолжен анализ данных экстремального состоянии атмосферы лета 2010 года. Исследованы вариации соотношения количества умерших и поступивших больных в пульмонологическое, кардиологическое и неврологическое отделения больницы Одинцовского района и Центральной клинической больницы РАН. Обнаружено, что основным критерием биотропности погоды, коррелирующим с указанным соотношением, 261 во второй половине лета 2010 года являлись температура воздуха и уровень загрязнения атмосферы. В соответствии с указанием Координатора Программы разработан проект Государственной программы «Фундаментальные и прикладные исследования рисков и путей снижения негативного комплексного воздействия экстремальных факторов окружающей среды на здоровье населения России в условиях изменяющегося климата (2011–2015 годы)», который представлен в Минздравсоцразвития России. Было проанализировано содержание сайтов, существующих в США и Европейских странах, посвящённых мониторингу загрязнения атмосферы, качеству воздуха в городах, влиянию изменения погоды, климата и окружающей среды на самочувствие людей. С учетом данного анализа и структуры проекта вышеуказанной Государственной программы разработан сайт «Окружающая среда и здоровье»: его концепция, структура, дизайн, программная реализация. Начато наполнение сайта. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЗАГРЯЗНЕНИЯ АТМОСФЕРЫ В МОСКОВСКОМ РЕГИОНЕ (2010-2011 Г.Г.). АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ КАЧЕСТВА ВОЗДУХА И МЕТЕОПАРАМЕТРОВ НА ЗДОРОВЬЕ НАСЕЛЕНИЯ 1) Е.И.Гречко , Г.И.Горчаков1), А.В.Джола1), В.С.Ракитин1), Н.Л.Тетерина2), М.С.Артамонова1), Л.О.Максименков1) Институт физики атмосферы им. А.М.Обухова РАН; 2)МУЗ «Районная больница № 3», с. Никольское, Одинцовский район МО 1) В течение 2010–2011 гг. на Звенигородской научной станции ИФА РАН им. А.М.Обухова проводились регулярные измерения содержания в атмосфере загрязняющих примесей (окиси углерода, окислов азота, озона, аэрозоля). Измерения проводились как в толще атмосферы, так и в приземном слое. Использовались спектроскопические комплексы и газоанализаторы. Подобные измерения проводятся в течение более чем 40 лет и являются уникальными для Московского региона. В июле-августе 2010 г. в Центральном регионе России, включая Московский регион, 262 наблюдалась аномально высокая температура воздуха. Как следствие этой природной аномалии возникли многочисленные пожары. Это были пожары торфяников, наземные и верховые пожары лесов. Возникла ситуация, когда во время мощного антициклона произошло катастрофическое накопление загрязняющих примесей в атмосфере Московского региона, включая г. Москву. Измерения содержания загрязняющих примесей в атмосфере показали, что концентрация окиси углерода в некоторые дни достигала 12 ppm. Это в 4 раза выше предельно допустимых концентраций (ПДК) и в 120 раз выше фоновых концентраций. Концентрация аэрозольных частиц достигала уровней, в 3 раза превышающих ПДК. Измерения содержания окиси углерода и аэрозоля в толще атмосферы также показали многократное превышение. По cпутниковым данным (MOPITT, AIRS) сделаны оценки выбросов окиси углерода во время пожаров в Центральной России. Выбросы окиси углерода достигали 17 мегатонн, что в 3 раза выше, чем во время летних пожаров 2002 года. Данные измерений прибором MAX DOAS показали в отдельные дни значения оптической толщины 3,5, в то время как содержание двуокиси азота было близко к фоновому. При анализе распределения аэрозольных частиц по размерам установлено, что в задымленном воздухе присутствовали, в основном, частицы размером менее 1 микрона. Как раз частицы именно этого размера наиболее опасны для органов дыхания. Измерения содержания загрязняющих веществ в атмосфере, выполненные в 2011 г., показали практически фоновые значения по всем компонентам, близкие к средним за последние 20 лет. Совместно со специалистами МУЗ «Районная больница № 3» Одинцовского района была проведена работа по анализу смертности пациентов в этот период по группам заболеваний (сердечно-сосудистые, органов дыхания). Был также проведен анализ смертности в этот период в Центральной клинической больнице РАН для больных с диагнозом сердечно-сосудистые заболевания. По сравнению с предыдущими годами резко возросла смертность, связанная с инсультами. Выявлено увеличение количества инфарктов и гипертонических кризов по сравнению с этим же периодом 2008–2009 гг. более чем в 2 раза. 263 Вывод: катастрофическая жара и пожары летом 2010 г. привели к увеличению смертности населения Московского региона. Причина – очень высокая степень загрязнения атмосферы, связанная с пожарами, и аномально высокая температура воздуха. Данные по заболеваемости и смертности за 2011 г. показывают величины, близкие к средним за предыдущие до 2010 годы. Результаты работы были представлены на нескольких конференциях, включая Седьмую Международную конференцию по реабилитологии 27-28 октября 2011 года (пос. Герцена, Московской обл.) и Шестую Международную конференции по атмосферной физике, климату и окружающей среде 1-6 ноября (г. Сиань, Китай). ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ НИЗКОЧАСТОТНЫМИ ФЛУКТУАЦИЯМИ АТМОСФЕРНОГО ДАВЛЕНИЯ С АНОМАЛИЯМИ САМОЧУВСТВИЯ МЕТЕОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ БОЛЬНЫХ С.Н.Куличков1), Г.А.Буш 1), А.И.Алехин 2), О.В.Овсянникова2) Учреждение Российской академии наук Институт физики атмосферы им. А.М.Обухова РАН, Москва; 2)Учреждение Российской академии наук Центральная клиническая больница РАН, Москва 1) Настоящая работа посвящена изучению влияния пульсаций атмосферного давления на состояние здоровья больных. С этой целью, начиная с августа 2008 года, производятся наблюдения пульсаций атмосферного давления с одновременной регистрацией количества экстренно госпитализированных в ЦКБ РАН больных, относящихся к метеочувствительным. В качестве датчика давления используется жидкостный микробарограф ИФА РАН для регистрации пульсаций давления в диапазоне периодов (0.001–2.44) часа. Для определения корреляции между пульсациями атмосферного давления и количеством поступающих больных в ЦКБ РАН из записанных записей колебаний давления при помощи цифровых фильтров Алексеева выделялся диапазон периодов (0.1–1)час. Месячная запись разбивалась на отрезки длительностью 4 часа, в которых вычислялась энергия пульсаций давления в данном 264 диапазоне периодов. Временная зависимость энергии пульсаций давления отображалась одновременно с графиком экстренной госпитализации больных. Совместно с записью микробарографа производилась также запись колебаний атмосферного давления метеорологическим барографом давления. За период с 01.04.09 по 31.10.10 г. в ЦКБ РАН было экстренно госпитализировано 1851 метеозависимых больных, из них 931 мужчин и 920 женщин. К числу метеозависимых больных отнесены больные с диагнозом инфаркт миокарда, cтенокардия, гипертонический криз, экстрасистолия, ОНМК, ЦВБ ДЭП. Средний возраст экстренно госпитализированных мужчин – 67.7 лет, женщин – 69.8 лет. В зависимости от заболевания средний возраст больных распределился следующим образом: 1) у мужчин: инфаркты – 69.1 лет, стенокардия – 68.5, лет, гипертония – 60.1 лет, экстрасистолия – 67.9 лет, ОНМК – 68.5 лет, ЦВБ ДЭП – 70.8 лет; 2) у женщин: инфаркты – 73.2 года, стенокардия – 72.3 года, гипертония – 63.9 лет, экстрасистолия – 71.3 лет, ОНМК – 73.6 лет, ЦВБ ДЭП – 69.9 – лет. Соответственно числа экстренно госпитализированных мужчин и женщин в порядке перечисления заболеваний распределились следующим образом: 1) мужчины – (163, 211, 117, 208, 115, 115) человек; 2) женщины – (72, 185, 207, 162, 78, 216) человек. В результате проведённых исследований установлено наличие зависимости количества экстренной госпитализации больных от колебаний атмосферного давления. При этом замечено, что часть больных вызывает скорую помощь при понижении атмосферного давления, часть при повышении. Например, в январе 2011 года отмечался рост поступления больных в ЦКБ РАН скорой помощью при понижении атмосферного давления. Так, при падении атмосферного давления со скоростью ~ 0.2 (мм рт.ст.)/час суточная госпитализация в клинике составила ~3 человека, а при росте атмосферного давления со скоростью ~0.25 (мм рт.ст.)/час – 0 человек. Напротив, в феврале 2010 года наблюдалось выраженное увеличение экстренной госпитализации при повышении атмосферного давления. При росте атмосферного давления со скоростью 0.4 (мм рт.ст.)/час суточное поступление больных в клинику скорой помощью составляло примерно 7 человек, а при падении давления со скоростью ~ 0.35 (мм рт.ст.)/час поступление больных было близким к нулю. Замечены случаи, когда выраженной зависимости 265 от скорости изменения атмосферного давления не было, однако при этом была выявлена соответствующая зависимость от интенсивности пульсаций атмосферного давления. ВЛИЯНИЕ АЭРОТЕХНОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА КАЧЕСТВО ВОД И ЗДОРОВЬЕ НАСЕЛЕНИЯ Т.И.Моисеенко1), Ю.Г.Таций1), Н.А.Гашкина1), А.Н.Шаров1), В.В.Мигорский2) Институт геохимии и аналитической химии им. В.И.Вернадского РАН, Москва 2) Институт проблем промышленной экологии КНЦ РАН, Апатиты 1) Биогеохимическая индикация загрязнения атмосферного воздуха позволяет установить этиологию заболеваний населения в индустриальных регионах, направить усилия на предупреждение развития микроэлементозов и хронической интоксикации населения. Поступление в окружающую среду газообразных выбросов металлургических предприятий обусловливает высокий уровень загрязнения атмосферного воздуха и, как следствие, открытых водоемов и донных отложений токсичными ингредиентами, что оказывает неблагоприятное влияние на состояние здоровья населения. Одними из наиболее загрязненных регионов России комплексом металлов являются г. Мончегорск Мурманской области (комбинат «Североникель») и район г. Карабаш Челябинской области (медеплавильный комбинат ЗАО «Карабашмедь»), на которых были проведены комплексные биогеохимические исследования последствий загрязнения воздушной и водной сред токсичными тяжелыми металлами (ТМ). На примере городов и поселков Кольского Севера и Южного Урала впервые получены оригинальные данные о содержании более 60 микроэлементов, включая Pb, Cd, Hg, Cu, Zn, Cr, Ni, в водах из источников питьевого водоснабжения и при подаче населению. Показано, что система водоподготовки на существующих водозаборах не устраняет ТМ из питьевых вод. И создает риск для заболеваний населения. Впервые получены достоверные связи между заболеваемостью населения и показателями комплексного загрязнения вод 266 металлами. Результаты анализа клинических, гистологических и лабораторных показателей посмертно обследованных пациентов показали, что в организме человека происходит накопление ТМ техногенной природы, обусловливающих патофизиологические изменения. Для изучения аккумуляции ТМ в тканях печени и почек отбирали патологоанатомический материал у людей, проживавших в данной местности не менее 10 лет и не работавших на предприятиях с высокой вредностью труда. Исследования в Мурманской области показали, что основную опасность для здоровья населения оказывает не столько Ni (наиболее массовый элемент загрязнения), сколько Cd, который в больших количествах накапливается в почках. Для Мончегорска, где питьевые воды содержат повышенные концентрации Ni, Cd, Pb и др. элементов, характерными заболеваниями являются моче- и желчекаменная болезнь, новообразования, глоуронефрит. В районе Карабаша установлена связь содержаний Pb, Cd, As и Hg в волосах детей, как биомаркеров микроэлементозов, от степени загрязнения воздуха и воды. Основным загрязняющим элементом, оказывающим негативное воздействие на здоровье детей, является свинец. Анализ статистических данных по заболеваемости населения г. Карабаш, питьевые воды которого содержат повышенные концентрации Pb, As и других элементов, показал, что помимо респираторно-вирусных, гастроэнтерологических и аллергических заболеваний, характерными также являются патологические нарушения нервной системы, особенно у детей. Полученные в ходе исследований зависимости между частотой встречаемости заболеваний и степенью загрязнения воздуха и поверхностных вод позволяют с большой долей вероятности предположить, что этиология и повышенная заболеваемость населения в г. Мончегорск и Карабаш, включая новообразования, обусловлена загрязнением окружающей среды и хроническим пролонгированным действием металлов и металлоидов. Полученные данные служат основой для медико-экологических детальных исследований и обоснованию мер по устранению источников загрязнения и лечению микроэлементозов у населяющих людей эти города. ПРОГНОЗ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ СМЕРТНОСТИ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ ИЗМЕНЕНИЕМ КЛИМАТА В 267 РОССИЙСКОЙ СУБАРКТИКЕ, НА ПРИМЕРЕ АРХАНГЕЛЬСКА Б.А.Ревич1), Д.А.Шапошников1), В.П.Мелешко2), В.А.Говоркова2), Т.В.Павлова2) Институт народнохозяйственного прогнозирования РАН, Москва Главная геофизическая обсерватория им. А.И.Воейкова, СанктПетербург 1) 2) Цель данного исследования – развитие методологии оценки дополнительной смертности, вызванной потеплением климата в Арктическом регионе, для получения численных прогнозов воздействия климатических изменений на здоровье населения. В качестве модельного города выбран Архангельска, где реализуется проект по адаптации системы здравоохранения к климатическим изменениям. В работе рассматриваются два механизма, обусловливающих влияние температуры приземного слоя атмосферы на здоровье человека – влияние сезонных изменений температуры и температурных волн. В основе первого механизма лежит представление о так называемых «температурных кривых смертности», которые численно характеризуют статистическую связь смертности с температурой воздуха. Если такая зависимость установлена, то для любого заданного наперед изменения среднесуточных температур за каждую календарную дату можно рассчитать соответствующее изменение смертности. Второй механизм использует представление о «температурных волнах». Точнее, гипотезу о том, что во время температурных волн смертность превышает среднестатистическую, ожидаемую для данных календарных дат величину. Причем, даже если предсказать смертность во время отдельно взятой ожидаемой температурной волны невозможно, развитые в данном исследовании методы позволяют рассчитать увеличение смертности в среднем для целого ансамбля волн, ожидаемых за достаточно продолжительный промежуток времени, скажем, за 20 лет. В этом случае при изменении некоторых характеристик ансамбля волн между базовым и прогнозным периодами должна меняться и дополнительная смертность, обусловленная температурными волнами. В рамках принятых в данном исследовании определений оба механизма 268 изменения смертности можно рассматривать независимо друг от друга, то есть они имеют аддитивный характер. На примере Архангельской области проведена регионализация ансамбля климатических моделей глобальной циркуляции атмосферы и океана (МОЦАО) и рассчитаны ожидаемые изменения среднесуточных температур воздуха для каждой календарной даты и изменения частоты и продолжительности волн тепла и волн холода между базовым периодом 1980-1999 гг. и прогнозным периодом 2040-2059 гг. с учетом сценария А2 роста парниковых газов и аэрозоля, по терминологии МГЭИК (IPCC). Снижение зимней смертности оказывается сильнее повышения летней смертности, и общий эффект потепления климата оказывается благоприятным – прогнозируется снижение среднегодовой смертности. На основе климатического прогноза было рассчитано ожидаемое к 2050 г. относительное изменение смертности в г. Архангельске отдельно для пяти причин (все внешние причины, все естественные причины, ишемическая болезнь сердца, цереброваскуляные и респираторные заболевания) для двух возрастных групп: 30-64 и свыше 64 лет. Естественная смертность может снизиться примерно на 1 %, а смертность от внешних причин примерно на 2 %. При этом для отдельных климатозависимых причин снижение будет больше – например, для инсультов до 4 %. При этом основные изменения ожидаются в старшей возрастной группе. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ОЦЕНКИ НЕГАТИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПОГОДНЫХ АНОМАЛИЙ И АЭРОЗОЛЬНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ АТМОСФЕРЫ НА ЛЕЧЕБНЫЕ СВОЙСТВА ГОРНЫХ КУРОРТНОРЕКРЕАЦИОННЫХ ЭКОСИСТЕМ (ПАРКОВ, СКВЕРОВ) ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ САНАТОРНОКУРОРТНОГО ЛЕЧЕНИЯ И УЧЕТА В СИСТЕМЕ МЕДИЦИНСКОГО ПРОГНОЗА ПОГОДЫ И.А.Сеник1), Г.С.Голицын1), М.С.Артамонова1), Н.П.Поволоцкая2), А.Н.Сафронов1), В.В.Слепых3) Высокогорный научный стационар УРАН Института физики атмосферы им. А.М.Обухова РАН 1) 269 ФГБУ «Пятигорский государственный НИИ курортологии Федерального медико-биологического агентства» 3) Горно-лесная лаборатория ФБУ «Научно-исследовательский институт горного лесоводства и экологии леса» МПР РФ 2) Большая часть низкогорья и среднегорья на Юге России (ЮФО, СКФО Северного Кавказа) отнесены к курортно-рекреационным зонам (КРЗ), имеющим стратегическое значение в оздоровлении населения России. Погодные аномалии и усиление антропогенной нагрузки оказывают негативное влияние на лечебно-оздоровительный потенциал курортно-рекреационных экосистем, ведущая роль в которых принадлежит ландшафтным экосистемам (паркам, скверам) и их биоклиматическим ресурсам, создающим благоприятный фон и для других курортных методов лечения. В эпоху климатических перемен необходимо создание технологии контроля биоклиматических ресурсов и корректировки медицинских технологий, использующих природные лечебные ресурсы этих экосистем для лечения и профилактики синдромов дизадаптации у больных с социально-значимыми заболеваниями. Были проведены в рамках мониторинга 2010-2011 гг. многочисленные маршрутные измерения параметров ионизации воздуха, фитонцидной активности растений, радиационного и теплового режима и других параметров, при разных метеоусловиях и разном аэрозольном и газовом составе приземной атмосферы на территории и вдоль маршрутов терренкура Ессентукского курортного парка (ЕКП). Синхронно с мониторингом терренкуров многофакторное обследование проходили 200 пациентов со сниженными адаптационными возможностями (с метаболическим синдромом, синдромом раздраженного кишечника и др.), находившиеся на курортном лечении, в том числе с применением технологии дозированной ходьбы по терренкурам, в Ессентукской клинике. Осуществлялись медико-биологические исследования фунциональной активности мозга, синдрома дизадаптации, сердечной деятельности и состояния других физиологических систем, клинические и биохимические исследования, были оценены типы адаптационных реакций, уровень реактивности организма (по Гаркави), метеопатические реакции по стандартным тестам (по Ефименко), показатели нейрососудистой реактивности (по 270 Топурия), терморегуляции (по Поволоцкой), вегетативные и гемодинамические индексы, липидный обмен. Это позволило оценить эффективность дозированных прогулок по маршрутам терренкура в сочетании с аэро-ионо-фитотерапией (АИФТ) при разных экологических и метеоусловиях и сравнить результаты курортного лечения с контрольной группой, а также обосновать критерии интегрального биоклиматического потенциала (IBK), утвержденные Медико-биологическим агентством РФ для оценки подобных эколого-рекреационных территорий. Было подтверждено, что ЕКП, являясь существенным средообразующим фактором города, обладает мощным лечебным потенциалом с IBK равным 2.34 балла. Особое внимание было уделено оценке фитонцидных свойств и компонентного состава летучих фитоорганических веществ растений в ЕКП. В качестве тест-культуры использовали Staphylococcus aureus 209 p. ЛФОВ растений ЕКП обладают от умеренной до выше средней фитонцидной активностью: 27-79 %. В состав ЛФОВ растений входят бициклические терпены (-пинен до 60 %; -пинен до 20 %; l-камфен до 6 %; -карен до 8.2 %), бициклические сложные эфиры (борнилацетат до 12.7 %) и другие компоненты Найденые зависимости фитонцидной активности от сезона года и погодных параметров положены в основу АИФТ. В ходе исследований проводится последовательная итерационная коррекция Системы медицинского прогноза погоды (МПП). На этапе 2011 г., учитывая летние пожары масштаба национальной катастрофы, предложено интегрировать в систему МПП блок оценки риска влияния пожаров на экологическую обстановку в регионе: используя орбитальные данные пожарной обстановки MODIS спутников Terra и Aqua MOD14/MYD14. Результаты исследований 2011 г. легли в основу докладов на совещаниях и конференциях, материалов для СМИ, рекомендаций по рациональному использованию экоресурсов и формированию системы мониторинга в регионе (по запросу администрации КМВ), а также для создания и совершенствования современных технологий КП и КТ. Работа поддержана грантами программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», РФФИ № 10-05-04014-а. 271 9. Материалы ГЕТЕРОГЕННЫЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ И.Г.Ассовский1), В.Г.Баленко2), В.И.Колесников-Свинарев1), Ю.А.Никитаев1), А.Я.Горенберг1), Г.П.Кузнецов1), В.А.Шубин3) Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва 2) НИИ органических полупродуктов и красителей, Москва; 3) Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва 1) Целью проекта является разработка новых медицинских материалов – гетерогенных фотосенсибилизаторов, состоящих из полупроводниковых керамик, сенсибилизированных органическими красителями к видимому свету для получения фотодинамического эффекта (ФДЭ). ФДЭ лежит в основе метода фотодинамической терапии (ФДТ) вирусных и онкологических заболеваний, а также фотодинамической дезинфекции и очистки от загрязнений материалов, применяемых в медицине (донорской крови, водных растворов и др.). Используемые в настоящее время в качестве фотосенсибилизаторов водорастворимые красители, прежде всего, метиленовый синий, несмотря на достаточно высокую их эффективность, имеют существенные недостатки: токсичность, сложность последующего удаления, а также невозможность длительного использования при многократном облучении. Разрабатываемые в рамках проекта гетерогенные фотосенсибилизаторы, состоящие из высокодисперсных широкозонных полупроводниковых керамик, сенсибилизированных органическими красителями к видимому свету, дают возможность обьединить преимущества керамических сенсибилизаторов и органических красителей. Новый класс высокоэффективных твердофазных фотосенсибилизаторов позволяет обеспечить малую токсичность, фотодинамическое действие в области максимальной прозрачности человеческих тканей, физическую и химическую стабильность сенсибилизаторов при многократном облучении и полное их извлечение после применения. Главными результатами выполнения программы исследований 2009-2011 годов являются: разработанные технологии синтеза пред272 лагаемых гетерогенных фотосенсибилизаторов, в том числе получения оксида титана фотосенсибилизированного к видимому свету фталоцианиновыми красителями; экспериментальное доказательство наличия фотодинамического действия у сенсибилизированных фталоцианинами микрочастиц двуоки титана. Программа исследований этапа 2011 года включала оптимизацию предлагаемого метода получения и состава гетерогенных фотосенсибилизаторов. Показано, что предпочтительным способом получения микрочастиц двуокиси титана фотосенсибилизированных безметальным фталоцианином является гидролиз жидких алкоголятов титана в растворах-предшественниках [смесях спиртов с растворителями красителя (бензолом, толуолом и др.) и технологическими добавками]. Для испытаний полученных гетерогенных структур керамика-краситель на фотодинамическую активность была создана специальная установка, позволяющая регистрировать изменение спектра оптической плотности тестируемого вещества в широком интервале длин волн. Раствор подсвечивался галогенной лампой через светофильтры желто-красным излучением, соответствующим максимальной прозрачности человеческих тканей и полосе поглощения красителя. В качестве модельного вещества, деградирующего при фотодинамическом воздействии, использовались растворы триптофана в воде различной концентрации. Облучение растворов происходило в течение 15 мин и повторялось 5 раз с периодом 24 часа. Результаты экспериментов доказывают наличие сильного фотодинамического эффекта: достаточно быстрое убывание характерного максимума спектра, соответствующего триптофану, при периодическом освещении водного раствора триптофана дневным светом. БИОСОВМЕСТИМЫЕ КОМПОЗИЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНЫХ ТКАНЕЙ С.М.Баринов1), В.С.Комлев1), И.В.Фадеева1), А.Ю.Федотов1), Н.В.Петракова1) Учреждение Российской академии наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН, Москва 1) 273 Прогресс в развитии медицинских технологий восстановления поврежденных костных тканей может быть обеспечен не только совершенствованием хирургической техники и реабилитационных мероприятий, но и, в значительной мере, внедрением в практику принципиально нового поколения имплантатов на основе синтетических материалов и клеточных технологий. Можно полагать, что максимальное приближение имплантата к естественной костной ткани обеспечит его оптимальное «биологическое» поведение в зоне дефекта и адекватное ремоделирование (реконструкцию) костной ткани. Полагают, что оптимальным материалом является композит кальцийфосфатная керамика – биополимер, моделирующий по фазовому составу и микроструктурной организации костную ткань. В работе проведены исследования по созданию композиционных материалов на основе хитозановых матриксов с использованием биомиметического метода осаждения на них фосфата кальция из жидкостей, моделирующих внеклеточные жидкости организма (SBF, simulated body fluid). Процесс организован подобно процессу биоминерализации коллагенового матрикса, происходящему в организме. Установлены закономерности формирования микроструктуры и свойств композиционных материалов в зависимости от состава матрикса и времени выдержки в SBF. Разработанные материалы эластичны, имеют пористость до 80 %, размер пор до 300 мкм, обладают регулируемой кинетикой биодеградации, содержат аморфный фосфат кальция. Возможен альтернативный подход, основанный на введении полимера в керамическую матрицу. Разработаны основы технологии высокопористых композиционных материалов с непрерывным кальцийфосфатным керамическим каркасом, пропитанным хитозаном в количестве до 25 об. %. Матриксы имеют взаимосвязанные поры, пористость от 50 до 75 %, размер крупных пор до 500 мкм и мелких до 2 мкм. Инфильтрация хитозаном позволяет повысить прочность при сжатии материала до 7 раз и снизить чувствительность прочности к пористости до 2 раз в результате залечивания трещиноподобных дефектов и снижения концентрации напряжения у пор. 274 МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ МАТЕРИАЛЫ С ПОВЫШЕННОЙ ТРОМБОРЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ И.Л.Валуев, И.В.Обыденнова, Л.В.Ванчугова, Ю.А.Талызенков Учреждение Российской академии наук Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН Предложен и экспериментально проверен новый подход к повышению тромборезистентности полимерных материалов путем модификации их поверхности смесью гирудина и овомукоида. Гирудин – антикоагулянт прямого действия, способный предотвращать свертывание крови за счет нейтрализации активности тромбина без участия каких-либо находящихся в крови компонентов. Овомукоид является природным ингибитором протеолитических ферментов широкого спектра действия. В качестве исходных полимеров использовали промышленно выпускаемые полимеры медицинского назначения – полиэтилен, полипропилен, полиметилметакрилат, полидиметилсилоксан, полиуретан и полиэтилентерефталат. Модификацию полимеров проводили путем радиационной привитой сополимеризации на их поверхности смеси гидрофильного мономера и ненасыщенных производных гирудина и овомукоида, получаемых ацилированием этих соединений хлорангидридом акриловой кислоты. Суммарная доза облучения составляла 1.5–5.0 Мрад. Оценку тромборезистентности полимеров проводили путем измерения времени свертывания крови на поверхности полимера, количества тромбоцитов, адгезированных из плазмы крови человека на этой поверхности, и константы скорости активации системы комплементов сыворотки человеческой крови. Показано, что прививка на поверхности полимера смеси гирудина и овомукоида приводит к частичной денатурации этих соединений и уменьшению их биологической активности. Введение в прививаемую смесь гидрофильного мономера обеспечивает удаление молекул гирудина и овомукоида от гидрофобной поверхности исходного полимера и создание благоприятных условий для их функционирования. В экспериментах in vitro показано, что в результате модификации время свертывания крови на поверхности полимера увеличивается примерно в 5-7 раз, количество адгезированных тромбоцитов уменьшается в 4-8 раз, а константа скорости активации системы комплементов сыворотки 275 человеческой крови, характеризующая степень денатурации белков плазмы крови в результате их контакта с поверхностью полимера, уменьшается в 6-10 раз. В экспериментах ex vivo в просвет яремных вен собак имплантировали цилиндры из исходных и модифицированных полимеров длиной 30 мм и диаметром 4 мм. Время экспозиции 30, 60 и 130 минут. Обнаружено, что за время наблюдения 130 минут цилиндры из модифицированных полимеров оставались полностью проходимыми и в их просвете тромбов не было. Цилиндры из немодифицированных полимеров забивались тромбом за первые 30 минут. Таким образом, в рамках решения проблемы повышения гемосовместимости полимеров создано три типа материалов для различных областей и сроков применения: материалы на основе смеси полимеров и водорастворимых наполнителей, контролируемо выделяющие наполнитель и тем самым обновляющие поверхность; материалы, способные сорбировать из крови плазминоген и его активировать в плазмин; материалы, предотвращающие свертывание крови за счет ингибирования активности тромбина. По материалам работ опубликовано несколько статей и получено 2 патента РФ. ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРСПЕКТИВНЫХ МЕДИЦИНСКИХ НАНОМАТЕРИАЛОВ С ЭФФЕТОМ ПАМЯТИ ФОРМЫ В.Т.Заболотный, Б.А.Гончаренко, А.Г.Колмаков, М.А.Севостьянов Учреждение Российской академии наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН В ИМЕТ РАН разработана комплексная технология получения одномерного композита на базе «наноструктурный сплава NiTi – поверхностный слой из Та» и уникальных медицинских устройства из него в виде стентов, фильтров и шунтов. Технология включает получение проволок из наноструктурированного никилида титана (диаметр зерна ≤150 нм) с прецизионным химическим составом (50,9±0,1 ат.% Ni), стабилизирующую термообработку, механическую обработку поверхности и ионно-вакуумную технологию 276 формирования поверхностного слоя из тантала. Диаметр проволок для стентов, используемых при восстановлении пищеводного тракта, составляет 300–280 мкм, а при шунтировании, в урологии, уринотерапии и др. – 150 мкм. Для получения наиболее благоприятного комплекса физикомеханических и химических свойств композита были проведены исследования по оптимизации технологических режимов на ключевых стадиях его получения. Так, было выявлено, что наиболее высокие показатели механических характеристик в условиях как статического, так и усталостного нагружнения, достигаются при использовании отжига 450 оС в течение 15 мин. Механическая обработка поверхности наиболее целесообразна до достижения относительной максимальной глубины поверхностных микродефектов R/d ≈0,007, после которой дальнейшее уменьшение величины дефектов уже не вызывает заметного улучшения механических свойств, но ведет к существенному росту финансовых и временных затрат. Проведение перед формированием танталового поверхностного слоя предварительной лучевой обработки ионами аргона при U см = 700 В и t = 20 мин позволяло добиваться хорошей адгезионной связи между компонентами композита и повышения механических характеристик основы. Формирование поверхностного слоя из тантала толщиной 3-4 мкм позволило получить изделия с очень высокими коррозионной стойкостью в активной среде и биосовместимостью. При коррозионных испытаниях изделий в средах, моделирующих разные участки человеческого организма, в течение 2 месяцев не обнаружено выхода ионов Ni и Ti в активную среду. Обнаружена высокая адгезионная связь между компонентами композита и стойкость поверхностного слоя к деформации. По сравнению с наноструктурным нитинолом у композита удалось добиться одновременного роста показателей прочности и пластичности (на 7–11 %) . Фазовый переход у нанокомпозита протекал так же, как и у сплава с памятью формы, но значения фазового предела текучести были выше. По клиническим прогнозам срок службы изделий из разработанного нанокомпозита превышает срок службы изделий из нитинола примерно в три раза. 277 Проведенные исследования позволили существенно улучшить «щадящий» режим эндоваскулярных операций с применением разработанных изделий, увеличить срок службы устанавливаемых стентов и повысить их биосовместимость с человеческим организмом. Полученные по оптимизированной технологии изделия типа «стент» превосходят любые зарубежные аналогичные устройства по биосовместимости, коррозионной стойкости, сроку службы и комплексу физико-механических свойств в 3-4 раза при существенно меньшей стоимости. Дальнейшие исследования, намеченные на 2012-2013 годы, будут направлены на создание композита с поверхностным слоем из сплавов типа Ti-Ta или Ti-TaNb, который будет иметь совместимость с никилидом титана по значениям модуля упругости и коэффициента термического расширения. Срок службы медицинских изделий из таких композитов в человеческом организме будет дополнительно увеличен еще в 2-3 раза. РАЗРАБОТКА НОВЫХ БИОАКТИВНЫХ И БИОРАЗЛАГАЕМЫХ КОМПОЗИЦИЙ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ПОЛИОКСИБУТИРАТА И ХИТОЗАНА ДЛЯ ИНКАПСУЛЯЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ А.Л.Иорданский1), С.З.Роговина1), Р.Ю.Косенко1), А.Л.Жулькина1), Е.Л.Иванцова1), Э.В.Прут1), Д.Д.Новиков1), К.В.Алексанян1), Г.А.Бонарцева2), А.П.Бонарцев2) Учреждение Российской академии наук Институт химической физики им. Н.Н.Семенова; 2) Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН 1) В рамках фундаментальной проблемы создания нового поколения полностью биоразлагаемых композиционных систем, предназначенных для замещения традиционных синтетических материалов, разработаны амфифильные, полностью биоразлагаемые композиции на основе природных полимеров – гидрофобного поли(3-гидроксибутирата) (ПГБ) и гидрофильного хитозана (ХТ). Показано, что в отличие от известных ранее полимерных терапевтических систем предлагаемые структуры обладают а) повышенной сорбционной емкостью лекарственных веществ (ЛВ), 278 регулируемой скоростью биоразложения в модельных и биологических средах, в) высокой биосовместимостью и отсутствием токсичности и г) способностью реализовывать различные кинетические профили пролонгированного высвобождения ЛВ в широком диапазоне времени (от недель до месяцев). 1. Сопоставление технологических методов получения пленочных композиций ПГБ-хитозан-рифампицин. Для формирования композиций были выбраны два независимых метода: смешение полимеров в водно-органических смесях растворителей, в частности диоксан – вода, а также их твердофазное смешение в условиях высокоинтенсивных сдвиговых деформаций. Установлено влияние условий смешения (температуры, времени смешения и последовательности загрузки компонентов) на функциональное поведение композиций. Разработанные способы инкапсуляции терапевтических агентов (рифампицина и дипиридамола) в твердой фазе и мокрым формованием позволили получить системы в широком диапазоне полимерных составов и концентраций ЛВ. 2. Контроль физико-химических характеристик смесевых композиций ПГБ-ХТ-ЛВ. Представлены научно обоснованные приципы влияния полярности макромолекул на морфологию (атомно-силовая и сканирующая микроскопия), транспортные и физико-химические характеристики (адгезионные, механические) биоразлагаемых композиций. Структурно-морфологические особенности композиций на микро- и наноуровнях (формирование водородных связей, анизотропия и гетерогенность матрицы, ее кристалличность) рассмотрены как ключевые факторы, ответственные за сорбционную емкость воды и ЛВ, а также определяющие их транспорт и скорость высвобождения ЛВ. 3. Ключевые кинетические характеристики направленного транспорта ЛВ in vitro. Впервые показано, что в исследуемых композициях транспортные процессы ответственны как за механизм высвобождения ЛВ, так и скорость гидролитической деструкции, приводящей к образованию фрагментов ПГБ и их последующий переход в окружающую водную среду. Найдена критическая ММ продуктов гидролиза (2000 кДа), при достижении которой происходит растворение и десорбция низкомолекулярных продуктов. 4. Микрозондовый анализ динамики сегментальной подвижности, температурный Фурье-имиджинг смесевых 279 композиций. Сопоставление сегментальной подвижности индивидуальных полимеров (ПГБ и хитозана) и их подвижностей в смеси позволило дать анализ интенсивности взаимодействия макромолекул разного типа, выявить температурные сдвиги фазовых переходов как результат смешения. Аналогичное «ужесточение» структуры подвижного полимера с низкой температурой стеклования (6 oC) наблюдается при его химической модификации полимером с более высокой температурой стеклования. По результатам этапа проекта оформляется Патент РФ 09.2011, опубликовано 2 главы в монографиях, 10 статей, представлено 2 доклада на международных конференциях, а также защищена бакалаврская диссертация (июнь 2011 г.) и подготовлена кандидатская диссертации Е.Л.Иванцовой (апрель 2012 г.). МИКРОКОМПОЗИТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ПИМЕРОВ КАК МАТРИЦЫ ДЛ ЛЕКАРСТЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В.Г.Куличихин1), В.Т.Калинников 2) Институт нефтехимического синтеза РАН, Москва Института химии и технологии редких элементов и минерального сырья Кольского научного центра РАН 1) 2) 1. Биоразлагаемые целлюлозно-хитозановые композиционные материалы С целью создания биосовместимых и биоразлагаемых целюлозно-хитозановых композиционных материалов для использования в медицинской технике разработана методология получения прекурсоров композитов – смеси целлюлозы с наночастицами хитозана, включающая нанодиспергирование хитозана в водных растворах до размеров 200-600 нм с последующей сушкой, предотвращающей агломерацию наночастиц хитозана. Как показали данные РСА и ИК-спектроскопии, в процессе структурной модификации хитозана происходит частичная деструкция хитозана по связи – С-О-С, сопровождающаяся увеличением степени кристалличности полученных образцов. Основываясь на разработанном нами оригинальном способе твердофазного растворения, полученные 280 прекурсоры были растворены в полярном растворителе Nметилморфолин-N-оксиде (ММО), а затем при их контакте с осадителем впервые получены смесевые нанокомпозитные волокна. Исследованы их структурные особенности. Было показано, что механические свойства полученных новых целлюлозно-хитозановых нанокомпозитов на 20-30 % превосходят прочностные показатели исходных целлюлозных волокон, при этом оказалось, что удлинение при разрыве в два раза выше, чем у целлюлозных волокон. Таким образом, впервые получены целлюлозно-хитозановых нанокомпозитные волокна, необычная высокая деформируемость которых позволяет рассматривать их как перспективные материалы в качестве основы для создания матриц лекарственных препаратов. 2. Органоминеральные биокомпозиты на основе фосфатов кальция В системе CaCl2-(NH4)2HPO4-NH4HCO3-(C6H11NO4)n-NH3-H2O в ходе совместного осаждения карбонатгидроксиапатита кальция (КГА) и хитозана (ХИТ) из водного раствора происходит образование однородного по составу композиционного материалов органика – неорганика КГА/ХИТ. Неорганическая фракция синтезированных биокомпозитов КГА/ХИТ представляет собой наноразмерный КГА с размерами частиц, близкими к размерам КГА нативной кости. Реакция синтеза КГА в ходе соосаждения органической и неорганической фракций из водных растворов в определенной степени моделирует процессы биоминерализации КГА при остеогенезе. В ходе реакции синтеза реализуется получение биокомпозита, моделирующего характеристики костной ткани. Морфология биокомпозитов по данным электронной микроскопии определяется взаимодействием нанокристаллов КГА с макромолекулами биополимера (ХИТ) с образованием в процессе высыхания глобул состава КГА-ХИТ, опредляющих глобулярное строение биокомпозита КГА/ХИТ и его нанопористую структуру. Синтезированные биокомпозиты КГА/ХИТ включают в свой состав биосовместимые органическую и неорганическую фракции и являются перспективными объектами для внедрения в медицинскую практику. 281 ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИАЛЬНЫХ ПРОФИЛИРОВАННЫХ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ЭНДОПРОТЕЗОВ СУСТАВОВ И СОСУДОВ МОЗГА С.П.Никаноров, В.М.Крымов, С.А.Пульнев Физико-технический институт им. А.Ф.Иоффе РАН Новые конструкции эндопротезов оптимально создавать на основе новых современных биосовместимых материалов. Разрабатываемые в ФТИ им. А.Ф.Иоффе материалы и способы их получения, а именно биосовместимые профилированный сапфир и сплавы с эффектом сверухпругости, были применены для создания эндопротезов суставов и эндопротезов (стентов) для лечения аневризм сосудов мозга. Эндопротезирование тазобедренного сустава является в настоящее время самой распространенной ортопедической операцией в мире. Однако задача обеспечения биосовместимости при высоких прочностных и трибологических показателях подвижного соединения современных эндопротезов еще не решена. В настоящее время в основном применяется энодопротез с бедренной головкой из металла, которая скользит по впадине из низкофрикционного полимера. Недостатком такого эндопротеза является его быстрый износ с попаданием микрочастиц в окружающие ткани и развитием остеолиза. В последнее время разрабатываются эндопротезы на основе пар трения керамика-керамика и металл-металл. Однако, как показывают работы украинских ученых (Институт патологии позвоночника и суставов им. М. Ситенко), наиболее перспективен эндопротез на основе пары трения сапфир-сапфир. В рамках данной работы была разработана технология получения шаровой опоры эндопротеза тазобедренного сустава на основе оригинальной метода выращивания профилированного сапфира. На первом этапе выращивалась из расплава заготовка в форме цилиндрической трубки с дном. Далее по специально разработанной технологии изготавливается конусное отверстие для сопряжения с металлической ножкой эндопротеза, а наружной 282 поверхности придается форма шара. Разработана методика тонкой шлифовки и дальнейшей полировки поверхности сапфирового шара. Изготовлены опытные образцы шаровой опоры из монокристаллического сапфира для испытаний прочностных и трибологических свойств в паре с чашкой из хирулена. Для лечения аневризм сосудов мозга интенсивно развивается методика блокирования аневризматической полости с помощью специальных спиралей, предназначенных для формирования тромба, который впоследствии замещается соединительным рубцом. Для предотвращения попадания спиралей в просвет здоровой артерии необходимо имплантировать стент, который выполняет функцию барьера. Для решения данной задачи разработана усовершенствованная конструкция саморасправляющегося плетеного эндопротеза с дополнительно вплетенными в его средней части нитями с целью уменьшения размера ячейки в области аневризмы. В результате на торцах стента ячейки имеют больший размер по сравнению с его средней частью. Такая конструкция уменьшит реакцию на имплантированный эндопротез, а уменьшение размера ячеек в его средней части предотвратит попадание тромбообразующих спиралей в просвет здоровой артерии. Из сверхупругой Ti-Ni проволоки диаметром 0,10 мм изготовлены прототипы эндопротезов диаметром 4 и 6 мм и длинной 40 мм новой конструкции. ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО ИМПРИНТИРОВАННЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ СОРБЕНТЫ ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОЙ СОРБЦИИ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ Е.Ф.Панарин 1), О.А.Писарев 1), А.Р.Грошикова1), И.В.Полякова1), А.П.Лещинская1), В.Н.Хирманов2) Институт высокомолекулярных соединений РАН, СанктПетербург; 2)Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова, Санкт-Петербург 1) 283 Одной из наиболее актуальных проблем современной медицины является рост сердечно-сосудистых заболеваний, обусловленный метаболическим синдромом. Гиперурикемия и подагра являются составляющими метаболического синдрома и представляют собой распространённые патологические процессы, предопределяющие риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и рост смертности. В результате выполнения проекта в 2009-2010 гг. с целью создания эфферентного метода лечения гиперурикемии и подагры разработаны методы синтеза и изучены свойства принципиально новых сшитых полимерных сорбентов, молекулярно импринтированных молекулами мочевой кислоты (МК). Селективность сорбции МК синтезированными сорбентами обусловлена способностью сетчатого полимера повторно «узнавать» и связывать молекулу МК. В результате выполнения проекта 2011 года разработаны методы синтеза оптимального полимерного плазмосорбента на основе диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ), импринтированного МК (МК-МИП-7-16), оптимизирован гранульный состав сорбентов и найдены оптимальные режимы селективной сорбции МК из плазмы крови больных гиперурикемией и подагрой. Показано, что межмолекулярное взаимодействие МК с МКМИП-7-16 носит полифункциональный характер, при этом МК проявляет свойства органического аниона, а также способна образовывать водородные связи с полимерным сорбентом. При анализе формы фронтальных выходных кривых плазмосорбции МК на МК-МИП-7-16 было установлено влияние скорости подвижной фазы на характер насыщения полимерных сорбентов уремическим токсином. Для значений приведенных скоростей протекания , 2 2 равных 5.2∙10 (сек-1) и 15∙10 (сек-1), кривые фронтальной сорбции симметричны, и их точки перегиба близки к середине фронта. При этом наблюдалось быстрое достижение равновесного насыщения колонки, после чего концентрация на выходе становилась равной исходной. Дальнейшее увеличение приводило к асимметризации выходных кривых и смещению точки перегиба в область малых объемов – в изученном интервале скоростей подвижной фазы происходил переход от регулярного к нерегулярному режиму фронтальной сорбции. Это было 284 использовано при определении оптимальных скоростей протекания плазмы крови при селективном извлечении из неё МК. Полученные в ходе выполнения проекта медицинские сорбционные материалы и использование оптимизированных параметров плазмосорбции позволили создать колонки для селективной сорбции МК, предназначенные для детоксикации организма человека путем экстракорпорального очищения плазмы крови сорбционным методом. В ходе выполнения проекта в 2011 году опубликовано четыре статьи, трое тезисов и получен патент РФ № 2415155 (зарегистрирован 27.03.2011) «Способ синтеза полимерного сорбента, молекулярно импринтированного мочевой кислотой». ПОЛИМЕРНЫЕ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ СВЕРХКРИТИЧЕСКИХ ФЛЮИДНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ, ДЛЯ ЗАМЕНЫ И РЕГЕНЕРАЦИИ БИОТКАНЕЙ В.К.Попов1), Е.Н.Антонов1), С.А.Бочкова1), Л.И.Кротова1), И.К.Свиридова2), Н.С.Сергеева2) 1) Учреждение Российской академии наук Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, г. Троицк, Московской области 2) МНИОИ им. П.А.Герцена, Москва Одним из основных критериев оптимизации физико-химических и биологических характеристик минерал-полимерных матриц, предназначенных для создания тканеинженерных конструкций (ТИК), наряду с минимальным уровнем цитотоксичности, высокой первичной клеточной адгезией, эффективностью поддержания пролиферации и дифференцировки клеток определенных типов, является корреляции скорости их ферментативной и/или гидролитической биодеградации либо биорезорбции со скоростью регенерации определенных типов ткани в месте имплантации. В рамках выполненной работы проведено комплексное изучение процессов биорезорбции полимерных матриксов из аморфных поли(D,L)-лактидов марок Purasorb PDL-02, PDL-04, PDL-07 и полилактогликолидов с соотношениями лактидов и 285 гликолидов 50:50 (марка PDLG50-02) и 75:25 марок PDLG75-02, PDLG75-04 и PDLG75-07 производства компании “Purac” (Голландия). Для определения молекулярной массы методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ) исследуемые образцы после их выдержки в фосфатном буфере в течение от 1 до 18 недель при температуре 37 оС помещались в стеклянную виалу объемом 5 мл и растворялись тетрагидрофураном, который также являлся и элюэнтом. Хроматограммы регистрировались при комнатной температуре и скорости потока элюэнта 1 мл/мин. После регистрации хроматограммы проводилось сглаживание шумов с помощью метода Савицкого-Голея, коррекция базовой линии и вычисление молекулярной массы исследуемого образца. На основе совокупного анализа изменений молекулярно-массового распределения использованных алифатических полиэфиров при их гидролитической биодеградации in vitro в фосфатном буферном растворе методом ГПХ, а также результатов оценки биосовместимости и определения скоростей биорезорбции экспериментальных образцов in vivo на модели подкожной имплантации крысам линии Wistar было показано, что как с точки зрения биосовместимости, так и оптимальных скоростей биорезорбции наиболее подходящим материалом для полимерной основы пористых матриксов ТИК, предназначенных для репаративного замещения костных дефектов, является полилактогликолид марки Purasorb PDLG75-07. Впервые методом микроскопии комбинационного рассеяния проведен анализ пространственного распределения биоактивных минеральных наполнителей (синтетических фосфатов кальция и мелкодисперсных натуральных кораллов) по объему полимерных матриксов. Он продемонстрировал высокую степень однородности структуры экспериментальных образцов пористых композитов, о полученных низкотемпературным (35-40 С) методом сверхкритической флюидной (СКФ) пластификации и последующего вспенивания алифатических полиэфиров в прессформах определенной геометрии. Результаты проведенных исследований позволили сделать выбор оптимальных (как с точки зрения биосовместимости и биоактивности, так и требуемых скоростей биорезорбции) материалов для изготовления минерал-полимерных ТИК, 286 содержащих синтетический нано-ГАП и мелодисперсные натуральные кораллы, а также мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, предназначенных для направленной регенерации костных тканей. ЛАЗЕРНЫЙ СИНТЕЗ ПОРИСТЫХ ТКАНЕВО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ БИОРЕЗИСТИВНЫХ КЕРАМОПЛАСТОВ И.В.Шишковский1), В.И.Щербаков1), С.Е.Волчков2), А.Н.Тороповский2), А.Е.Щербовских2), О.В.Тюмина2) Самарский филиал Учреждения Российской академии наук Физического института им. П.Н.Лебедева РАН, Самара; 2) Государственного бюджетное учреждение здравоохранения Самарской области «Клинический центр клеточных технологий» 1) В последнее время биорезорбируемые полимеры привлекают внимание в качестве основы для создания заменителей костной ткани (тканево-инженерных конструкций или scaffold) и систем медленного дозирования лекарственных препаратов (Drug Delivery Systems – DDS). Основным преимуществом данных полимерных материалов является их способность постепенно растворяться в физиологических жидкостях организма по мере формирования новой ткани или высвобождения содержащихся внутри полимерной матрицы лекарственных препаратов. Метод послойного селективного лазерного спекания (СЛС) обладает неоспоримыми преимуществами при создании scaffolds и DDS. Композиты – это многокомпонентные материалы, состоящие из полимерной, металлической, углеродной, керамической или другой основы (матрицы), армированной наполнителями из волокон, нитевидных кристаллов, микро- (нано-) дисперсных частиц и др. Если пористая структура инфильтруется живой тканью, она также может вести себя как композитный материал, но только если стык ткани и материала является достаточно прочным для передачи напряжений. Варьируя состав матрицы и наполнителя, их соотношение, ориентацию и внутреннюю структуру наполнителя, можно предсказывать и управлять требуемым набором свойств 287 изделий из таких материалов. В настоящем проекте было предложено создание методом СЛС scaffold из керамопластов, в которых в качестве полимерной матрицы был использован биоинертный поликарбонат или поэфирэфиркетон /PEEK/, а также биорезорбируемый – полилактид -/PLA/ плюс керамический наполнитель различной природы (Al2O3, ZrO2, гидроксиаппатит – ГАП), что значительно расширяет возможности регулирования свойств композиционных материалов. Нами за отчетный период: Показана возможность СЛС чистого ПЕЕК на длине волны 10.6 мкм и с микронаполнителями (титан, керамика – Al2O3, ZrO2 или ГАП) на длине волны 1.06 мкм; Определены оптимальные условия послойного лазерного спекания (мощность, скорость сканирования, размер пятна ЛИ) на установке КВАНТ-60 (длина волны 1.06 мкм) как отдельных монослоев, так и объемных изделий из биоинертного PEEK и биорезорбируемого PLA с указанными выше наполнителями в пропорциях 1:1, 2:1, что позволяет говорить о реальности создания тканево-инженерных 3D конструкций и систем доставки лекарств (scaffolds, bio-МЕМS – drug delivery systems) из этих материалов; Методами рентгеноструктурного анализа показано, что при СЛС не происходит существенного изменения в составе исходных порошковых смесей, что принципиально важно для их последующих медицинских приложений. Сканирующая электронная микроскопия подтверждает, что полимерная матрица ПЕЕК удерживает биокерамику (ГАП), не наблюдается их разрушение и сохраняет при этом достаточное количество пор. Синтезированные методом СЛС пористые 3D scaffolds из керамопластов были исследованы в ГБУЗ СО КЦКТ на мультипотентных мезенхимально-стромальных клетках (ММСК) человека. Проведено иммунофенотипирование, индукция дифференцировки в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях, оценка дифференцировки и пролиферативной активности. Определена токсичность путем сравнительного подсчета скорости их удвоения при морфометрировании клеток, а также оценкой способности клеток к миграции c использованием Time Lapse эксперимента. 288 По результатам выполнения опубликованы следующие работы: проекта в 2011 г. 1. Шишковский И.В. Основы селективного лазерного спекания метал - полимерных композиций с нановключениями: парадигма создания MEMS. // Перспективные материалы, 2011, N 6. (принята к публикации). 2. Шишковский И., Ю. Морозов, Л. Волова, С. Фокеев. Лазерный синтез и сравнительное тестирование трехмерного пористого матрикса из титана и никелида титана, как репозитария для стволовых клеток. // Порошковая металлургия, 2011. Vol. 50, 9/10 (принята к публикации) 3. Shishkovsky I.V., Volchkov S.E., Tumina O. V. MMSSC chemotaxis near porous surface of biocompatible NiTi scaffolds, synthesized via SLS method. // MRS 2011 Fall Meeting, Symposium KK: Biomaterials for Tissue Regeneration, Boston, MA, USA, Nov. 28 - Dec. 2. 2011. 4. Shishkovsky I.V. Functional design of porous drug delivery systems based on laser assisted manufactured nitinol. // MRS 2011 Fall Meeting, Symposium II: BioMEMS - Materials and Devices, Boston, MA, USA, Nov. 28 - Dec. 2. 2011. 5. I. V. Shishkovskii, I.A. Yadroitsev and I.Yu. Smurov . Selective laser sintering/melting of nitinol–hydroxyapatite composite for medical applications.// Powder Metallurgy and Metal Ceramics. 2011. Vol. 50, 5/6. p. 275-283. DOI: 10.1007/s11106-011-9329-6 6. Kuznetsov M.V., Shishkovsky I.V., Morozov Yu.G. 3D ceramic fabrication via selective laser sintering (SLS) and combined SLS—selfpropagating high temperature synthesis (SHS). // XI International Symposium on Self-Propagating High Temperature Synthesis, 5 - 9 September 2011, Anavyssos, Attica, Greece, p. 360. 7. Shishkovsky I.V., Kuznetsov M.V., Morozov Yu.G. Comparative microstructural analysis and histomorphological studies of tissue reactions to porous titanium and nitinol implants produced by SHS-SLS. // XI International Symposium on Self-Propagating High Temperature Synthesis, 5-9 September 2011, Anavyssos, Attica, Greece, p. 376. 8. Shishkovsky I.V. Chemical and physical vapor deposition methods for nanocoatings. Book chapter in: A. S. Hamdy and I. Tiginyanu (Eds.), "Nanocoatings and Ultra Thin-Films", 414 p Woodhead Publishing Limited, Abington Cambridge, UK, on - line ISBN 978-1-84569-812-6, pp. 57-77. 9. Шишковский И.В. Взаимосвязь лазерного дизайна – микроструктуры – свойств пористых 3D матриксов для клеточной инженерии и систем доставки лекарств. // Известия Самарского научного центра РАН, T .13. 2011. N 4. c .45-53. 289 10. Shishkovsky I.V., Morozov. Y.G. Laser assisted fabrication of porous polymer MEMS with nano structured additives. // MRS Proceedings, Vol. 1312, 2011, p. 1-6. DOI: 10.1557/opl.2011.122 290 10. Приборы КОМПЛЕКС ЛУЧЕВЫХ УСТАНОВОК ДЛЯ РАДИОТЕРАПИИ НОВООБРАЗОВАНИЙ МОЗГА С ИСПОЛЬ3ОВАНИЕМ ПУЧКОВ ПРОТОНОВ И ФОТОНОВ С.В.Акулиничев, В.Н.Асеев,В.Н.Васильев, В.И.Ильин, Д.А.Коконцев, Д.Б.Лазебник, В.М.Скоркин Институт ядерных исследований РАН, Москва В отчетном году исследования по развитию комплекса установок для радиотерапии новообразований мозга были направлены на получение и исследование протонных терапевтических пучков и на развитие технологии облучения очагов в области мозга с использованием тормозных фотонов. В направлении развития протонной терапии новообразований мозга были получены следующие основные результаты. Для компьютерной подготовки процесса зготовления индивидуальных формирующих устройств, расчета параметров пучков и контроля лечения новообразований была создана новая оригинальная программа по методу Монте-Карло, позволяющая рассчитывать прохождение протонов не только в среде (формирующие устройства и тело пациента), но и в элементах магнитной оптики. Была рассчитана и изготовлена система двойного рассеяния пучков для получения однородных пучков протонов в диапазонах их энергии, наиболее соответствующих лечению новообразований мозга: 160 и 209 МэВ. Данная система позволяет получать в изоцентре однородные пучки протонов диаметром до 9 см, соответствующие медицинским требованиям по основным параметрам. В результате был подготовлен и проведен тестовый сеанс с протонами энергии 120, 160 и 209 МэВ. Измерение и последующее изучение параметров пучков показало, что впервые на протонной лучевой установке ИЯИ РАН были получены терапевтические пучки, удовлетворяющие ряду основных требований терапии новообразований мозга. Более того, с учетом пространственно-временных и энергетических характеристик пучков можно утверждать, что полученные пучки протонов имеют наилучшие в России параметры с точки зрения лучевой терапии новообразований мозга: энергия протонов позволяет совместить 291 пик Брэгга с любой точкой в области головы, а частота и длительность макроимпульсов протонов позволяют вести прямой мониторинг пучка и подведенной дозы. Дальнейшая подготовка к проведению клинических испытаний будет связана с получением трехмерных распределений дозы, выделяемой протонами в мишени. Для этого рассчитывается и готовится комплекс модулирующих устройств (гребенчатых фильтров и т.д.), позволяющих сформировать индивидуальные дозовые распределения. Тестовый сеанс по проверке трехмерных дозовых распределений намечен на декабрь текущего года. Кроме того, в отчетном году продолжалась работа по развитию и внедрению технологии конвенциальной лучевой терапии новообразований мозга с использованием тормозных фотонов. Проведенная в ИЯИ РАН доработка ускорителя электронов СЛ-75, которая заключалась в создании систем фиксации пациентов и индивидуальной коллимации пучков вторичных фотонов, позволила с высоким качеством облучать новообразования мозга. В частности, в отчетном году ряду пациентов было проведено облучение очагов, включая метастазы, в области мозга. Во всех случаях после курса лучевой терапии наблюдалась положительная динамика течения болезни. ПОВЫШЕНИЕ ПОМЕХОУСТОЙЧИВОСТИ СЛУХОВОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ВОСПРИЯТИИ ДВИЖЕНИЯ АКУСТИЧЕСКОГО ИСТОЧНИКА С ПОМОЩЬЮ НОВОГО СПОСОБА КОДИРОВАНИЯ ЗВУКА ДЛЯ ЦЕЛЕЙ КОХЛЕАРНОГО ПРОТЕЗИРОВАНИЯ Н.И.Никитин, Я.А.Альтман , Н.Н.Бехтерев Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург Одной из серьезных проблем восстановления пространственного слуха у глухих, пользующихся кохлеарными протезами, является низкая помехоустойчивость слуховой системы в условиях электрического раздражения слухового нерва. Особенно сильны проявления понижения слуховой помехоустойчивости при восприятии таких важных для жизнедеятельности сигналов, как сигналы, исходящие от движущихся акустических источников (данные собственного пилотного исследования). В этой связи 292 актуален поиск новых перспективных методов преобразования звука в электростимулирующий эквивалент, позволяющих если и не полностью реабилитировать это важное свойство слуховой системы, то, по крайней мере, существенно его улучшить. Целью данного исследования, проведенного на глухих животных с регистрацией вызванных потенциалов слуховой коры мозга, являлось изучение возможностей улучшения слуховой помехоустойчивости при маскировке движущегося во фронтальном части пространства источника звука (полезный сигнал) в условиях замены традиционно используемой в практике слуховой реабилитации электрической стимуляции (ЭСт) слухового нерва на разрабатываемый нами способ (ЭСр). В качестве референтных использовались данные, полученные на интактных улитках внутреннего уха при акустической стимуляции (АС). Установлено, что в условиях маскировки полезного сигнала предшествующим сигналом-помехой (равной интенсивности и отставленного на 100 мс) в диапазоне скоростей движения 20–680 град/с и околопорогой интенсивности преобразованной АС (в среднем 1.3 дБ над порогом реакции) применение ЭСр вместо ЭСт не изменяет уровня помехоустойчивости. При смене медиолатерального направления движения на латеромедиальное использование ЭСр вместо ЭСт не приводило к изменению эффективности демаскировки полезного сигнала под влиянием сигнала-помехи. При ЭСр, и ЭСт, как и при АС, обнаруживалась хотя и слабовыраженная, но достоверно бóльшая чувствительность к маскированному латеромедиальному направлению движения и, как следствие, повышение верхней границы диапазона воспринимаемых скоростей движения (с 480 до 680 град./с) в этом направлении. Однако выявленное на околопороговых интенсивностях ЭСр, ЭСт и АС равенство уровней слуховой помехоустойчивости при восприятии движения источника звука нарушалось для более громких сигналов. При незначительном повышении уровня интенсивности обоих сигналов при ЭСт (в среднем до 2.4 дБ) эффективность полезного сигнала снижалась изза нарушения действия механизмов помехоустойчивости. Если же вместо ЭСт использовали ЭСр, уровень помехоустойчивости при оценке характеристик реакции на движение источника звука в условиях сохранения параметров стимуляции оставался тем же, что и при АС, в пределах изменения интенсивности раздражения в 293 среднем до 48.7 дБ и лишь при дальнейшем ее повышении значительно ухудшался. Результаты исследования свидетельствуют о неоспоримом преимуществе ЭСр над ЭСт в обеспечении необходимого запаса слуховой помехоустойчивости при восприятии сигналов движущегося источника звука если и не во всем, то в достаточно широком динамическом диапазоне кодируемого звукового раздражения. РАЗРАБОТКА ОПТИКО-ЭЛЕКТРОННОЙ СИСТЕМЫ АНАЛИЗА БИНОКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ФОРМИРОВАНИЯ ЗРИТЕЛЬНОГО ОБРАЗА В.Н.Гридин1), М.И.Труфанов1) Учреждение Российской академии наук Центр информационных технологий в проектировании (ЦИТП) РАН, Одинцово 1) Одной из сложных задач в области сенсорных систем человека является анализ механизма взаимодействия нервного центра и зрительного анализатора, что в значительной степени обусловлено отсутствием современных методов и средств сопоставления параметров процессов, происходящих в зрительном анализаторе, с результатами анализа в центральных структурах коры головного мозга. Для решения задачи предлагается использовать оптико-электронную систему, состоящую из видеокамеры, аналоговых усилиителей с аналого-цифровыми преобразователями и персонального компьютера, обеспечивающего измерение параметров движения глаз в процессе наблюдения человеком предъявляемых ему объектов одновременно с измерением электрической активности соответствующих проекционных зон коры головного мозга. Анализ производят следующим образом. На размещенном перед лицом человека дисплее компьютера формируют тестовые объекты – геометрические фигуры. Видеокамеру настраивают так, чтобы изображение глаза занимало практически весь кадр. Испытуемого в различные моменты времени просят наблюдать тестовые объекты или закрывать глаза. Видеокамера формирует изображение лица и передает его в компьютер. На изображении производится определение состояния глаза – «открыт/закрыт» и двумерных координат центра зрачка, в случае если глаз открыт. Определяемые 294 для каждого k-го кадра изображения координаты зрачка и признак «закрытый/открытый глаз» сохраняются в массиве E. Анализ массива E с запаздыванием относительно реального времени на время t поступления нескольких кадров обеспечивает определение траектории движения зрачка, что позволяет исследовать механизм анализа (рассматривания) тестового объекта зрительной системой. Одновременно с процессом отслеживания движений глаза осуществляется регистрация и оценка электрической активности участков коры головного мозга, отвечающих за процесс анализа изображения. Для этого на входы аналоговых усилителей подаются сигналы, снимаемые с затылочной и теменной проекционных зон больших полушарий мозга. Далее полученные сигналы после аналогоцифрового преобразования поступают в компьютер. После накопления необходимого количества отсчетов выполняется быстрое преобразование Фурье, в результате которого формируется спектр сигнала. Анализ спектра сигнала позволяет выявить изменения в электрической активности мозга, определить амплитуду и частоту сигнала и сопоставить произошедшие изменения с процессом наблюдения тестовых объектов и движением зрачка. Таким образом, синхронное отслеживание движений зрачка и параллельная оценка изменений в электрической активности коры головного мозга с помощью предлагаемой оптико-электронной системы позволяют обеспечить объективный анализ взаимодействия зрительный анализатор – нервный центр. Наряду с этим, оптикоэлектронная система может быть применена в повседневной практике врача-офтальмолога для диагностики отклонений зрительной системы человека. ИССЛЕДОВАНИЕ, РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ МЕДУЧРЕЖДЕНИЙ РАН МЕТОДОВ И ПРИБОРОВ ГЛУБИННОЙ ТЕРМОГРАФИИ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА Ю.В.Гуляев1), А.А.Аносов1), А.С.Казанский1), А.Д.Мансфельд2), П.В.Субочев2) Институт радиотехники и электроники им. В.А.Котельникова РАН, Москва; 2) Институт прикладной физики РАН, Москва 1) Ряд заболеваний, например воспалительные процессы, сопровождается локальным нагревом тканей организма человека. 295 Прогрев тканей, например гипертермия, используется в медицине, как один из способов лечения. И в том, и в другом случае важна информация о динамике изменений глубинной температуры организма. Такую информацию можно получить с помощью акустотермографии. Это безопасный неинвазивный метод контроля внутренней температуры, основанный на измерении собственного теплового акустического излучения тела человека. Совместно с врачами Центральной клинической больницы РАН отрабатывалась и совершенствовалась методика акустотермометрического контроля глубинной температуры тела человека. Использовали стандартный многоканальный акустотермограф, а также одноканальный, но мультиспектральный акустотермометр. Испытуемые держали кисть руки в воде, температура которой менялась. Воду подогревали, доводили ее температуру до 37 0С и продолжали нагрев вплоть до 40 0С. За разогревом кисти следили по акустотермометрическим данным, при этом восстанавливали профиль внутренней температуры от ладони к тыльной стороне. Использовали два датчика (один со стороны ладони, другой с тыльной стороны) или один многочастотный датчик. Сначала измеряемая акустояркостная (т.е. интегральная) температура кисти и восстанавливаемая температура в глубине кисти повышались (до 37 0С) и при этом были выше температуры воды. Потом и акустояркостная, и восстановленная температура совпадали с температурой воды (при 37 0С). В дальнейшем акустояркостная температура стала ниже температуры воды, а глубинная температура остановилась на 37 0С. Когда испытуемые держали руку в холодной воде (около 14 0С), то и акустояркостная, и восстанавливаемая температура медленно снижались (измерения продолжались около 15 минут). Полученные результаты хорошо объясняются изменением кровотока в кисти. Отметим, что при температуре воды выше 37 0С кровь начинает охлаждать руку. При восстановлении распределения глубинной температуры использовали априорную информацию о том, что искомое распределение подчиняется уравнению теплопроводности с учетом кровотока. Этот подход позволил существенно повысить точность восстановления. Применение мультичастотного зондирования крайне важно для медицинских приложений. Использование всего лишь одного датчика, с одной стороны, упрощает процедуру контроля. С другой 296 стороны, сразу получают несколько независимых результатов, что позволяет восстанавливать не только среднюю температуру, но распределение внутренней температуры. Совместно с измерениями на испытуемых, были проведены модельные эксперименты по восстановлению пространственного распределения внутренней температуры объекта. При восстановлении главная роль отводилась выбору оптимальных алгоритмов учета уравнения теплопроводности. Совместно в модельных экспериментах проводили независимый контроль внутренней температуры, что позволяло измерить погрешность восстановления. Было показано, что использование уравнения теплопроводности повышает точность восстановления и делает ее допустимой для медицинских приложений. ТЕЛЕМЕТРИЧЕСКИЙ КАПНОГРАФ ДЛЯ СИСТЕМ МУЛЬТИГАЗОВОГО МОНИТОРИНГА ДЫХАНИЯ В АНЕСТЕЗИОЛОГИИ И ИНТЕНСИВНОЙ ТЕРАПИИ Ю.Я.Кисляков1), Л.П.Кислякова1), И.А.Полукаров2), А.Ю.Зайцева1) Институт аналитического приборостроения РАН, СанктПетербург; 2) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 1) Разработан высокоточный, быстродействующий капнограф с беспроводной системой связи для непрерывного контроля в ходе каждого дыхательного цикла парциального давления СО2 (рСО2) в потоке вдыхаемых и выдыхаемых искусственных газовых смесей при мониторинге газообменной функции легких в анестезиологии и интенсивной терапии. Капнограф конструктивно состоит из двух модулей: стационарного, встроенного в систему подачи-отведения дыхательных газовых смесей, и мобильного, принимающего и обрабатывающего информацию на расстоянии. Стационарный модуль содержит: термостатируемую проточную газовую измерительную ячейку; сенсорный блок, включающий датчики рСО2, атмосферного давления, объемной скорости газового потока и температуры дыхательной газовой смеси; электронный преобразователь выходных сигналов сенсоров; микропроцессорный блок управления; малогабаритный аккумулятор; блок беспроводной 297 передачи информации на основе микропроцессорного миниатюрного передатчика. Мобильный модуль содержит миниатюрное беспроводное микропроцессорное приемное устройство, связанное через USB порт с внешним компьютерным блоком (notebook) анализа результатов измерений и управления работой стационарного модуля капнографа. Измерение рСО2 в воздухе и искусственных газовых смесях, содержащих наркотические газы, осуществляется с высокой точностью и быстродействием (допустимая погрешность измерения -1-2 % в диапазоне 0–120 мм рт. ст., быстродействие – 0.01 сек) благодаря применению метода молекулярной корреляционной ИКспектроскопии на основе использования уникальных отечественных (ФТИ РАН) полупроводниковых лазерных технологий – иммерсионных свето- и фотодиодов с узкой диаграммой направленности излучения на длине волны 4.25 мкм (где СО2 имеет наибольшую интенсивность поглощения, а у паров Н2О и большинства используемых наркотических газов оно отсутствует). Предусмотрено встраивание в сенсорный блок узкополосных оптических фильтров для наркотических газов, поглощающих излучение вблизи этой длины волны. Разработанная конструкция термостатируемой измерительной проточной ячейки устраняет проблемы, связанные с конденсацией влаги, резко снижает габариты, вес, себестоимость и расходы на эксплуатацию капнографа. Для беспроводной связи стационарного и мобильного моделей разработан радиомодем, включающий недорогой трансивер (приемо-передатчик) и устройство сопряжения. Он с помощью микроконтроллеров управляют процессом передачи и приема данных – устанавливает связь на расстоянии до 20 м, выбирает канал, на котором получается максимальная скорость обмена, и преобразует поток данных в пригодный для передачи по интерфейсу USB. Эти устройства позволяют получить скорость передачи информации до 500 Кбод/с. Для лабораторных условий принятая максимальная скорость передачи является оптимальной. Созданный капнограф может быть использован для неинвазивной диагностики энергетического и пластического метаболизма человека, сельскохозяйственных животных и растений, экспресс-контроля работоспособности человека, качества пищевых продуктов и режима питания человека, продуктивности сельскохозяйственных 298 животных, мониторинга среды жизнедеятельности. В таких приборах крайне нуждаются научно-исследовательские организации биологического профиля, клинические, реабилитационные, реанимационные отделения, кабинеты функциональной диагностики медицинских учреждений, спортивные, военные и сельскохозяйственные организации. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ НИЗКОЧАСТОТНОЙ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИИ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КАК ВАРИАНТА РЕАБИЛИТАЦИИ КАРДИОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ НА СТАЦИОНАРНОМ ЭТАПЕ ЛЕЧЕНИЯ И.Б.Козловская 1), М.Г.Полтавская 2), Ю.А.Коряк 1), А.Л.Сыркин 2), И.В.Саенко 1), А.В.Свет 2), А.В.Чаплыгин 2) Учреждение Российской академии наук ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН 2) ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова 1) В настоящее время наряду с медикаментозной терапией сердечно-сосудистых заболеваний все большее значение придается программам кардиореабилитации, основу которых составляют дозированные физические нагрузки. Однако для некоторых категорий больных сколько-нибудь интенсивные нагрузки, сопровождающиеся значительным напряжением центрально-циркуляторных механизмов, оказываются противопоказанными. Кроме того, их выполнение не всегда возможно у лиц с неврологическими или ортопедическими проблемами, многих пожилых пациентов. Высокоэффективным аналогом физических тренировок в данном случае может стать метод низкочастотной электростимуляции. В последние годы опубликованы результаты ряда исследований, показавших, что электромиостимуляция не уступает традиционным физиическим тренировкам по влиянию на основные показатели толерантности к нагрузке. Цель работы: клинические испытания безопасности, переносимости и эффективности коротких курсов низкочастотной электростимуляции мышц как варианта реабилитации кардиологических больных на стационарном этапе лечения. Материалы и методы: 22 больным (67,1±11,3 лет) с различной 299 сердечно-сосудистой патологией (ИБС, n=15, гипертоническая болезнь, n=12, нарушения ритма сердца, n=15, сердечная недостаточность, n=15) проведены короткие курсы низкочастотной электромиостимуляции (ЭМС) нижних конечностей с помощью электромиостимулятора «Стимул-01», разработанного в ГНЦ РФ – ИМБП РАМН. Продолжительность курсов составляла от 6 до 11 процедур, продолжительность стимуляции – до 40–60 мин, амплитуда стимулов увеличивалась по мере адаптации пациентов и составляла в среднем от 11,1±1,7 до 13,0±1,6 В для разных групп мышц. Результаты: данный режим стимуляции являлся комфортным для пациентов, хорошо переносился, не сопровождался местными или системными неблагоприятными побочными явлениями. ЭМС не сопровождалась существенными изменениями ЧСС и АД. ЭМС не приводила к усугублению сердечно-сосудистой патологии и сдвигам лабораторно-инструментальных показателей. У пациентов с наиболее низкой исходной толерантностью к нагрузке и малоподвижных больных возрастала двигательная активность, повышалась толерантность к нагрузке (по субъективным шкалам, данным теста с 6-минутной ходьбой, нагрузочных проб). Выводы: низкочастотная ЭМС с помощью электромиостимулятора «Стимул-01» безопасна, хорошо переносима и комфортна для широкого круга госпитализированных кардиологических больных. Низкочастотная ЭМС может явиться ценным дополнением в лечении и реабилитации кардиологических пациентов. КОМПАКТНЫЙ ОПТИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ДНКБИОДАТЧИКОВ И ДИХРОМЕТРА И ОЦЕНКА С ЕГО ПОМОЩЬЮ ВЛИЯНИЯ НАНОЧАСТИЦ НА СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ 2) О.Н.Компанец , Ю.М.Евдокимов1), С.Г.Скуридин1), В.М.Гусев2), М.А.Павлов2), Д.П.Чулков2) Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта (ИМБ) РАН, Москва; 2)Институт спектроскопии РАН (ИСАН), Троицк 1) Для проверки предположения о сходстве биологического действия наночастиц золота (Au) на пространственно организованные структуры ДНК с действием молекул, обладающих мутагенной 300 активностью [1, 2], проведено исследование изменений оптического сигнала кругового дихроизма (КД) частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) ДНК как модельной системы в результате их взаимодействия с наночастицами Au. Предварительно в ИСАН была проведена доработка и оптимизация конструкции, электронных узлов и ПО оптического биосенсора на основе дихрометра с использованием ХЖКД ДНК в качестве биодатчиков, что позволило продвинуть рабочий диапазон биосенсора в УФ область до 190 нм и повысить его надежность и чувствительность. Эксперимент показал, что обработка частиц ХЖКД ДНК наночастицами Au (диаметр 2÷3 нм, концентрация ~7,2 ∙ 1014 частиц/мл) приводит к резкому уменьшению характерной для частиц ХЖКД оптической активности, проявляемой в виде аномальной отрицательной полосы в спектре КД в области 270 нм. Анализ возможных причин эффекта показал, что действие наночастиц Au сопровождается не только уменьшением до ~0,3 величины "параметра порядка" молекул ДНК в квазинематических слоях частиц ХЖКД (в исходной структуре она близка к 0,8), но и уменьшением, вплоть до полного исчезновения, спиральной закрутки слоев в структуре частиц [3]. Проверка характера влияния наночастиц Au на свойства частиц ХЖКД ДНК была проведена методом "внешнего" хромофора с использованием красителя SG, интеркалирующего между парами азотистых оснований ДНК с проявлением дополнительной аномальной полосы в спектре КД в видимой области спектра (500 нм). Действие наночастиц Au на частицы ХЖКД ДНК, обработанные красителем SG, также вызывает быстрое (примерно за 90 с) уменьшение амплитуд полос, расположенных в области поглощения хромофоров как ДНК, так и SG [3]. Исходя из модели линейного расположения наночастиц Аu между молекулами ДНК в квазинематических слоях ХЖКД, можно предположить, что наночастицы Au размером около 2 нм, внедряясь между молекулами ДНК, образуют наноцепочки (линейные кластеры) с длиной, доходящей до ~60 нм. Формирование нанокластеров Аu индуцирует уменьшение "параметра порядка" молекул ДНК в этих слоях, в результате чего спиральная закрутка пространственной структуры частиц ХЖКД уже не сохраняется. 301 Поскольку частицы ХЖКД ДНК отражают некоторые оптические свойства хромосом простейших [2], наблюдаемое нарушение пространственно упорядоченной структуры частиц ХЖКД может быть одной из причин генотоксического эффекта наночастиц золота. 1. Скуридин С.Г., Дубинская В.А., Рудой В.М., Дементьева О.В., Захидов С.Т., Маршак Т.Л., Кузьмин В.А., Попенко В.И., Евдокимов Ю.М. Действие наночастиц золота на упаковку молекул ДНК в модельных системах. ДАН, 432(6), 838-841 (2010). 2. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Семенов С.В., Скуридин С.Г. Жидкокристаллические дисперсии и наноконструкции ДНК. Ред. Евдокимов Ю.М. М.: Радиотехника, 296 с. (2008). 3. С.Г.Скуридин, В.А.Дубинская, Э.В.Штыкова, В.В.Волков, В.М.Рудой, О.В.Дементьева, В.А.Кузьмин, Е.С.Лисицына, С.Т.Захидов, И.А.Зеленина, Ю.М.Евдокимов. Фиксация наночастиц золота в структуре квазинематических слоев, образованных молекулами ДНК. Биол. мембраны, 28 (3), с. 191-198 (2011). МНОГОВОЛНОВАЯ МЕДИЦИНСКАЯ УСТАНОВКА НА ТВЕРДОТЕЛЬНОМ С ДИОДНОЙ НАКАЧКОЙ ЛАЗЕРЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ МИКРОБНОЙ ПРИРОДЫ Г.П.Кузьмин1, О.В.Ловачева2, А.А.Сироткин1 Институт общей физики им. А.М.Прохорова РАН, Москва Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, Москва 1 2 В Институте общей физики им. А.М.Прохорова РАН разработана лазерная медицинская установка «МАРИЯ» на основе криптон – фторного эксимерного лазера с длиной волны излучения 248 нм для лечения деструктивных форм туберкулеза легких [1]. Методика лечения с использованием данной установки разработана в Центральном НИИ туберкулеза РАМН. В ходе клинических испытаний была доказана высокая эффективность методики при эндокавитарном лечении деструктивных форм туберкулеза. Однако лазерная медицинская установка «МАРИЯ» не получила должного распространения в медицинской практике из-за высокой стоимости. К ее недостаткам следует отнести также большие габариты, вес и необходимость работы с агрессивными газовыми смесями, которые 302 требуют специальных мер безопасности и периодического восполнения. Исходя из вышесказанного была создана многоволновая лазерная медицинская установка «ЛИВАДИЯ», пригодная как для бактерицидного, так и для терапевтического воздействия на пораженные участки организма [2]. Это установка на основе твердотельного лазера с диодной накачкой с преобразованием основной длины волны излучения 1.064 мкм во вторую гармонику 0.532 мкм и четвертую гармонику 0.266 мкм. Терапевтический эффект при использовании установки достигается за счет функции многоволнового излучения в ультрафиолетовом, видимом и инфракрасном диапазонах длин волн. При этом имеется возможность использования как отдельных длин волн, так и их комбинации, что позволяет выбирать наиболее оптимальный режим облучения для каждого конкретного заболевания. Комбинированное воздействие излучения может использоваться для эндокавитарного лечения деструктивных форм туберкулеза легких. Альтернативной областью использования является лечение гнойно-воспалительных процессов мягких тканей: комбинированное воздействие излучения на очаг гнойновоспалительного процесса в мягких тканях вызывает подавление роста патогенной микрофлоры и одновременную стимуляцию репаративных процессов тканей, что актуально в гинекологии, отоларингологии, терапии и особенно в гнойной хирургии. В Центральном НИИ туберкулеза РАМН проведены клинические испытания установки «ЛИВАДИЯ» при лечении больных туберкулезом бронхов и неспецифическим эндобронхитом с использованием эндобронхиального облучения. Показано, что ультрафиолетовое облучение на длине волны 266 нм слизистой бронхов при различных видах воспаления улучшает регенеративные процессы в тканях бронхов, что приводит к сокращению сроков лечения. [1] V.G.Dobkin, G.P.Kuzmin, O.V.Lovacheva and Eximer laser “Maria” in treatment lung and bronchia tuberculosis. International conference ALT-03, UK, 2003, pp. 19-23. [2] G.P.Kuzmin, A.G.Kuzmina, O.V.Lovachova, A.A.Sirotkin. Multiwave medical device on the diode pumped solid state laser for the microbe nature disease treatment. 19th Internat. Conference on Advanced Laser Technologies – ALT-11, Golden Sands, Bulgaria. 3-8 September 2011, pp.33-34. 303 ПОРТАТИВНЫЕ ПРИБОРЫ ДЛЯ ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОГО КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР И ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ТКАНИ Л.П.Межов-Деглин1) , В.Б.Ефимов1), А.В.Лохов1), М.К.Макова1), Л.В.Абдурахимов1) , З.В.Калмыкова2), В.В.Шафранов3), Л.В.Андрианова4) Институт физики твердого тела РАН, Черноголовка 2) Городская клиническая больница № 60, Москва 3) РГМУ, Москва 4) Больница с поликлиникой НЦЧ РАН, Черноголовка 1) В ИФТТ РАН совместно с сотрудниками ряда медицинских учреждений Москвы и Московской обл. проводятся исследования, в цели которых входят разработка криогенной аппаратуры для медицины, макетные испытания опытных образцов приборов и последующее внедрение новых комбинированных технологий лечения в практику медицинских учреждений России, т.е. развитие приборной базы инновационной технологии лечения, включающей, в частности, комбинированное электромагнитное плюс криовоздействие, что особенно важно для лечения детей и людей старших возрастных групп. Результаты работы коллектива соавторов в рамках данного проекта в 2011 г. таковы. 1. Проведены модельные испытания работы контактных криодеструкторов двух типов в желатиновом геле и на мышечной ткани “in vitro”: а) деструктор с металлическим сменным активным наконечником, охлаждаемым жидким азотом, который хранится в ручке-резервуаре деструктора, и б) контактных криоаппликаторов, цельнометаллический активный наконечник которых охлаждают во внешнем сосуде с жидким азотом непосредственно перед применением. Результаты изучения совместного СВЧ- плюс криовоздействия на биологическую ткань с применением этих деструкторов обсуждаются в статье, принятой к публикации в «Вестнике РАЕН», и были представлены в устном докладе одного из участников проекта на Международной конференции по криогенной медицине в Японии в октябре 2011 г. 2. Усовершенствована конструкция малогабаритного азотного криораспылителя. Выходящая из сопла распылителя узкая 304 парожидкостная струя, температура которой близка к -180 0С, используется для быстрого бесконтактного охлаждения обрабатываемого участка биологической ткани. Распылители могут быть использованы как в криохиругии – для целенаправленного замораживания и деструкции локальных очагов, расположенных на поверхности или в объеме организма (для локализации струи применяются специальные прижимные тубусы), так и в терапии – например, в косметологии, в ожоговой терапии, и т.п., в частности для обработки больших площадей кожи пациента. Результаты применения этой методики были представлены во втором докладе российских участников на Международной конференции по криогенной медицине в Японии в октябре 2011 г. 3. Впервые экспериментально проверена возможность изготов-ления прозрачного активного наконечника криодеструкторов из сапфира со светодиодом внутри наконечника, что открывает возможности совмещения ИК- или лазерного- и криовоздействия в одном приборе. Подготовлена документация, необходимая для патентования новых разработок. ОСОБЕННОСТИ ЧАСТОТНО-ВРЕМЕННОЙ СТРУКТУРЫ ЭЭГ У ПАЦИЕНТОВ НА РАННИХ СТАДИЯХ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА Ю.В.Обухов1), М.С.Королев1), А.В.Карабанов2), Е.Ю.Федотова2), В.В.Гнездицкий2), А.В.Габова3), Г.Д.Кузнецова3),С.Н.Иллариошкин2) Институт радиотехники и электроники им. В.А.Котельникова, РАН, Москва; 2) Научный центр неврологии РАМН, Москва 3) Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН 1) Была исследована частотно-временная структура ЭЭГ у 21 пациента с дрожательно-ригидной формой болезни Паркинсона (БП) на ранней стадии заболевания (1-я стадия по шкале Хен-Яр). Разработан количественный метод оценки вейвлет спектрограммы ЭЭГ. У пациентов на 1-й стадии БП по сравнению со здоровыми испытуемыми наблюдалась значительная дезорганизация распределения локальных максимумов вейвлет спектрограммы во времени и увеличение средней частоты доминирующего ритма ЭЭГ. 305 В работе представлены результаты анализа фоновой ЭЭГ, записанные от затылочной, теменной и центральной областей коры правого и левого полушария мозга. Для данного исследования ЭЭГ были специально разработаны программы, позволявшие количественно оценивать данные, полученные в результате вейвлет анализа. Вейвлет спектрограмма ЭЭГ состоит из серий локальных максимумов, отражающих изменения амплитуды спектральных коэффициентов в различных частотных диапазонах. Задача поиска экстремумов вейвлет преобразования на плоскости частота–время состоит из двух этапов. На 1-м этапе в проекции вейвлет спектрограммы на плоскость – частота–амплитуда разделяются диапазоны частот существования хребтов вейвлет спектрограмм. На 2-м этапе в каждом из выделенных диапазонов частот определяются локальные максимумы в проекции спектрограммы на плоскость время–амплитуда. Далее определялись координаты локальных максимумов вейвлет спектрограммы на плоскости частота – время и строились точечные диаграммы положения локальных экстремумов во всех диапазонах частот. Далее в каждой полосе частот 0,1 Гц суммируются амплитуды локальных максимумов на всем временном интервале и строятся их гистограммы от частоты. Для анализа частотновременной структуры более длительных (минутных) отрезков ЭЭГ кроме точечных диаграмм доминирующего ритма строились также динамические гистограммы с окном 16 с. В данной работе признаки дезорганизации электрической активности мозга были обнаружены также на ранней стадии БП. Графическое представление распределения локальных максимумов разной частоты во времени в виде точечных диаграмм оказалось удачным для демонстрации и количественной оценки нарушений частотно-временной организации ЭЭГ. Диапазон распределения основной массы локальных максимумов вейвлет спектрограммы ЭЭГ пациентов оказался значительно шире, чем в норме. У всех обследованных нами молодых пациентов и у 12 из 16 пожилых пациентов на 1-й стадии болезни Паркинсона было обнаружено достоверное учащение доминирующей активности ЭЭГ. Т.е. эти изменения имели противоположное направление по сравнению с изменениями на более поздних стадиях заболевания. Этот неожиданный факт, несомненно, требует особого внимания. Повышение или, напротив, снижение частоты альфа диапазона ЭЭГ может 306 свидетельствовать о нейрофизиологических различиях рассматриваемых процессов. Прогрессирующее снижение частоты доминирующего ритма на поздних стадиях БП рассматривается большинством авторов как свидетельство нарастания нейродегенеративных изменений в мозге. И тогда возникает предположение, что обнаруженное учащение ЭЭГ на ранней стадии БП может отражать компенсаторные процессы, которые происходят на доклинической стадии БП и еще проявляются на самых ранних клинических стадиях. РАЗРАБОТКА ДАТЧИКА ОДНОРОДНОСТИ ОСНОВНОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ ТРАВМАТОЛОГИЧЕСКОГО ТОМОГРАФА К.М.Салихов, Я.В.Фаттахов, А.Р.Фахрутдинов, В.Н.Анашкин, В.А.Шагалов, М.К.Галялтдинов, К.С.Сайкин, Н.А.Крылатых, Д.Д.Габидуллин, Н.М.Гафиятуллин Учреждение РАН Казанский физико-технический институт им. Е.К.Завойского Казанского научного центра РАН, Казань Создание медицинских ЯМР-томографов сопряжено с целым рядом технических проблем. В частности, требуется магнитная система, создающая поле высокой однородности (~10-5) в заявленном объеме. Но после монтажа основного магнита можно рассчитывать на неоднородность не лучше ~10-3, ввиду различных неточностей сборки магнита, влияния стальных конструкций, окружающих магнит, и др. Улучшение однородности возможно с помощью тонкой юстировки магнита, а также путем формированием полей, компенсирующих неоднородность. Одним из важнейших этапов процесса настройки однородности является этап измерения объёмной карты поля. Контроль однородности основного магнитного поля томографа может осуществляться с помощью датчика, разработанного в лаборатории ММФ КФТИ и, выполненного в виде жёстко закреплённых точечных контуров, расположенных на поверхности объёма однородности. Этот комплекс рассчитан на измерение однородности поля напряженностью 0.4 Тл в сфере диаметром 150 мм в зазоре постоянного магнита. Исходя из небольших габаритов конструкции, необходимо ввести ограничение числа измерительных контуров на рабочей 307 сфере датчика. С целью подбора оптимальной конфигурации расположения контуров на сфере проведено моделирование нескольких возможных конфигураций датчика. Для каждой конфигурации произведен анализ качества отображения сферических гармоник на сфере. Критерием качества являются коэффициенты отображения заданных гармоник датчиком. При конструировании датчика также возникает проблема развязки отдельных контуров из-за их близкого расположения друг к другу. Эта проблема решена двумя способами: 1) установкой электромагнитных экранов между близко расположенными катушками, 2) ортогональным расположением катушек в случаях, когда установка экранов невозможна. Дело в том, что нельзя заэкранировать контур по всем направлениям – нужно оставить «прозрачность» по направлению возбуждающего РЧ-поля. Кроме того, нельзя устанавливать экраны слишком близко к катушке, поскольку это приводит к потере добротности контура и, как следствие, к потере сигнала. Другая техническая проблема связана с сопряжением самого датчика с каким-либо управляющим устройством. Как правило, задача коммутации нескольких входов на один выход решается с помощью мультиплексоров. Но в этом случае происходит шунтирование контура входом мультиплексора при выборе соответствующего датчика. Предложенный путь решения – трансформация эквивалентного сопротивления контура к входному сопротивлению мультиплексора посредством емкостного делителя контура. В этом случае необходимо найти оптимальный баланс между потерей сигнала и влиянием входных цепей мультиплексоров. В результате проведенной работы создан макетный образец датчика однородности магнитного поля, произведены необходимые настройки и проведены соответствующие испытания. ЛАЗЕРНЫЙ АНАЛИЗ ЭНДОГЕННОГО СО В ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИФФУЗИОННОЙ СПОСОБНОСТИ АЛЬВЕОЛЯРНО-КАПИЛЛЯРНОЙ МЕМБРАНЫ Е.В.Степанов, Ю.А.Шулагин, Е.В.Бабарсков Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва 308 Определение диффузионных свойств легочной мембраны являяется важным диагностическим тестом, широко используемым в пульмонологии и в общей клинической практике, например при предоперационном обследовании. Для этих целей широко применяются методы, основанные на определении так называемого «коэффициента переноса» DLCO из воздуха легких в кровь для СО (моноокиси углерода). Для определения этой величины используются различные подходы, основанные на вдыхании воздушной газовой смеси, содержащей высокие концентрации (~0.3 %) CO, и наблюдении динамики выведения СО с выдыхаемым воздухом. Наиболее распространенным является метод одиночного вдоха, предложенный еще в начале прошлого столетия и принятый в качестве «золотого стандарта» определения диффузионных характеристик легочной мембраны. Существенный недостаток данного подхода связан с тем, что величина DLCO определяется не только диффузионными свойствами собственно альвеолярно-капиллярной мембраны, но и скоростью связывания СО эритроцитами. Это может приводить к неопределенности в результатах теста и затруднять диагностику, так как патологические изменения получаемого параметра могут быть в равной степени вызваны как патологией легочной мембраны, так и заболеваниями системы крови. Таким образом, актуальной является разработка методов, позволяющих измерять диффузионную способность собственно альвеолярнокапиллярной мембраны. Для решения проблемы дифференцировки предлагается ряд усовершенствований классического метода. Например, применение воздушных смесей СО с различным содержанием О2 или добавление в дыхательную смесь помимо СО еще и NO и наблюдение динамики выведения обоих газов. Однако все это значительно усложняет диагностические приборы и методы, а также вносит дополнительное воздействие на организм, которое может приводить к ошибкам в диагностике. Для решения проблемы нами предлагается использовать новый подход, основанный на анализе в выдыхаемом воздухе содержания эндогенного СО, продуцируемого самим организмом вследствие гемолиза гемм-содержащих белковых структур. Как показали проведенные теоретические и экспериментальные исследования, динамика выделения эндогенного СО из крови в легкие определяется именно диффузионной способностью альвеолярно-капилярной мем309 браны легких. Реализация данного подхода традиционными инструментальными методами принципиально невозможна, так как существенно возрастают требования к чувствительности и селективности анализа содержания СО в выдыхаемом воздухе. Поскольку средний уровень относительного содержания эндогенного СО в выдыхаемом воздухе составляет ~10-4 % , для его анализа необходима чувствительность детектирования на уровне 10-6 %. При этом должна быть обеспечена достаточно высокая селективность анализа СО в условиях высокого содержания СО2 и паров Н2О в выдыхаемом воздухе. Такой прецизионный и селективный анализ СО может быть реализован за счет использования методов лазерного спектрального анализа, в частности с использованием перестраиваемых диодных лазеров. Этот подход, кроме того, обеспечивает широкий динамический диапазон (~6 порядков) анализа содержания СО, что позволяет в рамках единого инструментального метода обеспечить возможность анализа как эндогенного СО в выдыхаемом воздухе, так и содержание экзогенного СО, вводимого в организм при использовании классических диффузионных тестов. Используя комбинацию этих двух тестов и единый аналитический лазерный инструмент, можно определять обе составляющие, как мембранную, так и «эритроцетарную», коэффициента переноса газов из легких в кровь, полностью снимая неопределенность получаемых диагностических результатов. МЫШЕЧНЫЙ ТОНУС В НОРМЕ И У БОЛЬНЫХ БОЛЕЗНЬЮ ПАРКИНСОНА ПО ДАННЫМ ЭЛАСТОМИОТОНОГРАФИИ Е.М.Тиманин1), А.В.Густов2), Е.А.Александрова2) Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород Нижегородская государственная медицинская академия ФА ЗСР РФ, Нижний Новгород 1) 2) Средствами комплекса “Механонейромиограф” [1] методом “Эластомиотонографии” [2] зарегистрированы упругость и вязкость следующих мышц: икроножные мышцы голени (ИМ), четырехглавые мышцы бедра (ЧМБ), бицепсы плеча (Б), трапециевидные мышцы шеи (ТМ). Измерения проведены слева и справа на группе из 20 здоровых добровольцев и на группе из 15 больных с болезнью 310 Паркинсона (10 в OFF-периоде, 5 в ON-периоде). Все обследованные подписали информированное согласие на участие в исследовании. По результатам измерений в группе здоровых сформированы нормы по упругости и вязкости на каждой из мышц. Для каждого больного сформирован протокол обследования, включающий данные об упругости и вязкости обследованных мышц и диаграммы, на которых приведено их соотношение с границами нормы на уровне доверительной вероятности 95 %. Проведен анализ протоколов и получены следующие результаты. На трапециевидной мышце шеи величина упругости не выходит за пределы нормы ни в одном из случаев. Величина вязкости здесь превысила границу нормы в одном случае в On-периоде (20 %) и в четырех случаях в Off-периоде (40 %). На бицепсе плеча в Onпериоде упругость всегда находилась в пределах нормы, в Offпериоде в двух случаях (20 %) она оказалась ниже нормы. Вязкость здесь оказалась выше нормы в одном случае в On-периоде (20 %) и в четырех случаях (40 %) в Off-периоде. На четырехглавой мышце бедра в On-периоде упругость оказалась в пределах нормы во всех случаях, кроме одного (20 %), где она ниже нормы. В Off-периоде упругость здесь оказалась нормальной в 4 случаях (40 %), повышенной в 2 случаях (20 %) и пониженной в 4 случаях (40 %). Вязкость здесь оказалась повышенной в одном случае (20 %) в Onпериоде и в 9 случаях (90 %) в Off-периоде. На икроножной мышце голени в On-периоде упругость понижена в двух случаях (40 %). В Off-периоде упругость оказалась нормальной в 4 случаях (40 %), повышенной в 3 случаях (30 %) и пониженной в 3 случаях (30 %). Вязкость здесь оказалась повышенной в 2 случаях (40 %) в Onпериоде и в 4 случаях (40 %) в Off-периоде. Таким образом, в Off-периоде во всех случаях наблюдался выход за пределы нормы хотя бы одной из измеренных величин. По упругости наблюдалось как ее снижение (на разных мышцах от 20 до 40 % случаев), так и ее повышение (на мышцах ног в 20–30 % случаев). По вязкости в Off-периоде всегда наблюдалось превышение нормы (на всех мышцах в 40 % случаев, кроме четырехглавой мышцы бедра, где превышение нормы наблюдалось в 90 % случаев). В On-периоде в 2 случаях (40 %) выхода за пределы нормы не наблюдалось ни по одному из измеренных параметров. По упругости наблюдалось снижение ниже нижней границы нормы 311 в 20–40 % случаев на мышцах ног. По вязкости наблюдалось превышение нормы в 20–40 % случаев на всех мышцах. 1. Тиманин Е.М., Еремин Е.В., Густов А.В., Устимкина М.А. Возможности диагностики болезни Паркинсона на основе компьютерной регистрации тремора // Фундаментальные науки – медицине. Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2008 году. М.: Фирма «Слово», 2008. – С. 133-134. 2. Тиманин Е.М., Еремин Е.В., Густов А.В., Устимкина М.А. Об информативности методов компьютерной механонейромиографии // Технологии живых систем. 2008. Т.5, № 5-6. С. 82-86. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ И АППАРАТНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛЯ ЭЛИМИНАЦИИ АТЕРОГЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ ИЗ ЖИДКИХ СРЕД ОРГАНИЗМА С ПРИМЕНЕНИЕМ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫХ НАНОСОРБЕНТОВ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ Ю.Г.Яновский1), А.Н.Данилин1), А.И.Алехин2), Н.Г.Гончаров2), В.И.Карандин3), А.Г.Рожков3) Учреждение Российской академии наук Институт прикладной механики РАН, Москва; 2)Центральная клиническая больница РАН, Москва; 3) 3 Центральный военный клинический госпиталь им. А.А.Вишневского, Красногорск 1) Быстрое развитие эфферентной терапии (ЭТ) в последние годы обусловлено возможностью ее эффективного применения при самых различных заболеваниях (острых и хронических эндотоксикозах, заболеваниях, протекающих с нарушением обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях и др.). В настоящее время известно несколько различных технологий проведения ЭТ, в том числе центрифужный и мембранный плазмаферез, каскадная плазмофильтрация, сорбция патогенных ингредиентов плазмы крови на различных сорбентах и др. Повышение эффективности сорбционных технологий заключается сегодня в создании сорбентов с высокой сорбционной ёмкостью и специфичностью, хорошей гемосовместимостью. Использование наночастиц в качестве сорбентов для медицинских целей весьма перспективно, поскольку наносорбенты различны по составу, могут обладать 312 огромной удельной поверхностью и, как следствие, высокой сорбционной ёмкостью. В связи с этим целью настоящей работы являлся как синтез магнитоуправляемых нанообъектов, пригодных для использования в медицине, так и сравнительное исследование их сорбционных свойств на образцах плазмы крови и лимфы человека. В качестве магнитных носителей в работе использовались нано- и микроразмерные частицы магнетита, синтезированные в ИПРИМ РАН, которые покрывали оболочками из молекул альбумина или додецилмеркаптана, и углеродные нанотрубки УНТ, синтезированные авторами по технологии CVD на железном и кобальтовом катализаторах. Изучение сорбционных свойств наносорбентов проводили на плазме крови и лимфы 12 человек (доноров). Биожидкости были предоставлены 3-м Центральным военным клиническим госпиталем им. А.А. Вишневского (3 ЦВКГ им. А.А. Вишневского). В качестве контролируемых критериев величины сорбционной ёмкости использовали показатели содержания в плазме крови и лимфы их основных постоянных ингредиентов, по уровню концентрации которых можно судить о состоянии клеточного, органного и общего гомеостаза при различных заболеваниях. Анализ надосадочных биожидкостей проводился в биохимической лаборатории 3 ЦВКГ им. А.А. Вишневского (биохимические анализаторы Olympus (Германия), Advia 1200 (США-Германия) и система клинического капиллярного электрофореза Paragon (США)). Контролируемыми показателями являлись: аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза, общий холестерин, мочевина, креатини́н, билирубин общий, глюкоза, общий белок, альбумин. Установлено, что наибольшая сорбционная активность проявляется у сорбентов, полученных на основе частиц магнетита со средним размером около 80 нм, а также сорбентов на основе УНТ-Fe. В наибольшей степени активны сорбенты на основе магнетита с оболочкой из додецилмеркаптана и сорбенты на основе УНТ, полученных на железном катализаторе. Например, средний процент удаления из плазмы крови билирубина превышает 60 %, из плазмы лимфы – 50 %. Отметим, что при использовании современных угольных сорбентов редко удается добиться снижения BiliT в крови более чем на 30 %. 313 Доказано, что полученные в ходе работы наносорбенты обладают весьма высокими сорбционными характеристиками и имеют перспективы использования в эфферентных системах очищения жидких сред человека и иных живых организмов от экзои эндотоксинов различной молекулярной массы. РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ ПРЕЦИЗИОННОГО МАЛОТРАВМАТИЧНОГО УДАЛЕНИЯ НОВООБРАЗОВАНИЙ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ НА ОСНОВЕ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СО2 ЛАЗЕРНОЙ ХИРУРГИЧЕСКОЙ УСТАНОВКИ В.А.Ульянов1), А.К.Дмитриев1), А.Н.Коновалов1), В.Н.Кортунов1),О.В.Маторин2), И.В.Решетов2) Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, г. Троицк 2) Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена 1) Представлены результаты работ по созданию и применению хирургической установки на основе волноводного СО2 лазера мощностью 25 Вт с ВЧ накачкой активной среды с системой оперативной диагностики процесса лазерного испарения биотканей по автодинному сигналу (приему обратно рассеянного излучения на резонатор лазера). Исследована эффективность диагностики лазерного испарения опухолевых тканей по автодинному сигналу с использованием различных средств доставки излучения к операционному полю в целях расширения возможностей эндоскопических применений интеллектуальной СО2 лазерной хирургической установки. Для транспортировки излучения к операционному полю использовались гибкие волоконные кристаллические световоды типа PIR на основе галогенидов серебра и полые волноводы типа HG на основе капиллярной кварцевой трубки. В качестве объектов воздействия излучения использовались желатиновые биомодели и биоткани in vitro. Установлено, что отношение «сигнал/шум» при использовании кристаллических гибких волокон составляет 10-12, а величина пропускания излучения соответствует уровню для зеркально-линзового манипулятора. Такой уровень полезного сигнала позволяет достаточно контрастно диагностировать 314 различие между здоровой и опухолевой тканями с близким водосодержанием. При использовании полого световода отношение «сигнал/шум» не превышает 3, что ограничивает возможности эндоскопических применений при таком способе подвода излучения к операционному полю. Проведен анализ принципиальных различий между опухолевыми и здоровыми тканями с точки зрения диагностики по обратно рассеянному излучению. В основе анализа – структурно-тканевый и биохимический атипизм, различие оптических свойств опухолей. Эти особенности опухолевых тканей определяют возможности использования такого структурно-чувствительного метода, как автодинное детектирование обратно рассеянного излучения для контроля прецизионного выпаривания «больной» ткани в реальном масштабе времени. ЦИФРОВОЙ АППАРАТНО-ПРОГРАММНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ МАССОВОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСТЕОПОРОЗА М.Н.Устинин1), А.И.Бойко1), Н.А.Арапов2), Б.Ф.Санталов3), М.М.Ольшевец1), В.А.Яшин3) Институт математических проблем биологии РАН, Пущино Отрадинская больница, Ступинский район Московской области 3) Институт биофизики клетки РАН, Пущино 1) 2) Целью выполняемого проекта является решение актуальной задачи практической медицины – создание аппаратнопрограммного комплекса и разработка методики для оценки минеральной плотности костной ткани по цифровым рентгеновским снимкам. Широкое внедрение таких комплексов позволит проводить массовую диагностику остеопороза. Развиваемый в проекте подход опирается на растущее использование компьютерных рентгеновских аппаратов. В ходе выполнения проекта создаются методики и приспособления для получения стандартизованных цифровых рентгеновских снимков, а также разрабатывается программное обеспечение для их автоматизированной обработки и анализа [1]. В отчетном году продолжались фундаментальные исследования как в экспериментальном, так и в теоретическом направлении. На базе кабинета цифровой ренгенодиагностики в Больнице 315 Пущинского научного центра РАН разрабатывается измерительный стенд для получения рентгеновского снимка, на котором одновременно экспонируются предплечье пациента и набор эталонных объектов. Проводится модификация измерительного комплекса – в состав компьютерной приставки [2] вводится цифровая камера с охлаждаемой матрицей. Это позволит существенно понизить уровень электронных шумов, улучшив тем самым статистические свойства измеряемой оптической плотности рентгеновского снимка. Продолжалась работа по компьютерному моделированию изучаемых объектов и имитационному моделированию процесса формирования рентгеновского снимка [3]. На основе результатов моделирования строятся методы автоматического сегментирования и анализа изображений применительно к поставленной задаче. Велись работы по развитию иерархической модели анализа изображений, содержащих эталонные и диагностические объекты. Сначала рассматривается двумерная модель для автоматической сегментации и локализации объектов на снимке. Затем для небольшой части снимка, подлежащей денситометрии, строится трехмерная модель и проводится идентификация параметров для оценки минеральной плотности. В отчетном году разработаны базовые алгоритмы и отдельные блоки программного обеспечения. В результате выполнения проекта планируется создать массовый и относительно недорогой инновационный продукт – программный комплекс в сочетании с простыми приспособлениями и методиками диагностики остеопороза. Литература 1. M.M.Olshevetz, M.N.Ustinin, and I.A.Nikonov. Software for Digital Filmless Roentgenography. In Pattern Recognition and Image Analysis. Vol. 16, 2006, pp. 23–25. 2. А.И.Алехин, Н.Г.Гончаров, В.Д.Лахно, М.Н.Устинин, Е.В.Соболев, Н.А.Арапов, Б.Ф.Санталов, М.М.Ольшевец, В.К.Салахутдинов. Создание телемедицинской диагностической сети на базе ЦКБ и медицинских учреждений РАН. Фундаментальные науки – медицине. Материалы конференции. Москва, 3-4 декабря 2007 г., М., Фирма «Слово», c.109-110. 316 3. М.Н.Устинин, А.И.Бойко. Оценка минеральной плотности костной ткани по цифровому рентгеновскому снимку с эталоном. Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА–2010". Москва, 21-25 июня 2010 г. сс. 98–100. Учреждение Российской академии наук Центральная клиническая больница РАН ВЛИЯНИЕ ПОГОДНЫХ УСЛОВИЙ НА СОСТОЯНИЕ АДАПТАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ О.В.Овсянникова ¹), А.И.Алехин ¹), В.А.Карев ¹), Г.А.Буш ²), Н.М.Гевондян 3), Н.А.Загустина 4) 1) Учреждение Российской академии наук Центральная клиническая больница РАН 2) Институт физики атмосферы РАН 3) Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН), Москва 4) Научно-исследовательский центр сверхслабых взаимодействий при Санкт-Петербургском Государственном университете телекоммуникаций им. проф. М.А.Бонч-Бруевича В современных медицинских исследованиях показана связь между погодными условиями и состоянием пациентов с кардиологической и неврологической патологией. Понятно, что при этом меняется состояние организма в целом. В случае снижения адаптационного потенциала погодные колебания сопровождаются декомпенсацией функционирования нескольких систем органов одновременно. Активно разрабатываются новые профилактические методики, направленные на повышение толерантности к изменениям погодных условий. Однако их эффективность оставляет желать лучшего. Определенные трудности возникают в связи с отсутствием методов адекватной экспресс-диагностики состояния адаптационной системы, в частности нейроэндокринно-иммунного комплекса. Целью настоящей работы явилось изучение информативности методов измерения адаптационного потенциала и активности иммунной системы в оценке влияния погодных условий на состояние пациентов с кардиологическими и неврологическими заболевания317 ми. Обследовано 126 больных (69 мужчин, 57 женщин, средний возраст 53,6±2,3 года) с ишемической болезнью сердца, гипертонической болезнью, дисциркуляторной энцефалопатией, состояниием после острого нарушения мозгового кровообращения. Пациенты наблюдались на протяжении 3 месяцев в стационаре и амбулаторно. В течение всего времени проводилась круглосуточная запись часовых и суточных пульсаций атмосферного давления (ЧСПАД) с помощью микробарографа. Адаптационный потенциал оценивали с помощью измерения концентрационно-кинетического потенциала (КСИ-потенциала) жидких сред организма, функциональную активность иммунной системы – путем определения функционально активных серопозитивных антител G класса к антигенам ± бактерий. Установлена тесная корреляция между скоростью изменений ЧСПАД и ухудшением самочувствия пациентов. По данным КСИметрии в периоды погодных колебаний ухудшалось состояние систем органов, подверженных патологическим изменениям, снижался адаптационный потенциал. Отмечена реакция иммунной системы в виде уменьшения процентного содержания высокоавидных антител, свидетельствующая о снижении ее функциональной активности. Выявленные изменения хорошо восстанавливались с помощью курсового лечения мезодиэнцефальной модуляцией (транскраниальной электротерапевтической коррекцией нейроэндокринных центров головного мозга). Таким образом, показана связь между скоростью изменений ЧСПАД и ухудшением состояния пациентов с сердечно-сосудистой и цереброваскулярной патологией. Изучена информативность новых методов оценки состояния нейроэндокринно-иммунного комплекса, подтверждена результативность мезодиэнцефальной модуляции при лечении патологических состояний, обусловленных погодными колебаниями. ОЦЕНКА КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ТЕРМОГЕЛИОКСА И НЕБУЛАЙЗЕРНОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ С.П.Григорьев1), Е.О.Лошкарева1), А.И.Алёхин2) Кафедра внутренних болезней МБФ ГБОУ ВПО РНИМУ 1) 318 им. Н.И.Пирогова, Москва; 2)Центральная клиническая больница РАН, Москва Известно, что ингаляции подогреваемой кислородно-гелиевой смеси (термогелиокс) способствуют улучшению газообмена, нормализации газового состава крови и кислотно-щелочного равновесия, уменьшению работы дыхательной мускулатуры, оптимизации деятельности дыхательного центра у больных бронхолегочными заболеваниями. Целью работы явилось изучение изменения клинической картины заболевания у больных бронхиальной астмой (БА) при лечении, включающем сочетанную небулайзерную терапию с термогелиоксом. 40 пациентов с БА инфекционно-зависимой и смешанной формы тяжелой степени в фазе обострения (из них 16 женщин и 24 мужчины, средний возраст 68±8,5 лет) были разделены на 2 группы по 20 человек в зависимости от проводимого лечения. Все пациенты получали лечение в соответствии с Национальными рекомендацииями, которое включало небулайзерную терапию беродуалом и пульмикортом. Больным из основных групп проводился курс небулайзерной терапии из 10 процедур по схеме «15 минут дыхания бронходилататором (атровент/беродуал) и кортикостероидом/5 минут дыхания атмосферным воздухом/6 минут ингаляций гелиоксом/5 минут дыхания атмосферным воздухом/5 минут дыхания бронходилататором (атровент/беродуал) и кортикостероидом». После окончания первого сеанса небулайзерной терапии с термогелиоксом у пациентов наблюдалось облегчение дыхания и улучшение отхождения мокроты. На 2-3 день курса комплексной терапии с термогелиоксом у больных БА было отмечено усиление кашля и отхождение мокроты, обусловленное ее разжижением. В середине курса терапии состояние больных БА в основной и контрольной группе объективно улучшалось: исчезли приступы удушья в ночное время; общее количество приступов удушья за сутки достоверно (р<0,05) уменьшилось в ОГ – с 4,8+1,4 до 0,8+0,8 в сутки, в КГ – с 4,6+1,5 до 1,3+0,9 в сутки. Кроме того, у пациентов с БА в середине комплексной терапии с термогелиоксом достоверно уменьшились одышка, а также количество хрипов (р<0,05). Причем по сравнению 319 с КГ степень уменьшения выраженности одышки, кашля и хрипов в середине курса терапии с термогелиоксом была достоверно выше. После курса терапии больных БА в обеих группах достоверно (р<0,05) уменьшилось количество приступов удушья, снизилась выраженность одышки и количество хрипов. Кроме того, в ОГ больных БА после курса терапии с термогелиоксом уменьшился кашель, а также количество отделяемой мокроты (р<0,05). Следует отметить, что по сравнению со стандартным курсом терапии использование термогелиокса позволяет более эффективно снизить выраженность одышки (в ОГ – на 69 %, в КГ – на 25 %) и кашля у больных БА (в ОГ – на 62 %, в КГ– на 31%) (р<0,05). Причем степень выраженности одышки, кашля и количество хрипов у больных БА ОГ в середине курса терапии значимо не отличалась (р>0,05) от выраженности этих симптомов у больных БА КГ в конце курса терапии, т.е. уже к середине курса небулайзерной терапии с термогелиоксом выраженность симптомов соответствует таковому после курса стандартной терапии. Этот положительный эффект комплексной терапии, по-видимому, объясняется как непосредственно лечебным действием термогелиокса, так и улучшением доставки в дистальные отделы бронхиального дерева лекарственных препаратов противовоспалительного и бронходилатирующего действия с большей их депозицией. ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА И КОРРЕКЦИЯ ГОМЕОСТАЗА НА МОЛЕКУЛЯРНОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ А.И.Алехин1), Н.М.Гевондян2), Н.А.Загустина3), В.А.Карев1), О.В.Овсянникова1) Центральная клиническая больница РАН (ЦКБ РАН), Москва 2) Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН), Москва 3) Научно-исследовательский центр сверхслабых взаимодействий при Санкт-Петербургском Государственном университете телекоммуникаций им. проф. М.А.Бонч-Бруевича 1) Высокая чувствительность центральных регуляторных систем организма к внешним или внутренним, острым или хроническим 320 стрессорным воздействиям различной природы (физической, химической, биологической) приводит к нарушению работы нервной, эндокринной и иммунной систем, снижению адаптационной способности организма и стремительному увеличению числа больных с вторичной иммунной недостаточностью (ВИН) у 80 % лиц работоспособного возраста. В то же время патогенез, диагностика и лечение стресс-индуцированных заболеваний до сих пор остаются недостаточно изученными. Целью данного проекта является разработка принципиально новых подходов диагностики и лечения ВИН-ассоциированных заболеваний, базирующихся на энергоинформационных измерениях, позволяющих проследить взаимосвязь между расстройствами биоэнергетических процессов, начиная с уровня трансмембранных процессов и кончая уровнем общего энергетического и концентрационного гомеостаза организма, и авидностью антител. На сегодняшний день коллективом авторов разработаны альтернативные методики оценки влияния внешних и внутренних факторов на биообъекты (патенты РФ № 2402757, № 2137133, № 2196333, № 2191385, № 2240843), не имеющие аналогов ни в России, ни за рубежом. Разработаны теоретические основы и алгоритм работы нового класса высокоточной аппаратуры, позволяющей объективно регистрировать сверхслабые энергетические процессы на молекулярном уровне организма (менее 0,002 эВ), представленной в виде диагностической экспертной системы «КСИМед». Высокая чувствительность метода, возможность математической обработки большого объёма данных о состоянии биологических объектов, простота в управлении позволяют получить объективный развёрнутый функциональный диагноз, включающий системный отклик организма на ту или иную патологию, и интегрально обозначать нозологическую форму. Кроме того, авторами разработаны новая технология экспресс-диагностики латентной и клинически выраженной стадий ВИН, контроля эффективности лечения и скрининга иммуномодуляторов на основании изменения авидности антител G класса. Разработки базируются на открытии ранее неизвестной формы недостаточности В-системы иммунитета, характеризующейся секрецией низкоавидных антител с низкой функциональной и протективной активностями, что способствует персистенции антигенов и патогенов и 321 развитию иммунопатологических процессов в тканях и органах. Применение разработанных технологий в клинической практике, в частности при лечении больных атопическим дерматитом различной степени тяжести, позволило выявить ранее неизвестные механизмы взаимосвязи между биоэнергетическими процессами, регуляторными системами, обеспечивающими поддержание гомеостаза в организме, и клиническими проявлениями ВИН, а также разработать на этой основе принципиально новую стратегию лечения с помощью иммунотропных пептидов и/или физических факторов воздействия на биологически активные точки. ПРИМЕНЕНИЕ ИНГАЛЯЦИЙ ПОДОГРЕВАЕМОЙ КИСЛОРОДНО-ГЕЛИЕВОЙ СМЕСИ (ГЕЛИОКСА) В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ ПНЕВМОНИЕЙ С.П. Григорьев1), А.Л. Красновский1), А.И. Алёхин2) Кафедра внутренних болезней МБФ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова, Москва 2) Центральная клиническая больница РАН, Москва 1) Внебольничная пневмония (ВП) относится к числу наиболее распространённых острых инфекционных заболеваний (число больных ВП в России превышает 1.5 миллиона в год) и является одной из ведущих причин смерти от инфекционных заболеваний. Несмотря на создание высокоэффективных антибактериальных препаратов широкого спектра действия, летальность при внебольничной пневмонии достигает 7 %. Таким образом, разработка и внедрение новых методов лечения ВП является актуальной задачей здравоохранения. За счёт уникальных физических свойств гелия (в первую очередь, низкой плотности) смесь гелия и кислорода (гелиокс) значительно свободнее воздуха поступает в лёгкие, заполняет их более равномерно (в т.ч. инфильтрированные отделы, способствуя сохранению в них газообмена), улучшает доставку кислорода, а также выведение углекислого газа, уменьшает нагрузку на дыхательные мышцы. При вдыхании подогреваемого гелиокса дополнительно происходит мощное тепловое и теплорефлекторное воздействие, что приводит к расширению бронхов, уменьшению 322 продукции и вязкости мокроты с облегчением её откашливания. Улучшение микроциркуляции в легких способствует лучшей доставке антибиотиков в очаг воспаления и ускоряет рассасывание инфильтрата. В исследование вошли 40 больных внебольничной сегментарной пневмонией средней тяжести. Случайным образом больные были разделены на две равные группы, сопоставимые по возрасту (45±8 лет) и полу. В обеих группах проводилась стандартная терапия ВП (антибактериальная, муколитическая, дезинтоксикационная). При эффективности антибиотиков по клиническим данным (стойкая тенденция к снижению лихорадки, уменьшение интоксикации) больные основной группы дополнительно получали ингаляции подогреваемого (температура в маске 40 °С) гелиокса (77 % гелия, 23 % кислорода) в течение 7 дней. Оценивались скорость разрешения симптомов (кашель, отделение и качество мокроты, одышка, общие симптомы интоксикации – по специально разработанному дневнику пациента с балльной оценкой каждого симптома), физикальных признаков, а также уменьшения выраженности воспаления (по динамике лабораторных маркеров воспаления, а также показателей хемилюминесценции (ХЛ) цельной крови). В основной группе уже к четвёртому дню комплексной терапии отмечается статистически значимое уменьшение выраженности основных симптомов и показателей воспаления (в группе контроля аналогичное снижение указанных показателей происходит к 7-му дню), быстрее разрешаются физикальные признаки воспалительной инфильтрации в лёгочной ткани. Таким образом, включение ингаляций подогреваемого гелиокса в комплексную терапию ВП способствует более быстрому и полному купированию воспаления, уменьшению сроков госпитализации и нетрудоспособности больных ВП. 323