сверхпроизводительная жидкостная хроматография. системы

АНАЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
СВЕРХПРОИЗВОДИТЕЛЬНАЯ ЖИДКОСТНАЯ
ХРОМАТОГРАФИЯ. СИСТЕМЫ ACQUITY UPLC
Извлечение выгоды из маленьких частиц
Чтобы по!настоящему воспользоваться
преимуществами возросшей скорости
превосходных разрешения
и чувствительности, обеспечиваемых
маленькими частицами, технология
приборов должна идти следом за частицами.
Стандартные системы ВЭЖХ просто не
в состоянии обеспечить все преимущества,
обеспечиваемые зернением менее 2 мкм.
Потребовалась совершенно новая
конструкция системы, с продвинутыми
технологиями в насосе, автоинжекторе,
детекторе, системе обработки данных
и сервисных диагностиках
Свидро В.А. ООО «Аналитек»
С
истема ACQUITY UPLC была разработана с нуля для
обеспечения минимального системного объема, что
бы полностью воспользоваться преимуществом низ
кой дисперсии и технологией маленьких частиц.
Разделения с высокой пиковой емкостью, достижи
мые с маленькими частицами, требуют более высоких
давлений, чем те, которые достижимы с сегодняшним
ВЭЖХ оборудованием. Рассчитанное давление при опти
мальном потоке, для достижения максимальной эффек
тивности на 15 сантиметровой колонке, упакованной
1,7 мкм частицами, составляет около 15 тыс. фунтов на
квадратный дюйм (PSI). Таким образом, требуется насос,
способный подавать раствор точно и воспроизводимо
при таких давлениях, а также компенсировать сжимае
мость раствора и работать как в градиентном, так и изо
кратическом режимах разделений.
С частицами 1,7 мкм были получены пики с шириной
на половине высоты менее чем за 1 секунду. Таким об
разом, предъявляются соответствующие требования к
детектору. Для того чтобы точно и воспроизводи
мо продетектировать пик, скорость
измерения должна быть достаточно
высока, чтобы набрать достаточное
количество точек по ширине пика,
кроме этого ячейка детектора
должна иметь минимальный объем,
чтобы сохранить эффективность
разделения. Теоретически, чув
ствительность по сравнению с
ВЭЖХ должна быть в 23 раза выше,
в зависимости от применяемого типа
детекции. Массспектрометрическая Рис.3
36
Окончание,
начало в предыдущем номере
детекция значительно улучшается с UPLC – увеличенная
концентрация внутри пика с уменьшенной хроматогра
фической дисперсией на уменьшенных потоках (без де
лителей потока) обеспечивает лучшую эффективность
ионизации и увеличивает чувствительность.
Ввод образца также критичен. Традиционные инжек
ционные клапаны, автоматические или ручные, разрабо
таны не для высоких давлений. Для защиты колонки от
экстремальных флуктуаций давлений процесс инжекции
должен быть относительно безимпульсационным.
Рабочий объем системы также должен быть мини
мальным для уменьшения потенциального расползания
пиков. Быстрый цикл инжекции также необходим, чтобы
полностью воспользоваться скоростью, обеспечиваемой
UPLC, которая в свою очередь требует высокой емкости
отделения для образцов. Инжекции низкого объема с ми
нимальным переносом пробы также необходимы для ре
ализации возросшей чувствительности.
Система Acquity UPLC (рис. 3) состоит из бинарного
градиентного насоса, системы подачи образцов (включая
нагреватель колонки), детектора и, как дополнение, эле
ватора для подачи плашек. Бинарный градиентный насос
имеет две головки, соединенные последовательно в каж
дом из насосов, создающие градиент на высокой стороне
давления. Имеется встроенный дегазатор для 4х входных
«Промышленное обозрение», июнь №3 (8) 2008
АНАЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
линий растворителей (одновременно используются две).
Предел рабочего давления для UPLC 15 000 psi (1000 bar).
Цикл инжектора 25 сек. без промывки и 60 сек. с промыв
кой двумя растворителями для уменьшения переноса
пробы. Большое количество плашек разнообразных фор
матов может быть использовано в термостатируемом ав
тоинжекторе. При применении дополнительного элевато
ра для подачи плашек, до 22х плашек могут быть проана
лизированы в автоматическом режиме. Нагреватель ко
лонки (до 650C) сконструирован в поворотном варианте
для размещения выхода колонки в непосредственной
близости от входа в массспектрометр.
УФдетекторы (обычный и PDA) имеют новую элек
тронику для поддержания Ethernetкоммуникации и вы
сокоскоростного измерения узких пиков. Так как УФде
текторы чувствительны к концентрации образца, объем
ячеек должен быть уменьшен для поддержания соответ
ствия между концентрацией и уровнем сигнала. Умень
шение объема ячейки в тоже время приводит к уменьше
нию оптического пути поперечного сечения, что в свою
очередь приводит к уменьшению полезного сигнала и
увеличению шума. Поэтому вместо традиционной ячейки
ВЭЖХ была разработана специальная ячейка UPLC (light
guided flow cell), которая при объеме в 500 нл имеет
стандартную длину оптического пути 10 мм.
Капилляры и соединения созданы и проложены меж
ду компонентами системы для обеспечения минималь
ной дисперсии, так же применены датчики утечек, сигна
лы от которых учитываются программой.
Рис. 4. Разделение на ВЭЖХ (а) и UPLC (в) для invitro
инкубированного декстрометорфана с микросомами
крысиной печени
ПРИМЕНЕНИЯ
Ранее хроматографисты были вынуждены идти на
компромиссы, и одним из наиболее обычных сценариев
было принесение в жертву разрешения в счет скорости.
С системами UPLC возросшее разрешение при более ко
ротких временах анализа дает больше информации.
Большее количество проанализированных образцов с
большей информацией на образец уменьшает время, за
трачиваемое для выпуска препарата на рынок, важней
ший критерий эффективности на современном фарма
цевтическом рынке.
UPLC так же может быть использовано для значитель
ного улучшения производительности при разработке ле
карственных препаратов. При таких разработках очень
важно раннее предсказание метаболизма и взаимодей
ствия препарата. Для раннего исключения кандидата из
всего процесса исследований, на рутинной основе про
водятся анализы метаболической стабильности, токсич
ности, ингибиции р450 и индукции. С середины 1990х
ВЭЖХ, соединенная с массспектрометрией используется
для метабономических исследований на рутинной осно
ве. Увеличенная селективность и чувствительность, быс
трые простые градиенты сделали технику LC/MS домини
рующей для количественного и качественного анализа.
Однако с увеличением числа и многообразия компонен
тов, поступающих в разработку и вследствие сложности
биологических матриц, потребовались новые аналитиче
ские технологии и процедуры, чтобы идти в ногу с требо
ваниями по тестированию образцов. Непредсказанные,
реактивные или токсичные метаболиты должны быть
идентифицированы как можно раньше. Поиск более точ
ных данных означает улучшение хроматографического
разрешения для получения большей пиковой емкости,
уменьшения коэлюции метаболитов, и в тоже время уве
«Промышленное обозрение», июнь №3 (8) 2008
Рис. 5. Экстрагированная ионная хроматограмма
на m/z = 258 и 244
личение чувствительности и уменьшения ионной супрес
сии в источнике ионизации массспектрометра.
Мощь Acquity UPLC при использовании в разработке
лекарственных препаратов может быть проиллюстриро
вана примером анализа invitro метаболизма декстроме
торфана, который претерпевает Одеалкилацию в двух
точках, приводя к трем главным метаболитам фазы 1. Эти
продукты могут претерпевать дальнейший метаболизм
через связывание с глюкороновой кислотой, образуя ме
таболиты с массой MH+ = 434 и 420. Эти данные показа
ны на рис. 4а и 4в, разделения на ВЭЖХ и UPLC соответ
ственно для invitro инкубированного декстрометорфана
с микросомами крысиной печени. Как видно, хромато
графическое деление на 1,7 мкм колонке значительно
37
АНАЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
С середины 1990!х ВЭЖХ, соединенная
с масс!спектрометрией используется
для метабономических исследований
на рутинной основе. Увеличенная
селективность и чувствительность, быстрые
простые градиенты сделали технику
LC/MS доминирующей для количественного
и качественного анализа
лучше, чем таковое на 3,5 мкм колонке ВЭЖХ. Пики ши
риной 4 сек. в основании дают пиковую емкость более
100, в то время как ВЭЖХ с шириной пика около 20 сек.
обеспечивают емкость в 20 пиков, что означает 5крат
ное превосходство UPLC. Экстрагированная ионная хро
матограмма на m/z = 258 и 244 показана на рис. 5.
Мы можем отчетливо увидеть два Одеалкилирован
ных метаболита при m/z = 258, которые разделены на
80%, в то время как 244 метаболит едва виден. Сравни
вая эту картинку с полученной на UPLC, мы увидим мета
болиты при m/z = 258, разделенные полностью и хорошо
различаемый метаболит 244.
Это дополнительное разрешение особенно важно при
анализе изобарных компонентов, таких как упомянутые
деалкилированные метаболиты. С применением UPLC с
увеличенным разрешением, ионная супрессия в источни
ке МС происходит в меньшей степени, что приводит к бо
лее дискретной ионизации метаболитов. Без разрешения,
обеспечиваемого UPLC, есть вероятность ошибочной
38
идентификации метаболитов или пропуска потенциально
токсичных компонентов. При улучшенной чувствительно
сти, обеспечиваемой UPLC, меньшие концентрации мета
болитов могут быть продетектированы, помогая исклю
чить из дальнейшего процесса исследований потенциаль
но токсичные компоненты. Дополнительная чувствитель
ность важна при выполнении MS/MS экспериментов, так
как влияет на получение интерпретируемых спектров.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В то время, когда многие исследователи достигли пре
делов, обеспечиваемых традиционными ВЭЖХ, UPLC
представляет возможность расширить возможности при
менения этой широко используемой науки о разделени
ях. Новая технология ACQUITY UPLC, как в смысле химии
сорбентов, так и в аппаратуре, обеспечивает больше ин
формации на единицу работы.
Так UPLC начинает выполнять обещания увеличения
скорости, разрешения и чувствительности, предсказан
ные для жидкостной хроматографии. П
ООО «Аналитек»
Эксклюзивный дистрибьютор
Waters на Украине
Email: office@analytec.com.ua
http : www.analytec.com.ua
Тел.: 531 90 34
Тел./факс: 531 90 35
«Промышленное обозрение», июнь №3 (8) 2008