- EcoPlant

Лекция 3. Ферментативная кинетика сложных биохимических реакций
Введение
Система Михаэлиса-Ментен представляет собой простейшую реалистическую фермент-субстратную реакцию. Однако в клетке широко распространены наиболее сложные системы, которые могут быть описаны за счет простых стехиометрических формул, описывающие
отдельные стадии. Конечно некоторые системы не могут быть описаны в результате простого суммирования отдельных реакций, так как в биологических системам наблюдаются колебательные явления и различные возмущения, чему будут посвящены отдельные лекции.
Часть А. Система фермент-субстрат-ингибитор
Действие ферментов можно полностью или частично подавить (ингибировать) определенными химическими веществами (ингибиторами). По характеру действия ингибиторы могут
быть обратимыми и необратимыми. В основе этого деления лежит прочность соединения ингибитора с ферментом. По характеру места связывания ингибиторы делятся на два типа: первые связываются с ферментом в активном центре, вторые — в удаленном от активного центра месте, при этом происходит блокирование функциональной группы молекулы фермента,
необходимой для проявления его активности.
Обратимое ингибирование.
Обратимость ингибирования может быть проверена несложными экспериментами. Если после отделения ингибитора от фермента или после уменьшения концентрации ингибитора
разбавлением реакционной смеси активность фермента восстанавливается, значит имеет место случай обратимого ингибирования. Существует два типа обратимых ингибиторов — конкурентные и неконкурентные. К примерам конкурентного ингибирования можно отнести
реакции, в которых участвует фермент (E) с одним связывающим центром, за который конкурируют два субстрата. В этом случае фермент образует один из двух возможных комплексов, каждый из которых распадается, давая один из продуктов и исходный фермент. Когда
один субстрат связывается с ферментом, это фактически означает, что он ингибирует реакцию другого субстрата с этим ферментом. Схематически эти реакции могут быть представле-
ны в следующей схеме:
k1
k2
S + E ↔ ES → PS + E (1)
k3
k4
I + E ↔ EI → PI + E
(2)
Когда два субстрата конкурируют за один и тот же центр фермента, то представленную выше
систему реакций называют полностью конкурентной. Считается, что конкуренция двух
субстратов за активный центр происходит вследствии сходных структур двух субстратов.
Образование (EI) уменьшает число молекул свободного фермента, и скорость реакции снижается. Связывание лигандов (S) и (I) с ферментом (E) происходит взаимоисключающим образом, образуется либо (ES), либо (EI). Так как конкурентный ингибитор обратимо связывается с ферментом, то можно сдвинуть равновесие реакции E + I → EI влево простым увеличением концентрации субстрата.
Например. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) — фермент, который дегидрирует сукцинат,
превращая его в фумарат:
Сукцинат + СДГ<-->СДГ • сукцинат —>СДГ + фумарат
Реакция подавляется малоновая кислота за счет связывания с сукцинатдегидрогеназа
Малонат + СДГ<-->±СДГ • малонат
Ингибирование СДГ малонатом можно устранить, повысив концентрацию сукцината.
В случае неконкурентного ингибитора увеличение концентрации субстрата не препятствует связыванию ингибитора. Неконкурентный ингибитор взаимодействует с ферментом в
участке, отличном от активного центра. Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата. Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что
приводит к снижению скорости ферментативной реакции. Кинетическая зависимость неконкурентного ингибирования представлена на рис.1.
Рис. 1. Влияние неконкурентного ингибитора на скорость ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата. Vmax - максимальная скорость реакции в отсутствие ингибитора; 'Vmax - максимальная скорость
реакции в присутствии ингибитора; Кm - константа Михаэлиса в отсутствие ингибитора; 'Кm - константа Михаэлиса в присутствии ингибитора (Биохимия: Под ред. Е.С. Северина., 2003.).
Необратимое ингибирование
Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, в результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.
К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg2+), серебра (Ag+) и мышьяка (As3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные
группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой
молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.
Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения механизма действия ферментов. С этой целью применяют вещества, блокирующие определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими.
Часть Б. Аллостерические ферменты и модель Моно-Уаймена-Шанже
Большинство ферментов имеют более одного связывающего центра для молекулы субстрата
(лиганда). Например гемоглобин имеет четыре связывающих центра для кислорода. В этом
случае, реакция между ферментом и субстратом называется кооперативным явлением, так
как одна молекула фермента связывает одну молекулу субстрата в одном активном центре,
другую молекулу субстрата в другом. Можно предположить, что молекула фермента, связывая один лиганд, образует один комплекс, а затем, связывая второй лиганд, образует второй
комлекс. Первый комплекс распадается с образованием свободного фермента и продукта, тогда как комплекс с двумя лигандами распадается с образованием комплекса с одним лигандом и продукта. Схематически эти реакции могут быть представлены в следующей схеме:
S + E ↔ С1 → P + E
(3)
S + C1↔ C2 → P + C1 (4)
График зависимости начальной скорости от концентрации субстрата имеет вид, показанный
на рис.2.
V
S
Рис.2. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата
S - образный характер этого графика отличается от простого случая фермент-субстрат теории
Михаэлиса-Ментен. Кривая типична для кооперативных явлений и по характеру кривой
можно определить реакцию кооперативного явления.
Для некоторых ферментов с несколькими связывающими центрами связывание лиганда одним центром может влиять на активность другого центра. Считается, что этот кооперативный эффект вызван конформационными изменениями молекулы фермента. Эффект влияния
одного лиганда на связывания другого носит название аллостерический эффект, а фермент,
проявляющий это свойство - аллостерическим ферментом.
Аллостерические эффекты опосредуются субстратом или ингибиторами и активаторами (аллостерическими эффекторами). Последние связываются со специфическими участками вне
активного центра и приводят к конформационным изменениям белка, попутно изменяя его
активность. В аллостерических системах сродство фермента к субстрату зависит от концентрации субстрата [S]. В этом случае вместо константы Михаэлиса (Km) указывают концентрацию субстрата при половине максимальном скорости ([S] 0.5). Аллостерические эффекторы влияют на максимальную скорость реакции V, концентрацию субстрата ( [S] 0.5) при скорости реакции, равной половине максимальной, и коэффициент Хилла (h).
Коэффициент Хилла ― безразмерная величина, характеризующая кооперативность
связывания лиганда ферментом или рецептором. Положительная кооперативность
характеризуется тем, что при присоединении лиганда к одному из активных центров
фермента присоединение последующих лингандов к остальным активным центрам
облегчается.
Коэффициент Хилла может принимать следующие значения:
h > 1 — Положительный кооперативный эффект: Присоединение одной молекулы лиганда к
активному центру фермента увеличивает сродство к лиганду остальных активных центров.
h < 1 — Отрицательный кооперативный эффект: Присоединение одной молекулы лиганда к
активному центру фермента уменьшает сродство к лиганду остальных активных центров.
h = 1 — Отсутствие кооперативного эффекта: Сродство фермента к лиганду не зависит от
уже присоединённых молекул лиганда.
Если изменяется преимущественно скорость реакции, говорят о «V-системе». В системах,
когда аллостерические эффекторы влияют на сродство фермента к субстрату и коэффициент
Хилла, говорят о «К-системе».
В 1965 г. Моно, Уаймен и Шанже предложили теорию аллостерического поведения. В теории предполагается, что аллостерический фермент содержит конечное, относительно небольшое число идентичных субедениц (n), которые называются протомерами, а сам фермент
— олигомер. Считается, что фермент построен из протомеров таким образом, что они занимают эквивалентное положения на аллостерической молекуле (симметричны оси). Предполагается, что фермент существует по крайней мере в двух активных состояниях, которые обратимо достижимы. Считается, что сродство одного из специфических центров к лиганду меняется, когда происходит переход от одного состояния фермента к другому, что вероятно
связано с конформационным изменением молекулы фермента.
На основе вышеописанных предположений рассмотрим простейшую модель, когда аллостерический фермент имеет два достижимых состояния, которые взаимодействуют с различной
степенью сродства с одним лигандом, обозначенным S. Два состояния фермента без лиганда
мы обозначим R (от англ. relaxed — расслабленное) и T (от англ. tense — напряженное), и
k+
предположим, что переход R0 ↔ T0 является равновесным с константой равновесия L. Это
kозначает, что реакция R T соответсвуент стационарному состоянию, где L = k+/k-. Константа
стационарного состояния L называется аллостерической константой.
Важной величиной в аллостерическом эффекте является функция насыщения Y. Это число,
определенное как доля центров, связанных в данный момент с лигандом. При Y=0, все центры фермента свободны, при Y=1, все центры связанны.
Фермент может образовывать комплекс с присоединением к нему r лигандов, обозначенные
Rr и Tr, где r = 1, ..., n. Предположим, что связывание лиганда с одним активным центром не
зависит от связывания другого лиганда с другим центром и константа диссоциации ферментсубстратного комплекса в состояниях R и T всегда равны (KR=KT).
Схематически эти реакции могут быть представлены в следующей схеме:
R0 ↔ T0
(5)
S + Rr ↔ Rr+1
(6)
S +Tr ↔ Tr+1
(7)
Еще раз отметим, что аллостерический эффект в этом случае не является прямым, т.е. присоединение молекулы субстрата к Ri непосредственно не влияет на реакуию Ti с субстратом. В
этом случае насыщение Y определяется формулой
(8)
Сделав ряд преобразований и обозначив α = S/KR и c = KR/KT формула насыщения принимает
вид, который позволяет определять насыщение фермента используя конкрентную величину
аллостерической констранты и констант диссоциации фермент-субстратного комплекса.
(9)
Выражение для насыщения Y - один из важных результатов модели Моно-Уаймена-Шанже
поведения аллостерического фермента. Определение значений Y позволяет строить зависимость протекания скорости биохимических реакций с участием аллостерических ферментов
и белков. Например насыщения гемоглобина кислородом.
Рис.3. Кривая насыщения гемоглобина кислородом
В 1972 г. Уаймен представил результаты для кривых насыщения при соединении кислорода
с гемоглобином у форели. Они мели явные S – образные характеристики, которые согласовались с приведенной выше аллостерической моделью.
Использованная литература
Биохимия. Под ред. Е.С. Северина., 2003.
Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000. 469 с. 768с.
Куценко С. А. Основы токсикологии. Санкт-Петербург, 2002 г. 720с.
Марри Дж. Нелинейные дифференциальные уравнения в биологии. Лекции о моделях.
М.:Мир.1983. 397с.