ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи МАКСИМОВА Юлия Геннадьевна ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: чл.-корр. РАН, профессор, доктор медицинских наук Демаков Виталий Алексеевич Пермь – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………..6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………………….21 ГЛАВА 1. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ……………………………...21 1.1. Метаболизм нитрилов у микроорганизмов……………………………………..27 1.2. Биокаталитическое получение амидов и карбоновых кислот из нитрилов……………………………………………………………………………40 1.3. Иммобилизация клеток нитрилгидролизующих бактерий для целей биокатализа и биодеградации…………………………………………….45 1.4. Иммобилизованные ферменты метаболизма нитрилов………………………..60 1.5. Физиология иммобилизованных микроорганизмов……………………………75 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………...86 2.1. Бактериальные штаммы и среды культивирования……………………………86 2.2. Условия культивирования бактерий в жидких питательных средах и определение ростовых характеристик………………………………………….87 2.3. Культивирование бактерий в присутствии носителей…….…………………..87 2.4. Носители для иммобилизации бактериальных клеток и ферментов……........88 2.5. Определение гидрофобности поверхности носителей и бактериальных клеток…………………………………………………………94 2.6. Реактивы………………………………………………………………………......94 2.7. Определение нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей и эффективности функционирования иммобилизованной системы…………...95 2.8. Определение массы адгезированных бактериальных клеток…………………96 2.9. Определение операционной стабильности иммобилизованных биокатализаторов………………..………………………………………..……...97 2.10. Получение белкового препарата, содержащего ферменты 3 метаболизма нитрилов…………………………………………………...………97 2.11. Иммобилизация ферментов…………………………...………………………..99 2.12. Определение кинетических параметров ферментативных реакций, катализируемых свободными и иммобилизованными ферментами………...100 2.13. Определение констант термоинактивации свободных и иммобилизованных ферментов……………………………….……………….101 2.14. Определение рН- и температурного оптимумов активности свободных и иммобилизованных ферментов…………………..…………..…102 2.15. Определение концентрации АТФ в бактериальных клетках биолюминесцентным методом………………………………………………...103 2.16. Оценка биопленкообразования………………………..……………………...105 2.17. Высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография………………..106 2.18. Микроскопия…………………………………………………………………...110 2.19. Статистическая обработка…………………………………………………….112 ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИЗ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ АДГЕЗИРОВАННЫМИ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ …………………..113 3.1. Адгезия бактериальных клеток на носителях…………………………………113 3.1.1. Взаимодействие бактериальных клеток с многослойными углеродными нанотрубками……………………………………………….…124 3.2. Свойства углеродсодержащих носителей……………………………………..127 3.2.1. Адсорбция нитрилов, амидов и карбоновых кислот на неорганических носителях……………………………….………………..133 3.3. Трансформация алифатических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий………...….135 3.3.1. Влияние адгезии клеток нитрилгидролизующих бактерий на их ферментативную активность ………………………………………….136 3.3.2. Операционная стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий…………………146 3.4. Трансформация ароматических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий….……...…158 4 3.5. Гетерогенный биокатализатор трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот на основе бактериальных клеток, агрегированных с нанотрубками ………...…………..………………………..168 3.6. Стереоселективная трансформация нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий…..….…….171 ГЛАВА 4. БИОКАТАЛИЗ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ БИОПЛЕНКАМИ НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ………………....179 4.1. Визуализация биопленок нитрилгидролизующих бактерий…………………179 4.2. Динамика роста биопленок нитрилгидролизующих бактерий………………182 4.3. Влияние адгезии нитрилгидролизующих бактерий на содержание внутриклеточного АТФ……………………………………………………...…185 4.4. Трансформация алифатических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий…………………………….......................…190 4.5. Трансформация ароматических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий………………………………………….…..192 4.6. Влияние токсичных субстратов и продуктов реакции гидролиза нитрилов на концентрацию внутриклеточного АТФ и жизнеспособность клеток биопленок R. ruber gt1 и P. fluorescens С2..….194 4.7. Смешанные биопленки нитрилутилизирующих бактерий…………………..200 ГЛАВА 5. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ ……………………………………….…………………………………207 5.1. Трансформация акрилонитрила иммобилизованными ферментами гидролиза нитрилов……………………..…………………...…207 5.1.1. Гидратация акрилонитрила адсорбированными ферментными препаратами, содержащими нитрилгидратазу……………….…………….207 5.1.2. Гидратация акрилонитрила нитрилгидратазой, ковалентно связанной с активированным хитозаном…………….……………………...215 5.1.3. Гидролиз акрилонитрила адсорбированными ферментными 5 препаратами, содержащими нитрилазу…………...…………………………226 5.1.4. Гидролиз акрилонитрила ковалентно иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими нитрилазу…………...…..…….234 5.2. Гидролиз акриламида иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими амидазу……………………………………......238 5.3. Стереоселективный гидролиз рацемического лактамида иммобилизованной амидазой………………………...…………..…………...244 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………...252 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………….....274 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ………………………………………......277 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………...…278 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Биокатализ - высокоэффективный специфичный процесс трансформации органических веществ, который в отличие от химического катализа происходит в «мягких» условиях, при нормальной температуре и давлении. Стадии хемоэнзиматического синтеза органических веществ, широко используемого в химической и фармацевтической промышленности, могут катализироваться микробными клетками, обладающими определенной ферментативной активностью, либо изолированными ферментами. Преимущества применения ферментов как промышленных катализаторов по сравнению с химическим катализом обусловлены экологической процессов, способностью к трансформаций, безопасностью ферментативных осуществлению стерео- и региоселективных возможностью получения органических веществ, не загрязненных продуктами побочных реакций [145, 186, 234, 235, 327, 359, 394, 416]. Получение амидов и карбоновых кислот с помощью микробных ферментов нитрилгидратазно-амидазного и нитрилазного пути метаболизма нитрилов является активно развивающейся биокаталитической технологией [14, 146, 220, 276]. Биотехнологическим способом из соответствующих нитрилов могут быть получены такие продукты, как акриламид [247, 316, 386], акриловая кислота [59, 69, 291, 404], никотинамид, никотиновая, изоникотиновая и пиколиновая кислоты [106, 109, 112, 278, 295, 305], путем стереоселективного гидролиза – энантиомерно чистые органические вещества, используемые в качестве интермедиатов при получении фармпрепаратов и химических веществ различного назначения [107, 119, 122, 362]. Интенсификация биотехнологических процессов может быть достигнута за счет перехода от гомогенного катализа к гетерогенному. Гетерогенный биокатализ – это ферментативный катализ, протекающий на границе раздела фаз. В качестве катализаторов такого процесса могут выступать иммобилизованные ферменты или целые клетки микроорганизмов. Применение иммобилизованных 7 биокатализаторов имеет ряд несомненных преимуществ, среди которых их стабилизация, возможность внедрения непрерывных технологий, упрощение процедуры выделения и очистки конечных продуктов, снижение количества отходов [24]. Несмотря на очевидные преимущества гетерогенного процесса, разработки иммобилизованных биокатализаторов часто остаются на лабораторном уровне, являются трудозатратными и не могут быть масштабированы и внедрены в производственный процесс. Неэффективность процесса создания гетерогенных биокатализаторов нередко связана с лежащим в его основе эмпирическим методом, иначе говоря, методом «проб и ошибок», отсутствием научно обоснованного подхода к их разработке в соответствии с требованиями биокаталитического процесса. Подавляющее большинство исследований гетерогенных биокаталитических процессов выполнено на основе клеток микроорганизмов, включенных в структуру гелей [87, 141, 172, 253, 273, 320, 403], тогда как использованию адгезированных клеток в биокатализе уделяется существенно меньше внимания. Это утверждение справедливо и для работ, касающихся иммобилизации клеток нитрилгидролизующих бактерий: основным методом иммобилизации является включение клеток в структуру гелей альгинатов [181, 229, 303, 391], каррагинанов [182], агара и агарозы [166], ПВС [328], ПАА [83]. Недостаточное внимание, уделяемое адгезированным биокатализаторам, может являться следствием основного недостатка этого метода – не очень высокой прочности взаимодействий, возникающих между клеткой и носителем, что приводит к вымыванию клеток. В то же время, именно иммобилизованные биокатализаторы на основе клеток микроорганизмов, приготовленные методом адгезии, могут быть масштабированы до уровня промышленного производства, т.к. их приготовление требует меньше времени, является несложным и экономически более выгодным. Основным требованием к функционированию таких биокатализаторов является сохранение ферментативной активности и достижение высокой операционной стабильности, которое происходит, в основном, благодаря правильному подбору 8 носителя. Следовательно, разработка научных основ создания гетерогенных биокатализаторов на основе адгезированных клеток остается особенно актуальной. Адгезия микроорганизмов в природной среде является естественным процессом, обусловливающим их существование в прикрепленном состоянии и инициирующим процессы образования биопленки. Исследования, касающиеся прикрепленного состояния бактерий, в настоящее время интенсивно развиваются и затрагивают генетические основы биопленкообразования [23], анализ мРНК и протеомный анализ [231, 239], морфологические и физиологические особенности иммобилизованных клеток [230, 265, 360, 402], состав и структуру внеклеточного полимерного матрикса [19, 203, 204]. В то же время, невыясненными остаются особенности энергетического состояния адгезированных клеток, наблюдающиеся на стадии инициации образования биопленки при переходе клетки от планктонного способа существования к прикрепленному. Известны лабораторные и промышленные разработки, в которых процессы микробной ферментации для получения спиртов, органических кислот, биогаза катализировались биопленками [114, 178, 179, 202, 262, 336, 372, 398]. В то же время, лишь единичные исследования посвящены изучению биопленок как катализаторов процессов трансформаций органических веществ [197, 282, 364], тогда как ряд авторов справедливо отмечает, что биопленка может являться самоиммобилизованным и саморегенерируемым катализатором, имеющим преимущества в тех случаях, когда токсичные субстраты и/или продукты ферментативного катализа оказывают неблагоприятное воздействие на жизнеспособность клетки [212, 281]. Иммобилизация ферментов для получения органических веществ имеет длительную историю [142], ряд работ посвящен трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот иммобилизованными нитрилгидролизующими ферментами [137, 158, 175, 222, 242, 377]. Однако остается не до конца выясненным вопрос иммобилизованных целесообразности ферментов в том применения случае, когда изолированных они являются 9 внутриклеточными, и может быть иммобилизована целая микробная клетка без сложной и дорогостоящей процедуры выделения отдельного фермента. Необходима систематизация знаний, касающихся каталитических свойств иммобилизованных различными способами ферментов метаболизма нитрилов и кинетических параметров катализируемых ими реакций, с целью выбора наиболее предпочтительных способов иммобилизации в зависимости от поставленных целей и особенностей биокаталитического процесса. Изложенные проблемы обусловливают актуальность диссертационной работы, посвященной всестороннему анализу процесса гетерогенной трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, основанному на иммобилизованных биокатализаторах трех типов: адгезированных бактериальных клетках, самоиммобилизованных, растущих в виде биопленок бактериях, а также иммобилизованных нитрилгидролизующих ферментах. Степень разработанности темы исследования Нитрилгидролизующие микроорганизмы в течение нескольких десятилетий остаются объектом повышенного внимания со стороны исследователей, изучающих генетические основы процессов трансформации нитрилов [28, 149, 163, 184, 326, 332, 393], метаболические пути, в которые вовлечены нитрилы и амиды, а также их предшественники и продукты нитрильного метаболизма [123, 185, 219, 245, 280, 292, 307, 325, 361,], биохимические основы процесса трансформации нитрилов и амидов [61, 162, 260], структуру нитрилгидролизующих ферментов [165, 176, 206, 246, 314, 315, 335, 409]. Возрастающий интерес к этой группе микроорганизмов вызван, главным образом, возможностью их применения в биотехнологических процессах для получения ряда промышленно важных химических веществ и фармпрепаратов [59, 69, 220, 287, 289]. Многочисленные работы посвящены гидролизу акрилонитрила в акриламид [221, 316, 352, 386] или акриловую кислоту [59, 69, 291, 404] микроорганизмами, обладающими нитрилгидратазо-амидазной системой [91, 173, 196, 272, 290, 304, 318] либо нитрилазой [18, 155, 248, 252, 298, 302, 310, 319]. Также в связи с перспективностью получения пиридинкарбоновых кислот и их 10 амидов, широко используемых в качестве витаминов, пищевых добавок и предшественников фармпрепаратов, разрабатываются процессы микробного гидролиза цианопиридинов [109, 112, 240, 261, 278, 295, 296, 305, 308, 330, 348, 367]. Способность к стереоселективной трансформации [122, 235], обнаруженная у нитрилаз и амидаз, явилась причиной возросшего интереса к этим ферментам и появления большого количества научных работ, посвященных стереоселективному гидролизу нитрилов и амидов. Так, стереоселективная трансформация нитрила миндальной кислоты до изомера миндальной кислоты осуществляется бактериями родов Pseudomonas, Microbacterium, Alcaligenes, клетки которых содержат нитрилазу [119, 339, 355, 362, 381, 384]. Ряд работ посвящен получению других оптически активных производных нитрилов с помощью нитрилазной или нитрилгидратазно-амидазной ферментативных систем микроорганизмов: предшественника (S)-диметилциклопропан для синтеза антибиотика карбоновой циластатина кислоты [414], – (S)- гидроксифеноксибутанамидов как потенциальных интермедиатов для синтеза βадренергических блокаторов [191], β-аминокислот – структурных компонентов ряда лекарственных препаратов [269, 333, 334, 382], D-фенилглицина – интермедиата для синтеза антибактериальных препаратов [107, 108, 171, 200, 214], этил (R)-4-циано-3-гидроксибутирата – интермедиата синтеза статинов [159, 299], нестероидного противовоспалительного препарата S-(+)-ибупрофена [340] и S-напроксена [192], (S)-3-(тиофен-2-илтио)бутановой кислоты – интермедиата синтеза противоглаукомного препарата [133]. Благодаря своим уникальным свойствам нитрилгидролизующие микроорганизмы и ферменты метаболизма нитрилов нашли промышленное применение. Примером успешного внедрения в производство является получение акриламида из акрилонитрила, осуществляемое биотехнологическим путем в Японии, России, Китае и Южной Корее. Наиболее эффективными биокатализаторами на данный момент являются Rhodococcus rhodochrous J1, разработанный в университете Киото и внедренный компанией Nitto Chemical Ltd. (Япония), и R. rhodochrous М33, селекционированный в ГосНИИ генетики и 11 селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва) и внедренный на ряде предприятий России [14]. Производство акриламида только компанией Nitto превышает 20000 тонн/год, синтез никотинамида (Lonza, Китай) – более 3000 тонн/год [234]. Также, по данным 2001 г, компания BASF (Германия) осуществляла гидролиз рацемического нитрила миндальной кислоты до Rминдальной кислоты с помощью фермента нитрилазы, выпуск продукта составлял несколько тонн в год; компания DSM (Дания) осуществляла трансформацию рацемических амидов аминокислот с помощью амидазы до непротеиногенных L-аминокислот, выпуск составлял от нескольких тонн до нескольких десятков тонн в год [234]. Иммобилизация нитрилконвертирующих бактерий и ферментов гидролиза нитрилов находится на стадии лабораторных разработок и представляет собой либо включение клеток в структуру ионотропных, термотропных и ковалентносвязанных гелей [83, 166, 181, 182, 229, 303, 328, 391], либо, в случае использования изолированной нитрилазы, активно разрабатывается метод получения поперечносшитых агрегатов ферментов [175, 242, 377]. Известно, что в процессе промышленного производства акриламида из акрилонитрила биокатализатор вносят в реактор в виде частиц ПАА, содержащих несколько клеток R. rhodochrous М33 (ЗАО «Биоамид», г. Саратов) [14], но, в то же время, синтез концентрированного раствора акриламида представляет собой периодический процесс. Цель настоящего исследования – выявление закономерностей процессов биокаталитической трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, протекающих в гетерогенной среде с участием адгезированных бактериальных клеток и биопленок нитрилгидролизующих бактерий, а также иммобилизованных ферментов метаболизма нитрилов, для создания эффективного биокатализатора. Основные задачи исследования: 1. Получение гетерогенного биокатализатора на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий, изучение процесса адгезии клеток на носителях и взаимодействия с многослойными углеродными 12 нанотрубками, а также гидролиза алифатических и ароматических нитрилов и амидов карбоновых кислот этими биокатализаторами. 2. Трансформация нитрилов и амидов самоиммобилизованными в биопленку нитрилгидролизующими бактериями, выявление особенностей функционирования гетерогенного биокатализатора на основе биопленок, оценка его устойчивости к токсичным субстратам и продуктам ферментативного катализа. 3. Изучение энергетического статуса клеток нитрилгидролизующих бактерий на этапе инициации образования биопленки – стадии необратимой адгезии. 4. Изучение препаратов каталитических свойств нитрилгидратазы, иммобилизованных нитрилазы и амидазы, ферментных определение кинетических параметров трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, катализируемой свободными и иммобилизованными ферментами. 5. Осуществление карбоновых стереоселективного кислот гетерогенным гидролиза нитрилов биокатализатором и амидов на основе адгезированных клеток бактерий и выделенных иммобилизованных ферментов. Изучение зависимости стереоселективности процесса от способа иммобилизации, типа биокатализатора и используемых носителей. Научная новизна Разработаны научные основы создания гетерогенного биокатализатора трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, позволяющие на основании ряда характеристик, присущих биологической составляющей процесса, носителю и трансформируемым субстратам предсказать его эффективность. Разработан алгоритм изучения свойств гетерогенного биокатализатора. Обоснован выбор иммобилизованного биокатализатора (адгезированные клетки или иммобилизованные изолированные ферменты) в зависимости от получения целевых продуктов и особенностей биокаталитического процесса, показано, что выделение и иммобилизация фермента предпочтительны для стереоселективной трансформации субстратов. 13 Показана первостепенность гидрофобных взаимодействий, предшествующих адгезии клеток на углеродных носителях, выявлена прямая зависимость между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов нитрилгидролизующих бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и массой адгезированных клеток на гидрофобных углеродных материалах (от использования r=0,884 до r=0,950, активированных p=0,05). углеродных Показана адсорбентов эффективность для получения биокатализатора гидролиза алифатических нитрилов на основе адгезированных бактериальных клеток неактивированных и, наоборот, носителей в предпочтительность гетерогенном процессе использования трансформации ароматических нитрилов. Изучены особенности взаимодействия клеток бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus с многослойными углеродными нанотрубками. Впервые показана возможность создания гетерогенных биокатализаторов на основе агрегированных с многослойными углеродными нанотрубками бактериальных клеток, и обоснованы преимущества таких биокатализаторов, заключающиеся, в частности, в легкости их отделения от реакционной среды и высокой клеточной нагрузке. Проведено сравнение кинетических параметров реакции трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, катализируемых ферментными препаратами нитрилгидратазы, нитрилазы и амидазы, иммобилизованными различными способами (адсорбцией, ковалентной сшивкой с носителем, образованием поперечно-сшитых ферментных агрегатов), а также каталитических свойств этих гетерогенных биокатализаторов. Изучено влияние способа иммобилизации на стереоселективность реакции гидролиза рацемических нитрилов и амидов, а также воздействие различных видов носителей на выход стереоизомеров в процессе гетерогенного предпочтительность создания гетерогенного биокатализа. Показана биокатализатора для стереоселективной трансформации на основе поперечно-сшитых агрегатов ферментов. 14 Разработана методика получения иммобилизованных ферментов гидролиза нитрилов путем активированного ковалентной сшивки 0,1% бензохиноном, белков и с гранулами образованием хитозана, поперечно-сшитых агрегатов фермента при высаливании белка из раствора сульфатом аммония с одновременным воздействием 0,1% раствора глутарового альдегида или бензохинона. Впервые показана возможность создания гетерогенного биокатализатора гидролиза нитрилов на основе биопленок нитрилтрансформирующих бактерий родов Rhodococcus, Pseudomonas, полученных Alcaligenes, в процессе культивирования с носителями, его повышенная устойчивость к токсичным субстратам и продуктам суспендированными бактерий в ферментативной клетками. присутствии Показана носителя как реакции по эффективность способа сравнению с культивирования создания гетерогенного биокатализатора, объединяющего наращивание биомассы микроорганизмов и иммобилизацию в один нитрилгидролизующих этап. бактерий Определена при продуктивность трансформации биопленок алифатических и ароматических нитрилов и амидов. Впервые изучены особенности энергетического статуса клеток бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas при необратимой адгезии на нерастворимом носителе, выражающиеся в значительном снижении концентрации АТФ в клетке при адгезии и в первые часы после переноса адгезированных клеток в свежую питательную среду. Показано, что степень снижения внутриклеточного пула АТФ зависит от свойств носителя, на котором адгезируются клетки. Показана обратная концентрационная зависимость активности гетерогенного биокатализатора, которая наблюдается при невысоких скоростях ферментативной реакции (единицы мкмоль продукта, образуемые 1 мг биокатализатора в минуту) даже при избытке субстрата. Определено, что подобная зависимость не наблюдается при высоких скоростях ферментативной реакции (сотни мкмоль продукта, образуемые 1 мг биокатализатора в минуту). Теоретическая значимость работы 15 Результаты значимости исследований позволили адгезированной биокаталитических формы трансформаций. сформулировать существования Замена концепцию бактерий о для свободносуспендированного состояния бактериальных клеток на адгезированное позволяет получить преимущество в биокаталитическом синтезе амидов и карбоновых кислот из соответствующих нитрилов, выражающееся в повышении ферментативной активности и стабильности в процессе многократных биотрансформаций. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о гетерогенном биокатализе осуществляемом как нитрилов клетками и амидов микроорганизмов, карбоновых так и кислот, выделенными ферментами. Экспериментальная адгезия микроорганизмов на нерастворимом носителе рассматривается как модель инициации образования биопленки в природе, связанной с прикреплением клеток к биотической или абиотической поверхности. Изучение самоиммобилизованных в процессе культивирования с носителями нитрилгидролизующих бактерий позволяет получить новые знания о существовании этих микроорганизмов в естественном, биопленочном состоянии. Принимая во внимание, что внутриклеточные ферменты функционируют не в разбавленном растворе, а в сложной гетерогенной среде, изучение каталитических свойств иммобилизованных ферментов и кинетических параметров катализируемых ими реакций дает новые знания о влиянии факторов окружающей среды на фермент, находящийся в прикрепленном состоянии. Полученные результаты, касающиеся энергетического статуса адгезированных бактерий, раскрывают особенности физиологического состояния клеток на этапе инициации образования биопленки – стадии необратимой адгезии, и позволяют провести параллель между этой стадией и лаг-фазой при периодическом культивировании бактерий в жидкой среде. Полученные стереоселективность клетками и новые данные трансформаций, ферментами, о влиянии гетерогенной катализируемых расширяют среды на иммобилизованными представление о стереохимии ферментативных реакций и показывают возможность управления процессом 16 получения стереоизомеров при варьировании используемого носителя для иммобилизации биокатализаторов. Разграничение терминов «адгезированные клетки микроорганизмов» и «биопленки микроорганизмов» в рамках более широкого понятия «иммобилизованные клетки» позволяет внести ясность в понимание гетерогенных биокаталитических процессов. Практическая значимость работы Практическая значимость работы заключается в создании активных и стабильных гетерогенных биокатализаторов процесса трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот для получения химических веществ, значимых в народном хозяйстве, и предшественников фармпрепаратов (акриламид, акриловая кислота, никотинамид, никотиновая, изоникотиновая и пиколиновая кислоты, фенилглицин и др.). Разработанный алгоритм изучения гетерогенного биокатализатора на примере процесса гетерогенного биокатализа нитрилов и амидов карбоновых кислот позволяет перейти от эмпирического подбора носителей для иммобилизации клеток и ферментов к менее трудозатратному способу оценки эффективности процесса, основанному на прогнозировании свойств гетерогенного биокатализатора по ряду признаков, присущих носителю, биологическому объекту и ферментативной реакции. Методология и методы исследования Диссертационная работа выполнена с применением классических и современных микробиологических (культивирование бактерий, поддержание бактериальных культур, определение ростовых характеристик, подсчет жизнеспособных клеток), биохимических (ферментативные трансформации органических веществ, получение препаратов ферментов, определение константы Михаэлиса-Ментен, максимальной скорости ферментативной реакции, константы термоинактивации, температурной и рН зависимости активности ферментов, энантиомерного избытка стереоизомеров), аналитических (методы спектрофотометрии, ВЭЖХ и ГХ) и микроскопических (фазово-контрастная и 17 флюоресцентная световая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия) методов. Иммобилизация клеток и ферментов выполнена модифицированными методами, известными из научной литературы, а также авторскими запатентованными методами (патент РФ № 2352635; патент РФ № 2500814). Основные положения, выносимые на защиту 1. Гидрофобные взаимодействия являются определяющими при адгезии на углеродсодержащих материалах клеток бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, гидрофобности с Rhodococcus поверхности. Выбор различной носителя для степенью иммобилизации бактериальных клеток обусловлен особенностями биокаталитического процесса и химической природы трансформируемых веществ. 2. Биопленки нитрилгидролизующих бактерий, полученные в процессе культивирования в присутствии носителей, могут служить гетерогенным биокатализатором трансформации алифатических и ароматических нитрилов и амидов карбоновых кислот. Устойчивость клеток биопленки к токсичному действию субстратов и продуктов реакции трансформации нитрилов повышается по сравнению с суспендированным состоянием. 3. Адгезия бактерий приводит к снижению содержания АТФ в клетках, которое продолжается в первые часы после переноса в свежую питательную среду; уровень снижения концентрации внутриклеточного АТФ зависит от свойств носителя, энергетического на статуса котором адгезируются клетки не влияет клетки. на Изменение активность нитрилгидролизующих ферментов. 4. На каталитические свойства иммобилизованного ферментного препарата, содержащего ферменты метаболизма нитрилов, влияют методы иммобилизации (адсорбция или ковалентная сшивка) и свойства носителей. Адсорбция на неорганических носителях дает преимущества в термостабильности фермента, ковалентная сшивка с органическими носителями – возрастание операционной стабильности и изменения рН профиля активности. 18 5. На стереоселективность гетерогенного гидролиза рацемических амидов и нитрилов влияет присутствие нерастворимого носителя в реакционной среде; наибольшую стереоселективность проявляют поперечно-сшитые ферментные агрегаты амидазы. Степень достоверности и апробация результатов Достоверность результатов исследования подтверждается объемом данных, полученных в ходе экспериментальных работ, выполненных с применением современных микробиологических, биохимических и аналитических методов. Получение гетерогенных биокатализаторов на основе клеток бактерий, адгезированных на носителях или выращенных в виде биопленок, подтверждено методами электронной и световой микроскопии; образующиеся в ходе биохимических трансформаций органические вещества проанализированы методами ВЭЖХ и ГХ. Полученные результаты обработаны с помощью лицензионных программ и методов статистического анализа. Основные положения диссертационной работы доложены на 7-й и 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2003, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», Москва, 2004; Третьем Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; 2-й и 3-й Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь – Казань – Пермь, 2005, Пермь – Нижний Новгород – Пермь, 2008; Международной научной конференции «Микробные биотехнологии», Одесса, 2006; Международной научной конференции молодых ученых “Modern problems of microbiology and biotechnology”, Odesa, 2007; VI и VII Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2008, 2010; 4th and 5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Geneva, Switzerland, 2011, Leipzig, Germany, 2013; International Conference “Biofilms 5”, Paris, France, 2012, “Biofilms 6”, Vienna, Austria, 2014. 19 По теме диссертации опубликовано 86 научных работ, в том числе 2 обзора и 17 экспериментальных статей в журналах, входящих в перечень, рекомендованный ВАК Минобрнауки РФ, 13 из которых входят в международные базы цитирования Web of Science/Scopus; получено 2 патента РФ. Связь работы с научными программами Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0406511). Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 04-04-97514-р_офи «Фундаментально-прикладные исследования для биотехнологического процесса получения 10–15% гидрогеля полиакриламида высокой чистоты на основе штамма микроорганизмов Rhodococcus ruber», 2004–2006 гг.; программы интеграционных исследований Уральского и Сибирского отделений РАН, 2004– 2006 гг.; Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», 2009–2014 гг; аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы, 2009–2010 гг; молодежного гранта по УрО РАН №35, 2004 г.; гранта РФФИ № 07-04-97617-р_офи «Фундаментальноприкладные исследования для создания безотходного биокаталитического процесса получения акриловых мономеров», 2007–2008 гг; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг., государственный контракт 02.740.11.0078; гранта РФФИ №13-04-96050-р_урал_а «Исследование стереоселективной биотрансформации амидов и сложных эфиров почвенными бактериями с применением энзимологических, метагеномных и геномных методов», 2013–2015 гг. Личный вклад автора и благодарности Автору принадлежит выбор проблемы, постановка целей и задач проведенных исследований, планирование экспериментов, выполнение 80% экспериментальной работы или непосредственное руководство экспериментами, 20 анализ, обобщение и интерпретация результатов, подготовка научных публикаций и патентов. Экспериментальные работы по трансформации ароматических нитрилов гетерогенным биокатализатором выполнены совместно с аспирантом ПГНИУ Д.М. Васильевым, по иммобилизации и изучению каталитических и стереоселективных свойств изолированной амидазы – с аспирантом ИЭГМ УрО РАН А.Н. Горбуновой. Автор технологий выражает и благодарность конструирования профессору машин кафедры Пермского материалов, национального исследовательского политехнического университета, д.т.н. В.Ф. Олонцеву за предоставленные образцы активных углей; ведущему научному сотруднику Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН д.х.н. Г.А. Коваленко за предоставленные образцы углеродсодержащих носителей и помощь в обсуждении ряда полученных результатов; начальнику лаборатории ОАО «Уральского НИИ композиционных материалов» С.М. Никулину за предоставленные образцы многослойных углеродных нанотрубок; д.г.-м.н., заслуженному деятелю науки РФ, профессору государственного кафедры минералогии национального и петрографии исследовательского Пермского университета Б.М. Осовецкому и сотруднику демонстрационно-методического центра TESCAN (г. Санкт-Петербург) к.ф.-м.н. М.В. Лукашовой за помощь в электронномикроскопическом анализе образцов; ведущему инженеру лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН Г.В. Овечкиной за помощь в ВЭЖХ-анализе образцов. Профилометрия адсорбентов была выполнена в лаборатории физики основ прочности в Институте механики сплошных сред УрО РАН (г. Пермь). Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, чл.-корр. РАН, профессору, д.м.н. В.А. Демакову за многолетнюю помощь и поддержку. 21 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ Возникновение микробиологии как науки связано с выделением микроорганизмов в чистую культуру, что позволило идентифицировать и детально изучать физиологические, биохимические и генетические свойства представителей этого царства живой природы. При этом изучение основных физиологических параметров проводилось на суспензионных культурах в замкнутых резервуарах при периодическом культивировании с истощением субстратов роста, либо при непрерывном культивировании с постоянной подачей питательных веществ и оттоком культуральной жидкости. Подобное суспензионное состояние дает возможность изучить закономерности роста культур микроорганизмов в сопоставлении с биохимическими процессами, лежащими в их основе экспериментальными и [17]. не Но подобные отражают условия реальных являются условий лишь существования микроорганизмов в природе. Как практически невозможно встретить чистые культуры микроорганизмов ограниченного числа в природных экстремальных условиях, биотопов, так за не исключением существует и бактериальных суспензий в естественной среде обитания. В конце XX века сформировалось представление микроорганизмов, означающий а в о прикрепленном микробиологии формирующееся на способе закрепился поверхности существования термин раздела «биопленка», фаз сообщество микроорганизмов, в котором клетки заключены во внеклеточный полимерный матрикс [38, 209]. Огромное количество современных исследований, посвещенных биопленкам, говорит о качественно новом уровне в развитии микробиологии, когда в эксперименте делаются естественное, природное состояние микроорганизма. попытки воссоздать 22 В биотехнологии в середине XX века также возрос интерес к использованию прикрепленных (иммобилизованных) клеток микроорганизмов. В производственном процессе иммобилизация клеток микроорганизмов была впервые применена более 150 лет назад. Однако бурное развитие методов иммобилизации живых клеток началось с 70-х гг ХХ века, что связано с потребностями фундаментальных исследований в области биохимии, молекулярной биологии, физиологии микроорганизмов, а также с разработкой современных биотехнологических производств. В России в начале 70-х годов Г.К. Скрябин и К.А. Кощеенко совместно с другими сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР провели первые эксперименты по иммобилизации интактных клеток микроорганизмов. В 1975 г. на Советско-американской конференции Г.К. Скрябин обосновал теоретические аспекты иммобилизации живых клеток микроорганизмов и возможности их практического использования, в том числе как биокатализаторов пролонгированного действия в синтезе стероидных гормонов [8]. В начале 70-х годов группа исследователей из Японии под руководством I. Chibata сообщила об успешном проведении биосинтеза L-аспартата иммобилизованными клетками, содержащими аспартазу исследовательских групп [157], начали после чего разработку значительное процессов количество трансформации органических веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов. Различные направления биотехнологии связаны с использованием иммобилизованных и самоиммобилизованных клеток микроорганизмов – это, прежде всего, биологическая очистка сточных вод и загрязненных почв, биодеградация, биосинтез, ферментация и биокатализ. Биокатализ и биотрансформация являются процессами химического превращения одного или более веществ, протекающими под действием биологических катализаторов – ферментов или клеток с определенной ферментативной активностью. Гетерогенный биокатализ – это специфический, высокоэффективный процесс трансформации органических веществ, протекающий на поверхности раздела фаз. Катализатором этого процесса является биологическая составляющая (фермент, 23 комплекс ферментов, органеллы, клетки), иммобилизованная на нерастворимом носителе. По определению Я. Халгаша, иммобилизация биокатализаторов – это фиксирование ферментов или клеток в некоторой фазе, чаще всего нерастворимой, отделенной от другой фазы (раствора), в которой находятся молекулы субстрата и (или) продукта, причем возможен межфазный перенос этих молекул [77]. На первой конференции по инженерной энзимологии (Henniker, NH, США, 1971) было определено, что иммобилизованные биокатализаторы – это ферменты или клетки, физически зафиксированные в определенной области, для того чтобы катализировать специфические реакции без потери каталитической активности и с возможностью повторного использования [201]. Известны различные способы иммобилизации биокатализаторов (Рисунок 1), подразделяющиеся на адсорбцию и ковалентное связывание (иммобилизация на поверхности материала носителя); включение в гели и инкапсуляцию (иммобилизация в структуру материала носителя). Отдельно можно выделить мембранные технологии и иммобилизацию без носителя (поперечная сшивка с образованием ковалентных связей) [31]. Рисунок 1 – Методы иммобилизации биокатализаторов 24 Адсорбция – это увеличение концентрации вещества на поверхности раздела фаз по сравнению с его концентрацией в объеме фазы [26]. Иммобилизация путем адсорбции – наиболее мягкий и предпочтительный способ фиксации биокатализатора по сравнению с включением в органические полимеры [67]. Отмечается, что сорбционный метод иммобилизации микроорганизмов на различных носителях позволяет значительно повысить эффективность биокатализа и биодеградации [4]. Адгезия – (от лат. adhaesio-притяжение, сцепление), явление соединения приведенных в контакт поверхностей конденсированных фаз [78]. Установлено, что приблизившись к поверхности, бактерии взаимодействуют с ней сначала с помощью гидрофобных взаимодействий, которые не могут обеспечить большой специфичности взаимодействия. Затем наступает более прочное прикрепление, которое осуществляется через несколько часов или даже суток после начала адгезии и достигается благодаря синтезу бактериями биополимеров, обычно полисахаридов, но иногда и полипептидов, с помощью которых клетки прочно прикрепляются к поверхности [20]. Y.H. An и R.J. Friedman в книге «Handbook of Bacterial Adhesion: Principles, Methods, and Applications» предлагают терминами «адгезия», «связывание» и «прикрепление» описывать эксперименты, касающиеся ранних стадий биопленкообразования, от обратимого связывания до необратимого прикрепления. Такие эксперименты охватывают временные периоды от минут до 1–2 ч. Когда эксперименты более длительны, 6–24 ч, наблюдения могут касаться как начальной адгезии, так и последующего размножения микроорганизмов на поверхности. В этом случае предпочтительнее использовать термины «колонизация», «образование микроколоний», «образование биопленки» или «формирование микробных матов» [96]. В экспериментальной части диссертационной работы будет рассмотрено приготовление и свойства гетерогенных биокатализаторов на основе адсорбированных и ковалентно присоединенных к носителю ферментов, а также адгезированных бактериальных клеток, взятых из культуры, находящейся в стационарной фазе роста, и биопленок, выращенных на носителях. 25 Для иммобилизации клеток микроорганизмов могут быть использованы адсорбенты органической (хитин, древесина, целлюлоза и т.д.) либо неорганической (глины, песок, кремнеземы, угли и т.д.) природы, искусственные неорганические носители (углеродные материалы, металлические сплавы, керамика и т.д.) и синтетические полимеры (полиэтилен, нейлон, полиуретаны и т.д.) [24]. Из вышеперечисленных носителей основное внимание в экспериментальной части работы будет уделено углеродсодержащим материалам. Углерод – основа органических веществ, он может быть рассмотрен как элемент, наиболее совместимый с живыми организмами. Поэтому логично ожидать, что носители, приготовленные на его основе, будут обладать свойствами, необходимыми для адгезии и дальнейшего роста микроорганизмов. Пористые углеродные материалы, в частности активные угли, являются одними из наиболее перспективных носителей [65]. Атомы углерода на поверхности кристаллов находятся в ином электронном и энергетическом состоянии, чем атомы объемной фазы, особенно в местах дефектов кристаллической решетки. Наличие у таких атомов свободных валентностей облегчает их химическое и сорбционное взаимодействие с различными веществами [50]. Угольные материалы обладают высокой химической и биологической стойкостью, механической прочностью, достаточной проницаемостью, большой удельной поверхностью (1000 м2/г и более), возможностью получения удобных в технологическом отношении форм (гранул, тканей, волокон). Иммобилизацию биопрепаратов на угольных материалах проводят либо адсорбцией, либо химическим связыванием с использованием бифункциональных реагентов [13]. Г.А. Коваленко с соавт. были разработаны неорганические углеродсодержащие носители для создания высокостабильных гетерогенных биокатализаторов. Макроструктурированные керамические носители, покрытые слоем каталитического волокнистого углерода и графитоподобным углеродом, успешно применялись для иммобилизации как растущих, так и нерастущих 26 бактериальных и дрожжевых клеток. Авторы отметили, что носители со слоем каталитического волокнистого углерода обеспечивают прочное связывание микробных клеток, а также полное сохранение ферментативной активности микроорганизмов и максимальную стабилизацию полученных биокатализаторов [74, 75, 76, 151]. Преимущества гетерогенного биокатализа заключаются в следующем [24]: 1. Упрощаются операции разделения биокатализатора и сред, содержащих целевые продукты, что позволяет перейти от периодических схем к более производительным непрерывным технологиям; 2. Появляется возможность более длительной эксплуатации клеток в отличие от однократного использования свободных культур; 3. Повышается устойчивость инактивирующих клеток внешних к факторов действию неблагоприятных (температуры, кислотности, концентрации электролитов, токсичных веществ), иногда становится возможной дополнительная защита культуры от загрязнения в случае нарушения стерильности; 4. Появляется возможность повышения продуктивности процессов в результате увеличения концентрации биомассы в единице рабочего объема реактора; 5. В некоторых случаях возможно повышение ферментативной активности биокатализатора; 6. Снижается количество отходов в виде отработанной биомассы. Таким образом, гетерогенный биокатализ органических соединений не только позволяет улучшить технологическую схему процесса, но и возвращает клетки микроорганизмов в их естественное (прикрепленное) состояние, что также может давать определенные преимущества перед свободными суспендированными клетками. 27 1.1. Метаболизм нитрилов у микроорганизмов Ферментативная активность, связанная с метаболизмом нитрилов, известна у нескольких семейств растений, грибов (Fusarium, Aspergillus, Penicillium), а также распространена у бактерий. Бактерии, обладающие ферментами гидролиза нитрилов, встречаются среди родов Acidovorax, Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Comamonas, Gordona, Corynebacterium, Klebsiella, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus и др. [121, 126, 188]. Представители родококков, утилизирующие нитрилы в качестве единственного источника углерода и энергии, обладают наиболее активными ферментами, конвертирующими нитрилсодержащие соединения, и выделяются из почвенной среды чаще других бактерий [146, 155, 404]. Уникальные свойства родококков, а именно сочетание высокого биодеградативного потенциала с непатогенностью подавляющего большинства представителей этого рода, обусловливают повышенный интерес исследователей-микробиологов и биотехнологов к этим бактериям [5, 21, 41, 129]. Известно несколько возможных путей биоконверсии нитрилов. Наиболее перспективным в прикладном отношении является их гидролиз. Согласно литературным данным, существует два пути микробной деструкции нитрилов [125]: 1. Нитрилы метаболизируются непосредственно в соответствующие кислоты и аммиак при помощи фермента нитрилазы (КФ 3.5.5.1): RCN+2H2O → RCOOH +NH3 2. Нитрилы подвергаются двуступенчатой деградации сначала до амида при участии фермента нитрилгидратазы (КФ 4.2.1.1.84); RCN+H2O → RCONH2 затем амид превращается в соответствующую кислоту и аммиак, в этом процессе участвует фермент амидаза (КФ 3.5.1.4): RCONH2+H2O → RCOOH+NH3 28 Структура и функции нитрилгидратазы Нитрилгидратаза – ключевой фермент в процессе ассимиляции нитрилов микроорганизмами. Основной особенностью этих ферментов является присутствие металла в активном центре, что лежит в основе их подразделения на 2 типа: железо- и кобальтсодержащие нитрилгидратазы [314, 331]. Железосодержащая нитрилгидратаза состоит из α и β субъединиц, которые формируют тесно связанный гетеродимер [206, 277]. И активный центр, и четвертичная структура стабилизируются молекулами воды внутри и снаружи фермента. 76 молекул воды между α и β субъедицами нитрилгидратазы способствуют образованию αβ гетеродимера, формируя множественные водородные связи, и снижают поверхностный заряд β субъедицы. Двадцать молекул воды формируют водородные связи, стабилизирующие уникальную структуру активного центра. Кобальтсодержащие нитрилгидратазы принадлежат к группе Со-зависимых ферментов, которые содержат некорриноидный кобальт в своей структуре [277]. Промышленно значимый микроорганизм Rhodococcus rhodochrous J1 содержит высокомолекулярную (H-NHase) и низкомолекулярную (L-NHase) нитрилгидратазу. Эти ферменты состоят из двух субъединиц (α, β). Для экспрессии генов, кодирующих эти нитрилгидратазы, требуются ионы кобальта и амиды. Для экспрессии генов, кодирующих H-NHase, требуется мочевина, LNHase – циклогексанокарбоксамид. Когда штамм R. rhodochrous J1 был культивирован в среде, содержащей в качестве индуктора мочевину, наблюдалась сверхпродукция H-NHase. Ее количество в этом случае составляло более 50% от всего растворимого белка [247]. Субъединицы всех известных нитрилгидратаз содержат высоко гомологичные аминокислотные последовательности. Цистеиновый кластер, который координирует железо или кобальт α субъединицы и два остатка аргинина β субъединицы полностью консервативны. Нитрилгидратазы Fe-типа в отличие от Со-типа проявляют фотореактивность и связывают молекулы NO. Нитрилгидратазы Fe-типа предпочтительно гидратируют алифатические нитрилы 29 с небольшой цепью, тогда как Со-NHase проявляют высокую аффинность к ароматическим нитрилам [176]. Известно, что удельная активность нитрилгидратазы намного выше, чем нитрилазы. Это обусловлено различием в реакционных механизмах этих двух ферментов. У нитрилазы в активном центре содержатся остатки цистеина, участвующие в гидролизе нитрилов, тогда как NHase содержит в активном центре металл [249]. Учитывая структуру и функции железосодержащих и кобальтсодержащих NHase, предложены модели протекания ферментативных реакций, которые предполагают три стадии. Во-первых, присоединение нитрила происходит близко к гидроксид-иону или к металлсвязывающей молекуле воды. Во-вторых, каждая гидроксильная группа или металлсвязывающая молекула воды атакуется нитрильным атомом углерода, в результате образуется имидат [R – C(OH) = NH]. Наконец, имидат таутомеризуется до амида. Следовательно, уникальная структура активного центра нитрилгидратазы катализирует нитрилы с большей эффективностью [277]. Большинство нитрилгидратаз имеет оптимум активности в нейтральной среде и при температуре 30–40ºС, хотя встречаются и более термостабильные ферменты, главным образом, изолированные из клеток бактерий рода Bacillus (Таблица 1). Успешное применение этих ферментов в промышленном производстве амидов привело к возрастанию интереса исследователей к их структуре и функциям. В течение последних 10 лет значительное количество работ было направлено на изучение сложных моделей, которые имитируют активный центр нитрилгидратазы. Цель такого поиска – установить роль негемового железа (или некорриноидного кобальта) активного центра нитрилгидратазы в процессе гидратации органических нитрилов [249]. 30 Температура, ºС Микроорганизм оптимум Agrobacterium tumefaciens IAMB261 - стабильность - рН оптимум 7,5 стабильность 6,5–9,5 КМ, M субстратная специфичность Ссылка Таблица 1 – Каталитические свойства некоторых нитрилгидратаз 7,9×10-3 [313] по индол-3ацетонитрилу A. tumefaciens d3 40 Arthrobacter sp. J1 35 Bacillus sp. RAPc8 60 50 >50 7,0 7,0–10,0 арилпропионитрилы [194] 7,0–7,2 - алифатические нитрилы [86] 7,0 - 1,1×10-2 по акрилонитрилу; [91, 386] 2,34×10-1 по валеронитрилу; 9×10-3 по ацетонитрилу B. pallidus Dac521 50 50 7,0–7,5 6,2–8,7 7,0×10-4 [173] по акрилонитрилу; 8,4×10-3 по ацетонитрилу; 6,7×10-3 по пропионитрилу Mesorhizobium sp. F28 37–45 7,5 5,0–8,8 5,3×10-4 [306] по акрилонитрилу R. rhodochrous J1 низкомолекулярная 40 R. rhodochrous J1 высокомолекулярная 35–40 Rhodococcus sp. YH3–3 ˂55 - 8,8 - 2,67×10-3 по акрилонитрилу 50 6,5 6,0–8,5 1,89×10-3 по акрилонитрилу - 40–60 - 2.5–11.0 8,45×10-4 по акрилонитрилу [99, 272] [99, 272] [241] 31 Таблица 1 – Продолжение Микроорганизм Rhodococcus sp. N771 30 стабильность ˂30 Rhodococcus sp. N774 35 32–35 оптимум R. equi A4 КМ, M рН 7,8 стабильность 6,0–8,0 - 7,7 ˂50 7,5 оптимум Ссылка Температура, ºС субстратная специфичность алифатические нитрилы [410] 7,0–8,5 алифатические нитрилы [196] 6,0–9,0 1,4×10-3 [344] по бензонитрилу; 5,7×10-3 по 3-цианопиридину; 3,9×10-3 по (R,S)-2фенилпропионитрилу Структура и функции амидазы Амидазы – ферменты, гидролизующие амидную связь между азотом и углеродом в молекулах небелковой природы с образованием кислоты и аммония [46, 365]. Большинство известных в настоящее время амидаз были обнаружены и описаны у бактерий родов Rhodococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Brevibacterium, Nocardia, Streptomyces, Blastobacter, Arthrobacter, Alcaligenes, Helicobacter, Lactobacillus и Methilophilus [208]. По современной классификации, основанной на гомологии аминокислотных последовательностей и наличии консервативных мотивов, амидазы подразделяют на две группы. К первой из них относятся амидазы из семейства CN-гидролаз (или нитрилазного гомотетрамерных суперсемейства), и существующие гомогексамерных комплексов, в растворе и в виде содержащие в каталитическом центре остатки лизина, цистеина и глутаминовой кислоты. К этой 32 группе относятся в основном алифатические амидазы, субстратами которых являются алифатические короткоцепочечные амиды – ацетамид, акриламид, пропионамид. Ко второй группе относятся амидазы семейства “amidase signature”, содержащие в активном центре два остатка серина и один остаток лизина. Эти амидазы формируют гомодимерные и гомооктомерные комплексы. Особенностью этих амидаз является абсолютно консервативный мотив GGSS, содержащий один из каталитически активных остатков серина. Субстратная специфичность таких амидаз шире, они способны гидролизовать наряду с алифатическими амидами также ароматические и разветвленные амиды – фенилацетамид, 2-фенилпропионамид, амид миндальной кислоты. Часто эти амидазы обладают стереоселективностью [46, 380]. Амидазы, активные по отношению к широкому спектру субстратов, являются растворимыми ферментами. Максимальная активность амидаз наблюдается при нейтральном значении pH. Однако есть амидазы, имеющие оптимум активности в щелочной среде (Таблица 2). Были обнаружены амидазы, имеющие молекулярный вес 180 кДа. Кроме того, обнаружена амидаза из Arthrobacter J-1, молекулярный вес которой был много больше – 320 кДа. Электрофоретический анализ показал, что амидазы Brevibacterium sp. R312 состоят из одного типа субъединиц. Каждая субъединица имеет молекулярную массу около 44 кДа. Четвертичная структура амидаз Brevibacterium sp. R312 отличается от таковой P. aeruginosa, которая состоит из 6 субъединиц (Мr = 33 кДа) и от амидазы Arthrobacter J-1, которая состоит из 8 субъединиц (Мr = 40 кДа). Ингибированием йодоуксусной кислотой, N-этилмалеимидом и парагидроксимеркурибензоатом было подтверждено, что амидазы содержат по крайней мере одну SH группу в активном центре [388]. По сравнению с нитрилгидратазами, амидазы более термостабильны. Встречаются амидазы, которые проявляют максимальную активность при температурах, превышающих 50ºС (Таблица 2). 33 Температура, ºС Микроорганизм оптимум стабильность КМ , M рН оптимум стабильность Arthrobacter sp.NJ-26 45 Brevibacillus borstelensis BCS-1 85 Brevibacterium iodinum TPU 5850 35 - 7,2 - Brevundimonas diminuta TPU 5720 50 - 7,5 - sp. 40 35–60 8 7,5–8 Burkholderia DR.Y27 7,5 70 9 7–10 субстратная специфичность Ссылка Таблица 2 – Каталитические свойства некоторых амидаз D-аланинамид [199] 1,45×10-2 [154, 293] по D-аланинамиду; D-метионинамид D-метионинамид, D-лизинамид, D-глутаминамид, D-фенилаланинамид L-амиды аминокислот 2,39×10-3 [254] [257] [344] по акриламиду; 0,27×10-3 по ацетамиду; 4,29×10-3 Mycobacterium neoaurum ATCC 25795 50 55 8,0-9,5 - Ochrobactrum anthropi SV3 45 35-50 8,5-9,5 6,5-11,0 по пропионамиду α-Н- и αалкилзамещенные амиды 4,4×10-4 по Dфенилаланин амиду; 5×10-4 по Dтирозинамиду 4,8×10-4 по Dтриптофанамиду [345] [255, 256] 34 Температура, ºС Микроорганизм Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 70 стабильность 60 Pseudomonas chlororaphis B 23 Rhodococcus erythropolis MP50 50 55 оптимум КМ , M рН 6,0–8,5 стабильность - 25–50 7,0–8,6 5,9–9,9 40–60 7,5 6,0–9,0 оптимум субстратная специфичность Ссылка Таблица 2 – Продолжение α-Н- и α,αдизамещенн ые амиды алифатические амиды [263] 6,9×10-5 [215] [160] по фенилацетамиду; 6,7×10-5 по кетопрофенамиду -4 R. rhodochrous J1 - - - - 1,5×10 по бензамиду [250] R. rhodochrous M8 55–60 40–65 7,0 5,0–8,0 алифатические амиды [237] Охарактеризована структура амидазы Rhodococcus sp. N-771 (Rh-амидаза). Rh-амидаза содержит три домена: N-терминальный, малый и большой домен. Nтерминальный домен не был обнаружен у других ферментов амидазного семейства. Этот домен вовлечен в формирование димера и вместе с малым доменом образует узкий субстрат-связывающий тоннель. Большой домен обнаруживает высокое структурное сходство с другими ферментами амидазного семейства. В этом домене локализуются каталитическая триада цис-серин, серин и лизин. Гидрофобные остатки малого домена участвуют в распознавании субстрата и связаны с различиями в субстратной специфичности ферментов амидазного семейства [380]. Структура и функции нитрилазы С момента своего открытия в 1964 г. нитрилазы были обнаружены у многих организмов: бактерий, грибов и растений, а в последние десятилетия их структура 35 и функции активно изучаются, что связано с биотехнологическим интересом, который они представляют. Биокаталитическое значение нитрилаз обусловлено их способностью гидролизовать широкий спектр различных нитрилов [301, 342, 343]. Нитрилазы (α/β-гидролазы), наряду с цианидгидратазами и цианиддегидратазами, представляют собой одну из ветвей нитрилазного надсемейства, в которое входит 12 семейств, не обладающих пептидазной активностью, и только данная ветвь использует в качестве субстратов нитрилы. Ферменты этого типа обладают четырехслойной (α-β-β-α) структурой типа сэндвич, и каталитически активной триадой, состоящей из остатков глутаминовой кислоты, лизина и цистеина. При образовании α-β-β-α структуры, пара α-спиралей располагается по бокам, и два слоя, каждый из шести β-нитей, образуют середину. Два таких α-β-β-α-комплекса взаимодействуют друг с другом, образуя тетрамерную структуру. Ассоциация субъединиц нитрилов в гомоолигомерные образования с высоким молекулярным весом, формирующих спиральную структуру и закрученные нити, является типичной структурной особенностью этих ферментов [143, 276]. Существует гипотетическая схема реакции для объяснения образования двух альтернативных продуктов, карбоновой кислоты или амида (побочный продукт) [276] (Рисунок 2). Считается, что при взаимодействии субстрата с ферментом происходит перенос электронов с сульфгидрильной группы цистеинового остатка на углерод цианогруппы нитрила, что приводит к образованию первичного комплекса, который гидролизуется с образованием интермедиата, обладающего четвертичной структурой. В дальнейшем происходит отщепление аммиака, которое возможно благодаря положительному заряду на атоме азота лизинового остатка, стабилизируемому остатком глутаминовой кислоты, в результате чего конечными продуктами реакции является карбоновая кислота и аммиак. Но при альтернативном пути, ведущем к получению на выходе амида, стабилизации положительного заряда мешает электронный или стерический эффект R- 36 заместителя. Таким образом, на тип продукта существенно влияет конфигурация R-группы. Рисунок 2 – Схема образования двух альтернативных продуктов на примере нитрила миндальной кислоты Была предложена следующая оценка роли каталитической триады: остатки цистеина и глутаминовой кислоты берут на себя роль нуклеофила и связующего звена соответственно, в то время как остаток лизина участвует в стабилизации образующегося в ходе реакции интермедиата с четвертичной структурой [276]. Нитрилазы являются мультимерными энзимами, при работе с которыми особенно сложной проблемой является их стабилизация. В случае мономерных ферментов, первым шагом их инактивации будут изменения в их третичной структуре, тогда как при инактивации мультимерных ферментов происходит диссоциация субъединиц фермента или нарушения, связанные с неправильной сборкой субъединиц. По этой причине предотвращение диссоциации фермента – это основная задача, необходимая для их стабилизации. Успешные работы по стабилизации мультимерных энзимов были проведены с помощью различных методов иммобилизации [232, 243]. Нитрилазы – чувствительные к кислороду ферменты, что связано с аутоокислением Инактивации остатков кислородом цистеина, можно находящихся избежать при в активном проведении центре. реакции в бескислородной среде. Добавление биологически совместимых электролитов с 37 высокой ионной силой может снизить концентрацию кислорода в реакционной смеси и скорость инактивации фермента. Однако такой подход может вызвать трудности при использовании различных гидрофобных субстратов. Другим возможным решением может быть окружение молекулы фермента гидрофильной оболочкой, снижающей концентрацию кислорода в среде фермента. Доказано, что создание гидрофильных оболочек вокруг иммобилизованных ферментов стабилизирует их, уменьшая вредное воздействие органических растворителей. Предполагают, что этот эффект вызван снижением концентрации органического растворителя вокруг молекулы фермента [377]. Таким образом, стабилизация нитрилаз должна включать в себя два момента: предотвращение диссоциации мультимера на субъединицы и защита активного центра от окисления. Однако, температурный и рН-диапазон работы этих ферментов достаточно широк, хотя у большинства нитрилаз рН-оптимум активности сдвинут в щелочную область (Таблица 3). Диапазон возможностей применения нитрилаз на сегодняшний день довольно широк, многие из катализируемых нитрилазой биотрансформаций имеют потенциал для технического использования, однако ферменты и/или условия процесса должны быть доработаны, чтобы удовлетворять условиям промышленного процесса. Для достижения этой цели могут быть использованы скрининг ферментов из новых источников, модификация структуры субстрата, подбор параметров среды и реакционного процесса, инженерия ферментов и различные способы иммобилизации, а также возможно совмещение этих подходов. В результате можно добиться улучшения субстратной специфичности, стабильности, активности или энантиоселективности, а также снижение амидной доли в нитрилазном продукте. Перспективным также считается использование нитрилаз в сочетании с другими ферментными или химическими катализаторами, что может привести к более эффективной эксплуатации нитрилаз в биокатализе. Такие подходы были разработаны, например, для синтеза (S)-миндальной кислоты, (S)–амида миндальной кислоты или гликолевой кислоты [276, 362]. 38 Температура, ºС Микроорганизм оптимум Acidovorax facilis 72W cтабильность рН оптимум КМ, M cтабильность субстратная специфичность Ссылка Таблица 3 – Каталитические свойства некоторых нитрилаз 5,6×10-2 65 ˂60 - 5–10 алифатические динитрилы [347] 1,2×10-2 Acinetobacter sp. AK226 50 ˂60 8 5,8–8 алифатические, гетероциклические нитрилы [411] 2,2×10-2 Alcaligenes sp. ECU0401 A. faecalis JM3 A. faecalis ATCC 8750 A. faecalis ZJUTB10 A. faecalis MTCC 10757 40 45 ˂50 20–50 8 7,5 - 7–8 алифатические и ароматичексие нитрилы 3,3×10-4 [161] арилацетонитрилы [288] 5,8×10-3 40–45 ˂50 7,5 6,5–8 арилацетонитрилы [412] 35 ˂35 7,7–8,5 - - [190] - алифатические и ароматичексие нитрилы [317] 35 - 8 8,57×10-3 Arthrobacter nitroguajacolicus ZJUTB06-99 40 ˂50 6,5 - по фенилацето нитрилу; 1,17 ×10-2 [370] по акрилонитрилу 9,2×10-4 Bacillus pallidus Dac521 65 ˂65 7,6 6–9 ароматические нитрилы [105] Brevibacterium sp. R312 35 ˂30 7 - 2,5×10-2 [210] 39 Температура, ºС Микроорганизм оптимум Klebsiella ozaenae Pseudomonas sp. 13 35 55 cтабильность ˂60 рН оптимум 9,2 9 cтабильность 7–11 КМ, M 3,1×10-4 Ссылка Таблица 3 – Продолжение бромоксинил [378] β-циано-Lаланин [413] 8,3×10-2 1,9×10-5 Pseudomonas sp. P. fluorescens DSM 7155 - 55 P. fluorescens Pf5 45 P. putida 40 Pyrococcus abyssi GE5 80 - ˂65 ˂50 60–90 - 9 7 7 7,4 7,4–8,8 6,5–8 6,0–8,0 Nметил/этил[357] 3-циано-4метокси-2пиридон 8,7×10-5 арилацетонитрилы 1,8×10-2 динитрилы 1,3×10-2 [266] [226] арилацетонитрилы [120] по малононитрилу [164] 3,47×10-3 0,1 Rhodococcus sp. NDB1165 45 ˂50 8 - ароматические и ненасыщенные алифатические нитрилы [93] 1,0×10-2 R. erythropolis ZJB-0910 30 ˂30 7,5 - β-гидрокси[309] алифатические нитрилы 4,5×10-2 R. rhodochrous PA-34 35 ˂35 7,5 - алифатические и ароматичексие нитрилы [116] 40 Таблица 3 – Продолжение Микроорганизм оптимум R. rhodochrous NCIMB 11216 R. rhodochrous K22 cтабильность рН оптимум cтабильность Ссылка Температура, ºС КМ, M 2,1×10-2 30 - 8 - ароматические нитрилы [218] алифатические нитрилы [341] 1,9×10-2 50 ˂55 5,5 - 1.2. Биокаталитическое получение амидов и карбоновых кислот из нитрилов Нитрильные соединения широко распространены в природе, главным образом, присутствуют в растениях в виде цианогликозидов, а также цианолипидов, цианоалкалоидов, рицина, фенилацетонитрила и др. Более 2000 видов растений накапливают цианогликозиды в семенах, корнях и листьях, а также секретируют нитрильные метаболиты в виде основного компонента экссудата ризосферы корней. Вероятно, этот процесс влияет на эволюцию и распространение микроорганизмов, способных к ассимиляции нитрилов [277]. Кроме того, химическая промышленность широко использует различные органические нитрилы для производства ряда полимеров, химических веществ и фармпрепаратов. Эти соединения также используются в качестве растворителей, экстрактантов, пестицидов, в органическом синтезе аминов, амидов, карбоновых кислот, эфиров, альдегидов, кетонов и гетероциклических соединений. Многие нитрилы очень токсичны, обладают мутагенным и канцерогенным действием, инактивируют респираторную систему, связываясь с цитохром С оксидазой. Биодеградативный потенциал микроорганизмов позволяет использовать их в качестве основного звена в биологической очистке окружающей среды от высокотоксичных нитрилов [121, 268]. 41 Микроорганизмы, трансформации обладающие нитрильных соединений, ферментативными могут быть системами использованы в биотехнологической промышленности для получения соответствующих амидов и карбоновых кислот. Благодаря своим уникальным свойствам (высокой удельной активности и стабильности, хемо-, регио- и энантиоселективности) ферменты метаболизма нитрилов находят широкое применение в органическом синтезе. Наиболее ярким примером применения нитрилгидролизующих бактерий в производстве является промышленное получение акриламида из акрилонитрила, начатое в середине 80-х гг прошлого века японской компанией Nitto Chemical Ltd. С тех пор биотехнологический способ производства акриламида был усовершенствован, получены новые штаммы, осуществляющие гидратацию акрилонитрила с большой степенью эффективности. В России промышленная технология получения биоакриламида разработана в ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов совместно с его Саратовским филиалом (в настоящее время ЗАО «Биоамид») и Саратовским филиалом НИИ полимеров на основе высокопродуктивного штамма Rhodococcus rhodochrous M33. В настоящее время в мире свыше 25% акриламида производится с помощью биокатализа (в Китае – свыше 40%), этот биотехнологический способ получил свое развитие в Японии, России, Китае и Южной Корее [14]. Акриловая кислота является сырьем для получения полимеров и сополимеров различного назначения, широко применяемых во всех сферах народного хозяйства. Акриловые полимеры применяются в производстве суперабсорбирующих материалов, флокулянтов, диспергирующих и загущающих агентов, лакокрасочных материалов, моющих средств, клеев, шпатлевок, текстиля. Объемы производства акрилатов неуклонно возрастают на протяжении двух последних десятилетий, что обусловлено ростом потребности в акриловой кислоте в среднем на 4–5% ежегодно [3]. Получение акрилатов из акрилонитрила может быть осуществлено с помощью ферментативных систем микроорганизмов либо двустадийно – нитрилгидратазой до амида и амидазой до соответствующей карбоновой кислоты, либо одностадийно нитрилазой. Большинство описанных 42 микроорганизмов обладает низкой активностью нитрилазы, что делает их промышленное использование нерентабельным и обусловливает необходимость дальнейшего поиска и селекции новых штаммов и совершенствование технологии биосинтеза акрилатов. Сотрудниками ЗАО «Биоамид» (Саратов) совместно с ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва) путем направленной селекции Alcaligenes denitrificans С-32 [59] получен штамм A. denitrificans ВКПМ В-9582, обладающий нитрилазной активностью, достаточной для промышленного получения акрилата аммония [69]. Предприятие «Ашленд МСП» (Пермь) для собственных нужд (производства флокулянтов) производит биокаталитическим путем сотни тонн акрилата аммония, используя в качестве катализатора штамм A. denitrificans С-32 и его мутант [14]. Пиридинкарбоновые кислоты и их амиды – предшественники ряда фармацевтических препаратов и различных востребованных в народном хозяйстве химических соединений. Витамины группы PP (никотинамид и никотиновая кислота) являются необходимым элементом питания и признанным официальной медициной лекарственным средством [112]. Изоникотиновая кислота является промежуточным продуктом в синтезе ряда противотуберкулезных препаратов группы гидразида изоникотиновой кислоты, антидепрессантов – ингибиторов моноаминооксидазы, хинуклидиновых лекарственных средств. Некоторые производные пиколиновой кислоты, в частности, 6-метилпиколиновая кислота – промежуточные продукты в синтезе фармацевтических препаратов, например, димеколина [82]. Впервые возможность получения ароматических карбоновых кислот из соответстующих нитрилов биокаталитическим способом была показана японскими исследователями в 1988 году. Ферментативная конверсия 3-цианопиридина в никотиновую кислоту и никотинамид была осуществлена при использовании в качестве биокатализатора клеток R. rhodochrous Jl, содержащих нитрилгидратазу и нитрилазу [300, 305]. Компании Nitto, BASF и Lonza разработали промышленный процесс биотрансформации 3-цианопиридина в никотинамид на основе клеток R. 43 rhodochrous Jl [112]. Общий годовой объем производства никотинамида биотехнологическим путем превышает 3000 тонн [14]. Способность к трансформации ароматических нитрилов до соответствующих амидов и карбоновых кислот встречается у представителей различных родов бактерий: Rhodococcus, Nocardia, Agrobacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter [18] и грибов Fusarium, Aspergillus, Giberella, Pinicillum [224]. Кроме биокатализатора R. rhodochrous Jl, для синтеза пиридинкарбоновых кислот и их амидов в лабораторных условиях были использованы нитрилаза Aspergillus niger К10 [342], клетки Microbacterium imperiale CBS 498-74 [112, 295, 296], R. rhodochrous PA-34 [330], N. globerula NHB-2 [308, 366, 367], R. erythropolis MTCC 1526 [240], B. pallidus Dac521 [106]. Группой исследователей под руководством L. Martínková был разработан процесс синтеза никотиновой кислоты в мембранном реакторе [112, 295, 296]. Нитрилгидролизующие ферменты способны осуществлять региоселективные трансформации, т.е. предпочтительное протекание реакции по одному из нескольких возможных реакционных центров молекулы. Так, нитрилаза Acidovorax facilis 72W и нитрилгидратазно-амидазная ферментативная система нескольких штаммов Comamonas testosteroni гидролизует (E,Z)-2-метил2-бутанонитрил до (E)-2-метил-2-бутановой кислоты (тиглиновой кислоты), интермедиата синтеза ряда фармпрепаратов и ароматизаторов [354]. С помощью нитрилазы из R. rhodochrous J1 был осуществлен региоселективный синтез 3- и 4цианобензойных кислот из изофталонитрила и терофталонитрила соответственно, со степенью конверсии более чем 99% [251]. Некоторые амидазы [160, 193, 199, 208, 215, 254, 263, 293, 345] и нитрилазы [116, 119, 120, 161, 171, 190, 191, 195, 355, 362, 411], редко – нитрилгидратазы [322, 346], обладают стереоселективностью, т.е. способностью гидролизовать преимущественно один изомер из рацемической смеси. Это свойство определяет интерес к этим ферментам как катализаторам синтеза энантиомерно чистых предшественников фармпрепаратов. Например, стереоселективная нитрилаза 44 может гидролизовать 3-гидроксиглутаронитрил до (R)-4-циано-3- гидроксибутирата, являющегося промежуточным соединением при синтезе препарата Аторвастатина (Lipitor), снижающего уровень холестерина в крови и являющегося на настоящий момент одним из наиболее продаваемых лекарственных препаратов в мире [299]. Эта трансформация может также катализироваться нитрилгидратазно-амидазной стереоселективностью обладает амидаза, как системой, в случае в которой конверсии 3- гидроксиглутаронитрила штаммом R. erythropolis N'4 [159]. Оптически активные 2-арилпропионовые кислоты являются активными субстанциями для синтеза нестероидных противовоспалительных средств – профенов. Известно, что активность профенов заключается в S-энантиомере. Тем не менее, многие профены используются как рацемические соединения, из-за сложности их получения в виде оптически чистых растворов. Поэтому ферментативный энантиоселективный синтез представляет для фармацевтической промышленности особый интерес. Так, в результате скрининга был выделен штамм Acinetobacter sp. AK226, конвертирующий рацемический 2-(4'- изобутилфенил)пропионитрил в S-(+)-2-(4'-изобутилфенил)пропионовую кислоту – S-(+)-ибупрофен [340]. Амид D-фенилглицина и D-фенилглицин являются ключевым интермедиатом в синтезе полусинтетических антибиотиков [107, 108, 144, 223]. Путем скрининга были получены штаммы рода Rhodococcus, использующие различные нитрилы в качестве единственного источника углерода и азота и обладающие неселективной нитрилгидратазой и экстремально селективной Lамидазой. Эти культуры гидролизовали D,L-фенилглицинонитрил до амида Dфенилглицина с выходом 48% и более чем 99% энантиомерным избытком и Lфенилглицина с выходом 52% и ee 97% [223]. Проведена трансформация рацемического фенилглицинонитрила в D-фенилглицин с энантиомерным избытком 95–98% клетками Pseudomonas aeruginosa 10145 [107, 108]. Выделено и исследовано несколько бактериальных изолятов, содержащих стереоселективную нитрилгидратазу. Различными штаммами Pantoea sp. и Nocardioides sp. 45 осуществлен гидролиз (RS)-фенилглицинонитрила до (S)-фенилглицина (˃99% ee), (R)-фенилглицина (˃99% ee), и амида (S)-фенилглицина (52% ee) [214]. Одно из направлений исследований нитрилгидролизующих бактерий и их ферментов связано с синтезом энантиомеров миндальной кислоты. (R)-(-)миндальная кислота является ключевым интермедиатом для получения полусинтетических цефалоспоринов и пенициллинов [362]. (R)-(-)-миндальная кислота была получена из рацемического нитрила миндальной кислоты в процессе биокатализа клетками Alcaligenes faecalis ATCC 8750 c энантиомерным избытком 100% [339], Pseudomonas putida MTCC 5110 с ee 98,8% [119, 195], ферментным препаратом грубой очистки, содержащим нитрилазу из A. faecalis МТСС 126 с ee 98,89% [355], изолятами P. putida, Microbacterium paraoxydans, M. liquefaciens с ee 93% [362]. 1.3. Иммобилизация клеток нитрилгидролизующих бактерий для целей биокатализа и биодеградации Данные, касающиеся иммобилизации клеток нитрилгидролизующих бактерий, обобщены в таблице 4. Анализ литературных данных показал, что подавляющее большинство нитрилутилизирующих исследований, микроорганизмов, касающихся связано иммобилизации с изучением биокаталитических свойств клеток, включенных в структуру гелей. Наиболее распространенным носителем, применяемым в этом методе иммобилизации клеток, является альгинат кальция. Так, клетки P. putida MTCC 5110, обладающие нитрилазной активностью, были включены в структуру альгината кальция и использованы для энантиоселективного гидролиза нитрила миндальной кислоты. Удельная активность иммобилизованных клеток была в 1,56–1,77 раза ниже, чем таковая свободных клеток при соответствующих рН, что, по предположению авторов, было обусловлено ограничением массопереноса в гелевом матриксе [119]. Известно, что одной из основных проблем иммобилизации биокатализатора являются ограничения массопереноса, возникающие из-за некаталитического матрикса, который составляет наибольшую часть иммобилизованного препарата. Нерастворимость многих нитрильных субстратов в водной среде приводит к 46 эскалации диффузионных проблем, что, в свою очередь, приводит к падению скоростей реакций и снижению выхода продукта [243]. Таблица 4 – Иммобилизация клеток нитрилгидролизующих бактерий Штамм микроорганизмов Bacillus megaterium F-8 Фермент Субстрат биокатализа Носитель Ссылка амидаза ацетамид альгинат [135, кальция, 168] агар, ПААГ, ПВСальгинат кальция нитрилаза 3-цианопиридин альгинат кальция B. subtilis ZJB- нитрилаза 063 p-метоксифенилацетонитрил альгинат [156] кальция, агар, ПААГ, ПВС Bacillus spp. ацетонитрил, акрилонитрил альгинат кальция бензонитрил гибридные [227] матриксы, полисульфоновые мембраны, активированные формальдегидом акрилонитрил ацетат [221] целлюлозы, альгинат кальция и бария, ПААГ B. pallidus Dac521 нитрилгидратаза Bacillus sp. UG- нитрилаза 5B Brevibacterium CH1 нитрилгидратаза [106] [303] 47 Таблица 4 – Продолжение Штамм микроорганизмов Candida guilliermondii CCT 7207 Фермент нитрилгидратазноамидазная система Носитель алифатические и альгинат ароматические нитрилы бария и амиды Ссылка [181] ацетонитрил альгинат [182] кальция, κкаррагинан, цитрусовый пектин (R)- 2, 2-диметилциклопропана карбоксамид альгинат кальция [193] нитрил миндальной кислоты альгинат кальция [379] пропионитрил альгинат кальция, триацетат целлюлозы [128] Nocardia нитрилаза globerula NHB-2 4-цианопиридин агар [337] Pseudomonas нитрилгидchlororaphis B23 ратаза адипонитрил ПААГ, альгинат кальция [83] Pseudomonas нитрилаза spp. J-1-3, J-13-1 нитрил янтарной кислоты альгинат кальция, ПВС альгинат кальция [397] C. guilliermondii UFMG-Y65 Delftia tsuruhatensis CCTCC M 205114 Escherichia coli BL21 (DE3) рекомбинантный штамм Klebsiella oxytoca P. aeruginosa 10145 - Субстрат амидаза нитрилаза нитрилгидратазноамидазная система - 2-фенил-2аминоацетонитрил [107] 48 Таблица 4 – Продолжение Штамм микроорганизмов P. aeruginosa амидаза акриламид P. aeruginosa амидаза ацетамид, акриламид, обращенные [338] пропионамид, этиловый мицеллы эфир глицинамида тетрадецилтриметилбромида аммония в гептан/октаноле Фермент P. putida MTCC нитрилаза 5110 Субстрат Носитель альгинат кальция нитрил кислоты Ссылка [329] миндальной альгинат кальция [119] - альгинат кальция [153] P. putida MTCC 6809 амидаза Rhodococcus sp. AJ270 нитрилгидратаза транс-2-метил-3-фенилоксиранкарбонитрил альгинат кальция и бария [229] Rhodococcus sp. ATCC 39484 нитрилгидратаза пропионитрил ПВС [328] Rhodococcus AJ270 амидаза акриламид агар, агароза, анионная ионообменная смола Dowex 1 [166] R. rhodochrous LL100-21 нитрилаза 3-цианопиридин альгинат кальция [401] R. rhodochrous нитрилаза бензонитрил альгинат кальция [391] 49 Таблица 4 – Продолжение Штамм микроорганизмов R. rhodochrous NHB-2 Фермент Субстрат Носитель Ссылка амидаза ацетамид, пропионамид, акриламид агар, ПААГ, альгинат кальция [396] R. equi A4 нитрилгидратазноамидазная система бензонитрил, 3-цианопиридин, (R,S)-3-гидрокси-2метиленбутанонитрил, (R,S)-гидрокси-2метилен-3фенилпропанонитрил LentiKats® [136] R. ruber NCIMB 40757 нитрилаза акрилонитрил ImmobaSilTM [124] Тем не менее, иммобилизация в альгинате кальция обеспечивала клеткам P. putida MTCC 5110 дополнительную степень термостабильности, проявляющуюся в более высокой активности при температурах выше 45ºС. Также иммобилизация позволяла многократно использовать биокатализатор с 88%-ной эффективностью конверсии нитрила миндальной кислоты на протяжении 20 последовательных реакционных циклов. При дозированном введении субстрата в реактор продуктивность на единицу объема составляла 0,49 г миндальной кислоты/л/ч, а каталитическая продуктивность – 0,39 г кислоты на 1 г клеток, причем энантиомерная чистота продукта составляла 98,8% [119]. Для трансформации нитрила миндальной кислоты до (R)-(–)-миндальной кислоты в структуре геля альгината кальция были иммобилизованы клетки рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21 (DE3), содержащие ген нитрилазы из P. putida MTCC 5110. В ряде экспериментов гранулы альгината кальция были обработаны глутаровым альдегидом для стабилизации. При повторном использовании в последовательных циклах конверсии субстрата наиболее стабильными были клетки, иммобилизованные в альгинате кальция с обработкой 50 сшивающим агентом, наименее стабильными – суспендированные клетки. Нитрилазная активность клеток в альгинате кальция без дополнительной стабилизации была достаточно высокой на протяжении 8 последовательных циклов конверсии субстрата. Во всех случаях энантиомерная чистота продукта была близка к 100% [379]. Клетки Pseudomonas aeruginosa 10145, иммобилизованные в структуре альгината кальция, катализировали гидролиз 2-фенил-2-аминоацетонитрила в энантиомерночистый D-фенилглицин. Максимальная конверсия субстрата, составляющая 20%, была достигнута за 3 ч реакции при использовании в качестве носителя гранул, пористость которых достигалась за счет более разбавленного раствора альгината натрия (1,5% вес/об.). При этом энантиомерный избыток Dфенилглицина составлял 98% [107]. Включенные в структуру геля альгината бария клетки Candida guilliermondii CCT 7207 были способны к деградации разнообразных нитрильных соединений, тогда как дрожжи в свободном состоянии не метаболизировали бензонитрил, циклопентанокарбонитрил и бензамид [181]. Инкапсулированные в альгинате кальция и бария клетки Rhodococcus sp. AJ270, содержащие нитрилгидратазноамидазную ферментативную систему, эффективно катализировали биотрансформацию рацемического транс-2-метил-3-фенил-оксиранкарбонитрила до энантиомерночистого 2R,3S-(–)-2-метил-3-фенил-оксиранкарбоксамида в присутствии органических растворителей метанола и ацетона [229]. Скрининг различных носителей, среди которых были альгинат кальция, агар, полиакриламид, ПВС, для иммобилизации клеток Bacillus subtilis ZJB-063, содержащих нитрилазу, показал, что наибольшей активностью в реакции биосинтеза p-метоксифенилуксусной кислоты из p-метоксифенилацетонитрила обладал препарат, в котором матриксом являлся альгинат кальция. За ним следовал агар, а иммобилизованный биокатализатор на основе ПАА и ПВС проявил наименьшую активность. Клетки, включенные в структуру геля альгината кальция, могли быть повторно использованы на протяжении 9 последовательных реакционных циклов с сохранением не менее 50% активности, 51 а дополнительная обработка гранул полиэтиленимином и глутаровым альдегидом приводила к увеличению операционной стабильности до 18 циклов [156]. Некоторые авторы, наоборот, отмечают преимущества использования в качестве гелевого матрикса ПВС по сравнению с альгинатами. Так, гранулы геля ПВС, содержащие клетки, механически более устойчивы, и что более важно, не теряют своей структуры при использовании широкого ряда буферов различных значений рН, тогда как гель альгината кальция растворяется в кислых растворах. Высушенные гранулы геля ПВС с иммобилизованными в их структуре клетками Rhodococcus sp. ATCC 39484 не теряли своей нитрилгидратазной активности при регидратации [328]. Среди четырех изученных носителей – ацетата целлюлозы, альгинатов кальция и бария и полиакриламида показано преимущество последнего для иммобилизации клеток Brevibacterium CH1, обладающих высокой активностью нитрилгидратазы по отношению к акрилонитрилу в сочетании с низкой активностью амидазы. Т.к. фермент быстро деактивировался при достижении концентрации акрилонитрила 10,1%, в реакторе поддерживали концентрацию субстрата ниже 3% и температуру 4ºС [221]. Гели триацетата целлюлозы и альгината кальция были использованы для иммобилизации клеток Klebsiella oxytoca, осуществляющих биодеградацию пропионитрила. Иммобилизованные системы были более эффективны, чем свободные клетки, для удаления пропионитрила в широких диапазонах температур (20–40ºС) и рН (6–8) и осуществляли деградацию субстрата до 99% в пяти последовательных циклах [128]. Возвращаясь к сравнению альгинатных гелей с другими носителями, нужно подчеркнуть, что примеры преимущества этих матриксов для иммобилизации клеток нитрилгидролизующих микроорганизмов встречаются чаще. Так, клетки Candida guilliermondii UFMG-Y65, иммобилизованные в Са-альгинате, деградируют ацетонитрил более эффективно, чем включенные в структуру геля κкаррагинана или цитрусового пектина [182]. Иммобилизация клеток Pseudomonas chlororaphis B23, содержащих нитрилгидратазу, гидратирующую адипонитрил до 5-циановалерамида с высокой региоселективностью, в гели агарозы и 52 κкаррагинана оказалась невозможна, т.к. клетки быстро деактивировались при температурах, необходимых для иммобилизации в этих матрицах (35–50ºС). Адсорбция на поверхности пористых неорганических носителей (таких как цеолит и пористое стекло) также не была предпочтительной из-за очень низкой удельной активности биокатализатора и механического истирания частиц в реакторе с перемешиванием. Высокая удельная активность биокатализатора была достигнута при включении клеток в структуру ПААГ и альгината кальция, но в идентичных условиях последний был более предпочтителен из-за его стабильности и большего выхода продукта на единицу веса катализатора [83]. Показано преимущество геля альгината кальция перед непрочными гранулами геля ПВС для иммобилизации клеток штаммов псевдомонад, деградирующих нитрил янтарной кислоты [397]. Иммобилизация клеток B. pallidus Dac521, продуцирующих нитрилазу, в структуре альгината кальция не воздействовала на удельную активность фермента, которая в реакции трансформации 3-цианопиридина до никотиновой кислоты сохранялась на уровне 98% от активности нативных клеток. При этом клетки были более устойчивы к инактивации при 60ºС, чем неиммобилизованные. Колоночный биореактор, заполненный иммобилизованным биокатализатором, функционировал при 50 и 60ºС с сохранением 100% нитрилазной активности в течение 100 и 10 ч соответственно [106]. Одним из способов преодоления ограничений массопереноса, возникающих при иммобилизации клеток в структуре гелей, является повышение температуры реакции. Но в этом случае активность ферментов будет снижаться в результате тепловой денатурации. Так, хотя иммобилизованные методом включения в структуру геля альгината кальция клетки B. pallidus Dac521 сохраняли 98% своей первоначальной активности при трансформации 3-цианопиридина, нитрилазная активность при 50°С составляла лишь 37 нмоль/мг/мин [106]. В сравнении со штаммом B. pallidus Dac521, содержащим термофильную нитрилазу, клетки Nocardia rhodochrous (R. rhodochrous) LL100-21, нитрилаза которых мезофильна, сохраняли только 38% 53 активности при иммобилизации в структуре геля альгината кальция, хотя при этом активность составляла 61 нмоль/мг/мин при 30°С [401]. Показано, что иммобилизация клеток термофильных Bacillus spp. в геле альгината кальция обеспечивала небольшую дополнительную термо- и химическую стабильность к высоким концентрациям субстрата, но скорость утилизации субстрата была лимитирована диффузионными затруднениями [303]. Также клетки R. rhodochrous, инкапсулированные в гранулы альгината, осуществляли биотрансформацию бензонитрила до бензойной кислоты нитрилазой со снижением скорости реакции на 26% по сравнению со свободными клетками [391]. В свою очередь, деградация акриламида амидазосодержащими клетками Pseudomonas aeruginosa, включенными в структуру геля альгината кальция, начиналась раньше, чем свободными, однако к третьим суткам деградация неиммобилизованными клетками была интенсивнее [329]. Клетки Rhodococcus AJ270, проявляющие амидазную активность, были иммобилизованы включением в гель агара и агарозы с целью дальнейшего использования для получения акриловой кислоты, и в качестве сравнения адсорбированы на анионной ионообменной смоле Dowex 1. По сравнению с бактериями, адсорбированными на Dowex 1, клетки, включенные в структуру агара, проявляли восьмикратно более высокую активность в расчете на см3 матрикса. Адсорбция и включение в структуру геля приводили к увеличению термостабильности амидазы в 3–4 раза, кроме того, включение в агар приводило к сдвигу рН оптимума с 8 до 7 и увеличению Km [166]. Клетки B. megaterium F-8, содержащие амидазу, были иммобилизованы в структуру гелей альгината кальция, агара, ПАА, и ПВС-альгинат кальция [135, 168]. При включении клеток в структуру гелей агара, ПАА и ПВС-альгинат кальция сохранялось 75, 65 и 80% ацилтрансферазной активности амидазы в реакции трансформации ацетамида в ацетогидроксамовую кислоту, тогда как при иммобилизации клеток в ферментативной активности структуре не геля наблюдалось. альгината кальция потери Иммобилизованные клетки проявили устойчивость по отношению к высоким концентрациям ацетамида 54 (более 600–700 мМ), в то время как рост свободных клеток при этих концентрациях субстрата полностью ингибировался. При проведении повторных циклов трансформации ферментативная активность иммобилизованных клеток постепенно повышалась к 5-му циклу, после чего активность оставалась постоянной до 10-го цикла [135]. Подобная зависимость при многоцикловом использовании была обнаружена для клеток R. rhodochrous NHB-2, иммобилизованных в агаре и ПААГ: после 5-го цикла амидазная активность, рассчитанная в % от исходной активности неиммобилизованных клеток, повышалась соответственно с 75 и 65% до 98 и 92%. Клетки, иммобилизованные в структуре геля альгината кальция, проявили более высокую термостабильность, чем свободные [396]. T.C. Bhalla с соавторами сообщили об эффективной конверсии 4цианопиридина клетками Nocardia globerula NHB-2, иммобилизованными в 1%ном агаре. При этом концентрация субстрата в среде, равная 100мМ, была оптимальна для конверсии иммобилизованными клетками [337]. Клетки R. equi A4, проявляющие нитрилгидратазную и амидазную активность, были иммобилизованы в гранулах гидрогеля LentiKats® линзообразной формы, которые представляют собой сополимер ПВС и полиэтиленгликоля. Полученный иммобилизованный биокатализатор был использован для биотрансформации бензонитрила, 3-цианопиридина, (R,S)-3гидрокси-2-метиленбутанонитрила фенилпропанонитрила. и Иммобилизованные (R,S)-гидрокси-2-метилен-3клетки полностью сохраняли нитрилгидратазную активность после иммобилизации, но стабильность фермента при повторных циклах трансформации была невелика. Наоборот, амидаза полностью сохраняла свою активность при повторном использовании биокатализатора. Исключительная стабильность биокатализатора при конверсии 3-гидрокси-2-метиленбутанонитрила позволила авторам предположить, что маленькие молекулы алифатических нитрилов являются наиболее подходящими субстратами [136]. 55 Клетки умеренно термофильного штамма Bacillus sp. UG-5B, обладающего нитрилазной активностью, были иммобилизованы различными способами – на поверхности (либо в структуре) разных носителей. Для включения клеток были использованы гибридные соль-гель матриксы, в которых предшественник оксид кремния был заменен 5–20% органического компонента – полиэтиленгликоля и/или ПВС. Клетки были включены в структуру вышеперечисленных матриксов, либо адсорбированы на них. Кроме того, для ковалентного связывания клеток были использованы предварительно те же носители активированные и полисульфоновые формальдегидом. Активация мембраны, носителей приводила к возрастанию ферментативной активности связанных клеток в 3 раза и была наибольшей для клеток на активированных мембранах (0,53 ЕД/мг клеток, где 1 ЕД соответствует количеству фермента, продуцирующему 1 мкм аммония в мин при конверсии бензонитрила). При повторных циклах конверсии наименьшей стабильностью обладали адсорбированные клетки [227]. S. Chacko с соавторами изучали продукцию амидазы иммобилизованными в альгинат кальция клетками P. putida MTCC 6809 и влияние дегидратации гранул на продукцию этого фермента. Иммобилизованный биокатализатор асептически переносили в свежую питательную среду, выращивали в течение 48 ч и определяли его амидазную активность. Авторы отмечают, что амидазная активность увеличивалась после 1 цикла, достигая максимума ко 2, 3 и 4-му циклам, после чего снижалась с сохранением 70% активности к 5 и 6-му циклу. Включение клеток в гранулы альгината обеспечивало небольшое повышение активности при 35 и 45°С на 20 и 10% соответственно. Дегидратация гранул приводила к снижению активности, которая составляла лишь 27% по сравнению с гидратированными гранулами, хотя и давала ряд преимуществ, таких как снижение риска бактериальной контаминации и легкость в транспортировке [153]. Был проведен асимметрический гидролиз (R)-2, 2-диметилциклопропана карбоксамида из рацемического (R, S)-2, 2-диметилциклопропана карбоксамида клетками Delftia tsuruhatensis CCTCC M 205114, иммобилизованными в геле альгината кальция, с целью накопления в среде S-изомера – ключевого 56 интермедиата циластатина. Иммобилизованные клетки проявили более высокую операционную стабильность по сравнению со свободными клетками – при включении клеток в стуктуру альгината кальция к 8-му циклу конверсия составляла 83,1%, тогда как у свободных клеток этот показатель был менее 50% после 3-х последовательных циклов реакции [193]. Также для получения гетерогенного биокатализатора был разработан метод образования обращенных тетрадецилтриметилбромида мицелл аммония в катионного гептане/октаноле сурфактанта (80/20%) с включенными в них клетками Pseudomonas aeruginosa, содержащими амидазу. Такие мицеллярные системы были использованы для синтеза гидроксамовых кислот. Иммобилизованный биокатализатор обладал большей стабильностью и проявлял более высокую активность при более низких концентрациях субстрата по сравнению со свободными клетками [338]. Иммобилизация нитрилгидролизующих бактерий была выполнена и для других целей – так, клетки R. ruber NCIMB 40757 в матриксе пористых колец из диметилсиликона ImmobaSilTM осуществляли детоксикацию паров акрилонитрила [124] и были использованы в составе кондуктометрического биосенсора для определения акрилонитрила в растворе [180]. По современным представлениям, микроорганизмы в природе существуют в виде структурированных сообществ – биопленок, формирующихся на поверхности раздела фаз [43]. При сравнении планктонных и прикрепленных популяций, одной из наиболее явных отличительных черт биопленок является внеклеточный полимерный матрикс, в который заключены клетки [209]. Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток внутри хорошо организованных систем [23]. Помимо общеизвестной отрицательной роли микробных биопленок, которая заключается в биокоррозии трубопроводов и систем коммуникации, в развитии инфекционного процесса, усугубляющегося повышенной устойчивостью биопленкообразующих микроорганизмов к антибиотикам и бактерицидным агентам, колонизацией медицинского оборудования, 57 имплантантов и катетеров, есть и другая, положительная сторона процесса пленкообразования. То, что является серьезной медицинской проблемой, становится неоспоримым преимуществом при биологической очистке сточных вод и загрязненных почв. Устойчивость к биоцидам, токсичным веществам, растворителям, высоким концентрациям тяжелых металлов позволяет рассматривать микробные биопленки как основное звено процесса биодеградации поллютантов. Кроме того, биопленки промышленно значимых штаммов микроорганизмов могут рассматриваться как самоиммобилизующиеся и саморегенерируемые биокатализаторы, что особенно актуально в тех случаях, когда субстраты и/или продукты биокатализа отрицательно воздействуют на жизнеспособность клетки [281]. Если использование биопленок в биологической очистке сточных вод имеет длительную историю, то целесообразность применения самоиммобилизованных в процессе роста микроорганизмов для целей биокатализа до сих пор остается спорным вопросом. В зависимости от природы катализатора, реакции, используемых субстратов и образующихся продуктов разработаны различные подходы к использованию в этих процессах целых клеток микроорганизмов. Целые клетки главным образом применяются в реакциях, основанных на катализе нестабильными, мультикомпонентными или мембран-связанными ферментами, или в сложных многостадийных реакциях и/или требующих присутствия кофакторов. Кроме того, целые клетки предпочтительнее изолированных ферментов из-за возрастания стоимости процесса, требующего стадии их выделения и очистки. Можно отметить несколько различных стратегий, касающихся цельноклеточного катализа, которые могут быть дифференцированы в зависимости от типа реакции (ферментация или биотрансформация) и типа используемых клеток (свободные или иммобилизованные, растущие или покоящиеся). Особый тип биокатализатора представляют биопленки, которые состоят из смеси растущих и покоящихся клеток и применимы как для ферментации, так и для биотрансформации [281]. 58 Многие микроорганизмы способны формировать биопленки, представляющие собой монокультуру, и являться биокатализаторами различных процессов трансформаций органических веществ. Монопленки микроорганизмов предпочтительны для процессов получения органических веществ, т.к. при этом возможен контроль и максимальный выход желаемых продуктов [130, 131]. В то же время, конструирование многовидовых бактериальных сообществ может оказаться полезным для выполнения каскадных или многошаговых реакций в синтезе предшественников фармпрепаратов или в биоэнергетике [212]. Возможность осуществления процессов с использованием биопленок зависит от биологических свойств микроорганизмов. Известно, что рост биопленки – это многостадийный процесс, включающий начальный этап прикрепления клетки к твердой поверхности, за которым следует необратимая адгезия, обусловленная внеклеточными полимерными веществами, продуцируемыми клеткой, пролиферация клеток и созревание биопленки, и, наконец, отрыв клеток от биопленки [209]. Внеклеточный полимерный матрикс, в составе которого могут быть углеводы, протеины, ДНК и липиды, сильно варьирует у различных микроорганизмов в зависимости от условий окружающей среды и, в свою очередь, оказывает влияние на морфологию и физиологию биопленки. При использовании биопленок в промышленности образование внеклеточного полимерного матрикса должно строго контролироваться, т.к. его избыток ограничивает массоперенос и загрязняет среду, снижая продуктивность катализа. Влияние образования внеклеточного полимерного матрикса на продуктивность, по-видимому, обусловлено свойствами самого организма, составом среды и типом процесса. Требования к микроорганизму, биопленка которого используется для биотрансформаций, заключаются в следующем: 1) непатогенность; 2) генетическая стабильность; 3) возможность быстрого образования прочно прикрепленной биопленки; 4) отсутствие избыточного образования внеклеточных полимерных веществ [281]. Многослойные зрелые биопленки состоят из клеток в различном физиологическом состоянии, причем на этой стадии развития биопленок обычно 59 наблюдается ограничение диффузии субстратов и продуктов. Различия в физиологическом состоянии и метаболической активности клеток, наряду с ограничением диффузии, создают градиенты субстратов и продуктов в биопленках. Хорошо известно, что биопленки обладают повышенной по сравнению с суспендированными клетками толерантностью к антимикробным агентам, токсичным веществам и другим вредным факторам. Ряд механизмов резистентности связан с такими моментами, как ограничение диффузионных процессов, лимитирование роста клеток, образование особых клеток в переживающем состоянии – «персистеров» и активное удаление токсинов. Некоторые из этих механизмов устойчивости могут быть неблагоприятны для продуктивного катализа. Например, устойчивость, обусловленная ограничением роста или состоянием метаболического покоя, может затруднять продукцию метаболитов, связанных с ростом, тогда как ограничение массопереноса и активное удаление токсичных субстратов посредством эффлюкса или деградации может негативно воздействовать на продуктивность [281]. Несмотря на то, что биопленки микроорганизмов традиционно используются для очистки сточных вод [47, 115, 213, 236, 275, 286, 324, 351, 373] и деградации поллютантов [139, 356], имеются примеры эффективного использования биокатализаторов в виде биопленок микроорганизмов в процессах ферментации и трансформации органических веществ. В реакторах, основанных на жизнедеятельности микробных биопленок, могут быть получены этанол [167, 169, 178, 259, 262, 398], бутанол [170, 207, 350, 405], 2,3-бутандиол [274], уксусная [131], молочная [89, 179, 216, 387], янтарная [202], фумаровая кислоты [336, 372]. В лабораторных условиях были проведены трансформации стирола в энантиомерно чистый (S)-оксид стирола биопленками штамма Pseudomonas sp. VLB120ΔC [282], конверсия D-аланина в пировиноградную кислоту биопленками Acetobacter xylinum, самоиммобилизованными в целлюлозных нановолокнах, которые штамм образовывал в процессе роста [364], трансформация бензальдегида в бензиловый спирт биопленками Zymomonas mobilis [197]. Кроме 60 того, известны примеры использования биопленок микроорганизмов в биоэнергетике, в частности, для получения биогаза [114, 132, 270, 417]. Однако, что касается нитрилгидролизующих бактерий, в научной литературе имеются сведения только о деградации нитрилов биопленками для целей биологической очистки, а не для целей биокатализа. Так, был разработан процесс культивирования микроорганизмов, использующих ацетонитрил как единственный источник углерода и азота, в виде биопленки на пластиковых носителях. Для этого был использован реактор с перемешиванием и постоянной подачей ацетонитрила. Эффективность процесса деградации ацетонитрила составляла от 53 до 100% в зависимости от нагрузки органическим веществом. Чтобы улучшить биодеградационные возможности процесса, был разработан двухшаговый процесс, основанный на применении двух реакторов, работающих совместно. В этом случае была достигнута эффективность 92–100% с нагрузкой 2 г ацетонитрила/л/сутки в первом реакторе [211]. Обобщая данные научной нитрилгидролизующих бактерий, литературы, касающиеся иммобилизации следует подчеркнуть, что данные по применению адгезированных клеток для биокатализа нитрилов единичны и не подтверждают успешность этого метода. В то же время известно, что метод включения клеток в структуру гелей разработан скорее на лабораторном уровне, т.к. является более дорогим и трудозатратным, а также в большинстве случаев приводит к снижению выхода продукта из-за затруднений массообмена в матриксе гелей. Поэтому метод иммобилизации путем адгезии клеток на носителе требует детальной разработки, сопровождающейся правильным подбором носителей и условий, для дальнейшего внедрения в биокаталитическое производство. 1.4. Иммобилизованные ферменты метаболизма нитрилов В некоторых производствах гораздо выгоднее вместо целых клеток использовать изолированные ферменты или неочищенные клеточные экстракты. В этом случае ферментативная реакция имеет следующие преимущества [6]: 61 – высокоспецифична по отношению к субстрату и продукту (тогда как клетка может обладать альтернативными метаболическими путями, в ходе которых образуются нежелательные побочные продукты); – легче вести борьбу с микробным загрязнением продукта; – не требуется специальной питательной среды для выращивания клеток; – отсутствуют клеточные мембраны, препятствующие взаимодействию фермента и субстрата. Хотя большинство ферментов, имеющих промышленное значение, содержится внутри микробных клеток, некоторые из них, особенно обладающие протеазным действием, относятся к внеклеточным ферментам. Очевидно, что для использования таких ферментов нет смысла осуществлять иммобилизацию микробных клеток. Иммобилизация клеток бесполезна во всех случаях, когда субстрат представляет собой полимер или нерастворимое вещество, так как она приводит к еще большему ограничению контакта между катализатором и субстратом. Кроме того, если в клетках содержится фермент, оказывающий неблагоприятное влияние на субстрат или на продукт основной реакции, можно избавиться от этой нежелательной ферментативной активности, например, путем ее ингибирования или избирательной тепловой денатурации. Если же от нее не удается избавиться, то имеет смысл использовать очищенный фермент вместо целых клеток. В то же время при использовании ферментов в качестве промышленных катализаторов также возникает целый ряд проблем, связанных с тем, что фермент часто оказывается нестабильным; растворимый фермент практически не поддается регенерации, процесс, основанный на работе растворимых ферментов, обычно носит периодический характер, и поэтому его трудно автоматизировать [73]. Среди различных способов стабилизации ферментов можно выделить следующие: – увеличение жесткости белковой глобулы, которое препятствует ее денатурационному разворачиванию и тем самым инактивации. Этот подход 62 может достигаться образованием химических связей между молекулами с образованием водорастворимого препарата; либо многоточечного взаимодействия белка (как ковалентного, так и физического) с поверхностью носителя для получения нерастворимого, гетерогенного биокатализатора. – пространственное разделение фермента и тех факторов среды, которые не благоприятствуют сохранению каталитической активности и специфичности [37]. Иммобилизация является наиболее часто используемой стратегией, позволяющей увеличить операционную стабильность биокатализатора, улучшить операционный контроль, более легко отделять продукт от реакционной среды и избежать его загрязнения биокатализатором, а также разрабатывать различные модификации реакторов [238, 353]. В результате связывания фермента на носителе были созданы гетерогенные катализаторы, для которых в 1971 г. был введен термин “иммобилизованные ферменты” [6]. Первое применение иммобилизованных ферментов в промышленности было описано в 1967 г. Chibata с соавторами, которые получили иммобилизованную аминоацилазу Aspergillus oryzae для разделения синтетической рацемической смеси D,L-аминокислот [142]. С появлением иммобилизованных ферментов открылись принципиально новые перспективы ферментные перед препараты прикладной обладают энзимологией. рядом Иммобилизованные существенных положительных характеристик при использовании их в прикладных целях, по сравнению с нативными предшественниками [6, 150]: 1. Гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в нужный момент, использовать катализатор повторно, получать продукт, не загрязненный ферментом, что особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств. 2. Использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например, в проточных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукта путем изменения скорости потока, и в целом облегчить конструкцию реактора. 3. Иммобилизация или модификация фермента способствует 63 целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности, зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям. 4. Иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя. Разнообразие процессов (как отражение разнообразия субстратов, типа реакций, конфигураций реактора и проточных процессов) обязательно требует разработки специфичных иммобилизованных ферментов, которые могут соответствовать требованиям данного процесса. Основными задачами при разработке иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов являются выбор подходящего носителя (определяемый как некаталитическая часть иммобилизованного фермента), условий (рН, температуры и характера среды) и самого фермента [150]. При работе с мультимерными энзимами проблема стабилизации становится главной. Одной из самых интересных и важных задач является предотвращение диссоциации субъединиц [205, 232]. Природа препарата иммобилизованного фермента, очевидно, зависит от характера содержащего фермент носителя. Включение фермента осуществляют различными способами: фермент может быть ковалентно связан с носителем, адсорбирован на нем или физически включен в нее [73, 100, 232]. В начале 60-х гг XX века исследования в области твердофазной химии протеинов позволили заключить, что поперечная сшивка поверхностных аминогрупп растворенных ферментов с бифункциональным реагентом, таким как глутаровый альдегид, приводит к образованию поперечно-сшитых нерастворимых ферментов (CLEs), сохраняющих свою каталитическую активность. Тем не менее, этот метод имел множество недостатков, среди которых низкая активность, низкая механическая стабильность, трудности в использовании. В 1964 г. Quiocho и Richards показали, что поперечно-сшитые кристаллизованные ферменты (CLECs) сохраняли свою активность. Использование CLECs в качестве 64 промышленных биокатализаторов было начато в 1990-х гг компанией Vertex Pharmaceuticals и в дальнейшем коммерциализировано Altus Biologics. Первые исследования были выполнены на CLECs термолизина (КФ 3.4.24.4), представляющего интерес в производстве аспартама, а затем методика была применена к широкому ряду ферментов [369]. CLECs были устойчивы к денатурации и нагреванию, органическим растворителям и протеолизу, высокоактивны и удобны в использовании. Главным их недостатком была необходимость кристаллизовать фермент, что требовало его высокой чистоты. С другой стороны, было хорошо известно, что добавление солей, органических растворителей или неионных полимеров к водным растворам белков приводит к осаждению их агрегатов без нарушения структуры и денатурации. Последующая поперечная сшивка полученных агрегатов делает их нерастворимыми, обеспечивает поддержание их суперструктуры, и, следовательно, каталитической активности. Разработка этого подхода дала начало новому семейству иммобилизованных ферментов, которое получило название «поперечно-сшитые агрегаты ферментов» (CLEA®) [88, 368]. Т.к. осаждение ферментов из водных растворов при добавлении сульфата аммония или полиэтиленгликоля часто использовалось как один из этапов их очистки, методология CLEA объединила очистку и иммобилизацию в один этап. К настоящему времени созданы препараты CLEA различных ферментов: липаз, пенициллин G амидазы, нитрилаз, эстераз, протеаз, аминоацилаз, гликозидаз, оксидоредуктаз [368, 369]. Разработана новая технология получения структурированных самоиммобилизованных ферментов – сферозимов [284, 285, 375]. Этот метод заключается в формировании сферических каталитически активных макрочастиц, названных авторами «сферозимы», который происходит в водно-масляной эмульсии. Этот метод первоначально был разработан для липаз, обладающих гидрофобной поверхностью, гидрофобным кольцом, активный создаваемым центр которой определенными также окружен аминокислотами. В эмульсии эти белки имеют тенденцию локализоваться и ориентироваться на 65 сферической поверхности эмульсионной капли. Последующая поперечная сшивка белка приводит к формированию самоиммобилизованной частицы [375]. Иммобилизация часто приводит к резким изменениям измеряемых параметров ферментативной реакции. Это относится, например, к максимальной скорости реакции, константе Михаэлиса, оптимумам температуры и рН, влиянию ингибиторов. Степень и природа этих изменений зависят не только от использованного метода иммобилизации, но и от типа ферментативной реакции [73]. Хотя иммобилизация ферментов развивалась в соответствии с требованиями производств, следует отметить, что преимущества прикрепления ферментов к поверхности используются живой клеткой. Прикрепление ферментов к подходящей поверхности обеспечивает их локализацию в определенном месте, где требуется их активность. Иммобилизация увеличивает концентрацию фермента и может защитить его от разрушения [142]. Различные методы иммобилизации и стабилизации были применены для нитрилаз, нитрилгидратаз и амидаз. Данные, касающиеся иммобилизации ферментов метаболизма нитрилов, обобщены в таблице 5. Таблица 5 – Иммобилизация ферментов метаболизма нитрилов Фермент Источник фермента Способ иммобилизации, носитель Ссылка Нитрилаза Pseudomonas Адсорбция на носителях, fluorescens ЕВС активированных 191 полиэтиленимином; включение в структуру полимера полиэтиленимина; CLEAs (осаждение полиэтиленимином, сшивка декстран полиальдегидом) [377] Нитрилаза Alcaligenes faecalis CLEAs (осаждение DSMZ, ген изопропиловым спиртом, клонирован в сшивка глутаральдегидом) Escherichia coli [242] 66 Таблица 5 – Продолжение Фермент Источник фермента Способ иммобилизации, носитель (R)-Оксинитрилаза миндаль (Prunus CLEAs (осаждение 1,2amygdalus) диметоксиэтаном, сшивка глутаральдегидом) Ссылка [174] Нитрилаза P. putida MTCC CLEAs (осаждение сульфатом [175] 5110, ген аммония, сшивка клонирован в E. глутаральдегидом) coli BL21 (DE3) Нитрилаза Alcaligenes faecalis Адсорбция на алюминии ATCC8750 [225] Нитрилгидратаза Brevibacterium A4 Адсорбция на DEAEцеллюлозе [222] Нитрилгидратаза Rhodococcus erytropolis A4 Нитрилгидратаза Geobacillus pallidus RAPc8 CLEAs (осаждение сульфатом [137] аммония, сшивка декстранполиальдегидом) Ковалентная сшивка с [158] ® Eupergit C, активированным 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимидом Нитрилгидратаза Rhodococcus ПВС/хитозан, сшивка rhodochrous ATCC глутаральдегидом BAA-870 Амидаза Geobacillus pallidus RAPc8 Eupergit®C Амидаза Rhodococcus erythropolis CLEAs (осаждение сульфатом [321] аммония, сшивка глутаральдегидом) [322] [90] Совместная иммобилизация Нитрилаза Aspergillus niger Бутил сефароза или Fusarium solani Амидаза R. erythropolis [228] 67 Таблица 5 – Продолжение Фермент Источник фермента Способ иммобилизации, носитель (S)-Селективная оксинитрилаза маниок (Manihot CLEAs esculenta) Нитрилаза P. fluorescens EBC 191 Амидаза R. erythropolis Ссылка [390] В исследовательских работах по иммобилизации гидролаз, описанных в научной литературе последних десятилетий, первенство по количеству ссылок принадлежит методу поперечно-сшитых агрегатов ферментов (cross-linked enzyme aggregates, CLEAs). Методика получения CLEAs ферментов, основы которой были разработаны и описаны R.A. Sheldon, в ряде работ была применена для иммобилизации нитрилазы [175, 242, 377]. Известно, что нитрилазы являются довольно чувствительными фермантами из-за присутствия остатков цистеина в каталитическом центре. Поэтому создание активного и стабильного биокатализатора на основе этих ферментов остается актуальной задачей, одним из решений которой является их иммобилизация [242]. Большинство нитрилаз довольно неустойчивы в растворе, и жесткие условия реакции во время иммобилизации могут нанести ущерб их активности. Тем не менее, некоторые мягкие методы пригодны для этой цели, в первую очередь это касается получения CLEAs [283]. C. Mateo и R.A. Sheldon с сотрудниками исследовали влияние кислорода на три различные нитрилазы. В течение 40 ч происходила 50–100% потеря активности ферментов, в то время как в присутствии аргона активность нитрилаз была полностью сохранена. Такое влияние кислородного фактора обычно связывают с аутоокислением каталитического центра этих ферментов. Инактивации нитрилаз кислородом можно избежать с помощью бескислородной среды, но такая среда является серьезным ограничением для работы реактора. 68 Возможным решением является окружение молекул фермента гидрофильной оболочкой для снижения концентрации кислорода только в микроокружении фермента. Для достижения такого эффекта была проведена адсорбция ферментов на носителях, активированных полиэтиленимином, в результате чего за счет высаливающего эффекта этих катионных полимеров были достигнуты хорошие результаты по стабилизации фермента в отношении вредного воздействия органических растворителей. Предполагается, что этот эффект был обусловлен снижением концентрации органического растворителя вокруг молекул фермента. Несмотря на высокую эффективность такого биокатализатора, его подготовка является многоступенчатой и довольно сложной. В качестве очень простого и эффективного метода было предложено создание агрегатов фермента соосаждением с полимером полиэтиленимином без ковалентной сшивки. Такие агрегаты нитрилаз были гораздо устойчивее к воздействию кислорода, чем растворенные ферменты. Нитрилаза из Pseudomonas fluorescens ЕВС 191, в частности, не теряла активности при воздействии кислорода в течение 48 ч. Исследователи объясняют этот результат низкой локальной концентрацией кислорода вблизи биокатализатора благодаря высаливающему эффекту этого полимера. При сравнении таких агрегатов нитрилаз из Pseudomonas fluorescens ЕВС 191 с CLEAs, приготовленными поперечной сшивкой декстран полиальдегидом, показано сохранение соответственно 55 и 50% первоначальной активности после иммобилизации [377]. P. Kaul с соавт. продолжили работу по созданию устойчивого, высокоэффективного биокатализатора на основе нитрилазы и провели анализ влияния температуры и органических растворителей на энантиоселективность иммобилизованного фермента. Энантиоселективная нитрилаза из Alcaligenes faecalis DSMZ, экспрессированная в Escherichia coli, была очищена и использована для приготовления CLEAs. Условия для подготовки CLEAs были оптимизированы с помощью различных органических растворителей и сшивающих агентов. Максимум активности фермента сохранялся при осаждении 85% (об.) изопропиловым спиртом и дальнейшем сшивании 30 мМ глутаровым 69 альдегидом. Приготовленные таким образом CLEAs сохраняли около 80% от первоначальной нитрилазной активности. Стабильность фермента в составе поперечно-сшитых агрегатов при 30˚C и 50˚C была больше, чем у растворимого препарата. CLEAs повторно использовали в течение 5 раз, при этом сохранялось 90% активности. Потеря энантиоселективности нитрилазы с увеличением температуры (от 10 до 50˚C) наблюдалась для обоих препаратов, но этот эффект был значительно менее выраженным для CLEAs [242]. (R)-Оксинитрилаза, выделенная из миндаля (Prunus amygdalus), осуществляющая реакцию превращения альдегидов до гидроцианидов, была иммобилизована в виде CLEAs путем осаждения 1,2-диметоксиэтаном и последующей сшивкой глутаральдегидом. Полученный препарат оказался высокоэффективным биокатализатором в средах с низким содержанием воды, в которых подавляются неферментативные побочные реакции. Это повысило чистоту и энантиоселективность конечного продукта. При этом на протяжении 10 последовательных циклов реакций CLEAs оксинитрилазы не теряли активности [174]. S. Kumar с соавторами проводили осаждение агрегатов нитрилазы, ген которой был клонирован из P. putida MTCC 5110 в E. coli BL21 (DE3), сульфатом аммония (35%) и использовали глутаровый альдегид (125 мМ) в качестве сшивающего агента. При этом CLEAs сохраняли 70% активности при конверсии нитрила миндальной кислоты, а их термостабильность в диапазоне температур от 4 до 45ºС по сравнению с ферментом в растворе увеличивалась во много раз. Отмечено, что даже при 4ºС за 75 ч нитрилаза в растворе теряла 90% своей активности, тогда как 140 ч воздействие температуры 45ºС на CLEAs приводило к потере лишь 50% первоначальной активности. При повторном использовании CLEAs активность в первых циклах реакции увеличивалась, достигая максимума к 5-му циклу, после чего начинала снижаться [175]. Определенные ферменты, которые используются в одном каскаде реакций, могут совместно осаждаться, или фермент и гидрофильные полимеры могут быть 70 совместно иммобилизованы для защиты фермента от взаимодействия с газами или органическими растворителями. Альтернативой совместной экспрессии оксинитрилазы и нитрилазы является ко-иммобилизация этих ферментов в комбинированных CLEAs. Кроме того, амидазы могут быть использованы в качестве третьего ко- иммобилизованного фермента, который будет конвертировать побочный амид в карбоновые кислоты [368]. Энантиомерно чистая (S)-миндальная кислота была синтезирована из бензальдегида путем последовательных присоединения молекул воды к цианогруппе и гидролиза в биэнзиматическом каскаде, который осуществлялся комбинированными CLEAs (S)-селективной оксинитрилазы из Manihot esculenta и неселективной нитрилазы из P. fluorescens EBC 191. При включении в CLEAs амидазы из R. erythropolis, конвертирующей побочный продукт амид, получили чистую (S)-миндальную кислоту с выходом 90% и энантиомерной чистотой более 99% [390]. Попытки иммобилизации нитрилазы другими способами, в частности, на полимерном носителе Eupergit®C, оказались неудачными. Так, несмотря на то, что связывание фермента с полимером достигало 98%, он полностью инактивировался, а насыщение нитрилазы субстратом перед иммобилизацией с целью защиты активного центра от взаимодействия с носителем приводило к сохранению лишь 3,5% первоначальной активности нативного энзима. Авторы предполагают, что причиной инактивации явилось либо связывание цистеиновых групп активного центра с оксирановыми группами носителя, либо потеря мультимерной активной структуры ферментного комплекса в процессе связывания [363]. Была показана возможность использования нитрилазы, иммобилизованной на алюминии, в синтезе из нитрилов ряда α-гидрокси и α-гидроксизамещенных карбоновых кислот, в частности, 2-гидрокси-4-метилтиобутановой кислоты, однако авторы не проводили сравнения активности и каталитических свойств иммобилизованной нитрилазы и свободного фермента [225]. 71 Хотя бактериальные клетки, содержащие нитрилгидратазу, широко используются для получения амидов из нитрилов, в целых клетках амиды обычно подвергаются дальнейшей трансформации до карбоновых кислот и аммония амидазами, которые экспрессируются в одном опероне с нитрилгидратазами. В этом случае может добавляться селективный ингибитор амидазы, либо активность ферментов может контролироваться условиями реакции. В качестве альтернативного решения этой проблемы предлагается использование очищенных или частично очищенных нитрилгидратаз. Но использование изолированных нитрилгидратаз сдерживает их нестабильность, в частности, невысокая термостабильность, что может быть преодолено при использовании адекватного метода иммобилизации [137]. Попытки получить иммобилизованный препарат нитрилгидратазы были сделаны еще в 80-х гг. прошлого века. H. Fradet с соавторами иммобилизовали частично очищенную нитрилгидратазу из Brevibacterium A4 на ионобменной смоле DEAE-целлюлозе. первоначальной Полученный активности при препарат в трансформации среднем терял пропионитрила 38% до пропионамида, а иммобилизация не приводила к существенному возрастанию термостабильности – после десятиминутной экспозиции при 45ºС активность снижалась на 80%. Иммобилизация на DEAE-целлюлозе приводила к небольшому сдвигу рН-оптимума активности в сторону более низких значений и небольшому повышению температурного оптимума, но концентрация продукта, полученная за единицу времени, была относительно низка [222]. Современные работы по иммобилизации нитрилгидратазы более успешны. Так, CLEAs нитрилгидратазы, полученные осаждением сульфатом аммония и поперечной сшивкой декстранполиальдегидом, сохраняли 88% первоначальной активности. Использование других веществ для осаждения белка приводило к полной деактивации фермента. Глутаровый альдегид в качестве сшивающего агента ингибировал активность нитрилгидратазы [137], подобный эффект был описан и для нитрилаз [88]. Авторы связывают этот эффект с тем, что макромолекулярный кросс-линкер слишком велик, чтобы проникать в активный 72 центр фермента и реагировать с аминокислотными остатками, существенными для проявления каталитической активности, тогда как молекулы глутарового альдегида, возможно, взаимодействуют с ними. Нитрилгидратаза из термофильного штамма Geobacillus pallidus RAPc8 была иммобилизована на ряде нерастворимых носителей при использовании различных поперечно-сшивающих агентов. Препараты на основе Eupergit®C, активированного 1-этил-3-(диметиламино-пропил)карбодиимидом, проявили самую высокую эффективность иммобилизации (93%), расcчитанную как отношение активности иммобилизованного фермента к активности свободного. Оптимум рН и температуры для проявления активности остался неизменным, но термостабильность иммобилизованного препарата увеличилась по сравнению с ферментом в растворе – время полужизни иммобилизованной нитрилгидратазы при 60ºС составило 330 мин по сравнению с 54,5 мин у фермента в растворе. Операционная стабильность при иммобилизации значительно увеличилась, иммобилизованный биокатализатор сохранял 85,7% первоначальной активности после 8 последовательных циклов реакции. Иммобилизованный препарат на основе Eupergit®C значительно в меньшей степени ингибировался субстратом (Ki =194,7 мМ), чем фермент в растворе (Ki=101,0 мМ) [158]. Энантиоселективный гидролиз рацемицеского нитрила миндальной кислоты до R-амида миндальной кислоты катализировали нитрилгидратазой из Rhodococcus rhodochrous ATCC BAA-870, иммобилизованной на носителе ПВС/хитозан – глутаральдегид. Иммобилизованный биокатализатор готовили путем смешивания нитрилгидратазы с хитозаном, последующей сшивкой глутаровым альдегидом, после чего добавляли ПВС и полученный гель высушивали при замораживании. Иммобилизованная нитрилгидратаза конвертировала нитрил миндальной кислоты до R-амида миндальной кислоты с энантиомерным избытком 81%, а оптимальными условиями для стереоселективного гидролиза являлись рН 8 и температура 40ºС. Константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции составляла 17,07±1,04 мM и 10,74±0,72 мМ/мин для иммобилизованной нитрилгидратазы и 13,6±0,91, 73 11,02±1,41 для свободного фермента соответственно. Иммобилизованный фермент выдерживал 9 последовательных циклов реакции, причем к 9-му циклу конверсия составляла 10% [322]. Описана совместная иммобилизация нитрилгидролизующих ферментов для различных целей – биокатализа и поверхностной модификации синтетических полимеров. Поверхностная модификация полиакрилонитрила заключалась в адсорбции на нем нитрилгидратазы и амидазы, которая приводила к гидролизу цианогрупп до карбоновых кислот [117]. Пример биокаталитического применения совместно иммобилизованных ферментов заключался в том, что нитрилаза из Aspergillus niger или Fusarium solani и амидаза из R. erythropolis, совместно иммобилизованные на колонке с бутил-сефарозой, гидролизовали 4- цианопиридин в изоникотиновую кислоту. Нитрилаза A. niger конвертировала субстрат в смесь кислоты и амида в молярном соотношении 3:1, тогда как амидаза гидролизовала амид, образующийся в качестве побочного продукта. При иммобилизации нитрилазы из F. solani молярное соотношение кислоты к амиду составляло 98:2, полная конверсия 40 мМ раствора 4-цианопиридина достигалась за счет увеличения количества иммобилизованной нитрилазы (5,5 ЕД), а общий выход продукта увеличивался до 88 мг/мл/ч. Снижение количества амида как побочного продукта также было достигнуто при использовании двух отдельных колонок (одна – с иммобилизованной нитрилазой, другая – с амидазой), работающих в тандеме. Этот подход позволяет предотвратить конкуренцию нитрилгидратазы, присутствующей в препарате амидазы, и нитрилазы за субстрат 4-цианопиридин. В этом случае достигали 99,8% чистоты раствора изоникотинамида без присутствия субстрата в элюенте [228]. Сведения об иммобилизации изолированных амидаз немногочисленны. Иммобилизацию этих ферментов осуществляли путем включения в гели полимеров синтетического и природного происхождения и адсорбции на активированном Амберлите-XAD57 [90], ковалентного присоединения к носителю [84, 147] и образования поперечно-сшитых агрегатов фермента [321]. Так, термостабильная амидаза Geobacillus pallidus RAPc8, иммобилизованная в 74 гранулы полиакрилатного полимера Eupergit®С, катализировала D-селективный гидролиз лактамида. При этом наблюдалась высокая степень связывания фермента с гранулами Eupergit®С и практически сохранялась амидазная активность (до 80%) [90]. Пенициллин амидаза, ковалентно иммобилизованная в Eupergit®С, активированном эпоксидными группами, была использована в промышленном масштабе [84]. Нативная и конъюгированная с декстраном пенициллин амидаза была ковалентно присоединена к диоксиду кремния с активированными амино-группами, что приводило к увеличению ее термостабильности [147]. Поперечно-сшитые ко-агрегаты амидазы Rhodococcus erythropolis и БСА, образованные поперечным сшиванием глутаровым альдегидом, после осаждения сульфатом аммония оставались стабильными как при повышении температуры до 50°С, так и в диапазоне рН от 5 до 12 [321]. Таким образом, на основании анализа научной литературы можно заключить, что наиболее успешным подходом к созданию иммобилизованного катализатора на основе ферментов нитрильного метаболизма явилось создание CLEAs. Но, несмотря на преимущества, заключающиеся в стабилизации и сохранении активности поперечно-сшитых агрегатов ферментов, в данном случае не происходит иммобилизации в классическом смысле этого слова, или, как иначе называют эти методики, происходит «иммобилизация без носителя». Отсутствие некаталитических масс в реакторе, с одной стороны, приводит к повышению продуктивности, рассчитанной на объем реактора, но, с другой стороны, лишает биокатализатор Затрудняется тех преимуществ, отделение продукта которые от дает присутствие реакционной среды, носителя. проведение непрерывного процесса биокатализа, невозможно конструирование различных типов реакторов. Поэтому поиск подходящих носителей и разработка методик иммобилизации этих ферментов остаются актуальными, а решением вышеперечисленных проблем, возможно, является объединение преимуществ CLEAs и носителей для создания стабильного и активного гетерогенного биокатализатора. 75 1.5. Физиология иммобилизованных микроорганизмов Существуют три принципиально различные причины, по которым прикрепление к твердым поверхностям может изменить физиологию микроорганизмов [271]: 1. посредством влияния концентрации и/или доступности питательных веществ; 2. посредством модификации процессов, ассоциированных с клеточной мембраной (например, транспорт субстрата или генерация энергии); 3. посредством развития биопленки, наличия полимерного матрикса, защищающего клетки от воздействий окружающей среды, возникновения в ней новых клеточных взаимодействий. Изучая бактериальные популяции образцов морской воды, C.E. ZoBell еще в 1943 г. сделал вывод, что среди бактерий морских вод в природной среде преобладают сессильные (прикрепленные к твердой поверхности) формы. В средах, где источники питательных веществ находятся в сильно разбавленном состоянии, таких как морская вода, органические вещества концентрируются путем адсорбции на твердых поверхностях, повышая активность прикрепленных бактерий [420]. При рассмотрении физиологических изменений клеток при их иммобилизации следует провести границу между самоиммобилизованными в процессе роста бактериями (биопленками) и искусственно иммобилизованными предварительно выращенными культурами. Одной из трудностей в осмыслении этого вопроса является отсутствие в работах исследователей четкого разделения понятий «биопленка», т.е. самоиммобилизованные на нерастворимом носителе в процессе роста клетки микроорганизмов, и «иммобилизованные клетки», под которым чаще всего понимают прикрепленные к поверхности или связанные в массе носителя нерастущие клетки. На настоящий момент не остается сомнений по поводу того, что рост в прикрепленном состоянии приводит к значительным изменениям в экспрессии генов по сравнению с планктонным способом 76 существования [43, 209, 231, 239]. Кроме того, наблюдаются различия в физиологии клеток самой биопленки, связанные с доступом субстратов роста и кислорода, местоположением клеток (на поверхности биопленки, в глубине, вблизи носителя), стадией созревания биопленки. Многочисленные работы по колониальной организации микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности входящих в ее состав клеток. Отмечено, микроорганизмов на что помимо плотных вертикальной средах свойственны слоистости также колониям секторные и концентрические зоны. Сектора соответствуют генетически различающимся клонам, что находит отражение в их различной окраске, консистенции, форме, скорости роста, активности ферментов. В качестве примера такой гетерогенности можно привести фазовую диссоциацию бактерий на R-, S- и M-формы [49]. Интересно, что клетки одного вида проявляют большие различия в таких факторах, как повышение содержания рибосом и скорость деления, даже когда клетки распространяются по поверхности тонким монослоем при отсутствии явных отличий в окружающей их среде [407]. Известно, что биопленка на нерастворимом субстрате претерпевает ряд изменений в процессе своего развития, которое условно можно поделить на несколько этапов. Первым этапом является обратимая адсорбция клеток на носителе. На этом этапе действуют неспецифические физико-химические силы между молекулами и структурами на поверхностях микроорганизма и твердого субстрата (Ван-дер-Ваальсовы, гидрофобные, электростатические и др.). Затем следует необратимая адгезия или стадия инициации развития биопленки: клетки теряют подвижность, слипаются, начинают выделять внеклеточные полимеры (полисахариды, липополисахариды, гликопротеины), формируя внеклеточный полимерный матрикс [43]. Этот этап, по-видимому, является ключевым в ее образовании [148] и связан со значительными метаболическими и структурными перестройками, изменениями белкового профиля клетки. Инициация образования биопленки происходит через множественный, конвергентный сигнальный путь, который регулируется различными сигналами окружающей среды [311]. 77 Очевидно, что для адгезии живых организмов характерны специфичность, биологическая целесообразность, вовлечение органелл типа жгутиков и фимбрий и метаболический контроль [52]. Затраты метаболического потенциала на процесс адгезии и инициацию образования биопленки велики: это синтез адгезинов, представляющих собой белки типа лектинов с «липкими» концами, которые обратимо и регулируемо связывают клетки с поверхностями; синтез антиадгезинов, нейтрализующих действие адгезинов, а также элементов системы передачи сигнала, позволяющей клеткам взаимодействовать друг с другом [44, 52]. Следовательно, прикрепление к поверхностям инициирует каскад физиологических изменений в клетках, которые приводят, в частности, к сверхпродукции экзополимеров, не только иммобилизующих клетки на колонизируемой поверхности, но также способствующих пространственному разделению различных видов в биопленке [204]. Внеклеточные полимерные вещества микроорганизмов представляют собой различные органические соединения, такие как полисахариды и протеины, составляющие до 90% общей массы, а также в меньшем количестве нуклеиновые кислоты и липиды. Они существенно влияют на бактериальную адгезию на твердых субстратах, обеспечивая инициацию формирования биопленки, т.к. поверхность клетки в этом случае изменяет свои физико-химические характеристики, такие как заряд, гидрофобность и полимерные свойства [203]. Затем следует этап образования микроколоний, обусловленный делением прикрепленной клетки, который еще называют стадией незрелой биопленки. К клеткам, локализованным на поверхности, прикрепляются вторичные колонизаторы. Одновременно с увеличением толщины биопленки формируются ее специфические структуры – полости, каналы, выросты, поры. Эта стадия зрелой биопленки в благоприятных условиях продолжается достаточно долго, а в неблагоприятных вступает в последнюю фазу – разрушения, сопровождающуюся гибелью части клеток и высвобождением остальной части клеток, переходом их в планктонное состояние и миграцией в новые места обитания [43]. 78 Популяции микроорганизмов способны оценивать собственную плотность по концентрации вырабатываемых всеми клетками популяции сигнальных веществ – аутоиндукторов. Кворум-зависимые (quorum-sensing) системы ставят под контроль плотности микробной популяции (кворума) многие процессы, в том числе люминесценцию, антибиотиков, синтез экзоферментов, межклеточный перенос конъюгацию), споруляцию, (трансформацию, факторов вирулентности, генетической информации агрегацию с образованием плодовых тел, формирование биопленок и др. [38, 48, 49]. Грамположительные бактерии главным образом используют в качестве сигнальных молекул системы кворум-сенсинга посттрансляционно-модифицированные олигопептиды. Эти автоиндуцирующиеся полипептиды состоят из 5–17 аминокислот с боковыми цепями, модифицированными тиолактона. Они изопрениловыми синтезируются в группами цитоплазме в или виде кольцами пептидов- предшественников, затем расщепляются, модифицируются и транспортируются во внеклеточную среду, где могут быть определены мембран-связанными двухкомпонентными системами фосфорилированию и детекции. активации Их детекция регуляторного приводит протеина, к который взаимодействует с промотором ДНК и включает экспрессию регуляторных генов кворум-сенсинга. В грамотрицательных бактериях сигнальными молекулями являются N-ацилгомосеринлактоны, которые также называют аутоиндуктор 1. Они содержат консервативное кольцо гомосеринлактона, которое соединено с ацильной цепью различной длины (4–18 атома углерода) и различной модификации. Комплекс ацилированных гомосеринлактонов и белков активирует транскрипцию генов, отвечающих за кворумзависимые процессы. Аутоиндуктор 2, представляющий собой фуранозилборатный эфир, обнаружен более чем у 50 различных видов бактерий, как грамотрицательных, так и грамположительных, и может служить «универсальным сигналом» для межвидовой коммуникации [349]. Скорость роста бактерий разных видов может возрастать, снижаться, либо не изменяться после иммобилизации, в зависимости от природы субстрата и возможности его сорбции на носителе. Так, скорость роста Klebsiella oxytoca, 79 адсорбированного на частицах гранулярного активного угля, возрастает более чем в 10 раз при росте на глутамате, который адсорбируется на поверхности углей, и не изменяется при росте на глюкозе, не адсорбирующейся на носителе [177]. С другой стороны, исследования И.К. Курдиш и З.Т. Бега показали, что глинистые минералы в концентрации 0,2–1,0% существенно стимулируют рост фосфатмобилизующих бактерий Bacillus subtilis при их культивировании в среде, содержащей труднорастворимый фосфат кальция. Авторы предполагают, что одним из механизмов повышения интенсивности роста бацилл в этом случае является увеличение повышении массопереноса концентрации кислорода, глинистых которое материалов до снижается 2%, приводя при к ингибированию их роста. При этом способность глюкозы и ионов фосфата сорбироваться на монтмориллоните авторы рассматривают как отрицательный момент [34]. В более ранних работах И.К. Курдиш и Л.В. Титовой также было показано, что высокодисперсные материалы оказывали стимулирующий эффект на рост бактерий. В частности, высокодисперсный диоксид кремния и его модифицированные формы, а также глинистые природные материалы палыгорскит, монтмориллонит и каолин в концентрации 10 г/л повышали выживаемость и интенсивность роста азотфиксирующих бактерий Agrobacterium radiobacter в процессе гетерофазного культивирования. В данной работе авторы сделали заключение, что изменения физиологической активности микроорганизмов при их взаимодействии с высокодисперсными материалами невозможно объяснить одними только ионообменными процессами между питательной средой и твердыми материалами, т.к. компонентный состав питательных сред при взаимодействии с этими материалами практически не изменялся [35]. При изучении стимулирующего влияния диоксида титана на рост азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий Azobacter vinelandii и B. subtilis авторы установили, что этот эффект не является следствием сорбции сахарозы на поверхности твердых частиц, и выдвинули предположение, что контактное взаимодействие клеток бактерий с диоксидом титана обуславливает увеличение проницаемости клеточной стенки, что приводит к более полному 80 потреблению субстрата [81]. Таким образом, в научной литературе не было выработано единого мнения о механизмах влияния высокодисперсных твердых материалов на физиологию растущих в их присутствии микроорганизмов. Также была продемонстрирована возможность глубинного гетерогенного культивирования молочнокислых бактерий, и показано, что присутствие в среде твердой фазы в виде измельченного (0,5–1 мм) жома топинамбура способствует повышению стрессоустойчивости этих бактерий и увеличивает количество клеток, остающихся жизнеспособными после длительного хранения. Авторы предполагают, что основной причиной этого эффекта является адгезия клеток на твердых частицах жома, что увеличивает их устойчивость к стрессовым факторам [11]. Сведения об удельной скорости продукции или выходе различных вторичных метаболитов, таких как ферменты и антибиотики, при иммобилизации клеток также противоречивы. Ряд работ подтверждает возрастание выхода вторичных метаболитов у иммобилизованных клеток. Например, уровень изопропилтиогалактозид-индуцированной β-галактозидазы был выше у иммобилизованных клеток E. coli, чем у суспендированных [92]. Иммобилизация в альгинате кальция стимулировала биосинтез супероксиддисмутазы клеток Aspergillus niger. Также иммобилизация изменяла спектр пектинолитических ферментов, экскретируемых A. niger: у иммобилизованных клеток наблюдалась сверхпродукция полиметилгалактуроназы и полигалактуроназы и снижение продукции пектинэстеразы и пектинлиазы [231]. В работе Т.М. Григорьевой с соавторами было отмечено, что, культивирование B. subtilis в виде биопленки дает увеличение продукции амилазы в 1,5–2,4 раза и глюканазы в 3 раза [12]. В то же время есть немало примеров снижения удельной продуктивности по отношению к свободным клеткам, что объясняется ограничениями массопереноса в системе иммобилизованных клеток [231]. Повышенная устойчивость биопленок микроорганизмов к ингибиторам, биоцидам и антибиотикам также общеизвестна, но нет единого мнения о механизмах этой устойчивости. Одним из наиболее распространенных 81 объяснений структуру является биопленки полимерным затруднение из-за матриксом. проникновения диффузионных Другая гипотеза веществ-ингибиторов ограничений, связана с в обусловленных существованием «биопленочного фенотипа», т.е. различной экспрессией генов в планктонных и прикрепленных клетках [43, 209, 231]. Сравнение профилей экспрессии генов в клетках одних и тех же бактерий, существующих в составе биопленки и в планктонном состоянии, показало, что около 45 генов экспрессируются различно. Более того, обнаружено, что дифференцированная экспрессия генов наблюдается в разных местах биопленки, что может свидетельствовать о способности индивидуальных членов бактериального сообщества выполнять разные функции, повышая выживаемость всего сообщества [38]. Наибольшее распространение получило представление о существовании в биопленках особых «персистирующих» клеток, находящихся в покоящемся состоянии и поэтому более устойчивых к действию неблагоприятных факторов [43, 209]. Прикрепление клеток E. coli к абиотической поверхности вызывает важные изменения в составе внешних мембранных белков, из которых 17 показали возросшие уровни синтеза, а 15 – уменьшенные [23]. Изменения проницаемости мембраны клеток в ответ на иммобилизацию также могут объяснить возрастание устойчивости грамотрицательных биопленкообразующих бактерий к антимикробным агентам. SDS-PAGE анализ протеинов внешней мембраны свободных и включенных в структуру геля клеток E. coli, устойчивых к βлактамным антибиотикам, показал дефицит уровня неспецифического поринового белка OmpF, которому принадлежит основная роль в проникновении антибиотиков в клетку, у иммобилизованных клеток по сравнению со свободными [231]. Сигналы, приводящие к активации стресс-зависимых реакций, часто приводят к образованию биопленки, которая, в свою очередь, индуцирует механизмы стрессорных ответов. Регуляторные механизмы этих процессов включают двухкомпонентные регуляторные системы, в которых главные 82 регуляторы, такие как ген rpoS и сигнальные молекулы, такие как циклический диГМФ, находятся в сложном взаимодействии [265]. Альтернативная σS cубъединица РНК полимеразы, кодируемая геном rpoS, и поэтому также называемая белком RpoS, рассматривается как основной регулятор общего стрессорного ответа у E. coli [265, 71]. Когда бактерии растут в периодической культуре на полноценной среде, внутриклеточная концентрация белка RpoS резко повышается в стационарной фазе роста и σS-ассоциированная форма РНКполимеразы становится основной формой РНК-полимеразы, активной на этой стадии роста. Важность rpoS в регуляции факторов адгезии и адаптации к существованию в виде биопленки продемонстрирована тем, что 46% rpoSзависимых генов различно экспрессируется в прикрепленных клетках, и что делеция rpoS отрицательно воздействует на способность E. coli формировать биопленки. Индукция регулона rpoS может быть согласована с аккумуляцией σS фактора в клетках биопленки, в результате их более медленного роста в сравнении с планктонными клетками [265]. Однако на сегодняшний момент остается открытым вопрос, какие физиологические изменения происходят в клетках искусственно иммобилизованных бактерий, предварительно выращенных в суспензии. Ранее исследователи придерживались мнения, что изменения, связанные с ферментативной активностью и стабильностью иммобилизованных клеток, могут быть обусловлены не внутренними перестройками клетки, а изменением окружающей среды [24]. Но, в то же время, в ряде работ появлялись гипотезы о физиологических перестройках, происходящих в иммобилизованных клетках, в том числе в клетках, включенных в структуру гелей [231, 385]. На сегодняшний момент изучение этих изменений может быть связано с развитием протеомного анализа, который, возможно, способен дать ответ об изменении экспрессии генов у микроорганизмов в ответ на иммобилизацию. Протеины, количество которых в клетке значительно варьирует при образовании биопленки или в искусственно иммобилизованных системах, могут быть разделены на три основных класса – белки, связанные с метаболическими процессами; вовлеченные в процессы 83 адаптации и защиты; мембранные протеины [94, 239]. Результаты протеомного анализа подтверждают, что при культивировании бактерий в виде суспензии существуют значительные физиологические различия клеток в экспоненциальной и стационарной фазах роста, но при этом искусственно иммобилизованные клетки не могут быть приравнены к суспендированным клеткам в стационарной фазе роста [239]. Большой интерес представляют сведения, касающиеся повышения ферментативной активности иммобилизованных клеток. Как было показано Г.А. Коваленко с соавт., у адсорбированных на углеродсодержащих носителях дрожжевых клеток наблюдалась активация внутриклеточной инвертазы в 1,5–1,8 раза и возрастание оксигеназной активности у адсорбированных родококков в 3,7 раза по сравнению с суспендированными клетками [76]. В связи с промышленной важностью культур дрожжевых клеток большое количество научных работ было сфокусировано на изучении их метаболического ответа на иммобилизацию. Показана активация энергетического метаболизма дрожжей при иммобилизации, увеличение удельных скоростей поглощения субстрата (особенно глюкозы) и экскреции продукта (этанола). Такая активация метаболизма дрожжей наблюдалась у различных типов иммобилизованных систем – включения в гель, адсорбции и колонизации пористого носителя [230, 231]. Также у иммобилизованных дрожжей было выявлено возрастание количества как запасных питательных веществ (гликогена и трегалозы), так и структурных полисахаридов (глюкана и маннана), что может быть связано с взаимодействием между поглощением глюкозы и активностью фосфофруктокиназы. Отмечено увеличение толерантности к этанолу и сдвиг в сторону повышения содержания насыщенных жирных кислот. В свою очередь, результаты изучения экспрессии стресс-зависимых генов HSP12 и SSA3 подтвердили, что иммобилизованные клетки в основном находятся в менее стрессовых условиях, чем свободносуспендированные, возможно, из-за защитных свойств микроокружения. В любом случае, иммобилизация оказывает большое 84 влияние на свойства плазматической мембраны, что может стать причиной изменений в ряде транспортных систем [230]. В ответ на стресс, лимитирование по источникам питания, изменение рН или уровня этанола, или при воздействии малых молекул, продуцируемых макроорганизмом-хозяином (ауксин растений, НАД млекопитающих), у дрожжей инициируются метаболические пути, приводящие к синтезу различных адгезинов – протеинов клеточной стенки. Это переключение от не-адгезивности к адгезивности, возможно, позволяет дрожжам адаптироваться к стрессу. Так, в конце ферментационного процесса, когда все доступные сахара ферментированы в этанол и диоксид углерода, дрожжевые клетки начинают адгезироваться друг к другу, формируя макроскопические флоки [402]. Также было установлено, что такой показатель, как активность воды, является одним из основных факторов, воздействующих на клетки, иммобилизованные в структуре гелей [113, 279, 360]. Макромолекулы полимера способны структурировать молекулы воды и поэтому снижать количество воды, доступной для клеток [279]. Так, клетки Klebsiella aerogenes компенсировали низкую активность воды в микроокружении повышенным синтезом осмотически активных соединений. В результате иммобилизованные клетки продуцировали большее количество многоатомных спиртов, в том числе глицерина и маннита [113]. В целом, снижение активности воды и доступа кислорода приводит к тому, что иммобилизованные клетки компенсируют это стрессовое воздействие окружающей среды изменениями в концентрации промежуточных метаболитов, за которым следует сдвиг в сторону альтернативных метаболических путей. Низкая активность воды увеличивает пул полиолов в клетке и способствует формированию этанола и молочной кислоты. Низкая концентрация кислорода увеличивает анаэробную ферментацию и снижает активность цикла трикарбоновых кислот и дыхательной цепи. Так, изменение окислительновосстановительного потенциала воздействует на баланс NADH/NADPH и благоприятствует формированию жирных кислот, каротинов и вторичных метаболитов из ацетил коэнзима А [360]. Например, иммобилизованные 85 дрожжевые клетки ферментируют глюкозу до этанола более эффективно [279]. Также низкая активность воды приводит к более высокой концентрации NADPH в клетке, что стимулирует анаболические реакции [113]. Таким образом, объяснение физиологических изменений, происходящих в клетке при иммобилизации, во многом противоречиво и, в основном, находится на стадии гипотез. Так, остается открытым вопрос, находится ли иммобилизованная клетка в состоянии стресса или, наоборот, в менее стрессовых условиях; является ли определяющим защитное действие микроокружения или на клетки воздействует увеличение их плотности. Кроме того, основное внимание при изучении биопленок уделяется патогенным и условнопатогенным микроорганизмам, борьба с антибиотикоустойчивостью которых является первоочередной медицинской задачей. Среди промышленно значимых микроорганизмов более изученными остаются дрожжи, тогда как бактериальным культурам уделяется существенно меньше внимания. При изучении физиологии искусственно иммобилизованных клеток микроорганизмов основной изучаемой иммобилизационной системой, главным образом, являются клетки, включенные в структуру гелей. Почти не уделяется внимание адгезированным клеткам, тогда как это состояние является естественным и понимание физиологических изменений, протекающих в клетке, может объяснить процессы, происходящие в природной среде. 86 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Бактериальные штаммы и среды культивирования Объектами антропогенно исследования загрязненных являлись почв и штаммы, изолированные селекционированные в из лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии (прежнее название – лаборатория химического мутагенеза) Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН: Rhodococcus ruber gt1 (ИЭГМ 612, Региональная профилированная коллекция алканотрофных www.iegm.ru/iegmcol/index.html), микроорганизмов, обладающий акроним высокой ИЭГМ, нитрилгидратазной активностью и практически неопределяющейся амидазной активностью; Pseudomonas fluorescens C2 (ВКМ В-2597Д), обладающий нитрилазной активностью; R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-2, R. rhodochrous 4-1, Alcaligenes faecalis 2, Acinetobacter guillouiae 11h, обладающие амидазной активностью в сочетании с низкой нитрилгидратазной активностью. Штаммы культивировали на синтетической минеральной среде N следующего состава (г/л): минеральная основа – KH2PO4 – 1,0; K2HPO4×3H2O – 1,6; NaCl – 0,5; MgSO4×7H2O – 0,5, микроэлементы CaCl2 – 0,005; FeSO4×7H2O – 0,01; CoCl2×6H2O – 0,01, рН 7,2±0,2. Источниками углерода являлась глюкоза – 1,0, источниками азота NH4Cl – 0,3 (для R. ruber gt1); ацетонитрил – 3,9 (для P. fluorescens C2), 0,39 (для R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-2, R. rhodochrous 41). Для штамма Alcaligenes faecalis 2 и Acinetobacter guillouiae 11h источником и углерода, и азота являлся 0,1 М ацетамид. Штаммы поддерживали на агаризованной среде Луриа-Бертани (LB), содержащей (г/л): триптон – 10,0; дрожжевой экстракт – 5,0; NaCl – 10,0; агар (Sigma) – 15,0. 87 2.2. Условия культивирования бактерий в жидких питательных средах и определение ростовых характеристик В автоклавированную при 121°С среду N асептически добавляли источники углерода и азота и микроэлементы. Клетки бактерий выращивали в 40 мл среды N в конических колбах объемом 100 мл; в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл; в 400 мл среды N в конических колбах объемом 1000 мл на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью вращения 90–120 об/мин и температуре 28–30°С. Плотность культуры бактерий измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-3 с использованием 0,5 см кюветы. Бактериальный рост оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при λ=540 нм с учетом разведения. Абсолютно сухую биомассу определяли путем взвешивания на аналитических весах предварительно отцентрифугированных в течение 10 мин при 12000 g и высушенных до постоянной массы клеток из известного объема суспензии. Удельную скорость роста (μ) определяли по формуле: μ = dx/dt × 1/x, где μ – прирост биомассы в единицу времени на единицу биомассы, x – начальная биомасса, мг/мл; t – время, ч 2.3. Культивирование бактерий в присутствии носителей Культивирование осуществляли в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл. Среду N предварительно автоклавировали с 1 г углеродсодержащего носителя или с пленкой полиэтилена высокой плотности площадью 1 дм2. В среду асептически добавляли источники углерода и азота, микроэлементы и инокулировали 4 мл бактериальной культуры (ОП540=0,5). Культивирование осуществляли на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью вращения 90–120 об/мин и температуре 28–30°С в течение 7 суток. 88 2.4. Носители для иммобилизации бактериальных клеток и ферментов В качестве носителей для иммобилизации бактериальных клеток использовали дробленые, гранулированные и порошкообразные углеродные материалы (Таблица 6, 7): • уголь активный березовый дробленый БАУ (пр-во Россия), • уголь активный гранулированный ФТД (пр-во Россия), • углеродный материал ФАС на основе фуриловой смолы (пр-во Россия), • уголь активный дробленый Norit PK 1-3 (пр-во Голландия), • уголь-сырец, измельченный до порошкообразного состояния с размером частиц 50–300 мкм, • дробленый уголь-сырец с размером частиц 1–6 мм и 3–10 мм; • Сибунит (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск, Россия) • «Сапропель» (Институт переработки углеводородов СО РАН, Омск, Россия) Носители семейства «Сапропелей» были получены карбонизацией илистых отложений пресных озер Омской области. • Шунгит (углеродсодержащий природный минерал) Шунгит (название дано по поселку Шуньга, Карелия, РФ) – минерал, промежуточный продукт между аморфным углеродом и кристаллическим графитом, содержащий углерод (30 масс. %), кварц (45 масс. %) и силикатные слюды (около 20 масс. %). Шунгитовый углерод представляет собой окаменевшее вещество органических донных отложений высокого уровня карбонизации [22]. • пеноуглерод марки ТУМаН (предоставлен Российским Федеральным Ядерным Центром ВНИИЭФ, Саров, Россия) ТУМаН – конструкционный стеклоуглеродный открытопористый материал, образованный слабо связанными между собой сферическими 89 пористыми углеродными частицами от 1 до 8 мкм, изготавливается заливкой жидкой композиции в форму с последующим отверждением и карбонизацией. волокнистые углеродные материалы (пр-ва РУП «Светлогорское «Химволокно», Беларусь) (Таблица 6): • карбонизированные углеродные вискозные волокна Карбопон; • карбонизированная углеродная вискозная ткань Урал ТМ-4; • активированные вискозные углеродные волокна Карбопон-Β-актив; композиционные углеродные материалы (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск, Россия) (Таблица 8): • керамзит с синтезированным на поверхности слоем каталитического волокнистого углерода (КВУ); • керамзит с синтезированным на поверхности слоем графитоподобного углерода; • массивный КВУ углеродные нанотрубки (Институт термохимии, Пермь, Россия) (Таблица 9). Многослойные углеродные нанотрубки (МУНТ) синтезировали осаждением из газовой фазы природного газа (содержание метана ~ 97 об.%). Осаждение МУНТ проводили на катализаторе, содержащем оксид магния, оксид никеля, оксид кобальта и частицы металлического сплава никеля и кобальта. Неочищенные МУНТ содержат: С ~ 83,0 вес.%, MgO ~ 16,6 вес.%, Со ~ 0,3 вес.% , Ni ~ 0,1 вес.%. Образцы МУНТ очищали посредством травления в растворе азотной кислоты (20 вес.%) при кипячении в течение 2 часов. После выдержки раствор промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (pH 6,5–7) и сушили при 180˚С в течение 4 часов. Очищенные МУНТ содержат: С ~ 99,3 вес.%, остальное – химически связанный кислород и остаточные примеси Co и Ni (менее 0,1 вес.%). Для адсорбционной иммобилизации ферментов использовали немодифицированные коммерческие оксиды алюминия (производства ОАО 90 «Катализатор», Новосибирск) (Таблица 10). Для получения углеродсодержащих адсорбентов (С/Al2O3) в Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН проводили синтез углеродного слоя, в том числе слоя каталитического волокнистого углерода (КВУ-слоя), путем пиролиза водород-пропан-бутана на немодифицированных оксидах алюминия при 600оС в реакторе с неподвижным слоем катализатора в условиях, описанных в работах [57, 58]. 91 Таблица 6 – Характеристика углеродных материалов Марка углеродного носителя Исходное сырье Параметры VΣ, см3/г 1,65–1,80 Vми, см3/г 0,22–0,25 пористой структуры Vме, см3/г Vма, см3/г dма, мкм 0,08–0,10 1,35–1,45 5–40 БАУ-А Березовый Березовый активный уголь древесный уголь Березовый уголь- береза 1,00–1,20 0 0,02–0,05 0,95–1,15 5–40 NORIT PK 1-3 торф 0,80–0,85 0,38–0,43 0,06–0,07 0,24–0,28 2–30 ФТД Фенолформальдегидная 0,80–0,85 0,50–0,60 0,12–0,14 0,08–0,10 7–15 сырец смола ФАС Фуриловая смола 0,82–0,86 0,48–0,50 0,20–0,30 0,14–0,16 3–10 Карбонизированная Вискоза-ткань 0,75–0,85 - - - 5–10* Карбопон Вискоза-войлок 0,35–0,40 - - - 20–50* Карбопон-В-актив Вискоза-войлок 1,20–1,40 - - - 20–50* ткань «Урал-ТМ4» Примечание: VΣ – суммарный объем пор, Vми – объем микропор, Vме – объем мезопор, Vма – объем макропор, dма – диаметр макропор, * - межволоконное пространство 92 Таблица 7 – Характеристика карбонизированных носителей Марка Исходное сырье d, мм Sуд, м2/г rме, мкм rма, мкм Графитизированная 2 441 0,02 - Илистые 2–3 85 0,2 4,7 отложения озер 3–5 Стеклоуглерод - 500 0,01 - носителя Сибунит сажа «Сапропель» ТУМаН Примечание: d – диаметр частиц, Sуд – удельная поверхность, rме – диаметр мезопор, rма – диаметр макропор Таблица 8 – Характеристика композиционных углеродсодержащих материалов Носитель Морфология поверхностного слоя Массивный КВУ (1–3 мм) Sуд, м2/г КВУ-слой 160 Графитоподобный слой 10 6,47%С/Керамзит КВУ-слой 22 2,84(3,63)%С/Н2/Керамзит КВУ-слой 20 4,98% /Сахар/Керамзит Примечание: Sуд - удельная поверхность Таблица 9 – Характеристика углеродных нанотрубок [45] Характеристика Значение Внешний диаметр трубок, нм 5–35 Внутренний диаметр, нм 3–14 Длина, мкм, не менее 2 Массовая доля углерода, %, не менее 99 Удельная поверхность, м2/г, по методу БЭТ, не менее 400 93 Таблица 10 – Характеристика немодифицированных оксидов алюминия и углеродсодержащих адсорбентов на их основе Адсорбент Конфигурация Sуд, м2/г Dпор, нм Немодифицированные оксиды алюминия Кольца высотой 5– КН-21 (Al2O3 I) 6 мм, внешний и внутренний 1 2900 13 95 221 12 диаметр 7 и 2 мм Черенки АОК-63-31 (Al2O3 II) диаметром 12 и длиной 12 мм АОК-63-11 «С» (Al2O3 III) Гранулы (шарики) диаметром 0,63– 1,25 мм Углеродсодержащие оксиды алюминия Кольца высотой 5–6 С/α-Al2O3 I мм, внешний и внутренний 9 330 15 94 206 12 220 11 диаметр 7 и 2 мм С/α-Al2O3 II Черенки диаметром 12 и длиной 12 мм Гранулы (шарики) С/ γ-Al2O3 III диаметром 0,63– 1,25 мм С/γ-Al2O3 (марки Округлые гранулы СУМС) диаметром 0,9 мм 94 2.5. Определение гидрофобности поверхности носителей и бактериальных клеток Гидрофобность поверхности носителей определяли по адсорбции нафталина из 0,1 мМ водного раствора. Концентрацию нафталина в водном растворе после 30 мин контакта с углеродсодержащими адсорбентами определяли методом ВЭЖХ на хроматографе LC-10 (“Shimadzu”, Япония) с колонкой Luna 5u C 18(2) 100A (250 × 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 10 мМ KH2PO4 и 25% ацетонитрила, скорость потока составляла 0,5 мл/мин при температуре 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм. Гидрофобность поверхности носителей выражали в % адсорбции нафталина. Гидрофобность поверхности бактериальных клеток оценивали модифицированным BACH-тестом [358] по относительному распределению между водной фазой и фазой гексадекана. К 3 мл суспензии клеток добавляли 0,1, 0,2, 0,5 и 1 мл гексадекана, интенсивно встряхивали в течение 2 мин, оставляли на 30 мин при температуре 30ºС и определяли ОП540 водной суспензии клеток. Гидрофобность поверхности клеток определяли как % адсорбции клеток в фазу гексадекана (среднее значение относительного изменения ОП540 клеточной суспензии в водной фазе) [29]. 2.6. Реактивы Акриламид, акриловая кислота, нитрил акриловой кислоты, никотинамид, изоникотинамид, пиколинамид, никотиновая кислота, изоникотиновая кислота, пиколиновая кислота, 2-, 3-, 4-цианопиридин, лактамид, D-, L-молочная кислота, фенилглицинонитрил гидрохлорид, D-, L-фенилглицин использовали в качестве субстратов и контролей для ВЭЖХ. Хитозан (“Sigma”, Япония), бензохинон (“Fluka”, Швейцария), глутаровый альдегид использовали для иммобилизации ферментов. Каолин (“Merck”) использовали для адсорбционной иммобилизации клеток бактерий. 95 Набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit, (“Sigma”, США) использовали для биолюминесцентного анализа АТФ. Набор реактивов LIVE/DEAD® (Syto 9/пропидиум иодид) BacLightTM Bacterial Viability Kits (“Invitrogen”, США) использовали для определения жизнеспособных и мертвых клеток с помощью флюоресцентной световой микроскопии. 2.7. Определение нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей и эффективности функционирования иммобилизованной системы Удельные нитрил- и амид-трансформирующие активности (ЕД) определяли по концентрации продуктов реакции в мкмоль (ммоль), образуемых 1 мг (1 г) клеток/фермента за 1 мин (1 ч). Нитрилгидратазную активность клеток оценивали спектрофотометрически экспресс-методом по изменению концентрации акриламида в реакционной среде за 1 мин трансформации акрилонитрила. Ранее было установлено [33], что в интервале длин волн от 230 до 260 нм акриламид и другие алифатические амиды обладают высоким коэффициентом светопоглощения, а светопоглощение алифатических нитрилов незначительно. Концентрации алифатических амидов определяли по разности оптической плотности реакционной среды при λ=240 или 260 нм в начале и в конце реакции. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro (England). Нитрилгидратазную, нитрилазную и амидазную активности свободных или иммобилизованных клеток (фермента) определяли по концентрации продукта (соответствующих амидов или карбоновой кислоты) реакции трансформации нитрилов и амидов. Время реакции выбирали экспериментально в зависимости от концентрации биокатализатора и типа ферментативной реакции, реакцию трансформации алифатических нитрилов и амидов останавливали 96 концентрированной HCl до конечной концентрации 5%, ароматических нитрилов и амидов – быстрым замораживанием образца. Если не указано иное, трансформацию алифатических нитрилов проводили при 22–25ºС, алифатических амидов и ароматических нитрилов и амидов – при 30ºС. Реакцию проводили в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) с постоянным перемешиванием при 100 об/мин. Концентрацию продуктов реакции определяли методом ВЭЖХ. Эффективность функционирования иммобилизованной системы (η) определяли как отношение ферментативной активности иммобилизованных клеток к активности свободных клеток [119]. 2.8. Определение массы адгезированных бактериальных клеток Выращенную до стационарной фазы бактериальную суспензию центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали однократно 0,01 М калийфосфатным буфером (рН 7,2±0,2), центрифугировали повторно и ресуспендировали в 0,01 М калий-фосфатном буфере. Адгезию бактериальных клеток проводили в течение 0,5–2 ч при 22ºС из 10 мл бактериальной суспензии, содержащей 1 мг сухих клеток/мл (в ряде опытов – от 0,1 до 4 мг/мл), на 0,2–1 г углеродсодержащих носителей или каолина при постоянном перемешивании на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин. Массу клеток в мл суспензии определяли взвешиванием на аналитических весах предварительно высушенной до постоянного веса биомассы в известном объеме суспензии. Массу адгезированных клеток определяли по формуле: А = m × V × (ОДисх – ОДфильтр) / ОДисх, где: А – масса адгезированных клеток, мг; m – концентрация клеток в суспензии до адгезии, мг/мл; V – объем суспензии, из которого адгезировали клетки, мл; ОДисх – оптическая плотность суспензии клеток до адгезии, измеренная при длине волны 540 нм; ОДфильтр – оптическая плотность суспензии клеток после адгезии. Носитель с адгезированными клетками отмывали 0,01 М калий-фосфатным буфером (рН 7,2±0,2) и хранили в течение 1–3 суток при температуре 4–10ºС. 97 2.9. Определение операционной стабильности иммобилизованных биокатализаторов Операционную стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий оценивали по сохранению нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей при последовательном проведении реакции трансформации акрилонитрила или акриламида, вносимого в каждом цикле до концентрации 1,3 и 0,1 М соответственно. Для иммобилизованного ферментного препарата концентрация субстратов составила 0,58 и 0,05 М соответственно. Продолжительность нитрилгидратазной реакции – 10–20 минут, нитрилазной и амидазной – 24 ч. После проведения реакционного цикла биокатализаторы однократно отмывали 0,01 М калий-фосфатным буфером и использовали в следующем цикле. В качестве контроля определяли операционную стабильность суспендированных клеток. Свободные клетки отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 10000 g, ресуспендировали в 0,01 М калий-фосфатном буфере, рН 7,2±0,2, повторно центрифугировали и использовали в следующем цикле. 2.10. Получение белкового препарата, содержащего ферменты метаболизма нитрилов Получение ферментного препарата, содержащего нтрилгидратазу. Нитрилгидратазу выделяли из клеток штамма R. ruber gt1, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью. Бактериальную культуру выращивали в колбах объемом 1 л на качалке со скоростью вращения 100 об/мин при 30°С до стационарной фазы роста на минимальной солевой среде N c 0,1% глюкозы и с добавлением хлористого аммония до конечной концентрации 10 мМ. Биомассу центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали клетки от среды и ресуспендировали в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2±0,2, содержащем 44 мМ бутират натрия. Клетки разрушали десятикратной обработкой ультразвуком (УЗГ8-0,4/22, ВНИИ ТВЧ г. Санкт-Петербург, Россия) по 15 с при частоте 22 кГц 98 с охлаждением до 0–4°С. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 10500 g и температуре 4°С, затем проводили фракционирование белка сульфатом аммония, последовательно доводя концентрацию до 35 и 60% от насыщающей. В препарате, полученном при 60%-ном насыщении сульфата аммония, содержание фермента составило 72% от общего количества белка. Количество белка в пробе определяли по методу Бредфорд с красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250 [56, 140]. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Нитрилгидратазную активность в пробе определяли спектрофотометрически, как описано выше. Получение ферментного препарата, содержащего нитрилазу. Клетки штамма P. fluorescens C2, обладающего нитрилазной активностью, выращивали на минеральной солевой среде N в конических колбах объемом 1 л при температуре 30°C и постоянном перемешивании со скоростью вращения 100 об/мин. В качестве источника углерода использовали глюкозу (0,1%), источника азота – ацетонитрил (0,5%). Клеточную суспензию центрифугировали 20 мин при 10500 g, клеточный осадок отмывали фосфатным буфером, содержащим 44 мМ бутират натрия. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,2±0,2, содержащего бутират натрия в указанной концентрации. Разрушение клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе при 22 кГц 7 раз по 20 сек с охлаждением осадка. Суспензию, содержащую разрушенные клетки, центрифугировали 20 мин при 10500 g с охлаждением (4°С). Высаливание фермента проводили сульфатом аммония до 35% от насыщающей концентрации и центрифугировали 20 мин при 10500 g с охлаждением. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с бутиратом натрия, концентрацию белка определяли по методике Бредфорд. Нитрилазную активность в образце оценивали спектрофотометрически при 230 нм по возрастанию оптической плотности раствора в течение 1 мин после добавления субстрата акрилонитрила. Ферментный препарат хранили при температуре –18ºС. Получение ферментного препарата, содержащего амидазу. R. rhodochrous 4–1, обладающий амидазной активностью, выращивали в колбах объемом 1 л на 99 шейкере со скоростью вращения 150 об/мин при 30°С до стационарной фазы роста на минимальной солевой среде N. В качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0,1%, источника азота – ацетонитрил в концентрации 10 мМ. Биомассу центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали клетки от среды и ресуспендировали в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2±0,2, содержащем 44 мМ бутират натрия. Клетки разрушали десятикратной обработкой ультразвуком по 15 с при частоте 22 кГц с охлаждением до 0–4°С. Гомогенат центрифугировали 20 мин фракционировали белок при 10500 сульфатом g и температуре аммония, 4°С, последовательно затем доводя концентрацию до 35 и 60% от насыщающей. Количество белка в пробе определяли по методу Бредфорд. Амидазную активность оценивали спектрофотометрически при 230 нм по возрастанию оптической плотности раствора в течение 1 мин после добавления субстрата акриламида. Ферментный препарат хранили при температуре –18ºС. 2.11. Иммобилизация ферментов Адсорбционная иммобилизация ферментов. Адсорбцию нитрилгидратазы и нитрилазы проводили при контакте раствора белка с носителем (немодифицированные оксиды алюминия и углеродсодержащие адсорбенты на их основе; карбонизированные материалы) в течение 24–168 ч в статических условиях при температуре 4–10ºС. Адсорбцию амидазы на углеродсодержащих носителях Сибуните и СУМС проводили при 22–25°С в течение 2 ч на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин. Носитель с адсорбированным ферментным препаратом отмывали 0,01М фосфатным буфером (pH 7,2±0,2) до исчезновения белка в промывных водах. Количество адсорбированного белка определяли по разности концентрации белка в суспензии до и после сорбции. Ковалентная иммобилизация ферментов на активированном хитозане. Нитрилгидратазу и нитрилазу иммобилизовали методом ковалентной сшивки с активированным хитозаном. Готовили 2%-ный (вес/об.) раствор хитозана средней 100 вязкости (“Sigma”, Япония) в 2%-ной (об./об.) уксусной кислоте и накапывали с помощью шприца для инъекций объемом 5 мл в 1 М раствор KOH. После затвердевания в течение 1 ч гранулы отмывали однократно 0,01 М калийфосфатным буфером, рН 7,2±0,2. Полученные гранулы активировали 0,1%-ным раствором бензохинона (“Fluka”, Швейцария) в течение 15 мин в объемном соотношении гранул и активатора 1 : 1. Отмывали 3 раза фосфатным буфером, двукратно превышающим объем раствора бензохинона. Активированные гранулы смешивали с ферментным препаратом в соотношении 2,5 : 1, после 40 мин инкубации при 22–25°С отмывали 3 раза фосфатным буфером, пятикратно превышающим объем раствора белка. Количество белка, связанного с активированным хитозаном, определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с носителем. Полученный иммобилизованный препарат хранили при температуре от 0 до +10°C. Получение поперечно-сшитых агрегатов ферментов (ПСАФ). Поперечносшитые агрегаты амидазы готовили фракционированием белка, выделенного при разрушении клеток R. rhodochrous 4–1, сульфатом аммония как описано выше, с одновременной обработкой 0,1% раствором глутарового альдегида либо 0,1% раствором бензохинона при температуре 22–25°С. 2.12. Определение кинетических параметров ферментативных реакций, катализируемых свободными и иммобилизованными ферментами Константу Михаэлиса-Ментен (КМ) и максимальную скорость ферментативной реакции (Vмакс.) вычисляли по графику зависимости активности от концентрации субстрата, построенному в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка (Рисунок 3). Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой нитрилгидратазой, проводили реакции трансформации растворов НАК в диапазоне концентраций от 0,015 до 1,36 М в 1–5 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 7,2±0,2) при 25°С в течение 10 мин, реакцию останавливали добавлением концентрированной HCl до конечной концентрации 101 5%, концентрацию образующегося акриламида определяли методом ВЭЖХ. Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой нитрилазой, проводили реакции трансформации растворов НАК в диапазоне концентраций от 0,06 до 1,3 М в 1–5 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 7,2±0,2) при 25°С в течение 40 мин, реакцию останавливали, как описано выше. Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой амидазой, проводили трансформацию раствора акриламида в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,8 М в 1–5 мл калий-фосфатного буфера (рН 7,2 ± 0,2) при 25°С в течение 60 мин, реакцию останавливали, как описано выше. 1/V 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1/Vмакс. 0 -10 1/Км0 10 20 30 40 50 60 70 80 1/S Рисунок 3 – График зависимости ферментативной активности от концентрации субстрата, построенный в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка 2.13. Определение констант термоинактивации свободных и иммобилизованных ферментов Термостабильность фермента определяли следующим образом: иммобилизованную и нативную нитрилгидратазу в 0,01 М калий-фосфатном 102 буфере (рН 7,2±0,2) прогревали при 40, 50 и 60°С в течение 15, 30, 45 и 60 мин, резко охлаждали на ледяной бане и проводили реакцию трансформации 0,58 М раствора акрилонитрила при 22°С. Иммобилизованную и нативную амидазу в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) прогревали при 50, 60 и 70°С в течение 15, 30, 45 и 60 мин, резко охлаждали на ледяной бане и проводили реакцию трансформации 0,05 М раствора акриламида при 25°С. Определяли нитрилгидратазную и амидазную активность, как описано выше. Константы термоинактивации фермента (Кин) вычисляли по графику зависимости натурального логарифма активности от времени экспозиции при данной температуре и выражали в обратных минутах (мин-1): Кин = tgα, где α – угол наклона прямой к оси X. 2.14. Определение рН- и температурного оптимумов активности свободных и иммобилизованных ферментов Зависимость активности иммобилизованной нитрилгидратазы и фермента в растворе от температуры определяли при проведении десятиминутной трансформации 0,58 М раствора акрилонитрила при температуре от 10 до 70°С в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) с предварительным нагревом реакционной смеси до внесения субстрата в течение 10 мин. Зависимость активности иммобилизованной и нативной нитрилазы от температуры определяли при проведении трансформации 0,58 М раствора акрилонитрила при температуре от 10 до 80°С в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) в течение 20 мин с предварительным нагревом реакционной смеси до внесения субстрата в течение 10 мин. Зависимость активности иммобилизованной амидазы и фермента в растворе от температуры определяли при проведении часовой трансформации 0,05 М раствора акриламида при температуре от 10 до 80°С в 0,01 М калийфосфатном буфере (рН 7,2±0,2) с предварительной экспозицией реакционной смеси при заданной температуре до внесения субстрата в течение 10 мин. Нагрев и трансформацию субстрата осуществляли в термостате ТС–1/80 СПУ (“Лабтех”, 103 Россия). Реакцию останавливали, как описано выше. Концентрацию акриламида определяли методом ВЭЖХ. Зависимость активности иммобилизованной и нативной нитрилгидратазы (нитрилазы) от рН реакционной среды изучали при проведении десятиминутной (40-минутной) трансформации 0,58 М раствора акрилонитрила при 22°С в универсальном буфере Теорелла–Стенхагена [7] при рН от 2 до 10,5. 2.15. Определение концентрации АТФ в бактериальных клетках биолюминесцентным методом Определение концентрации АТФ в клетках бактерий, адгезированных на углеродсодержащих адсорбентах. Экстракцию АТФ из суспендированных и иммобилизованных бактериальных клеток грамположительных и грамотрицательных бактерий проводили диметилсульфоксидом (ДМСО) [16]. Для определения концентрации АТФ в адгезированных клетках к 200 мг углеродсодержащих носителей с клетками добавляли 2 мл ДМСО и через 15 мин экспозиции на льду жидкую фазу центрифугировали 2 мин при 15400 g и замораживали надосадочную жидкость. В качестве контроля концентрацию АТФ определяли в клетках суспензии. Для определения концентрации АТФ в клетках, находящихся в суспензии, 1 мл образца центрифугировали 5 мин при 15400 g, удаляли надосадочную жидкость и разрушали клетки 1 мл 90%-ного ДМСО в течение 15 мин на льду. Образцы замораживали и хранили при –18°С. Использовали стандартный набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit (“Sigma”, США), образцы разводили в 10 раз, смешивали с люциферинлюциферазным реагентом в соотношении 1 : 1 и измеряли интенсивность свечения на планшетном ридере Infinite M200 pro (“Tecan”, Швейцария). Определение концентрации АТФ в клетках бактерий, адгезированных на полистероле. В лунки 96-луночного полистеролового планшета вносили по 100 мкл суспензии R. ruber gt1 (8,0 × 108 КОЕ/мл) и P. fluorescens C2 (8,2 × 1011 КОЕ/мл) и через 2 ч инкубации в статических условиях при температуре 22°С 104 определяли КОЕ/мл суспензии. Суспензию удаляли, адгезированные клетки промывали однократно калий-фосфатным буфером, вносили 100 мкл ДМСО и экстрагировали АТФ в течение 15 мин на льду. Исходную суспензию R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 (1 мл) центрифугировали 10 мин при 15400 g, удаляли надосадочную жидкость, вносили 1 мл 90% ДМСО и экстрагировали АТФ 15 мин на льду. Определение концентрации АТФ в клетках биопленок. Чтобы оценить динамику роста биопленок, в лунки полистерольного 96-луночного планшета вносили среду N (150 мкл) и инокулировали суспензией нитрилутилизирующих бактерий (10 мкл, 2,0±0,2 x 108 КОЕ/мл). Каждые сутки планктонные клетки удаляли из лунок декантацией, отмывали биопленку 200 мкл фосфатного буфера дважды и вносили 100 мкл ДМСО для экстракции АТФ из лунки. После 15 мин экспозиции на льду пробы отбирали, замораживали и хранили при –18ºС. Чтобы оценить влияние токсичных субстратов и продуктов ферментативной реакции на биопленки нитрилгидролизующих бактерий, супернатант отделяли от четырехсуточных биопленок и переносили в пустые лунки. Биопленки промывали 150 мкл фосфатного буфера дважды, вносили 150 мкл буфера, в который добавляли акрилонитрил до конечной концентрации 1,3 М, акриламид до концентрации 1,7 М, акриловую кислоту до концентрации 1,3 М. Те же концентрации органических веществ вносили в суспензию планктонных клеток. После 20 мин экспозиции раствор с биопленок удаляли декантацией, а суспензию центрифугировали в планшетах 20 мин при 2464 g. Супернатант удаляли, к биопленкам и осадку клеток добавляли 100 мкл ДМСО. Через 15 мин пробы отбирали, замораживали и хранили при –18°С. Чтобы определить концентрацию АТФ по уровню свечения образца, строили калибровочный график, используя данные свечения образцов с известной концентрацией АТФ (Рисунок 4). Концентрацию АТФ в образце определяли, умножая условные единицы свечения образца на коэффициент, полученный из калибровочного графика: k = ctgα, где α – угол наклона прямой к оси X. 105 сигнал 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 0,00E+00 5,00E-11 1,00E-10 1,50E-10 2,00E-10 2,50E-10 3,00E-10 3,50E-10 4,00E-10 Концентрация АТФ, М Рисунок 4 – Калибровочная кривая соотношения условных единиц свечения образца и концентрации АТФ 2.16. Оценка биопленкообразования В лунки полистерольного плоскодонного 96-луночного планшета вносили среду N (150 мкл) и инокулировали суспензией нитрилутилизирующих бактерий (10 мкл, 2,0±0,2 x 108 КОЕ/мл). После 1–7 суток инкубации в термостате при 30°С планктонные клетки удаляли из лунок декантацией, отмывали биопленку 200 мкл калий-фосфатного буфера дважды и определяли биопленкообразование по методу окраски с кристаллическим фиолетовым с модификацией [233, 312, 323]. Биопленку окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 40 мин в темноте, удаляли краситель, отмывали окрашенную биопленку 1 раз калий- 106 фосфатным буфером и экстрагировали краситель 96% спиртом (200 мкл). Биопленкообразование оценивали по оптической плотности раствора красителя при 540 нм на планшетном ридере Infinite M200 pro (“Tecan”, Швейцария). 2.17. Высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография Концентрацию алифатических нитрилов и амидов (нитрила акриловой кислоты, акриламида, акрилонитрила) определяли методом ВЭЖХ на хроматографе LC-10 (“Shimadzu”, Япония) с колонкой Synergi 4u Hydro–RP 80A (250 × 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 25 мМ NaH2PO4, скорость потока составляла 0,75 мл/мин при 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм (Рисунок 5). Также концентрацию алифатических нитрилов и амидов определяли методом ГХ на хроматографе GC-2014 (“Shimadzu”, Япония), оснащенном пламенно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена твердым носителем полисорб-1, фракция 0,25–0,5 мм (“Реахим”, Россия). Газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 см3/мин. Температура термостата составляла 190±3°С, температура испарителя 220±10°С. Концентрацию ароматических нитрилов и амидов (никотиновой кислоты, никотинамида, 3-цианопиридина; изоникотиновой кислоты, изоникотинамида, 4цианопиридина; пиколиновой кислоты, пиколинамида, 2-цианопиридина) определяли методом ВЭЖХ на колонке Luna 5u C 18(2) 100A (250 × 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 10 мМ KH2PO4 и 25% ацетонитрила, скорость потока составляла 0,5 мл/мин при температуре 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм (Рисунок 6, 7, 8). 107 Рисунок 5 – Разделение акриловой кислоты (1), акриламида (2), нитрила акриловой кислоты (3) на колонке Synergi 4u Hydro–RP 80A Рисунок 6 – Разделение никотиновой кислоты (1), никотинамида (2), 3цианопиридина (3) на колонке Luna 5u C 18(2) 100A 108 Рисунок 7 – Разделение изоникотиновой кислоты (1), изоникотинамида (2) и 4цианопиридина (3) на колонке Luna 5u C 18(2) 100A 109 Рисунок 8 – Разделение пиколиновой кислоты (1), пиколинамида (2) и 2цианопиридина (3) на колонке Luna 5u C 18(2) 100A Концентрацию фенилгилицинонитрила и D-, L-фенилглицина определяли на колонке CROWNPAK® CR(-). В качестве элюента использовали раствор HClO4 (pH 2,0) и 10% метанола, скорость потока составляла 0,300 мл/мин при 30°C, детекцию проводили при длине волны 210 нм (Рисунок 9). 110 Рисунок 9 – Разделение L-фенилглицина (1), D-фенилглицина (2) и фенилглицинонитрила (3) на колонке CROWNPAK® CR(-) 2.18. Микроскопия Сканирующая электронная микроскопия. Визуализацию адгезированных на углеродсодержащих носителях бактериальных клеток проводили в сканирующем электронном микроскопе марок JSM 6460 LV (“Jeol”, Япония) и LEO 1430 (“LEO”, Германия) в Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск; MIRA 3 (“TESCAN”, Чехия) в демонстрационно-методическом центре TESCAN, Санкт-Петербург; JSM 7500F (“Jeol”, Япония) на кафедре минералогии и петрографии геологического факультета ГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» при ускоряющем напряжении 10–30 кВ. Образцы носителей с адгезированными клетками высушивали на воздухе и просматривали в сканирующем электронном микроскопе без каких-либо дополнительных модификаций. Элементно-структурный анализ носителей выполнен с помощью системы рентгеновского энергодисперсионного микроанализа Oxford Instruments Advanced 111 AztecEnergy с безазотным детектором X-max 20 Standard в сканирующем электронном микроскопе MIRA 3 (“TESCAN”, Чехия). Световая фазовоконтрастная микроскопия. Неокрашенные биопленки бактерий на полиэтилене изучали в световом микроскопе Leica DM LS (Германия) с фазовым контрастом при увеличении 1000 раз. Флюоресцентная микроскопия. Биопленки выращивали в чашках Петри на предметных стеклах (25×75 мм), погруженных в синтетическую минеральную среду N, инокулированную клетками соответствующего штамма. Биопленки бактерий и суспендированные клетки окрашивали красителем LIVE/DEAD® (Syto 9/пропидиум иодид) BacLightTM Bacterial Viability Kits (“Invitrogen”, США) из расчета 3 мкл смеси красителя на 1 мл физиологического раствора (0,85% NaCl), инкубировали в темноте в течение 20 мин и просматривали в световом микроскопе Leica DM LS с флюоресценцией. Световая просвечивающая микроскопия. Образцы носителей просматривали в световом микроскопе Биомед-6 (Россия) при увеличении 40 раз, микрофотографии обрабатывали в программе Thixomet Lite и определяли размер и площадь поверхности частиц. В случае если размер частиц превышал 1,5 мм, дисперсность оценивали с использованием стереомикроскопа SKT-3BT (Meiji techno, Япония) при увеличении 20 раз. Профилометрия. Шероховатость поверхности носителей определяли с помощью интерференционного микроскопа NewView 5000 (Германия) – бесконтактного оптического трехмерного профилометра высокой точности, измерения проводили на базе лаборатории физических основ прочности Института механики сплошных сред УрО РАН (г. Пермь). Изображения поверхности получали при увеличении 1300 и 2000 раз. Определяли показатель Ra − шероховатость, как среднее арифметическое абсолютных значений высоты, отсчитываемых от центральной линии, и rms − среднее квадратичное отклонение от центральной линии. 112 2.19. Статистическая обработка Все опыты повторяли не менее трех раз. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительные интервалы, достоверность различий определяли с использованием критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости p˂0.05. Анализ результатов проводили с помощью стандартных пакетов лицензионных программ MS Excel 2003 и Statistica. Вид распределения исследуемых признаков определяли с использованием критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Для исследования связи двух признаков в случае нормального распределения вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (r), при этом статистическая достоверность рассчитывалась при уровне значимости p=0,05. При распределении признаков, отличном от нормального, вычисляли непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (R), при этом достоверными считали связи при p<0,05. Степень корреляции оценивали в зависимости от значения коэффициента |R|<0,3 – слабая корреляция, 0,3< |R|<0,70 – умеренная корреляция, |R|˃0,70 – сильная корреляция. 113 ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИЗ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ АДГЕЗИРОВАННЫМИ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ Гетерогенные биокатализаторы трансформации алифатических и ароматических нитрилов были разработаны на основе выращенных до стационарной фазы роста клеток нитрилгидролизующих актино- и гаммапротеобактерий, адгезированных на неорганических носителях (углеродсодержащих активированных и неактивированных материалах различных технологических форм – дробленых, гранулированных, порошкообразных, волокнистых; минеральных носителях с углеродом, синтезированным на поверхности; многослойных углеродных нанотрубках; на каолине). Необходимым требованием для успешного приготовления иммобилизованных биокатализаторов такого типа была высокая сорбционная емкость носителей по отношению к бактериальным клеткам, отсутствие диффузионных ограничений, минимальная адсорбция субстрата и продукта ферментативной реакции на носителе. Соблюдение этих требований позволило осуществить эффективную трансформацию нитрилов в соответствующие амиды и карбоновые кислоты с сохранением, а в некоторых случаях с повышением исходной ферментативной активности суспендированных клеток, а также добиться повышения операционной стабильности биокатализатора по сравнению с клетками в суспензии. 3.1. Адгезия бактериальных клеток на носителях Клетки выращенной до стационарной фазы роста пятисуточной суспензии R. ruber gt1 (μ=0,0037 ч-1) и R. erythropolis 11–2 (μ=-0,0009 ч-1) (Рисунок 10), однократно отмытые 0,01 М калий-фосфатным буфером (рН 7,2±0,2) и ресуспендированные в том же буфере до конечной концентрации 1 мг/мл, были адгезированы на неорганических углеродсодержащих носителях (Рисунок 11, 12). 114 1 0.7 (а) 0.9 (б) Оптическая плотность, λ=540 Оптическая плотность, λ=540 0.6 0.8 0.5 0.7 0.6 0.4 0.5 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0 0 0 1 2 3 4 5 Время культивирования, сутки 6 7 0 1 2 3 4 5 Время культивирования, сутки 6 7 Рисунок 10 – Кривые роста R. ruber gt1 (а) и R. erythropolis 11–2 (б) на синтетической минеральной среде N c 0,1% глюкозой в качестве источника углерода Электронно-микроскопическое изучение показало, что клетки родококков, достигающие в фазе наибольшей каталитической активности от 1 до 7 мкм в длину, эффективно адгезируются как на активированных носителях (БАУ, Norit PK 1-3 [36]), так и на неактивированных (уголь-сырец). В структуре БАУ, Norit PK 1-3 и угля-сырца имеются макропоры, по размерам превышающие микробную клетку, тогда как мезо- и микропоры активных углей из-за своих размеров недоступны для адгезии бактериальных клеток. У волокнистых материалов (Карбопон, Урал ТМ-4) адсорбирующая поверхность создается за счет волокон, а не пор, и клетки адгезируются на поверхности волокна. На электронномикроскопических изображениях также видно, что на «Сапропеле» родоккоки адгезируются в достаточном количестве благодаря наличию крупных пор и неровностей, на Сибуните – благодаря выраженной шероховатости поверхности. При сравнении визуальной картины распределения клеток по поверхности образца как наилучшие носители для адгезии клеток были отмечены активные угли БАУ и Norit PK 1-3, поверхность которых густо, хотя и неравномерно, покрыта клетками как «сеткой» или плотной пленкой. Клетки на волокнах распределены неравномерно в виде отдельных скоплений, в основном на стыках или дефектах волокон. 115 Рисунок 11 – Адгезия клеток R. ruber gt1 на углеродсодержащих носителях: Урал ТМ-4 (а), Сибунит (б), уголь-сырец (в), Карбопон (г), БАУ (д), «Сапропель» (е) а б В Рисунок 12 – Адгезия клеток R. erythropolis 11–2 на БАУ (а) и угле-сырце (б) 116 Сравнивали массу клеток R. ruber gt1, адгезированных из суспензии концентрацией 1 мг/мл на углеродных носителях различных технологических форм, различающихся по пористости, дисперсности и гидрофобности поверхности. Как показано в таблице 11, наибольшая масса адгезированных клеток родококков, достигающая 13–15 мг АСБ/г сорбента, наблюдалась на активных дробленых углях БАУ, ФТД, Norit PK 1-3 и угле-сырце. На волокнистых углеродных материалах – Карбопоне, Урал ТМ-4, а также углеродном материале ФАС адгезировалось меньшее количество клеток – 7,5, 9,5 и 8 мг АСБ/г сорбента, соответственно. Максимальное количество клеток адгезировалось на углеродном тканом материале «Урал» лишь через 1 сутки инкубирования, тогда как на других изученных углеродных носителях максимум достигался в течение получаса. Таблица 11 – Масса адгезированных клеток R. ruber gt1 на углеродных материалах Носитель Масса адгезированных клеток, мг АСБ/г носителя БАУ 14,50±0,97 Norit PK 1-3 13,00±1,13 ФТД 12,00±2,26 Уголь-сырец порошкообразный 12,50±0,98 Уголь-сырец дробленый 7,38±1,12 Шунгит 8,39±0,98 Урал ТМ-4 9,50±0,98 Карбопон 7,50±1,70 ФАС 8,00±1,13 Примечание: Концентрация суспензии клеток – 1мг/мл Известно, что процесс адсорбции клеток предшествует их необратимой адгезии [43] и зависит от площади доступной поверхности, которая слагается в основном из поверхности макропор, превышающих по размерам микробную 117 клетку [13, 24]. Активированный уголь БАУ обладает развитой системой макропор (1,35–1,45 см3/г), что составляет 80–82% от общего объема пор (Таблица 6). Диаметр макропор изученных носителей находится в диапазоне от 2 до 40 мкм, что обеспечивает эффективную адсорбцию клеток, размер которых 1–7 мкм. Показано, что дисперсное состояние углеродных носителей также имеет значение для процесса адсорбции клеток. Так, мелкодисперсность ФТД и порошкообразного угля-сырца обеспечивала связывание клеток родококков, сравнимое с БАУ. Среди изученных сорбентов, нетканый материал Карбопон имеет меньший суммарный объем пор – 0,60–0,68 см3/г, а у ФАС и активной ткани Урал ТМ-4 суммарный объем микро- и мезопор превышает объем макропор, что отражается на процессе адсорбции клеток. В дальнейшем в работе были изучена корреляция массы адгезированных бактериальных клеток и свойств носителей (дисперсности и гидрофобности поверхности). На основании того, что неспецифическая адсорбция предшествует адгезии бактериальных клеток, зависимость количества адгезированных клеток от их концентрации в суспензии была представлена в виде изотерм адсорбции. В случае взаимодействия клеток штамма R. ruber gt1 с поверхностью носителей было установлено, что на композиционных углерод-минеральных носителях изотермы адсорбции имеют вид изотерм Лэнгмюра, и на кривых наблюдается характерное плато, соответствующее образованию монослойного покрытия из адсорбированных бактериальных клеток – насыщению поверхности носителя клетками (Рисунок 13, а). Исследования показали, что максимальной адсорбционной способностью по отношению к клеткам R. ruber gt1 обладают углеродные носители семейства «Сапропели» и Сибунит (Рисунок 13, б), масса адгезированных клеток на данных носителях достигала 20–25 мг/г. Для «Сапропеля», как показали расчеты, от 50 до 100% поверхности были доступны для адгезии родококков благодаря макропористой структуре данного носителя, в которой преобладали поры размером ≥ 2–4 мкм. Для мезопористых носителей Сибунита и КВУ доступная для адгезии родококков поверхность составляла не более 10% от величины S УД БЭТ (Таблица 7, 8). Для всех носителей было найдено, 118 что при начальной концентрации клеток в суспензии 0,2–0,3 мг/мл на поверхности закрепляется до 90% бактерий от их общего числа в суспензии, тогда как при концентрации клеток 2,7 мг/мл – лишь от 20 до 50% клеток в зависимости от носителя. (а) Масса адгезированных клеток,мг/г 16 14 1 2 12 3 10 8 6 4 2 0 0 3 (б) 30 Масса адгезированных клеток, мг/г 0.5 1 1.5 2 2.5 Концентрация клеток в суспензии,мг/мл 4 25 20 5 15 6 10 5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Концентрация клеток в суспензии, мг/мл 3 Рисунок 13 – Зависимость массы клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродминеральных (а) и углеродных носителях (б), от концентрации клеток в 119 суспензии: 1 – керамзит с КВУ-слоем, 2 – керамзит с Г-слоем, 3 – стеклопена с КВУ-слоем, 4 – «Сапропель», 5 – Сибунит, 6 – массивный КВУ Было обнаружено, что на всех изученных носителях при увеличении времени контакта бактериальной суспензии с адсорбентами количество адгезированных клеток возрастает в 2–3 раза (Таблица 12), что указывает на склонность родоккоков к агрегации, подтвержденной также электронномикроскопическим исследованием (Рисунок 11). Таким образом, адсорбционную способность изученных носителей по отношению к клеткам родококков можно повысить как путем увеличения продолжительности контакта клеток с носителем, так и увеличением концентрации клеточной суспензии. Таблица 12 – Адсорбционные свойства углеродсодержащих носителей по отношению к клеткам R. ruber gt1 и акриламиду 24 ч 96 ч Адсорбционная емкость носителей по отношению к акриламиду, мг/г Керамзит/КВУ(К1) 4,09 6,50 0 Керамзит/КВУ(К2) 4,17 6,45 0 Керамзит/Г-слой 4,13 6,19 0 Стеклопена/КВУ 2,90 4,69 0 «Сапропель» 2,55 6,63 3,92 Сибунит 2,01 4,60 5,31 КВУ массивный 4,35 5,73 0 ТУМаН 1 (ячейки размером 0,5–1 мм) 2,55 4,74 0 Масса адгезированных клеток, Носители мг АСБ/г носителя* ТУМаН 2 (ячейки 4,48 4,40 2,51 размером 1–2 мм) Примечание: *Начальная концентрация клеток в суспензии 0,35 мг/мл 120 Изучена адгезия клеток R. erythropolis 11-2 на активном угле БАУ. По типу изотермы можно заключить, что процесс взаимодействия описывается теорией полимолекулярной адсорбции Брунауэра, Эммета, Теллера (БЭТ) и предполагает формирование полислоя клеток на поверхности с высоким адсорбционным потенциалом [26]. Масса адгезированных клеток, мг/г 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Концентрация клеток в суспензии, мг/мл 4.5 Рисунок 14 – Зависимость массы адгезированных на БАУ клеток R. erythropolis 11-2 от концентрации клеток в суспензии По-видимому, в том случае, когда концентрация клеток в суспензии не превышает 0,75 мг/мл, имеет место монослойная адсорбция, т.к. в диапазоне концентрации от 0,09 до 0,75 мг/мл количество адсорбированных клеток не возрастает и составляет 7,3–7,5 мг клеток на 1 г сорбента (Рисунок 14). Но при дальнейшем увеличении концентрации клеток в суспензии величина адсорбции начинает линейно возрастать, достигая 63 мг/г при плотности суспензии 3,9 мг/мл. В этом диапазоне концентрации клеток в суспензии происходит полислойная адсорбция, что может в дальнейшем приводить к затруднениям массообмена при трансформации органических веществ. 121 Адгезия клеток штаммов P. fluorescens С2 и R. ruber gt1 на волокнистых углеродных адсорбентах была изучена в сравнительном аспекте. Псевдомонады и родококки неслучайно были выбраны в качестве модельных организмов для изучения процесса адгезии на нерастворимых неорганических материалах – главным образом, это связано с тем, что нитрилутилизирующие представители этих родов относятся к различным группам: гамма-протеобактерии Pseudomonas sp. – грамотрицательны, актинобактерии Rhodococcus sp. – грамположительны. Кроме того, по BACH-тесту оценивалась гидрофобность поверхности клеток исследуемых штаммов [29, 358]. Определено, что относительная гидрофобность клеток R. ruber gt1 и R. erythropolis 11-2, оцененная по сродству к гексадекану, составляет в среднем 41–52%, т.е. около половины клеток суспензии при смешивании с гексадеканом переходит в гидрофобную фазу. Поверхность P. fluorescens С2, наоборот, гидрофильна, т.к. в среднем не более 6% клеток этого штамма переходят в фазу гексадекана. Известно, что адгезивная активность микроорганизмов определяется свойствами клеточной поверхности, прежде всего ее гидрофобностью, и в свою очередь, степень гидрофобности микробных клеток зависит от содержания липидов в клеточной стенке [64]. Нами было показано, что клетки родококков, имеющие гидрофобную поверхность, лучше адгезируются на гидрофобной поверхности углеродных носителей, чем клетки псевдомонад (Рисунок 15). По характеру графиков зависимости массы адгезированных клеток от их начальной концентрации в суспензии можно сделать вывод о насыщении адсорбента клетками, которое наступает при достижении концентрации суспензии P. fluorescens С2 0,15 мг АСБ/мл и R. ruber gt1 – 1–1,5 мг АСБ/мл. Масса адгезированных клеток на активированном Карбопоне была выше, чем на неактивированном, из чего можно заключить, что активация носителя позволяет увеличить его способность связывать клетки бактерий. 122 (а) 1 Масса адгезированных клеток, мг/г 20 2 16 12 8 3 4 0 0 0.5 1 1.5 2 Концентрация клеток в суспензии, мг/мл (б) 7 Масса адгезированных клеток, мг/г 2.5 1 6 5 4 3 2 2 1 3 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Концентрация клеток в суспензии, мг/мл 0.35 Рисунок 15 – Зависимость массы клеток R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens С2 (б), адгезированных на углеродных волокнистых материалах, от концентрации клеток в суспензии: 1 – Карбопон–B–актив, 2 – Карбопон, 3 – Урал ТМ–4 123 Т.к. по данным BACH-теста клетки P. fluorescens С2 имеют гидрофильную поверхность, можно предположить лучшее сродство клеток к гидрофильному, а не гидрофобному носителю. В качестве такого носителя был выбран каолин – высокодисперсная пластичная порода, состоящая в основном из минерала каолинита (гидросиликата алюминия), которая представляет собой мелкие гидрофильные частицы пластинчатого строения с толщиной пластинок 0,1–3,0 мкм [35]. Масса адгезированных клеток, мг /г 60 50 40 30 20 10 0 0 Рисунок 16 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Концентрация клеток в суспензии, мг/мл – Зависимость массы адгезированных на 3.5 каолине клеток P. fluorescens С2 от их концентрации в суспензии Показано, что зависимость массы адгезированных клеток P. fluorescens С2 от их начальной концентрации в суспензии близка к линейной. При концентрации клеток в суспензии 3 мг/мл (по сухой биомассе) масса адгезированных клеток достигает 47 мг АСБ на 1 г носителя (Рисунок 16). Ярко выраженная способность клеток бактерий данного штамма к адгезии на каолине, возможно, связана с высокой дисперсностью материала и сродством гидрофильных поверхностей клеток и носителя. Таким образом, приведенные выше примеры подтверждают, что одним из факторов успешной адгезии бактериальных клеток на 124 нерастворимом носителе является совпадение степени гидрофобности поверхности клетки и носителя. Действительно, движущей силой адсорбционного процесса на низкоэнергетических незаряженных поверхностях являются гидрофобные взаимодействия [60]. Однако формирование полислоя клеток родококков было обнаружено только на активированном адсорбенте БАУ. 3.1.1. Взаимодействие бактериальных клеток с многослойными углеродными нанотрубками Изучено взаимодействие бактериальных клеток с нанообъектами – многослойными углеродными нанотрубками (МУНТ). Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что в присутствии МУНТ бактериальные клетки образуют агрегаты, а углеродные нанотрубки адсорбируются на поверхности отдельных клеток и их агрегатов (Рисунок 17). Характер взаимодействия не зависит от типа клеточной стенки и одинаков как для грамположительных (R. ruber gt1, R. erythropolis 11–2), так и для грамотрицательных (A. faecalis 2) бактерий. Экспериментально подтверждено, что агрегаты клеток бактерий с нанотрубками представляют собой гетерогенный биокатализатор и легко отделяются от реакционной среды фильтрованием через бумажный фильтр «красная лента». Определено количество бактериальных клеток, которые связываются неочищенными и очищенными нанотрубками (Рисунок 18). Показано, что как грамположительные (R. ruber gt1, R. erythropolis 11–2), так и грамотрицательные (P. fluorescens C2, A. faecalis 2) бактерии лучше связываются неочищенными нанотрубками, причем процент связывания наиболее высок для клеток R. erythropolis 11–2 – 94 и 88% соответственно, и ниже для P. fluorescens C2 – 58 и 37% соответственно. 125 1 а 2 б 2 126 в г 3 2 3 Б Рисунок 17 – Агрегация клеток R. erythropolis 11–2 (а, б) и A. faecalis 2 (в, г) в присутствии углеродных нанотрубок: 1 – МУНТ, 2 – клеточные агрегаты, 3 – отдельные клетки, покрытые нанотрубками А Концентрация клеток, мг/г 500 450 400 350 300 250 2 200 150 100 1 50 0 P.fluorescens C2 A. faecalis 2 R. ruber gt1 R. erythropolis 11-2 Рисунок 18 – Концентрация клеток (мг/г), сорбируемая очищенными (1) и неочищенными (2) углеродными нанотрубками 127 3.2. Свойства углеродсодержащих носителей Адгезия бактериальных клеток на нерастворимых носителях является результатом взаимодействия двух факторов – свойств клеточной поверхности и характеристик самого материала, на котором закрепляются клетки. Следовательно, для изучения этого процесса необходимо определение основных свойств носителей, таких как гидрофобность, дисперсность, шероховатость и элементный состав. Гидрофобность углеродсодержащих носителей оценивали по адсорбции нафталина из 0,1 мМ водного раствора (Таблица 13). Исходя из данных адсорбции гидрофобного нафталина на изученных носителях, наиболее гидрофобным является активированная углеродная ткань Карбопон-В-актив и активный уголь Norit PK 1-3, не адсорбирует нафталин массивный КВУ, а минимальная адсорбция этого вещества наблюдается на пеностекле со слоем каталитического волокнистого углерода. Корреляционный анализ (n=14) выявил статистически значимую положительную связь между гидрофобностью адсорбента и массой адгезированных клеток родококков, имеющих гидрофобную клеточную стенку (r=0,679; p=0,05). Корреляция в данном случае может быть оценена как умеренная. Также определяли массу адгезированных клеток штаммов бактерий, различающихся гидрофобностью клеточной стенки, на носителях с различной гидрофобностью поверхности (Таблица 14). Оценивали корреляцию массы адгезированных клеток Pseudomonas fluorescens C2 (гидрофобность поверхности 5,9%), Acinetobacter guillouiae 11h (4,8%), Alcaligenes faecalis 2 (18,5%), Rhodococcus erythropolis 11-2 (41,1%) с гидрофобностью носителей. Так, для штамма Pseudomonas fluorescens C2, поверхность клеток которого была оценена как гидрофильная, отмечали умеренную отрицательную связь между массой адгезированных клеток и гидрофобностью носителей (r= –0,664; p=0,05), что может быть объяснено тем, что все носители в той или иной мере были гидрофобны (от 20 до 92%). В то же время, для других штаммов распределение 128 признаков было отличным от нормального, а корреляция была недостоверной. Это может быть связано с тем, что на адгезию влияют и другие свойства носителей, а именно дисперсность, удельная поверхность и размер макропор. Однако, при оценке зависимости массы адгезированных клеток изученных штаммов, отличающихся гидрофобностью поверхности, на каждом из изученных углеродсодержащих носителей, была выявлена сильная положительная связь от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). Это может свидетельствовать о том, что при адгезии на гидрофобном носителе масса прикрепившихся клеток тем выше, чем больше гидрофобность их поверхности. Таблица 13 – Корреляция массы адгезированных клеток R. ruber gt1 с гидрофобностью носителей, выраженной в % адсорбции нафталина (M±m) Адсорбция нафталина, % Масса адгезированных клеток R. ruber gt1, мг/г* БАУ Березовый активный уголь 65,9±4,5 14,5 Березовый уголь-сырец 54,2±5,0 12,5 Norit PK 1-3 91,9±6,0 13 ФТД 60,4±4,4 12 ФАС 54,6±8,9 8 Карбонизированная ткань «Урал- 43,4±12,4 9,5 Карбопон 43,8±7,3 7,5 Карбопон-В-актив 91,7±5,5 17 Сибунит 46,0±2,2 9,5 «Сапропель» активированный 20,8±1,0 13 СУМС 36,5±6,2 7 КВУ массивный 0 9,3 КВУ-пеностекло 15,0±4,9 8,9 Керамзит – графитоподобный слой 34,5±19,0 14,5 Носитель ТМ-4» * Концентрация исходной клеточной суспензии 1 мг/мл 129 Таблица 14 – Масса адгезированных клеток штаммов, различающихся гидрофобностью клеточной стенки, на углеродсодержащих носителях(M±m) Штаммы гидрофобность клеток, % гидрофобность носители носителей, % Pseudomonas Acinetobacter Alcaligenes guillouiae fluorescens faecalis 2 11h C2 5,9±1,8 4,8±2,3 18,5±4,5 Rhodococcus erythropolis 11-2 41,1±8,2 Масса адгезированных клеток, мг/г БАУ 65,9±4,5 1,74±0,30 2,29±0,48 3,86±0,92 7,92±0,50 Norit PK1-3 ФТД 91,9±6,0 3,26±0,40 0,12±0,03 2,87±0,55 14,45±0,81 60,4±4,4 0,03±0,02 3,48±0,30 3,48±0,06 8,10±1,12 ФАС 54,6±8,9 1,60±0,32 0,62±0,13 2,37±0,79 12,93±0,36 СУМС 36,5±6,2 4,77±0,17 1,07±0,27 3,65±0,25 15,2±0,80 Сибунит 46,0±2,2 9,25±0,78 6,00±0,28 12,95±0,49 36,55±0,42 «Сапропель» 20,8±1,0 11,55±0,07 9,68±0,04 15,15±0,78 37,30±0,64 *Концентрация исходной клеточной суспензии 1 мг/мл Дисперсность носителей (Таблица 15) оценивали в световом микроскопе Биомед-6 (Россия) при увеличении 40 раз, результаты обрабатывали в программе Thixomet Lite. В случае если размер частиц превышал 1,5 мм, дисперсность оценивали с использованием стереомикроскопа SKT-3BT (Meiji techno, Япония) при увеличении 20 раз. Корреляционный анализ (n=14) выявил слабую положительную связь между величиной адсорбции и дисперсностью носителей (r=0,220; p=0,05), что говорит о том, что эта характеристика не является определяющей для адгезии клеток. Только при сравнении носителей одной марки, но разной дисперсности (порошкообразный и дробленый уголь сырец) можно говорить о том, что на материале с более высокой дисперсностью адгезируется больше клеток (в среднем 12,5 и 7,38 мг сухих клеток / г носителя соответственно). 130 Таблица 15 – Дисперсность носителей Носитель Размер частицы, мм Площадь поверхности частицы, мм2 ФТД 0,392±0,037 0,137±0,023 ФАС мелкие частицы 0,995±0,150 1,270±0,368 2,92±0,30 - 0,021±0,004 0,00026±0,00007 3,50±0,56 - 1,341±0,125 2,023±0,345 2,69±0,20 - СУМС 0,925±0,097 0,958±0,220 КВУ массивный 1,153±0,202 1,334±0,453 Керамзит/КВУ слой (6%) 0,824±0,116 0,781±0,182 Керамзит/графитоподобный слой КВУ/пеностекло 7,09±0,61 - 6,17±0,74 - БАУ 3,90±0,55 - Norit PK 1-3 3,59±0,49 - Шунгит 3,19±0,54 - ФАС крупные частицы Сырец порошкообразный Сырец дробленый «Сапропель» Сибунит Шероховатость поверхности носителей (Таблица 16) оценивали на бесконтактном оптическом трехмерном профилометре высокой точности – интерференционном микроскопе NewView 5000 (Германия). Определяли шероховатость (Ra) и среднее квадратичное отклонение (rms). Оценивали корреляцию массы адгезированных клеток R. ruber gt1 и шероховатости поверхности углеродсодержащих носителей. Был рассчитан непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена: R= –0,276, но при этом p=0,47, что говорит о недостоверности этой связи. Следовательно, нельзя делать заключение о взаимосвязи этих двух параметров. Вероятно, отсутствие достоверной связи этих параметров является следствием влияния множества факторов на адгезию 131 бактериальных клеток на нерастворимом носителе, из которых изменение шероховатости поверхности адсорбента в изученных пределах не является определяющим. Таблица 16 – Шероховатость носителей Носитель Ra, мкм rms, мкм Керамзит/Г-слой 1034 2212 КВУ/массивный 2206 2929 КВУ/пеностекло 3467 4051 БАУ 1164 1376 Шунгит 1902 2437 Сырец 3992 4645 Сибунит 727 920 «Сапропель» 3417 4143 ФАС 145 110 132 Элементный состав двух отличающихся по происхождению носителей – карбонизированной ткани Урал ТМ-4 (исходное сырье – вискозное волокно) и «Сапропеля» активированного (исходное сырье – ил пресных озер Омской области) был изучен в сканирующем электронном микроскопе MIRA 3 (“TESCAN”, Чехия) с помощью системы рентгеновского энергодисперсионного микроанализа. Показано, что основным элементом карбонизированной ткани Урал ТМ-4 является углерод (Рисунок 19), тогда как «Сапропель» более сложен по элементному составу, и содержит Si, O, K, Na, Mg, Al, Ca, S, Fe и другие элементы, что может быть объяснено органической природой этого носителя (Рисунок 20). Можно выдвинуть предположение, что элементный состав носителя оказывает определенное воздействие на физиологическое состояние адгезированных клеток, следовательно, тоже должен быть учтен при выборе оптимального носителя клеток в гетерогенном биокатализе. Рисунок 19 – Элементный состав карбонизированной ткани Урал ТМ-4 133 Рисунок 20 – Элементный состав носителя «Сапропель» 3.2.1. Адсорбция нитрилов, амидов и карбоновых кислот на неорганических носителях В процессе биокаталитического синтеза важным этапом является отделение конечного продукта ферментативной реакции от биокатализатора. В случае использования иммобилизованных каталитически активных клеток необходимо учитывать связывание полученного продукта с сорбентом. Сорбционная емкость углеродных носителей по отношению к акриламиду представлена в таблице 17. Показано, что носители с иммобилизованными клетками адсорбировали меньше акриламида, чем свободные от клеток. Разность между адсорбцией 134 продукта реакции свободными носителями и носителями, содержащими клетки, была достаточно велика для дробленого активного угля БАУ (22 и 7 мг/г сорбента соответственно). Сорбция акриламида на угле-сырце практически отсутствовала. Уменьшение адсорбции акриламида на носителе при иммобилизации клеток, вероятно, объясняется тем, что иммобилизованные клетки блокируют доступ к части микропор, в которых, главным образом, адсорбируются низкомолекулярные органические соединения. Суммарный объем пор угля-сырца в основном представлен макропорами, что объясняет малые величины адсорбции молекул акриламида и полное отсутствие его адсорбции после предварительной иммобилизации клеток. Было показано, что акриламид не адсорбируется на КВУ и графитоподобном углероде, но в небольшом количестве адсорбируется на Сибуните и «Сапропеле» – 5,31 и 3,92 мг/г носителя соответственно (Таблица 12). Таблица 17 – Адсорбция акриламида на углеродных носителях, мг/г (M±m) Носители Адсорбция акриламида носителями без клеток Адсорбция акриламида носителями с иммобилизованными на них клетками БАУ 22,0±2,3 6,6±2,6 Norit PK 1-3 16,7±1,5 7,5±0,5 ФТД 19,4±0,9 9,5±0,8 уголь-сырец 2,9±0,5 0,1±0,0 Карбопон 10,6±0,4 4,6±1,4 ФАС 16,5±0,6 11,2±2,9 Изучена адсорбция соответствующих амидов ароматических и нитрилов карбоновых кислот, (цианопиридинов) образующихся и при ферментативном гидролизе этих нитрилов. В отличие от алифатических органических веществ, ароматические соединения адсорбировались на активированных носителях (БАУ, Карбопон-В-актив) в большей степени. Так, на 135 БАУ адсорбировалось до 90 мг/г 3-цианопиридина и до 78 мг/г никотинамида (Таблица 18). Определено, что на 0,5 г БАУ за 40 мин адсорбируется 74% 100 мМ раствора никотинамида и 86% 100 мМ раствора 3-цианопиридина. На 0,2 г Карбопон-В-актив за то же время адсорбировалось 11 и 32%; на 0,2 г «Сапропеля» – 6 и 10% соответственно. Таблица 18 – Адсорбция ароматических нитрилов, амидов и карбоновых кислот на неорганических носителях, мг/г (M±m) Носитель 3-цианопиридин никотинамид никотиновая кислота БАУ 90,24±0,07 77,64±0,52 3,62±0,72 Карбопон-В-актив 82,38±11,64 27,81±5,61 0 «Сапропель» 25,93±1,65 15,34±3,26 0 Урал ТМ-4 0 0 0 Уголь-сырец 0 0 0 Каолин 0 0 0 3.3. Трансформация алифатических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий Одним из основных качеств гетерогенного биокатализатора, по которому можно судить о его эффективности, является сохранение исходной ферментативной активности клеток как сразу после адгезии, так и при многократном использовании биокатализатора. Сохранение активности при проведении последовательных циклов трансформации субстрата было обозначено термином «операционная стабильность биокатализатора». Эту характеристику определяли как для иммобилизованных, нитрилгидролизующих бактерий. так и для свободных клеток 136 3.3.1. Влияние адгезии клеток нитрилгидролизующих бактерий на их ферментативную активность Была определена удельная нитрилгидратазная активность клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродсодержащих адсорбентах, удельная нитрилазная активность клеток P. C2, fluorescens адгезированных на углеродсодержащих носителях и каолине, удельная амидазная активность R. erythropolis 11-2, адгезированных на БАУ и угле-сырце. Нитрилгидратазная активность адгезированных клеток R. ruber gt1 Удельная нитрилгидратазная активность суспендированных клеток линейно возрастает при увеличении концентрации НАК до 0,05 М (Рисунок 21). При дальнейшем повышении концентрации субстрата значительного возрастания активности не наблюдается, т.к. происходит насыщение активного центра фермента субстратом. В данном случае график зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата представляет собой часть равнобочной гиперболы, как и в большинстве случаев, касающихся кинетики реакций, катализируемых изолированными ферментами [15]. Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 800 600 400 200 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Концентрация НАК, М 1 1.2 Рисунок 21 – Зависимость удельной нитрилгидратазной активности клеток R. ruber gt1 от концентрации НАК 137 Нитрилгидратазная активность, равная максимальной активности интактных клеток, у родококков, иммобилизованных на всех изученных углеродных сорбентах, за исключением «Сапропеля», достигается при возрастании концентрации субстрата до 0,8–1,3 М (Таблица 19). Таблица 19 – Эффективность функционирования иммобилизованной системы (η) и стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродсодержащих носителях Носитель [S], M η n БАУ 1,04 1,41 8 Norit PK 1-3 1,63 1,35 8 ФТД 0,97 1,42 7 уголь-сырец 0,77 1,43 8 Урал ТМ-4 1,25 1,15 7 Карбопон 0,97 1,28 7 Карбопон-В-актив 1,13 0,81 5 ФАС 1,21 1,42 7 Массивный КВУ 0,86 1,23 7 Керамзит/графитоподобный слой 1,3 0,57 2 Керамзит/КВУ-слой (6,47 вес%) 0,9 2,28 8 Керамзит/КВУ-слой (2,84 – 3,63 вес%) 0,9 1,84 6 Сибунит 1,13 2,35 2 «Сапропель» 0,05 2,85 3 Шунгит 1,3 0,11 10 Примечание: [S] – концентрация раствора акрилонитрила, при которой наблюдается максимальная активность адгезированных клеток; n – количество 138 циклов, в которых сохраняется 50% активности гетерогенного биокатализатора; η суспензии клеток принято за 1. При этом адгезированные клетки проявляют при трансформации высоких концентраций субстрата ферментативную активность, превышающую на 20–40% ее максимальное значение у суспендированных клеток. Исключение составляют гетерогенные биокатализаторы, приготовленные путем адгезии клеток родококков на материалах Карбопон-В-актив (активность не превышает 81% исходной), керамзите с графитоподобным слоем углерода на поверхности (57% исходной) и шунгите (11%). Возможно, такое снижение активности связано со свойствами носителей. Активированное нетканное полотно "Карбопон-В-актив" представляет собой углеродный волокнистый сорбент, нетканная основа которого импрегнирована мелкодисперсным активированным углеродом [2]. В результате такой модификации материал Карбопон-В-актив обладает сильно гидрофобной поверхностью и высокой сорбционной емкостью, что приводит к частичной адсорбции продукта реакции. Также снижение активности может быть связано с возникновением диффузионных затруднений при полислойной адсорбции клеток, о которой можно судить по характеру кривых адсорбции (Рисунок 15). Падение нитрилгидратазной активности родококков при адгезии на шунгите может быть объяснено бактерицидной свидетельствует в пользу природой этого утверждения, адсорбента что для [22], что проявления также данной ферментативной активности необходимо поддержание жизнеспособности клетки. Относительно гладкий графитоподобный слой углерода, синтезированный на поверхности керамзита, по-видимому, оказывает неблагоприятное воздействие на активность адгезированных на нем клеток, возможно, связанное с увеличением сайтов адгезии при взаимодействии с гладкой поверхностью, что может неблагоприятно сказаться на массообмене. Так, при сравнении микрофотографий, полученных в сканирующем электронном микроскопе, можно заметить отличие между характером адгезии клеток на гладком (керамзите с поверхностным слоем графитоподобного углерода) и шероховатом (керамзите со слоем КВУ) носителе 139 (Рисунок 22). Можно предположить, что гладкая поверхность носителя менее благоприятна для проявления ферментативной активности иммобилизованного биокатализатора. Пределом растворимости НАК является концентрация 1,1 М (7,35% при температуре 20ºС) [1]. Возможность использования более высоких концентраций для биотрансформации связана с тем, что клетки постепенно поглощают субстрат и трансформируют его в продукт (акриламид), удаляя НАК из реакционной среды, в результате чего происходит постепенное его растворение и конверсия. Повышение концентрации НАК в среде ограничено, по-видимому, его токсичностью для клеток и ферментативных систем. а б Рисунок 22 – Клетки R. ruber gt1, адгезированные на керамзите с поверхностным слоем КВУ (а) и на керамзите с поверхностным слоем графитоподобного углерода (б) [36]. Нитрилазная активность адгезированных клеток P. fluorescens С2 Было отмечено, что нитрилазная активность штамма P. fluorescens С2, как и нитрилгидратазная R. ruber gt 1, возрастала у адгезированных клеток по сравнению с суспендированными. В зависимости от носителя активность возрастала: при адгезии клеток на углеродной ткани Урал ТМ-4 – в 7,4 раза (до 140 2,6 мкмоль/мг/мин), на Карбопон-В-актив – в 2 раза (до 0,7 мкмоль/мг/мин) при исходной активности суспендированных клеток 0,35 мкмоль/мг/мин. Такое увеличение ферментативной активности наблюдалось лишь при высоких концентрациях вносимого субстрата (9–10 об.%), значительно превышающих технологические концентрации (2%), разработанные для проведения синтеза карбоновых кислот и амидов суспендированной биомассой [3]. В то же время, активность адгезированных клеток P. fluorescens С2 зависела от концентрации клеток в реакционной среде. Так, на угле-сырце различной дисперсности (порошкообразном, дробленом с размером фракций 1–6 и 3–10 мм) масса адгезированных клеток возрастала с увеличением дисперсности, но при этом снижалась удельная нитрилазная активность по отношению к НАК (Рисунок 23). Нитрилазная активность суспензии P. fluorescens С2 также находится в обратной зависимости от концентрации клеток при избытке субстрата в среде (конверсия 1,3 М раствора НАК). Обнаружена сильная отрицательная корреляционная связь между этими показателями (r= –0,871; p=0,05). Масса адгезированных клеток Активность Масса адгезированных клеток, мг/г 12 800 700 600 10 500 8 400 6 300 4 200 2 100 0 0 ПС ФрС1 Удельная нитрилазная активность, ммоль/г/ч 14 ФрС2 Рисунок 23 – Зависимость удельной нитрилазной активности при конверсии НАК от концентрации клеток P. fluorescens С2, адгезированных на различных 141 фракциях угля-сырца (ПС – порошкообразный, ФрС1 – фракция с размером частиц 1–6 мм, ФрС2 – фракция с размером частиц 3–10 мм) Таким образом, на удельную нитрилазную активность клеток влияет их концентрация в реакционной среде, а в гетерогенном биокатализе ферментативная активность зависит от количества адгезированных клеток при прочих равных условиях и избытке субстрата. Адгезия клеток P. fluorescens С2 на каолине приводила к достоверному увеличению нитрилазной активности иммобилизованных клеток при концентрации НАК от 0,59 до 1,3 М (p˂0,05), причем средняя величина активности адгезированных клеток при концентрации субстрата 1,3 М превышала таковую свободных клеток в 2 раза (Рисунок 24). Всплеск активности при данной концентрации субстрата может быть связан с тем, что эта концентрация НАК является оптимальной для иммобилизованных клеток – несмотря на то, что она находится за пределами растворимости (1,1 М при 20ºС), присутствие адсорбента Удельная нитрилазная активность, мкмоль/мг/мин влияет на равномерное потребление субстрата с постепенным его растворением. 4 3.5 1 3 2.5 2 2 1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Концентрация НАК, М Рисунок 24 – Влияние концентрации субстрата на удельную нитрилазную активность адгезированных на каолине (1) и свободных (2) клеток штамма P. fluorescens С2, взятых в концентрации 0,4 мг/мл 142 Удельная нитрилазная активность клеток P. fluorescens С2, адгезированных на каолине, при гидролизе 1,3 М раствора НАК была сопоставима с активностью высокопродуктивных продуцентов нитрилазы Alcaligenes denitrificans C-32 и A. denitrificans ВКПМ В-9582 (2,4 и 3,6 мкмоль/мг/мин при выращивании на мясопептонном агаре и 2,8 и 4,0 мкмоль/мг/мин при выращивании на минеральной среде с ацетатом аммония и кукурузным экстрактом в колбах) [69]. В то же время, при малой концентрации адгезированных клеток активность P. fluorescens С2 достигала 12 мкмоль/мг/мин, что говорит о перспективности использования малых количеств адгезированных клеток или сильно разбавленных суспензий микроорганизмов для увеличения нитрилазной активности. Амидазная активность адгезированных клеток R. erythropolis 11-2 Чтобы оценить влияние адгезии клеток R. erythropolis 11-2 на амидазную активность, проводили трансформацию различных концентраций акриламида свободными и иммобилизованными на БАУ клетками. Определено, что удельная амидазная активность находилась в обратной зависимости от концентрации клеток при конверсии амидов как интактными клетками, так и адгезированными на носителе (Рисунок 25). Показана сильная обратная связь между концентрацией клеток в суспензии и их активностью (R = –0,821; p = 0,02). Подобная зависимость была обнаружена для амидазной и нитрилазной активности, что, вероятно, связано с невысокой скоростью конверсии субстрата. В этом случае удельная активность составляла единицы мкмоль продукта, образуемого в минуту 1 мг сухих клеток, тогда как в случае нитрилгидратазной активности – сотни мкмоль. В связи с этим может быть выдвинута гипотеза, по которой при изначальной относительно низкой скорости ферментативной реакции определяющую роль играет диффузия субстрата, когда затруднения массообмена возникают как при высокой концентрации клеток в суспензии, так и при избыточной (полислойной) адсорбции клеток на носителе. 143 (а) Удельная амидазная активность, ммоль/г/ч 6 5 4 3 2 1 0 0 15 30 45 Масса адгезированных клеток, мг/г (б) 35 Удельная амидазная активность, ммоль/г/ч 60 30 25 20 15 10 5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Масса адгезированных клеток, мг/мл 3.5 Рисунок 25 – Зависимость удельной амидазной активности адгезированных на БАУ (а) и суспендированных (б) клеток R. erythropolis 11-2 от их концентрации в реакционной среде. 144 При одинаковом количестве адгезированных и суспендированных клеток (4–4,5 мг) в реакционной среде иммобилизованные клетки трансформировали 50– 500 мМ раствор акриламида с меньшей скоростью, чем свободные (Рисунок 26). По-видимому, в данном случае плотность клеток имела определяющее значение для проявления активности, хотя за время, в течение которого определяли накопление продукта, субстрат реакции полностью не использовался. Плотность адгезированных клеток была в данном случае значительно выше, чем в суспензии, что, возможно, оказывало неблагоприятное воздействие на проявление Удельная амидазная активность, ммоль/г/ч активности в связи с диффузионными затруднениями и конкуренцией за субстрат. 40 35 1 30 25 20 2 15 10 5 0 0 100 200 300 400 Концентрация субстрата, мМ 500 Рисунок 26 – Влияние концентрации акриламида на удельную амидазную активность клеток R. erythropolis 11–2 в суспензии (1) и адгезированных на БАУ (2) Клетки R. erythropolis 11-2 были адгезированы на различных фракциях углясырца: порошкообразном и дробленом с размером частиц 1–6 и 3–10 мм. Было показано, что на порошкообразном носителе адгезируется в 10 раз больше биомассы, чем на дробленых фракциях, но величина удельной амидазной 145 активности при этом находится в обратной зависимости от количества клеток 60 350 Масса адгезированных клеток, мг/г Масса адгезированных клеток Активность 50 300 250 40 200 30 150 20 100 10 50 0 0 ПС ФрС1 Удельная амидазная активность, ммоль/г/ч (Рисунок 27). ФрС2 Рисунок 27 – Зависимость удельной амидазной активности при конверсии акриламида от концентрации клеток R. erythropolis 11-2, адгезированных на различных фракциях угля-сырца (ПС – порошкообразный, ФрС1 – фракция с размером частиц 1–6 мм, ФрС2 – фракция с размером частиц 3–10 мм) При сравнении полученных данных с данными других исследователей можно утверждать, что удельная амидазная активность клеток R. erythropolis 11-2, достигающая 300 ммоль/г/ч при концентрации адгезированных клеток на дробленом угле-сырце 2,5 мг АСБ/г, превышает амидазную активность, которую проявляет Rhodococcus erythropolis MTCC 1526 на оптимизированной среде культивирования [198]. Так, внесение в качестве индуктора ацетамида позволило авторам исследования достичь активности, равной 464,23 ЕД/г (ЕД активности была принята как количество фермента, конвертирующего 1 мкмоль ацетамида и гидроксиламина до ацетгидроксамата и аммония в мин при 37ºС), что соответствовало 28 ммоль/г/ч. Максимум амидазной активности в этом 146 исследовании был достигнут при выращивании родококков на оптимизированной среде с определенным соотношением сорбитола, дрожжевого экстракта, мясного пептона и ацетамида, и был равен 1162,09 ЕД/г, что соответствовало 70 ммоль/г/ч [198]. 3.3.2. Операционная стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий Для того чтобы оценить операционную стабильность биокатализатора, проводили последовательные циклы конверсии субстрата, после каждого цикла гетерогенный биокатализатор отделяли от реакционной среды, промывали 0,01 М калий-фосфатным буфером (рН 7,2±0,2) и использовали в дальнейших трансформациях. Снижение ферментативной активности при многократной конверсии субстрата может происходить либо в результате ингибирования фермента, либо из-за десорбции клеток и вымывания их из реакционной среды. Преимущество имел биокатализатор, способный длительно и многократно конвертировать субстрат без потери ферментативной активности. Операционная стабильность биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt 1, адгезированных на углеродсодержащих носителях Операционную стабильность биокатализаторов на основе адгезированных клеток R. ruber gt 1 оценивали при проведении последовательных 20-минутных циклов трансформаций НАК. После 1-го цикла реакции у клеток, иммобилизованных на большинстве изученных носителей, наблюдали повышение активности фермента в последующих циклах (Рисунок 28, 29). Подобное повышение активности может быть обусловлено защитным действием носителей и/или адаптацией внутриклеточного фермента к дозированному поступлению субстрата. Это явление также может быть связано с тем, что активность вычисляется по образованию продукта, который в первом цикле частично 147 адсорбируется на носителях (адсорбция акриламида показана в таблице 17). В последующих циклах величина адсорбции продукта снижается, т.к. уменьшается доступная для адсорбции поверхность носителя, что приводит к повышению концентрации акриламида в реакционной среде. В этом случае происходит кажущееся повышение активности фермента, обусловленное лишь снижением адсорбции продукта по мере уменьшения доступной поверхности носителя. Тем не менее, 3–4 кратное повышение активности в последующих циклах не может быть объяснено лишь адсорбционными процессами, особенно в случае таких носителей, как порошкообразный уголь-сырец, который не адсорбирует акриламид. D. Chand с соавторами (2004 г) наблюдали подобное явление повышения ферментативной активности в последующих циклах по сравнению с первым циклом конверсии при многоцикловом гидролизе ацетамида, акриламида и пропионамида клетками R. rhodochrous NHB–2, иммобилизованными методом включения в структуру гелей агара и акриламида. Авторы предполагали, что это связано с поддержанием в системе иммобилизованных клеток определенного уровня субстрата и продукта, благоприятствующего протеканию реакции [396]. Показано, что нитрилгидратазная активность клеток R. ruber gt 1, адгезированных на БАУ и порошкообразном угле-сырце, не ниже активности фермента в первом цикле на протяжении 8 циклов реакции, на Карбопоне, Norit PK 1-3, ФАС – 7 циклов, на ФТД и дробленом угле-сырце – 6 циклов. При сравнении операционной стабильности гетерогенных биокатализаторов, носителями которых являются волокнистые активированные и неактивированные углеродные материалы, показано, что нитрилгидратазная активность клеток на активированных углеродных волокнах (Карбопон-В-актив) сохраняется в большей степени и большее количество циклов, чем на неактивированных (Урал ТМ-4) (Рисунок 29). Оценивали многократной продуктивность биотрансформации иммобилизованных НАК (Таблица родококков 20). при Наибольшая продуктивность при трансформации 1,3 М раствора НАК наблюдалась у клеток, адгезированных на Карбопоне, наименьшая – на дробленом угле-сырце. 148 Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 400 1 300 200 2 4 5 100 3 0 20 70 120 170 Продолжительность циклов реакции, мин 220 Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 400 6 300 7 200 100 8 0 20 70 120 170 Продолжительность циклов реакции, мин 220 Рисунок 28 – Операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродных носителях: 1 – БАУ, 2 – ФТД, 3 – Norit PK 1-3, 4 – порошкообразный уголь-сырец, 5 – ФАС, 6 – Карбопон, 7 – Урал, 8 – дробленый уголь-сырец. 149 Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 400 350 300 250 200 1 150 2 100 50 0 10 20 30 40 50 60 70 Продолжительность циклов реакции, мин 80 Рисунок 29 – Операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на волокнистых углеродных материалах: 1 – Карбопон-В-актив, 2 – Урал ТМ-4 Таблица 20 – Продуктивность гетерогенных биокатализаторов на основе нерастущих клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродных адсорбентах Носитель мг клеток (по сухому весу) ммоль акриламида ммоль АА/мг БАУ 2,09 325,39 155,69 ФТД 1,65 267,04 161,84 Карбопон 1,67 335,97 201,18 Norit PK 1-3 3,50 372,33 106,38 Урал ТМ-4 3,39 329,56 97,21 3,38 311,38 92,12 ФАС 3,06 300,08 98,07 порошкообразный уголь-сырец 2,80 403,16 143,99 дробленый угольсырец Примечание: Время работы биокатализатора в периодическом режиме 200 мин, концентрация НАК – 1,3 М 150 Изучена операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродсодержащих носителях марок Сибунит, «Сапропель», керамзитах с графитоподобным слоем углерода и слоем КВУ на поверхности. Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 300 250 200 150 1 100 2 50 3 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Продолжительность циклов реакции, мин 200 Рисунок 30 – Операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродных носителях: 1 – массивном КВУ, 2 – «Сапропеле», 3 – Сибуните 151 Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 1000 800 1 600 2 400 3 200 0 20 40 60 80 Продолжительность циклов реакции, мин 100 Рисунок 31 – Операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродных и углерод- минеральных носителях: 1 – ТУМаН 1, 2 – стеклопена со слоем КВУ, 3 – ТУМаН 2 Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 250 200 1 150 100 50 2 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Продолжительность циклов реакции, мин Рисунок 32 – Операционная стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на композиционных углеродминеральных носителях: 1 – керамзит со слоем КВУ, 2 – керамзит со слоем графитоподобного углерода 152 При сравнении операционной стабильности гетерогенных биокатализаторов, полученных адгезией клеток R. ruber gt1 на углеродных («Сапропеле», Сибуните, массивном КВУ, носителях семейства ТУМаН) и углерод-минеральных носителях алюмосиликатной природы (керамзит, стеклопена) с синтезированными на их поверхности слоями различной морфологии, было показано, что только КВУ-слой дает преимущества при многократной конверсии НАК (Рисунок 30, 32). Снижение нитрилгидратазной активности клеток, иммобилизованных на этих носителях, наблюдается только к 7-му реакционному циклу, тогда как во всех остальных случаях падение активности начинается со второго цикла. Наиболее показательным является сравнение операционной стабильности гетерогенных биокатализаторов, носителями которых является керамзит с синтезированным на поверхности графитоподобным углеродом (гладкий слой) и КВУ (шероховатый слой) (Рисунок 32). При адгезии клеток на гладком графитоподобном слое углерода существенно снижается и нитрилгидратазная активность, и операционная стабильность. Сохранение нитрилгидратазной активности,% 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 Циклы 5 6 7 Рисунок 33 – Операционная стабильность суспендированных клеток R. ruber gt1 153 Операционную стабильность гетерогенных биокатализаторов сравнивали с таковой биокатализатора в виде суспензии клеток R. ruber gt1 стационарной фазы роста. Показано, что 50% первоначальной активности терялось уже во 2 цикле трансформации 1,3 М раствора НАК, а к 7 циклу оставалась не более 3% нитрилгидратазной активности (Рисунок 33). Следовательно, гетерогенный процесс значительно стабилизирует ферментативную активность и дает возможность многократного использования биокатализатора. Также было показано, что снижение активности гетерогенных биокатализаторов при многоцикловом использовании обусловлено дезактивацией фермента, а не десорбцией клеток, т.к. в десорбирующем буферном растворе нитрилгидратазную активность не обнаруживали. В препаратах промывных вод, исследованных в световом фазово-контрастном микроскопе, бактериальные клетки не обнаруживались, хотя реакция на присутствие белка с реактивом Бредфорд была слабой положительной, что может свидетельствовать о присутствии единичных клеток, либо содержимого лизированных клеток в промыве. Сравнивая операционную стабильность адгезированных клеток родококков, обладающих нитрилгидратазной активностью, с данными научной литературы, следует отметить, что клетки, иммобилизованные в геле альгината кальция, могут конвертировать некоторые субстраты более продолжительное время и в течение большего количества последовательных циклов реакций. Так, биокатализатор на основе клеток P. chlororaphis B23, иммобилизованых в структуре геля альгината кальция, осуществлял гидратацию адипонитрила до 5-циановалерамида на протяжении 58 Brevibacterium последовательных CH1, включенные реакционных в гель циклов альгината [83]. кальция Клетки и ПАА, трансформировали акрилонитрил до акриламида при 7ºС в течение 7 дней без потери активности [221]. В то же время, при выборе способа иммобилизации и носителя следует учитывать не только операционную стабильность, но и другие характеристики, а именно сохранение активности при иммобилизации, нагрузку клетками, доступность (дешевизну) носителя, стоимость процедуры 154 иммобилизации и др. Кроме того, как отмечает D. Kubáč с соавторами, операционная стабильность иммобилизованного биокатализатора сильно зависит от субстрата и /или продукта биотрансформации – так, клетки R. equi A4, иммобилизованные в структуре носителя носителя LentiKats® (сополимер ПВС и полиэтиленгликоля), трансформировали (R,S)-3-гидрокси-2-метилено- бутанонитрил в течение 4-х циклов без потери активности, тогда как при трансформации бензонитрила терялось около 20 и 30% первоначальной активности уже во втором и третьем циклах [136]. Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток P. fluorescens С2, адгезированных на углеродсодержащих носителях Несмотря на то, что нитрилазная активность значительно ниже нитрилгидратазной, стабильность нитрилазы гораздо выше, что, возможно, связано с ее большей термостабильностью по сравнению с нитрилгидратазой. Известно, что тепловой выход реакции гидратации НАК составляет +18–19 ккал/моль [3], а разогрев реакционной смеси, находящийся в прямой зависимости от концентрации субстрата, приводит к падению активности фермента. В случае нитрилазной активности биокатализаторов операционная превышала таковую стабильность гетерогенных на гомогенных основе клеток P. fluorescens С2, адгезированных на волокнистых углеродных материалах. Наибольшую стабильность при многократной конверсии НАК проявил гетерогенный биокатализатор, носителем клеток в котором был Карбопон-Вактив (Рисунок 34). При проведении последовательных циклов трансформации НАК клетками P. fluorescens С2, адгезированными на носителе Карбопон-В-актив, наблюдали повышение активности во втором цикле по сравнению с гидролизом субстрата сразу после адгезии. Факт повышения активности во втором и нескольких последующих циклах был неоднократно отмечен при многоцикловой конверсии НАК адгезированными клетками R. ruber gt1, в том числе и иммобилизованными 155 на носителе Карбопон-В-актив. Подобное явление было обнаружено в работах Сохранение активности, % [153, 168, 396], хотя исчерпывающего объяснения ему дано не было. 120 100 80 4 60 40 2 20 1 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Циклы Рисунок 34 – Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток P. fluorescens С2, адгезированных на носителях: 1– Карбопон-В-актив, 2 – Урал ТМ-4, 3 – Карбопон, 4 – суспензия Клетки нитрилазную трансформации P. fluorescens С2, активность НАК на адгезированные протяжении (Рисунок 35). 11 на каолине, сохраняли последовательных Определено, что время циклов работы биокатализатора достигало 288 ч, общая продуктивность составляла 1143 ммоль акриловой кислоты на 1 мг клеток. Время полужизни составляло 144 ч, что соответствует шести последовательным 24-х часовым циклам реакции. Постепенное снижение количества образуемой кислоты связано, главным образом, не с вымыванием клеток из реакционной среды либо их разрушением, сопровождающимся выходом нитрилазы в среду, а с ингибированием фермента при воздействии высоких концентраций токсичного субстрата. Это подтверждается отсутствием нитрилазной активности и клеток в промыве после проведения реакции. 156 Концентрация АК, ммоль/л 1200 1000 800 600 400 200 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 Продолжительность циклов реакции, ч Рисунок 35 – Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток P. fluorescens С2, адгезированных на каолине Данные, касающиеся операционной стабильности адгезированных клеток P. fluorescens С2, полученные нами, сопоставимы с литературными данными по операционной стабильности иммобилизованных нитрилазосодержащих бактерий в реакциях трансформации нитрилов. Так, при изучении различных способов иммобилизации клеток Bacillus sp. UG-5B было показано, что наименьшей стабильностью при конверсии бензонитрила обладают адсорбированные клетки и включенные в гибридные матриксы – остаточная активность после 5 циклов составляет 20 и 40% соответственно, а наибольшей – связанные с полисульфоновыми мембранами, сохраняющие 100% активности после 8 циклов и 50% после 10 циклов реакции [227]. 157 Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток R. erythropolis 11-2, адгезированных на углеродсодержащих носителях Изучена операционная стабильность биокатализатора на основе клеток R. erythropolis 11-2, адгезированных на БАУ. Показано, что иммобилизованные клетки на протяжении 7 циклов последовательных 24-х часовых реакций трансформации акриламида до акриловой кислоты сохраняют более 80% своей активности, причем до 6-го цикла активность даже превышает первоначальную, измеренную после адгезии клеток (Рисунок 36). В то же время, активность суспендированных клеток снижается уже во втором цикле, составляя менее 40% первоначальной, а к 7-му циклу не превышает 3% первоначальной активности. Таким образом, за 168 ч биокатализатор на основе адгезированных на БАУ клеток R. erythropolis 11-2 в количестве 3 мг (по сухой биомассе клеток) образует 37,4±2,6 мг акриловой кислоты. 180 Сохранение амидазной активности, % 160 1 140 120 100 80 60 40 2 20 0 1 2 3 4 Циклы 5 6 7 Рисунок 36 – Операционная стабильность биокатализатора на основе клеток R. erythropolis 11-2, адгезированных на БАУ (1), и в свободносуспендированном состоянии (2) 158 В работах других исследователей было показано сохранение амидазной активности при иммобилизации клеток в структуре гелей. Клетки Bacillus sp., включенные в агар и ПАА, конвертировали ацетамид до ацетогидроксамовой кислоты в течение 10 циклов без потери активности [135]. Также 10 циклов не снижалась ацилтрансферазная активность амидазы клеток B. megaterium, иммобилизованных в структуре геля альгината кальция [168]. Клетки Delftia tsuruhatensis CCTCC M 205114, содержащие амидазу, осуществляли энантиоселективный гидролиз (R)-2, 2-диметилциклопропанокарбоксамида при включении в гель альгината кальция в течение 8 последовательных циклов реакций, причем эффективность конверсии к 8-му циклу составляла 83,1% [193]. Литературные данные позволяют заключить, что клетки, включенные в гели, обладают достаточной операционной стабильностью, что объясняется особенностями этого метода иммобилизации клеток – клетки «захвачены» структурой геля, их вымывание сведено к минимуму. Однако, при адгезии между клеткой и ностелем также создаются более прочные связи по сравнению с начальной обратимой адсорбцией. Поэтому данные, полученные при определении операционной стабильности адгезированных клеток, сравнимы с данными, полученными при включении клеток в структуру гелей. 3.4. Трансформация ароматических нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий1 Выявление закономерностей гетерогенного биокатализа нитрилов связано также с решением вопроса, влияет ли химическая природа субстрата на 1 Экспериментальные работы, касающиеся трансформации ароматических нитрилов, выполнены совместно с аспирантом ГБОУ ВПО ПГНИУ Д.М. Васильевым и результаты опубликованы в статьях: Максимова Ю.Г., Васильев Д.М., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Трансформация 2- и 4-цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилгидролизующих бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. – 2013. – Т. 49, № 4. – с. 358–363; Максимова Ю.Г., Васильев Д.М., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Биокаталитическая трансформация 3-цианопиридина иммобилизованными и суспендированными клетками нитрилутилизирующих бактерий // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. – 2012. – Т. 8., № 2. – С. 54-58. 159 особенности протекания ферментативной реакции в гетерогенной среде. С этой целью была изучена трансформация ароматических нитрилов и амидов адгезированными клетками и проведено сравнение с гетерогенной конверсией алифатических субстратов теми же биокатализаторами. Трансформация цианопиридинов адгезированными клетками R. ruber gt1 Адгезию клеток R. ruber gt1 проводили на активированных и неактивированных углеродных адсорбентах. Изучали динамику трансформации 2, 3, 4-цианопиридинов этими гетерогенными биокатализаторами. Изучена динамика трансформации 3-цианопиридина клетками R. ruber gt1, адгезированными на носителях БАУ, Карбопон-В-актив и «Сапропель» активированный (Рисунок 37). Несмотря на иммобилизованными то, что клетками, к 120 мин реакции, 3-цианопиридин катализируемой практически полностью трансформируется (а, б), не происходит эквимолярной конверсии субстрата в продукт, вероятно, за счет адсорбции большей части продукта на активированных носителях (Таблица 18). В данном биокаталитическом процессе для иммобилизации клеток родококков наиболее предпочтительными оказываются неактивированные углеродные адсорбенты, как, например, карбонизированные углеродные волокна Урал ТМ-4 и уголь-сырец. Изучена зависимость удельной нитрилгидратазной активности свободных и иммобилизованных клеток R. ruber gt1 от концентрации субстрата 3-цианопиридина. Показано, что активность клеток, иммобилизованных на карбонизированных волокнах Урал ТМ-4, при конверсии субстрата, концентрация которого не превышает 200 мМ, близка к активности свободносуспендированных клеток. При дальнейшем повышении концентрации субстрата до 800 мМ у неиммобилизованных клеток наблюдается линейная зависимость активности от концентрации 3-цианопиридина, а у адгезированных происходит лишь незначительное повышение активности (Рисунок 38). 160 а) 30 25 1 20 15 10 5 2 30 25 1 20 15 2 10 5 0 0 0 10 20 30 40 Время реакции, мин 50 0 60 10 20 30 40 50 60 Время реакции, мин г) 35 Концентрация 3-ЦП и НА, г/л 30 25 20 2 15 1 10 5 0 160 в) 35 Концентрация 3-ЦП и НА, г/л б) 35 Концентрация 3-ЦП и НА, г/л Концентрация 3-ЦП и НА, г/л 35 30 25 2 20 1 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 Время реакции, мин 30 40 Время реакции, мин 50 60 Рисунок 37 – Динамика трансформации 3-цианопиридина (1) в никотинамид (2) клетками R. ruber gt1, адгезированными на БАУ (а), Карбопон-В-актив (б), «Сапропель» активированный (в) и суспендированными (г) 161 В отличие от конверсии алифатических нитрилов адгезированными клетками, при трансформации ароматических нитрилов не наблюдалось повышение активности клеток при их иммобилизации. Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 80 1 70 60 50 40 2 30 20 10 0 0 200 400 600 Концентрация 3-цианопиридина, мМ 800 Рисунок 38 – Влияние нитрилгидратазной активности клеток R. ruber gt1, суспендированных (1) и адгезированных на носителе Урал ТМ-4 (2), от концентрации 3-цианопиридина Суспендированные и иммобилизованные на углеродных волокнах Урал ТМ4 клетки R. ruber gt1 служили биокатализаторами для получения концентрированного раствора никотинамида. Определено, что при внесении в среду 3-цианопиридина до конечной концентрации 200 мМ каждый час в течение 6-ти часов свободносуспендированный биокатализатор в количестве 0,6 г/л синтезирует раствор никотинамида концентрацией 26 г/л, а иммобилизованный в количестве 500 г/л (по общей массе носителя) – 10 г/л (Рисунок 39). Интересно, что по истечении каждого часа конверсии свободными клетками субстрат в среде не обнаруживался, но и концентрация продукта эквимолярно не возрастала. Вероятно, это связано с накоплением продукта в клетках, что объясняется 162 прекращением пассивного транспорта никотинамида из клеток в реакционную среду при возрастании его концентрации вне клеток. Действительно, при разрушении клеток ультразвуком в цитоплазме обнаруживали никотинамид и 3цианопиридин. При конверсии иммобилизованными клетками после 6 ч Концентрация никотинамида, г/л конверсии в реакционной среде оставался 3-цианопиридин в концентрации 27 г/л. 30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 Время конверсии, ч 5 6 1 2 Рисунок 39 – Синтез раствора никотинамида (г/л) клетками R. ruber gt1, адгезированными на носителе Урал ТМ-4 (1) и находящимися в суспензии (2) Также в качестве носителя для иммобилизации клеток родококков с целью гетерогенной трансформации ароматических нитрилов был выбран неактивированный уголь-сырец. Изучена динамика трансформации 2- и 4цианопиридина клетками R. ruber gt1, адгезированными на порошкообразном угле-сырце. 163 (а) 20 (б) 20 1 16 Концентрация 2-ЦП и ПА, г/л Концентрация 2-ЦП и ПА,г/л 16 12 8 1 12 8 4 4 2 2 0 0 10 20 30 40 Время реакции, мин 50 10 20 30 40 Время реакции, мин 50 60 163 (в) 3 16 Концентрация 4-ЦП и ИНА, г/л 0 60 (г) 16 Концентрация 4-ЦП и ИНА, г/л 0 3 12 12 8 4 4 0 8 4 4 0 0 5 10 15 20 Время реакции, мин 25 30 0 5 10 15 20 Время реакции, мин 25 30 Рисунок 40 – Динамика трансформации 2-цианопиридина (а, б) и 4-цианопиридина (в, г) суспензией клеток R. ruber gt1 (а, в) и клетками, адгезированными на угле-сырце (б, г): 1 – пиколинамид, 2 – 2-цианопиридин, 3- изоникотинамид, 4 – 4-цианопиридин 164 Суспензия клеток R. ruber gt1 и адгезированные на угле-сырце клетки трансформировали 2- и 4-цианопиридин до пиколинамида и изоникотинамида соответственно (Рисунок 40). Нитрилгидратазная активность суспендированных клеток по этим субстратам достоверно не различалась, а при иммобилизации наблюдалось незначительное снижение активности по 4-цианопиридину (Таблица 21). В то же время активность по 2-цианопиридину у иммобилизованных клеток была ниже, чем у свободных в 1,4–2,6 раза и в 1,2–2 раза ниже, чем по 4цианопиридину у иммобилизованных клеток. Таблица 21 – Активность свободносуспендированных и адгезированных на углесырце клеток R. ruber gt1 по отношению к 2- и 4-цианопиридину, ммоль/г/ч биокатализатор 2-цианопиридин 4-цианопиридин суспензия 887,70±106,43 803,70±53,51 адгезированные клетки 460,20±84,74 702,40±25,49 Таким образом, снижение активности нитрилгидратазы иммобилизованных клеток по 2-цианопиридину было значительнее, чем по 4-цианопиридину. Вероятно, это связано с природой субстрата – 2-цианопиридина, который не смешивается с водой, образуя в ней эмульсию. Возможно, для трансформации этого субстрата необходима его адсорбция на клеточной стенке бактерий, а уже затем проникновение в клетку. При смешивании бактериальной суспензии с эмульсией 2-цианопиридина в воде дисперсная фаза не визуализировалась, что можно объяснить переходом этого вещества в адсорбированное состояние. Адгезия бактериальных клеток на нерастворимом носителе в определенной мере снижает площадь доступной поверхности клетки и затрудняет процессы диффузии, что в свою внутриклеточного фермента. очередь может сказываться на активности 165 Трансформация цианопиридинов адгезированными клетками P. fluorescens С2 Клетки грамотрицательных псевдомонад были адгезированы на гидрофильном каолине для проведения гетерогенной трансформации 2- и 4цианопиридина. Суспензия клеток P. fluorescens С2 и клетки, иммобилизованные на каолине, осуществляли одностадийную конверсию нитрилазой 2- цианопиридина в пиколиновую кислоту и 4-цианопиридина в изоникотиновую кислоту (Рисунок 41). Время полной конверсии 200 мМ раствора 2-цианопиридина как свободными, так и иммобилизованными клетками, было в 10 раз больше, чем 4цианопиридина, при использовании одинаковой массы биокатализатора. При этом активность адгезированных клеток по 4-цианопиридину достоверно не отличалась от активности свободных клеток (Таблица 22). При использовании псевдомонад в качестве биокатализатора для гидролиза цианопиридинов в соответствующие пиридинзамещенные карбоновые кислоты наблюдается такая же тенденция при трансформации 2-цианопиридина, как и в случае родококков. Таблица 22 – Активность свободносуспендированных и адгезированных на каолине клеток P. fluorescens С2 по отношению к 2- и 4-цианопиридину, ммоль/г/ч биокатализатор 2-цианопиридин 4-цианопиридин суспензия 8,81±1,18 19,63±1,65 адгезированные клетки 5,35±1,37 21,53±3,32 166 (б) Концентрация 2-ЦП и ПК, г/л Концентрация 2-ЦП и ПК, г/л (а) 1 20 15 10 5 15 10 5 2 2 0 0 0 10 20 30 Время реакции, ч 40 0 50 (в) 10 Концентрация 4-ЦП и ИНК, г/л 3 8 4 4 40 50 (г) 16 12 20 30 Время реакции, ч 166 16 Концентрация 4-ЦП и ИНК, г/л 1 20 3 12 8 4 4 0 0 0 1 2 3 Время реакции, ч 4 5 0 1 2 3 Время реакци, ч 4 5 Рисунок 41 – Динамика трансформации 2-цианопиридина (а, б) и 4-цианопиридина (в, г) суспензией клеток P. fluorescens С2 (а, в) и клетками, адгезированными на каолине (б, г): 1 – пиколиновая кислота, 2 – 2-цианопиридин, 3 – изоникотиновая кислота, 4 – 4-цианопиридин 167 Трансформация амидов пиридинкарбоновых кислот адгезированными клетками R. erythropolis 11-2 Проведена трансформация никотинамида клетками R. erythropolis 11-2, адгезированными на различных фракциях угля-сырца. При конверсии ароматического субстрата наблюдается такая же зависимость, как и в случае алифатических амидов – с уменьшением биомассы иммобилизованных клеток возрастает их удельная амидазная активность. Масса адгезированных клеток родококков на порошкообразном угле-сырце в 3,5 раза превышает таковую на фракциях дробленого угля-сырца, тогда как удельная амидазная активность клеток, адгезированных на дробленом угле с размером частиц 3–10 мм, Масса адгезированных клеток Активность 40 Удельная амидазная активность, ммоль/г/ч Масса адгезированных клеток, мг/г превышает активность клеток на порошкообразном угле в 1,3 раза (Рисунок 42). 20 16 30 12 20 8 10 4 0 0 ПС Рисунок 42 – ФрС1 Зависимость удельной ФрС2 амидазной активности от массы адгезированных на различных фракциях угля-сырца (ПС – порошкообразный, ФрС1 – фракция с размером частиц 1–6 мм, ФрС2 – фракция с размером частиц 3– 10 мм) клеток R. erythropolis 11-2 при конверсии никотинамида В данном случае, вероятно, как и вслучае конверсии алифатического субстрата, на активность могут влиять два фактора – конкуренция за субстрат при увеличении концентрации клеток и затруднения массообмена, наблюдающиеся 168 при полислойной адсорбции клеток на порошкообразном угле-сырце. Удельная амидазная активность адгезированных клеток по никотинамиду, полученная нами (0,207–0,288 мкмоль/мг/мин при 30ºС), сопоставима данными, полученными M. Cantarella с соавт. (2008 г) – 0,243 мкмоль/мг/мин при конверсии 100 мМ раствора субстрата суспендированными клетками Microbacterium imperiale CBS 498-74 при температуре 50ºС [109]. 3.5. Гетерогенный биокатализатор трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот на основе бактериальных клеток, агрегированных с нанотрубками Методом сканирующей электронной микроскопии было показано, что при взаимодействии с нанотрубками в жидкой среде бактериальные клетки формируют агрегаты (Рисунок 17). Формирование агрегатов предположительно обусловлено взаимным влиянием положительно заряженных нанотрубок и отрицательно заряженной поверхности клеток. Изучено влияние гетерогенной среды на нитрил- и амидгидролизующую активность R. ruber gt1, R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2. Показано, что при трансформации акрилонитрила до акриламида у клеток R. ruber gt1, агрегированных с очищенными МУНТ, нитрилгидратазная активность незначительно снижается по сравнению с активностью суспензии, тогда как у клеток, агрегированных с неочищенными МУНТ, падает и составляет не более 2% от исходной активности (Рисунок 43). При конверсии 3-цианопиридина до никотинамида агрегаты клеток с очищенными МУНТ проявляют активность, равную активности суспензии, а при связывании с неочищенными МУНТ сохраняется 33% первоначальной активности интактных клеток. При трансформации 0,1 М раствора акриламида до акриловой кислоты клетками R. erythropolis 11-2, агрегированными с очищенными и неочищенными МУНТ, удельная амидазная активность составляет 55 и 14% исходной активности интактных клеток соответственно. У A. faecalis 2 активность агрегатов клеток с 169 очищенными МУНТ достигает активности интактных клеток, а с неочищенными Удельная нитрилгидратазная активность, ммоль/г/ч нанотрубками снижается в 10 раз (Рисунок 44). 6000 1 5000 2 4000 3000 2000 1000 3 0 акрилонитрил 3-цианопиридин Рисунок 43 – Удельная нитрилгидратазная активность клеток R. ruber gt1 в Удельная амидазная активность, ммоль/г/ч суспензии (1), агрегированных с очищенными (2) и неочищенными МУНТ (3) 80 1 70 60 50 40 2 30 20 3 10 0 R. erythropolis 11-2 A. faecalis 2 Рисунок 44 – Удельная амидазная активность клеток R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2 в суспензии (1), агрегированных с очищенными (2) и неочищенными МУНТ (3) 170 Несмотря на то, что с неочищенными МУНТ связывается больше клеток, чем с очищенными, для создания гетерогенного биокатализатора требуется очистка нанотрубок от примесей. Необходимость очистки обусловливается значительным снижением ферментативной активности клеточных агрегатов, которая обнаружена и при функционировании различных ферментов (нитрилгидратаза R. ruber gt1 и амидаза R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2), и при трансформации различных субстратов (алифатический акрилонитрил и ароматический 3-цианопиридин). Снижение ферментативной активности может являться следствием нарушения либо жизнеспособности клетки в целом, либо транспортной системы, ассоциированной с клеточными мембранами, а также происходить в результате затруднения массообмена клетки с окружающей средой, создаваемого адгезированными к клеточной поверхности нанотрубками. Установленный факт отрицательного влияния технологических примесей в составе наноматериалов согласуется с литературными данными [25]. В то же время, нами установлена способность бактериальных клеток расти в присутствии как очищенных, так и неочищенных нанотрубок в концентрации 2 мг/мл. Этот факт может указывать на то, что МУНТ не обладают прямым бактерицидным действием, а снижение ферментативной активности скорее связано с затруднением транспорта субстратов и продуктов через клеточную мембрану при формировании агрегатов клетка–МУНТ. Таким образом, для получения гетерогенного биокатализатора на основе нерастущих бактериальных клеток носителями могут служить не только адсорбенты, дисперсность которых превышает размеры бактерий, но и наноматериалы. В этом случае характер взаимодействия клетка–носитель качественно иной – клетки не адгезируются к поверхности носителя, а формируют агрегаты, покрытые наноразмерными объектами. Для сохранения ферментативной активности биокатализатора важна очистка МУНТ от примесей, кроме того, представляется перспективной функционализация нанотрубок с целью снижения повреждающего действия на клетку с одновременным сохранением высокого сродства этих материалов к клеточной поверхности. 171 3.6. Стереоселективная трансформация нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий Известно, что нитрилаза и амидаза часто проявляют стереоселективность в реакциях гидролиза нитрилов и амидов, что является важным свойством, нашедшем применение в биокаталитическом синтезе ряда интермедиатов фармацевтических препаратов [107, 108, 119, 122, 214]. В то же время, данные, позволяющие анализировать влияние гетерогенной среды на стереоселективность этих ферментов, немногочисленны. Эти работы касаются либо включения клеток или ферментов в структуру гелей [107, 322], либо приготовления поперечносшитых агрегатов ферментов без носителя [242, 390]. С целью изучения влияния адгезии клеток и присутствия носителя в среде на стереоселективность реакции была проведена трансформация рацемического фенилглицинонитрила гетерогенным биокатализатором на основе клеток P. fluorescens С2, содержащих нитрилазу, и рацемического лактамида иммобилизованными клетками амидазосодержащих родококков. Трансформация фенилглицинонитрила адгезированными клетками P. fluorescens С2 Клетки P. fluorescens С2, адгезированные на углеродсодержащих носителях Сибунит и «Сапропель», конвертировали 10 мМ раствор фенилглицинонитрила в D- и L-фенилглицин (Рисунок 45). Активность нитрилазы суспендированных и адгезированных на Сибуните и «Сапропеле» клеток при конверсии этого субстрата составила 1,57±0,42, 0,86±0,55 и 3,14±1,82 ммоль/г/ч соответственно. Показано, что при часовой конверсии фенилглицинонитрила клетками, иммобилизованными на Сибуните, энантиомерный избыток (ee) L-изомера составляет 54%, тогда как при продолжительности реакции 20 ч увеличивается до 96%. В случае клеток псевдомонад, адгезированных на «Сапропеле», при часовой конверсии ee L-изомера составляет 30%, но при увеличении времени протекания 172 реакции до 20 ч смещается в сторону выхода D-изомера, ee которого к этому времени достигает 78%. В качестве контроля реакцию проводили суспендированными клетками, и в этом случае стереоселективность реакции мало изменялась во времени, а ee L-фенилглицина составлял 50–68%. Сибунит, 1 ч Сибунит, 20 ч D D (77±7)% (98±2)% L L "Сапропель", 20 ч "Сапропель", 1 ч L D (65±2)% (89±1)% L D Суспензия, 20 ч Суспензия, 1 ч D D (75±10)% L (84±2)% L Рисунок 45 – Соотношение изомеров D- и L-фенилглицина при гидролизе фенилглицинонитрила суспендированными и адгезированными на Сибуните и «Сапропеле» клетками P. fluorescens С2 173 Такое изменение энантиомерного избытка одного из образующихся изомеров может быть связано с природой носителя, используемого для адгезии клеток. Выдвинута гипотеза, по которой изменение рН в микроокружении адсорбента может влиять на взаимопревращения уже образовавшихся изомеров. Этим может объясняться влияние длительности реакции (длительности контакта реакционной среды с носителем) на энантиомерный избыток одного из стереоизомеров фенилглицина. Трансформация рацемического лактамида адгезированными клетками родококков, содержащими амидазу Для того чтобы оценить влияние адгезии клеток родококков на стереоселективность амидазы, проводили реакцию трансформации рацемического лактамида до L- и D-молочной кислоты. Суспендированные клетки R. erythropolis 6–2 и R. rhodochrous 4-1 гидролизовали лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 76 к 24% и 62 к 38% соответственно, а штамм R. erythropolis 11-2 образовывал рацемическую смесь изомеров. При иммобилизации клеток R. erythropolis 6-2 на БАУ мольная доля D-изомера составляла 70%, тогда как адгезированные клетки R. rhodochrous 4-1 гидролизовали лактамид без стереоселективности (Таблица 23). Известно, что многие оптически активные вещества обладают лишь ограниченной устойчивостью. В случае снижения доли одного из оптических изомеров при трансформации иммобилизованными на углеродном носителе клетками, возможно, происходит рацемизация молочной кислоты. Рацемизация чаще происходит не самопроизвольно, а вызывается различными физикохимическими воздействиями, причем катализаторами рацемизации могут выступать щелочные агенты [55]. В данном случае, причина снижения оптической чистоты образующейся молочной кислоты при гидролизе адгезированными клетками, по-видимому, была связана не с изменением скорости образования изомеров, а с присутствием носителя, приводящем к рацемизации. 174 Действительно, контакт с БАУ D- и L-изомеров молочной кислоты в соотношении 4:1 в течение 1 ч при 22ºС приводил к смещению этого соотношения в сторону преобладания L-изомера. Таблица 23 – Стереоселективная трансформация рацемического лактамида до Dи L-молочной кислоты суспендированными и адгезированными на БАУ клетками родококков, обладающими амидазной активностью Стереоизомер, образующийся в избытке ee (%) Удельная активность, ммоль/г/ч D 52,4 62,9 D 38,5 31,3 D 24,8 5,9 Иммобилизованные клетки R. rhodochrous 4-1 рацемическая смесь - 1,1 Свободные клетки R. erythropolis 11-2 рацемическая смесь - 0,6 Иммобилизованные клетки R. erythropolis 11-2 рацемическая смесь - 0,4 Биокатализатор Свободные клетки R. erythropolis 6-2 Иммобилизованные клетки R. erythropolis 6-2 Свободные клетки R. rhodochrous 4-1 Таким образом, стереоселективность амидазы в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида при адгезии клеток снижалась, что обусловливало необходимость поиска других способов получения гетерогенного биокатализатора для стереоселективной трансформации, в частности, разработку способов выделения и иммобилизации фермента. Обобщая вышеизложенное, следует выделить особенности биокаталитической трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, протекающей в гетерогенной среде с участием адгезированных бактериальных клеток. Так, в процессе гидролиза алифатических нитрилов R. ruber gt1 наиболее 175 предпочтительными для адгезии клеток среди изученных углеродных материалов являлись макропористые активированные носители БАУ и Norit PK 1-3, мелкодисперсные ФТД и порошкообразный уголь-сырец, волокнистые материалы Урал ТМ-4 и Карбопон, а также носители со слоем КВУ на поверхности. Эти носители обеспечивали сохранение и даже повышение ферментативной активности после адгезии, а также высокую операционную стабильность, выражающуюся в сохранении не менее 50% первоначальной активности на протяжении 7–8 последовательных циклов конверсии акрилонитрила. Носители, наиболее приемлемые для адгезии клеток родококков, либо обладали макропорами, превышающими по размеру бактериальную клетку, либо были высокодисперсными, что обеспечивало увеличение площади поверхности, доступной для клеток. Межволоконное пространство тканных и войлочных материалов, либо шероховатая поверхность носителя, с которой клетка взаимодействовала по отдельным сайтам адгезии, а не всей своей поверхностью, обеспечивали незатрудненную диффузию субстрата и продукта. В этих случаях выполнялись следующие требования к созданию гетерогенного биокатализатора: количество адгезированных клеток было достаточным в сочетании с малой адсорбцией продукта ферментативной реакции, диффузионные затруднения отсутствовали либо были малы, что не сказывалось на ферментативной активности клеток. Кроме того, в ряде случаев у адгезированных клеток наблюдали повышение нитрилгидратазной и нитрилазной активности. Увеличение активности могло быть связано с защитным действием адсорбента при конверсии высоких концентраций токсичного субстрата, и/или изменением проницаемости клеточной мембраны, происходящем при адгезии клеток. Кроме того, снижение ферментативной активности клеток при адгезии на природном углеродсодержащем минерале шунгите и при взаимодействии с неочищенными нанотрубками позволяет выдвинуть предположение, что для проявления нитрили амидгидролизующей активности необходимо поддержание жизнеспособности бактериальной клетки. Известно, что и неочищенные нанотрубки [25], и минерал шунгит [22] обладают бактерицидным действием. 176 При адгезии клеток псевдомонад, имеющих гидрофильную поверхность, предпочтительным являлся гидрофильный высокодисперсный каолин. Отмечена умеренная корреляция между гидрофобностью поверхности носителя и массой адгезированных клеток родококков, также имеющих гидрофобную поверхность (r=0,679; p=0,05), а также сильная положительная связь между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и массой адгезированных клеток на гидрофобных углеродных материалах (БАУ, Norit PK 1-3, ФТД, ФАС): от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). Корреляция между количеством адгезированных клеток и дисперсностью материала была определена как слабая (r=0,220; p=0,05), а корреляционная связь между шероховатостью поверхности адсорбента и массой адгезированных гидрофильные клеток свойства была недостоверна. поверхности Следовательно, адсорбата и гидрофобно- адсорбента являются определяющими при адгезии бактериальных клеток на нерастворимом носителе. Так как процессу адгезии бактериальных клеток предшествует их адсорбция на носителе, зависимость массы адгезированных клеток от их начальной концентрации в суспензии была описана различными типами изотерм адсорбции. Так, изотермы адсорбции клеток родококков на композиционных углеродминеральных и волокнистых углеродных носителях имели вид изотерм Лэнгмюра, что подтверждало образование монослоя на поверхности носителя; на активированных (БАУ) – вид изотерм Брунауэра, Эммета, Теллера (БЭТ), что предполагало формирование полислоя клеток на поверхности носителя. В свою очередь, зависимость массы адгезированных клеток P. fluorescens С2 на каолине от начальной концентрации клеток в суспензии в диапазоне концентраций до 3 мг сухих клеток/мл близка к линейной, что в данном случае, возможно, говорит не о полислойной адсорбции, а об отсутствии точки насыщения адсорбента в этом диапазоне концентраций клеточной суспензии, что является следствием высокой дисперсности материала. Операционная стабильность родококков, содержащих нитрилгидратазу, при адгезии на углеродных носителях значительно повышалась по сравнению с 177 суспендированными клетками, тогда как адгезия клеток псевдомонад, имеющих нитрилазную активность, не давала такого преимущества. Этот факт может быть объяснен различиями в нитрилтрансформирующих каталитических ферментов – свойствах термостабильность этих нитрилазы значительно выше, чем нитрилгидратазы [30, 408], и ее активность в меньшей степени ингибируется при экзотермической реакции гидролиза высоких концентраций акрилонитрила. Ароматические субстраты и продукты реакции (цианопиридины, пиридинкарбоновые кислоты и их амиды) вносят определенные коррективы в алгоритм создания гетерогенного биокатализатора гидролиза нитрилов и амидов. Так, благодаря своей химической структуре, ароматические соединения в высокой степени адсорбируются на активированных носителях, что в данном случае делает выбор этих материалов для иммобилизации бактериальных клеток необоснованным. Выбор носителя при этом приходится останавливать на неактивированных адсорбентах, несмотря на то, что бактериальные клетки в большей степени адгезируются на поверхности активированных углеродных материалов, чем неактивированных. Показано, что при адгезии на различных фракциях угля-сырца клеток P. fluorescens C2, обладающих нитрилазой, и R. erythropolis 11-2 с амидазной активностью, существует обратная зависимость между массой адгезированных клеток и удельной активностью внутриклеточного фермента. Так, отмечена сильная отрицательная связь между этими показателями (R = –0,886; p = 0,02). Подобной зависимости не наблюдается при адгезии клеток R. ruber gt1, нитрилгидратаза которых обладает активностью, на порядок и более превышающей нитрилазную и амидазную ферментативную активность. При проведении стереоселективной трансформации амидов и нитрилов – гидролизе рацемического лактамида и фенилглицинонитрила, было показано, что присутствие носителя в реакционной среде может оказывать влияние на стереоизомерию продуктов, приводя либо к рацемизации смеси, либо к избытку одного из изомеров, которое меняется в зависимости от природы носителя и 178 времени контакта гетерогенного биокатализатора с реакционной смесью. В этом случае экспериментальным путем может быть подобран носитель для иммобилизации клеток, который смещает энантиомерный избыток продукта в сторону желаемого изомера. Таким образом, впервые, на примере R. ruber gt1, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, была показана возможность увеличения удельной нитрилгидратазной активности бактериальных клеток при адгезии на углеродных материалах; концентрационная зависимость удельной нитрилазной и амидазной активностей и возможность их увеличения в разбавленных суспензиях и при невысоких концентрациях адгезированных клеток (на примере нитрилазосодержащего штамма P. fluorescens C2 и штамма R. erythropolis 11-2 с выраженной амидазной активностью); возрастание активности в первых циклах многократной конверсии субстрата адгезированными клетками; зависимость стереоселективности трансформации фенилглицинонитрила от носителя, используемого для адгезии клеток, и времени протекания ферментативной реакции. 179 ГЛАВА 4. БИОКАТАЛИЗ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ БИОПЛЕНКАМИ НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ Гетерогенный биокатализатор для осуществления процесса гидролиза нитрилов и амидов может быть получен в процессе культивирования клеток нитрилгидролизующих бактерий в присутствии нерастворимых материалов. В этом случае при культивировании можно получить два типа биокатализатора одновременно: суспендированный и гетерогенный, представляющий собой биопленку, выращенную на носителе. Известно, что клетки в биопленке защищены от вредных воздействий окружающей среды [23, 38, 43, 209], поэтому возникает предположение, что таким способом можно получить биокатализатор для долговременного использования, устойчивый к высоким концентрациям токсичных субстратов и продуктов ферментативной реакции. В качестве носителей для образования биопленок нитрилгидролизующих бактерий были выбраны углеродные волокнистые материалы, такие как карбонизированная ткань Урал ТМ-4, нетканый волокнистый материал Карбопон, активированный нетканый материал Карбопон-В-актив и полиэтиленовая пленка. 4.1. Визуализация биопленок нитрилгидролизующих бактерий Биопленки нитрилгидролизующих бактерий визуализировали с помощью световой фазово-контрастной и электронной сканирующей микроскопии. В световом фазово-контрастном микроскопе без дополнительной окраски были получены микрофотографии биопленок на полиэтиленовой пленке высокой плотности (Рисунок 46). Биопленки псевдомонад на полиэтилене представляют собой однородный слой клеток, равномерно покрывающий поверхность полимера, тогда как родококки образуют скопления, состоящие из удлиненных гифообразных клеток размером 7–10 мкм и клеток, поделившихся на мелкие короткие палочки, некоторые из которых близки по форме к коккам и имеют размер не более 1 мкм. 180 а б Рисунок 46 – Фазово-контрастное изображение неокрашенных биопленок R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) на полиэтиленовой пленке. Увеличение ×1000. Масштабная линейка соответствует 10 мкм. Биопленки R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 на углеродных волокнистых носителях были изучены в электронном сканирующем микроскопе. Было показано, что биопленки псевдомонад имеют более выраженный полимерный матрикс, который в ряде случаев не позволяет визуализировать отдельные клетки (Рисунок 47). Биопленки как псевдомонад, так и родококков формируются на волокнах носителей, частично заполняя межволоконное пространство. Отмечено, что на углеродных волокнах, особенно на активированном материале КарбопонВ-актив, P. fluorescens C2 образует наиболее мощную биопленку, а на ткани Урал ТМ-4 нарастает слой уплощенных клеток. R. ruber gt1 на волокнах последнего носителя, наоборот, представлен единичными клетками, в основном удлиненными, а на активированном Карбопоне наблюдаются неравномерно выросшие микроколонии. Наболее выраженно биопленка R. ruber gt1 формируется на неактивированном Карбопоне, на котором отмечено присутствие не только колоний клеток на отдельных волокнах, но и массивной биопленки в межволоконном пространстве, покрытой полимерным матриксом. 181 Рисунок 47 – Биопленки нитрилгидролизующих бактерий на углеродных волокнистых адсорбентах: а, б, в - P. fluorescens C2, г, д, е - R. ruber gt1; а, г – 182 Карбопон, б, д – Урал ТМ–4, в, е – Карбопон–B–актив. 1 – клетки; 2 – волокна носителя 4.2. Динамика роста биопленок нитрилгидролизующих бактерий Количественное определение биопленкообразования вызывает определенные затруднения и необходимость поиска косвенных методов, т.к. прямой высев клеток биопленки и определение количества колониеобразующих единиц затруднены из-за сложности механического отделения клеток от носителя и разрушения агрегатов клеток без нарушения их жизнеспособности. В некоторых случаях для этих целей используют ультразвук, что также требует подбора параметров озвучивания, при которых не нарушается целостность клеток, но в то же время, обеспечивается полная десорбция клеток с поверхности носителя. Для оценки биопленкообразования часто используют метод окраски кристаллическим фиолетовым с последующей экстракцией красителя спиртом или уксусной кислотой [323]. Кристаллический фиолетовый – это основной краситель, который связывается с отрицательно заряженными молекулами поверхности клетки и полисахаридами внеклеточного полимерного матрикса. Т.к. этот краситель окрашивает как живые, так и мертвые клетки, и внеклеточный матрикс, этот метод не позволяет оценить количество жизнеспособных клеток, а дает представление лишь о массивности биопленки в целом [323]. Для оценки динамики роста нитрилгидролизующих бактерий было использовано два метода: определение общей биомассы биопленки при окрашивании кристаллическим фиолетовым и определение общего количества АТФ биопленки. Второй способ позволяет оценить метаболическую активность и жизнеспособность клеток, а сравнение этих методов может показать корреляцию показателей, отражающих биомассу и жизнеспособность. Определение концентрации АТФ биолюминесцентным методом основано на реакции окисления D-люциферина люциферазой светляков, которое происходит в присутствии АТФ и сопровождается пропорциональным по 183 интенсивности выделением света [51, 63]. Определение внутриклеточного пула АТФ таким способом нацелено, главным образом, на подсчет количества жизнеспособных клеток и основывается на том факте, что средняя величина удельной концентрации АТФ в расчете на одну клетку определенного типа постоянна [110, 134]. Определение численности клеток биолюминесцентным методом особенно актуально, если клетки находятся в прикрепленном состоянии или растут в виде биопленки [85, 102]. Методика определения содержания АТФ в иммобилизованных клетках была разработана Е.Н. Ефременко [16], адаптирована нами к определению энергетического статуса адгезированных клеток и клеток Оптическая плотность экстрагированного красителя, λ=540 нм биопленок. 2 1.8 1.6 1 1.4 1.2 1 0.8 0.6 2 0.4 0.2 0 0 1 2 3 4 5 Время роста, сутки 6 7 Рисунок 48 – Динамика роста биопленок R. ruber gt1 (1) и P. fluorescens C2 (2), оцененная по изменению оптической плотности экстрагированного красителя кристаллического фиолетового При посуточной окраске биопленок R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 и измерении оптической плотности экстрагированного красителя было показано, что максимальная биомасса биопленки P. fluorescens C2 достигается уже через сутки роста, тогда как R. ruber gt1 – на четвертые сутки (Рисунок 48). Через сутки 184 роста количество биомассы биопленки P. fluorescens C2 постепенно снижается, но полного разрушения биопленки к 7-м суткам роста не наблюдается. Динамика роста биопленок нитрилутилизирующих бактерий оценивалась также по изменению общего количества АТФ, экстрагированного из биопленок (Рисунок 49). При использовании этого метода наблюдалось сходство кривой роста с таковой, полученной предыдущим методом. Так, максимальное количество АТФ экстрагировалось из суточных биопленок P. fluorescens C2 и трехсуточных биопленок R. ruber gt1. К 7-м суткам количество АТФ в биопленках P. fluorescens C2 снижалось более значимо, чем оптическая плотность экстрагированного раствора красителя. Следовательно, к 7-м суткам количество жизнеспособных клеток P. fluorescens C2 снижается, тогда как общая биомасса биопленки, слагаемая из живых, неживых клеток и полимерного матрикса, остается почти неизменной. В этом случае оценка динамики роста биопленок по определению общего количества АТФ более адекватно отражает количество жизнеспособных клеток. Концентрация АТФ, пикоМ/лунку 14 12 10 8 1 6 4 2 2 0 0 1 2 3 4 5 Время роста, сутки 6 7 Рисунок 49 – Динамика роста биопленок R. ruber gt1 (1) и P. fluorescens C2 (2), оцененная по изменению содержания общего АТФ биопленки 185 Отмечена положительная корреляционная зависимость при сравнении массивности биопленки в целом и жизнеспособности клеток биопленки, лежащих в основе двух методов оценки динамики роста биопленок. Так, при посуточном определении оптической плотности экстрагированного красителя кристаллического фиолетового и концентрации внутриклеточного АТФ у R. ruber gt1 отмечается умеренная корреляция при сравнении этих параметров (r=0,513; p=0,05). У P. fluorescens C2 при распределении величин, отличном от нормального, отмечается достоверно высокая корреляция между этими значениями (R=0,821; p=0,02). Следовательно, несмотря на то, что значения, полученные методом окраски кристаллическим фиолетовым, отражают массивность биопленки в целом, без учета жизнеспособных клеток и полимерного матрикса, завышающего показания, между величинами, определяющими биопленкообразование, и содержанием внутриклеточной АТФ наблюдается корреляция от умеренной до высокой, что дает возможность остановиться на одном из вышеперечисленных способов учета динамики роста биопленки в зависимости от поставленных задач. 4.3. Влияние адгезии нитрилгидролизующих бактерий на содержание внутриклеточного АТФ Адгезия микробных клеток к абиотической или биотической поверхностям инициирует образование биопленки. Важным моментом в формировании биопленок являются изменения в метаболизме бактерий в процессе их перехода от планктонного образа жизни к прикрепленному [23]. Понимание этого вопроса связано с углубленным изучением физиологии мутантов бактерий, у которых нарушен процесс инициации и развития биопленок, микроскопическим наблюдением, анализом мРНК и протеомным анализом [209, 239]. Известно, что индикатором энергетического статуса клеток является их аденилатный пул. Однако работы, посвященные определению содержания АТФ в клетках биопленок, немногочисленны. В работе S.L. Kinniment и J.W.T. Wimpenny 186 определено содержание АТФ, АДФ и АМФ в срезах биопленки Pseudomonas aeruginosa в двух временных точках – 55 и 105 ч роста, соответствующих «квазистационарной» фазе [244]. Вместе с тем, в научной литературе не было обнаружено сведений об исследовании влияния стадии инициации развития биопленки – необратимой адгезии клеток – на содержание внутриклеточной АТФ. Методика определения количества клеток микроорганизмов по концентрации АТФ не является абсолютно точной, т.к. количество АТФ в жизнеспособной клетке варьирует в зависимости от физиологического состояния и фазы роста. Изменение концентрации АТФ в клетке, как возрастание в результате разобщения энергетического и конструктивного обмена, так и падение, свидетельствует о стрессовом состоянии микробной клетки [62, 72]. Поэтому данная методика может быть также применима к обратной задаче, а именно к определению энергетического состояния прикрепленной клетки при известном количестве клеток в образце. Чтобы оценить влияние адгезии клеток на содержание в них АТФ, клетки R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 были выращены в суспензии до стационарной фазы и инкубированы с углеродсодержащими носителями. Показано, что концентрация АТФ в клетках после адгезии в подавляющем большинстве случаев снижается на порядок и более (Таблица 24). Чтобы определить, отражает ли подобное снижение физиологическое состояние клеток изученных штаммов бактерий, или является результатом присутствия адсорбентов в образце, был проведен эксперимент по адсорбции АТФ на тех же углеродных материалах. Действительно, на носителях, взятых в том же количестве, как и в опытных образцах, из 1,95 нМ раствора АТФ на Урал ТМ-4 адсорбировалось 5,5, на БАУ – 58,3, Сибуните – 20,5, «Сапропеле» – 32,0%. Данные, представленные в таблице, содержат поправку на адсорбцию АТФ. Известно, что в адгезии клеток бактерий большую роль играют гидрофобные взаимодействия. Углеродсодержащие носители, использованные для адгезии, гидрофобны, и на них эффективнее адсорбируются клетки, клеточная стенка которых также обладает гидрофобностью. При старении клеток бактерий 187 происходят значительные изменения физиолого-биохимического статуса, проявляющиеся в изменении свойств клеточной поверхности, в частности, ее гидрофильно-гидрофобных характеристик, причем мертвые и гипометаболические клетки имеют очень высокие показатели сорбции на гидрофобизированных носителях [68]. Можно предположить, что заметное снижение количества АТФ в расчете на клетку связано с тем, что сорбируются в первую очередь мертвые клетки за счет повышенной гидрофобности их клеточной стенки. Для того чтобы определить, жизнеспособны ли адгезированные клетки, образцы носителей с клетками переносили в свежую питательную среду и извлекали через 2, 24 и 48 ч. Показано, что содержание АТФ на клетку через 2 ч снижалось даже по сравнению с концентрацией АТФ в клетках сразу после адгезии (Рисунок 50). Но к 24 и 48 ч роста в свежей питательной среде этот показатель начинал возрастать, что говорит о возможном нарастании биомассы на носителях, подтверждающем жизнеспособность адгезированных клеток. Определено, что клетки R. ruber gt1, находящиеся в логарифмической фазе роста, содержали 2,300±0,077, а P. fluorescens C2 – 3,950±0,452 нМ/мг АТФ. При адгезии клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, также наблюдается падение концентрации внутриклеточного АТФ. Так, при адгезии клеток P. fluorescens C2 на Сибуните, содержание АТФ снижалось до 0,025±0,002 нМ/мг. В фазе активного роста гипометаболические и мертвые клетки практически не содержатся, что также подтверждает предположение, что снижение концентрации АТФ не связано с адсорбцией нежизнеспособных клеток. 188 Таблица 24 – Влияние адгезии на углеродсодержащих носителях на концентрацию АТФ в клетках R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 Характеристика носителей Rhodococcus ruber gt1 Pseudomonas fluorescens C2 Марка Размер частиц, мм Диаметр макропор, мкм Суспендированные клетки Урал ТМ-4 - 5–10* 1,071 ± 0,484 0,049 ± 0,035 0,144 ± 0,018 0,105 ± 0,044 БАУ 2–4 5–40 1,071 ± 0,484 0,020 ± 0,011 0,144 ± 0,018 0,039 ± 0,011 Сибунит 2 0,02** 1,071 ± 0,484 0,003 ± 0,001 0,144 ± 0,018 0,032 ± 0,006 «Сапропель» 2–3 4–5 1,071 ± 0,484 0,002 ± 0,001 0,144 ± 0,018 0,006 ± 0,004 носителей Адгезированные клетки Суспендированные клетки Адгезированные клетки [АТФ], нМ/мг Примечание: *Носитель марки Урал ТМ-4 является тканым материалом, состоящим из волокон, вместо диаметра макропор представлено межволоконное пространство (мкм). **У носителя марки Сибунит макропоры отсутствуют, в таблице представлен диаметр мезопор. 189 Концентрация АТФ в клетках, lg[АТФ, нМ/мг] 0 (а) 1 -0.5 -1 2 -1.5 -2 -2.5 0 10 20 30 40 50 Время культивирования, ч Концентрация АТФ в клетках, lg[АТФ, нМ/мг] 0.2 (б) 0 1 -0.2 -0.4 2 -0.6 -0.8 -1 0 10 20 30 40 Время культивирования, ч 50 Рисунок 50 – Изменение концентрации АТФ в клетках R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) в результате адгезии на БАУ и после переноса адгезированных клеток в свежую питательную среду: 1 – суспендированные клетки, 2 – клетки сразу после адгезии 190 Основываясь на полученных нами данных, можно заключить, что при адгезии клеток на изученных сорбентах уровни уменьшения концентрации внутриклеточного АТФ различны. Так, более значительное снижение пула АТФ в клетке отмечено при адгезии на носителе «Сапропель» – на порядок для клеток P. fluorescens C2 и на два порядка для клеток R. ruber gt1. В то же время при адгезии клеток P. fluorescens C2 на волокнистом углеродном материале Урал ТМ4 содержание АТФ в клетке снижается незначительно, а при адгезии клеток R. ruber gt1 – на порядок. Показано, что на уровень снижения содержания АТФ в клетке при адгезии влияют и природа субстрата, и вид микроорганизма. Носитель «Сапропель» гораздо более сложен по элементному составу, так как по своей природе является карбонизированным илистым отложением. В его составе обнаружены Si, O, Mg, Al, Ca, S, Fe (Рисунок 20). Тканый материал Урал ТМ-4 – карбонизированное вискозное волокно, не содержащее побочных примесей, основным химическим элементом которого является углерод (Рисунок 19). Выделение в среду различных ионов носителем «Сапропель», вероятно, влияет на адгезированные клетки и их физиологическое состояние, а размер частиц и диаметр макропор носителей влияют скорее на величину адсорбции, а не на энергетическое состояние адгезированных клеток, так как четкой зависимости содержания внутриклеточного АТФ от этих параметров выявлено не было (Таблица 24). 4.4. Трансформация алифатических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий Изучена трансформация нитрилгидролизующих бактерий, акрилонитрила выращенными на биопленками углеродсодержащих материалах и полиэтилене. При конверсии алифатического субстрата – акрилонитрила только суммарная продукция акриламида планктоном и биопленкой R. ruber gt1, выращенной на полиэтилене, достигала суммарной продуктивности контрольной 191 суспензии. При этом вклад биопленки в суммарную продуктивность был наибольшим при использовании в качестве носителя полиэтилена и наименьшим при использовании Карбопон-В-актив (Рисунок 51). Содержание АА в пробе, мг 3500 (а) 3000 планктон биопленка 2500 2000 1500 1000 500 0 Контроль Урал ТМ-4 Содержание АК в пробе, мг 2500 Полиэтилен Карбопон-Вактив Карбопон (б) 2000 1500 1000 500 0 Контроль Урал ТМ-4 Полиэтилен КарбопонВ-актив Карбопон Рисунок 51 – Образование акриламида и акриловой кислоты планктонными клетками и биопленками R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) при конверсии 1,3 М раствора акрилонитрила 192 4.5. Трансформация ароматических нитрилов биопленками нитрилгидролизующих бактерий Содержание НА в пробе, мг 600 (а) планктон биопленка 500 400 300 200 100 0 Контроль Урал ТМ-4 Содержание НК в пробе, мг 300 Полиэтилен Карбопон-Вактив Карбопон (б) 250 200 150 100 50 0 Контроль Урал ТМ-4 Полиэтилен КарбопонВ-актив Карбопон Рисунок 52 – Образование никотинамида и никотиновой кислоты планктонными клетками и биопленками R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) при конверсии 200 мМ раствора 3-цианопиридина 193 Показано, что выращенные в процессе культивирования с носителем Урал ТМ-4 биопленка и планктон R. ruber gt1 суммарно продуцируют больше никотинамида при конверсии 200 мМ раствора 3-цианопиридина, чем контрольная суспензия, выращенная без носителей (Рисунок 52, а). При трансформации 3-цианопиридина биопленкой, выращенной на активированном носителе Карбопон-В-актив, образуется меньше никотинамида, что сказывается на суммарной конверсии субстрата. Возможным объяснением этого может быть природа самого носителя – на активированном материале сорбируется и субстрат, и продукт ферментативной реакции, что приводит к снижению концентрации продукта в реакционной среде. При трансформации 3-цианопиридина планктоном и биопленкой P. fluorescens С2 наибольший выход никотиновой кислоты наблюдается при использовании в качестве носителя полиэтилена, наименьший – при выращивании клеток на носителе Карбопон-В-актив (Рисунок 52, б). Показано, что акрилонитрил гидролизуется биопленкой менее эффективно, чем ароматический нитрил. При конверсии акрилонитрила биопленкой и планктоном суммарный выход акриловой кислоты не достигает такового, полученного при конверсии контрольной суспензией. Возможно, к такому явлению приводит сочетание природы субстрата и особенностей биопленкообразования этого вида бактерий. Так, P. fluorescens С2 при росте в виде биопленки образует большое количество внеклеточного полимерного матрикса, который затрудняет проникновение субстрата к клеткам. Можно предположить, что более гидрофобный ароматический субстрат в этом случае может лучше проникать через полимерный матрикс, чем алифатический. Сравнивали продуктивность биопленок, выращенных на различных носителях, при трансформации НАК и 3-цианопиридина. Показано, что наибольшее количество продукта (АК, НК, АА, НА) синтезируют биопленки P. fluorescens C2 и R. ruber gt1, выращенные на полиэтилене (Таблица 25). Также от этих значений достоверно не отличается продуктивность выращенных на носителе Урал ТМ-4 биопленок P. fluorescens C2 при синтезе АК и биопленок R. 194 ruber gt1 при синтезе НА. Минимальные количества продукта получены при использовании в качестве биокатализатора биопленок нитрилгидролизующих бактерий, выращенных на носителе Карбопон-В-актив, что, возможно, связано с его адсорбцией на этом активированном носителе. Таблица 25 – Образование продуктов трансформации акрилонитрила и 3цианопиридина биопленками нитрилгидролизующих бактерий, выращенными на носителях P. fluorescens C2 t, носители R. ruber gt1 Продукт, мг/г(дм2)* t, мин АК НК Полиэтилен 1440 487,6±82,0 126,3±6,2 120 1046,8±113,0 186,8±58,6 Урал ТМ-4 1440 532,1±17,2 68,4±5,6 120 519,5±8,7 213,3±7,6 1440 362,2±40,1 50,6±8,0 120 317,2±82,7 81,8±18,1 1440 413,2±128,4 87,6±10,7 120 614,2±86,6 130,5±15,0 Карбопон-Вактив Карбопон мин Продукт, мг/г(дм2)* АА НА Примечание: *количество образуемого продукта при катализе биопленкой, выращенной на полиэтилене, рассчитано на дм2 4.6. Влияние токсичных субстратов и продуктов реакции гидролиза нитрилов на жизнеспособность и концентрацию внутриклеточного АТФ клеток биопленок R. ruber gt1 и P. fluorescens С2 Изучено влияние акрилонитрила (НАК), акриламида (АА) и акриловой кислоты (АК) на клетки четырехсуточной культуры R. ruber gt1 и P. fluorescens C2, находящиеся в суспензии и в биопленке. Показано, что при 20-минутном воздействии 1,7 М раствора АА на планктонные клетки R. ruber gt1 происходит падение содержания АТФ в клетках более чем в половину от контроля, тогда как 195 концентрация АТФ в клетках биопленки достоверно возрастает (Рисунок 53). Раствор НАК в концентрации 1,3 М не приводит к достоверному снижению содержания АТФ в клетках планктона, тогда как в клетках биопленки оно значительно (более чем в 2 раза) возрастает. Падение содержания АТФ в планктонных клетках при воздействии высоких концентраций АА может быть связано со снижением их жизнеспособности, тогда как возрастание в клетках биопленки может свидетельствовать о большей адаптивной способности, которая проявляется в стрессовом состоянии. При воздействии НАК на клетки следует учитывать, что одновременно начинается его гидролиз, сопровождающийся накоплением АА, таким образом, воздействие становится многофакторным, Концентрация АТФ, пикоМ/лунку включающим влияние токсичного субстрата и продукта. 12 контроль АА 1,7 М 10 НАК 1,3 М 8 6 4 2 0 планктон биопленка Рисунок 53 – Влияние 20-минутного воздействия 1,7 М раствора акриламида (АА) и 1,3 М раствора акрилонитрила (НАК) на содержание АТФ в клетках планктона и биопленки R. ruber gt1 При воздействии 1,3 М раствора АК происходит резкое падение концентрации АТФ как в клетках планктона, так и в клетках биопленки P. fluorescens C2, вероятно, связанное с закислением среды, которое приводит к 196 гибели клеток (Рисунок 54). НАК в концентрации 1,3 М приводит к 50%-му снижению содержания АТФ в планктонных клетках, тогда как в клетках биопленки оно не изменяется по сравнению с контролем. Следовательно, физиологическое состояние клеток биопленок нитрилгидролизующих бактерий существенно отличается от планктонного состояния. Биопленки как R. ruber gt1, так и P. fluorescens C2 более устойчивы к воздействию высоких концентраций токсичных субстратов и продуктов и обладают большими адаптивными способностями, чем планктонные клетки. Концентрация АТФ, пикоМ/лунку 6 контроль НАК 1,3 М АК 1,3 М 5 4 3 2 1 0 планктон биопленка Рисунок 54 – Влияние 20-минутного воздействия 1,3 М раствора акриловой кислоты (АК) и 1,3 М раствора акрилонитрила (НАК) на содержание АТФ в клетках планктона и биопленки P. fluorescens C2 Для качественной оценки жизнеспособности клеток биопленки и суспендированных клеток нитрилгидролизующих бактерий после воздействия токсичных субстратов и продуктов трансформации нитрилов, выращенные на предметном стекле биопленки и препараты суспензии окрашивали красителем LIVE/DEAD® и просматривали в световой микроскоп с флюоресценцией (Рисунок 55, 56). Следует отметить, что четырехсуточная суспензия P. fluorescens 197 C2 уже содержала значительное количество нежизнеспособных клеток, что, скорее всего, связано с особенностями роста этого микроорганизма. Воздействие 1,3 М раствора НАК приводило к потере жизнеспособности и лизису клеток суспензии, что следует из наблюдаемой картины при окраске флюоресцентной меткой. В то же время клетки биопленки остаются практически полностью жизнеспособными, что коррелирует с данными АТФ-метрии. Воздействие АК, связанное не только с высокой токсичностью этого соединения, но и с закислением среды до низких значений рН, приводит к лизису большей части клеток суспензии, а отдельные клетки, сохранившие четкие очертания, судя по окраске, имеют нарушенную мембрану. Клетки биопленки, наоборот, большей частью сохраняются, но имеют промежуточную окраску, что не дает возможности делать однозначные выводы об их потенциальной жизнеспособности. Данные АТФ-метрии говорят о потере жизнеспособности не только суспендированных клеток, но и клеток биопленки, либо о стрессовом состоянии последних, сопровождающимся резким снижением внутриклеточного пула АТФ. Воздействие 1,7 М АА Воздействие 1,3 М АК 1,3 М НАК Воздействие Контроль 198 Суспензия P. fluorescens C2 Биопленка P. fluorescens C2 199 Рисунок 55 – Влияние 20-минутного воздействия 1,3 М растворов НАК и АК и 1,7 М раствора АА на жизнеспособность клеток P. fluorescens C2 в суспензии и биопленке, оцененное с помощью флюоресцирующей метки LIVE/DEAD®: зеленое окрашивание – жизнеспособные клетки с неповрежденной мембраной, красное окрашивание – нежизнеспособные клетки с поврежденной мембраной Биопленка R. ruber gt1 Воздействие 1,3 М НАК Воздействие 1,7 М АА Контроль Суспензия R. ruber gt1 Рисунок 56 – Влияние 20-минутного воздействия 1,3 М раствора НАК и 1,7 М раствора АА на жизнеспособность клеток R. ruber gt1 в суспензии и биопленке, оцененное с помощью флюоресцирующей метки LIVE/DEAD®: зеленое 200 окрашивание – жизнеспособные клетки с неповрежденной мембраной, красное окрашивание – нежизнеспособные клетки с поврежденной мембраной 4.7. Смешанные биопленки нитрилгидролизующих бактерий Трансформация нитрилов до соответствующих кислот может протекать как по одноэтапному нитрилазному пути, так и в две стадии, включающие гидратацию до амидов нитрилгидратазой с последующим гидролизом амидазой до карбоновой кислоты [14]. Не всегда штаммы содержат одинаково активные и нитрилгидратазу, и амидазу, т.к. нитрилгидролизующие бактерии биотехнологического значения нередко бывают селекционированы либо в направлении увеличения нитрилгидратазной, либо амидазной активности. В связи с этим возможно создание гетерогенного биокатализатора трансформации нитрилов в соответствующие карбоновые кислоты на основе нескольких штаммов, один из которых обладает высокой нитрилгидратазной, а другой – выраженной амидазной активностью. Наиболее экономичным в данном случае представляется их совместное культивирование в присутствии носителя, с целью получения смешанной биопленки этих штаммов. Эта возможность была изучена при совместном культивировании двух штаммов родококков, один из которых обладал высокой нитрилгидратазной активностью без проявления амидазной активности (R. ruber gt1), другой – выраженной амидазной активностью (R. erythropolis 11-2). Во втором варианте штамм, проявляющий амидазную активность, был грамотрицательным (A. faecalis 2). Смешанные биопленки R. ruber gt1 и R. erythropolis 11-2. В среду N (100 мл) с 0,1% глюкозой в качестве источника углерода и 0,05% ацетонитрилом в качестве источника азота вносили по 5 мл (2,0±0,2) x 108 КОЕ/мл суспензии родококков обоих штаммов и культивировали в присутствии носителей Карбопона и полиэтиленовой пленки высокой плотности при 30ºС с перемешиванием на шейкере (130 об/мин). После 7 суток культивирования определяли КОЕ/мл планктона (колонии R. ruber gt1 имели оранжевую, R. 201 erythropolis 11-2 – кремовую окраску). При подсчете КОЕ был вывлен факт частичного подавления роста R. erythropolis 11-2, который образовал в 5 раз меньше колоний, чем R. ruber gt1 (1,7 x 108 против 9,1 x 108 КОЕ/мл). Для определения биокаталитической способности биопленок была проведена 48часовая трансформация 1,3 М раствора акрилонитрила (Рисунок 57). Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что биопленки были образованы в основном R. ruber gt1, который осуществляет трансформацию НАК до акриламида, причем суммарный вклад биопленочных и планктонных клеток в эту трансформацию достоверно больше, чем контрольной суспензии, выращенной без носителя. культивировании Вклад в R. erythropolis присутствии 11-2 носителя в биотрансформацию значительно ниже, чем при при культивировании в суспензии без носителей, о чем можно судить по образованию акриловой кислоты из акриламида. Таким образом, формирование биопленок смешанными культурами одного рода бактерий в данном случае происходит с преобладанием одного вида над другим, в данном случае – R. ruber gt1 над R. Образование акриламида,мг в пробе erythropolis 11-2. 800 700 планктон биопленка (а) 600 500 400 300 200 100 0 Контроль Полиэтилен Карбопон 202 Образование акриловой кислоты, мг в пробе 40 (б) планктон биопленка 35 30 25 20 15 10 5 0 Контроль Полиэтилен Карбопон Рисунок 57 – Образование акриламида (а) и акриловой кислоты (б) при трансформации НАК смешанными культурами R. ruber gt1 и R. erythropolis 11-2 Смешанные биопленки R. ruber gt1 и A. faecalis 2. В среду N (100 мл) с 0,1% глюкозой в качестве источника углерода для штамма R. ruber gt1 и 0,1 М ацетамидом в качестве источника углерода для штамма A. faecalis 2, а также с 0,1 М хлоридом аммония в качестве источника азота, вносили 1 мл инокулята R. ruber gt1 (1,3 х 109 КОЕ/мл) и 0,5 мл A. faecalis 2 (1,0 х 1010 КОЕ/мл) и культивировали в присутствии носителей Карбопона и полиэтилена высокой плотности при 30ºС с перемешиванием на шейкере (130 об/мин). На 7-е сутки культивирования подсчитывали количество жизнеспособных клеток путем высева на агаризованную среду Луриа-Бертани, колонии различали по окраске. Смешанная суспензия содержала 1,1 х 1011 КОЕ/мл R. ruber gt1 и 8,6 х 1011 КОЕ/мл A. faecalis 2. Более интенсивный рост R. ruber gt1, отличающийся на два порядка от такового в присутствии R. erythropolis 11-2, вероятно, связан с использованием разных источников углерода при росте в присутствии A. faecalis 2, не потребляющего глюкозу в качестве источника питания. Отсутствие конкуренции за источники питания приводит к интенсивному росту и 203 второго штамма – A. faecalis 2. Смешанные биопленки, образованные R. ruber gt1 и A. faecalis 2 на Карбопоне, были визуализированы в электронном микроскопе (Рисунок 58). Биопленки, образованные на волокнах, разрастаются в межволоконное пространство. На крупном плане отмечено, что как между клетками, так и между клетками и волокнами образуются тяжи полимерного вещества. а б 1 2 Рисунок 58 – Общий вид (а) и отдельные клетки (б) смешанной биопленки R. ruber gt1 и A. faecalis 2: 1 – клетки, 2 – тяжи полимерного вещества Проведена 48-часовая трансформация 200 мМ раствора 3-цианопиридина клетками планктона и биопленки. Показано, что за 48 ч трансформации 3цианопиридина контрольной суспензией весь образовавшийся никотинамид трансформируется в никотиновую кислоту амидазой A. faecalis 2, тогда как биопленки в основном образуют никотинамид, и лишь малое его количество трансформируется в никотиновую кислоту (Рисунок 59). Следовательно, несмотря на то, что при совместном культивировании R. ruber gt1 и A. faecalis 2 в суспензии эти микроорганизмы нарастают одинаково интенсивно, в биопленке преобладают клетки R. ruber gt1, о чем можно судить по эффективной 204 трансформации цианопиридина до никотинамида. Возможно, это связано с лучшей адгезией клеток родококков, имеющих гидрофобную клеточную стенку, на гидрофобных носителях. Содержание никотинамида в пробе, мг 350 300 (а) планктон биопленка 250 200 150 100 50 0 Контроль Содержание никотиновой кислоты в пробе, мг 450 400 планктон биопленка Полиэтилен Карбопон (б) 350 300 250 200 150 100 50 0 Контроль Полиэтилен Карбопон Рисунок 59 – Образование никотинамида (а) и никотиновой кислоты (б) при трансформации 3-цианопиридина смешанными культурами R. ruber gt1 и A. faecalis 2 205 Из результатов, описанных в данной главе, следует, что биопленки нитрилгидролизующих бактерий могут являться компонентом гетерогенного биокатализатора, осуществляющим трансформацию нитрилов и амидов карбоновых кислот. Культивирование в присутствии носителя позволяет объединить два этапа создания гетерогенного биокатализатора (выращивание биомассы и ее иммобилизация на носителе) в один, когда иммобилизация происходит естественным путем наращивания биопленки. При анализе научной литературы обнаружено, что биопленки микроорганизмов были изучены в процессах ферментации (получение спиртов, органических кислот), биоэнергетике и очистке сточных вод [115, 212, 236, 281, 373], тогда как сведения о «биопленке-биокатализаторе» для процессов трансформации органических веществ единичны. Биопленки нитрилгидролизующих бактерий оказались более устойчивы к действию токсичных нитрилов и амидов карбоновых кислот, чем суспендированные клетки, что подтверждалось АТФ-метрией и оценкой жизнеспособности клеток с помощью флюоресцирующей метки LIVE/DEAD®. В то же время, особенности роста бактериальных культур в виде биопленки, а именно массивность образуемого внеклеточного полимерного вещества, накладывают отпечаток на функционирование этого типа биокатализатора в процессе трансформации характеризующиеся органических избыточной веществ. продукцией Так, полимерных псевдомонады, веществ при образовании биопленки, менее эффективно трансформируют субстрат из-за диффузионных затруднений, создаваемых внеклеточным матриксом. Выращивание смешанной биопленки, состоящей из штамма бактерий с высокой нитрилгидратазной и штамма с выраженной амидазной активностью, и применение ее для гидролиза нитрилов в соответствующие карбоновые кислоты оказалось неэффективным как в случае представителей одного рода, так и разных родов, отличающихся предпочтениями по питательному субстрату и по типу клеточной стенки. В первом случае, возможно, причиной этой неэффективности являлась конкуренция за субстрат, во втором – худшая адгезивная способность одного из штаммов. 206 Выявленная физиологическая особенность адгезированного состояния бактериальных клеток (этапа инициации образования биопленки) – снижение внутриклеточного пула АТФ – может повлиять на активность энергозависимых ферментов, в то время как ферменты, на функционирование которых не требуются затраты энергии, трансформируют субстрат столь же эффективно, как и в планктонных клетках. Рост биопленки может быть оценен посуточно по содержанию в ней АТФ, что дает более точные сведения о жизнеспособности клеток, тогда как метод оценки биомассы биопленки по экстрагированному красителю кристаллическому фиолетовому дает возможность оценить массивность биопленки в целом. В то же время, между данными, полученными этими методами, наблюдается корреляция от умеренной до высокой, что дает возможность определять динамику роста биопленки одним из перечисленных способов. Оценка динамики роста биопленок важна для выбора оптимального срока культивирования в присутствии носителей, что может быть применено и для других промышленно значимых микроорганизмов. Таким образом, впервые показано, что биопленки нитрилгидролизующих бактерий могут являться гетерогенным биокатализатором трансформации амидов и нитрилов карбоновых кислот, обладающим повышенной устойчивостью к токсичным субстратам и продуктам ферментативной реакции (акрилонитрилу и акриламиду), этап инициации образования которых (стадия необратимой адгезии) характеризуется пониженным суспендированными клетками. содержанием АТФ по сравнению с 207 ГЛАВА 5. ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА НИТРИЛОВ Гетерогенные биокатализаторы трансформации нитрильных соединений также могут быть приготовлены путем иммобилизации изолированных ферментов метаболизма нитрилов. В данной главе исследованы два способа иммобилизации – адсорбция на нерастворимом носителе и ковалентная сшивка с носителем, изучены каталитические свойства полученных иммобилизованных ферментных препаратов и влияние иммобилизации на кинетические параметры реакции гидратации/гидролиза нитрилов. Кроме того, получены поперечносшитые агрегаты амидазы и изучена их стереоселективность в реакции гидролиза рацемического субстрата, а также влияние способа иммобилизации амидазы на стереоселективность биотрансформации. 5.1. Трансформация акрилонитрила иммобилизованными ферментами гидролиза нитрилов 5.1.1. Гидратация акрилонитрила адсорбированными ферментными препаратами, содержащими нитрилгидратазу Нитрилгидратаза, выделенная из штамма Rhodococcus ruber gt1, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, была иммобилизована на немодифицированных оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах, в том числе на углеродном носителе Сибуните. Изучена активность и операционная стабильность адсорбированной нитрилгидратазы в реакции трансформации акрилонитрила в акриламид. Установлено, что величина адсорбции белка на углеродсодержащих носителях выше, чем на немодифицированных оксидах алюминия (Таблица 26). 208 Очевидно, что присутствие углерода в составе адсорбента увеличивает его способность связывать фермент. Максимальная величина адсорбции составляет 8–9 мг/г. Таблица 26 – Адсорбционные свойства немодифицированных и углеродсодержащих оксидов алюминия и Сибунита Адсорбент Sуд, м2/г Dпор, нм Масса носителя, г Адсорбированный белок, мг (величина адсорбции, мг/г) Немодифицированные оксиды алюминия Al2O3 I 1 2900 0,6 2,6 (4,3) Al2O3 II 13 95 2,0 1,0 (0,5) Al2O3 III 221 12 0,5 0,5 (1,0) Углеродсодержащие оксиды алюминия С/α-Al2O3 I 9 330 0,6 5,5 (9,2) С/α-Al2O3 II 15 94 2,0 1,0 (0,5) С/ γ-Al2O3 III 206 12 0,5 3,0 (6,0) 220 11 0,2 0,8 (4,0) С/γ-Al2O3 (марки СУМС) Углеродные носители Сибунит 441 18 0.2 1,6 (8,0) Примечание: *Время адсорбции – 48 ч; концентрация исходного раствора белка – 14 мг/мл (для носителей Сибунит и марки СУМС – 3,3 мг/мл) При иммобилизации нитрилгидратазы на немодифицированных оксидах алюминия (без углерода) стационарное состояние в системе «раствор/адсорбент» устанавливается через 10 сут. При адсорбции фермента на углеродсодержащих носителях количество адсорбированного белка постепенно возрастает (Таблица 209 27) при увеличении продолжительности адсорбции. Это может быть обусловлено медленной диффузией фермента внутрь гранул носителя и/или полислойной адсорбцией молекул белка за счет межмолекулярных взаимодействий. Таблица 27 – Кинетика адсорбции нитрилгидратазы на углеродсодержащих носителях и оксидах алюминия Адсорбент Содержание углерода, % Величина адсорбции, мг белка/г носителя 24 ч 96 ч 168 ч 216 ч Немодифицированные оксиды алюминия Al2O3 I 0 3,8 13,8 4,0 5,6 Al2O3 II 0 0,6 0 0 1,8 Al2O3 III 0 5,0 0 0 2,0 Углеродсодержащие оксиды алюминия С/Al2O3 I 3,1 2,3 9,8 12,5 18,2 С/Al2O3 II 0,5 1,1 2,2 2,8 - С/Al2O3 III 0,2 2,0 7,2 9,8 17,2 СУМС 20,0 14,5 32,0 43,3 63,0 39,0 46,5 Углеродные носители Сибунит 99,0 19,3 29,8 Примечание: *Концентрация исходного раствора белка – 14 мг/мл Динамика трансформации акрилонитрила адсорбированной нитрилгидратазой Определена нитрилгидратазы. ферментативная Было обнаружено, активность что при иммобилизованной иммобилизации на 210 углеродсодержащих адсорбентах С/Al2O3-I, II, III нитрилгидратаза сохраняла не более 2% от первоначальной активности фермента в растворе, равной 300 мкмоль/мг/мин, тогда как на носителях без углерода фермент сохранял 6–10% исходной активности. Это может быть объяснено либо менее плотным строением адсорбционного слоя на исходных оксидах алюминия по сравнению с углеродсодержащими носителями, либо меньшей деформацией молекулы фермента при взаимодействии с полярной гидрофильной поверхностью Al2O3. Результаты изучения кинетики гидратации акрилонитрила с участием гетерогенных биокатализаторов, приготовленных путем адсорбционной иммобилизации фермента, представлены на рисунках 60–63. 0.6 1 0.5 0.5 2 0.4 0.4 4 0.3 0.3 3 0.2 0.2 0.1 0.1 0 Концентрация АА, моль/л Концентрация НАК,моль/л 0.6 0 0 10 20 30 40 Время реакции, мин 50 60 Рисунок 60 – Динамика трансформации акрилонитрила (НАК) в акриламид (АА) нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителях Al2O3 I (1, 3) и С/Al2O3I (2, 4): 1, 2 – образование АА, 3, 4 – убыль НАК Реакция гидратации акрилонитрила в акриламид с участием биокатализаторов «нитрилгидратаза на Al2O3-I» протекает с одинаковой скоростью независимо от присутствия углеродного слоя на поверхности, и полная конверсия субстрата достигается через 1 ч (Рисунок 60). При этом следует отметить, что количество адсорбированного фермента на углеродсодержащем 211 носителе в 2 раза больше (Таблица 26), чем на немодифицированном оксиде алюминия. Кинетика реакции гидратации акрилонитрила с участием биокатализаторов «нитрилгидратаза на Al2O3-II» и одинаковым количеством адсорбированного фермента, указывает на такую же закономерность: нитрилгидратаза на немодифицированном оксиде алюминия трансформирует нитрил в 3 раза быстрее 0.6 0.6 2 1 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 3 4 0 0 20 40 Концентрация АА, моль/л Концентрация НАК, моль/л (Рисунок 61). 60 80 100 120 Время реакции, мин 140 160 0 180 Рисунок 61 – Динамика трансформации акрилонитрила (НАК) в акриламид (АА) нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителях Al2O3 II (1, 3) и С/Al2O3II (2, 4): 1, 2 – образование АА, 3, 4 – убыль НАК Для биокатализаторов «нитрилгидратаза на Al2O3-III» полная конверсия акрилонитрила проходит за 24 ч (Рисунок 62), при этом количество нитрилгидратазы на углеродсодержащем носителе в 6 раз больше (Таблица 26). Таким образом, установлена обратная зависимость между количеством адсорбированного фермента и сохранением его каталитической активности. Синтезированный на поверхности носителя слой углерода повышает сорбционную емкость носителя по отношению к белку, но приводит к снижению 212 активности фермента. Возможно, в данном случае, снижение активности нитрилгидратазы связано с ее полислойной адсорбцией и/или неправильной ориентацией молекулы фермента на поверхности, которые затрудняют перенос 0.6 0.6 1 0.5 0.5 2 0.4 0.4 3 0.3 0.3 0.2 0.2 4 0.1 0.1 0 Концентрация АА, моль/л Концентрация НАК, моль/л субстрата из раствора к активному центру фермента. 0 0 250 500 750 1000 Время реакции, мин 1250 Рисунок 62 – Динамика трансформации акрилонитрила (НАК) в акриламид (АА) нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителях Al2O3 III (1, 3) и С/Al2O3III (2, 4): 1, 2 – образование АА, 3, 4 – убыль НАК Для сравнения нитрилгидратаза была адсорбирована на коммерческих мезопористых носителях марок СУМС (С/γ-Al2O3) и Сибунит (полностью углеродный носитель). Носитель марки Сибунит ранее был изучен для иммобилизации фермента глюкоамилазы [27]. При сравнении биокатализаторов, приготовленных на основе СУМС и Сибунит, было обнаружено, что трансформация акрилонитрила ферментом, адсорбированным на носителе СУМС, за 24 ч происходит более полно (Рисунок 63), при этом в реакцию вступает в 2 раза меньшее его количество (Таблица 26). Сравнительные исследования биокатализаторов, приготовленных на носителях марок СУМС и Сибунит, 213 подтвердили, что удельная активность иммобилизованной нитрилгидратазы уменьшается при адсорбции на более гидрофобной поверхности Сибунита. 0.5 1 0.5 2 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 3 0.2 0.1 0.1 Концентрация АА, моль/л Концентрация НАК, моль/л 0.6 4 0 0 0 250 500 750 1000 Время реакции, мин 1250 Рисунок 63 – Динамика трансформации акрилонитрила (НАК) в акриламид (АА) нитрилгидратазой, иммобилизованной на носителях СУМС (1, 3) и Сибунит (2, 4): 1, 2 – образование АА, 3, 4 – убыль НАК Таким образом, при выборе адсорбента для иммобилизации нитрилгидратазы важно придерживаться оптимальной массовой доли углерода в составе неорганического носителя, поскольку повышение содержания углерода приводит к возрастанию количества адсорбированного фермента, но одновременно и к снижению его активности. Операционная стабильность адсорбированной нитрилгидратазы При проведении повторных циклов трансформации акрилонитрила наиболее стабильной была нитрилгидратаза, иммобилизованная на Al2O3-II (Рисунок 64, б): на протяжении 5 циклов последовательных ферментативных реакций сохранялось не менее 50% первоначальной активности 214 свежеприготовленного биокатализатора. Нитрилгидратаза, иммобилизованная на носителях I и III, уже к третьему циклу теряла более 50% активности (Рисунок 64, Сохранение активности, % 1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 (а) 1 2 2 3 4 Циклы 5 6 (в) 12 1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Сохранение активности, % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 3 4 Циклы 100 5 6 (б) 1 2 1 Сохранение активности, % Сохранение активности, % а, в). 2 3 4 Циклы 5 6 (г) 3 4 80 60 40 20 0 1 2 3 Циклы 4 5 Рисунок 64 – Операционная стабильность биокатализаторов, приготовленных адсорбцией нитрилгидратазы на носителях I (а), II (б), III (в): 1 – оксид алюминия, 2 – слой КВУ на оксиде алюминия; и на углеродсодержащих носителях (г): 3 – СУМС, 4 – Сибунит. По оси ординат – сохранение нитрилгидратазной активности в повторяющихся циклах использования биокатализаторов в периодических условиях: концентрация НАК – 0,58 моль/л, 25ºС, рН 7,2±0,2 (100% – активность в 1-м цикле реакции) Было установлено, что потеря активности происходила, главным образом, не в результате десорбции белка (наличие белка в промыве контролировали по 215 методу Бредфорд), а вследствие ингибирования нитрилгидратазы высокими концентрациями токсичного субстрата. Известно, что акрилонитрил дезактивирует ферменты путем алкилирования сульфгидрильных групп [220]. При сравнении операционной стабильности нитрилгидратазы, иммобилизованной на носителях марок СУМС и Сибунит было показано, что на Сибуните фермент более стабилен и сохраняет 50% активности на протяжении 4-х циклов реакции (Рисунок 64, г). Закономерности между наличием синтезированного слоя углерода на поверхности оксидов алюминия и операционной стабильностью иммобилизованной нитрилгидратазы выявлено не было. Также была изучена термостабильность иммобилизованной нитрилгидратазы. Иммобилизованная нитрилгидратаза проявляла максимальную активность при 30–40°С. При 70°С нитрилгидратаза в растворе и в иммобилизованном состоянии на немодифицированных и углеродсодержащих оксидах алюминия сохраняла соответственно 2,7, 30 и 17,5% максимальной активности. Следовательно, адсорбция на неорганических носителях повышает термостабильность нитрилгидратазы на порядок. Таким образом, хотя адсорбция фермента на немодифицированных оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах приводит к кажущемуся снижению его активности, иммобилизация дает возможность многократного использования катализатора и повышает его термостабильность. 5.1.2. Гидратация акрилонитрила нитрилгидратазой, ковалентно связанной с активированным хитозаном Иммобилизованный биокатализатор на основе ферментного препарата, содержащего нитрилгидратазу, был получен путем ковалентной сшивки белка с хитозановыми гранулами, предварительно активированными бифункциональными реагентами. В качестве активаторов использовали 0,5; 1; 1,5; 2% раствор глутарового альдегида и 0,1% раствор бензохинона. Глутаровый альдегид в качестве бифункционального реагента часто используется для 216 ковалентного присоединения ферментов к носителю [183]. Для выбора предпочтительного активатора определяли активность иммобилизованного ферментного препарата нитрилгидратазы. Определено, что при использовании 0,5–2% растворов глутарового альдегида для активации нитрилгидратазы сохраняется хитозановых не гранул более 6% у иммобилизованной первоначальной активности интактного фермента. Полученные результаты согласуются с литературными данными об ингибировании активности нитрилгидратазы глутаровым альдегидом [137]. Основываясь на полученных данных, в дальнейших экспериментах для активирования хитозана использовали 0,1% раствор бензохинона. В некоторых случаях при использовании такой схемы активации носителя добивались полного сохранения активности нативного фермента. Исследованы каталитические свойства нитрилгидратазы, изолированной из штамма R. ruber gt1 и иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным 0,1%-ным раствором бензохинона. Определено, что с активированным хитозаном за 20 мин контакта связывается до 70% нативного белка. Определены кинетические параметры реакции гидратации акрилонитрила, катализируемой иммобилизованной нитрилгидратазой и ферментом в растворе. Каталитические параметры реакции гидратации акрилонитрила в акриламид Изучено влияние концентрации акрилонитрила на активность нитрилгидратазы, связанной с активированным хитозаном (Рисунок 65), определены константа Михаэлиса (КМ) и максимальная скорость нитрилгидратазной реакции (Vмакс.) (Таблица 28). Определено, что максимальная скорость нитрилгидратазной реакции (Vмакс.), катализируемой ковалентно иммобилизованным ферментом, может достигать Vмакс. реакции с участием фермента в растворе – 50 мкмоль/мг/мин. Сохранение ферментативной активности при иммобилизации указывает на то, что бензохинон в качестве 217 бифункционального реагента эффективно связывает молекулу фермента с хитозаном, не затрагивая ее активный центр. Константа Михаэлиса (КМ) нитрилгидратазы, ковалентно присоединенной к хитозану, не изменяется (Таблица 28). Т.к. по определению Vмакс. и КМ – константы уравнения скорости реакции, выведенного для определения ферментативной активности в разбавленном растворе, в случае иммобилизованных ферментов следует говорить о «кажущейся» константе Михаэлиса [73]. Удельная активность, мкмоль/мг/мин 60 (а) 50 40 30 20 10 0 0 0.5 1 Концентрация НАК, М 1.5 218 (б) Удельная активность, мкмоль/мг/мин 60 50 40 30 20 10 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Концентрация НАК, М Рисунок 65 – Зависимость удельной активности нитрилгидратазы в растворе (а) и иммобилизованной на активированном хитозане (б) от концентрации субстрата Зависимость нитрилгидратазной активности от температуры и термоинактивация свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы Известно, что в отличие от оптимума рН не существует температурного оптимума активности ферментов, т.к. зависимость активности от температуры является результатом наложения двух различных процессов: ускорения движения молекул при повышении температуры и денатурации белка, зависящей от температуры и времени ее воздействия [7]. По нашим данным, температурный оптимум активности сдвигался в сторону более высоких значений температуры при увеличении концентрации фермента в растворе. Так, при количестве белка в растворе 0,45–0,5 мг/мл максимальная активность наблюдалась при 30–40°С, а при увеличении количества белка в растворе до 1,1 мг/мл – при 50°С. Интересно, что подобная зависимость активности от температуры прослеживалась и у иммобилизованного фермента: при иммобилизации на хитозане от 0,8 до 2 мг белка максимальная активность наблюдалась при 45°С, от 3,8 до 4 мг – при 55°С. 219 Пример зависимости нитрилгидратазной активности свободного и иммобилизованного фермента от температуры показан на Рисунке 66. Известно, что зависимость кинетики инактивации от концентрации фермента является критерием диссоциативной инактивации [9]. Таким образом, концентрационная зависимость термоинактивации согласуется с данными об олигомерной структуре нитрилгидратазы [246]. Следуя литературным данным, можно заключить, что нитрилгидратаза не является термостабильным ферментом. Так, только у бацилл температурный оптимум активности нитрилгидратазы достигает 50ºС, тогда как в среднем эта величина не превышает 30–40ºС (Таблица 1). Максимум активности выделенной из Brevibacterium A4 и адсорбированной на DEAE-целлюлозе нитрилгидратазы достигался при 40ºС, что на 5ºС превышало таковой для фермента в растворе [222]; максимум активности как свободной, так и иммобилизованной на Eupergit®C нитрилгидратазы из термостабильного штамма Geobacillus pallidus RAPc8 был равен 60ºС [158]. Наибольшая конверсия рацемического нитрила миндальной кислоты нитрилгидратазой из R. rhodochrous ATCC BAA-870, иммобилизованной в ПВС/хитозане, сшитом глутаровым альдегидом, наблюдалась при 40ºС [322]. Определены константы термоинактивации иммобилизованной нитрилгидратазы и фермента в растворе (Таблица 26). Показано, что ковалентно иммобилизованная нитрилгидратаза более термостабильна, чем находящаяся в растворе (Рисунок 67). Наиболее вероятно, что увеличение термостабильности связано с тем, что ковалентная сшивка фермента с носителем предотвращает диссоциацию фермента на субъединицы, происходящую при повышении температуры, а также усиливает общую жесткость молекулы фермента, приводя к его стабилизации [205]. 220 Таблица 28 – Каталитические свойства свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы Кин, мин-1 КМ, моль/л В растворе 0,41±0,15 50 6,6 х 10-3 2,7 х 10-2 1,4 х 10-1 Иммобилизованная 0,42±0,05 50 2,2 х 10-3 2,4 х 10-2 1,0 х 10-1 Сохранение активности, % Нитрилгидратаза Vмакс., мкмоль/ мг/мин 40°С 50°С 60°С 100 2 80 60 40 1 20 0 10 20 30 40 50 Температура, °С 60 70 Рисунок 66 – Зависимость активности (%) нитрилгидратазы от температуры: 1– иммобилизованная на активированном хитозане; 2 – в растворе. Количество белка в растворе – 0,5, иммобилизованного – 0,8–1,5 мг в 10 мл реакционной смеси. 100% – максимальная активность нитрилгидратазы соответственно иммобилизованной и свободной Сохранение активности, % 221 (а) 140 1 120 100 80 2 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 50 60 Сохранение активности, % Время реакции, мин (б) 100 80 1 60 40 20 2 0 0 10 20 30 40 Время реакции, мин 222 (в) Сохранение активности, % 100 80 60 40 1 20 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Время реакции, мин Рисунок 67 – Термоинактивация (%) нитрилгидратазы при 40 (а), 50 (б) и 60ºС (в): 1 – иммобилизованной на активированном хитозане; 2 – в растворе. Количество белка в растворе – 0,3–0,7, иммобилизованного – 1,4–3,7 мг в 10 мл реакционной смеси. 100% – активность нитрилгидратазы при 22ºС Зависимость активности свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы от рН Показано, что нитрилгидратаза, иммобилизованная на хитозане, проявляет активность при более низких значениях рН, чем фермент в растворе, который инактивируется при рН<4,0 (Рисунок 68). 223 Сохранение активности, % 100 80 1 60 40 2 20 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 рН Рисунок 68 – Зависимость активности (%) свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы от рН: 1 – иммобилизованной на активированном хитозане; 2 – в растворе. 100% – максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилгидратазы соответственно Оптимум рН для нитрилгидратазы в растворе более узкий и находится в нейтральной области, тогда как ковалентно связанный фермент проявляет активность, близкую к максимальной, в более широком диапазоне рН – от 5,0 до 7,0. В щелочном диапазоне рН>10,0 инактивируется и свободный, и иммобилизованный фермент. Подобный эффект влияния рН на активность иммобилизованной нитрилгидратазы можно объяснить природой носителя – хитозана. В данном случае рН в макроокружении фермента, где происходят измерения, отличается от рН микроокружения фермента, на которое оказывает воздействие носитель. Большое количество свободных аминогрупп в молекуле хитозана определяет его свойство связывать ионы водорода и приобретать избыточный положительный заряд [80, 258]. Т.к. поликатионы обычно отталкивают протоны, то вблизи фермента рН будет выше, чем в свободном 224 растворе, следовательно, рН-диапазон работы фермента расширится в сторону более низких значений. По данным научной литературы, рН оптимум работы нитрилгидратаз лежит в нейтральной или слабощелочной (7,7–7,8) области (Таблица 1). Оптимум рН активности нитрилгидратазы, иммобилизованной на DEAE-целлюлозе, был немного ниже, чем свободного фермента (6,5 против 7) [222], иммобилизованной на Eupergit®C оставался равным таковому фермента в растворе (рН 7) [158], а процент конверсии иммобилизованной нитрила на носителе миндальной кислоты нитрилгидратазой, ПВС/хитозан-глутаровый альдегид, был максимален при рН 8, что связано с особенностями конверсии этого субстрата [322]. Преимуществом полученного нами иммобилизованного препарата нитрилгидратазы, ковалентно сшитой с активированным хитозаном, явилась возможность работы фермента в широком диапазоне рН с расширением оптимума в кислую сторону, что не было отмечено у описанных в литературе иммобилизованных нитрилгидратаз. Операционная стабильность нитрилгидратазы, иммобилизованной на активированном хитозане При проведении последовательных циклов конверсии акрилонитрила была выявлена высокая операционная стабильность иммобилизованной нитрилгидратазы (Рисунок 69). Во втором и нескольких последующих (до 6) циклах реакции было отмечено возрастание нитрилгидратазной активности в 18 раз по сравнению с первым циклом, затем постепенное снижение активности, которая в 50 цикле была в 3,5 раза выше, чем в первом. Стабильность иммобилизованного фермента при повторном многократном использовании можно объяснить жестким фиксированием его молекулы на носителе, предотвращающим диссоциацию гетеромера и потерю структуры субъединиц. Вымывание фермента из носителя также не происходило благодаря ковалентным связям, образованным между его молекулой, бифункциональным реагентом и 225 хитозаном. Для объяснения эффекта возрастания нитрилгидратазной активности были проведены эксперименты по адсорбции продукта реакции – акриламида на активированном хитозане с иммобилизованным на нем белком. Определено, что из 1%-ного (вес/об.) раствора акриламида адсорбируется 25% вещества. Из этого можно сделать вывод, что повышение концентрации акриламида во втором цикле реакции в некоторой степени связано не с повышением активности, а со снижением величины адсорбции продукта за счет взаимодействия с амидом части реакционноспособных групп хитозана и активатора в предыдущем цикле. Т.к. для объяснения 18-кратного возрастания активности с 1 по 6 цикл этого недостаточно, можно высказать предположение, что дробное введение субстрата в реакционную среду вызывало адаптацию каталитического центра фермента к данному субстрату, приводя к увеличению скорости фермент-субстратных взаимодействий. При многоцикловой конверсии акрилонитрила определено, что иммобилизованный ферментный препарат в количестве 1,4 мг (по белку) за 8,3 ч образует 60 ммоль акриламида. Иммобилизованная на активированном хитозане нитрилгидратаза проявила самую высокую операционную стабильность по сравнению с данными, представленными в научной литературе: при проведении 8 последовательных циклов конверсии 3-цианопиридина нитрилгидратаза, иммобилизованная на Eupergit®C, теряла 10% активности [158]; конверсия нитрила миндальной кислоты нитрилгидратазой, иммобилизованной на ПВС/хитозане с ковалентной сшивкой глутаровым альдегидом, составляла лишь 10% после 9 последовательных циклов реакции [322]. Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин 226 160 120 80 40 0 1 5 9 13 17 21 25 29 Циклы 33 37 41 45 49 53 Рисунок 69 – Операционная стабильность иммобилизованной нитрилгидратазы 5.1.3. Гидролиз акрилонитрила адсорбированными ферментными препаратами, содержащими нитрилазу Из клеток P. fluorescens C2 был получен частично очищенный препарат нитрилазы, который иммобилизовали методом адсорбции на углеродном носителе «Сапропель». Была определена величина адсорбции нитрилазы на этом носителе. Установлено, что величина адсорбции белка на «Сапропеле» возрастает с увеличением его концентрации в среде. Так, при исходной концентрации белка 0,55 мг/мл адсорбировалось 2,11 мг белка на 1 г носителя, а при 9 мг/мл – 16 мг/г соответственно. При этом концентрация белка в растворе выше 9 мг/мл приводила к резкому повышению величины адсорбции, что свидетельствует о процессах полислойной адсорбции молекул фермента при достижении данных концентраций (Рисунок 70). По своему типу изотерма адсорбции была близка к изотерме БЭТ (Брунауэра, Эммета, Теллера) [26, 79]. 227 Величина адсорбции, мг/г 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 Концентрация белка, мг/мл 14 16 18 Рисунок 70 – Зависимость величины адсорбции нитрилазы на «Сапропеле» от исходной концентрации белка. Время адсорбции 120 ч Величина адсорбции, мг/г 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 25 50 75 100 Время адсорбции, ч 125 150 Рисунок 71 – Изменение величины адсорбции нитрилазы на «Сапропеле» в зависимости от продолжительности адсорбции. Исходная концентрация белка 9 мг/мл 228 Величина адсорбции фермента возрастала при увеличении времени контакта раствора белка с носителем. При исходной концентрации фермента 9 мг/мл величина адсорбции после 80 ч нарастала незначительно, а через 144 ч достигала наибольшего значения – 11,5 мг на 1 г адсорбента (Рисунок 71). Каталитические параметры реакции трансформации акрилонитрила адсорбированной нитрилазой Изучена зависимость скорости реакции, катализируемой свободной и иммобилизованной нитрилазой, от концентрации субстрата в реакционной среде (Рисунок 72). Концентрации раствора НАК варьировали в диапазоне от 0,07 до 1,36 М. По графику Лайнуивера-Берка, построенному на основе полученных данных с использованием двойных обратных величин, были вычислены Vмакс. и КМ для растворенного фермента и адсорбированного на «Сапропеле», которые у свободной нитрилазы составили 4 мкмоль/мг/мин и 0,4 моль/л соответственно, у иммобилизованной – 0,4 мкмоль/мг/мин и 1,1 моль/л соответственно. (а) 2 Удельная активность, мкмоль/мг/мин 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 Концентрация НАК, М 0.6 0.8 229 0.16 (б) Удельная активность, мкмоль/мг/мин 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Концентрация НАК, М Рисунок 72 – Зависимость активности нитрилазы в растворе (а) и иммобилизованной на «Сапропеле» (б), от концентрации субстрата Влияние температуры на активность нитрилазы, адсорбированной на «Сапропеле» При проведении 40 мин трансформации 0,59 М раствора НАК при различной температуре (10–80˚С) максимальная активность нитрилазы в растворе была отмечена при 50˚С, а к 70˚С происходила полная инактивация фермента. Активность фермента, иммобилизованного на «Сапропеле», достигала максимума при 60˚С, при этом нитрилаза сохраняла около 20% активности даже при 80˚С (Рисунок 73). Нитрилазы так же, как нитрилгидратазы, имеют субъединичную структуру, но в отличие от последних представляют собой гомоолигомультимеры. Первым этапом инактивации также является диссоциация на субъединицы, которая увеличивается при повышении температуры. В этом случае адсорбция на нерастворимом носителе оказывает защитное действие на фермент, стабилизирует 230 его структуру и позволяет ферменту функционировать при более высоких температурах. 0.8 Удельная активность, мкмоль/мг/мин 0.7 1 0.6 0.5 0.4 0.3 2 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 60 Температура, ºС 70 80 Сохранение активности, % 100 1 80 2 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 Температура, ºС 70 80 Рисунок 73 – Влияние температуры на активность нитрилазы в растворе (1) и иммобилизованной на «Сапропеле» (2). 100% – максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилазы соответственно 231 Нитрилазы – более термостабильные ферменты, чем нитрилгидратазы (Таблица 3). Нитрилазы из различных источников характеризуются широким диапазоном температурного оптимума активности, от 30˚С у R. erythropolis ZJB0910 [309] и R. rhodochrous NCIMB 11216 [218] до 65˚С у Acidovorax facilis 72W [347] и Bacillus pallidus Dac521 [105] и даже 80˚С у архей Pyrococcus abyssi GE5 [164]. Нитрилаза из P. fluorescens C2 даже в свободном состоянии имеет высокий температурный оптимум активности – 50˚С, который при адсорбции на углеродсодержащем носителе повышается еще на 10˚С, что делает иммобилизованный препарат перспективным для гидролиза нитрилов в широком диапазоне температур. Сохранение активности, % Влияние рН на активность нитрилазы, адсорбированной на «Сапропеле» 120 100 1 2 80 60 40 20 0 3 4 5 6 7 8 рН 9 10 11 12 13 Рисунок 74 – Влияние рН на активность нитрилазы в растворе (1) и иммобилизованной на «Сапропеле» (2). 100% – максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилазы соответственно 232 При изучении зависимости активности нитрилазы от рН реакционной среды отмечено, что нитрилаза в растворе при рН 3 была неактивна, а максимум активности наблюдался при рН 10. Нитрилаза, адсорбированная на «Сапропеле», сохраняла 15% активности при рН 3, а максимум активности приходился на рН 8. В сильнощелочной реакционной среде при рН выше 12,5 активность и растворенной, и иммобилизованной нитрилазы была минимальной (Рисунок 74). Сдвиг активности иммобилизованной нитрилазы в кислую сторону, возможно, связан с разницей рН микро- и макроокружения фермента. Можно выдвинуть предположение, что носитель «Сапропель», являющийся карбонизированными органическими иловыми осадками пресных озер, защелачивает микроокружение, в котором находится адсорбированный фермент, за счет присутствия ионов Na+ , Mg2+, Ca2+ в составе носителя (Рисунок 19), в результате чего сдвиг рН макроокружения в кислую сторону не оказывает ингибирующего воздействия на нитрилазу. Известные нитрилазы имеют различные рН-оптимумы активности (Таблица 3). Так, есть нитрилазы, для которых оптимальны нейтральные и слабощелочные среды, реже кислые (рН 5,5 для нитрилазы из R. rhodochrous K22 [341]) или щелочные (рН 9–9,2 для нитрилазы из P. fluorescens DSM 7155 [266], Pseudomonas sp. 13 [413] и Klebsiella ozaenae [378]). Нитрилаза P. fluorescens C2 в нейтральном, слабощелочном и кислом растворе проявляет лишь половину от максимальной активности, наблюдаемой при рН 10, тогда как активность иммобилизованного на «Сапропеле» фермента в диапазоне рН от 5 до 10 составляет не менее 60% от максимальных значений. Операционная стабильность адсорбированной нитрилазы Проведены последовательные 24 часовые циклы конверсии 0,59 М раствора акрилонитрила нитрилазой, адсорбированной на «Сапропеле». К 4-му циклу сохранялось около 50% от первоначальной нитрилазной активности, в 233 дальнейшем снижение активности происходило постепенно и к 16-му циклу сохранялось около 9% активности (Рисунок 75). Таким образом, за 384 ч 2 мг адсорбированного фермента образует 307 мг акриловой кислоты. В научной литературе имеются сведения о возможности многократного использования поперечно-сшитых агрегатов нитрилазы. Так, для CLEAs нитрилазы из Alcaligenes faecalis DSMZ 30030 продемонстрировано сохранение почти 90% активности после 5 циклов реакции [242]. Активность CLEAs нитрилазы из рекомбинантной Pseudomonas putida увеличивлась после первых циклов использования, достигая максимума к 5-му циклу, после чего начинала снижаться [175]. Сравнивая результаты с известными данными, можно заключить, что ковалентная сшивка, которая имеет место при образовании CLEAs, значительно стабилизирует фермент по сравнению с адсорбцией на нерастворимых носителях. Однако сохранение 20% первоначальной активности на протяжении 13 иммобилизованной циклов на 24-х часовой «Сапропеле», конверсии позволяет НАК сделать нитрилазой, вывод, что адсорбированный фермент также может долговременно функционировать. Сохранение активности, % 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Циклы Рисунок 75 – Операционная стабильность нитрилазы, иммобилизованной на «Сапропеле» 234 5.1.4. Гидролиз акрилонитрила ковалентно иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими нитрилазу Определено количество белка, связанного немодифицированным хитозаном и хитозаном, активированным 0,1% раствором бензохинона. Показано, что при возрастании концентрации белка в пробе до 18,5 мг/мл связывание белка достигает 55–60% от исходного количества. Установлено, что активация хитозана не приводила к возрастанию количества связанного белка (Рисунок 76). Повидимому, при связывании белка с неактивированным хитозаном имеет место адсорбция, столь же эффективная, как и ковалентная сшивка с активирующим веществом, когда многочисленные аминогруппы хитозана образуют водородные связи с карбоксильными группами белков. 70 1 Адсорбция, % 60 50 2 40 30 20 10 0 0 10 20 30 Концентрация белка, мг/мл 40 Рисунок 76 – Связывание ферментного препарата, содержащего нитрилазу, на неактивированном (1) и активированном (2) хитозане, 100% – концентрация белка в пробе 235 Трансформация акрилонитрила нитрилазой, иммобилизованной на активированном и неактивированном хитозане Изучена активность иммобилизованного и неиммобилизованного препарата нитрилазы в реакции трансформации акрилонитрила. Показано, что при иммобилизации на хитозановых гранулах, как активированных, так и немодифицированных, наблюдается снижение нитрилазной активности (Таблица 29). Возможно, это связано с деформациями активного центра, происходящими при иммобилизации фермента. Кроме того, хитозановые гранулы адсорбируют продукт реакции – акриловую кислоту. В среднем, активированные гранулы адсорбируют 50–70, неактивированные – 40–65% акриловой кислоты. В результате того, что активность фермента оценивается по конечному продукту, истинная активность будет выше измеренной. Таблица 29 – Нитрилазная активность иммобилизованных ферментных препаратов и фермента в растворе Активность нитрилазы, ммоль/г/ч Концентрация НАК, М на активированном хитозане на немодифицированном хитозане в растворе 0,07 21,0 5,6 13,0 0,15 13,7 6,8 22,0 0,29 24,0 9,4 42,5 Влияние температуры на активность нитрилазы, иммобилизованной на активированном и неактивированном хитозане Изучено влияние температуры на активность нитрилазы, связанной с хитозаном, и фермента в растворе. Показано, что как иммобилизованная нитрилаза, так и фермент в растворе имеет максимум активности при 60ºС (Рисунок 77). При температуре 70ºС наблюдается снижение активности, у 236 неиммобилизованного фермента на 73%, у связанного с активированным и неактивированным хитозаном – на 36 и 60% соответственно. Ковалентная сшивка с активированным хитозаном обеспечивает бóльшую стабильность фермента при воздействии высоких температур, предотвращая диссоциацию на субъединицы, тогда как адсорбция на неактивированном хитозане обеспечивает меньшую термостабильность фермента, чем ковалентная сшивка, но бóльшую, чем в растворе. Удельная активность, ммоль/г/ч 160 140 1 120 100 80 60 40 2 20 3 0 10 20 30 40 50 60 Температура, ºС 70 80 Сохранение активности, % 100 80 60 2 1 40 3 20 0 10 20 30 40 50 60 Температура, ºС 70 80 Рисунок 77 – Влияние температуры на активность нитрилазы в растворе (1) и фермента, иммобилизованного на активированном (2) и неактивированном (3) хитозане; 100% – максимальная активность для каждого биокатализатора 237 Операционная стабильность нитрилазы, иммобилизованной на хитозане Оценивали операционную стабильность биокатализатора на основе иммобилизованной нитрилазы. Показано, что нитрилаза, ковалентно связанная с активированным хитозаном, более стабильна, чем адсорбированная на немодифицированном носителе (Рисунок 78). В целом, за 312 ч работы биокатализатора, 2 мг ферментного препарата, иммобилизованного на активированном и неактивированном хитозане, при многоцикловой конверсии НАК образуют 136,5 и 37,5 мг акриловой кислоты соответственно. К 11-му циклу реакции активность иммобилизованной нитрилазы падает. Сохранение активности, % 250 200 150 100 1 50 2 0 1 2 3 4 5 6 Циклы 7 8 9 10 Рисунок 78 – Операционная стабильность нитрилазы, иммобилизованной на активированном (1) и неактивированном (2) хитозане Увеличение активности после первого цикла реакции было показано и для поперечно-сшитых агрегатов нитрилазы. Так, при повторном использовании CLEAs нитрилазы их активность в первых циклах реакции увеличивалась, достигая максимума к 5-му циклу, после чего начинала снижаться [175]. 238 5.2. Гидролиз акриламида иммобилизованными ферментными препаратами, содержащими амидазу2 Получены препараты амидазы Rhodococcus rhodochrous 4–1, иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, физической адсорбции на углеродсодержащих носителях и методом поперечно-сшитых агрегатов фермента (ПСАФ) в отсутствии носителя. Проведен сравнительный анализ некоторых каталитических свойств свободной и иммобилизованной на активированном хитозане амидазы. Исследовано влияние методов иммобилизации на стереоселективные свойства амидазы в модельной реакции трансформации рацемического лактамида до D- и L-молочной кислоты. Каталитические параметры реакции трансформации акриламида амидазой, ковалентно связанной с активированным хитозаном Показано, что при иммобилизации амидазы на активированном хитозане ее активность снижалась в 2 раза (Рисунок 79). При увеличении концентрации субстрата акриламида до 0,05 М наблюдалось линейное возрастание активности как иммобилизованного, так и свободного фермента, тогда как дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводило к линейному увеличению активности. Следовательно, данная концентрация субстрата для амидазы являлась насыщающей вне зависимости от связанного или свободного состояния фермента. При сопоставлении полученных нами результатов с литературными данными можно сделать вывод о более высокой активности амидазы, ковалентно присоединенной к активированному бензохиноном хитозану, по сравнению с поперечно-сшитыми агрегатами амидазы, полученными высаливанием сульфатом 1. 2 Экспериментальные работы, касающиеся иммобилизации амидазы и изучения ее каталитических и стереоселективных свойств, выполнены совместно с аспирантом ИЭГМ УрО РАН А.Н. Горбуновой и опубликованы в статье: Горбунова А.Н., Максимова Ю.Г., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю. Каталитические и стереоселективные свойства иммобилизованной амидазы Rhodococcus rhodochrous 4–1 // Прикладная биохимия и микробиология. - 2015. – Т. 51, № 5. – С. 482–489. 239 аммония и поперечной сшивкой глутаровым альдегидом [321]. Так, в работе H.J. Park с соавт., образованные таким способом агрегаты проявили активность по акриламиду, равную 0,73 ЕД/мл (при активности растворенной амидазы 2,75 ЕД/мл). Единица активности соответствовала количеству фермента, необходимому для образования 1 мкмоль NH3 в минуту, в 1 мл содержалось 10 мг амидазы. Следовательно, активность таких агрегатов составляла 0,073 мкмоль/мг/мин (сохранение 26,5% активности), тогда как в нашем случае максимальная активность составляла 1,29 мкмоль/мг/мин (сохранение 42% Удельная активность, мкмоль/мг/мин исходной активности). 1 3 2 2 1 0 0 0.2 0.4 0.6 Концентрация акриламида, М 0.8 Рисунок 79 – Зависимость удельной активности амидазы в растворе (1) и иммобилизованной на активированном хитозане (2) от концентрации субстрата акриламида Влияние температуры на активность амидазы, иммобилизованной на активированном хитозане Изучена зависимость амидазной активности от температуры и определены константы Определено, термоинактивации что для свободной фермента в и иммобилизованной растворе температурный амидазы. оптимум 240 трансформации акриламида находился в пределах 40–50˚С, для иммобилизованного – 45–55˚С (Рисунок 80). Показано, что при воздействии повышенной температуры иммобилизованный фермент более стабилен, чем находящийся в растворе (Таблица 30). Так, активность иммобилизованной амидазы при воздействии температуры 50°С в течение 30 мин повышалась по сравнению с измеренной при 25°С, а при экспозиции в течение часа при 60°С сохранялось около 90%, тогда как у фермента в растворе – всего 30% активности (Рисунок 81, а, б). Прогрев как свободного, так и иммобилизованного фермента при 70°С в течение 45 мин приводил к полной инактивации (Рисунок 81, в). Следовательно, ковалентная сшивка амидазы с носителем приводит к стабилизации ее структуры, предотвращая диссоциацию на субъединицы при повышении температуры, что приводит к повышению термостабильности иммобилизованного фермента. Таблица 30 – Термоинактивация свободной и иммобилизованной амидазы Кин, мин-1 Амидаза 50°С 60°С 70°С В растворе 6,1 × 10-3 2,9 × 10-2 1,2 × 10-1 Иммобилизованная 2,3 × 10-3 2,3 × 10-2 1,0 × 10-1 241 Сохранение активности, % 100 2 1 80 60 40 20 0 10 Рисунок 30 80 – 50 Температура, °С Зависимость 70 активности амидазы в растворе (1) и иммобилизованной на активированном хитозане (2) от температуры. 100% – максимальная активность свободной и иммобилизованной соответственно Сохранение активности, % 160 (а) 120 1 80 2 40 0 0 10 20 30 Время, мин 40 50 60 амидазы 242 (б) Сохранение активности, % 100 1 80 60 2 40 20 0 0 10 20 40 50 60 40 50 60 (в) 100 Сохранение активности, % 30 Время, мин 80 60 1 40 2 20 0 0 10 20 30 Время, мин Рисунок 81 – Термоинактивация (%) амидазы при 50 (а), 60 (б) и 70ºС (в): 1 – иммобилизованной на активированном хитозане; 2 – в растворе. 100% – активность амидазы при 25ºС 243 Операционная стабильность амидазы, иммобилизованной на хитозане Изучена операционная стабильность амидазы, ковалентно присоединенной к активированному хитозану. При проведении последовательных циклов конверсии акриламида установлено, что иммобилизованный ферментный препарат сохраняет около 20% активности, измеренной в первом цикле, при 5кратной трансформации (Рисунок 82). За 144 ч при последовательной конверсии 0,05 М раствора акриламида 0,84 мг фермента катализировали синтез 32 мг акриловой кислоты. Из работы H.J. Park с соавторами известно, что поперечно-сшитые агрегаты амидазы R. erythropolis сохраняют 96% активности после 3-х циклов конверсии изобутирамида [321]. Авторы ограничились тремя реакционными циклами, что может быть связано со сложностью многократного использования CLEAs. Очевидно, что для многоцикловой конверсии предпочтительнее использовать фермент, иммобилизованный на нерастворимом носителе. Удельная активность, мкмоль/мг/мин 0.4 0.3 0.2 0.1 0 24 48 72 96 120 Продолжительность циклов реакции, ч 144 Рисунок 82 – Операционная стабильность амидазы, иммобилизованной на хитозане, активированном бензохиноном 244 5.3. Стереоселективный гидролиз рацемического лактамида иммобилизованной амидазой Стереоселективные свойства свободной и иммобилизованной амидазы R. rhodochrous 4-1 изучали в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида до D- и L-изомеров молочной кислоты. Отмечено, что при ковалентной сшивке фермента с активированным хитозаном стереоселективность реакции снижается (Таблица 31). Так, соотношение D- и L- энантиомеров молочной кислоты в реакции, катализируемой ферментом в растворе, составило 89 и 11%, тогда как в реакции, катализируемой ковалентно присоединенной к хитозану амидазой – 59 и 41%. Было изучено влияние адсорбционной иммобилизации на углеродсодержащих носителях на активность и стереоселективность амидазы. Установлено, что при адсорбции амидаза сохраняет лишь 18% активности нативного фермента. Показано, что фермент, иммобилизованный на СУМС, гидролизовал лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 60 к 40%, тогда как фермент, адсорбированный на Сибуните, гидролизовал лактамид без стереоселективности (Таблица 31). С другой стороны, адсорбция амидазы стереоизомеров в на «Сапропеле» сторону приводила D-лактата. к Можно сдвигу соотношения предположить, что стереоселективность реакции снижается как за счет изменения скорости образования энантиомеров, так и в результате влияния гетерогенной среды, в частности, свойств носителей, на рацемизацию полученных продуктов реакции гидролиза лактамида. При контакте смеси D- и L-изомеров молочной кислоты в соотношении 4 : 1 с СУМС в течение 1 ч при 22ºС происходило превращение смеси в L-изомер, с Сибунитом – в D-изомер. Так как эти данные не согласуются с результатами трансформации рацемического лактамида амидазой, адсорбированной на этих носителях, можно заключить, что на процесс снижения энантиоселективности реакции влияет не только микроокружение фермента, 245 создаваемое углеродным носителем, но и особенности образования ферментсубстратного комплекса у адсорбированной амидазы. Были получены поперечно-сшитые агрегаты фермента (ПСАФ) при высаливании сульфатом аммония с одновременной сшивкой бифункциональными реагентами – глутаровым альдегидом и бензохиноном. Установлено, что при сшивании молекул амидазы бензохиноном сохраняется около 9% исходной активности фермента, глутаровым альдегидом – около 30% активности. Было показано, что иммобилизованная амидаза, полученная данным методом, проявляет более высокую D-стереоселективность, чем фермент в растворе. Так, биокатализатор, полученный сшивкой глутаровым альдегидом, катализировал гидролиз D,L-лактамида с энантиомерным избытком D-изомера до 94%. 246 Таблица 31 – Каталитические и стереоселективные свойства амидазы, иммобилизованной различными методами Активность, мкмоль/мг·мин ee, % по акриламиду по лактамиду Количество связанного белка, % 4,17 (100) 3,80 (100) 100 89 : 11 78 на Сибуните 1,18 (28) 0,68 (18) 59 50 : 50 0 на СУМС 0,83 (20) 0,57 (15) 67 60 : 40 20 на «Сапропеле» - 0,08 (16) 11 93 : 7 86 2,50 (60) 1,60 (42) 38 59 : 41 18 1,34 (32) 1,14 (30) 100 96 : 4 92 0,44 (10) 0,34 (9) 100 84 : 16 68 (% сохранения активности) Амидаза В растворе Адсорбированная Соотношение энантиомеров молочной кислоты активированному хитозану глутаровый ПСАФ альдегид бензохинон 246 Ковалентно присоединенная к D : L, % 247 Изучено влияние температуры на стереоселективные свойства ковалентно иммобилизованной и свободной амидазы. Было показано, что образование изомеров молочной кислоты происходит в диапазоне температур от 25 до 60°С, при этом максимальный энантиомерный избыток (ее), равный 29%, наблюдался у ковалентно присоединенной к хитозану амидазы при 60°С (Рисунок 83). (а) 1.8 1.4 60 2 1 50 1.2 1 40 0.8 30 0.6 ее, % Удельная активность, мкмоль/мг/мин 1.6 70 20 0.4 10 0.2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Температура, °С (б) 30 25 1 20 1 0.8 0.6 15 0.4 10 0.2 5 2 0 0 10 30 50 Температура, °С 70 ее, % Удельная активность, мкмоль/мг/мин 1.2 248 (в) 80 1.6 60 1 1.2 2 40 0.8 ее, % Удельная активность, мкмоль/мг/мин 2 20 0.4 0 0 10 30 50 Температура, °С 70 Рисунок 83 – Зависимость скорости реакции гидролиза рацемического лактамида и стереоселективности амидазы в растворе (а), иммобилизованной на активированном хитозане (б), ПСАФ амидазы, полученных сшивкой глутаровым альдегидом (в), от температуры: 1 – энантиомерный избыток (ee), %; 2 – активность, мкмоль/мг/мин Максимальный ее у ПСАФ амидазы, полученных сшивкой глутаровым альдегидом, достигал 77–78% при 40–60°С. У свободного фермента максимальный энантиомерный избыток наблюдался при 40°С. Сдвиг максимума энантиоселективности ковалентно сшитого фермента в сторону более высоких температур может объясняться стабилизацией определенной конформации амидазы, более предпочтительной для образования фермент-субстратного комплекса с D-изомером лактамида. Температура ниже 20°С и выше 60°С приводила к снижению энантиоселективности. Известно, что энантиоселективность является результатом разницы между свободной энергией активации энантиомеров, которая имеет энтальпический и энтропический компонент. В данном случае образование комплекса D-изомера с активным центром амидазы энтальпически выгодно, но энтропически не выгодно. Другим 249 значимым параметром является температура рацемизации [242]. В данном случае нагрев реакционной смеси до 70°С приводил к резкому снижению энантиоселективности даже в случае ферментов, стабилизированных за счет ковалентной сшивки. По литературным данным, для ПСАФ нитрилазы, гидролизующих рацемический нитрил миндальной кислоты до (R)-миндальной кислоты, увеличение энантиоселективности наблюдалось при снижении температуры, что, тем не менее, сопровождалось нежелательным падением скорости реакции [242]. В данном случае, предпочтительность ковалентносшитой амидазы для стереоселективного гидролиза заключается в совпадении максимумов активности и энантиоселективности. Таким образом, для проявления стереоселективности амидазы в гетерогенном катализе определяющим является присутствие носителя, который может привести к сдвигу в соотношении образующихся энантиомеров. В этом случае перспективным представляется метод иммобилизации без носителя, а именно образование ПСАФ, приводящий к стабилизации фермента за счет образующихся поперечных сшивок бифункциональными реагентами. Другим возможным решением может быть тщательный подбор носителя, который обеспечит увеличение энантиомерной чистоты образующегося продукта. Анализируя результаты, касающиеся гетерогенного биокатализа нитрилов и амидов, осуществляемого иммобилизованными ферментами метаболизма нитрилов, следует отметить основные особенности, присущие биокатализаторам, иммобилизованным различными методами. Так, в подавляющем большинстве случаев, иммобилизация ферментов приводила к снижению активности, причем для различных методов и носителей степень этого снижения была различной. Наибольшее снижение активности было отмечено при адсорбционной иммобилизации нитрилгидратазы на углеродсодержащих носителях, когда сохранение нитрилгидратазной активности не превышало 2% от исходной. На оксидах алюминия без углерода сохранение активности было чуть большим – до 10%. Активность нитрилазы, адсорбированной на «Сапропеле», снижалась в 2 раза, а амидазы, иммобилизованной на углеродсодержащих носителях, – на 70– 250 80%. Потери активности ковалентно присоединенных к активированному хитозану ферментов были меньшими – до 40% у амидазы, до 50% у нитрилазы, в некоторых случаях у нитрилгидратазы отмечали сохранение активности (при учете связывания образующегося акриламида хитозаном). В этом случае можно заключить, что адсорбция, особенно на углеродсодержащих носителях, в большинстве изученных случаев менее благоприятна для сохранения активности, чем ковалентная сшивка с активированным хитозаном. Возможно, это связано с гидрофобностью углеродных носителей, которые частично разрушают гидратную оболочку ферментов, необходимую для работы активного центра [277, 377]. Другой немаловажной характеристикой иммобилизованных ферментов является их способность к многоцикловому функционированию, о чем свидетельствует операционная стабильность, оцененная по сохранению активности при периодической конверсии субстрата. У всех иммобилизованных препаратов ферментов гидролиза нитрилов отмечена возможность многократного использования. Операционная стабильность проявлялась в разной степени – адсорбированная на немодифицированных и углеродсодержащих оксидах алюминия нитрилгидратаза проявляла активность при работе в течение 5–6 циклов, нитрилаза на «Сапропеле» – до 16 циклов. Наибольшую операционную стабильность проявила нитрилгидратаза, ковалентно сшитая с активированным хитозаном – активность не ниже таковой, измеренной в первом цикле реакции, сохранялась на протяжении 50-ти последовательных циклов. У ковалентно сшитой амидазы и нитрилазы активность была отмечена на протяжении 6 и 10 циклов соответственно. Общей чертой изученных иммобилизованных ферментов метаболизма нитрилов явилось увеличение их термостабильности и температурного оптимума активности. Возможность работы фермента при высоких температурах в большей степени обеспечивалась адсорбционной иммобилизацией, так, нитрилгидратаза на неорганических носителях была активна даже при 70ºС, тогда как у фермента, ковалентно присоединенного к активированному хитозану, при этой температуре активности не наблюдалось. Нитрилаза, адсорбированная на «Сапропеле», при 251 80ºС сохраняла 20% от максимальной активности. Термостабильность ковалентно сшитой амидазы и нитрилазы возрастала незначительно. Эффект возрастания устойчивости фермента к действию повышенных температур, по всей вероятности, связан с двумя факторами – стабилизацией субъединичной структуры ферментов как при адсорбции, так и при ковалентной сшивке, обеспечивающей уменьшение подвижности молекул, и защитным действием неорганических адсорбентов. За счет меньшей теплопроводности носителей по сравнению с водой, адсорбированный фермент находится в более выгодных условиях, чем находящийся в растворе или присоединенный к активированному органическому носителю, такому, как хитозан. Изменение рН-профиля активности нитрилгидролизующих ферментов при их иммобилизации во многом зависит от природы носителя. Так, сдвиг максимума активности в кислую сторону и отсутствие ингибирования активности при кислых значениях рН, проявляющееся при иммобилизации на хитозане и «Сапропеле», по всей вероятности, связано с защелачивающим действием этих носителей. Так, в микроокружении фермента создается более щелочная среда, позволяющая ферменту функционировать даже при сильном закислении макроокружения. Наибольшая стереоселективнось амидазы отмечена при ее иммобилизации методом ПСАФ (в отсутствии носителя), снижение энантиомерной чистоты получаемого продукта наблюдалось при низких (менее 40ºС) и высоких (более 60ºС) температурах, причем максимум стереоселективности совпадал с пиком активности. Таким образом, впервые была показана перспективность иммобилизации нитрилгидратазы методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным 0,1% бензохиноном, заключающаяся, главным образом, в высокой операционной стабильности (не менее 50 циклов без снижения активности, измеренной в первом цикле) и устойчивости к низким рН, а также перспективность создания поперечно-сшитых агрегатов амидазы для повышения оптической чистоты продукта стереоселективного гидролиза рацемических амидов. 252 ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основе сравнительного анализа трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот иммобилизованными биокатализаторами выявлены закономерности гетерогенного процесса, катализируемого адгезированными бактериальными нитрилазной клетками, и обладающими выраженной амидазной высокой нитрилгидратазной, активностью; биопленками нитрилгидролизующих бактерий, полученными в процессе культивирования с носителем, и иммобилизованным ферментным препаратом нитрилгидратазы, нитрилазы и амидазы. Преимущества гетерогенного биокаталитического процесса над гомогенным отмечены достаточно давно: это стабилизация ферментативной активности, легкость отделения биокатализатора от среды, возможность создания непрерывных технологий. Но на настоящий момент остаются невыясненными ряд положений, а именно, в чем заключаются и с чем связаны физиологические изменения, протекающие в бактериальных клетках при их адгезии на твердом нерастворимом носителе; возможно ли управлять биотехнологическим процессом с помощью подбора носителя для иммобилизации клеток; как перейти от эмпирического трудозатратного подбора методов иммобилизации биокатализаторов и используемых носителей к научным основам создания гетерогенных биокатализаторов. Основываясь на полученных в диссертационной работе результатах, составлена схема взаимодействия компонентов гетерогенного биокаталитического процесса (Рисунок 84): для адгезии бактериальных клеток предпочтительны макропористые носители с шероховатой поверхностью, совпадающие по степени гидрофобности с поверхностью клетки, для адсорбции ферментов метаболизма нитрилов – мезопористые материалы преимущественно с гидрофильной поверхностью; для конверсии алифатических субстратов – активированные адсорбенты, ароматических – неактивированные. 253 Гетерогенный биокаталитический процесс Биологический объект с каталитической активностью Изолированный фермент Носитель Мезопористый Макропористый Бактериальная клетка Шероховатая поверхность Гидрофильная поверхность Гидрофобная поверхность Алифатические субстраты и продукты Химическая природа субстратов и продуктов реакции Гладкая поверхность Гидрофильный Гидрофобный Активированный Неактивированный Ароматические субстраты и продукты Рисунок 84 – Схема взаимодействия компонентов гетерогенного биокаталитического процесса, основанного на адгезированных бактериальных клетках и адсорбированных ферментах На основании результатов диссертационной работы был предложен алгоритм изучения свойств гетерогенного биокатализатора (Рисунок 85): 254 Связывание/адсорбция ферментов (адгезия клеток микроорганизмов) на носителе нет есть Ферментативная активность возрастает сохраняется ингибируется Динамика трансформации органического вещества эквимолярная не эквимолярная Операционная стабильность высокая низкая Адсорбция субстратов и продуктов реакции есть нет / минимальна Стереоселективность реакции (если необходимо) повышается остается без изменений снижается Эффективный гетерогенный биокатализатор Рисунок 85 – Алгоритм изучения свойств гетерогенного биокатализатора 255 Алгоритм заключается в последовательном изучении ряда характеристик иммобилизованной биологической составляющей гетерогенного процесса. На первом этапе определяют, есть ли связывание фермента или адгезия клеток на нерастворимом носителе. Если количество связанного фермента (адгезированных клеток) достаточно – например, в процессе, рассмотренном нами, принимался минимум 1 мг АСБ адгезированных клеток на 1 г носителя для дальнейшего изучения, – следующим этапом являлось проведение ферментативной реакции с целью определения сохранения каталитической активности иммобилизованного биокатализатора. В процессе проведения ферментативной реакции проводили отбор проб через разные промежутки времени для изучения динамики трансформации. Так, при трансформации ароматических субстратов бактериальными клетками, адгезированными на активированных углеродных адсорбентах, наблюдали неэквимолярную конверсию вещества – при полном расходовании субстрата в реакционной среде продукт не был образован в равном количестве. В этом случае целесообразно определение адсорбции субстратов и продуктов реакции на носителе. На конечном этапе изучения следует определить операционную стабильность иммобилизованного биокатализатора – при возможности его многоциклового использования подтверждается эффективность полученного гетерогенного биокатализатора. В диссертационной биокатализатора: 1) работе бактериальные рассмотрено клетки, три типа гетерогенного адгезированные на твердом нерастворимом носителе, в основном углеродном или углеродсодержащем (активные угли, углеродные синтезированным слоем волокна, углерода, бактериальные биопленки, изолированные ферменты, композиционные углеродные выращенные на нанотрубки нерастворимом иммобилизованные материалы методом и с т.д.); 2) носителе; 3) адсорбции на неорганических носителях или ковалентной сшивкой с активированным органическим носителем. Подавляющее большинство исследований, касающихся создания гетерогенного биокатализатора на основе клеток микроорганизмов, посвящено 256 методу включения клеток в структуру гелей. Это справедливо и для изучения иммобилизованных клеток нитрилгидролизующих бактерий [83, 166, 181, 182, 229, 303, 328, 391]. Действительно, этот метод интересен эффективным «захватом» клеток матрицей геля, предотвращающим их вымывание в реакционную среду, а также возможностью создания различных технологически удобных форм биокатализатора. Однако, как подтверждают многочисленные исследования, основной проблемой такого биокатализатора становится затруднение массопереноса субстратов и продуктов в гранулах геля, что приводит к снижению активности биотехнологического иммобилизованных процесса. Кроме того, клеток и продуктивности снижение ферментативной активности может происходить в результате различных физико-химических воздействий при фазовых переходах золь/гель: так, жидкое состояние термотропных гелей, к которым относятся, например, агар, агароза и каррагинаны, достигается при повышенных температурах, что отрицательно сказывается на ферментативной активности; отвердение ионотропных гелей требует присутствия определенных ионов (кальция, бария, стронция) [406]; полимеризация ковалентносшитых гелей (ПАА) происходит в присутствии высоко реакционноспособных веществ и является экзотермической. В свою очередь, адгезия бактериальных клеток возвращает микроорганизм в естественное «прикрепленное» состояние и предполагает создание защитного микроокружения. Ряд авторов подтверждает, что сорбционный метод иммобилизации микроорганизмов на различных носителях позволяет значительно повысить эффективность биокатализа и биодеградации, кроме того, он прост в реализации и не оказывает стрессовых воздействий на клетки [4]. Углеродные или углеродсодержащие адсорбенты были выбраны в качестве носителей неслучайно: углерод может считаться одним из наиболее «биосовместимых» химических элементов, является основой органических веществ, химически инертен в нормальных условиях. Возможность применения углеродных адсорбентов для иммобилизации микробных клеток была описана в работах, связанных с биодеградацией загрязняющих веществ [40, 98, 127, 400]. Синтезу 257 композиционных материалов с поверхностным слоем углерода и изучению их как носителей для иммобилизации клеток микроорганизмов посвящены работы Г.А. Коваленко с соавторами [29, 57, 58, 151]. Для создания гетерогенного биокатализатора гидролиза нитрилов и амидов на основе нерастущих бактериальных клеток углеродные адсорбенты были применены впервые. Было проведено сравнение широкого ряда углеродных носителей для иммобилизации клеток: активные угли (БАУ, Norit PK 1-3, ФТД), уголь-сырец (порошкообразный, дробленый), волокнистые углеродные материалы (Карбопон, Карбопон-В-актив, Урал ТМ-4), углеродные материалы (на основе фуриловой смолы – ФАС, на основе карбонизированных илистых отложений пресных озер – «Сапропель», на основе графитизированной сажи – Сибунит), композиционные материалы (керамзит со слоем синтезированного слоя КВУ и графитоподобного углерода, стеклопена со слоем КВУ), массивный КВУ, пеноуглерод марки ТУМаН, многослойные углеродные нанотрубки. Как отражено в алгоритме исследования эффективности гетерогенного биокатализатора, на первом этапе оценивали адгезию бактериальных клеток на носителях и изучали зависимость массы адгезированных клеток от их концентрации в суспензии, используя полученные данные для построения изотерм адсорбции. Объектами изучения являлись бактериальные штаммы, различающиеся строением и гидрофобногидрофильными характеристиками клеточной стенки: грамположительные Rhodococcus ruber gt1 и R. erythropolis 11-2 (поверхность которых, следуя BACHтесту, оценивалась как гидрофобная – 41–52% клеток переходило в фазу гексадекана), грамотрицательные Pseudomonas fluorescens C2 и Acinetobacter guillouiae 11h с гидрофильной поверхностью клетки (соответственно 6 и 5% клеток при распределении между фазами гексадекан/вода переходило в фазу гексадекана), Alcaligenes faecalis 2, поверхность клеток которых может быть оценена как слабо гидрофобная (18,5%). Следует отметить, что родококки адгезировались на всех изученных углеродных носителях, вне зависимости от степени их гидрофобности, оцененной по адсорбции нафталина. Так, на массивном КВУ, степень гидрофобности которого была равна 0, из бактериальной 258 суспензии концентрацией 1 мг/мл адгезировалось 7 мг сухих клеток/г носителя, тогда как 8 мг клеток адгезировалось на носителе марки ФАС, гидрофобность которого составляла 55%. В то же время, корреляционный анализ показал умеренную положительную связь между гидрофобностью носителя и массой адгезированных клеток R. ruber gt1 (r=0,679; p=0,05). Была выявлена сильная положительная связь между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и их адгезией на гидрофобных углеродных материалах (БАУ, Norit PK 1-3, ФТД, ФАС): от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). Адгезия клеток P. fluorescens C2, поверхность которых оценивалась как гидрофильная, на неактивированных углеродных носителях была мала (менее 1 мг сухих клеток на г носителя), что затрудняло построение изотерм адсорбции. Лишь на активированных носителях (Карбопон-В-актив, БАУ) масса адгезированных клеток псевдомонад достигала 6 мг/г. Адгезия микроорганизмов является комплексным процессом, в который вовлечены взаимодействия на уровне поверхности клетки. Первоначально адгезия бактерий к абиотическим поверхностям опосредована неспецифическими взаимодействиями. Адгезия зависит от таких факторов, как ионная сила и состав среды, рН, температура, время контакта и концентрация клеток, заряд поверхности, гидрофильность/гидрофобность, пористость, шероховатость и микротопография поверхности [118, 217, 297]. Сопоставляя собственные результаты по иммобилизации клеток R. ruber gt1 на различных углеродных материалах с накопленными сведениями о бактериальной адгезии, можно заключить, что на адгезию влияет не только гидрофобность носителя, а целый комплекс характеристик: дисперсность и наличие макропор, от которых зависит площадь удельной поверхности материала, тип поверхности носителя (шероховатая/гладкая), обеспечивающий оптимальный контакт с поверхностью бактерии, активация углеродного адсорбента. Однако корреляция между массой адгезированных клеток и дисперсностью материала была определена как слабая (r=0,220; p=0,05), а корреляционная связь между массой адгезированных клеток и 259 шероховатостью поверхности носителя была недостоверной, что подтверждает превалирование гидрофобных взаимодействий при адгезии клеток на поверхности носителя. Известно, что наружная поверхность клеточной стенки родококков шероховатая, неровная, со множественными выступами и шишковидными выростами, содержащими адгезины, которые характеризуются повышенной степенью гидрофобности, что позволяет бактериальным клеткам легко преодолевать электростатическое отталкивание при сближении с носителем [10]. Интересно, что при адгезии родококков на активированном носителе БАУ изотермы адсорбции имеют вид изотерм БЭТ, что свидетельствует о переходе монослойной адсорбции в полислойную при достижении определенной концентрации клеток в суспензии, тогда как изотермы адсорбции бактериальных клеток на волокнистых углеродных и композиционных материалах с синтезированным углеродным слоем на поверхности, а также на носителях Сибунит и «Сапропель» имеют вид изотерм Лэнгмюра, что подтверждает формирование монослоя клеток на поверхности носителя. Если взаимодействие бактериальной клетки, имеющей микрометровые размеры, с нерастворимым носителем происходит по принципу адгезии клетки на его поверхности, то, как и следовало ожидать, взаимодействие клетки с нанообъектами происходит по иному принципу. Сканирующая электронная микроскопия выявила агрегацию бактериальных клеток в присутствии нанотрубок. Показано, что агрегация позволяет беспрепятственно отделять биокатализатор от реакционной среды при использовании бумажных фильтров, через поры которых профильтровываются единичные клетки, находящиеся в суспензии. Впервые обоснована возможность создания гетерогенного биокатализатора на основе агрегатов бактериальных клеток с очищенными многослойными углеродными нанотрубками. Изучение влияния углеродных нанотрубок на жизнеспособность бактерий, проведенное разными исследователями, дало противоречивые результаты. Так, некоторые авторы утверждают наличие у нанотрубок сильной антимикробной активности, выявленной как при воздействии на споры, так и на вегетативные 260 клетки, которое заключается в локализованном нарушении клеточной стенки углеродными нанотрубками, действующими как «шприцы». Более того, ведется речь о новой технологии (CNT – carbon nanotube technology), обеспечивающей обеззараживание воды путем концентрирования патогенов и нарушения их жизнеспособности [103, 374]. S. Kang с соавторами одними из первых привлекли внимание к цитотоксическому действию одностенных нанотрубок в отношении бактериальных клеток [111, 374], в то же время в ряде работ подчеркивается антибактериальная активность многостенных углеродных нанотрубок [395, 418]. Следует отметить, что еще в пионерских исследованиях, посвященных биопленкам морских микроорганизмов, высказывались идеи об отрицательном влиянии на бактериальную клетку объектов, имеющих меньшие размеры [420]. С другой стороны, Д.Г. Дерябин с соавт. методом атомно-силовой микроскопии показали, что контакт многостенных и ряда одностенных углеродных нанотрубок с поверхностью E. coli не сопровождается изменением морфологии и жизнеспособности воздействия модельного нанотрубок на организма [25]. Также бактериальную интересен популяцию в эффект целом. Экспериментальное внесение нанотрубок в почву в концентрации 1000 мг/кг привело к снижению количества представителей родов Derxia, Holophaga, Opitutus и Waddlia, тогда как количество бактерий, относящихся к родам Rhodococcus, Cellulomonas, Nocardioides и Pseudomonas, которые известны своей способностью деградировать трудноразлагаемые соединения, увеличилось [97]. Углеродные нанотрубки могут быть полезны для биоремедиации, при удалении поллютантов, особенно органики, которая не может быть легко сконцентрирована при использовании удаления токсина другого микропористого цианобактерий адсорбента. посредством Ralstonia Эффективность solanacearum, формирующей биопленки на нанотрубках, была на 20% выше, чем его удаление отдельно нанотрубками путем адсорбции или неиммобилизованными бактериями [189]. Биодеградация трихлорэтилена в грунтовых водах осуществлялась бактериями, иммобилизованными на нанотрубках, при этом поллютант вначале адсорбировался нанотрубками, а затем удалялся иммобилизованными бактериями 261 [399]. Таким образом, углеродные нанотрубки рассматриваются как мультифункциональный адсорбент, хотя вопрос, касающийся их токсичности и биосовместимости, остается спорным [383]. Нами, в свою очередь, было подтверждено сохранение ферментативной активности агрегатов как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий при их взаимодействии с очищенными нанотрубками, тогда как агрегация клеток с неочищенными МУНТ приводила к значительному снижению активности, вероятно, вследствие отрицательного воздействия технологических примесей на физиологическое состояние клетки. Определена эффективность функционирования иммобилизованной системы (η), выраженная как отношение ферментативной активности адгезированных клеток к активности клеток в суспензии. Показано, что в подавляющем большинстве случаев при конверсии алифатического субстрата адгезированными клетками R. ruber gt1, обладающими нитрилгидратазной активностью, η была больше 1. Это означает, что активность иммобилизованных клеток не только сохранялась, но и увеличивалась по сравнению с интактными. По убыванию η ряд носителей распределился следующим образом: «Сапропель» > Сибунит > Керамзит/КВУ (6.47% С) > Керамзит/КВУ (3.63% С) > уголь-сырец > ФТД > ФАС > БАУ > Norit PK 1-3 > Карбопон > КВУ массивный > Урал ТМ-4 > Карбопон-Вактив > Керамзит/графитоподобный слой. Отмечено, что только для носителей Карбопон-В-актив, Керамзит/графитоподобный слой и шунгит η была меньше 1. В то же время, по операционной стабильности иммобилизованных биокатализаторов, определенной как количество последовательных циклов конверсии субстрата (n), в которых сохраняется не менее 50% активности, измеренной в первом цикле, ряд носителей распределился следующим образом: Керамзит/КВУ (6,47% С) > БАУ = Norit PK 1-3 = уголь-сырец > ФТД = Урал ТМ4 = Карбопон = ФАС = КВУ массивный > Керамзит/КВУ (3,63% С) > КарбопонВ-актив > «Сапропель» > Сибунит = Керамзит/графитоподобный слой. Сравнивая эти два ряда, по сочетанию η и n можно составить интегративный ряд от наиболее к наименее предпочтительному адсорбенту в данном процессе: Керамзит/КВУ 262 (6,47% С) > уголь-сырец > БАУ > ФТД > Norit PK 1-3 > «Сапропель» > Керамзит/КВУ (3,63% С) > Сибунит = ФАС > Карбопон > Урал ТМ-4 > КВУ массивный > Карбопон-В-актив > Керамзит/графитоподобный слой. Таким образом, наилучшим адсорбентом, сочетающим в себе максимальные значения η и n, был керамзит с синтезированным на поверхности слоем КВУ с содержанием С до 6,47 вес%. Такие адсорбенты, как активные угли БАУ, Norit PK 1-3, ФТД и неактивированный порошкообразный уголь-сырец как по значению η, так и по значению n занимали промежуточное положение, что, наряду с анализом нагрузки этих адсорбентов клетками, подтверждает эффективность их использования в качестве носителей бактериальных клеток, обладающих гидрофобной клеточной стенкой. Наихудшие результаты, как по значению η, так и по значению n были получены для керамзита с синтезированным на поверхности гладким графитоподобным слоем, что, в свою очередь, указывает на неэффективность такого адсорбента, по-видимому, обусловленную гладкой поверхностью и отсутствием макропор. Факты увеличения ферментативной активности иммобилизованных клеток обсуждались в научной литературе неоднократно, но до сих пор не выработано единого мнения о причинах этого феномена. Высказываются идеи как о стрессовом состоянии иммобилизованных клеток, так и, наоборот, о менее стрессовых условиях прикрепленного образа существования. Так, к стрессовым воздействиям окружающей среды в данном случае можно отнести снижение активности воды и доступа кислорода, что приводит к компенсаторным изменениям в концентрации промежуточных метаболитов у иммобилизованных клеток, за которыми следует сдвиг в сторону альтернативных метаболических путей [360]. Вышеперечисленные эффекты наблюдаются у клеток, включенных в структуру геля. Наоборот, есть данные, свидетельствующие о снижении стрессовых факторов окружающей среды при прикреплении клетки, возможно, связанные с защитным микроокружением, которое создает носитель. Результаты изучения экспрессии стресс-зависимых генов HSP12 и SSA3 у дрожжей подтвердили, что иммобилизованные клетки в основном находятся в менее 263 стрессовых условиях, чем свободносуспендированные. Также иммобилизация оказывает большое влияние на свойства плазматической мембраны, что может стать причиной изменений в ряде транспортных систем [230]. Изучение физиологии адгезированных бактериальных клеток в диссертационной работе затрагивало один из аспектов клеточного метаболизма – содержание внутриклеточного АТФ. Определение пула АТФ нацелено, главным образом, на определение количества жизнеспособных клеток [110], что особенно актуально в случае сессильных форм, когда другие способы оценки вызывают затруднение [102, 134]. Кроме того, содержание АТФ в клетке может служить индикатором ее метаболического статуса и позволяет оценить влияние различных факторов, в том числе, биоцидов [51], антибиотиков [104], температуры культивирования [267] и др. Определение концентрации АТФ в расчете на биомассу позволяло судить о метаболическом состоянии биопленок анаэробов в процессе роста [101]. В работе Е.Н. Ефременко для экспресс-оценки физиологического состояния гетерогенных биокатализаторов был предложен метод АТФ-метрии, основанный на люциферин-люциферазной реакции [16]. Изменение концентрации АТФ в клетке, как возрастание в результате разобщения энергетического и конструктивного обмена, так и падение, свидетельствует о стрессовом состоянии микробной клетки [62, 72], так, отмечено, что аккумуляция АТФ в клетке E. coli при воздействии антибиотиков была обусловлена ингибированием процессов потребления энергии [104]. По нашим данным, необратимая адгезия приводит к снижению пула АТФ в клетке, причем степень снижения зависит от носителя. Рост бактерий в периодической культуре на жидких средах может быть представлен графически в виде классической кривой, которая начинается с лагфазы, характеризующейся адаптацией культуры к субстрату без нарастания биомассы [42]. Лаг-фаза на сегодняшний день является наименее изученной стадией развития микробной культуры. У Salmonella enterica серовар Typhimurium наблюдали статистически значимые изменения экспрессии 2657 генов (более чем половина генома) в клетках, взятых в одной временной точке 264 лаг-фазы, по сравнению с инокулюмом стационарной фазы роста [264]. Данные, касающиеся уровня АТФ в клетках лаг-фазы периодической культуры микроорганизмов, в научной литературе представлены достаточно скудно. В работе Ю.К. Кудыкиной отмечается, что в процессах реактивации микобактерий в лаг-фазе вначале активируется аденилатциклаза, повышается уровень цАМФ, и, как следствие, в клетке начинается синтез нуклеиновых кислот и активация других звеньев метаболизма, что, в конечном счете, приводит к делению клетки [32]. У дрожжей отмечается гипераккумуляция цАМФ в клетках лаг-фазы [392]. В свою очередь, известно, что концентрация цАМФ в клетке обратно пропорциональна концентрации АТФ [54]. С.Ю. Митяшиной было показано, что введение в среду культивирования Desulfovibrio desulfuricans В-1388 5% окиси углерода приводит к снижению содержания АТФ в клетках в первые 5 часов роста, которые соответствуют лаг-фазе [39]. В работе Е.Б. Тихоновой с соавторами показано, что в первые часы роста Rhodococcus minimus происходит уменьшение пула АТФ в клетке одновременно с увеличением интенсивности дыхания, хотя выраженной лаг-фазы в данных экспериментах авторы не наблюдали [70]. Возможно, при адгезии происходит подобный процесс, когда клетка, прикрепившись к нерастворимому носителю, проходит стадию адаптации, которая характеризуется падением концентрации АТФ в клетке. Кроме того, для начальных стадий образования биопленки необходим синтез протеинов [311], что в свою очередь требует затрат энергии. Для адгезии живых организмов характерны специфичность, вовлечение органелл типа жгутиков и фимбрий и метаболический контроль. При этом затраты метаболического потенциала на процесс адгезии велики: синтез собственно адгезинов (белки или гликопептиды), антиадгезинов, сигнальных молекул [52]. Нами выдвинута гипотеза, по которой адгезия клеток бактерий на нерастворимом субстрате может быть приравнена к лаг-фазе периодической культуры, в процессе которой происходит перестройка микроорганизма в ответ на новые условия существования. 265 По-видимому, адгезию микроорганизмов не следует рассматривать как стрессовый фактор в классическом понимании этого слова, т.к. адгезия – естественный, присущий всем микроорганизмам процесс, не связанный с опасными для жизнедеятельности клетки воздействиями. Действительно, к стрессовым факторам, которые влияют на бактериальную клетку, могут быть отнесены такие явления, как голодание, высокая осмолярность, высокая или низкая температура, неоптимальный рН. Однако прикрепление к поверхности твердых тел является естественным механизмом адаптации, придающим клеткам большую устойчивость к различным факторам внешней среды. Известно, что стринджент-ответ, представляющий собой согласованное торможение синтеза белка, РНК, ДНК и пептидогликана при сильных стрессорных воздействиях, связанных со значительным замедлением скорости роста при исчерпании источников питания в среде, вносит существенный вклад в регуляцию многих процессов, ассоциированных с ростом, вторичным метаболизмом, персистенцией, образованием биопленок. В настоящее время принято считать, что стринджент-ответ представляет собой универсальную реакцию клеток на любой вид стресса, сопровождающийся задержкой или полной остановкой роста, какова бы ни была ее причина, например, вступление клеток в стационарную фазу роста или лаг-фазу во время диауксического роста. Известно, что основной промотор rpoS (гена, кодирующего σS-субъединицу РНКполимеразы) в 5–10 раз повышает транскрипцию при вступлении микроорганизмов в стационарную фазу, а трансляция уже существующей мРНК rpoS стимулируется, в том числе, в ответ на высокую плотность клеток в культуре [71]. Когда бактерии растут в периодической культуре на полноценной среде, внутриклеточная концентрация белка RpoS резко повышается в стационарной фазе роста и σS-ассоциированная форма РНК-полимеразы становится основной формой РНК-полимеразы, активной на этой стадии роста [265]. При адгезии значительно повышается плотность клеток даже по сравнению с суспензией в стационарной фазе роста. Таким образом, адгезия клеток бактерий на нерастворимом субстрате приводит к запуску ряда адаптивных механизмов 266 клетки. Эти реакции, в свою очередь, сопровождаются снижением внутриклеточного пула АТФ. В работе S.L. Kinniment и J.W.T. Wimpenny было показано, что биопленки P. aeruginosae, находящиеся в «квазистационарном» состоянии (55 и 105 ч роста), характеризуются низким энергетическим зарядом, возрастающим от «дна» до поверхности биопленки, но в максимуме достигающим не более 0,6 едициц [244]. P. fluorescens C2 – представитель грамотрицательных гамма- протеобактерий, R. ruber gt1 – грамположительных актинобактерий, одно из основопологающих отличий которых обусловлено структурой клеточной стенки. Известно, что процесс формирования биопленки зависит от многих факторов, среди которых состав среды, свойства носителя и самих микроорганизмов. Разнообразие адгезионных механизмов у различных микроорганизмов обусловливается огромным числом вариантов взаимодействия этих факторов [19]. При исследовании мутантов таких грамотрицательных бактерий, как P. aeruginosa, P. fluorescens и E. coli, была выявлена важная роль флагелл и пилей для ранних стадий развития биопленок. Кроме того, было установлено, что прикрепление клеток E. coli к абиотической поверхности вызывает важные изменения в составе внешних мембранных белков, причем уровень синтеза 17 белков возрастает, грамположительных а 15 снижается бактерий [23]. обусловлена В в свою очередь, основном адгезия гидрофобными взаимодействиями, а степень гидрофобности связана с содержанием клеточных липидов [64]. Как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий адгезию к твердым поверхностям обусловливают внеклеточные полимерные вещества [203], синтез которых возрастает при контакте с поверхностью [204]. Возможно, метаболические перестройки, направленные на образование внеклеточных полимерных веществ, не столь велики у псевдомонад, которые и в суспендированном состоянии характеризуются повышенным синтезом этих веществ. Скорее всего, на содержание внутриклеточного АТФ изученных штаммов влияют не только особенности, обусловленные структурой клеточной стенки, и, как следствие, различия адгезионных механизмов, но и особенности 267 роста этих бактерий в периодической культуре. Так, P. fluorescens C2 по сравнению с R. ruber gt1 – быстрорастущий организм. Его стационарная фаза роста характеризуется значительным снижением жизнеспособности, о чем также можно судить по содержанию внутриклеточного АТФ (Таблица 24). При адгезии P. fluorescens C2 снижение пула АТФ в клетке менее резкое, чем у клеток R. ruber gt1, энергетическое состояние которых в суспензии стационарной фазы характеризуется бóльшим количеством АТФ. Следует отметить, что объяснение влияния различных факторов (свойств носителей, клеточной стенки бактериальных клеток, особенностей роста микроорганизма) на содержание внутриклеточного АТФ при адгезии находится на стадии гипотез и требует дальнейшего детального изучения. Рассмотрен другой тип гетерогенного биокатализатора – биопленки нитрилутилизирующих бактерий, выращенные в процессе культивирования в присутствии носителя. Показано, что биопленки нитрилгидролизующих родококков и псевдомонад могут являться эффективным биокатализатором трансформации алифатических и ароматических нитрилов в соответствующие амиды и карбоновые кислоты. Изучение микробных биопленок во многом ассоциировано с их негативной ролью в жизни и хозяйственной деятельности человека и подчинено разработке методов борьбы с ними. С другой стороны, в научной литературе с недавнего времени начало укрепляться мнение о биопленках как «рабочих лошадках промышленности» (“industrial workhorses”) [281], используемых в технологиях очистки окружающей среды и биокатализе. Повсеместно применяемый метод биологической очистки сточных вод активным илом по своей сути является процессом, основанным на жизнедеятельности самоиммобилизующихся микроорганизмов [53, 66]. Процессы обработки сточных вод основаны на использовании трех типов микробных агрегатов: статические биопленки (например, в биофильтрах), биопленки в виде макрочастиц и флоккул (в активном иле) [294]. С другой стороны, понятие «биопленка-биокатализатор» появилось относительно недавно [212, 281, 282], в подавляющем большинстве случаев относится к процессам ферментации и основано на главном 268 преимуществе биопленок перед планктонным состоянием: их устойчивости по отношению к токсичным субстратам и продуктам, оказывающим негативное влияние на жизнеспособность. Нами был получен биокатализатор трансформации нитрилов и амидов на основе бактериальных биопленок, выращенных на углеродсодержащих волокнистых адсорбентах и полиэтилене высокой плотности. Устойчивость биопленок родококков и псевдомонад к высоким концентрациям акриламида, акриловой кислоты и акрилонитрила была изучена двумя методами: АТФ-метрией и качественным анализом жизнеспособности с помощью флюоресцентной метки LIVE/DEAD®. Эпифлуоресцентная и конфокальная лазерная микроскопия, позволяющая визуализировать биопленку с помощью окраски флюоресцентными маркерами, в настоящее время является одним из развивающихся способов изучения биопленок [95, 389]. В нашем случае визуализация жизнеспособных и мертвых клеток подтвердила данные АТФметрии: клетки биопленки не теряют своей жизнеспособности при воздействии высоких концентраций токсичных агентов. Так, инкубация в присутствии акриловой кислоты, обладающей не только токсичным эффектом, но и низкой рН, приводит к сдвигу окраски, но не нарушает морфологию клеток биопленки, тогда как в суспензии клетки почти не визуализируются, вероятно, из-за их лизиса. Показано, что монопленки более эффективны для биокатализа нитрилов и амидов карбоновых кислот, тогда как смешанные биопленки, даже в случае отсутствия конкуренции за субстрат роста, не обладают такой же способностью к трансформации, как смешанная суспензионная культура тех же штаммов. Возможно, это связано с разной адгезивной способностью различных штаммов при использовании определенного носителя, который оказывается предпочтительным только для одного микроорганизма. Одним из направлений исследования явилось создание гетерогенного биокатализатора трансформации нитрилов и амидов на основе ферментных препаратов, представляющих собой бесклеточные экстракты грубой очистки, содержащие нитрилгидратазу, нитрилазу или амидазу. Ферментный препарат был иммобилизован различными способами – адсорбционным, методом ковалентной 269 сшивки с носителем и методом создания поперечно-сшитых агрегатов фермента (ПСАФ). Для адсорбции нитрилгидролизующих ферментов впервые были использованы немодифицированные оксиды алюминия и углеродсодержащие носители на их основе, а также углеродные носители «Сапропель» и Сибунит. Адсорбционная иммобилизация приводила к значительной потере ферментативной активности. Возможно, это связано с нарушением гидратной оболочки фермента, необходимой для функционирования активного центра [277, 377], которое происходит при контакте с гидрофобным носителем. Действительно, потери активности при адсорбции на немодифицированных оксидах алюминия были меньшими, хотя величина адсорбции белка на углеродсодержащих носителях была выше. Стереоселективность адсорбированной амидазы также снижалась, вероятно, одной из причин этого была рацемизация полученного продукта при контакте с носителем. При оценке различных методов и носителей для иммобилизации ферментов метаболизма нитрилов наиболее эффективным был признан метод ковалентной сшивки с активированным хитозаном. Натуральный полиаминосахарид хитозан – сополимер D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина – является перспективным носителем для иммобилизации ферментов, т.к. сочетает в себе такие характеристики, как гидрофильность, высокая аффинность к белкам, доступность функциональных групп для прямых реакций с ферментами и для химических модификаций [258]. За счет большого количества водородных связей, которые способен образовывать хитозан, он является универсальным сорбентом, который может связывать вещества органической и неорганической природы. Большое количество свободных аминогрупп в молекуле определяет его способность взаимодействовать с бифункциональными реагентами, образующими химические связи как с молекулой хитозана, так и с молекулой белка, что делает возможным ковалентную сшивку фермента с хитозаном [80]. Из научной литературы известны примеры успешной иммобилизации ферментов на модифицированном и немодифицированном хитозане. Так, липаза из Candida rugosa, иммобилизованная на модифицированных аминокислотами и 270 активированных эпихлоргидрином хитозановых гранулах, сохраняла активность при хранении и многоцикловом использовании, а также могла функционировать при температуре 55˚С [415]. При иммобилизации на активированном хитозане у каталазы повышалась термостабильность, операционная стабильность и стабильность при хранении [152]. Иммобилизация аллиназы на хитозане, активированном ангидридом янтарной кислоты, приводила к повышению оптимума pH и температуры по сравнению с нативным ферментом и давала возможность многоразового использования фермента [419]. Преимущества иммобилизованной на хитозане β-галактозадазы перед нативным ферментом было основано на расширении рН и температурного оптимума, более высокой термостабильности и возможности многократного применения [187]. По нашим данным, ковалентная сшивка нитрилгидратазы с хитозаном, активированным бензохиноном, дает возможность использовать фермент не менее чем в 50-и последовательных циклах конверсии акрилонитрила, повышает его термостабильность и расширяет рН оптимум активности, кроме того, появляется возможность функционирования фермента в кислой среде (до рН 3–4). Ковалентная сшивка повышала термостабильность нитрилгидратазы при 40ºС и амидазы при 50ºС, тогда как при более высоких температурах – 50 и 60ºС для нитрилгидратазы и 60 и 70ºС для амидазы возрастание термоустойчивости было незначительно. Как хитозан, так и «Сапропель» повышают рН в микроокружении фермента, что приводит к сдвигу оптимума рН активности в сторону более низких значений и возможности работы фермента в кислой среде. Разница в рН-профилях активности нативных и иммобилизованных ферментов, по-видимому, связана с различиями рН в микро- и макроокружении фермента [73] и обусловлена свойствами носителя. Основываясь на полученных нами результатах, можно сделать вывод, что иммобилизованный на хитозане и «Сапропеле» фермент находился в микроокружении, рН которого сдвинута в щелочную область по сравнению с реакционной средой. Хитозан – поликатион, который отталкивает протоны, а в составе «Сапропеля» присутствуют ионы Na+, K+, Ca2+ и Mg2+ (Рисунок 19). Однако в настоящее время появились сведения о 271 возможности исследования внутренней среды биокатализатора в режиме “real time” [371]. Разработаны методы для определения рН и концентрации кислорода внутри частицы, основанные на применении опто-химических рН- и О2-сенсоров, которые доступны в разных модификациях (точечные, в виде слоев, оптоволоконные, частицы микро- и нанометрового размера) [138]. Также чтобы сделать возможным измерение внутри пористых носителей, разрабатываются методы иммобилизации люминесцентных красителей в твердый носитель, либо прямой конъюгации фермента с рН-чувствительным люминофором (например, флюоресцеин внутреннюю тиоизоцианат, среду, оптимизировать FITC) окружающую процесс, [376]. Возможность иммобилизованный провести скрининг охарактеризовать фермент, позволит подходящих методик иммобилизации и геометрии носителя, оценить кинетические параметры и массоперенос в гетерогенной системе. Современной тенденцией в разработке иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов является создание CLEAs (cross-linked enzyme aggregates, или ПСАФ – поперечно-сшитые агрегаты ферментов) [368, 369]. Этот метод позволяет достичь стабилизации мультимерных энзимов, но аморфное состояние таких препаратов затрудняет их использование в колоночном и многоцикловом синтезе. В нашей работе были приготовлены ПСАФ амидазы с использованием бифункциональных реагентов – глутарового альдегида и бензохинона, и изучена их стереоселективность в реакции гидролиза рацемического лактамида. Действительно, этот метод позволил получить препараты фермента, проявляющие максимальную стереоселективность, превышающую таковую нативного фермента. ПСАФ амидазы из R. rhodochrous 41, полученные одновременной преципитацией сульфатом аммония и ковалентной сшивкой глутаровым альдегидом, проявили максимальную активность и стереоселективность в диапазоне температур от 40 до 60ºС. Совпадение максимумов активности и стереоселективности явилось преимуществом полученных препаратов. По литературным данным, у CLEAs нитрилазы, гидролизующих рацемический нитрил миндальной кислоты до (R)-миндальной 272 кислоты, энантиоселективность увеличивалась при снижении температуры, тогда как скорость реакции при низкой температуре обычно снижается [242]. На стереоселективность реакции также влияет носитель, присутствующий в гетерогенной среде. Так, соотношение изомеров в реакции гидролиза фенилглицинонитрила адгезированными на углеродных носителях Сибунит и «Сапропель» клетками P. fluorescens C2 при протекании реакции в течение 24 ч было противоположным. Если через 1 ч реакции соотношение стереоизомеров в растворе было сдвинуто в сторону L-фенилглицина как у адгезированных, так и у суспендированных клеток, то к 24 ч выход L-изомера у биокатализатора на Сибуните уже составлял 98%, а на «Сапропеле» преобладал выход D-изомера. При конверсии лактамида адсорбированной амидазой присутствие носителя Сибунита в реакционной смеси приводило к рацемизации раствора, «Сапропеля» – к преобладанию D-изомера, тогда как фермент в растворе гидролизовал лактамид до L- и D-молочной кислоты с 78%-ным энантиомерным избытком последнего. Таким образом, нами впервые было показано влияние углеродных носителей на стереоселективность ферментативных реакций, протекающих в гетерогенной среде. При сравнении функционирования в гетерогенной среде трех различающихся по активности ферментов как в изолированном состоянии, так и в бактериальной клетке, были выявлены следующие закономерности. Во-первых, удельная амидазная и нитрилазная активность, уступающая более чем на порядок нитрилгидратазной, зависит от концентрации клеток в растворе и в адгезированном состоянии при избытке субстрата и прочих равных условиях. Факт преднамеренной избыточности субстрата в реакции позволяет предполагать, что обратная зависимость активности от концентрации биокатализатора является следствием не столько конкуренции за субстрат, сколько возникающих диффузионных затруднений. Следовательно, если скорость фермент-субстратных взаимодействий велика, что в нашем случае имеет место при функционировании нитрилгидратазы, то роль диффузии незначительна, и реакция протекает в кинетическом режиме. Таким образом, при создании иммобилизованного 273 биокатализатора следует обращать внимание на исходную ферментативную активность. Относительно низкая ферментативная активность налагает ограничения на концентрацию иммобилизованных клеток и белкового препарата – в этом случае следует отдавать предпочтение носителям, позволяющим создать монослой биокатализатора на поверхности, избегая полислойной адсорбции. При сравнении гетерогенных биокатализаторов, полученных на основе бактериальных клеток и выделенных ферментов, возникает вопрос о целесообразности трудозатратной стадии выделения фермента, локализованного в цитоплазме клетки. Действительно, в большинстве случаев адгезированые бактерии, обладающие нитрилгидролизующей активностью, могут являться эффективным биокатализатором. Однако выделение внутриклеточного фермента и его стабилизация необходимы для повышения стереоселективности реакции, причем в данном случае более предпочтительна «иммобилизация без носителя», т.е. образование ПСАФ. Кроме того, выделение нитрилгидратазы и ее сшивка с хитозаном, активированным 0,1% бензохиноном, позволили получить препарат, обладающий максимальной операционной стабильностью из изученных гетерогенных биокатализаторов – он выдерживал не менее 50 циклов последовательной конверсии акрилонитрила, причем даже в 50-м цикле активность была в 3,5 раза выше, чем в первом. Перспективы дальнейшей разработки темы затрагивают анализ протеома клеток нитрилгидролизующих бактерий в адгезированном состоянии и в состоянии биопленки на различных этапах ее формирования, что позволит углубить знания об экспрессии генов и физиологических изменениях бактериальных клеток при первичной адгезии и росте в виде биопленки. Практическими перспективами работы является создание биофильтров для очистки воды от нитрильных загрязнений на основе адгезированных клеток и биопленок нитрилтрансформирующих бактерий, а также разработка биореакторов для осуществления непрерывного биокаталитического процесса трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот до соответствующих продуктов, которые могут найти применение в химической и фармацевтической промышленности. 274 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что на адгезию бактериальных клеток на углеродных материалах наибольшее влияние оказывают гидрофобно-гидрофильные характеристики поверхностей клетки и носителя. Показана умеренная положительная связь (r=0,679; p=0,05) между гидрофобностью углеродных носителей и массой адгезированных клеток R. ruber gt1, обладающих гидрофобной клеточной стенкой (48–52% по BACH-тесту), а также сильная положительная связь между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и их адгезией на гидрофобных углеродных материалах: от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). 2. На основании иммобилизованной анализа системы эффективности (η) и функционирования операционной стабильности биокатализатора (n), изученных в процессе гидролиза акрилонитрила, выстроен интегративный ряд углеродных носителей, используемых для адгезии клеток R. ruber gt1, по убыванию этих характеристик: Керамзит/КВУ (6,47% С) > уголь-сырец порошкообразный > БАУ > ФТД > Norit PK 1-3 > «Сапропель» > Керамзит/КВУ (3,63% С) > Сибунит = ФАС > Карбопон > Урал ТМ-4 > КВУ массивный > Карбопон-В-актив > Керамзит/графитоподобный слой. 3. Показано, что при выборе носителя для создания эффективного гетерогенного биокатализатора на основе адгезированных клеток необходимо учитывать адсорбцию продуктов трансформации материалом носителя: для гидролиза алифатических нитрилов и амидов адгезию бактериальных клеток предпочтительно осуществлять на активированных углеродных материалах, тогда как для гидролиза ароматических субстратов – на неактивированных. 4. Показано, что гетерогенный биокатализатор трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот может быть получен агрегацией клеток нитрилгидролизующих бактерий с многослойными углеродными 275 нанотрубками. Агрегация родококков с неочищенными нанотрубками достоверно выше, чем грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas и Alcaligenes, и составляет 415–440 мг сухой биомассы на 1 г носителя. Установлено, что ферментативная активность клеток, агрегированных с неочищенными нанотрубками, в 4–45 раз ниже, чем с очищенными, что обусловливает необходимость очистки углеродных нанорубок от технологических примесей. 5. Показано, что биопленки нитрилгидролизующих бактерий, полученные при культивировании в присутствии носителей, являются гетерогенным биокатализатором, токсичным проявляющим субстратам и повышенную продуктам устойчивость трансформации к нитрилов. Максимальное количество акриламида (1047±113 мг) получено при 20минутной конверсии 1,3 М раствора акрилонитрила, никотиновой кислоты (126±6 мг) – при 24 ч конверсии 200 мМ раствора 3цианопиридина выращенными на 1 дм2 полиэтилена высокой плотности биопленками R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 соответственно. 6. Установлено, что стадия инициации образования биопленки – необратимая адгезия – характеризуется снижением пула АТФ в клетке, причем уровень снижения зависит от свойств носителя. Отмечено, что наибольшее снижение концентрации внутриклеточного АТФ происходит при адгезии R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 на носителе «Сапропель» – от 1,071 до 0,002 нМ/мг и от 0,144 до 0,006 нМ/мг соответственно. 7. Определено, что адсорбция нитрилгидролизующих ферментов на углеродсодержащих носителях приводит к снижению их активности, но увеличивает их устойчивость к высоким температурам. Ковалентная сшивка ферментов с хитозаном, активированным бензохиноном, повышает термостабильность, расширяет рН оптимум активности и увеличивает кислотоустойчивость, многоциклового использования. а также дает возможность 276 8. Установлено, что стереоселективность гидролиза рацемических нитрилов и амидов карбоновых кислот в гетерогенном процессе зависит от характеристик носителя, присутствующего в реакционной среде: 24часовая трансформация фенилглицинонитрила клетками P. fluorescens C2, адгезированными на носителе «Сапропель», приводила к накоплению в среде D-фенилглицина (ee=78%), на носителе Сибунит – L-фенилглицина (ee=96%). Определено, что наибольшую стереоселективность при гидролизе лактамида проявили поперечно-сшитые глутаровым альдегидом агрегаты амидазы, стабилизированные без носителя. 277 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ НАК – нитрил акриловой кислоты (акрилонитрил) АА – акриламид АК – акриловая кислота 2-, 3-, 4-ЦП – 2-,3-,4-цианопиридин соответственно ПА – пиколинамид ПК – пиколиновая кислота НА – никотинамид НК – никотиновая кислота ИНА – изоникотинамид ИНК – изоникотиновая кислота ПАА – полиакриламид ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГХ – газовая хроматография ОП – оптическая плотность АСБ – абсолютно сухая биомасса LB – среда Луриа-Бертани КВУ – каталитический волокнистый углерод МУНТ – многослойные углеродные нанотрубки АТФ – аденозинтрифосфорная кислота ДМСО – диметилсульфоксид ПСАФ – поперечно-сшитые агрегаты фермента CLEAs – cross-linked enzyme aggregates ее – энантиомерный избыток (enantiomeric excess) 278 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Акрилонитрил / Russian Chemistry (Российская химическая энциклопедия) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.russian- chemistry.ru/reagents/4146. 2. Активированный уголь, сорбенты – производство, применение, продажа. Очистка воды, водоподготовка, очистка воздуха, фильтры, загрузки // Активированное нетканное полотно УВС "Карбопон-В-Актив" [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://carbo.e-stile.ru/uvs-polotno/. 3. Аликин, В.Н. Конверсия специальной технической химии. Пороха, топлива, заряды / В.Н. Аликин [и др.]. – Пермь: ПНЦ УрО РАН, 1999. – 176 с. 4. Биодеградация метилацетата и этилацетата иммобилизованными клетками Pseudomonas esterophilus / Н.В. Доронина, Н.М. Назаров, В.А. Ежов, Ю.А. Троценко // Прикл. биохим. микробиол. – 2006. – Т. 42, № 1. – С. 52–54. 5. Биокатализаторы многофункционального назначения на основе ресурсного потенциала коллекции алканотрофов / И.Б. Ившина [и др.] // В кн.: Инновационные биотехнологии в странах ЕвраАзЭС. – Минск: Беларуcкая навука, 2011. – С. 105–119. 6. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин [и др.]. – М.: Высшая школа, 1987. – 160 с. 7. Биссвангер, Х. Практическая энзимология / Х. Биссвангер // М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010. – С. 96. 8. Боронин, А.М. Академик Георгий Константинович Скрябин / А.М. Боронин // Микробиология. – 1999. – Т. 68, № 6. – С. 809–815. 9. Варфоломеев, С.Д. Биокинетика: Практический курс / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. – М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. – 720 с. 10. Bлияние физико-химических свойств актинобактерий рода Rhodococcus на их адгезию к полистиролу и н-гексадекану / Е.В. Рубцова [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 4. – С. 900–904. 279 11. Глубинное гетерофазное культивирование молочнокислых бактерий / Б.А. Кареткин, Н.Г. Лойко, И.В. Шакир, В.И. Панфилов // Биотехнология. – 2013. – № 1. – С. 59–68. 12. Григорьева, Т.М. Зависимость уровня продукции гидролитических экзоферментов от способа культивирования бактерий Bacillus subtilis / Т.М. Григорьева, В.М. Трехова, Р.Р. Азизбекян // Биотехнология. – 2010. – № 5. – С. 29–36. 13. Давиденко, Т.И. Угольные материалы – носители для иммобилизации ферментов и клеток микроорганизмов / Т.И. Давиденко. – Одесса: Изд-во ФХИ НАН Украины, 1995. – 36 с. 14. Дебабов, В.Г. Биокаталитический гидролиз нитрилов / В.Г. Дебабов, А.С. Яненко // Обзорный журнал по химии. – 2011. – Т. 1, № 4. – С. 376–394. 15. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб // Пер. с англ. – М.: Мир. – 1966. – 816 с. 16. Ефременко, Е.Н. иммобилизованных Гетерогенные клеток биокатализаторы микроорганизмов: на основе фундаментальные и прикладные аспекты : дис. … д-ра биол. наук : 03.00.02, 03.00.23 / Ефременко Елена Николаевна. – М., 2009. – 433 с. 17. Ждан-Пушкина, С.М. Основы роста культур микроорганизмов. Учеб. пособие / С.М. Ждан-Пушкина; под ред. В.П. Гончаровой. – Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та, 1983. – 188 с. 18. Забазная, Е.Б. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту / Е.Б. Забазная, С.В. Козулин, С.П. Воронин // Прикл. биох. микробиол. – 1998. – Т. 34, № 4. – С. 377–381. 19. Закономерности развития биопленки и особенности образования внеклеточных полимерных веществ штаммом Sphingomonas sp. / К.Г. Ипполитов, А.С. Сироткин, С.А. Понкратова, М. Кюн // Биотехнология. – 2003. – № 3. – С. 3–11. 280 20. Земледелие от «А» до «Я». [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://racechrono.ru/pochva-i-mikroorganizmy/3672-priroda-yavleniya-adgeziimikroorganizmov-chast-4.html. 21. Ившина, И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, Р.А. Пшеничнов, А.А. Оборин // УНЦ АН СССР: Свердловск, 1987. – 125 с. 22.Игнатов, И. Состав фуллеренсодержащего и структурные минерала шунгита. свойства природного Математическая модель взаимодействия шунгита с молекулами воды / И. Игнатов, О.В. Мосин // Интернет-журнал «Науковедение». – 2014. – №2 (21) [Электронный ресурс] – М.: Науковедение, 2014. – Режим доступа: http://naukovedenie.ru/PDF/12TVN214.pdf. 23. Ильина, Т.С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития / Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Генетика. – 2004. – Т. 40, № 11. – С. 1445–1456. 24. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов. – М.: Изд-во МГУ, 1994. – 288 с. 25. Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии / Д.Г.Дерябин [и др.] // Российские нанотехнологии. – 2010. – Т. 5, № 11–12. – С. 103–108. 26. Карнаухов, А.П. Адсорбция. Текстура дисперсных и пористых материалов / А.П. Карнаухов. – Новосибирск: Наука. Сибирское предприятие РАН, 1999. – 470 с. 27. Каталитические свойства глюкоамилазы, иммобилизованной на углеродном носителе Сибуните / Г.А. Коваленко, Л.В. Перминова, Т.Г. Терентьева, Г.В. Плаксин // Прикл. биохим. микробиол. – 2007. – Т. 43, № 4. – С. 412–418. 28. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous M8 / В.П. Вейко [и др.] // Биотехнология. – 1995. – № 5–6. – С. 3–5. 281 29. Коваленко, Г.А. Углеродминеральные носители для адсорбционной иммобилизации нерастущих бактериальных клеток / Г.А. Коваленко, Е.В. Кузнецова, В.М. Ленская // Биотехнология. – 1998. – № 1. – С. 47–56. 30. Козлов, С.В. Биологическая характеристика бактериальных штаммов – активных продуцентов нитрилгидролизующих ферментов : дис. … канд. биол. наук : 03.00.07 / Козлов Сергей Васильевич. – Пермь, 2007. – 139 с. 31. Кощеенко, К.А. Живые иммобилизованные клетки как биокатализаторы процессов трансформации и биосинтеза органических соединений / К.А. Кощеенко // Прикл. биохим. микробиол. – 1981. – Т. 17, Вып. 4. – С. 477– 493. 32. Кудыкина, Ю.К. рН-Индуцируемое образование покоящихся форм микобактерий и роль аденилатциклазы в их реактивации : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.01.04 / Кудыкина Юлия Константиновна. – М., 2011. – 24 с. 33. Кузнецова, М.В. Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus – продуцентов нитрилгидратазы : дис. … канд. биол. наук : 03.00.07 / Кузнецова Марина Валентиновна. – Пермь, 2004. – 124 c. 34. Курдиш, И.К. Влияние глинистых минералов на рост фосфатмобилизующих бактерий Bacillus subtilis / И.К. Курдиш, З.Т. Бега // Прикл. биохим. микробиол. – 2006. – Т. 42, № 4. – С. 438–442. 35. Курдиш, И.К. Применение высокодисперсных материалов в технологии культивирования и получения гранулированных препаратов Agrobacterium radiobacter / И.К. Курдиш, Л.В. Титова // Прикл. биохим. микробиол. – 2001. – Т. 37, № 3. – С. 369–373. 36. Максимова, Ю.Г. Биотрансформация акрилонитрила иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus : дис. … канд. биол. наук : 03.00.07 / Максимова Юлия Геннадьевна. – Пермь, 2006. – 127 с. 37. Мартинек, К. Стабилизация ферментов – ключевой фактор при внедрении биокатализа в практику / К. Мартинек, И.В. Березин // Успехи химии. – 1980. – Т. XLIX, вып. 5. – С. 737–770. 282 38. Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан. – М.: Медицина, 2005. – 367 с. 39. Митяшина, С.Ю. Влияние окиси углерода на энергетический статус Desulfovibrio desulfuricans B-1388 : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.07, 03.01.04 / Митяшина Светлана Юрьевна. – Казань, 1998. – 18 с. 40.Нагаев, В.В. Биологический метод регенерации активных углей / В.В. Нагаев, А.С. Сироткин // Химия и технология воды. – 1998. – Т. 20, № 5. – С. 535–545. 41.Нестеренко, О.А. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. – Киев: Наукова думка, 1985. – 336 c. 42. Нетрусов, А.И. Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 352 с. 43. Николаев, Ю.А. многоклеточного Биопленка организма? – / «город Ю.А. микробов» Николаев, В.К. или аналог Плакунов // Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 2. – С. 149–163. 44. Николаев, Ю.А. Свойства адгезина и антиадгезина Pseudomonas fluorescens / Ю.А. Николаев, Дж.И. Проссер // Микробиология. – 2000. – Т. 69, № 2. – С. 237–242. 45. Никулин, С.М. Синтез многослойных углеродных нанотрубок и их применение в производстве композиционных материалов / С.М. Никулин, Д.А. Руденко // Перспективные материалы. – 2011. – №11. – С. 54–62. 46. Новая ациламидаза из Rhodococcus erythropolis TA37, способная гидролизовать N-замещенные амиды / К.В. Лавров, И.А. Залунин, Е.К. Котлова, А.С. Яненко // Биохимия. – 2010. – Т. 75, вып. 8. – С. 1111–1119. 47. Ножевникова, А.Н. Использование микробного процесса анаэробного окисления аммония (анаммокс) для биотехнологической очистки стоков / 283 А.Н. Ножевникова, М.В. Симанькова, Ю.В. Литти // Биотехнология. – 2011. – № 5. – С. 8–31. 48. Олескин, А.В. Биосоциальность одноклеточных (на материале исследований прокариот) / А.В. Олескин // Журнал общей биологии. – 2009. – Т. 70, № 3. – С. 225–238. 49. Олескин, А.В. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов / А.В. Олескин, И.В. Ботвинко, Е.А. Цавкелова // Микробиология. – 2000. – Т. 69, № 3. – С. 309–327. 50. Олонцев, В.Ф. Российские активные угли / В.Ф. Олонцев, Р.А. Безруков. – М.: Изд-во ГУ ВШЭ, 1999. – 90 с. 51. Определение биолюминесцентным методом минимальных ингибирующих концентраций веществ по отношению к бактериям, участвующим в биокоррозии / Е.Н. Ефременко [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. – 2005. – Т. 41, № 4. – С. 429–434. 52. Паников, Н.С. Рост и адгезия Pseudomonas fluorescens в периодической культуре: кинетический анализ действия внеклеточных антиадгезинов / Н.С. Паников, Ю.А. Николаев // Микробиология. – 2002. – Т. 71, № 5. – С. 619–628. 53.Плакунов, В.К. Микробные биопленки: перспективы использования при очистке сточных вод / В.К. Плакунов, Ю.А. Николаев // Вода: химия и экология. – 2008. – № 2. – С. 11–13. 54.Плакунов, В.К. Основы динамической биохимии. Учебное пособие / В.К. Плакунов, Ю.А. Николаев. – М.: Логос, 2010. – 213 с. 55. Потапов, В.М. Стереохимия / В.М. Потапов. – М.: Химия, 1988. 464 с. 56. Практическая химия белка / Ред. А.М. Дарбре. – М.: Мир, 1989. – С. 297– 298. 57. Приготовление и исследование алюмосиликатных носителей с синтезированным слоем каталитического волокнистого углерода. I. Синтез 284 углеродных нановолокон на нанесенном Ni-катализаторе / Г.А. Коваленко [и др.] // Кинетика и катализ. – 2007. – Т. 48, № 5. – С. 800–807. 58. Приготовление и исследование алюмосиликатных носителей с синтезированным слоем каталитического волокнистого углерода. II. Синтез углеродных нановолокон на нанесенном Со-катализаторе / Г.А. Коваленко [и др.] // Кинетика и катализ. – 2007. – Т. 48, № 5. – С. 808–815. 59. Разработка и внедрение биокаталитического способа получения акриловой кислоты. I. Выделение штамма Alcaligenes denitrificans, трансформирующего акрилонитрил в акрилат аммония / С.В. Полтавская [и др.] // Биотехнология. – 2004. – № 1. – С. 62–70. 60. Разработка феноменологической модели кинетики бактериальной адсорбции на низкоэнергетических поверхностях / В.В. Федорович, С.В. Калюжный, П. Ван дер Мирен, В. Верстрает // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. – 2002. – Т. 43, № 6. – С. 417–419. 61. Регуляция биосинтеза ферментов биодеградации нитрилов у Rhodococcus rhodochrous M0 / О.Б. Астаурова [и др.] // Биотехнология. – 1991. – N. 5. – С. 10–14. 62. Роль транспорта путресцина и калия в регуляции топологического состояния ДНК в процессе адаптации Escherichia coli к температурному стрессу / А.Г. Ткаченко, М.Р. Пшеничнов, О.Я. Салахетдинова, Л.Ю. Нестерова // Микробиология. – 1998. – Т. 67, № 5. – С. 601–606. 63. Романова, Н.А. Сравнение методов экстракции внутриклеточного АТФ микроорганизмов различного типа для биолюминесцентного определения клеток микроорганизмов / Н.А. Романова, Л.Ю. Бровко, Н.Н. Угарова // Прикл. биохим. микробиол. – 1997. – Т. 33, № 3. – С. 344–349. 64. Рубцова, Е.В. Влияние условий культивирования на адгезивную активность родококков в отношении н-гексадекана / Е.В. Рубцова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Прикл. биохим. микробиол. – 2012. – Т. 48, № 5. – С. 501–509. 285 65. Рымовская, М.В. Биосорбционная очистка сточной воды производства полимеров / М.В. Рымовская, Н.С. Ручай // Биотехнология. – 2008. – № 2. – С. 51–58. 66. Сироткин, А.С. Агрегация микроорганизмов: флокулы, биопленки, микробные гранулы / А.С. Сироткин, Г.И. Шагинурова, К.Г. Ипполитов. – Казань: Изд-во «Фэн» АН РТ, 2007. – 160 с. 67.Слабова, О.И. Иммобилизация олиготрофных бактерий на пористых носителях методом сорбции / О.И. Слабова, Д.И. Никитин // Микробиология. – 2005. – Т. 74, № 3. – С. 430–432. 68. Сорбция микроорганизмов крупнопористыми агарозными криогелями, содержащими привитые алифатические цепи разной длины / В.Г. Евтюгин [и др.] // Микробиология. – 2009. – Т. 78, № 5. – С. 667–673. 69. Сравнительный анализ штаммов, используемых в процессе получения акрилата аммония / С.А. Глинский [и др.] // Биотехнология. – 2010. – № 1. – С. 17–24. 70. Тихонова, Е.Б. Изменение пула АТФ в динамике периодического роста Rhodococcus minimus / Е.Б. Тихонова, И.Т. Ермакова, Е.Л. Головлев // Микробиология. – 1992. – Т. 61, вып. 4. – С. 591–597. 71. Ткаченко, А.Г. Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов / А.Г. Ткаченко. – Екатеринбург: УрО РАН, 2012. – 268 с. 72. Ткаченко, А.Г. Роль энергетического статуса и транспорта путресцина в обеспечении гомеостаза внутриклеточного рН в процессе щелочных и кислотных шифтов у Escherichia coli / А.Г. Ткаченко, А.А. Чудинов, Т.Г. Нагорских // Микробиология. – 1993. – Т. 62, Вып. 1. – С. 37–45. 73. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. – М.: Мир, 1983. – 213 с. 74. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов / Г.А. Коваленко [и др.] // Биотехнология. – 2003. – № 4. – С. 52–62. 286 75. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов / Г.А. Коваленко [и др.] // Биотехнология. – 2004. – № 6. – С. 34–45. 76. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной Иммобилизация иммобилизации нерастущих ферментов клеток и дрожжей микроорганизмов. и растущих 5. клеток алканотрофных родококков / Г.А. Коваленко [и др.] // Биотехнология. – 2006. – № 1. – С. 76–83. 77. Халгаш, Я. Биокатализаторы в органическом синтезе / Я. Халгаш. – М.: Мир, 1991. – 204 с. 78. Химик. Сайт о химии. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.xumuk.ru/encyklopedia/25.html. 79. Хитин и хитозан: природа, получение и применение / Под ред. A.P. de Abram. – Издано Российским Хитиновым Обществом, 2010. – 292 с. 80. Хитозан как перспективный носитель для иммобилизации липазы / Т.А. Ковалева, А.С. Беленова, А.И. Сливкин, В.Л. Лапенко // Биотехнология. – 2010. – № 4. – С. 59–64. 81. Чеботарев, А.Ю. Стимулирующее влияние диоксида титана на рост бактерий / А.Ю. Чеботарев, И.К. Курдиш // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2-6 июня 2008 г.). – С. 144–146. 82. Яхонтов, Л.М. Синтетические лекарственные средства / Л.М. Яхонтов, Р.Г. Глушков // Под ред. А.Г. Натрадзе. – М.: Медицина, 1983. – 272 с. 83. 5-Cyanovaleramide production using immobilized Pseudomonas chlororaphis B23 / E.C. Hann [et al.] // Bioorg. Medicin. Chemistry. – V. 7. – 1999. – P. 2239–2245. 84.6-Aminopenicillanic acid production in stationary basket bioreactor with packed bed of immobilized penicillin amidase—Penicillin G mass transfer and consumption rate under internal diffusion limitation / D. Caşcaval, M. Turnea, A.-I. Galaction, A.C. Blaga // Biochem. Eng. J. – 2012. – V. 69. – P. 113–122. 287 85. A comparison of the use of an ATP-based bioluminescent assay and image analysis for the assessment of bacterial adhesion to standard HEMA and biomimetic soft contact lenses / C.S. Andrews [et al.] // Biomaterials. – 2001. – V. 22. – P. 3225–3233. 86. A new enzymatic method of acrylamide production / Y. Asano [et al.] // Agric. Biol. Chem. – 1982. – V. 46. – P. 1183–1189. 87.A new immobilization technique of whole cells and enzymes with colloidal silica and alginate / Y. Fukushima, K. Okamura, K. Imai, H. Motai // Biotechnol. Bioeng. – 1988. – V. 32. – P. 584–594. 88.A new, mild cross-linking methodology to prepare cross-linked enzyme aggregates / C. Mateo [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2004. – V. 86(3). – P. 273–276. 89.A novel honeycomb matrix for cell immobilization to enhance lactic acid production by Rhizopus oryzae / Z. Wang [et al.] // Biores. Technol. – 2010. – V. 101. – P. 5557–5564. 90. A novel thermostable nitrilase superfamily amidase from Geobacillus pallidus showing acyl transfer activity / H.S. Makhongela [et al.] // Appl. Microbiol. Biotech. – 2007. – V. 75(4). – P. 801–811. 91. A novel thermostable nitrile hydratase / R.A. Pereira, D. Graham, F.A. Rainey // Extremophiles. – 1998. – V. 2. – P. 347–357. 92. A patch coating method for preparing biocatalytic films of Escherichia coli / O.K. Lyngberg [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 1999. – V. 62. – P. 44–55. 93. A propionitrile induced nitrilase of Rhodococcus sp. NDB 1165 and its application in nicotinic acid synthesis / S. Prasad [et al.] // World J. Microbiol. – Biotechnol. – 2007. – V. 23. – P. 345–353. 94. A proteomic approach to biofilm cell physiology / L. Coquet [et al.] // Methods in biotechnology: Immobilization of enzymes and cells. Ed. by J.M. Guisan. Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2006. – P. 403–414. 288 95. A standardized pre-treatment method of biofilm flocs for fluorescence microscopic characterization / O. Nosyk, E. ter Haseborg, U. Metzger, F.H. Frimmel // J. Microbiol. Meth. – 2008. – V. 75. – P. 449–456. 96. An, Y.H. Handbook of bacterial adhesion: Principles, methods, and applications // Y.H. An, R.J. Friedman // Totowa, N.J.: Humana Press Inc., 2000. – 644 c. 97. An evaluation of the impact of multiwalled carbon nanotubes on soil microbial community structure and functioning / B. Shrestha [et al.] // J. Hazard. Mat. – 2013. – V. 261. – P. 188–197. 98. Activated carbon and synthetic resins as support material for methanogenic phenol-degrading consortia – Comparison of phenol-degrading activities / W.B. Kindzierski, P.M. Fedorak, M.R. Gray, S.E. Hrudey // Water Environ. Res. – 1995. – V. 67(1). – P. 108–117. 99. Activity regulation of photoreactive nitrile hydratase by nitric oxide / M. Okada [et al.] // J. Am. Chem. Soc. – 1997. – V. 119. – P. 3785–3791. 100. Adamczak, M. Strategies for improving enzymes for efficient biocatalysis / M. Adamczak, S.H. Krishna // Food Technol. Biotechnol. – 2004. – V. 42(4). – P. 251–264. 101. Adhesion and growth of anaerobic biofilms on ion exchange resins / R.F.G. Selle Sardi, W. Bulani, W.L. Cairns, N. Kosaric // Water Poll. Res. J. Canada. – 1986. – V. 21(4). – P. 486–495. 102. Adhesion of Rhodococcus sp. S3E2 and Rhodococcus sp. S3E3 to plasma prepared Teflon-like and organosilicon surfaces / M. Lehocký [et al.] // J. Materials Proc. Technol. – 2009. – V. 209. – P. 2871–2875. 103. Adsorption of Bacillus subtilis on single-walled carbon nanotube aggregates, activated carbon and NanoCeramTM / V.K.K. Upadhyayula, S. Deng, G.B. Smith, M.C. Mitchell // Water Research. – 2009. – V. 43. – P. 148–156. 104. Akhova, A.V. ATP/ADP alteration as a sign of the oxidative stress development in Escherichia coli cells under antibiotic treatment / A.V. Akhova, A.G. Tkachenko // FEMS Microbiol. Lett. – 2014. – V. 353. – P. 69–76. 289 105. Almatawah, Q.A. Characterization of an inducible nitrilase from a thermophilic bacillus / Q.A. Almatawah, R. Cramp, D.A. Cowan // Extremophiles. – 1999. – V. 3. – P. 283–291. 106. Almatawah, Q.A. Thermostable nitrilase catalysed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine / Q.A. Almatawah, D.A. Cowan // Enzyme Microb. Technol. – 1999. – V. 25. – P. 718–724. 107. Alonso, F.O.M. Enantiomerically pure D-phenylglycine production using immobilized Pseudomonas aeruginosa 10145 in calcium alginate beads / F.O.M. Alonso, O.A.C. Antunes, E.G. Oestreicher // J. Braz. Chem. Soc. – 2007. – V. 18(3). – P. 566–571. 108. Alonso, F.O.M. Production of enantiomerically pure D-phenylglycine using Pseudomonas aeruginosa 10145 as biocatalyst / F.O.M. Alonso, E.G. Oestreicher, O.A.C. Antunes // Braz. J. Chem. Eng. – 2008. – V. 25(1). – P. 1–8. 109. Amidase-catalyzed production of nicotinic acid in batch and continuous stirred membrane reactors / M. Cantarella [et al.] // Enzyme Microb. Technol. – 2008. – V. 42. – P. 222–229. 110. An approach to the rapid control of oil spill bioremediation by bioluminescent method of intracellular ATP determination / E.N. Efremenko [et al.] // Int. Biodeterior. Biodegrad. – 2005. – V. 56. – P. 94–100. 111. Antibacterial effects of carbon nanotubes: size does matter! / S. Kang, M. Herzberg, D.F. Rodrigues, M. Elimelech // Langmuir. – 2008. – V. 24(13). – P. 6409–6413. 112. Application of continuous stirred membrane reactor to 3-cyanopyridine bioconversion using the nitrile hydratase–amidase cascade system of M. imperiale CBS 498-74 / L. Cantarella [et al.] // Enzyme Microb. Technol. – 2010. – V. 47. – P. 64–70. 113. Application of immobilized cells for biotransformations of steroids / H.-P. Schmauder [et al.] // J. Basic Microbiol. – 1991. – V. 31(6). – P. 453–477. 114. Application of polyethylene glycol immobilized Clostridium sp. LS2 for continuous hydrogen production from palm oil mill effluent in upflow anaerobic 290 sludge blanket reactor / L. Singh [et al.] // Biochem. Eng. – 2013. – V. 70. – P. 158–165. 115. Aslan, S. Nitritation and denitritation of ammonium-rich wastewater using fluidized-bed biofilm reactors / S. Aslan, M. Dahab // J. Hazard. Mat. – 2008. – V. 156. – P. 56–63. 116. Asymmetric hydrolysis of α-aminonitriles to optically active amino acids by a nitrilase of Rhodococcus rhodochrous PA-34 / T.C. Bhalla [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1992. – V. 37. – P. 184–190. 117. Babu, V. Competitive adsorptions of nitrile hydratase and amidase on polyacrylonitrile and its affect on surface modification / V. Babu, B. Choudhury // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. – 2012. – V. 89. – P. 277–282. 118. Bacterial adhesion. A physicochemical approach / M.C.M. Van Loosdrecht, J. Lyklema, W. Norde, A.J.B. Zehnder // Microb. Ecol. − 1989. − V. 17. − P. 1−15. 119. Banerjee, A. Enhancing the catalytic potential of nitrilase from Pseudomonas putida for stereoselective nitrile hydrolysis / A. Banerjee, P. Kaul, U.C. Banerjee // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – V. 72. – P. 77–87. 120. Banerjee, A. Purification and characterization of an enantioselective arylacetonitrilase from Pseudomonas putida / A. Banerjee, P. Kaul, U. Banerjee // Arch. Microbiol. – 2006. – V. 184. – P. 407–418. 121. Banerjee, A. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects / A. Banerjee, R. Sharma, U.C. Banerjee // Appl. Microbiol. Biotechnol. –2002. – V. 60. – P. 33–44. 122. Beard, T.M. Enantioselective biotransformations using rhodococci / T.M. Beard, M.I. Page // Antonie van Leeuwenhoek. – 1998. – V. 74. – P. 99–106. 123. Behrman, E.J. The bacterial oxidation of nicotinic acid / E.J. Behrman, R.Y. Stanier // J. Biol. Chem. – 1957. – V. 228. – P. 923–945. 124. Biocatalytic scrubbing of gaseous acrylonitrile using Rhodococcus ruber immobilized in synthetic silicone polymer (ImmobaSilTM ) rings / P.C.J. Roach, D.K. Ramsden, J. Hughes, P. Williams // Biotech. Bioeng. – 2004. – V. 85(4). – P. 450–455. 291 125. Biochemical and genetic analyses of nitrile metabolism in Rhodococcus strains / M. Kobayashi, S. Horinouchi, T. Beppu, S. Shimizu // Biotechnology. – 1995. – V. 7–8. – P. 136–138. 126. Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes / D. Cowan [et al.] // Extremophiles. – 1998. – V. 2. – P. 207–216. 127. Biodegradation of BTEX by bacteria on powdered activated carbon / C.A. Mason [et al.] // Bioprocess Engineer. – 2000. – V. 23. – P. 331–336. 128. Biodegradation of propionitrile by Klebsiella oxytoca immobilized in alginate and cellulose triacetate gel / C.Y. Chen, S.C. Chen, M. Fingas, C.M. Kao // J. Hazard. Mater. – 2010. – V. 177. – P. 856–863. 129. Biodegradation potential of the genus Rhodococcus / L. Martínková, M. Pátek, J. Nešvera, V. Křen // Environ. International. – 2009. – V. 35. – P. 162–177. 130. Biofilm and their engineered counterparts: A new generation of immobilised biocatalysts / M. Winn [et al.] // Catal. Sci. Technol. – 2012. – V. 2. – P. 1544– 1547. 131. Biofilm reactors for industrial bioconversion processes: employing potential of enhanced reaction rates / N. Qureshi [et al.] // Microb. Cell Fact. – 2005. – V. 4:24. 132. Biohydrogen production in anaerobic fluidized bed reactors: Effect of support material and hydraulic retention time / A.R. Barros [et al.] // Int. J. Hydrogen Energy. – 2010. – V. 35. – P. 3379–3388. 133. Biohydrolysis of (S)-3-(thiophen-2-ylthio)butanenitrile / M. Gelo-Pujic [et al.] // Tetrahedron Lett. – 2006. – V. 47. – P. 8119–8123. 134. Bioluminescent assay for measurement of bacterial attachment to polyethylene / Ludwicka A. [et al.] // J Microbiol Methods. – 1985. – V. 4. – P. 169–177. 135. Biotransformation of amide using Bacillus sp.: isolation strategy, strain characteristics and enzyme immobilization / M. Sogani, N. Mathur, P. Bhatnagar, P. Sharma // Int. J. Environ. Sci. Technol. – 2012. – V. 9. – P. 119–127. 292 136. Biotransformation of nitriles by Rhodococcus equi A4 immobilized in LentiKats® / D. Kubáč [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 2006. – V. 39. – P. 59–61. 137. Biotransformations of nitriles to amides using soluble and immobilized nitrile hydratase from Rhodococcus erythropolis A4 / D. Kubáč [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 2008. –V. 50. – P. 107–113. 138. Borisov, S.M. Optical nanosensors – smart tools in bioanalytics / S.M. Borisov, I. Klimant // Analyst. – 2008. – V. 133. – P. 1302–1307. 139. Borja, J.Q. Biodegradation of polychlorinated biphenyls using biofilm grown with biphenyl as carbon source in fluidized bed reactor / J.Q. Borja, J.L. Auresenia, S.M. Gallardo // Chemosphere. – 2006. – V. 64. – P. 555–559. 140. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – V. 72. – P. 248–253. 141. Brányik, T. Encapsulation of microbial cells into silica gel / T. Brányik, G. Kuncová // J. Sol-Gel Sci. Technol. – 1998. – V. 13. – P. 283–287. 142. Brena, B.M. Immobilization of enzymes / B.M. Brena, F. Batista-Viera // Methods in Biotechnology: Immobilization of Enzymes and Cells. Ed. by J.M. Guisan / Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2006. – 449 p. 143. Brenner, C. Catalysis in the nitrilase superfamily / C. Brenner // Curr. Opin. Struct. Biol. – 2002. – V. 12. – P. 775–782. 144. Bruggink, A. Synthesis of β-lactam antibiotics: chemistry, biocatalysis and process integration / A. Bruggink, P.D. Roy. – Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2001. – 103 p. 145. Bull, A.T. Biocatalysts for clean industrial products and processess / A.T. Bull, A.W. Bunch, G.K. Robinson // Curr. Opin. Microbiol. – 1999. – V. 2. – P. 246– 251. 146. Bunch, A.W. Biotransformation of nitriles by rhodococci / A.W. Bunch // Antonie Van Leeuwenhoek. – 1998. – V. 74. – P. 89–97. 293 147. Burteau, N. Stabilisation and immobilisation of penicillin amidase / N. Burteau, S. Burton, R.R. Crichton // FEBS Lett. – 1989. – V. 258(2). – P. 185–189. 148. Busscher, H.J. Initial microbial adhesion is a determinant for the strength of biofilm adhesion / H.J. Busscher, R. Bos, H.C. van der Mei // FEMS Microbiol. Lett. – 1995. – V. 128. – P. 229–234. 149. Cameron, R.A. Molecular analysis of the nitrile catabolism operon of the thermophile Bacillus pallidus RAPc8 / R.A. Cameron, M. Sayed, D.A. Cowan // Biochimica et Biophysica Acta. – 2005. – V. 1725. – P. 35–46. 150. Cao, L. Immobilised enzymes: science or art? / L. Cao // Curr. Opin. Chem. Biol. – 2005. – V. 9. – P. 217–226. 151. Catalytic filamentous carbons for immobilization of biologically active substances and non-growing bacterial cells / G.A. Kovalenko [et al.] // Carbon. – 2001. – V. 39. – P. 1033–1043. 152. Cetinus, S. Immobilization of catalase onto chitosan and cibacron blue F3GA attached chitosan beads / S. Cetinus, H. Oztop, D. Saraydın // Enzyme Microb. Technol. – 2007. – V. 41. – P. 447–454. 153. Chacko, S. A comparative study on the production of amidase using immobilized and dehydrated immobilized cells of Pseudomonas putida MTCC 6809 / S. Chacko, P.W. Ramteke, B. Joseph // J. Genetics Engin. Biotechnol. – 2012. – V. 10. – P. 121–127. 154. Characterization of a thermostable D-stereospecific alanine amidase from Brevibacillus borstelensis BCS-1 / D. Baek [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2002. – V. 69. – P. 980–986. 155. Characterisation of nitrilase and nitrile hydratase biocatalytic systems / D. Brady [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – V. 64. – P. 76–85. 156. Chen, J. Biosynthesis of p-methoxyphenylacetic acid from p- methoxyphenylacetonitrile by immobilized Bacillus subtilis ZJB-063 / J. Chen, Y.-G. Zheng, Y.-C. Shen // Proc. Biochem. – 2008. – V. 43. – P. 978–983. 294 157. Chibata, I. Immobilized aspartase-containing microbial cells: preparation and enzymatic properties / I. Chibata, T. Tosa, T. Sato // Appl. Microbiol. – 1974. – V. 27(5). – P. 878–885. 158. Chiyanzu, I. Immobilization of Geobacillus pallidus RAPc8 nitrile hydratase (NHase) reduses substrate inhibition and enhances thermostability / I. Chiyanzu, D.A. Cowan, S.G. Burton // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 2010. – V. 63. – P. 109– 115. 159. Choi, Y.H. Biochemical characterization of Rhodococcus erythropolis N’4 nitrile hydratase acting on 4-chloro-3-hydroxybutyronitrile / Y.H. Choi, K.-N. Uhm, H.-K. Kim // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 2008. – V. 55. – P. 157–163. 160. Ciskanik, L.M. Purification and characterization of an enantioselective amidase from Pseudomonas chlororaphis B 23 / L.M. Ciskanik, J.M. Wilczek, R.D. Fallon // Appl. Environ. Microbiol. – 1995. – V. 61. – P. 998–1003. 161. Cloning and biochemical properties of a highly thermostable and enantioselective nitrilase from Alcaligenes sp. ECU0401 and its potential for (R)(−)-mandelic acid production / Z.-J. Zhang [et al.] // Bioproc. Biosyst. Eng. – 2011. – V. 34. – P. 315–322. 162. Cloning and optimization of a nitrilase for the synthesis of (3S)-3-cyano-5methyl hexanoic acid / Z. Xie [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 2006. – V. 41. – P. 75–80. 163. Cloning, nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of two cobaltcontaining nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous J1 / M. Kobayashi [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta. – 1991. – V. 1129. – P. 23– 33. 164. Cloning, overexpression, and characterization of a thermoactive nitrilase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi / P. Mueller [et al.] // Protein Expr. Purif. – 2006. – V. 47. – P. 672–681. 165. Cobalt-substituted Fe-type nitrile hydratase of Rhodococcus sp. N-771 / M. Nojiri [et al.] // FEBS Letters. – 2000. – V. 465. – P. 173–177. 295 166. Colby, J. Immobilization of Rhodococcus AJ270 and use of entrapped biocatalyst for the production of acrylic acid / J. Colby, D. Snell, G.W. Black // Monatshefte für Chemie. – 2000. – V. 131. – P. 655–666. 167. Comparison of entrapment and biofilm mode of immobilisation for bioethanol production from oilseed rape straw using Saccharomyces cerevisiae cells / A.K. Mathew, M. Crook, K. Chaney, A.C. Humphries // Biomass and Bioenergy. – 2013. – V. 52. – P. 1–7. 168. Comparison of immobilized whole resting cells in different matrices vis-à-vis free cells of Bacillus megaterium for acyltransferase activity / M. Sogani, N. Mathur, P. Sharma, P. Bhatnagar // J. Environ. Res. Develop. – 2012. – V. 6 (3A). – P. 695–701. 169. Continuous high rate production of ethanol by Zymomonas mobilis in an attached film expanded bed fermenter / R.R. Bland [et al.] // Biotechnol. Lett. – 1982. – V. 4. – P. 323–328. 170. Continuous solvent production by Clostridium beijerinckii BA101 immobilized by adsorption onto brick / N. Qureshi, J. Schripsema, J. Lienhardt, H.P. Blaschek // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – V. 16. – P. 377–382. 171. Conversion of mandelonitrile and phenylglycinenitrile by recombinant E. coli cells synthesizing a nitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191 / S. Rustler [et al.] // Enz. Microb. Technol. – 2007. – V. 40. – P. 598–606. 172. Coradin, T. Silica-alginate composites for microencapsulation / T. Coradin, N. Nassif, J. Livage // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2003. – V. 61. – P. 429–434. 173. Cramp, R.A. Molecular characterisation of a novel thermophilic nitrile hydratase / R.A. Cramp, D.A. Cowan // Biochimica et Biophysica Acta. – 1999. – V. 1431. – P. 249–260. 174. Cross-linked aggregates of (R)-oxynitrilase: a stable, recyclable biocatalyst for enantioselective hydrocyanation / L.M. van Langen, R.P. Selassa, F. van Rantwijk, R.A. Sheldon // Org. Lett. – 2005. – V. 7(2). – P. 327–329. 296 175. Cross-linked enzyme aggregates of recombinant Pseudomonas putida nitrilase for enantioselective nitrile hydrolysis / S. Kumar [et al.] // Biores. Technol. – 2010. – V. 101. – P. 6856–6858. 176. Crystal structure of cobalt-containing nitrile hydratase / A. Miyanaga, S. Fushinobu, K. Ito, T. Wakagi // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2001. – V. 288. – P. 1169–1174. 177. Davies, D.G. Growth and comparative physiology of Klebsiella oxytoca attached to granular activated carbon particles and in liquid media / D.G. Davies, G.A. McFeters // Microb. Ecology. – 1988. – V. 15(2). – P. 165–175. 178. Demirci, A. Ethanol production by Saccharomyces cerevisiae in biofilm reactors / A. Demirci, A.L. Pometto III, K.-L.G. Ho // J. Industrial Microbiol. Biotech. – 1997. – V. 19. – P. 299–304. 179. Demirci, A. Evaluation of biofilm reactor solid support for mixed-culture lactic acid production / A. Demirci, A.L. Pometto III, K.E. Johnson // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1993. – V. 38. – P. 728–733. 180. Development of conductimetric biosensor using immobilised Rhodococcus ruber whole cells for the detection and quantification of acrylonitrile / P.C.J. Roach, D.K. Ramsden, J. Hughes, P. Williams // Biosens. Bioelectr. – V. 19. – 2003. – P. 73–78. 181. Dias, J.C.T. Bioconversion of nitriles by Candida guilliermondii CCT 7207 cells immobilized in barium alginate / J.C.T. Dias, R.P. Rezende, V.R. Linardi // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2001. – V. 56. – P. 757–761. 182. Dias, J.C.T. Biodegradation of acetonitrile by cells of Candida guilliermondii UFMG-Y65 immobilized in alginate, κ-carrageenan and citric pectin / J.C.T. Dias, R.P. Rezende, V.R. Linardi // Braz. J. Microb. – 2000. – V. 31. – P. 61–66. 183. Different mechanisms of protein immobilization on glutaraldehyde activated supports: Effect of support activation and immobilization conditions / L. Betancor [et al.] // Enzyme Microb. Technol. – 2006. – V. 39. – P. 877–882. 297 184. Discovery of a mandelonitrile hydrolase from Bradyrhizobium japonicum USDA110 by rational genome mining / D. Zhu, C. Mukherjee, E.R. Biehl, L. Hua // J. Biotechnol. – 2007. – V. 129. – P. 645–650. 185. Discovery of a reaction intermediate of aliphatic aldoxime dehydratase involving heme as an active center / K. Konishi [et al.] // PNAS. – 2006. – V. 103(3). – P. 564–568. 186. Dordick, J.S. The evolution of biotransformation technologies / J.S. Dordick, Y.L. Khmelnitsky, M.V. Sergeeva // Curr. Opin. Microbiol. – 1998. – V. 1. – P. 311–318. 187. Dwevedi, A. Optimal immobilization of β-galactosidase from Pea (PsBGAL) onto Sephadex and chitosan beads using response surface methodology and its applications / A. Dwevedi, A.M. Kayastha // Biores. Technol. – 2009. – V. 100. – P. 2667–2675. 188. Ebbs, S. Biological degradation of cyanide compounds / S. Ebbs // Curr. Opin. Biotechnol. – 2004. – V. 15. – P. 231–236. 189. Effective removal of microcystins using carbon nanotubes embedded with bacteria / H.Yan [et al.] // Chin. Sci. Bull. – 2004. – V. 49. – P. 1694–1698. 190. Enantioselective biocatalytic hydrolysis of (R,S)-mandelonitrile for production of (R)-(−)-mandelic acid by a newly isolated mutant strain / Y.-P. Xue [et al.] //J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2011. – V. 38. – P. 337–345. 191. Enantioselective hydrolysis of β-hydroxy nitriles using the whole cell biocatalyst Rhodococcus rhodochrous ATCC BAA-870 / H.H. Kinfe [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 2009. – V. 59. – P. 231–236. 192. Enantioselective hydrolysis of naproxen nitrile and naproxen amide to Snaproxen by new bacterial isolates / N. Layh [et al.] // J. Bacteriol. – 1994. – V. 33. – P. 175–182. 193. Enantioselective hydrolysis of (R)-2, 2-dimethylcyclopropane carboxamide by immobilized cells of an R-amidase-producing bacterium, Delftia tsuruhatensis CCTCC M 205114, on an alginate capsule carrier / Y.-S. Wang [et al.] // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2010. – V. 37. – P. 503–510. 298 194. Enantioselective hydrolysis of racemic 2-phenylpropionitrile and other (R, S)-2arylpropionitriles by a new bacterial isolate, Agrobacterium tumefaciens strain d3 / R. Bauer [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1994. – V. 42. – P. 1–7. 195. Enantioselective nitrilase from Pseudomonas putida: cloning, heterologous expression, and bioreactor studies / A. Banerjee [et al.] // Mol. Biotechnol. – 2009. – V. 41. – P. 35–41. 196. Endo, T. Nitrile hydratase of Rhodococcus sp. N-774. Purification and amino acid sequences / T. Endo, I. Watanabe // FEBS Lett. – 1989. – V. 243(1). – P. 61–64. 197. Enhanced benzaldehyde tolerance in Zymomonas mobilis biofilms and the potential of biofilm applications in fine-chemical production / X.Z. Li, J.S. Webb, S. Kjelleberg, B. Rosche // Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – V. 72. – P. 1639–1644. 198. Enhanced production of amidase from Rhodococcus erythropolis MTCC 1526 by medium optimisation using a statistical experimental design / B.K. Vaidya [et al.] //J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – V. 36. – P. 671–678 199. Enzymatic production of D-alanine from D,L-alaninamide by novel Dalaninamide specific amide hydrolase / A. Ozaki, H. Kawasaki, M. Yagasaki, Y. Hashimoto // Biosci. Biotechn. Biochem. –1992. – V. 56. – P. 1980–1984. 200. Enzymic resolution of DL-phenylglycine / G.D.C. Machado, M. Gomes Jr., O.A.C. Antunes, E.G. Oestreicher // Proc. Biochem. – 2005. – V. 40. – P. 3186– 3189. 201. Eş, I. Principles, techniques, and applications of biocatalyst immobilization for industrial application / I. Eş, J.D.G. Vieira, A.C. Amaral // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2015. – V. 99. – P. 2065–2082. 202. Evaluation of succinic acid continuous and repeat-batch biofilm fermentation by Actinobacillus succinogenes using plastic composite support bioreactors / S.E. Urbance, A.L. Pometto III., A.A. DiSpirito, Y. Denli // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – V. 65. – P. 664–670. 299 203. Extracellular polymeric substances responsible for bacterial adhesion onto solid surface / S. Tsuneda [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 2003. – V. 223. – P. 287– 292. 204. Extracellular products as mediators of the formation and detachment of Pseudomonas fluorescens biofilms / D.G. Allison [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 1998. – V. 167. – P. 179–184. 205. Fernandez-Lafuente, R. Stabilization of multimeric enzymes: Strategies to prevent subunit dissociation / R. Fernandez-Lafuente // Enzyme Microb. Technol. – 2009. – V. 45. – P. 405–418. 206. Fe-type nitrile hydratase / I. Endo [et al.] // J. Inorg. Biochem. – 2001. – V. 83. – P. 247–253. 207. Forberg, C. Control of cell adhesion and activity during continuous production of acetone and butanol with adsorbed cells / C. Forberg, L. Haggstrom // Enzyme Microb. Technol. – 1985. – V. 7. – P. 230–234. 208. Fournand, D. Aliphatic and enantioselective amidases: from hydrolysis to acyl transfer activity / D. Fournand, A. Arnaud // J. Appl. Microbiol. – 2001. – V. 91. – P. 381–393. 209. Ghannoum, M. Microbial biofilms / M. Ghannoum, G.A. O’Toole. – Washington, DC: ASM Press, 2004. – 426 p. 210. Gradley, M.L. Asymmetric hydrolysis of R-(−), S(+)-2-methylbutyronitrile by Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 / M.L. Gradley, C.J.F. Deverson, C.J. Knowles // Arch. Microbiol. – 1994. – V. 161. – P. 246–251. 211. Håkansson, K. Microbial degradation of acetonitrile using a suspended-carrier biofilm process / K. Håkansson, B. Mattiasson // Biotechnol. Lett. – 2002. – V. 24. – P. 287–291. 212. Halan, B. Biofilms as living catalysts in continuous chemical syntheses / B. Halan, K. Buehler, A. Schmid // Trends Biotechnol. – 2012. – V. 30(9). – P. 453–465. 300 213. Hasar, H. Simultaneous removal of organic matter and nitrogen compounds by combining a membrane bioreactor and a membrane biofilm reactor / H. Hasar // Biores. Technol. – 2009 – V. 100. – P. 2699–2705. 214. Hensel, M. Stereoselective hydration of (RS)-phenylglycine nitrile by new whole cell biocatalysts / M. Hensel, S. Lutz-Wahl, L. Fischer // Tetrahedron: Asymmetry. – 2002. – V. 13. – P. 2629–2633. 215. Hirrlinger, B. Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyzes 2- arylpropionamides / B. Hirrlinger, A. Stolz, H.J. Knackmuss // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178. – P. 3501–3507. 216. Ho, K.-L.G. Optimization of L-(+)-lactic acid production by ring and disc plastic composite supports through repeated-batch biofilm fermentation / K.-L. G.Ho, A.L. Pometto III, P.N. Hinz // Appl. Env. Microbiol. – 1997. – V. 63(7). – P. 2533–2542. 217. Hori, K. Bacterial adhesion: from mechanism to control / K. Hori, S. Matsumoto // Biochem. Eng. J. – 2010. – V. 48. – P. 424−434. 218. Hoyle, A.J. The nitrilases of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 / A.J. Hoyle, A.W. Bunch, C.J. Knowles // Enzyme Microb. Technol. – 1998. – V. 23. – P. 475–482. 219. Hughes, D.E. 6-Hydroxynicotinic acid as an intermediate in the oxidation of nicotinic acid by Pseudomonas fluorescens / D.E. Hughes // Biochem. – 1955. – V. 60. – P. 303–310. 220. Hughes, J. Application of whole cell rhodococcal biocatalysts in acrylic polymer manufacture / J. Hughes, Y.C. Armitage, K.C. Symes // Antonie Van Leeuwenhoek. – 1998. – V. 74(1–3). – P. 107–118. 221. Hwang, J.S. Biotransformation of acrylonitrile to acrylamide using immobilized whole cells of Brevibacterium CH1 in a recycle fed-batch reactor / J.S. Hwang, H.N. Chang // Biotech. Bioeng. – 1989. – V. 34. – P. 380–386. 301 222. Hydratation of nitriles using a bacterial nitrile-hydratase immobilized on DEAE-cellulose / H. Fradet, A. Arnaud, G. Rios, P. Galzy // Biotechnol. Bioeng. – 1985. – V. 27. – P. 1581–1585. 223. Hydrolysis of D,L-phenylglycine nitrile by new bacterial cultures / M.A. Wegman [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. – 2001. – V. 11. – P. 249–253. 224. Hydrolysis of nitriles and amides by filamentous fungi / O. Kaplan, K. Nikolaou, A. Pišvejcová, L. Martínková // Enzyme Microb. Technol. – 2006. – V. 38. – P. 260–264. 225. Hydrolysis of nitriles using an immobilized nitrilase: applications to the synthesis of methionine hydroxy analogue derivatives / P. Rey [et al.] // J. Agric. Food Chem. – 2004. – V. 52. – P. 8155–8162. 226. Identification and characterization of a novel nitrilase from Pseudomonas fluorescens Pf-5 / J.-S. Kim [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – V. 83. – P. 273–283. 227. Immobilization of cells with nitrilase activity from a thermophilic bacterial strain / L. Kabaivanova, E. Dobreva, P. Dimitrov, E. Emanuilova // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2005. – V. 32. – P. 7–11. 228. Immobilization of fungal nitrilase and bacterial amidase – two enzymes working in accord / V. Vejvoda [et al.] // Biocatal. Biotransform. – 2006. – V. 24(6). – P. 414–418. 229. Immobilization of Rhodococcus sp. AJ270 in alginate capsules and its application in enantioselective biotransformation of trans-2-methyl-3-phenyloxiranecarbonitrile and amide / X.-L. Guo, G. Deng, J. Xu, M.-X. Wang // Enzyme Microb. Technol. – 2006. – V. 39. – P. 1–5. 230. Immobilized yeast cell system for continuous fermentation application / P.J. Verbelen [et al.] // Biotechnol. Lett. – 2006. – V. 28. – P. 1515–1525. 231. Immobilized-cell physiology: current date and the potentialities of proteomics / G.A. Junter, L. Coquet, S. Vilain, T. Jouenne // Enzyme Microb. Technol. – 2002. – V. 31. – P. 201–212. 302 232. Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques / C. Mateo [et al.] // Enzyme Microb. Technol. –2007. – V. 40. – P. 1451–1463. 233. In vitro biofilm formation of commensal and pathogenic Escherichia coli / A. Reisner [et al.] // J. Bacteriol. – 2006. – V. 188(10). – P. 3572–3581. 234. Industrial biocatalysis today and tomorrow / A. Schmid [et al.] // Nature. – 2001. – V. 409. – P. 258–268. 235. Industrial methods for the production of optically active intermediates / M. Breuer [et al.] // Angew. Chem. Int. Ed. – 2004. – V. 43. – P. 788–824. 236. Integrated application of upflow anaerobic sludge blanket reactor for the treatment of wastewaters / M.A. Latif, R. Ghufran, Z.A. Wahid, A. Ahmad // Water Res. – 2011. – V. 45. – P. 4683–4699. 237. Isolation and primary characterization of an amidase from Rhodococcus rhodochrous / E.K. Kotlova [et al.] // Biochemistry (Mosc). – 1999. – V. 64. – P. 384–390. 238. Iyer, P.V. Enzyme stability and stabilization – aqueous and non-aqueous environment / P.V. Iyer, L. Ananthanarayan // Process Biochem. – 2008. – V. 43. – P. 1019–1032. 239. Junter, G.-A. Immobilized viable microbial cells: from the process to the proteome... or the cart before the horse / G.-A. Junter, T. Jouenne // Biotech. Adv. – 2004. – V. 22. – P. 633–658. 240. Kamble, A. Optimization of crucial reaction conditions for the production of nicotinamide by nitrile hydratase using response surface methodology / A. Kamble, U.C. Banerjee // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2008. – V. 151. – P. 143–150. 241. Kato, Y. Nitrile hydratase involved in aldoxime metabolism from Rhodococcus sp. strain YH3-3 / Y. Kato, T. Tsuda, Y. Asano // Eur. J. Biochem. – 1999. – V. 263. – P. 662–670. 303 242. Kaul, P. Cross-linked amorphous nitrilase aggregates for enantioselective nitrile hydrolysis / P. Kaul, A. Stolz, U.C. Banerjee // Adv. Synth. Catal. – 2007. – V. 349. – P. 2167–2176. 243. Kaul, P. Predicting enzyme behavior in nonconventional media: correlating nitrilase function with solvent properties / P. Kaul, U.C. Banerjee // Microb. Biotechnol. – 2008. – V. 35. – P. 713–720. 244. Kinniment, S.L. Measurements of the distribution of adenylate concentrations and adenylate energy charge across Pseudomonas aeruginosa biofilms / S.L. Kinniment, J.W.T. Wimpenny // Appl. Environ. Microbiol. – 1992. – V. 58(5). – P. 1629–1635 245. Kligler, I.J. The function of nicotinic acid in bacterial metabolism / I.J. Kligler, N. Grossowicz // J. Bacteriol. – 1941. – V. 42(2). – P. 173–192. 246. Kobayashi, M. Cobalt proteins / M. Kobayashi, S. Shimizu // Eur. J. Biochem. – 1999. – V. 261. – P. 1–9. 247. Kobayashi, M. Enzymatic synthesis of acrylamide: a success story not yet over… / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Trends Biotechnol. – 1992. – V. 10. – P. 402–408. 248. Kobayashi, M. Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous J1. Purification and characterization / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Eur. J. Biochem. – 1989. – V. 182. – P. 349–356. 249. Kobayashi, M. Nitrile hydrolases / M. Kobayashi, S. Shimizu // Curr. Opin. Chem. Biol. – 2000. – V. 4. – P. 95–102. 250. Kobayashi, M. The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis / M. Kobayashi, M. Goda, S. Shimizu // FEBS Lett. – 1998. – V. 439(3). – P. 325–328. 251. Kobayashi, M. Regiospecific hydrolysis of dinitrile compounds by nitrilase from Rhodococcus rhodochrous J1 / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1988. – V. 29. – P. 231–233. 304 252. Kobayashi, M. Versatile nitrilases: nitrile-hydrolysing enzymes / M. Kobayashi, S. Shimizu // FEMS Microbiol. Lett. – 1994. – V. 120. – P. 217–224. 253. Kobayashi, S. Immobilized catalysts in combinatorial chemistry / Curr. Opin. Chem. Biol. – 2000. – V. 4. – P. 338–345. 254. Komeda, H. A novel D-stereoselective amino acid amidase from Brevibacterium iodinum: gene cloning, expression and characterization / H. Komeda, Y. Asano // Enzyme Microb. Technol. – 2008. – V. 43. – P. 276–283. 255. Komeda, H. Gene cloning, nucleotide sequencing, and purification and characterization of the D-stereospecific amino-acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3 / H. Komeda, Y. Asano // Eur. J. Biochem. – 2000. – V. 267(7). – P. 2028–2035. 256. Komeda, H. Enhancement of the thermostability and catalytic activity of Dstereospecific amino-acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3 by directed evolution / H. Komeda, N. Ishikawa, Y. Asano // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 2003. – V. 21. – P. 283–290. 257. Komeda, H. L-Stereoselective amino acid amidase with broad substrate specificity from Brevundimonas diminuta: characterization of a new member of the leucine aminopeptidase family / H. Komeda, N. Hariyama, Y. Asano // Appl. Microbiol. Biotech. – 2006. – V. 70. – P. 412–421. 258. Krajewska, B. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review / B. Krajewska // Enzyme Microb. Technol. – 2004. – V. 35. – P. 125–139. 259. Krug, T.A. Ethanol production using Zymomonas mobilis immobilized on an ion exchange resin / T.A. Krug, A.J. Daugulis // Biotechnol. Lett. – 1983. – V. 5. – P. 159–164. 260. Kukushkin, V.Y. Metal-mediated and metal-catalyzed hydrolysis of nitriles / V.Y. Kukushkin, A.J.L. Pombeiro // Inorg. Chim. Acta. – 2005. – V. 358. – P. 1– 21. 305 261. Kumar, S. Process intensification of nicotinic acid production via enzymatic conversion using reactive extraction / S. Kumar, B.V. Babu // Chem. Biochem. Eng. – 2009. – V. 23(3). – P. 367–376. 262. Kunduru, M.R. Continuous ethanol production by Zymomonas mobilis and Saccharomyces cerevisiae in biofilm reactors / M.R. Kunduru, A.L. Pometto III // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 1996. – V. 16. – P. 249–256. 263. L-Selective amidase with extremely broad substrate specificity from Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 / T. Sonke [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – V. 71. – P. 7961–7973. 264. Lag phase is a distinct growth phase that prepares bacteria for exponential growth and involves transient metal accumulation / M.D. Rolfe [et al.] // J. Bacteriol. – 2012. – V. 194(3). – P. 686–701. 265. Landini, P. Cross-talk mechanisms in biofilm formation and responses to environmental and physiological stress in Escherichia coli / P. Landini // Res. Microbiol. – 2009. – V. 160(4). – P. 259–266. 266. Layh, N. Characterization and partial purification of an enantioselective arylacetonitrilase from Pseudomonas fluorescens DSM 7155 / N. Layh, J. Parratt, A. Willetts // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 1998. – V. 5. – P. 467–474. 267. Lee, Y.N. Measurement of ATP generation and decay in Micobacterium leprae in vitro / Y.N. Lee, M.J. Colston // J. General Microbiol. – 1985. – V. 131. – P. 3331–3337. 268. Li, T. Biodegradation of organonitriles by adapted activated sludge consortium with acetonitrile-degrading microorganisms / T. Li [et al.] // Water Res. – 2007. – V. 41. – P. 3465–3473. 269. Liljeblad, A. Biocatalysis as a profound tool in the preparation of highly enantiopure β-amino acids / A. Liljeblad, L.T. Kanerva // Tetrahedron. – 2006. – V. 62. – P. 5831–5854. 270. Long-term stability of hydrogen and organic acids production in an anaerobic fluidized-bed reactor using heat treated anaerobic sludge inoculum / G.M. Shida [et al.] // Int. J. Hydrogen Energy. – 2009. – V. 34. – P. 3679–3688. 306 271. López-Cortés, A. Paleobiological significance of hydrophobicity and adhesion of phototrophic bacteria from microbial mats / A. López-Cortés // Precambrian Res. – 1999. – V. 96. – P. 25–39. 272. Low-molecular-mass nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1: purification, substrate specificity and comparison with the analogous highmolecular-mass enzyme / M. Wieser [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 1998. – V. 169. – P. 17–22. 273. Lozinsky, V.I. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments / V.I. Lozinsky, F.M. Plieva // Enzyme Microb. Technol. – 1998. – V. 23. – P. 227–242. 274. Maddox, I.S. Continuous production of 2,3-butanediol from whey permeate using cells of Klebsiella pneumoniae immobilized on to bonechar / I.S. Maddox, N. Qureshi, J. McQueen // New Zealand J. Dairy Sci. Technol. – 1988. – V. 23. – P. 127–132. 275. Martin, K.J. The membrane biofilm reactor (MBfR) for water and wastewater treatment: Principles, applications, and recent developments / K.J. Martin, R. Nerenberg // Biores. Technol. – 2012. – V. 122. – P. 83–94. 276. Martínková, L. Biotransformations with nitrilases / L. Martínková, V. Křen // Curr. Opin. Chem. Biol. – 2010. – V. 14. – P.130–137. 277. Mascharak, P.K. Structural and functional models of nitrile hydratase / P.K. Mascharak // Coordin. Chem. Rew. – 2002. – V. 225. – P. 201–214. 278. Mathew, C.D. Nitrilase-catalyzed production of nicotinic acid from 3cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous JI / C.D. Mathew, T. Nagasawa, M. Kobayashi, H. Yamada // Appl. Environ. Microbiol. – 1988. – V. 54. – P. 1030–1032. 279. Mattiasson, B. Microenvironmental effects on metabolic behaviour of immobilized cells. A hypothesis / B. Mattiasson, B. Hahn-Hӓgerdal // European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1982. – V. 16. – P. 52–55. 307 280. Metabolism of acrylonitrile by Klebsiella pneumoniae / M.S. Nawaz [et al.] // Arch. Microbiol. – 1991. – V. 156. – P. 231–238. 281. Microbial biofilms: a concept for industrial catalysis? / B. Rosche [et al.] // Trends Biotechnol. – 2009. – V. 27(11). – P. 636–643. 282. Microbial biofilms: new catalysts for maximizing productivity of long-term biotransformations / R. Gross, B. Hauer, K. Otto, A. Schmid // Biotechnol Bioeng. – 2007. – V. 98(6). – P. 1123–1134. 283. Mild hydrolysis of nitriles by the immobilized nitrilase from Aspergillus niger K10 / V. Vejvoda, O. Kaplan, K. Bezouska, L. Martinkova // J. Mol. Catal. B: Enzym. – 2006. – V. 39. – P. 55–58. 284. Molawa, L.G. Modification of alcalase SphereZyme™ by entrapment in LentiKats® to impart improved particle stability / L.G. Molawa, J. Jordaan, J. Limson, D. Brady // Biocatal. Biotransform. – 2013. – V. 31(2). – P. 71–78. 285. Molawa, L.G. Determining the applicability of the SphereZymes® immobilised protease for the biocatalysis of protein / L.G. Molawa, D. Brady, J. Jordaan //European Cells and Materials. – 2010. – V. 19(1). – P. 30. 286. Mowla, D. Theoretical and experimental investigation of biodegradation of hydrocarbon polluted water in a three phase fluidized-bed bioreactor with PVC biofilm support / D. Mowla, M. Ahmadi // Biochem. Eng. J. – 2007. – V. 36. – P. 147–156. 287. Mylerová, V. Synthetic applications of nitrile-converting enzymes / V. Mylerová, L. Martínková // Curr. Org. Chem. – 2003. – V. 7. – P. 1–17. 288. Nagasawa, T. A novel nitrilase, arylacetonitrilase, of Alcaligenes faecalis JM3: Purification and characterization / T. Nagasawa, J. Mauger, H. Yamada // Eur. J. Biochem. – 1990. – V. 194. – P. 765–772. 289. Nagasawa, T. Application of nitrile converting enzymes for production of useful compounds / T. Nagasawa, H. Yamada // Pure & Appl. Chem. – 1990. – V. 62, N. 7. – P. 1441–1444. 290. Nagasawa, T. Occurrence of a cobalt-induced and cobalt-containing nitrile hydratase in Rhodococcus rhodochrous J1 / T. Nagasawa, K. Takeuchi, H. 308 Yamada // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1988. – V. 155(2). – P. 1008 – 1016. 291. Nagasawa, T. Production of acrylic acid and methacrylic acid using Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase / T. Nagasawa, T. Nakamura, H. Yamada // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1990. – V. 34. – P. 322–324. 292. Nawaz, M.S. Metabolism of benzonitrile and butyronitrile by Klebsiella pneumoniae / M.S. Nawaz // Appl. Environ. Microbiol. – 1992. – V. 58(1). – P. 27–31. 293. New thermostable D-methionine amidase from Brevibacillus borstelensis BCS1 and its application for D-phenylalanine production / D. Baek [et al.] // Enzyme Microb. Technol. – 2003. – V. 32. – P. 131–139. 294. Nicolella, C. Wastewater treatment with particulate biofilm reactors / C. Nicolella, M.C.M. van Loosdrecht, J.J. Heijnen // J. Bacteriol. – 2000. – V. 80. – P. 1–33. 295. Nicotinic acid bio-production by Microbacterium imperiale CBS 489-74: effect of 3-cyanopyridine and temperature on amidase activity / M. Cantarella [et al.] // Process Biochem. – 2012. – V. 47. – P. 1192–1196. 296. Nicotinic acid bioproduction in UF-membrane reactor via nitrile hydrataseamidase catalyzed reactions / M. Cantarella [et al.] // Chem. Eng. Trans. – 2008. – V. 14. – P. 323 – 328. 297. Nikolajeva, V. Factors influencing adhesion of Pseudomonas putida on porous clay ceramic granules / V. Nikolajeva, T. Griba, Z. Petriņa // Environ. Exp. Biol. – 2012. – V. 10. – P. 77–80. 298. Nitrilase and its application as a “green” catalyst / R. Singh [et al.] // Chem. Biodiversity. – 2006. – V. 3. – P. 1279–1287. 299. Nitrilase-catalysed desymmetrisation of 3-hydroxyglutaronitrile: preparation of a statin side-chain intermediate / S. Bergeron [et al.] // Org. Proc. Res. Develop. – 2006. – V. 10. – P. 661–665. 309 300. Nitrilase-catalyzed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous JI / C.D. Mathew, T. Nagasawa, M. Kobayashi, H. Yamada // Appl. Environ. Microbiol. –1988. – V. 54. – P. 1030–1032. 301. Nitrilases in nitrile biocatalysis: recent progress and forthcoming research / J.-S. Gong [et al.] // Microb. Cell Factories – 2012. – 11:142. 302. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous J1. Sequencing and overexpression of the gene and identification of an essential cysteine residue / M. Kobayashi [et al.] // Biol. Chem. – 1992. – V. 267(29). – P. 20746–20751. 303. Nitrile biotransformations using free and immobilized cells of a thermophilic Bacillus spp. / D. Graham, R. Pereira, D. Barfield, D. Cowan // Enzyme Microbiol. Technol. – 2000. – V. 26. – P. 368–373. 304. Nitrile hydratase and amidase from Rhodococcus rhodochrous hydrolyze acrylic fibers and granular polyacrylonitriles / M.M. Tauber, A. Cavaco-Paulo, K.-H. Robra, G.M. Gübitz // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – V. 66(4). – P. 1634–1638. 305. Nitrile hydratase-catalyzed production of nicotinamide from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 / T. Nagasawa, C.D. Mathew, J. Mauger, H. Yamada // Appl. Environ. Microbiol. – 1988. – V. 54(7). – P. 1766–1769. 306. Nitrile hydratase from Mesorhizobium sp. F28 and its potential for nitrile biotransformation / Y.-S. Feng [et al.] // Proc. Biochem. – 2008. – V. 43. – P. 1391–1397. 307. Nitrile pathway involving Acyl-CoA synthetase / Y. Hashimoto [et al.] // J. Biol. Chem. – 2005. – V. 280(10). – P. 8660–8667. 308. Nocardia globerula NHB-2: Bench scale production of nicotinic acid / N.N. Sharma, M. Sharma, H. Kumar, T. C. Bhalla // Process Biochem. – 2006. – V 41. – P. 2078–2081. 309. Novel biosynthesis of (R)-ethyl-3-hydroxyglutarate with (R)-enantioselective hydrolysis of racemic ethyl 4-cyano-3-hydroxybutyate by Rhodococcus erythropolis / H.-P. Dong, Z.-Q. Liu, Y.-G. Zheng, Y.-C. Shen // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2010. – V. 87. – P. 1335–1345. 310 310. O’Reilly, C. The nitrilase family of CN hydrolysing enzymes – a comparative study / C. O’Reilly, P.D. Turner // J. Appl. Microbiol. – 2003. – V. 95. – P. 1161–1174. 311. O’Toole, G.A. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis / G.A. O’Toole, R. Kolter // Mol. Microbiol. – 1998. – V. 28(3). – P. 449–461. 312. O'Toole, G.A. Microtiter dish biofilm formation assay / G.A. O'Toole // 2011. – J. Vis. Exp. – 47:2437. 313. Occurrence of enzymes involved in biosynthesis of indole-3-acetic acid from indole-3-acetonitrile in plant-associated bacteria, Agrobacterium and Rhizobium / M. Kobayashi [et al.] // PNAS. – 1995. – V. 92. – P. 714–718. 314. Odaka, M. Post-translational modifications in nitrile hydratase family / M. Odaka, M. Tsujimura, I. Endo // RIKEN Review. – 2001. – N. 41. – P. 58–60. 315. Oligomeric structure of nitrilases. Effect of mutating interfacial residues on activity / Sewell B.T., Thuku R.N., Zhang X., Benedik M.J. // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2005. – V. 1056. – P. 153–159. 316. Optimal conditions for cultivation of Rhodococcus sp. N-774 and for conversion of acrylonitrile to acrylamide by resting cells / I. Watanabe [et al.] // Agric. Biol. Chem. – 1987. – V. 51(12). – P. 3201–3206. 317. Optimization of nitrilase production from Alcaligenes faecalis MTCC 10757 (IICT-A3): effect of inducers on substrate specificity/ Y.V.D. Nageshwar [et al.] // Bioproc. Biosyst. Eng. – 2011. – V. 34. – P. 515–523. 318. Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1 / T. Nagasawa [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1991. – V. 34. – P. 783–788. 319. Pace, H.C. The nitrilase superfamily: classification, structure and function / H.C. Pace, C. Brenner // Genome Biol. – 2001. – V. 2(1). – P. 1–9. 311 320. Park, J.K. Microencapsulation of microbial cells / J.K. Park, H.N. Chang // Biotech. Adv. – 2000. – V. 18. – P. 303–319. 321. Park, H.J. Biotransformation of amides to acids using a co-cross-linked enzyme aggregate of Rhodococcus erythropolis amidase / H.J. Park, K.-N. Uhm, H.-K. Kim // J. Microbiol. Biotechnol. – 2010. – V. 20(2). – P. 325–331. 322. Pawar, S.V. Enantioselective enzymatic hydrolysis of rac-mandelonitrile to Rmandelamide by nitrile hydratase immobilized on poly(vinylalcohol)/chitosan−glutaraldehyde support / S.V. Pawar, G.D. Yadav // Ind. Eng. Chem. Res. − 2014. − V. 53. − P. 7986−7991. 323. Peeters, E. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates / E. Peeters, H.J. Nelis, T. Coenye // J. Microbiol. Methods. – 2008. – V. 72. – P. 157–165. 324. Performance of a membrane biofilm reactor for denitrification with metane / O. Modin, K. Fukushi, F. Nakajima, K. Yamamoto // Biores. Technol. – 2008. – V. 99. – P. 8054–8060. 325. Pinsky, A. The oxidation of nicotinic acid by Pseudomonas fluorescens / A. Pinsky, M. Michaelis // Biochem. – 1952. – V. 52. – P. 33–38. 326. Podar, M. Evolution of a microbial nitrilase gene family: a comparative and environmental genomics study / M. Podar, J.R. Eads, T.H. Richardson // BMC Evolutionary Biology. – 2005. – 5:42. 327. Pollard, D.J. Biocatalysis for pharmaceutical intermediates: the future is now / D.J. Pollard, J.M. Woodley // Trends Biotechnol. – 2006. – V. 25(2). – P. 66– 73. 328. Polyvinyl alcohol-immobilized whole-cell preparations for the biotransformation of nitriles / A. Bauer, N. Layh, C. Syldatk, A. Willetts // Biotechnol. Lett. – 1996. – V. 18. – P. 343–348. 329. Prabu, C.S. Biodegradation of acrylamide employing free and immobilized cells of Pseudomonas aeruginosa / C.S. Prabu, A.J. Thatheyus // Int. Biodeterior. Biodegrad. – 2007. – V. 60. – P. 69–73. 312 330. Prasad, S. Bench scale conversion of 3-cyanopyidine to nicotinamide using resting cells of Rhodococcus rhodochrous PA-34. / S. Prasad, J. Raj, T. C. Bhalla // Indian J. Microbiol. – 2007. – V. 47. – P. 34–41. 331. Prasad, S. Nitrile hydratases (Nhases): At the interface of academia and industry / S. Prasad, T.C. Bhalla // Biotech. Adv. – 2010. – V. 28. – P. 725–741. 332. Precigou, S. Rapid and specific identification of nitrile hydratase (NHase)encoding genes in soil samples by polymerase chain reaction / S. Precigou, P. Goulas, R. Duran // FEMS Microbiol. Lett. – 2001. – V. 204. – P. 155–161. 333. Preiml, M. A new approach to β-amino acids: biotransformation of N-protected β-amino nitriles / M. Preiml, K. Hillmayer, N. Klempier // Tetrahedron Lett. – 2003. – V. 44. – P. 5057–5059. 334. Preiml, M. Biotransformation of β-amino nitriles: the role of the N-protecting group / M. Preiml, H. Hӧnig, N. Klempier // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. – 2004. – V. 29. – P. 115–121. 335. Primary structure of an aliphatic nitrile-degrading enzyme, aliphatic nitrilase, from Rhodococcus rhodochrous K22 and expression of its gene and identification of its active site residue / M. Kobayashi, N. Yanaka, T. Nagasawa, H. Yamada // Biochemistry. – 1992. – V. 31. – P. 9000–9007. 336. Production of fumaric acid by immobilized Rhizopus arrhizus on net / C. Gu [et al.] // Biores. Technol. – 2013. – V. 131. – P. 303–307. 337. Production of isonicotinic acid using agar entrapped whole cells of Nocardia globerula NHB-2 / T.C. Bhalla, P.K. Mehta, N.N. Sharma, S.K. Bhatia // XVIIth International Conference on Bioencapsulation, Groningen, Netherlands. – 2009. – Poster P40. – P. 1–4. 338. Production of hydroxamic acids by immobilized Pseudomonas aeruginosa cells: Kinetic analysis in reverse micelles / M. Bernardo, R. Pacheco, M.L.M. Serralheiro, A. Karmali // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. – 2013. – V. 93. – P. 28– 33. 313 339. Production of (R)-(–)-mandelic acid from mandelonitrile by Alcaligenes faecalis ATCC 8759 / K. Yamamoto, K. Oishi, I. Fujimatsu, K. Komatsu // Appl. Environ. Microbiol. – 1991. – V. 57. – P. 3028–3032. 340. Production of S-(+)-Ibuprofen from nitrile compound by Acinetobacter sp. strain AK226 / K. Yamamoto [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1990. – V. 56(10). – P. 3125–3129. 341. Purification and characterization of a novel nitrilase of Rhodococcus rhodochrous K22 that acts on aliphatic nitriles / M. Kobayashi, N. Yanaka, T. Nagasawa, H. Yamada // J. Bacteriol. – 1990. – V. 172. – P. 4807–4815. 342. Purification and characterization of a nitrilase from Aspergillus niger K10 / O. Kaplan [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – V. 73. – P. 567–575. 343. Purification and characterization of a nitrilase from Fusarium solani O1 / V. Vejvoda [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. – 2008. – V. 50. – P. 99– 106. 344. Purification and characterization of amidase from acrylamide-degrading bacterium Burkholderia sp. strain DR.Y27 / M.A. Syed, S.A. Ahmad, N. Kusnin, M.Y.A. Shukor // Afric. J. Biotech. – 2012. – V. 11(2). – P. 329– 336. 345. Purification and characterization of an L-amino amidase from Mycobacterium neoaurum ATCC 25795 / H. Hermes [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. –1993. – V. 60. – P. 153–159. 346. Purification and characterization of the enantioselective nitrile hydratase from Rhodococcus equi A4 / I. Prepechalova [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2001. – V. 55. – P. 150–156. 347. Purification, cloning, sequencing and over-expression in Escherichia coli of a regioselective aliphatic nitrilase from Acidovorax facilis 72W / S. Chauhan [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2003. – V. 61. – P. 118–122. 348. Qadreyah, A.A. Thermostable nitrilase catalysed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine / A.A. Qadreyah, D.A. Cowan // Enzyme Microb. Technol. – 1999. – V. 25. – P. 718–724. 314 349. Quorum sensing veterinary pathogens: Mechanisms, clinical importance and future perspectives / F. Boyen [et al.] // Veterinary Microbiol. – 2009. – V. 135. – P. 187–195. 350. Qureshi, N. Reactor design for the ABE fermentation using cells of Clostridium acetobutylicum immobilized by adsorption onto bonechar / N. Qureshi, I.S. Maddox // Bioprocess Eng. – 1988. – V. 3. – P. 69–72. 351. Rabah, F.K.J. Nitrate removal characteristics of high performance fluidized-bed biofilm reactor / F.K.J. Rabah, M.F. Dahab // Water Res. – 2004. –V. 38. – P. 3719–3728. 352. Raj, J. Rhodococcus rhodochrous PA-34: A potential biocatalyst for acrylamide synthesis / J. Raj, S. Prasad, T.C. Bhalla // Proc. Biochem. – 2006. – V. 41. – P. 1359–1363. 353. Recent advance in the support and technology used in enzyme immobilization / T. Xie [et al.] // African J. Biotechnol. – 2009. – V. 8(19). – P. 4724–4733. 354. Regioselective biocatalytic hydrolysis of (E,Z)-2-methyl-2-butenenitrile for production of (E)-2-methyl-2-butenoic acid / E.C. Hann [et al.] // Tetrahedron. – 2004. – V. 60. – P. 577–581. 355. Release of an enantioselective nitrilase from Alcaligenes faecalis MTCC 126: a comparative study / R. Singh [et al.] // Bioprocess Biosyst. Eng. – 2005. – V. 27. – P. 415–424. 356. Removal of phenols, thiocyanate and ammonium from coal gasification wastewater using moving bed biofilm reactor / H.-q. Li, H.-j. Han, M.-a. Du, W. Wang // Biores. Technol. – 2011. – V. 102. – P. 4667–4673. 357. Robinson, W.G. Ricinine nitrilase: I. Reaction product and substrate specificity / W.G. Robinson, R.H. Hook // J. Biol. Chem. – 1964. – V. 239. – P. 4257–4262. 358. Rosenberg, M. Adherence of bacteria to hydrocarbons: A simple method for measuring cell surface hydrophobicity / M. Rosenberg, D. Gutnik, E. Rosenberg // FEMS Microbiol. Lett. – 1980. – V. 9. – P. 29–33. 359. Rozzell, J.D. Commercial scale biocatalysis: myths and realities / J.D. Rozzell // Bioorg. Med. Chem. – 1999. – V. 7. – P. 2253–2261. 315 360. Saucedo, J.E.N. Physiological and morphological modifications in immobilized Gibberella fujikuroi mycelia / J.E.N. Saucedo, J.-N. Barbotin, D. Thomas // Appl. Environ. Microbiol. – 1989. – V. 55(9). – P. 2377–2384. 361. Saunders, F. The role of nicotinamide and related compounds in the metabolism of certain bacteria / F. Saunders, A. Dorfman, S.A. Koser // J. Biol. Chem. – 1941. – V. 138. – P. 69–82. 362. Screening for enantioselective nitrilases: kinetic resolution of racemic mandelonitrile to (R)-(–)-mandelic acid by new bacterial isolates / P. Kaul, U.C. Banerjee, S. Mayilraj, A. Banerjee // Tetrahedron Asymmetry. – 2004. – V. 15. – P. 207–211. 363. Selective hydrolysis of the nitrile group of cis-dihydrodiols from aromatic nitriles / S. Yildirim [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. – 2006. – V. 38. – P. 76–83. 364. Self-immobilized recombinant Acetobacter xylinum for biotransformation / M.I. Setyawati, L.-J. Chien, C.-K. Lee // Bioch. Eng. J. – 2009. – V. 43. – P. 78–84. 365. Sharma, M. Amidases: versatile enzymes in nature / M. Sharma, N.N. Sharma, T.C. Bhalla // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. – 2009. – V. 8. – P. 343–366. 366. Sharma, N.N. An improved nitrilase-mediated bioprocess for synthesis of nicotinic acid from 3-cyanopyridine with hyperinduced Nocardia globerula NHB-2 / N.N. Sharma, M. Sharma, T.C. Bhalla // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2011 – V. 38(9). – P. 1235–1243. 367. Sharma, N.N. Nocardia globerula NHB-2 nitrilase catalysed biotransformation of 4-cyanopyridine to isonicotinic acid / N.N. Sharma, M. Sharma, T.C. Bhalla // AMB Express. – 2012. – V. 2(1) : 25. 368. Sheldon, R.A. Cross-linked enzyme aggregates (CLEA®s): stable and recyclable biocatalysts / R.A. Sheldon // Biochem. Soc. Trans. – 2007. – V. 35. – P. 1583–1587. 369. Sheldon, R.A. Enzyme immobilization: the quest for optimum performance / R.A. Sheldon // Adv. Synth. Catal. – 2007. – V. 349. – P. 1289–1307. 316 370. Shen, M. Isolation and characterization of a novel Arthrobacter nitroguajacolicus ZJUTB06-99, capable of converting acrylonitrile to acrylic acid / M. Shen, Y.-G. Zheng, Y.-C. Shen // Process Biochem. – 2009. – V. 44. – P. 781–785. 371. Shine a light on immobilized enzymes: real-time sensing in solid supported biocatalysts / J.M. Bolivar, T. Consolati, T. Mayr, B. Nidetzky // Trends Biotechnol. – 2013. – V. 31(3). – C. 194–203. 372. Simultaneous production and recovery of fumaric acid from immobilized Rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an adsorption column / N. Cao, J. Du, C.S. Gong, G.T. Tsao // Appl. Env. Microbiol. – 1996. – V. 62. – P. 2926–2931. 373. Simultaneous removal of organic matter and nitrogen compounds by an aerobic/anoxic membrane biofilm reactor / H. Hasar, S. Xia, C.H. Ahn, B.E. Rittmann // Water Res. – 2008. – V. 42. – P. 4109–4116. 374. Single walled carbon nanotubes exhibit strong antimicrobial activity / S. Kang, M. Pinault, L.D. Pfefferle, M. Elimelech // Langmuir. – 2007. – V. 23. – P. 8670–8673. 375. Spherezymes: A novel strustured self-immobilisation enzyme technology / D. Brady [et al.] // BMC Biotechnology. – 2008. – 8:8. 376. Spieß, A.C. Direct measurement of pH profiles in immobilized enzyme carriers during kinetically controlled synthesis using CLSM / A.C. Spieß, V. Kasche // Biotechnol. Prog. – 2001. – V. 17. – P. 294–303. 377. Stabilisation of oxygen-labile nitrilases via co-aggregation with poly(ethyleneimine) / C. Mateo [et al.] // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. – 2006. – V. 38. – P. 154–157. 378. Stalker, D.M. Purification and properties of a nitrilase specific for the herbicide bromoxynil and corresponding nucleotide sequence analysis of the bxn gene / D.M. Stalker, L.D. Malyj, K.E. McBride // J. Biol. Chem. – 1988. – V. 263. – P. 6310–6314. 317 379. Stereo-selective conversion of mandelonitrile to (R)-(–)-mandelic acid using immobilized cells of recombinant Escherichia coli / C.V. Pawar [et al.] // Biotech. – 2012. – V. 2. – P. 319–326. 380. Structure and characterization of amidase from Rhodococcus sp. N-771: Insight into the molecular mechanism of substrate recognition / A. Ohtaki [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. – 2009. – V. 1804. – P. 184–192. 381. Studies on the production of enantioselective nitrilase in a stirred tank bioreactor by Pseudomonas putida MTCC 5110 / S.C. Naik [et al.] // Biores. Technol. – 2008. – V. 99. – P. 26–31. 382. Synthesis and microbial transformation of β-amino nitriles / M. Winkler [et al.] // Tetrahedron. – 2005. – V. 61. – P. 4249–4260. 383. Synthesis of bacterial celluloses in multiwalled carbon nanotube-dispersed medium / W.-I. Park [et al.] // Carbohydrate Polymers. – 2009. – V. 77. – P. 457–463. 384. Synthesis of enantiomerically pure (S)-mandelic acid using an oxynitrilasenitrilase bienzymatic cascade: a nitrilase surprisingly shows nitrile hydratase activity / C. Mateo [et al.] // Tetrahedron: Asymmetry. – 2006. – V. 17. – P. 320– 323. 385. Szczęsna-Antczak, M. Stability of extracellular proteinase productivity by Bacillus subtilis cells immobilized in PVA-cryogel / M. Szczęsna-Antczak, T. Antczak, S. Bielecki // Enzyme Microb. Technol. – 2004. – V.34. – P.168–176. 386. Takashima, Y. Nitrile hydratase from a thermophilic Bacillus smithii / Y. Takashima, Y. Yamaga, S. Misuda // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 1998. – V. 20. – P. 220–226. 387. Tay, A. Production of L-(+)-lactic acid from glucose and starch by immobilized cells of Rhizopus oryzae in a rotating fibrous bed bioreactor / A. Tay, S.T. Yang // Biotechnol. Bioeng. – 2002. – V. 80. – P. 1–12. 388. The amidases from a Brevibacterium strain: study and applications / M. Maestracci [et al.] // Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. – 1988. – V. 36. – P. 68–115. 318 389. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method / A. Bridier [et al.] // J. Microbiol. Meth. – 2010. – V. 82. – P. 64–70. 390. The combi-CLEA approach: enzymatic cascade synthesis of enantiomerically pure (S)-mandelic acid / A. Chmura [et al.] // Tetrahedron: Assymetry. – 2013. – V. 24. – P. 1225–1232. 391. The effect of whole cell immobilization on the biotransformation of benzonitrile and the use of direct electric current for enhanced product removal / R. Mustacchi [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2005. – V. 91(4). – P. 436–440. 392. The lag phase rather than the exponential growth phase on glucose is associated with a higher cAMP level in wild-type and cAPK attenuated strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae / P. Ma [et al.] // Microbiology. – 1997. – V. 143. – P. 3451–3459. 393. The molecular cloning and sequencing of the nitrilase gene of Rhodococcus rhodochrous PA-34 / T.C. Bhalla [et al.] // Acta Biotechnol. – 1995. – V. 15(3). – P. 297–306. 394. Thomas, S.M. Biocatalysis: application and potentials for the chemical industry / S.M. Thomas, R. DiCosimo, V. Nagarajan // Trends Biotechnol. – 2002. – V. 20(6). – P. 238–242. 395. Toxicity mechanism of carbon nanotubes on Escherichia coli / Young Y.-F. [et al.] // Materials Chemistry and Physics. – 2012. – V. 134. – P. 279–286. 396. Treatment of simulated wastewater containing toxic amides by immobilized Rhodococcus rhodochrous NHB-2 using a highly compact 5-stage plug flow reactor / D. Chand [et al.] // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2004. –V. 20. – P. 679–686. 397. Treatment of succinonitrile wastewater by immobilized high efficiency microorganism strains / X.F. Zhou [et al.] // Water Sci. Technol. – 2008. – V. 58(4). – P. 911–918. 319 398. Tyagi, R.D. Studies on immobilized Saccharomyces cerevisiae. I. Analysis of continuous rapid ethanol fermentation in immobilized cell reactor / R.D. Tyagi, T.K. Ghose // Biotechnol. Bioeng. – 1982. – V. 24. – P. 781–795. 399. Upadhyayula, V.K.K. Appreciating the role of carbon nanotube composites in preventing biofouling and promoting biofilms on material surfaces in environmental engineering: A review / V.K.K. Upadhyayula, V. Gadhamshetty // Biotech. Adv. – 2010. – V. 28. – P. 802–816. 400. Use of activated carbon as a support medium for H2S biofiltration and effect of bacterial immobilization on available pore surface / Y.L. Ng [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – V. 66. – P. 259–265. 401. Vaughan, P.A. Conversion of 3-cyanopyridine to nicotinic acid by Nocardia rhodochrous LL100-21 / P.A. Vaughan, C.J. Knowles, P.S.J. Cheetham // Enzyme Microb. Technol. – 1989. – V. 11. – P. 815–823. 402. Verstrepen, K.J. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts / K.J. Verstrepen, F.M. Klis // Mol. Microbiol. – 2006. – V. 60(1). – P. 5–15. 403. Walsh, P.K. Cell growth patterns in immobilization matrices / P.K. Walsh // Biotech. Adv. – 1995. – V. 13. – P. 13–43. 404. Webster, N.A. Comparative characterisation of two Rhodococcus species as potential biocatalysts for ammonium acrylate production // N.A. Webster, D.K. Ramsden, J. Hughes // Biotech. Lett. – 2001. – V. 23. – P. 95–101. 405. Welsh, F.W. Solid carriers for a Clostridium acetobutylicum that produced acetone and butanol / F.W. Welsh, R.E. Williams, I.A. Veliky // Enzyme Microb. Technol. – 1987. –V. 9. – P. 500–502. 406. Widerøe, H. Evaluation of the use of Sr2+ in alginate immobilization of cells / H. Widerøe, S. Danielsen // Naturwissenschaften. – 2001. – V. 88. – P. 224–228. 407. Wimpenny, J. Heterogeneity in biofilms / J. Wimpenny, W. Manz, U. Szewzyk // FEMS Microbiol. Rev. – 2000. – V. 24. – P. 661–671. 408. Xudong, S.U.N. Deactivation kinetics of nitrile hydratase in free resting cells / S.U.N. Xudong, Y.U. Huimin, S.H.E.N. Zhongyao // Biotechnol. Bioeng. – 2009. – V. 17(5). – P. 822–828. 320 409. Yamada, H. Hydratases involved in nitrile conversion: screening, characterization and application / H. Yamada, S. Shimizu, M. Kobayashi // The Chemical Record. – 2001. – V. 1. – P. 152–161. 410. Yamada, H. Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide / H. Yamada, M. Kobayashi // Biosci. Biotech. Biochem. – 1996. – V. 60. – P. 1391–1400. 411. Yamamoto, K. Purification and characterization of nitrilase responsible for the enantioselective hydrolysis from Acinetobacter sp. AK 226 / K. Yamamoto, K.-I. Komatsu // Agric. Biol. Chem. – 1991. – V. 55. – P. 1459–1466. 412. Yamamoto, K. Purification and characterization of the nitrilase from Alcaligenes faecalis ATCC 8750 responsible for enantioselective hydrolysis of mandelonitrile / K. Yamamoto, I. Fujimatsu, K.-I. Komatsu // J. Ferment. Bioeng. – 1992. – V. 73. – P. 425–430. 413. Yanase, H. Purification, crystallization and some properties of β-cyano-Lalanine-degrading enzyme in Pseudomonas sp. 13 / H. Yanase, T. Sakai, K. Tonomura // Agric. Biol. Chem. – 1983. – V. 47. – P. 473–482. 414. Yeom, S.-J. Enantioselective production of 2,2-dimethylcyclopropane carboxylic acid from 2,2- dimethylcyclopropane carbonitrile using the nitrile hydratase and amidase of Rhodococcus erythropolis ATCC 25544 / S.-J. Yeom, H.-J. Kim, D.-K. Oh // Enz. Microbial. Technol. – 2007. – V. 41. – P. 842–848. 415. Yi, S.-S. Amino acid modified chitosan beads: Improved polymer supports for immobilization of lipase from Candida rugosa / S.-S. Yi, J.-M. Noh, Y.-S. Lee // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. – 2009. – V. 57. – P. 123–129. 416. Zaks, A. Industrial biocatalysis / A. Zaks // Curr. Opin. Chem. Biol. – 2001. – V. 5. – P. 130–136. 417. Zhao, Q.-B. Fermentative H2 production in an upflow anaerobic sludge blanket reactor at various pH values / Q.-B. Zhao, H.-Q. Yu // Biores. Technol. – 2008. – V. 99. – P. 1353–1358. 321 418. Zhao, X. Recent progress and perspectives on the toxicity of carbon nanotubes at organism, organ, cell, and biomacromolecule levels / X. Zhao, R. Liu // Environment International. – 2012. – V. 40. – P. 244–256. 419. Zhou, J.Q. Immobilization of alliinase with a water soluble–insoluble reversible N-succinyl-chitosan for allicin production / J.Q. Zhou, J.W. Wang // Enzyme Microb. Technol. – 2009. – V. 45. – P. 299–304. 420. Zobell, C.E. The effect of solid surfaces upon bacterial activity / C.E. Zobell // J. Bacteriol. – 1943. – V. 46(1). – P. 39–56.
