магистр / диплом
advertisement
Министерство образования и науки Российской Федерации МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (государственный университет) ФАКУЛЬТЕТ РАДИОТЕХНИКИ И КИБЕРНЕТИКИ КАФЕДРА ПРОБЛЕМ ПЕРЕДАЧИ И ОБРАБОТКИ ИНФОРМАЦИИ (Специальность «Математические и информационные технологии») ГЕНОМНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ СЕТЕЙ ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ У БАКТЕРИЙ Магистерская диссертация студента 511 группы Жарова Ильи Алексеевича Научный руководитель Казаков А.Е., к.м.н. Москва, 2011 Содержание Содержание...........................................................................................................................2 1 Список сокращений ....................................................................................................2 2 Введение.......................................................................................................................3 3 Постановка задачи.......................................................................................................3 4 Обзор литературы .......................................................................................................4 5 4.1 Регуляция генной экспрессии .............................................................................4 4.2 Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов .................................5 4.3 Регуляция экспрессии транспортера Blt ............................................................6 4.4 Поглощение железа и его регуляция белком Fur..............................................8 4.5 Метаболизм окиси азота и его регуляция белками NsrR, NnrR и NorR .........9 Материалы и методы ................................................................................................10 5.1 5.1.1. Задача 1 ...........................................................................................................10 5.1.2. Задача 2 ...........................................................................................................11 5.2 6 Использованное программное обеспечение ....................................................10 Методы решения задачи ....................................................................................11 5.2.1. Задача 1 ...........................................................................................................11 5.2.2. Задача 2 ...........................................................................................................12 Результаты .................................................................................................................13 6.1 Задача 1 ...............................................................................................................13 6.2 Задача 2 ...............................................................................................................21 7 Выводы .......................................................................................................................28 8 Список использованных источников ......................................................................28 1 Список сокращений АТФ – аденозинтрифосфат ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота МЛУ – множественная лекарственная устойчивость п.н. – пар нуклеотидов РНК – рибонуклеиновая кислота ABC – ATP binding cassette HTH – helix-turn-helix MATE – multigrug and toxic compound extrusion 2 MFS – major facilitator superfamily RND – resistance, nodulation and cell division SMR – small multidrug resistance 2 Введение К настоящему времени известны нуклеотидные последовательности нескольких тысяч геномов прокариот. Экспериментальное исследование функции всех кодируемых ими белков осуществить невозможно, поэтому менее трудоемкие и затратные методы вычислительной молекулярной биологии приобретают все большее значение и популярность. Одной из важнейших областей исследования является регуляция экспрессии генов. Одинаковые изменения фенотипа могут вызываться как изменениями в генах, непосредственно ответственных за фенотип, так и в генах или прочих элементах регуляторных систем. Транскрипция генов одной биохимической системы, расположенных в разных локусах на хромосоме, нередко регулируется одним регуляторным белком. Совокупность таких генов называется регулоном. Объединение генов в регулоны дает дополнительную информацию для предсказания принадлежности неохарактеризованных генов к той или иной системе. Данная работа состоит из двух частей. Первая часть посвящена компьютерной реконструкции регулона BltR в бактериях. Подсемейство регуляторов транскрипции BltR относится в семейству MerR. К настоящему времени в нем экспериментально изучен только белок BltR Bacillus subtilis. Вторая часть посвящена поиску сайтов связывания регуляторов Fur, RirA, NsrR, NnrR и NorR в геномах протеобактерий. Результаты работы были представлены автором на XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» и опубликованы в журнале «Молекулярная биология» (Жаров И.А., Гельфанд М.С., Казаков А.Е. Регуляция генов множественной лекарственной устойчивости факторами транскрипции подсемейства BltR // Молекулярная биология – 2011, т. 45 – № 4 – с. 715-723). 3 Постановка задачи Целью данной работы является реконструкция регулонов, включающих в себя гены множественной лекарственной устойчивости, поглощения железа, нитрозативного стресса и денитрификации у бактерий. В соответствии с выбранной целью, были поставлены следующие задачи: 3 1. Сравнительный геномный анализ транскрипционных факторов подсемейства BltR в бактериях а. Поиск гомологов белка BltR и построение их филогенетического дерева. б. Построение поисковых профилей сайтов связывания транскрипционных регуляторов с ДНК. в. Поиск потенциальных сайтов связывания в геномах, содержащих представителей подсемейства BltR, и выявление генов, потенциально регулируемых этими регуляторами. г. Детальный анализ функций регулируемых генов. 2. Реконструкция (поглощение регулонов железа); факторов NsrR, NorR транскрипции Fur (нитрозативный в энтеробактериях стресс) и NnrR (денитрификация) в протеобактериях. а. Поиск гомологов данных транскрипционных факторов и построение их филогенетических деревьев. б. Построение поисковых профилей сайтов связывания транскрипционных регуляторов с ДНК. в. Поиск потенциальных сайтов связывания в геномах энтеробактерий (Fur) и протеобактерий (остальные факторы транскрипции) и выявление генов, потенциально регулируемых этими регуляторами. г. Общий анализ функций регулируемых генов. Новизна работы состоит в том, что регулятор транскрипции BltR вне модельного организма Bacillus subtilis исследован не был; a регуляторы Fur, NsrR, NorR и NnrR ранее изучались в существенно меньшем наборе организмов. 4 Обзор литературы 4.1 Регуляция генной экспрессии Поскольку живые организмы находятся в меняющейся внешней среде, а также проходят через различные стадии жизненного цикла, экспрессия генов (синтез РНК и белка) поддерживается на постоянном уровне. Регуляция экспрессии генов может происходить на стадиях инициации, элонгации или терминации транскрипции а также на этапе трансляции. Регуляция на стадии инициации транскрипции наиболее экономична, т.к. при этом блокируется как синтез РНК, так и последующий синтез белка. Регуляция инициации транскрипции осуществляется преимущественно специальными белкамирегуляторами (транскрипционными факторами), 4 которые связываются со специфическими последовательностями нуклеотидов (сайтами связывания), как правило, расположенными поблизости от промотора. Регулятор переходит из неактивного состояния в активное путем окисления, фосфорилирования, связывания с малой молекулой (эффектором) или посредством других молекулярных взаимодействий. Транскрипционные факторы подразделяют на активаторы (стимулирующие транскрипцию) и репрессоры (подавляющие транскрипцию). Если транскрипционный фактор регулирует гены, относящиеся к одной функциональной подсистеме, он называется локальным, если же он отвечает за регуляцию разных функций, то его называют глобальным. Бактериальные транскрипционные факторы, как правило, содержат HTH-домен (helix-turn-helix), ответственный за сайт-специфичное связывание с ДНК [25]. Они нередко активны в форме димеров или олигомеров. В этих случаях их сайты связывания на ДНК представляют собой инвертированные или, реже, прямые повторы, которые могут быть разделены промежутком. Нередко ген, кодирующий фактора транскрипции, расположен на хромосоме в непосредственной близости от регулируемых им оперонов. Длина сайта связывания обычно составляет 12-30 п.н. [44]. 4.2 Поиск сайтов связывания транскрипционных факторов Для поиска потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов in silico, как правило, используют матрицы позиционных весов [44]. Обучающей выборкой для матрицы является выравнивание нуклеотидных последовательностей известных сайтов связывания. Каждый элемент такой матрицы есть функция от частоты встречаемости данного нуклеотида в данной позиции в обучающей выборке. Например, в программе SignalX из пакета программ GenomeExplorer [1] используется следующая формула для веса нуклеотида b в позиции k: wb ,k log( N b ,k 0.5) 0.25 log( N i A,C ,G ,T i ,k 0.5) , где Nb,k – количество появлений нуклеотида b в позиции k. В ходе поиска сайтов в геноме для каждой последовательности нуклеотидов нужной длины подсчитывается вес, который определяется как сумма весов всех нуклеотидов. Потенциальными сайтами считаются лишь те последовательности, вес которых превышает заданное пороговое значение. Вес сайта зависит от его длины, поэтому имеет смысл сравнивать веса сайтов одинаковой длины. Одним из ограничений подхода является то, что матрицы позиционных весов не учитывают взаимодействие между позициями, и каждая позиция оценивается независимо. 5 Существуют и другие методы поиска сайтов в геноме. Ранее использовался поиск по консенсусу. Консенсус мотива – последовательность, в каждой позиции которой находится наиболее часто встречающийся в данной позиции мотива нуклеотид. При использовании данного метода вес сайта является функцией от числа совпадений сайта с консенсусом мотива. Распространение получили методы предсказания сайтов с неизвестной заранее последовательностью нуклеотидов: гиббсовский семплер [29], MEME [5]. Их работа сводится к нахождению локального множественного выравнивания заданных последовательностей. Однако эти методы не подходят для полногеномного поиска сайтов и дают менее точные результаты по сравнению с матрицами позиционных весов для случаев, когда априори известна модель сайта. 4.3 Регуляция экспрессии транспортера Blt У грамположительной бактерии B. subtilis экспериментально охарактеризован транспортер МЛУ Blt, относящийся к надсемейству MFS и включающий 12 трансмембранных альфа-спиралей. Транспортерами МЛУ называют транспортные белки, способные выводить из клетки широкий набор антимикробных соединений. Они играют существенную роль в выработке устойчивости многих видов бактерий к лекарственным средствам. Предполагают, что их клеточная роль состоит в выводе из клетки токсичных гидрофобных соединений, встречающихся в окружающей среде и проникающих в клетку путем пассивной диффузии [25]. Среди прокариотических транспортеров МЛУ выделяют 5 групп: надсемейства ABC (ATP binding cassette), MFS (major facilitator superfamily), и RND (resistance, nodulation and cell division) и семейства SMR (small multidrug resistance) и MATE (multigrug and toxic compound extrusion) [25]. Транспортеры надсемейства ABC используют в качестве источника энергии гидролиз АТФ, остальные же транспортеры МЛУ – протонный или натриевый градиент. Транспортер Blt способствует удалению из клетки родаминовых красителей, бромистого этидия [39], фторхинолонов, акридиновых красителей, тетрафенилфосфония, хлормицетина, пуромицина, нетропсина и доксорубицина [3, 38]. Транскрипцию гена blt, кодирующего этот транспортер, активирует белок BltR. Он принадлежит к семейству факторов транскрипции MerR. В одном опероне с blt расположен ген, кодирующий ацетилтрансферазу BltD (рис. 1). Ген, кодирующий регулятор BltR, расположен в одном локусе с регулируемыми генами. Фермент BltD катализирует реакцию ацетилирования полиаминов спермина и спермидина, что приводит к их последующей деградации [56]. Примечательно, что транспортер Blt выводит из клетки не только токсичные вещества, но и спермидин [34, 57]. Тем не менее, спермидин 6 не является эффектором регулятора BltR [34]. Роль полиаминов в метаболизме бактерий на настоящий момент полностью не выяснена. В частности, к их функциям относятся стабилизация РНК и ДНК, реакция на окислительный стресс и повышенную кислотность, биосинтез сидерофоров, выработка вирулентности, образование биопленок и пр. [47, 49, 58]. Установлено, что полиамины необходимы Escherichia coli для нормальной скорости размножения [49]. Спермидин синтезируется бактериями из аминокислот аргинина, орнитина и метионина, тогда как спермин обычно поглощается из внешней среды [47, 49]. Известно, что в клетках Escherichia coli ацетилирование спермидина приводит к его деградации и стимулируется его избытком в клетке или среде, а также при низких температурах [49], тепловом шоке, пониженной кислотности и воздействии этанола [12]. bltR blt bltD Рисунок 1. Структура локуса blt [3]. Толстыми стрелками обозначены гены, тонкими стрелками показаны старты транскрипции, треугольником показан сайт связывания BltR. Сайт связывания регулятора BltR расположен между элементами −35 и −10 промотора регулируемого оперона blt-bltD. Длина промежутка между этими элементами составляет при этом 19 п.н. вместо обычных 16-17 п.н. (рис. 2). Сайт связывания белка BltR представляет собой нестрогий палиндром длиной 17 п.н., частично перекрывающийся с −35 элементом промотора регулируемого гена. Такое расположение сайта связывания относительно промотора характерно и для других регуляторов семйства MerR, например, BmrR, который регулирует экспрессию транспортера МЛУ Bmr. Механизм активации транскрипции регулятором BmrR B. subtilis изучен экспериментально [37, 59]. При связывании лиганда с C-концевым доменом белка BmrR происходит расплетение одной из альфа-цепей белка и раскрытие внутреннего кармана, в котором отрицательно заряженный остаток глютамина образует высокоаффинную связь с положительно заряженной молекулой лиганда. При этом Bmr становится способным к димеризации и последующему связыванию с ДНК [60]. Молекула ДНК в комплексе эффектор-BmrR-ДНК изогнута, причем расстояние между промоторными элементами уменьшено на длину, эквивалентную 2 п.н. Такие же деформации ДНК наблюдаются и при связывании с ней других регуляторов семейства MerR – MtaN [23, 37], CueR, ZntR [13] и SoxR [55], гораздо менее сходных по аминокислотной последовательности с BltR, чем BmrR. Исходя из этого, можно предположить, что подобный принцип действия характерен и для BltR. 7 Рисунок 2. Структура промоторной области гена, blt [3]. Элементы промотора выделены рамками, палиндромный сайт связывания выделен синим цветом. Центр палиндрома отмечен стрелкой. Заглавные буквы отмечают позиции, удовлетворяющие условию обратной комплементарности. 4.4 Поглощение железа и его регуляция белком Fur Железо необходимо для жизнедеятельности практически всех живых организмов. Железо входит в состав таких важных и высококонсервативных белков, как оксидоредуктазы, глобины и цитохромы. Окисленный ион железа Fe3+ наиболее часто встречается в богатых кислородом средах. Он плохо растворим в воде, поэтому у большинства живых существ в процессе эволюции выработаны сложные механизмы связывания и поглощения этого иона. Бактерии, дрожжи и многие растения производят специальные секретируемые вещества – сидерофоры, которые связывают ион Fe3+, а затем поглощаются клетками [15]. Кроме собственных сидерофоров, некоторые бактерии способны использовать сидерофоры других видов, а также глобины и трансферрины организма хозяина. Внутри клетки железо высвобождается и восстанавливается до иона Fe2+, который уже может быть использован для встраивания в активные центры железосодержащих белков. Транспорт железа через цитоплазматическую мембрану осуществляется главным образом специфичными ABC-транспортерами. Транспорт через внешнюю мембрану у грамотрицательных бактерий происходит через специальные мембранные белки; этот процесс обеспечивается энергией с помощью периплазматического белкового комплекса TonB-ExbBD [15]. Репрессия транскрипции генов транспорта и метаболизма железа фактором транскрипции Fur является основным механизмом контроля уровня железа в клетке у многих бактерий [11]. Как правило, для димеризации и связывания с ДНК необходимо связывание Fur с ионом Fe2+. Менее распространена активация транскрипции комплексом Fur-Fe2+. В состав регулона Fur чаще всего входят гены различных систем транспорта железа и биосинтеза сидерофоров, а также запасания и утилизации железа. Сайт связывания Fur был экспериментально изучен в Escherichia coli [31]. Методами сравнительной геномики регулон Fur был охарактеризован, к примеру, в гаммапротеобактериях в [41] и в альфа-протеобактериях в [46]. В некоторых видах альфа-протеобактерий белок Fur утратил свою роль глобального регулятора гомеостаза железа. Его функции сместились в сторону регуляции поглощения 8 марганца с соответствующими изменениями в специфичности связывания им ионов [26]. В этих организмах за регуляцию поглощения железа отвечат другие регуляторные факторы. В частности, в семействе Rhizobiaceae эту роль играют два других транскрипционных фактора – RirA, принадлежащий семейству Rrf2, и Irr, образующий отдельное подсемейство регуляторов в Fur семействе. 4.5 Метаболизм окиси азота и его регуляция белками NsrR, NnrR и NorR Окись азота (NO) является токсичным и химически активным веществом. Она хорошо растворяется в воде, и ее молекулы легко проникают через клеточную мембрану. Токсичность окиси азота определяется прежде всего тем, что ее молекулы связываются с окислительно-восстановительными центрами белков и с тиольными группами, лишая эти белки нормальной функциональности [53]. К тому же, окись азота способна связываться с супероксидным радикалом, образуя крайне токсичный пероксинитрит (ONOO−) [48]. Окись азота является промежуточной стадией денитрификации – анаэробного дыхательного процесса восстановления нитрата до газообразного азота, осуществляемая некоторыми видами прокариот. Вследствие высокой токсичности данного вещества, денитрифицирующие бактерии вынуждены строго контролировать его концентрацию. Другие бактерии сталкиваются с окисью азота при контакте с денитрифицирующими бактериями (преимущественно в почве) или находясь внутри многоклеточного организма. К регуляторам транскрипции, непосредственно реагирующим на окись азота, относятся NsrR, NnrR и NorR. Эти белки, наряду с другими регуляторами метаболизма оксидов азота в различных видах прокариот, были исследованы методами сравнительной геномики [45]. Регулятор NsrR, входящий в семейство Rrf2, впервые был исследован в Nitrosomonas europaea [7]. При отсутствии окиси азота в среде, этот белок остается связанным с ДНК и предотвращает инициацию транскрипции с близлежащего промотора. Если Fe-S кластер, входящий в комплекс NsrR, связывает молекулу окиси азота, то регулятор теряет способность связывать ДНК. Сайт связывания этого регулятора был идентифицирован на основе консервативности в некодирующих областях перед регулируемыми генами [45]. Наиболее часто регулируемые NsrR гены – hmp, кодирующий диоксигеназу окиси азота, и hcp-hcr, кодирующие гидроксиламинредуктазу. Позже сайты связывания были подтверждены в ходе прямых экспериментов в Escherichia coli [30], Streptomyces coelicolor [52] и Vibrio fischeri [20]. 9 Активатор транскрипции NorR взаимодействует с альтернативным бактериальным сигма-фактором σ54. Активация транскрипции с σ54-зависимого промотора требует образования гексамерного кольца, составленного из факторов транскрипции, таких как NorR [10]. Поэтому сайты связывания таких регуляторов обычно расположены группами по несколько подряд. В случае NorR в такой группе обыкновенно насчитывается 3 сайта. Гексамер NorR обладает АТФ-азной активностью, необходимой для инициации транскрипции. Данный транскрипционный фактор был впервые охарактеризован в Ralstonia eutropha [43], и его сайты связывания были определены экспериментально [9]. Среди оперонов, регулируемых NorR, чаще всего встречаются hcp-hcr и norVW, кодирующий редуктазу окиси азота. Регулятор генов денитрификации NnrR принадлежит к семейству Crp-Fnr и является активатором транскрипции. Данный белок характерен для денитрифицирующих альфапротеобактерий и регулирует экспрессию генов, кодирующих нитритредуктазу Nir и редуктазу окиси азота Nor [45]. NnrR был впервые изучен в Rhodobacter sphaeroides [51]. 5 Материалы и методы 5.1 Использованное программное обеспечение Поиск гомологов проводили при помощи программы BLASTP из семейства программ BLAST [4]. Для множественного выравнивания аминокислотных последовательностей использовали программу MUSCLE [21]. Для преставления моделей мотивов в виде диаграмм Лого применяли программу WebLogo [16]. Построение матриц позиционных весов выполняли с использованием пакета программ GenomeExplorer [1] 5.1.1. Задача 1 Нуклеотидные последовательности геномов, координаты точек старта трансляции генов, аминокислотные последовательности и консервативные домены белков взяты из базы данных GenBank [8]. Филогенетические деревья строили методом ближайшего соседа при помощи программ PROTDIST и NEIGHBOR из пакета программ PHYLIP [22]. Поиск сайтов связывания регуляторов и промоторов регулируемых генов выполняли с использованием пакета программ GenomeExplorer [1]. 10 5.1.2. Задача 2 Нуклеотидные последовательности геномов, координаты точек старта трансляции генов, аминокислотные последовательности, консервативные домены белков и данные о составе отрологичных рядов взяты из базы данных MicrobesOnline [18]. Филогенетические деревья строили методом ближайшего соседа при помощи пакета программ MEGA [50]. Поиск сайтов связывания регуляторов выполняли с использованием программы RegPredict [40]. 5.2 Методы решения задачи 5.2.1. Задача 1 Поиск сайтов связывания производили в области −400 .. +50 п.н. относительно старта трансляции гена, аннотированного в базе данных GenBank. Для поиска промоторов использовали консенсусную последовательность промотора B. subtilis. Поиск сайтов проводили для всех генов в геноме. Гены полагали принадлежащими одному оперону, если они имели одинаковое направление транскрипции, а расстояние между ними не превышало 150 п.н. Белки подсемейства BltR идентифицировали следующим способом. Сначала среди всех белков, представленных в базе данных GenBank (RefSeq) [8], по полной аминокислотной последовательности белка BmrR B. subtilis (gi:50812267) провели поиск гомологов. При этом максимальное значение e-value принимали равным 3 × 10-8, чтобы можно было включить в рассмотрение белки различных подсемейств (BmrR, BltR и TipAL-Mta). Эти подсемейства очень близки и образуют тесную группу внутри семейства MerR. К тому же, белки BmrR, BltR и Mta (в последнем случае – N-концевой фрагмент) активируют транскрипцию генов, кодирующих транспортеры МЛУ в B. subtilis [2, 3, 6]. В выборку включили также все белки, содержащие консервативные домены HTH_BmrR, HTH_BltR и HTH_BmrR-like, аннотированные в базе данных GenBank (CDD) [8]. Регуляторы транскрипции обычно классифицируются по их ДНК-связывающим доменам. Поэтому полагали, что аннотация различных консервативных ДНК-связывающих доменов приблизительно соответствует искомой классификации отобранных регуляторных белков. Этот отбор проводили на начальном этапе до строгого определения подсемейств и выбора порядка работы с ними. По аминокислотным последовательностям N-концевых доменов, отвечающих за связывание с ДНК и димеризацию этих белков, построено общее филогенетическое дерево (данные не приведены). 11 Значимость сайтов определяли при помощи метода, отличного от стандартного метода проверки соответствия [36]. Ранее было показано, что сайты связывания активаторов семейства MerR располагаются между промоторными элементами, промежуток между которыми увеличен и составляет 19 п.н. у BltR [3]. В ходе поиска сайтов это подтвердилось и для гомологов белка BltR. При этом расстояние между центром палиндрома и 5’-концом элемента −35 промотора фиксировано и равно 13 п.н., поэтому с учетом этих фактов провели повторный поиск. Потенциальный сайт связывания считали значимым, если вес сайта превышал пороговое значение (принятое равным 5.00), и его центр располагался на расстоянии 13 п.н. от 5’-конца потенциального элемента −35 промотора. Этот метод применим для поиска сайтов связывания белков-активаторов. Действительно, для активации транскрипции необходимо определенное взаимное расположение сайта и промотора, в то время как расположение сайта репрессоров транскрипции может быть более свободным [24]. Функциональные типы регулируемых генов определялись по консервативным функциональным доменам, присутствующим в кодируемых ими белках и аннотированным в базе данных GenBank. В случае отсутствия такой аннотации предсказание функционального типа производили, исходя из информации о ближайших гомологах продуктов данного гена, найденных с помощью программы BLAST. 5.2.2. Задача 2 Множество геномов, в котором проводилась реконструкция регулонов, было определено заранее. Для регулона Fur были выбраны 12 геномов энтеробактерий. Для регулонов NsrR, NorR и NnrR набор состоял из 50 геномов альфа-протеобактерий, 37 геномов бета-протеобактерий и 90 геномов гамма-протеобактерий (включая упомянутые выше 12 геномов энтеробактерий). При составлении исследуемого множества организмов преследовали цель максимально охватить таксономическое дерево альфа-, бета- и гаммапротеобактерий и разнообразные экологические типы бактерий, включить в него наиболее изученные виды. В основу поисковых профилей были положены сайты, предсказанные для регулятора транскрипции Fur [41] и для регуляторов NsrR, NorR и NnrR [45]. Сайты связывания регуляторов искали перед всеми генами в исследуемых геномах в области −250 .. +50 п.н. относительно старта трансляции гена. Область поиска была сужена по сравнению с задачей 1, так как расположение сайтов связывания факторов транскрипции Fur, NsrR, NorR и NnrR было ранее изучено. В программе RegPredict поиск сайтов производится в нескольких геномах родственных бактерий [40]. В такие группы геномов, 12 как правило, включали геномы бактерий одного семейства. Результаты поиска группируются на основе гомологии потенциальных регулируемых генов. Значимыми считались высококонсервативные сайты, а также сайты, расположенные перед генами, входящими в изучаемую функциональную систему (метаболизм железа для регулятора Fur и метаболизм оксидов азота для NsrR, NorR и NnrR). Предположительные функции регулируемых генов определяли при помощи данных консервативных доменов, филогении белков и совместном расположении генов, аннотированных в базе данных MicrobesOnline [18]. Для однозначной идентификации генов и соответствующих им белков использовались идентификаторы Locus Tag. 6 Результаты 6.1 Задача 1 На первом этапе работы был проведен поиск гомологов регулятора транскрипции BltR. В 32 геномах бактерий обнаружено 45 таких белков, кодируемых хромосомными генами. Из этих геномов 30 принадлежат бактериям, относящимся к Firmicutes, и по одному – к типам Bacteroidetes (Bacteroides capillosus) и Proteobacteria (Desulfotalea psychrophila). Подавляющее большинство из этих белков имеют N-концевой ДНК-связывающий домен, аннотированный в базе данных NCBI CDD как HTH_BltR. Таким образом, можно утверждать, что все эти белки принадлежат к подсемейству BltR. В трех из этих 45 белков, в базе данных NCBI CDD аннотирован ДНК-связывающий домен типа HTH_BmrR-like (gi: 16803170, 16800165, 116333464) и в одном белке – домен типа HTH_BmrR (gi:1160932044). Еще в шести белках аннотирован ДНК-связывающий домен HTH_MerRSF, без указания подсемейства (gi: 153856027, 153815375, 227520881, 160916222, 169347356, 154505010). В четырех из этих белков (gi: 153815375 160916222, 169347356, 154505010) впоследствии был найден сайт связывания, типичный для подсемейства BltR, что служит дополнительным аргументом в пользу отнесения этих белков к данному подсемейству. Филогенетическое дерево белков подсемейства BltR (рис. 3) не соответствует таксономическому дереву типа Firmicutes. Это позволяет предположить, что данная регуляторная система неоднократно утрачивалась в ходе эволюции или передавалась посредством горизонтального переноса. Ортологи генов транспортных белков и других белков МЛУ, регулируемых активаторами подсемейства BltR, присутствуют в гораздо более широком наборе геномов (данные не приведены), чем изученные регуляторные 13 белки. Предположительно в таких геномах экспрессия генов транспортеров МЛУ может регулироваться другими механизмами. Рисунок 3. Филогенетическое дерево регуляторов подсемейства BltR. Подписи к листьям указывают gi-идентификаторы белков. Звездочкой выделен экспериментально изученный белок BltR B. subtilits. В основу матриц позиционных весов для поиска сайтов связывания гомологов BltR был положен сайт из B. subtilis (рис. 2). Длину мотива расширили до 23 п.н. для удобства сравнения весов в дальнейшей работе с близким подсемейством регуляторов BmrR, сайты связывания которых имеют длину 23 п.н. (данные не приведены). Потенциальные сайты связывания 33 белков подсемейства BltR найдены перед 45 оперонами в 25 геномах бактерий (табл. 1). В геномах Dorea longicatena и Lactobacillus brevis не найдено сайтов связывания, а в геномах Clostridium leptum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus delbrueckii, 14 Listeria monocytogenes и Listeria innocua найденные сайты имели вес меньше порогового. Эти геномы в дальнейшем не рассматривали. Таблица 1. Регуляторы, регулируемые гены и их промоторные области. Положение промоторной области указано относительно старта трансляции. В последовательности промоторных областей элементы промотора выделены прописными буквами. Серым цветом выделены позиции сайта связывания, совпадающие с консенсусом. Alkaliphilus metalliredigens gi-идентификатор Регулиру- Вес Последовательность Регуляемого тора белка 150388453 150388452 6.41 TTGACTatagtgttacaccatacttTATTAT Alkaliphilus oremlandii 158319861 158319860 6.25 TTGACTataagataaccttatagttTATAAT Anaerostipes caccae 167746581 167746582 5.93 TTGACTttacacttactgaatacttTAAGGT Bacillus amyloliquefaciens 154685067 154685066 6.29 TTGACTatacggtaaccatatccttTATGAT Bacillus halodurans 15616608 Геном 5.82 TTGACTatcgtgttacaccacacctTAGTAT 15616607 157692587 157692588 5.72 TTGACTatggagttactccacccttTATGAT Bacillus pumilus Bacillus sp. B14905 157693118 5.50 TTTACTctagagttactccatacttTACACT 126650590 126650591 6.54 TTGACTatatagtaactatatacttTAGATT Bacillus subtilis 16079711 Bacteroides capillosus 154496178 154496179 5.71 TTGACTgtcgggttacccgatactcTATAAT Clostridium acetobutylicum 15896684 6.45 TTGACTatacggtaaccatatacctTATGAT 16079712 6.03 TTGACTatatagttacaatatccctTATTAT 15896685 164687741 164687742 6.26 TTGACTatcctgttactgaatacttTAGTAT Clostridium bartlettii 164688754 164688755 6.29 TTGACTatggagttactccatagttTATTAT - 164688081 5.15 TTGACAttaaagtaactggaaacttTACACT 160941689 160941690 6.16 TTGACTatcgggttaccctatagcaTATGAT Clostridium bolteae 160940294 160940295 5.25 TTGACTctaaagctactttatggttTATAGT 148378886 148378885 6.18 TTGACTattgagtaactctatacttTATAAT Clostridium botulinum 148379916 148379915 6.51 TTGACTataaggtaacattatagttTATGAT Clostridium butyricum 182420230 182420239 5.99 TTGACTatcctgttacaggatacctTATTAT 126698600 126698601 6.42 TTGACTatcctgttacagtatagttTATCAT Clostridium difficile 126699657 126699656 6.15 TTGACTttagggttaccagatacttTAGGAT 126699120 126699109 6.43 TTGACTatatagttactatatagctTATTAT 160881741 160881740 5.99 TTGACTatggagctactccatacttTATATT 160878259 160878260 5.66 TTGACTataagacgaccttatagttTATAAT Clostridium phytofermentans Clostridium ramosum Clostridium sp. L2-50 Clostridium spiroforme 160879754 160879755 5.89 TTGACAatatagttactatatccttTATAGT - 160880229 5.51 ATGACTatcatgtaaatttatagtaTATTGT 167754927 167755703 160894538 169351488 167754926 167754837 167755192 167755702 160894539 169351487 6.66 5.51 6.00 6.06 6.48 6.26 TTGACTataaggttaccttatagttTATCAT TTGACTatacgcttagacaatagttTAGAGT TTGACTataaggtaatcttatagttTAAGAT TTGACTttacagtaactgtagacttTATGAT TTGACTatagggttaccctatagtaTATGCT TTGACTataaggtaaccttatagtcTATTAT 169351323 169351322 5.25 TTGACAttacagttactgtatatttTATCAT 169347356 169347355 6.13 TTGACAttacagttactgtatacttTATCAT 187779436 187779437 6.51 TTGACTataaggtaacattatagttTATCAT Clostridium sporogenes - 187780222 5.46 TAGACTatataattaccatatttttTAGTAT 15 187778000 187777999 6.00 TTGACTattgagtaactccatacttTATAAT 51244047 Eubacterium dolichum 160916222 160916223 5.37 TTGATCttacagttactgtatagttTATCAT Lysinibacillus sphaericus Ruminococcus gnavus Ruminococcus torques 51244048 5.35 TTGACCatatagttactatataccgTATAAG Desulfotalea psychrophila 169829923 169829924 6.54 TTGACTatatagtaactatatacttTAAATT 169828740 6.02 TTGACTatatagttactatacagtcTAAAAT 154505010 154505009 6.13 TTGACAttacagttactgtatacttTATCAT 154504419 5.62 TTGACCatcgtcttactctatagttTATTGT 153815902 153815901 5.71 TTGACTgtacagttactgtacattaTATGAT 153815375 153815374 5.44 TTGAGTatatagtaacaatataccaTATAAT Было установлено, что палиндромный мотив связывания регулятора состоит из нечетного числа нуклеотидов. Сайт всегда располагается между элементами −35 и −10 промотора регулируемого гена. Длина промежутка между элементами промотора составляет 19 п.н., тогда как у бактерий она обычно равна 16-17 п.н. При этом центр палиндрома находится на фиксированном расстоянии (13 п.н.) от 5’-конца −35-элемента промотора. На диаграмме Лого (рис. 4) заметно, что палиндромный мотив перекрывается с −35-элементом промотора. Исходя из этого, принято правило определения значимости сайтов, найденных при повторном поиске. Однозначное взаиморасположение сайта и промотора позволяет предположить, что все регуляторы семейства BltR являются активаторами транскрипции, как и экспериментально изученный белок из B. subtilis. Рисунок 4. Диаграмма Лого промоторных областей регулируемых генов. Синими скобками отмечены элементы промотора. Красной скобкой отмечен палиндромный мотив, стрелкой показан его центр. В восьми геномах найдено более одного регулятора подсемейства BltR (рис. 5). Во всех случаях в дивергоне с геном регулятора располагается регулируемый оперон. Единственное исключение составляет геном Clostridium difficile. В нем между геном, кодирующим регулятор (gi:126699120), и потенциальным регулируемым геном cdeA расположено примерно 13000 п.н. и 10 генов. При этом ген регулятора и регулируемый оперон находятся на разных цепях ДНК. Ранее экспериментально показали, что бромистый этидий служит субстратом для MATE-транспортера CdeA, а транскрипция 16 гена cdeA стимулируется при его добавлении в среду [19]. В то же время, бромистый этидий выводится из клеток B. subtilis транспортером Bmr и является эффектором для BmrR [2]. Исходя из этого, можно предположить, что функциональность регулятора сохранилась и у C. difficile, а бромистый этидий – один из его лигандов. В геномах B. pumilus, C. bartlettii, C. phytofermentans, C. ramosum, C. sporogenes, Lysinibacillus sphaericus и Ruminococcus gnavus сайты связывания регулятора обнаружены перед оперонами, Рисунок 5. Структура BltR-зависимых регулонов. Кружками отмечены потенциальные сайты связывания регуляторов подсемейства BltR. 17 не входящими в один локус с генами регуляторов. Однако сайты, расположенные перед этими оперонами, были значимыми и аналогичными сайтам перед оперонами, расположенными в одном локусе с геном регулятора. В этом случае возможна или регуляция транскрипции таких генов регуляторами, гены которых расположены в других локусах, или потеря регуляции при сохранении сайта связывания. Если в геноме присутствует лишь один ген регулятора подсемейства BltR (как у B. pumilus, L. sphaericus и R. gnavus), то этот регулятор скорее всего связывается с данными сайтами. Если же в геноме присутствует более одного гена, кодирующего гомолог BltR (C. bartlettii, C. phytofermentans, C. ramosum и C. sporogenes), то невозможно определить, какому из них соответствует данный сайт. Поскольку число значимых сайтов в геноме не превышает числа регуляторов более чем на два, рассмотренные в работе регуляторы являются локальными. В изученных бактериальных геномах среди регулируемых генов наиболее широко представлены гены (рис. 5), кодирующие транспортеры семейства MATE (в 13 геномах), ацетилтрансферазы (в 12 геномах) и транспортеры надсемейства ABC (в 10 геномах). При этом в 9 геномах обнаружены и гены, кодирующие ацетилтрансферазы, и гены транспортеров. Ацетилтрансферазы являются близкими гомологами белка BltD из B. subtilis, и, по-видимому, также обладают спермин/спермидин-ацетилтрансферазной активностью. Гены ABC-транспортеров, как правило, расположены тандемно (рис. 5). Субстраты указанных транспортеров определяли с помощью филогенетического анализа. С этой целью были построены филогенетические деревья транспортеров обеих групп, содержащие белки, гены которых регулируются гомологами BltR, и экспериментально охарактеризованные белки (рис. 6, 7). На обоих деревьях изученные в данной работе транспортеры располагаются на отдельной ветви. Один из изученных в данной работе MATE-транспортеров CdeA (gi:126699109) из C. difficile ранее был охарактеризован экспериментально [19]. Он выводит из клетки бромистый этидий и акрифлавин и относится к Na+-антипортерам (см. табл. 2). Кроме того, бромистый этидий стимулирует транскрипцию гена этого транспортера [19]. Ближайшими экспериментально изученными гомологами для MATE-транспортеров являются белки VmrA из Vibrio parahaemolyticus [14, 28] и MepA из Staphylococcus aureus [27, 35], а для ABC-транспортеров – YdaG и YdbA (LmrCD) из Lactococcus lactis [32, 33] и RscAB из Streptococcus pyogenes [17]. VmrA и MepA, как и все транспортеры семейства MATE, относятся к транспортерам МЛУ [28]. LmrCD также является транспортером МЛУ, тогда как для RscAB эта роль только предполагается (табл. 2). Поэтому, можно предположить, что исследованные в данной работе белки семейства MATE – 18 Рисунок 6. Филогенетическое дерево транспортеров семейства MATE. Подписи к листьям указывают gi-идентификаторы белков. Черным цветом показаны экспериментально охарактеризованные белки. Синим цветом показаны белки, изученные в данной работе. Пунктиром показаны экспериментально охарактеризованные белки, изученные в данной работе. Рисунок 7. Филогенетическое дерево транспортеров надсемейства ABC. Обозначения использованы те же, что и на рис. 6. транспортеры МЛУ. Такая функция предполагается и для ABC-транспортеров, но с меньшей степенью уверенности. Интересно, транспорта. что данные MFS-транспортеры транспортеры являются используют различные H+-антипортерами, а механизмы среди MATE- транспортеров встречаются как H+, так и Na+-антипортеры. Экспериментально изученный MATE-транспортер CdeA C. difficile является Na+-антипортером [19]. Предположительно, его гомологи, исследованные в данной работе, также используют Na+-зависимый механизм транспорта. ABC-транспортеры используют энергию гидролиза АТФ. Таким образом, регуляция и функции изученных в данной работе транспортных систем, вероятно, одинаковы, несмотря на различие способов экспорта токсичных веществ. Таблица 2. Экспериментально изученные транспортеры, гомологичные исследованным в данной работе. Названия субстратов, относящихся к антибиотикам, выделены курсивом. Организм B. subtilis Белок Bmr Семейство MFS B. subtilis C. difficile V. parahaemolyticus Blt CdeA VmrA MFS MATE MATE S. aureus MepA MATE L. lactis LmrCD ABC S. pyogenes RscAB ABC Субстраты бромистый этидий, тетрафенилфосфоний, родамин 6G, акрифлавин, фторхинолоны, хлоромицетин, пуромицин, нетропсин, доксорубицин то же и спермидин бромистый этидий, акрифлавин бромистый этидий, тетрафенилфосфоний, акривлавин, 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) бромистый этидий, тетрафенилфосфоний, DMG-MINO, тигециклин, ципрофлоксацин, норфлоксацин, пентамидин, хлористый бензалконий, цетримид, хлоргексидин, деквалиний, акрифлавин, кристаллический фиолетовый, 4,6-диамидино-2фенилиндол, Hoechst 33342, пиронин Y, родамин 6G, триметиламмоний-1,6-дифенил1,3,5-гексатриен (TMA-DPH) бромистый этидий, даунорубицин, 2′,7′‑бис(карбоксиэтил)-5(6)карбоксифлуоресцеин, пентаацетоксиметиловый эфир (BCECF-AM), Hoechst 33342, родамин 6G, холевая кислота Не исследованы Ссылка 3, 38, 39 3, 57 19 14, 28 27, 35 32, 33 17 Регуляция ацетилтрансфераз, гомологичных BltD B. subtilis, в 12 геномах из 25 позволяет предположить, что изученная регуляторная система имеет отношение к 20 метаболизму полиаминов в грамположительных бактериях. Возможно, регулируемые транспортеры могут выводить спермидин из клетки, подобно Blt. Состав изученных регулонов позволяет предположить наличие связи между системами МЛУ и метаболизма полиаминов у бактерий типа Firmicutes. Изучение этой связи представляет собой тему для дальнейшего исследования. 6.2 Задача 2 Гомологи регулятора Fur были обнаружены во всех 12 исследуемых геномах энтеробактерий. Филогенетическое дерево этих белков приведено на рис. 8. Мотив связывания Fur представляет собой нестрогий палиндром длины 19 п.н. Помимо палиндромности данный мотив обладает внутренней сдвиговой симметрией: консенсусная последовательность нуклеотидов GATAAT повторяется с 1 по 6 и с 7 по 12 позиции (рис. 9). Вследствие этого в большинстве случаев потенциальные сайты связывания Fur расположены тандемно со сдвигом 6 п.н. друг относительно друга. Веса сайтов в тандеме могут сильно отличаться друг от друга. Тем не менее, остается неясным, действительно ли сайты Fur расположены тандемно и перекрываются друг с другом, или они распознаются таким образом вследствие сдвиговой симметрии. Рисунок 8. Филогенетическое дерево регуляторов транскрипции Fur в энтеробактериях. Подписи к листьям указывают идентификаторы Locus Tag соответствующих генов. 21 Рисунок 9. Диаграмма Лого сайтов связывания регулятора транскрипции Fur в энтеробактериях. В результате поиска сайтов установлено, что наиболее часто встречающимися членами регулона Fur в энтеробактериях являются АТФ-зависимые системы транспорта железа в клетку и системы биосинтеза сидерофоров. В шести геномах (E. coli, Salmonella typhimurium, Enterobacter sp. 638, Edwardsiella tarda, Proteus mirabilis и Photorhabdus luminescens) найдены сайты перед самим геном Fur, что является свидетельством его авторегуляции. Вопреки ожиданиям, не было выявлено ни одного оперона, регуляция которого была бы консервативна во всех 12 геномах. Лишь гены fur, gpmA (кодирует фосфоглицератмутазу), ptrB (протеаза II), sapABCDF и oppABCDF (транспортеры пептидов) присутствуют во всех геномах, но не во всех геномах перед ними найдены сайты. Наиболее консервативными членами регулона Fur (найдены сайты в 9 и более геномах из 12) являются гены ABC-транспортеров железа hemPRSTUV, sitABCD, fhuCDB, feoABC, yiuABC; энергетического комплекса exbBD, транспортера ионов Fe2+ и Mn2+ mntH, супероксиддисмутазы yjjZ, гены сборки Fe-S кластера sufABCDE, ферритинов ftnA и bfr, и ферредоксина bfd. Отсутствие строгой консервативности регуляции генов можно объяснить наличие многих генов со схожими функциями в геномах и взаимозаменяемостью компонентов систем (предположительно, различные внешние мембранные рецепторы могут взаимодействовать с различными ABC-транспортерами). В число регулируемых АТФ-зависимых транспортеров входят hemPRSTUV, yijD-ycdOB, fhuACDB, feoABC, fepDGC, yiuABC, feuIRABCD, eitABC, iroDCDE, fatBCDE. Гены внешних мембранных рецепторов сидерофоров могут быть расположены как в одном опероне с генами ABC-транспортеров (hemR, fhuA,fhuE) или генами биосинтеза сидерофоров (cjrC, phuA, fuyA, fepA, pvuA, iutA), так и отдельно от них (yncD, fcuA, cfrA, cirA, foxR, fhuE, fyuA, iroN, hasR, ireA, foxA). Регулируемые гены биосинтеза сидерофоров включают в себя ysuJIGH, entCEBA-ybdB, entFA, phbH, irp2-nrpSUT, iucABCD-iutA. Ген, кодирующий регулятор NsrR обнаружен в геномах бактерий, входящих во все три исследуемых класса: в 20 геномах альфа-протеобактерий, 43 геномах бета22 протеобактерий и 74 геномах гамма-протеобактерий. Однако в альфа-протеобактериях этот транскрипционный фактор представлен только в некоторых видах из каждого изученного семейства. На филогенетическом дереве NsrR (рис. 10) видны свидетельства многочисленных горизонтальных переносов – когда на одной ветке располагаются белки, принадлежащих бактериям разных классов. В бета-протеобактериях регулятор NsrR обнаружен в большинстве геномов, в том числе – во всех исследуемых геномах групп Ralstonia и Burkholderia. В гамма-протеобактериях NsrR регулон отсутствует в группах Pasteurellales, Pseudomonadaceae и Xanthomonadales. В число наиболее часто регулируемых генов входят: в альфа-протеобактериях – nsrR и hmp (кодирует диоксигеназу окиси азота); в бета-протеобактериях – hmp, nsrR и hcp-hcr (кодирует Рисунок 10. Филогенетическое дерево регуляторов транскрипции NsrR в протеобактериях. 23 гидроксиламинредуктазу), в гамма-протеобактериях – hmp, nsrR, hcp-hcr, nnrS и dnrN (предположительно – гены устойчивости к окиси азота). Ген регулятора нередко образует дивергон с регулируемым опероном. В этих случаях возможна и авторегуляция NsrR, т.к. для данного фактора транскрипции она была показана ранее [53]. Рисунок 11. Диаграммы Лого сайтов связывания регулятора транскрипции NsrR A – в альфапротеобактериях, Б – в бета-протеобактериях, В – в гамма-протеобактериях. Регуляторы транскрипции NorR обнаружены в 14 геномах бета-протеобактерий и в 47 геномах гамма-протеобактерий (не обнаружены в группах Pasteurellales, Moraxellaceae и Xanthomonadales), но не в геномах альфа-протеобактерий. Так же, как и в случае с NsrR, на филогенетическом дереве регуляторов заметны свидетельства горизонтальных переносов генов norR. Сайты связывания данного регулятора расположены с группах по 2-3 сайта. Действительно, для активации транскрипции с σ54-зависимого промотора необходимо образование гексамера активаторов транскрипции, которые связываются в виде димеров с каждым палиндромным ДНК-сайтом [10]. Ген norR, как правило, дивергентно транскрибируется с регулируемым им опероном. Его экспрессия негативно 24 регулируется путем связывания его продукта, NorR, с теми же сайтами связывания. В случаях, когда обнаружено два сайта, третий, предположительно, имел вес ниже порогового. Наличие слабых сайтов можно объяснить белок-белковым взаимодействием внутри гексамера NorR, которое может компенсировать слабое взаимодействие регулятора с ДНК. На диаграмме Лого (рис. 11) видно, что в мотиве связывания NorR насчитывается лишь две (в бета-протеобактериях) или три (в гамма-протеобактериях) пары высококонсервативных позиций. В бета-протеобактериях данным фактором транскрипции регулируются гены редуктазы окиси азота norAB (преимущественно в группе Ralstonia) и hmp (в Burkholderia и Comamonadaceae). В гамма-протеобактериях наиболее консервативными членами регулона являются гены редуктазы окиси азота norVW (в Enterobacteriales, Psychromonadaceae/Aeromonadales), Vibrionales, norB (в Shewanellaceae Shewanellaceae), hmp и nnrS Pseudomonadaceae и Alteromonadales) и hcp-hcr (в Vibrionales). Рисунок 12. Филогенетическое дерево регуляторов транскрипции NorR в бета- и гаммапротеобактериях. 25 и (в Рисунок 13. Диаграммы Лого сайтов связывания регулятора транскрипции NorR A – в бетапротеобактериях, Б – в гамма-протеобактериях. Регуляторы транскрипции NnrR обнаружены лишь в 17 геномах альфа- протеобактерий, 10 из которых входят в группу Rhizobiales. Возможно, в других видах альфа-протеобактерий произошла утрата этой регуляторной системы. Мотив связывания NnrR имеет четную длину (рис. 14) Экспрессия NnrR подвержена авторегуляции, как и в случаях NsrR и NorR. Регулон NnrR насчитывает от двух до одиннадцати регулируемых оперонов. Консервативными членами регулона являются гены денитрификации: norQCDB (редуктаза окиси азота), nirKV (нитритредуктаза), nnrS, norE (оксидаза цитохрома C, необходимая для функционирования Nor), nosRZDFYLX (редуктаза закиси азота). Также в регулон входят гены протеазы, и оксидазы hemN, участвующей в метаболизме порфиринов. Рисунок 14. Диаграмма Лого сайтов связывания регулятора транскрипции NnrR в альфапротеобактериях. 26 Рисунок 15. Филогенетическое дерево регуляторов транскрипции NnrR в альфапротеобактериях. 27 7 Выводы 1 Реконструкция регулонов транскрипционных факторов подсемейства BltR показала, что большинство регулируемых генов кодируют транспортеры МЛУ надсемейств ABC, MFS и семейства MATE, а также спермин/спермидин-ацетилтрансферазы. Всего было реконструировано 33 регулона в 25 геномах бактерий. 2 Идентифицированы регуляторы: Fur – в 12 геномах энтеробактерий, NsrR – в 137 геномах протеобактерий, NorR – в 61 геноме бета- и гамма-протеобактерий, NnrR – в 17 геномах альфа-протеобактерий. Филогенетический анализ показал наличие горизонтальных переносов регуляторных систем NsrR и NorR в протеобактериях. 3 Транскрипционные факторы Fur, NsrR, NorR и NnrR нередко регулируют транскрипцию собственных генов (авторегуляция). 4 Для потенциальных сайтов связывания Fur характерно их расположение парами на расстоянии 6 п.н. друг от друга при длине сайта 19 п.н. В Fur регулон в энтреробактериях входят гены ABC-транспортеров железа, биосинтеза сидерофоров, гены ферритинов и ферредоксинов. 5 В NsrR регулон в протеобактериях входят гены: редуктаз и диоксигеназ окиси азота, гидроксиламинредуктаз и другие возможные гены устойчивости к оксидам азота. 6 Сайты связывания NorR располагаются группами по три с характерным расстоянием 23-25 п.н. между соседними сайтами. В NorR регулон в бета- и гамма-протеобактериях входят гены редуктаз окиси азота, диоксигеназ окиси азота и гидроксиламинредуктаз. 7 В NnrR регулон в альфа-протеобактериях входят гены денитрификации: редуктаз окиси и закиси азота, нитритредуктаз, а также протеаз. 8 Список использованных источников 1. Миронов А.А., Винокурова Н.П., Гельфанд М.С. Программное обеспечение анализа бактериальных геномов // Молекулярная биология – 2000, т. 34 – № 2 – с. 253-262. 2. Ahmed M., Borsch C.M., Taylor S.S., Vazquez-Laslop N., Neyfakh A.A. A Protein That Activates Expression of a Multidrug Efflux Transporter upon Binding the Transporter Substrates // The Journal of Biological Chemistry – 1994, Vol. 269 – № 45 – pp. 2850628513. 3. Ahmed M., Lyass L., Markham P.N., Taylor S.S., Vazquez-Laslop N., Neyfakh A.A. Two Highly Similar Multidrug Transporters of Bacillus subtilis Whose Expression Is Differentially Regulated // Journal of Bacteriology - 1995, Vol. 177 – № 14 – pp. 39043910. 4. Altschul S.F., Madden T.L., Schäffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. & Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Research – 1997, № 25 – pp. 3389-3402. 5. Bailey T.L., Elkan C. Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers // Proceedings of the International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology – 1994, Vol. 2, pp. 28-36. 6. Baranova N.N., Danchin A., Neyfakh A.A. Mta, a global MerR-type regulator of the Bacillus subtilis multidrug-efflux transporters // Molecular Microbiology – 1999, № 31 – pp. 1549-1559. 7. Beaumont H.J., Lens S.I., Reijnders W.N., Westerhoff H.V., van Spanning R.J. Expression of nitrite reductase in Nitrosomonas europaea involves NsrR, a novel nitrite-sensitive transcription repressor // Molecular Microbiology – 2004, Vol. 254 – № 1 – pp. 148-158. 8. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank // Nucleic Acids Research – 2008, № 36 (Database issue) – pp. D25-D30. 9. Büsch A., Pohlmann A., Friedrich B., Cramm R. A DNA region recognized by the nitric oxide-responsive transcriptional activator NorR is conserved in beta- and gammaproteobacteria // Journal of Bacteriology – 2004, Vol. 186 – № 23 – pp. 7980-7987. 10. Bush M., Ghosh T., Tucker N., Zhang X., Dixon R. Nitric oxide-responsive interdomain regulation targets the σ54-interaction surface in the enhancer binding protein NorR // Molecular Microbiology – 2010, Vol. 77 – № 5 – pp. 1278-1288. 11. Carpenter B.M., Whitmire J.M., Merrell D.S. This is not your mother's repressor: the complex role of fur in pathogenesis // Infection and Immunity – 2009, Vol. 77 – № 7 – pp. 2590-2601. 12. Carper S.W., Willis D.G., Manning K.A., Gerner E.W. Spermidine acetylation in response to a variety of stresses in Escherichia coli // The Journal of Biological Chemistry – 1991, Vol. 266 – № 19 – pp. 12439-12441. 13. Changela A., Chen K., Xue Y., Holschen J., Outten C.E., O'Halloran T.V., Mondragón A. Molecular basis of metal-ion selectivity and zeptomolar sensitivity by CueR. // Science – 2003, Vol. 301 – № 5638 – pp. 1383-1387. 14. Chen J., Morita Y., Huda M.N., Kuroda T., Mizushima T., Tsuchiya T. VmrA, a member of a novel class of Na(+)-coupled multidrug efflux pumps from Vibrio parahaemolyticus // Journal of bacteriology – 2002, Vol. 184 – № 2 – pp. 572-576. 15. Chu B.C., Garcia-Herrero A., Johanson T.H., Krewulak K.D., Lau C.K., Peacock R.S., Slavinskaya Z., Vogel H.J. Siderophore uptake in bacteria and the battle for iron with the host; a bird's eye view // Biometals – 2010, Vol.23 – № 4 – pp. 601-611. 16. Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.M., Brenner S.E. WebLogo: A sequence logo generator // Genome Research – 2004, Vol.14 – № 6 – pp. 1188-1190. 17. Dalton T.L., Collins J.T., Barnett T.C., Scott J.R. RscA, a member of the MDR1 family of transporters, is repressed by CovR and required for growth of Streptococcus pyogenes under heat stress // Journal of Bacteriology – 2006, Vol.188 – № 1 – pp. 77-85. 18. Dehal P.S., Joachimiak M.P., Price M.N., Bates J.T., Baumohl J.K., Chivian D., Friedland G.D., Huang K.H., Keller K., Novichkov P.S., Dubchak I.L., Alm E.J., Arkin A.P. MicrobesOnline: an integrated portal for comparative and functional genomics // Nucleic Acids Research – 2010, № 38 (Database issue) – pp. D396-D400. 19. Dridi L., Tankovic J., Petit J.C. CdeA of Clostridium difficile, a new multidrug efflux transporter of the MATE family // Microbial Drug Resistance – 2004, Vol. 10 – № 3 – pp. 191-196. 20. Dunn A.K., Karr E.A., Wang Y., Batton A.R., Ruby E.G., Stabb E.V. The alternative oxidase (AOX) gene in Vibrio fischeri is controlled by NsrR and upregulated in response to nitric oxide // Molecular Microbiology – 2010, Vol. 77– № 1 – pp. 44-55. 21. Edgar, R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput // Nucleic Acids Research – 2004, Vol. 32 – № 5 – pp. 1792-1797. 22. Felsenstein, J. PHYLIP - Phylogeny Inference Package (Version 3.2) // Cladistics – 1989, № 5 – pp. 164-166. 23. Godsey M.H., Baranova N.N., Neyfakh A.A., Brennan R.G. Crystal Structure of MtaN, a Global Multidrug Transporter Gene Activator // The Journal of Biological Chemistry – 2001, Vol. 276 – № 50 – pp. 47178-47184. 30 24. Gralla J.D., Collado-Vides J. Organization and function of transcription regulatory elements // In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology. – Washington, D.C.: ASM Press, 1996, pp. 1232—1245. 25. Grkovic S., Brown M.H., Skurray R.A. Regulation of Bacterial Drug Export Systems // Microbiology and Molecular Biology Reviews – 2002, Vol. 66 – № 4 – pp. 671-701. 26. Johnston A.W., Todd J.D., Curson A.R., Lei S., Nikolaidou-Katsaridou N., Gelfand M.S., Rodionov D.A. Living without Fur: the subtlety and complexity of iron-responsive gene regulation in the symbiotic bacterium Rhizobium and other alpha-proteobacteria // Biometals – 2007, Vol. 20 – № 3-4 – pp. 501-511. 27. Kaatz G.W., McAleese F., Seo S.M. Multidrug resistance in Staphylococcus aureus due to overexpression of a novel multidrug and toxin extrusion (MATE) transport protein // Antimicrobial Agents and Chemotherapy – 2005, Vol. 49 – № 5 – pp. 1857-1864. 28. Kuroda T., Tsuchiya T. Multidrug efflux transporters in the MATE family // Biochimica et Biophysica Acta – 2009, Vol. 1794 – № 5 – pp. 763-768. 29. Lawrence C.E., Altschul S.F., Boguski M.S., Liu J.S., Neuwald A.F., Wootton J.C. Detecting subtle sequence signals: a Gibbs sampling strategy for multiple alignment // Science – 1993, Vol. 262– № 5131– pp. 208-214. 30. Lin H.Y., Bledsoe P.J., Stewart V. Activation of yeaR-yoaG operon transcription by the nitrate-responsive regulator NarL is independent of oxygen- responsive regulator Fnr in Escherichia coli K-12 // Journal of Bacteriology – 2007, Vol. 189 – № 21 – pp. 75397548. 31. De Lorenzo V., Wee S., Herrero M., Neilands J.B. Operator sequences of the aerobactin operon of plasmid ColV-K30 binding the ferric uptake regulation (fur) repressor // Journal of Bacteriology – 1987, Vol. 169 – № 6 – pp. 2624-2630. 32. Lubelski J., de Jong A., van Merkerk R., Agustiandari H., Kuipers O.P., Kok J., Driessen A.J.M. LmrCD is a major multidrug resistance transporter in Lactococcus lactis // Molecular Microbiology – 2006, Vol. 61 – № 3 – pp. 771-781. 33. Lubelski J., Mazurkiewicz P., van Merkerk R., Konings W.N., Driessen A.J.M. ydaG and ydbA of Lactococcus lactis encode a heterodimeric ATP-binding cassette-type multidrug transporter // The Journal of Biological Chemistry – 2004, Vol. 279 – № 33 – pp. 3444934455. 34. Markham P.N., Neyfakh A.A. Efflux-mediated drug resistance in Gram-positive bacteria // Current Opinion in Microbiology – 2001, Vol. 4 – № 5 – pp. 509-514. 35. McAleese F., Petersen P., Ruzin A., Dunman P.M., Murphy E., Projan S.J., Bradford P.A. A novel MATE family efflux pump contributes to the reduced susceptibility of 31 laboratory-derived Staphylococcus aureus mutants to tigecycline // Antimicrobial Agents and Chemotherapy – 2005, Vol. 49 – № 5 – pp. 1865-1871. 36. Mironov A.A., Koonin E.V., Roytberg M.A., Gelfand M.S. Computer analysis of transcription regulatory patterns in completely sequenced bacterial genomes // Nucleic Acids Research – 1999, Vol. 27 – № 14 – pp. 2981-2989. 37. Newberry K.J., Brennan R. G. The structural mechanism for transcription activation by MerR family member multidrug transporter activation, N terminus // The Journal of Biological Chemistry – 2004, Vol. 279 – № 19 – pp. 20356-20362. 38. Neyfakh A.A The Multidrug Efflux Transporter of Bacillus subtilis Is a Structural and Functional Homolog of the Staphylococcus NorA Protein // Antimicrobial Agents and Chemotherapy – 1992, Vol. 37 – № 1 – pp . 484-485. 39. Neyfakh A.A, Bidnenko V.E., Chen L.B. Efflux-mediated multidrug resistance in Bacillus subtilis: Similarities and dissimilarities with the mammalian system // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA – 1991, Vol. 88 – № 11 – pp. 4781-4785. 40. Novichkov P.S., Rodionov D.A., Stavrovskaya E.D., Novichkova E.S., Kazakov A.E., Gelfand M.S., Arkin A.P., Mironov A.A., Dubchak I. RegPredict: an integrated system for regulon inference in prokaryotes by comparative genomics approach // Nucleic Acids Research – 2010, № 38 (Web Server issue) – pp. W299-W307. 41. Panina E.M., Mironov A.A., Gelfand M.S. Comparative analysis of FUR regulons in gamma-proteobacteria // Nucleic Acids Research – 2001, Vol. 29 – № 24 – pp. 51955206. 42. Paulsen I.T, Chen J., Nelson K.E., Saier M.H. Comparative Genomics of Microbial Drug Efflux Systems // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology – 2001, Vol. 3 – № 2 – pp. 145-150. 43. Pohlmann A., Cramm R., Schmelz K., Friedrich B. A novel NO-responding regulator controls the reduction of nitric oxide in Ralstonia eutropha // Molecular Microbiology – 2000, Vol. 38 – № 3 – pp. 626-638. 44. Rodionov D.A. Comparative Genomic Reconstruction of Transcriptional Regulatory Networks in Bacteria // Chemical Reviews – 2007, Vol. 107 – № 8 – pp. 3467-3497. 45. Rodionov D.A., Dubchak I.L., Arkin A.P., Alm E.J., Gelfand M.S. Dissimilatory metabolism of nitrogen oxides in bacteria: comparative reconstruction of transcriptional networks // PLoS Computational Biology – 2005, Vol. 1 – № 5 – pp. e55. 46. Rodionov D.A., Gelfand M.S., Todd J.D., Curson A.R., Johnston A.W. Computational reconstruction of iron- and manganese-responsive transcriptional networks in alphaproteobacteria // PLoS Computational Biology – 2006, Vol. 2 – № 12 – pp. e163. 32 47. Shah P., Swiatlo E. A multifaceted role for polyamines in bacterial pathogens // Molecular Microbiology – 2008, Vol. 68 – № 1 – pp. 4-16. 48. Spiro S. Nitric oxide-sensing mechanisms in Escherichia coli // Biochemical Society Transactions – 2006, Vol. 34 – part 1 – pp. 200-202. 49. Tabor C.W., Tabor H. Polyamines in microorganisms // Microbiological Reviews – 1985, Vol. 49 – № 1 – pp. 81-99. 50. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Molecular Biology and Evolution – 2011, Epub ahead of print. 51. Tosques I.E., Shi J., Shapleigh J.P. Cloning and characterization of nnrR, whose product is required for the expression of proteins involved in nitric oxide metabolism in Rhodobacter sphaeroides 2.4.3 // Journal of Bacteriology – 1996, Vol. 178 – № 16 – pp. 4958-4964. 52. Tucker N.P., Hicks M.G., Clarke T.A., Crack J.C., Chandra G., Le Brun N.E., Dixon R., Hutchings M.I. The transcriptional repressor protein NsrR senses nitric oxide directly via a [2Fe-2S] cluster // PLoS One – 2008, Vol. 3 – № 11 – pp. e3623. 53. Tucker N.P., Le Brun N.E., Dixon R., Hutchings M.I. There's NO stopping NsrR, a global regulator of the bacterial NO stress response // Trends in Microbiology – 2010, Vol. 18 – № 4 – pp. 149-156. 54. Ward A., Hoyle C., Palmer S., O’Reilly J., Griffith J., Pos M., Morrison S., Poolman B., Gwynne M., Henderson P. Prokaryote Multidrug Efflux Proteins of the Major Facilitator Superfamily: Amplified Expression, Purification and Characterisation // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology – 2001, Vol. 3 – № 2 – pp. 193-200. 55. Watanabe S., Kita A., Kobayashi K., Miki K. Crystal structure of the [2Fe-2S] oxidativestress sensor SoxR bound to DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA – 2008, Vol. 105 – № 11 – pp. 4121-4126. 56. Woolridge D.P., Martinez J.D., Stringer D.E., Gerner E.W. Characterization of a novel spermidine/spermine acetyltransferase, BltD, from Bacillus subtilis. // Biochemical Journal – 1999, № 340 – pp. 753-758. 57. Woolridge D.P., Vazquez-Laslop N., Markham P.N., Chevalier M.S., Gerner E.W., Neyfakh A.A. Efflux of the natural polyamine spermidine facilitated by the Bacillus subtilis multidrug transporter Blt // Journal of Biological Chemistry – 1997, Vol. 272 – № 14 – pp. 8864-8866. 33 58. Wortham B.W., Patel C.N., Oliveira M.A. Polyamines in Bacteria: Pleiotropic Effects yet Specific Mechanisms // In: The Genus Yersinia. – New York, Springer, 2007 – pp. 106115. 59. Zheleznova-Heldwein E.E., Brennan R.G. Crystal structure of the transcription activator BmrR bound to DNA and a drug // Nature – 2001, Vol. 409 – pp. 378–382. 60. Zheleznova E.E., Markham P.N., Neyfakh A.A., Brennan R.G. Structural basis of multidrug recognition by BmrR, a transcription activator of a multidrug transporter // Cell – 1999, Vol. 96 – №3 – pp. 353-362. 34