Противоопухолевые ферменты: новые подходы к поиску и
advertisement
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича На правах рукописи Покровский Вадим Сергеевич Новые подходы к созданию и экспериментальному изучению препаратов на основе противоопухолевых ферментов Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук 14.01.12. Онкология 03.01.04. Биохимия Научный консультант: Проф., д.м.н. Е.М. Трещалина Москва 2015 2 Оглавление Сокращения и условные обозначения .......................................................................................... 5 Введение .............................................................................................................................................. 7 Актуальность темы исследования ................................................................................................ 7 Степень разработанности темы исследования ............................................................................ 7 Цель и задачи исследования .......................................................................................................... 9 Научная новизна ........................................................................................................................... 10 Теоретическая и практическая значимость работы .................................................................. 11 Методология и методы исследования ........................................................................................ 12 Положения, выносимые на защиту ............................................................................................ 12 Степень достоверности и апробация результатов .................................................................... 13 Личный вклад автора ................................................................................................................... 14 Структура диссертации................................................................................................................ 14 Публикации ................................................................................................................................... 14 Глава 1. Перспективы поиска, создания и доклинического изучения ферментных противоопухолевых препаратов. Обзор литературы ........................................................................ 15 1.1. Ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот ......................................................... 15 1.1.1. L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1.) ............................................................................................. 15 1.1.2. L-аргининдеиминаза (КФ 3.5.3.6.) .................................................................................... 21 1.1.3. L-метионин–γ-лиаза (КФ 4.4.1.11.)................................................................................... 24 1.1.4. Оксидазы L-аминокислот .................................................................................................. 25 1.1.5. L-фенилаланин:аммиак-лиаза (КФ 4.3.1.5)...................................................................... 28 1.1.6. Тирозин-фенол-лиаза (КФ 4.1.99.2).................................................................................. 29 1.2. Рибонуклеазы............................................................................................................................. 29 1.2.1. Ранпирназа (онконаза) ....................................................................................................... 29 1.2.2. Амфиназа ............................................................................................................................ 30 1.2.3. Биназа .................................................................................................................................. 31 1.3. Современные подходы к созданию и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов ......................................................................................................................................... 31 1.3.1. Поиск перспективных субстанций ................................................................................... 31 1.3.2. Разработка методов выделения субстанции в препаративном количестве .................. 32 1.3.3. Оценка физико-химических и кинетических свойств ферментов ................................. 35 1.3.4. Оценка антипролиферативной активности ферментов .................................................. 36 1.3.5. Поиск способов оптимизации терапевтических характеристик .................................... 39 1.3.6. Оценка элементов фармакокинетики ............................................................................... 41 1.4. Актуальность разработки новых подходов к поиску и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов ...................................................................................................... 42 Глава 2. Материалы и методы ............................................................................................................. 45 2.1. Изученные ферменты и их источники .................................................................................... 45 2.2. Реактивы ..................................................................................................................................... 46 2.3. Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов ............................................................... 46 2.4. Наработка биомассы и очистка L-аспарагиназ ...................................................................... 48 2.5. Определение ферментативной активности ............................................................................. 48 2.6. Определение физико-химических свойств ............................................................................. 49 2.7. Исследования зависимости «структура-функция» ................................................................ 50 2.8. Оценка цитотоксичности .......................................................................................................... 51 2.9. Оценка специфической противоопухолевой активности ...................................................... 53 2.10. Оценка токсичности ................................................................................................................ 56 2.11. Оценка элементов фармакокинетики .................................................................................... 57 2.12. Оценка иммуногенности ........................................................................................................ 59 2.13. Статистическая обработка ...................................................................................................... 61 Глава 3. Экспериментальные подходы к созданию и отбору продуцентов ферментов ........ 63 3 3.1. Новый метод отбора штаммов-продуцентов L-аспарагиназ................................................. 63 3.2. Создание новых рекомбинантных штаммов-продуцентов L-аспарагиназ .......................... 68 3.2.1. Создание штамма-продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis ......................................................................................................................... 68 3.2.2. Создание штамма продуцента L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum ........................ 72 3.2.3. Создание продуцентов мутантных форм L-аспарагиназы R. rubrum............................ 74 3.3. Выделение и очистка полученных L-аспарагиназ ................................................................. 75 3.3.1. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы Y. pseudotuberculosis ...................... 75 3.3.2. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы R. rubrum......................................... 76 Глава 4. Физико-химические и кинетические характеристики полученных ферментов .............. 80 4.1. Оптимальные условия протекания ферментативных реакций ............................................. 80 4.1.1. Оптимумы рН и температуры новых L-аспарагиназ ...................................................... 80 4.2. Чувствительность к химической и температурной денатурации ......................................... 84 4.2.1. Стабильность полученных L-аспарагиназ ....................................................................... 84 4.3. Кинетические параметры полученных L-аспарагиназ .......................................................... 86 Глава 5. Отдельные биологические характеристики полученных ферментов ............................... 90 5.1. Антигенные свойства и перекрестная иммуногенность новых L-аспарагиназ................... 90 5.1.1. IgG-иммунный ответ .......................................................................................................... 90 5.1.2. IgМ-иммунный ответ ......................................................................................................... 90 5.1.3. Перекрестная иммуногенность L-аспарагиназ ................................................................ 91 5.2. Основные фармакокинетические параметры ......................................................................... 93 5.2.1. Элементы фармакокинетики L-лизин-α-оксидазы у мышей ......................................... 93 5.2.2. Прогнозирование фармакокинетических параметров L-лизин-α-оксидазы у человека ........................................................................................................................................................ 95 5.2.3. Элементы фармакокинетики L-метионин–γ-лиаз у мышей ........................................... 96 5.2.4. Стабильность L–метионин-γ-лиаз в плазме крови человека ......................................... 97 Глава 6. Прескрининг на культурах опухолевых клеток новых ферментов различной природы 99 6.1. Цитотоксичность новых L-аспарагиназ .............................................................................. 99 6.2. Цитотоксичность L-метионин–γ-лиаз из новых источников .......................................... 104 6.3. Цитотоксичность L-фенилаланин:аммиак-лиазы Rhodosporidium toruloides ............... 105 6.4. Цитотоксичность L-лизин–альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai .............. 106 6.5. Цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius ...................................................... 107 6.1.6. Отбор ферментов на основании данных прескрининга ............................................... 107 Глава 7. Противоопухолевая активность новых ферментов различной природы и механизма действия............................................................................................................................................... 109 7.1. Скрининг противоопухолевой активности отобранных ферментов .................................. 109 7.1.1. Скрининг и диапазон терапевтических доз новых L-аспарагиназ .............................. 109 7.1.2. Оценка антипролиферативной активности in vivo L-фенилаланин:аммиак-лиазы ... 114 7.1.3. Оптимизация схемы внутривенного введения противоопухолевого фермента Lлизин–альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai ....................................................... 115 7.1.4. Спектр чувствительных опухолей к L-лизин–альфа-оксидазе Trichoderma cf. aureoviride Rifai .......................................................................................................................... 119 7.1.5. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius ........................... 122 7.2. Доклиническое изучение новых ферментов на подкожных ксенографтах опухолей человека у иммунодефицитных мышей ....................................................................................... 123 7.2.1. Спектр противоопухолевой активности L-лизин–альфа-оксидазы ............................ 123 7.2.2. Противоопухолевая активность иммуноРНКазы 4D5 scFv-дибарназы ...................... 125 7.2.3. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius (биназы) ........... 129 7.3. Разработка модели для доклинической оценки противоопухолевого эффекта L-метионин– γ-лиаз ............................................................................................................................................... 130 7.4. Доклиническое изучение in vivo эффективности и переносимости комбинаций с L-лизинальфа-оксидазой ............................................................................................................................. 134 4 7.4.1. Оценка «острой» токсичности L-лизин-альфа-оксидазы и препаратов для комбинаций ...................................................................................................................................................... 134 7.4.2. Эффективность и переносимость комбинации иринотекана с L-лизин-альфаоксидазой .................................................................................................................................... 137 7.4.3. Эффективность и переносимость комбинации цисплатин + L-лизин-альфа-оксидаза ...................................................................................................................................................... 141 7.4.4. Эффективность и переносимость комбинированной терапии этопозид + L-лизинальфа-оксидаза............................................................................................................................ 144 Глава 8. Новые аспекты изучения механизмов действия и прогнозирования биологической активности ферментов ....................................................................................................................... 146 8.1. Оценка взаимосвязей «структура-функция» с использованием сайт-направленного мутагенеза L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum ................................................................ 146 8.2. Взаимосвязь между антипролиферативной и ферментативной активностью .............. 153 8.2.1. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта Lаспарагиназ ................................................................................................................................. 153 8.2.2. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта Lметионин–γ-лиаз ......................................................................................................................... 162 8.3. Прогнозирование иммуногенности и анализ структуры эпитопов L-аспарагиназ....... 163 8.4. Влияние L-метионин–γ-лиазы на отдельные звенья механизма индукции апоптоза .. 167 Глава 9. Обсуждение полученных данных с оценкой перспектив поиска и экспериментального изучения ферментов с противоопухолевой активностью .............................................................. 169 9.1. Поиск и создание ферментов с противоопухолевой активностью ..................................... 169 9.2. Анализ выбора продуцента фермента ................................................................................... 174 9.3. Прогнозирование антипролиферативной активности на основании кинетических характеристик фермента ................................................................................................................ 175 9.4. Прогнозирование основных фармакокинетических параметров противоопухолевого фермента у человека на основе данных in vivo ........................................................................... 178 9.5. Оценка очередности использования ферментных препаратов одной группы с учетом перекрестной иммуногенности ..................................................................................................... 179 9.6. Алгоритм экспериментального изучения антипролиферативной активности потенциальных противоопухолевых ферментов......................................................................... 180 9.7. Особенности выбора препаратов для комбинированного применения с противоопухолевыми ферментами ............................................................................................... 184 9.8. Новые подходы к экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов ....... 185 Выводы ........................................................................................................................................ 187 Практические рекомендации..................................................................................................... 189 Благодарности............................................................................................................................. 191 Литература .................................................................................................................................. 192 5 Сокращения и условные обозначения ADI — L-arginine deiminase, L-аргининдеиминаза ASS1 — argininosuccinate synthetase, аргининосукцинат синтаза DONV — диазо-4-окси-L-норвалин EcA — Escherichia coli L-asparaginase, L-аспарагиназа E. сoli II типа EMA — European Medicines Agency ErA — Erwinia chrysathemi L-asparaginase II типа EwA — Erwinia carotovora L-asparaginase II типа FGF — fibroblast growth factor, фактор роста фибробластов HpA — Helicobacter pylori L-asparaginase II типа IC50 — index of cytotoxicity, концентрация, ингибирующая рост клеток в культуре, на 50% ICH — International Conference on Harmonisation IFNAR — interferon alpha/beta receptor, рецепторы интерферона α/β Km — константа Михаэлиса LAAO — L-aminoacid oxidase, оксидазa L-аминокислот LD50 — средне-смертельная доза (доза, вызывающая гибель 50% животных) LLC — Lewis lung carcinoma, эпидермоидная карцинома легкого Льюис LO — L-lysine-alpha-oxydase, L-лизин-альфа-оксидаза MGL — L-methionine–gamma-lyase, L-метионин–гамма-лиаза PAL — L-phenylalanine ammonium-lyase, L-фенилаланин:аммиак-лиаза RrA — Rhodospirillum rubrum L-asparaginase, L-аспарагиназа R. rubrum I типа T1/2 — период полувыведения WsA — Wolinella succinogenes L-asparaginase, L-аспарагиназа W. succinogenes II типа WsA-Hep — биомодифицированная L-аспарагиназа W. succinogenes II типа YpA — Yersinia pseudotuberculosis L-asparaginase, L-аспарагиназа Y. pseudotuberculosis II типа БСА — бычий сывороточный альбумин ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография ГЛФ — готовая лекарственная форма ГСПГ — гепарансульфатсодержащие протеогликаны ДИ — доверительный интервал ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА — иммуноферментный анализ МЕ — международная единица МСК — мезенхимальные стромальные клетки 6 НМРЛ — немелкоклеточный рак легкого ОЕ — оптическая единица ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз ОП — оптическая плотность ПЖ — продолжительность жизни ПЛФ — пиридоксальфосфат ПО — программное обеспечение ПЦР — полимеразная цепная реакция ПЭГ — полиэтиленгликоль (PEG) СПЖ — средняя продолжительность жизни РНК — рибонуклеиновая кислота ТРО — торможение роста опухоли УПЖ — увеличение продолжительности жизни ЦНС — центральная нервная система в/бр — внутрибрюшинно в/в — внутривенно в/м — внутримышечно п/к — подкожно 7 Введение Актуальность темы исследования На сегодняшний день эффективность системной лекарственной терапии в клинической онкологии, позволяющей улучшить показатели отдаленной выживаемости больных раком, остается недостаточной [16, 17, 307]. За последние годы не произошло кардинального улучшения отдаленных результатов лечения. Это связано, прежде всего с тем, что лишь немногие из противоопухолевых агентов зарегистрированы в качестве лекарственных средств и вошли в стандартные схемы лечения. Неудачи терапии онкологических заболеваний, как правило, связаны с отсутствием у новых препаратов преимуществ перед существующими, низкой селективностью действия или трудоемкостью их создания. Немаловажную роль играет и традиционное отставание применения научных знаний в клинической практике. Все это происходит на фоне постоянно растущей онкологической заболеваемости. Вышесказанное определило поиск новых мишеней и подходов к созданию инновационных лекарственных средств, особенно для лечения труднокурабельных и диссеминированных опухолей. Таким образом, разработка новых подходов к созданию и экспериментальному изучению ферментов, проявляющих противоопухолевую активность, с оригинальным механизмом действия является, несомненно, актуальным решением важной проблемы фундаментальной и практической науки в области биомедицины, и, в частности, онкологии и биохимии. Степень разработанности темы исследования В последнее время накопилось много данных о ферментах с потенциальной противоопухолевой активностью, которые требуют обобщения, систематизации и выявления закономерностей противоопухолевого действия для построения перспективной стратегии поиска и изучения новых кандидатов с целью создания на их основе противоопухолевых препаратов. Анализ литературы позволяет считать, что результативная разработка новых противоопухолевых ферментов невозможна без использования достижений различных дисциплин: биохимии и химии, биологии, биотехнологии и микробиологии, генетики и физиологии, фармакологии и онкологии. Изменение стратегии поиска новых кандидатов, благодаря фундаментальным достижениям молекулярной биологии и экспериментальной онкологии, привело к трансформации эмпирического подхода в направленный скрининг для мишень-ориентированной (таргетной) терапии. Развитие направленного скрининга имеет целью максимально индивидуализировать лечение путем блокирования ключевых ферментов пролиферации и сопряженных с ней процессов метаболизма клетки. Однако первоначальный оптимизм, связанный с появлением 8 таргетных препаратов, сменился чередой разочарований в силу несостоятельности такой монотерапии при быстропрогрессирующих опухолях. Например, такие таргетные препараты, как гефитиниб (селективный ингибитор тирозинкиназы рецепторов эпидермального фактора роста HER-1), типифарниб (ингибитор фарнезилтрансферазы), бортезомиб (ингибитор антиапоптотических сигнальных путей bcl-2), маримастат (ингибитор матриксных металлопротеиназ), темсиролимус (ингибитор m-TOR) оказались неэффективными при мелкоклеточном раке легкого [154, 205, 236, 299]. В настоящее время стало понятно, что таргетные препараты не способны кардинально решить проблему лечения малочувствительных к химиотерапии (мезотелиома плевры, саркома мягких тканей, рак поджелудочной железы) и диссеминированных опухолей различных локализаций. При таком развитии событий в мире возобновился интерес к группе препаратов с биохимическим механизмом действия — противоопухолевым ферментам, известными представителями которого были нативная и модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ) Lаспарагиназы E. coli (EcA) и Erw. carotovora (ErA). Попытки создания новых ферментных препаратов были направлены на расширение спектра противоопухолевого действия и улучшение терапевтических характеристик ферментов. Предполагалось, что поиск новых источников и разработка рекомбинантных и структурно модифицированных ферментов могут быть результативными. Действительно, в последнее время несколько новых препаратов ферментов достигли этапа клинических испытаний. Так, по данным сайта clinicaltrials.gov в 2015 году пегилированная L-аргинин дезиминаза (ADI-PEG 20) проходит клинические исследования по 11 протоколам I–III фазы при разных локализациях, в т.ч. в комбинации с цисплатином и пеметрекседом. Одобрен ряд клинических протоколов с ранпирназой (новой рибонуклеазой) при мезотелиоме плевры [100, 229]. Возобновление интереса к противоопухолевым ферментам позволяет в новом свете взглянуть на преимущества и недостатки, отличающие их как от «классических» цитостатиков, так и от таргетных препаратов. Среди преимуществ очевидными являются: ♦ оригинальный механизм действия и относительно высокая специфичность по отношению к конкретному молекулярному субстрату; ♦ наличие достоверных биологических маркеров, позволяющих прогнозировать клиническую эффективность, например, отсутствие аргининосукцинат синтазы (ASS1) в опухолевых клетках; ♦ отсутствие традиционной для классических цитостатиков лимитирующей токсичности (например, выраженной миелосупрессии), что позволяет включать их в многокомпонентные схемы высокодозной комбинированной химиотерапии. Среди недостатков следует подчеркнуть специфику биологических свойств действующих веществ, прежде всего, белковую природу. В отличие от иммуноглобулинов для ферментных 9 препаратов не существует простых и однозначных культуральных тестов in vitro для моделирования взаимодействия с субстратом (по примеру взаимодействия «антигенантитело»), что особенно справедливо для рибонуклеаз. В результате возникает проблема поиска релевантной модели для демонстрации антипролиферативного эффекта и механизма действия, основанных на метаболической неполноценности потенциальных клеток-мишеней. Необходимо также выделить ряд факторов, требующих обособлять ферменты от других групп противоопухолевых препаратов и создавать оригинальные протоколы изучения их антипролиферативного действия. Экзогенные ферменты являются чужеродными для человека белками и проявляют выраженные антигенные свойства, что предопределяет гуморальный ответ, обусловливает аллергенность, возможность развития анафилактических реакций и быструю наработку иммунологической резистентности. Даже при сохранении первичной структуры изменение пространственной конформации фермента может привести к потере специфической активности. Еще одна трудность заключается в том, что на активность ферментов существенно влияют наличие протеаз и различные изменения факторов внешней среды (pH, температура, состав плазмы крови). В связи с этим поиск и внедрение новых противоопухолевых ферментов в клиническую практику до сих пор остаются не вполне успешными. Совершенствование технологий получения рекомбинантных белков решило проблему получения целевого белка в препаративных количествах, однако не облегчило последующее изучение специфической противоопухолевой активности, а также других необходимых этапов экспериментального исследования потенциальных кандидатов. В основе антипролиферативного действия ферментов лежат фундаментальные характеристики лекарственной субстанции, определяющие важнейшие терапевтические свойства будущего лекарства: спектр совместимость с активности, препаратами избирательность другого механизма антипролиферативного действия при действия, комбинированной химиотерапии и др. Уникальные биологические свойства ферментов диктуют необходимость разработки индивидуальной программы их получения и экспериментальной оценки. Перечисленные факторы важны также для разработки современных подходов к доклиническому изучению новых противоопухолевых ферментов. Цель и задачи исследования Цель работы — разработка новых методических подходов к созданию и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов. Задачи: 1. Разработка нового метода отбора штаммов-продуцентов нативных и мутантных форм Lаспарагиназ из разных источников. 10 2. Изучение физико-химических и биологических свойств ферментов различного механизма действия, полученных с использованием новых методов: сайт-направленный мутагенез, конъюгация с биологически активными пептидами и фрагментами антител. 3. Разработка новых методов прогнозирования биологически значимых фармакологических характеристик ферментов, расщепляющих аминокислоты, на основе их физико-химических и кинетических характеристик. 4. Разработка новой модели для изучения in vivo противоопухолевой активности пиридоксаль5’-зависимых ферментов на примере L-метионин–γ-лиаз (MGL). 5. Оценка перспективности доклинического изучения новых кандидатов: L- фенилаланин:аммиак-лиазы (PAL), ряда L-метионин–γ-лиаз, нативных и химерных рибонуклеаз из различных источников путем скрининга in vitro и in vivo. 6. Разработка оптимальной схемы применения L-лизин–α-оксидазы (LO) на основе фармакологических характеристик in vitro и in vivo. 7. Оценка терапевтического преимущества комбинированной терапии с LO при лечении солидных опухолей. 8. Выявление особенностей противоопухолевого, иммуногенного действия и фармакокинетических характеристик, сравнительная оценка перспективности ферментов различной природы: L-аспарагиназ, L-метионин–γ-лиаз, L-лизин–α-оксидазы. 9. Совершенствование методических основ поиска и экспериментального изучения новых ферментных противоопухолевых препаратов. Научная новизна ♦ Впервые получен ряд продуцентов новых рекомбинантных L-аспарагиназ из Yersinia pseudotuberculosis, Rhodospirillum rubrum и их мутантных форм. ♦ Впервые охарактеризованы физико-химические и антипролиферативные свойства новых рекомбинантных L-аспарагиназ Yersinia pseudotuberculosis, Rhodospirillum rubrum, Wolinella succinogenes а также их мутантных и химерных форм. ♦ Впервые предложен принципиально новый методический подход для отбора на плотной среде активных штаммов-продуцентов L-аспарагиназ различного происхождения. ♦ Впервые выявлено наличие антипролиферативного эффекта у внутриклеточной L- аспарагиназы I типа. ♦ Впервые охарактеризованы особенности антипролиферативного эффекта ряда ферментных препаратов различного происхождения in vitro и in vivo: MGL, PAL, рибонуклеаз различного происхождения. 11 ♦ Впервые разработана модель in vivo для изучения противоопухолевой активности ПЛФзависимых ферментов из различных источников. ♦ Впервые разработана терапевтическая схема внутривенного (в/в) введения LO на опухолевых моделях in vivo, охарактеризованы эффективные и переносимые дозы. ♦ Впервые разработаны схемы полихимиотерапии с включением LO на различных опухолевых моделях in vivo, охарактеризованы эффективные переносимые дозы и режимы применения. ♦ Впервые обоснованы и апробированы новые методики изучения биологически значимых характеристик противоопухолевых ферментов из разных источников: исследование перекрестной иммуногенности ферментов с общим механизмом действия; прогнозирование фармакокинетических параметров у человека на основании данных фармакокинетики у животных; прогнозирование противоопухолевого эффекта на основании каталитических свойств. Теоретическая и практическая значимость работы Сформулированные положения о технологических, биохимических и биологических особенностях противоопухолевых ферментов различной природы создают основу для прогресса в практике создания и экспериментального изучения новых противоопухолевых ферментов различной природы. Обобщены и проанализированы данные об известных и применяемых в клинической практике ферментах, а также новых потенциальных кандидатах для создания лекарственных препаратов. Оптимизированные ферменты из группы L-аспарагиназ могут быть использованы для создания одноименных препаратов с улучшенными терапевтическими свойствами, способных заменить EcA или ErA в 1-й или во 2-й линии терапии при развитии к ним иммунологической резистентности у пациентов с гемобластозами. Схемы комбинированной химиотерапии с включением LO направлены на создание новых комбинаций противоопухолевых препаратов, ориентированных на лечение солидных опухолей, в т.ч. рака толстой кишки. Биохимические и биологические характеристики новых MGL, PAL и рибонуклеаз различного происхождения позволяют оценить клиническую перспективность этих групп ферментов. Предложенные новые методы отбора продуцентов, создания мутантных белков, изучения перекрестной иммуногенности, фармакокинетики, эффективности и переносимости схем комбинированной терапии с включением ферментных препаратов, подходы и рекомендации расширяют возможности использования ферментов в онкологии. Результаты настоящего исследования использованы на Федеральном уровне в методических рекомендациях «Разработка технических требований к технологиям разработки инновационных лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний» (Министерство 12 промышленности и торговли РФ, «5.5 Онкотребования 2011»); в деятельности рабочей группы Министерства образования и науки РФ по рассмотрению тематики работ в рамках мероприятий 5 «Доклинические исследования инновационных лекарственных средств» и 22 «Разработка новых образовательных программ и образовательных модулей для профильных высших и средних специальных учебных заведений» ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу». Методология и методы исследования В экспериментальной части работы использованы как стандартные методы молекулярной биологии, биохимии, токсикологии и экспериментальной онкологии, так и принципиально новые методы, предложенные и апробированные в рамках настоящего исследования. Стандартные подходы использованы для конструирования новых штаммов-продуцентов ферментов, создания мутантных форм L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum, изучения физикохимических свойств, ферментативной активности, кинетических характеристик, цитотоксической активности, противоопухолевой активности, переносимости ферментов, а также статистической обработки данных. Новые методы и модели применены для отбора штаммов-продуцентов L-аспарагиназ, изучения перекрестной иммуногенности L-аспарагиназ, изучения зависимостей «структура-функция» для L-аспарагиназ I типа методом сайтнаправленного мутагенеза, элементов фармакокинетики LO и MGL, антипролиферативного эффекта MGL, прогнозирования антипролиферативного эффекта L-аспарагиназ на основании кинетических характеристик, изучения эффективности комбинированной терапии c LO. Положения, выносимые на защиту 1. Созданы рекомбинантные продуценты и выделены в препаративных количествах новые бактериальные L-аспарагиназы из Yersinia pseudotuberculosis II типа и Rhodospirillum rubrum I типа, а также ряд их мутантных форм. Методом сайт-направленного мутагенеза установлены функционально-значимые аминокислотные остатки L-аспарагиназы I типа Rhodospirillum rubrum, ответственные за реализацию ферментативной активности. 2. Разработан новый комплексонометрический метод определения аспарагиназной активности на плотной среде, который позволяет выявлять активные штаммы-продуценты L-аспарагиназ с удельной активностью >0,1 МЕ/мг белка. 3. Новые L-аспарагиназы: из Wolinella succinogenes II типа, нативная и конъюгированная с гепаринсвязывающим пептидом, из Rhodospirillum rubrum I типа и из Yersinia pseudotuberculosis II типа обладают достоверной антипролиферативной активностью на моделях in vitro и in vivo. В ряду изученных L-аспарагиназ II типа существует достоверная прогностическая значимость 13 L-аспарагиназной активности для проявления антипролиферативной активности. Оптимальной для применения во второй линии терапии после L-аспарагиназы E. coli из изученных является L-аспарагиназа Wolinella succinogenes типа, II нативная или конъюгированная с гепаринсвязывающим пептидом. 4. Модель эпидермоидной карциномы легкого Льюис с дополнительным внутрибрюшинным (в/бр) введением пиридоксина может быть использована для оценки противоопухолевого эффекта L-метионин–γ-лиаз. Наиболее благоприятным фармакокинетическим профилем и уровнем антипролиферативного эффекта среди изученных L-метионин–γ-лиаз обладает Lметионин–γ-лиаза Clostridium sporogenes. 5. Для L-лизин-α-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai ВКМF-4268D эмпирически разработана безопасная и эффективная схема многократного в/в введения мышам с нагрузочной и поддерживающими дозами (дискретный режим). Среди изученных схем комбинированной терапии с L-лизин–α-оксидазой наиболее эффективно сочетание L-лизин–α-оксидазы с иринотеканом. 6. Химерные иммуноРНКазы, одноцепочечных вариабельных состоящие из мини-антител фрагментов антител, scFv) и (антиген-связывающих рибонуклеазы Bacillus amyloliquefaciens — барназы, обладают достоверным противоопухолевым эффектом. Более высокий эффект конъюгата 4D5 scFv-дибарназы по сравнению только с мини-антителами 4D5 scFv свидетельствует о наличии существенного вклада ферментативной активности в реализацию противоопухолевого эффекта. 7. Установлено, что использование модифицированного иммуноферментного метода и прямого определения активности для расчета основных фармакокинетических параметров L-лизин–αоксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai ВКМF-4268D при в/в введении дает сопоставимые результаты. 8. Установлена значимая антипролиферативная активность in vitro L-фенилаланин:аммиаклиазы Rhodosporidium toruloides, in vivo рибонуклеазы Bacillus intermedius. Степень достоверности и апробация результатов Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: 1. V молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 26–27 октября 2009 г. 2. X Всероссийская научно-практическая конференция с международным «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 22–23 марта 2011 г. 3. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, 8–12 августа 2011 г. участием 14 4. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Москва, 14–17 ноября 2011 г. 5. Заседание Ученого совета НИИ ЭДИТО ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН 24 января 2012 г. 6. 23th International Congress of Anti-Cancer Treatment, Paris, 31 January–2 February 2012. 7. XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 23–27 апреля 2012 г. 8. 22nd Biennial Congress of the EACR, Barcelona, 7–10 July 2012. 9. Заседание Объединенного Ученого совета ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН 15 апреля 2013 г. 10. 38th FEBS Congress, St. Petersburg, 6–11 July 2013. Личный вклад автора Автором определено научное направление, сформулированы цель и задачи исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения, в том числе методические подходы к оптимизации получения активных субстанций, обобщены и интерпретированы полученные результаты. Лично автором проведены эксперименты по оценке физико-химических и противоопухолевых свойств всех изученных ферментов. В соавторстве проведены эксперименты по созданию рекомбинантных штаммов-продуцентов и биоинформатическая часть работы. Структура диссертации Диссертационная работа изложена на 221 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 6 глав c описанием результатов исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов, списка сокращений и списка литературы, включающего 375 источников, из них 40 отечественных и 335 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 40 рисунками и 62 таблицами. Публикации По теме диссертации опубликовано 33 печатных работы, из них 7 за рубежом, 21 научная статья в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, получено 3 патента РФ. 15 Глава 1. Перспективы поиска, создания и доклинического изучения ферментных противоопухолевых препаратов. Обзор литературы Благодаря успехам биохимии и биотехнологии все более широкое применение в клинической медицине находят белковые препараты с ферментативной активностью, отличающиеся по механизму и разнообразию действия от традиционных препаратов, используемых в онкологии. Уже более 50 лет они используются для заместительной терапии при недостаточности поджелудочной железы, для ускорения заживления ран, в качестве тромболитиков, а также для лечения злокачественных новообразований. Первым бактериальным ферментом со специфическим действием на опухолевые клетки, нашедшим применение в клинической онкогематологии, стала L-аспарагиназа. В настоящее время для лечения больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) успешно применяются препараты нативной и иммобилизованной L-аспарагиназы из различных бактериальных источников (EcA и ErA, пегилированная EcA). Помимо этого, получены доказательства противоопухолевой активности и ряда других ферментов различного происхождения: пегилированной аргининдезиминазы (ADI), ранпирназы, MGL и др. Таким образом, для онкологии остается актуальной задача создания противоопухолевых препаратов на основе ферментов из различных источников с исследованием их биохимических свойств и молекулярных механизмов действия. 1.1. Ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот Применение противоопухолевых ферментных препаратов, участвующих в метаболизме определенных аминокислот, основано на традиционном представлении об отсутствии или низкой активности определенных синтетаз аминокислот в опухолевых клетках. Среди представителей этой группы L-аспарагиназы, L-лизин-альфа-оксидазы (LO), MGL, ADI и др. 1.1.1. L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1.) История обнаружения противоопухолевых свойств L-аспарагиназы связана с именем J. Kidd, который в 1953 г. впервые показал, что сыворотка крови морских свинок способна тормозить рост лимфосаркомы Гарднера у мышей С3Н [188]. В 1961 г. J. Broome выделил из сыворотки морских свинок сам фермент и установил, что именно с ним связано ее противоопухолевое действие [83]. Впоследствии был предположен основной механизм противоопухолевого действия L-аспарагиназ, который заключается в торможении синтеза белка вследствие гидролиза аспарагина в плазме крови с образованием аспарагиновой кислоты и аммиака (1). Наиболее чувствительными к аспарагиназе оказались лимфобластные клетки, лишенные 16 аспарагинсинтетазы и, соответственно, неспособные, в отличие от здоровых клеток, к самостоятельному синтезу L-аспарагина. (1) Однако существуют доказательства того, что противоопухолевое действие L-аспарагиназ не ограничивается только лишь снижением уровня свободного L-аспарагина [53], но имеются также и более специфические механизмы прямого воздействия на опухолевые клетки, заключающиеся в гидролизе связанного L-аспарагина в составе гликопротеиновых клеточных рецепторов. Известно, что на поверхности многих клеток гемобластозов присутствует увеличенное количество мембранных рецепторов, таких как CD19, CD40, IGF-R, значительно повышающих их чувствительность к действию митогенов различной природы. Данные рецепторы, связываясь со своими лигандами, обусловливают усиление роста и пролиферации опухолевых клеток [53; 216]. Между тем, многие из этих рецепторов представляют собой гликопротеиновые комплексы, в которых белковая часть объединена с N-гликозидной через пептидный спейсер (подобен пептидному мостику N-ацетилмурамовой кислоты), обогащённый амидными группами L-аспарагина [53; 133]. Полученные данные позволяют предполагать, что L-аспарагиназа не только разрушает свободный L-аспарагин в окружении опухолевых клеток, но также, возможно, способна расщеплять аспарагин в составе пептидных спейсеров гликопротеиновых рецепторов опухолевых клеток [133]. Рецепторы с отщеплённой подобным образом гликозидной частью не способны связываться с соответствующими лигандамимитогенами и стимулировать пролиферацию, что может объяснять еще один вероятный специфический механизм противоопухолевого действия L-аспарагиназ. Исследования in silico показали высокий уровень гомологии (до 49%) нуклеотидных последовательностей генов L-аспарагиназ и интерферонов β из различных биологических источников. Эти данные позволяют предположить, что L-аспарагиназы, наряду с ферментативным действием, могут обладать также механизмом специфического цитокинового действия. Данный механизм можно охарактеризовать как интерфероноподобный эффект, который, по всей видимости, может выражаться в способности взаимодействовать с рецепторами к интерферонам (interferon alpha/beta receptor (IFNAR)), приводя к индукции внутриклеточных ингибиторов целого ряда циклинзависимых киназ (Cdk) и их активных комплексов. Взаимодействие с IFNAR приводит к усилению экспрессии p38 MAP-киназы, активно фосфорилирующей белок р57 (Kip2) по остатку Thr143. В результате такого фосфорилирования в значительной степени возрастает блокирующее сродство р57 к комплексу Cyclin A/Cdk2, что влечёт за собой остановку деления клеток в фазе G1 жизненного цикла 17 [153]. Совокупность современных научных знаний предполагает наличие многофакторного механизма антипролиферативного действия L-аспарагиназ, ведущая роль в котором все же принадлежит расщеплению L-аспарагина. Реальный вклад каждого механизма в реализацию противоопухолевого эффекта пока остается недостаточно выясненным, в опубликованных работах также нет доказательства прямой связи между сродством к субстрату и антипролиферативной активностью L-аспарагиназ. В экспериментальных исследованиях 1970-х годов была выявлена наиболее чувствительная опухоль мышей — лимфаденоз Фишера L5178Y. Эта модель стала сигнальной для первичной оценки противоопухолевого действия новых препаратов L-аспарагиназы in vivо [38]. Начиная с 70-х годов прошлого века и по настоящее время EcA используется в составе схем комбинированной индукционной химиотерапии при ОЛЛ. В последние годы появились сообщения об ее эффективности в комбинированной терапии NK/T-клеточной и кожной Тклеточной лимфом [172, 254, 363]. Исследования последних лет направлены на минимизацию выявленных в ходе клинического применения недостатков существующих препаратов L-аспарагиназ: иммуногенности, отдельных побочных эффектов, а также предупреждение формирования лекарственной резистентности при повторных курсах. С этой целью исследуются L-аспарагиназы из новых источников, а также модифицированные (конъюгированные с другими макромолекулами или мутантные) формы известных ферментов. Минимизация L-глутаминазной активности L-аспарагиназ. Помимо расщепления L-аспарагина большинство L-аспарагиназ бактериального происхождения также способны к дезаминированию L-глутамина. При этом многие авторы полагают, что именно с Lглутаминазной активностью связаны гепатотоксичность, нарушения свертываемости крови и угнетение центральной нервной системы (ЦНС) [256, 278, 340, 345]. Это обусловлено тем, что в основном пути биосинтеза L-аспарагина в клетках млекопитающих (из аспарагиновой кислоты при участии аспарагинсинтетазы) донором амидной группы является L-глутамин [349]. Таким образом, снижение концентрации L-глутамина лишает нормальные клетки возможности избежать токсического действия фермента путем внутриклеточного синтеза L-аспарагина. На культуре гепатоцитов крысы показано, что EcA вызывает угнетение синтеза белка, которое сопровождается пропорциональным снижением внутриклеточной концентрации L-глутамина [340]. В клинических исследованиях было установлено, что через 1 ч после в/в введения EcA больным ОЛЛ концентрация L-глутамина плазмы крови уменьшалась до 5% от исходного значения. Это позволило ряду авторов предположить, что угнетение синтетической функции печени коррелирует с L-глутаминазной активностью [256]. Этой гипотезе отвечают результаты доклинического изучения L-аспарагиназы Wolinella succinogenes (WsA), лишенной L- 18 глутаминазной активности, продемонстрировавшей, в отличие от отсутствие EcA, гепатотоксичности или иммуносупрессивного эффекта in vivo [69, 112]. Позднее было установлено, что угнетение синтеза белка в печени и селезенке после применения EcA коррелирует с содержанием фосфорилированного трансляционного фактора eIF2 [278]. Существуют предположения, что нейротоксичность препаратов L-аспарагиназ так же, как и гепатотоксичность, связана с образованием L-глутаминовой кислоты, повышенная концентрация которой может оказывать угнетающее воздействие на ЦНС [316]. Показано, что через 24 ч после введения EcA мышам концентрация глутаминовой кислоты в плазме крови может возрастать в 6 раз [280]. Эти предположения подтверждаются результатами I фазы клинического изучения фермента из Acinetobacter, обладающего высокой L-глутаминазной активностью: выраженным нейротоксичность угнетением ЦНС аспарагиназы-глутаминазы вплоть до комы и Acinetobacter летального исхода проявляется и является дозолимитирующей [345]. В качестве альтернативной причины нейротоксичности Lаспарагиназ рассматривается повышение концентрации аммиака в плазме крови [313, 316]. Так, концентрация аммиака увеличивается в течение первых суток после введения EcA до уровня, в 7 раз превышающего исходный, после чего в течение 2 сут полностью нормализуется, что соответствует длительности циркуляции EcA [313, 346]. Попытки снизить L-глутаминазную активность препаратов L-аспарагиназ традиционно предпринимаются двумя путями. Первый из них предполагает поиск аспарагиназ с низкой Lглутаминазной активностью из других источников и детальное изучение их биохимических и биологических свойств. Например, практически отсутствует L-глутаминазная активность у WsA и L-аспарагиназы Helicobacter pylori (HpA) [7, 89, 112]. Второй подход — модификация уже изученных ферментов; замена аминокислотных остатков, определяющих субстратную специфичность. В частности, к избирательному снижению Lглутаминазной активности EcA приводит замена Asp248 [109]. Путем направленного мутагенеза были получены гены, кодирующие EcA с различными заменами Asp248, которые в составе вектора pT7-7 использовались при трансформации штамма E. coli CU1783. Из полученных рекомбинантных ферментов наиболее перспективным оказался белок с заменой Asp248Ala: константа скорости ферментативной реакции kcat гидролиза L-глутамина по сравнению с природным ферментом снижалась с 3,3×10–1 до 2,9×10–3, снижение kcat гидролиза L-аспарагина было значительно менее выраженным [109]. Однако помимо увеличения токсичности, L-глутаминазная активность EcA вносит существенный вклад и в реализацию ее противоопухолевого действия. Так, существуют данные о том, что дезамидирование L-глутамина дополнительно снижает концентрацию L-аспарагина в плазме крови и отчасти предопределяет эффективность лечения, поскольку L-глутамин 19 используется клеточной аспарагинсинтетазой для синтеза L-аспарагина [61, 62, 262]. Это предположение подкрепляется исследованиями in vitro, показавшими, что целенаправленное угнетение активности глутаминсинтетазы повышает цитотоксический эффект EcA [281, 332]. Снижение иммуногенности L-аспарагиназ. Наиболее хорошо изученные способы: химическая модификация молекулы белка, иммобилизация на водорастворимых полимерах или создание липосомальной лекарственной формы. «Закрытие» поверхности белка затрудняет процесс распознавания антигена и презентации макрофагами его фрагментов Т-хелперам, что определяет снижение иммуногенности. В настоящее время существует ряд различных методов модификации белковых препаратов, одним из наиболее эффективных является химическая модификация белка полиэтиленгликолем (ПЭГ). Пегилирование EcA существенно увеличивает продолжительность её циркуляции в кровотоке — Т1/2 увеличивается от 1,24±0,17 до 5,73±3,24 сут [42, 59]. Однако при развитии аллергической реакции на нативную EcA Т1/2 как нативной, так и пегилированной L-аспарагиназы существенно сокращается, что объясняется их идентичными антигенными свойствами [187]. Пегилирование позволяет частично решить только две проблемы, связанные с применением Lаспарагиназы — уменьшить интенсивность иммунного ответа, а также несколько увеличить стабильность препарата в крови. При этом на частоту развития и выраженность других побочных эффектов пегилирование не влияет [61]. Так, сравнительное исследование нативной и пегилированной EcA у детей с ОЛЛ показало, что при применении последней панкреатит развивается у 18% больных, что достоверно выше, чем после введения нативной EcA [48]. Помимо EcA, с использованием метоксиполиэтиленгликоль-n-нитрофенилкарбоната с молекулярной массой ПЭГ 5000 получена также пегилированная ErA [21]. Наряду с пониженной иммуногенностью она более стабильна при протеолизе трипсином и трипсиноподобными протеазами плазмы крови, а также при воздействии повышенной температуры по сравнению с нативным ферментом. Кроме того, на культурах клеток лейкозов Molt-4 и Raji для модифицированной L-аспарагиназы показана более высокая цитостатическая активность, что может объясняться более медленным разрушением [21]. Помимо пегилирования, к снижению иммуногенности приводит инкапсулирование Lаспарагиназы в липосомы диаметром 158–180 нм [135], иммобилизация на гидрогеле ПЭГальбумина [175], инкапсулирование фермента в наночастицы сополимера лактид-гликолида [136], химическая модификация L-аспарагиназы NO2-карбоксиметил-хитoзаном в присутствии L-аспарагиновой кислоты [276]. Т1/2 из плазмы крови макак-резус поли-DL-аланил-модифицированной ErA более чем в 100 раз больше, чем для нативного фермента [338]. Инкапсулирование в липосомы пальмитоил-Lаспарагиназы увеличивает ее Т1/2 более чем в 8 раз [179]. Для уменьшения иммуногенности L- 20 аспарагиназ и увеличения времени их циркуляции в крови путем «закрытия» поверхности белка от иммунокомпетентных клеток и протеолитических ферментов возможно также использование других рекомбинантных белков, обладающих низкой токсичностью и иммуногенностью, например, различных белков шелка [207, 311, 373]. Среди изучаемых перспективных способов снижения иммуногенности можно указать также инкапсуляцию фермента в эритроциты in vitro [204]. Другим возможным подходом к снижению иммуногенности является эпитопное картирование антигенных детерминант L-аспарагиназ и получение мутантных ферментов со сниженной иммуногенностью. Так, показано, что для ErA основным антигенным эпитопом является участок GIVPPDEELP, а замена Pro285 на Thr285 снижает иммуногенность в 8 раз [235]. Третьим возможным способом решения этой проблемы может быть последовательное применение L-аспарагиназ с различными антигенными свойствами. В частности, показано, что антитела к EсА не вызывают разрушение ErA, и это позволяет ее с эффектом применять у больных с исчерпанными возможностями [142, 341, 369]. Применение L-аспарагиназ, не инактивирующихся антителами к EcA и ErA, может оказаться эффективным при выработке иммунологической резистентности к EcA и ErA после многократных курсов химиотерапии. Экспериментально доказано, что отличными от EcA иммуногенными свойствами обладают WsA и HpA [7, 113]. Четвертым возможным подходом к снижению иммуногенности является поиск и использование белков с меньшей молекулярной массой, что может позволить, помимо снижения иммуногенности, снизить также белковую нагрузку. Изучение L-аспарагиназ из других источников. Существование широкого ряда природных Lаспарагиназ с различной первичной структурой а, следовательно, физико-химическими свойствами и антипролиферативным эффектом, открывает новые возможности для поиска новых противоопухолевых ферментов. Все бактериальные L-аспарагиназы в настоящее время принято разделять на два основных типа. К главным критериям их отличия относятся локализация (вне- или внутриклеточная), сродство к субстрату и четвертичная структура [227]. Принято считать, что L-аспарагиназы I типа представляют собой конститутивно экспрессирующиеся ферменты, локализованные в цитоплазме и характеризующиеся высоким значением Km (10-3 М) для L-аспарагина. К L-аспарагиназам I типа относятся внутриклеточные L-аспарагиназы E. coli, Bacillus subtilis, Methanococcus jannaschii, Pyrococcus horikoshii и др. [74, 362]. Их Km составляет около 3,5 мМ, и считается, что противоопухолевой активностью они не обладают [68, 88]. Бактериальные L-аспарагиназы II типа относятся к периплазматическим ферментам, имеют низкое значение Km (10-5 М) для L-аспарагина и широкую субстратную специфичность [255]. L-аспарагиназы II типа включают применяемые в клинической онкологии 21 EcA и ErA, а также практически все изученные L-аспарагиназы с доказанной антипролиферативной активностью. Эффективность в отношении лейкозных клеток in vitro или in vivo была обнаружена у ряда бактериальных L-аспарагиназ II типа (периплазматических): WsA, HpA, a также L-аспарагиназ Thermus thermophilus, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Erwinia aroidea, Aspergillus terreus, Mycobacterium tuberculosis [1, 7, 89, 90, 268, 274, 277, 282]. Успешно прошла клинические испытания ErA, которая, в отличие от EcA, не снижает уровень антитробмина, α2-антиплазмина и плазминогена в плазме крови и, следовательно, не повышает риск тромбообразования [54, 118]. Аналогичные данные получены in vivo для EwA [117]. На III фазе сравнительного изучения EcA и ErA у детей, больных ОЛЛ (n=702), показано, что при одинаковых дозах (10 000 МЕ/м2 2 раза в неделю в течение 4 нед) нарушения свертываемости крови наблюдались значительно чаще при применении EcA (30,2 и 11,8%, соответственно, p <0,0001), выраженность и частота развития других побочных эффектов существенно не отличались [118]. При этом как непосредственная эффективность лечения (частота ремиссий), так и отдаленные результаты (риск рецидива, бессобытийная и общая выживаемость) при применении ErA были достоверно хуже [118]. По данным другого масштабного (n=758), но не рандомизированного исследования, применение ErA также реже осложняется панкреатитами и нейротоксичностью [121]. В то же время ErA относится к L-аспарагиназам с относительно высокой L-глутаминазной активностью, которая достигает 10–15% от L-аспарагиназной и значительно выше, чем у EcA (составляет около 2% от L-аспарагиназной) [54, 118, 162]. Этот факт дает возможность усомниться в прямой зависимости выраженности токсического действия L-аспарагиназ от их Lглутаминазной активности и предполагать наличие других факторов, влияющих на переносимость лечения. С другой стороны, меньшая токсичность, как и более низкая, чем у ЕсА, эффективность лечения может быть связана с меньшим Т1/2 ErA из кровотока (0,65 сут для ErA и 1,24 сут для EcA) [59]. Таким образом, детальное изучение физико-химических и биологических свойств Lаспарагиназ, а также молекулярных механизмов их действия позволит обнаружить закономерности проявления токсического действия и возможности для его снижения и улучшить терапевтические характеристики L-аспарагиназ. 1.1.2. L-аргининдеиминаза (КФ 3.5.3.6.) Появление в середине 1940-х годов интереса к антипролиферативным свойствам L-аргиназы и L-аргининдеиминазы (ADI) — ферментов, катализирующих разрушение аргинина, было обусловлено обнаружением стимулирующего действия аргинина на митотическую активность 22 клеток карциномы 63 мышей и его участие в синтезе креатинина у крыс с саркомой Йенсена [63, 64]. Кроме того, в работах начала 1970-х было показано, что аргинин необходим для выживания клеток лимфомы Беркитта и лимфосаркомы мышей [257, 315]. Исторически первой была изучена аргиназа, которая катализирует расщепление аргинина на оринитин и мочевину (2). Была создана пегилированная рекомбинантная аргиназа человека, которая эффективно ингибировала рост гепатоцеллюлярной карциномы in vitro и in vivo [96]. Обе формы аргиназы, нативная и пегилированная угнетали также пролиферацию клеток лимфаденоза Фишера, но были неэффективны на этой модели in vivo [294]. Рекомбинантная пегилированная аргиназа продемонстрировала способность модифицировать противоопухолевый эффект цитарабина на ксенографтах Т-клеточного лейкоза человека (аддитивный эффект) [152]. В последние годы опубликованы данные о наличии значимой цитотоксичности у рекомбинантной аргиназы человека в отношении клеток рака предстательной железы [163]. (2) Преимущества ADI (катализирует расщепление аргинина до цитруллина и аммиака) по сравнению с аргиназой определяются отсутствием мочевины среди продуктов реакции и большей ферментативной активностью при физиологических значениях рН и температуры (3). Впервые ADI была выделена в 1970-х годах из клеток Pseudomonas putida [300]. Позднее аналогичный фермент был получен из Mycoplasma arginini и оказался эффективным in vivo на модели гепатомы МН134 и других опухолях животных [323]. Для рекомбинантной ADI Mycoplasma arginini с противоопухолевыми свойствами в экспериментах на культуре эндотелиальных клеток и в опытах in vivo с матригелем показано антиангиогенное действие [263]. Обладает противоопухолевым эффектом также и рекомбинантная ADI из Pseudomonas plecoglossicida [248]. (3) 23 Пегилированная ADI Mycoplasma homimis ADI-SS PEG20,000 оказалась эффективной на различных моделях меланомы и гепатоцеллюлярной карциномы in vitro и in vivo [130]. На культурах опухолевых клеток лимфоидного происхождения ADI давала существенно более высокий эффект по сравнению с миелоидными клетками [143]. На культуре клеток Tлимфобластного лейкоза CCRF-CEM также показан синергизм действия пегилированной ADI с глюкокортикоидами [251]. Эффективность фермента была подтверждена в клинических исследованиях при лечении солидных опухолей. При неоперабельной гепатоцеллюлярной карциноме контроль роста опухоли составил 83%, а объективный эффект достиг 47% (11% полных и 36% частичных ремиссий при 36% стабилизаций), медиана выживаемости достигла 15,8 мес; при диссеминированной меланоме — значительное увеличение выживаемости с контролем роста опухоли и объективным эффектом в 24% случаев (4% полных и 20% частичных ремиссий) [58, 102, 141, 171]. В более позднем исследовании I/II фазы ADI PEG 20 при распространенной меланоме у 9 из 31 пациентов была зафиксирована стабилизация процесса при хорошей переносимости терапии [258]. Опубликованы результаты единичных клинических наблюдений эффекта пегилированной ADI у пациентов c рефрактерной к терапии кожной Т-клеточной лимфомы (синдром Сезари) [107]. Позднее для солидных опухолей было установлено, что прямым биохимическим маркером, позволяющим прогнозировать эффективность ADI, является дефицит аргининосукцинатсинтазы-1 (ASS1) [132, 185, 223, 322, 351]. Отсутствие последней выявлено в культурах клеток гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы, рака поджелудочной железы, почки, предстательной железы, мезотелиомы плевры и ретинобластомы человека [77, 130, 189, 190, 303, 321, 364]. В исследованиях Delage B. et al. было показано, что для клеток гемобластозов характерен особый путь «выключения» гена ASS1, а именно метилирование его промотора, которое можно использовать для прогнозирования эффективности терапии ADI даже с большей достоверностью, чем отсутствие продукта экспрессии гена — самого белка ASS1. Метилирование промотора ASS1 является отличительной чертой клеток ряда лимфом от нормальных гемопоэтических клеток и сопровождается активацией каспазозависимой гибели клеток после коинкубации с ADI. Этот эффект был изучен на клетках различных лимфом: фолликулярной, диффузной В-крупноклеточной, из клеток мантийной зоны, Беркитта и ходжкинской [107]. C другой стороны, индукция экспрессии ASS1 ассоциирована с резистентностью к аргинин-депривирующей терапии [337]. Как и для L-аспарагиназ, актуальные направления экспериментальных исследований ADI включают поиск ферментов с улучшенными терапевтическими характеристиками. В частности, мутантная форма ADI Mycoplasma arginini M314 (аминокислотные замены A128T, H404R, 24 I410L) обладает в 20 раз большей удельной активностью по сравнению с нативной формой [249]. Пегилирование увеличивает Т1/2 ADI из плазмы крови мышей от 5 ч до 7 сут, при этом снижая его иммуногенность [130, 159]. 1.1.3. L-метионин–γ-лиаза (КФ 4.4.1.11.) L-метионин–-лиаза (MGL) — пиридоксаль-5'-фосфат-зависимый фермент, катализирующий реакцию -элиминирования L-метионина с образованием метилмеркаптана, -кетомасляной кислоты и аммиака (4). O NH3 H3C O S CH3SH + O + NH4 O O (4) Помимо основой функции α, γ-элиминирования метионина, MGL катализирует также реакции γ-замещения метионина и α, β-элиминирования и β-замещения цистеина, S-метил-L-цистеина с образованием соответствующих меркаптанов, пировиноградной кислоты и аммиака [330]. MGL была выделена из бактерий Pseudomonas putida, Pseudomonas ovalis, Aeromonas sp., Clostridium sporogenes, Phorphyromonas gingivalis, Brevibacterium linens BL2, Citrobacter freundii и ряда других, из эукариотических простейших Trichomonas vaginalis и Entamoeba histolytica и из грибов Aspergillus flavipes [15, 25, 125, 127, 169, 199, 217, 242, 293, 330, 335, 365]. Фермент представляет интерес в качестве противоопухолевого средства, поскольку метионин необходим для роста злокачественных клеток различного происхождения, и антипролиферативный эффект MGL связывают с разрушением L-метионина [25, 92, 327]. Дефицит L-метионина лишает клетки органической серы и лабильной метильной (СН3)-группы S-аденозилметионина, которая используется в реакциях постсинтетического метилирования полимерных молекул нуклеиновых кислот и белков, а также для синтеза адреналина, холина, фосфолипидов и креатина. Фермент останавливает клеточный цикл в фазе G2 [30, 164, 195]. В 1973 г. опубликованы данные об эффективности MGL Clostridium sporogenes in vitro в культуре клеток мышиной мастоцитомы P815 и in vivo на саркоме Уокера 256 крыс [199]. Эффективность фермента (нативного или рекомбинантного) из Pseudomonas putida показана на широком спектре перевиваемых солидных опухолях животных и человека: саркоме Йошида, немелкоклеточном раке легкого NCL-Н460 и Ma44, медуллобластоме Daoy; нейробластоме LAN-1 и NMB-7, раке толстой кишки HCT116, HCT15, HT29, Colo205 и SW620, фибросаркоме HT1080, плоскоклеточном раке KB3-1, KB8-5 [164, 195, 326, 328, 366]. К MGL из Pseudomonas putida чувствительны культуры клеток гемобластозов CEM, Molt4, Molt16, K562, HL60 [160]. 25 Цитотоксичность MGL из Aspergillus flavipes продемонстрирована на культурах клеток рака предстательной железы, печени и молочной железы [126]. На ксенографтах рака толстой кишки человека Colo205 и SW620, а также рака молочной железы человека MX-t показан синергизм комбинации рекомбинантной MGL с цисплатином [161, 328]. На модели карциномы легкого Льюис мышей обнаружен потенцирующий эффект MGL при совместном применении с 5-фторурацилом [366]. На ксенографтах нейробластомы и глиобластомы человека эффективными были комбинации MGL с винкристином, темозоломидом или кармустином [164, 196]. Доклиническое изучение токсичности продемонстрировало, что MGL практически не имеет гематологической токсичности (за исключением эритропении I–II степени) и обладает слабыми антигенными свойствами [366]. В рамках пилотного клинического исследования I фазы подтверждена безопасность применения MGL Pseudomonas putida у больных метастатическим раком молочной железы и зарегистрирован слабый противоопухолевый эффект на фоне значительного снижения концентрации метионина в сыворотке крови [329]. В начале XXI в. была создана пегилированная MGL, обладающая сопоставимой с нативным ферментом эффективностью in vivo. Пегилирование позволило увеличить в 20 раз Т1/2 фермента из плазмы крови и существенно снизить его иммуногенность [318]. Разработка новых лекарственных форм доставки с использованием катионных липосом, конъюгированных с антиCAGE одноцепочечным фрагментом антител scFV может повышать эффективность проникновения фермента внутрь клеток; клиническое значение этого, однако, остается пока неясным [354]. Интересен опыт использования гена MGL Pseudomonas putida (MET) и пролекарства в виде неактивного селенометионина (SeMET) [228]. Был сконструирован рекомбинантный аденовирусный вектор, включающий ген MGL, запускающийся CMV-5 промотором (rAd-MET). Комбинация MET и SeMET приводила к образованию токсичного метилселенола. Введение SeMET в культуру клеток, трансфецированных rAd-MET, вызывало гибель более 80% клеток рака легкого А549, клеток плоскоклеточного рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, яичников. Авторы полагают, что механизм цитотоксичности метилселенола связан с индукцией апоптоза вследствие образования супероксидных радикалов. 1.1.4. Оксидазы L-аминокислот Оксидазы L-аминокислот (LAAO) — флавин-содержащие ферменты, характерной особенностью которых является высокая стереоспецифичность по отношению к L-изомерам аминокислот. LAAO широко распространены в природе и обнаружены у многих видов змей [45, 271, 310, 325], насекомых [46], некоторых видов бактерий [72, 73, 80, 81, 115, 221], грибов 26 [202, 250, 253, 305], водорослей [270], моллюсков и рыб [86, 122, 181, 191, 194, 324]. У млекопитающих оксидазы L-аминокислот выделены из печени, почек, мозга [240, 241], секрета молочных желез у мышей [319] и из полиморфноядерных лейкоцитов [119]. За последние 10–15 лет LAAO стали предметом интенсивного изучения в силу их многообразного биологического действия. В частности, были обнаружены антибактериальные, противогрибковые, противопротозойные, противовирусные и противоопухолевые свойства этих ферментов. Известно, что LAAO подвергают окислительному дезаминированию аминокислоты с образованием α-кетокислот с высвобождением аммиака и пероксида водорода. Соответственно, механизм антипролиферативного действия может быть объяснен, с одной стороны, дефицитом разрушаемой аминокислоты, а с другой — накоплением пероксида водорода, повреждающего молекулы ДНК [202]. Подтверждением значимости вклада оксидативного стресса, образующегося вследствие гиперпродукции H2O2, является показанное в целом ряде работ достоверное снижение цитотоксичности LAAO в присутствии каталазы [49, 213]. Пероксид водорода, являясь активной формой кислорода, способен вызывать в зависимости от концентрации повреждение ДНК и гибель клетки как путем некроза, так и путем апоптоза. Под действием пероксида водорода в клетках инициируется каскад образования других активных форм кислорода, что приводит к изменению трансмембранного потенциала митохондрий. В условиях умеренного повреждения клетки в отсутствие гипоксии происходит редукция трансмембранного потенциала, что может провоцировать активацию митохондриальной ветви апоптоза. В отсутствие выраженного энергодефицита и сохранности генетического аппарата гибель клетки реализуется путем апоптоза, но глубокая гипоксия и выраженные повреждения ДНК инициируют некроз. В частности, морфологические признаки обоих типов гибели клеток показаны на клетках Jurkat после коинкубации с LAAO малайзийской гремучей змеи. В присутствии каталазы количество клеток, погибающих путем апоптоза, увеличивается [51]. Проапоптотическое действие в отношении опухолевых клеток LAAO яда королевской кобры Ophiophagus hannah было подтверждено с использованием фикоэритрит-(PE) аннексин-V/7амино-актиномицинового теста (AAD), причем число клеток, находящихся в апоптозе, было существенно выше среди опухолевых клеток по сравнению с неопухолевыми [213]. Способность LAAO индуцировать апоптоз опухолевых клеток также была продемонстрирована с использованием теста на каспазы-3/7 с оценкой фрагментации ДНК [213]. В ряде работ была обнаружена способность LAAO связываться с поверхностью клеток, обусловленная наличием в структуре ферментов углеводных остатков [139, 239]. Выдвинуты предположения [51], что LAAO могут не только связываться с поверхностью клеток линии Jurkat, но интернализовываться, выполняя свою каталитическую функцию внутри клеток. Этот 27 путь осуществляется благодаря углеводной части фермента, поскольку дегликозилированные препараты LAAO не способны прикрепляться к клетке. Аналогичный механизм поглощения клеткой можно отметить у бактериальных токсинов белковой природы Vibrio cholerae и Corynebacterium diphtheriae [184, 237]. Изложенные выше факты о различных путях реализации биологического действия LAAO на клетку указывают, что их антипролиферативное действие может быть связано со способностью прикрепляться к поверхности клетки и создавать локально высокие концентрации пероксида водорода, а также со способностью удалять из среды культивирования эссенциальные аминокислоты. Оценка цитотоксического эффекта в отношении различных культур опухолевых клеток проведена для целого ряда ферментов из класса LAAO, при этом наибольший массив данных был получен для неспецифичных LAAO яда змей и морских моллюсков и L-лизин-альфаоксидазы (LO). Цитотоксический эффект LAAO был продемонстрирован на различных моделях опухолей животных и человека: саркоме S180, раке молочной железы SKBR-3, асцитной опухоли Эрлиха EAT [170], Т-лимфобластном лейкозе Jurkat [51, 170] и С8166 [372], промиелоцитарном лейкозе человека HL-60 [310, 336], карциноме шейки матки HeLa [183, 288, 370], глиобластоме [317], карциноме яичников человека A2780 [264], Т-клеточном лейкозе мышей EL-4 [166], эритромиелобластного лейкоза человека K562 [288]. Так, LAAO змеи Bothrops leucurus, специфичная в отношении L-метионина, L-норлейцина, Lлейцина, L-фенилаланина и L-триптофана продемонстрировала цитотоксичность в отношении культур клеток рака желудка MKN-45, аденокарциномы HUTU, рака толстой кишки RKO [244]. LAAO яда королевской кобры Ophiophagus hannah дала выраженный цитотоксический эффект в отношении клеток рака молочной железы MCF7 и аденокарциномы легкого А549, c IC50 0,04 и 0,05 мкг/мл, соответственно [213]. При этом отмечается, что IC50 для неопухолевых клеток молочной железы 184В5 и легкого NL20 была в 3–4 раза выше, что свидетельствует об избирательности действия LAAO на злокачественные опухолевые клетки. LAAO яда Lachesis muta, активная в отношении широкого спектра гидрофобных аминокислот, токсична для клеток рака желудка AGS (IC50=22,7 мкг/мл), рака молочной железы MCF7 (IC50=1,41 мкг/мл) [82]. LAAO Bothrops atrox цитотоксична в отношении клеток гемобластозов HL60, Jurkat, меланомы мышей B16F10, а также клеток PC12 [49]. LAAO Trimeresurus flavoviridis активна на клетках глиомы крыс C6 и человека RBR 17T, U251 [317]. L-лизин-альфа-оксидаза (LO) — дезаминаза незаменимой L-аминокислоты — L-лизина. Интенсивное изучение противоопухолевых свойств фермента началось в 1980–1984 гг. после 28 выделения из клеток грибов Trichoderma viride Y 244-2 (Япония) и Trichoderma harzianum Rifai (СССР) [34, 202]. Известно, что LO подвергает окислительному дезаминированию L-лизин с образованием пероксида водорода и α-кето-ε-аминокапроновой кислоты (5). Соответственно, механизм антипролиферативного действия объясняли уменьшением снабжения опухолевых клеток L-лизином, который является составной частью гистоновых белков и участвует не только в формировании хроматина, но и в тонких механизмах передачи наследственной информации. Позже было установлено, что цитотоксический эффект фермента также связан с накоплением пероксида водорода, повреждающего молекулы ДНК [202]. (5) LO Trichoderma harzianum Rifai изучена на широкой панели опухолевых моделей in vivo. В культуре клеток лимфомы Беркитта (P3HRj) показано, что фермент блокирует переход клеток из фазы S в G2/М клеточного цикла [14]. В отличие от L-аспарагиназы, она обладает существенно более широким спектром противоопухолевой активности и эффективна в отношении гемобластозов L1210, P388, La, а также ряда солидных опухолей [38]. В то же время на высокочувствительном к L-аспарагиназам лимфаденозе Фишера L5178Y LO оказалась совершенно неактивной. Токсикологическое изучение показало, что LO обладает большой терапевтической широтой, что позволяет варьировать величину эффективной дозы в 10 раз без опасности увеличения токсичности [38]. Фермент имеет слабый аллергенный потенциал, практически не включает гуморальный иммунный ответ на белковые антигены и не меняет функциональную активность Т-лимфоцитов [38]. Для облегчения доставки LO к клеткам-мишеням были разработаны методы получения конъюгатов с антителами, в том числе с моноклональными ICO-80 к рецептору CD5 [9, 23]. Связывание моноклональных антител с ферментом не изменило их специфичности в отношении рецептора CD5 на поверхности клеток Jurkat при незначительном снижении цитотоксичности химерного белка по сравнению с нативным ферментом [23]. 1.1.5. L-фенилаланин:аммиак-лиаза (КФ 4.3.1.5) L-фенилаланин:аммиак-лиазы (PAL) катализируют превращение L-фенилаланина в транскоричную кислоту и аммиак (6) [291]. PAL выделены из различных штаммов грибов и бактерий, и, прежде всего, изучены в качестве средств для заместительной терапии фенилкетонурии [76, 87, 279, 292]. В экспериментальных исследованиях 1970-х годов показана эффективность PAL из Rhodotorula glutinis в отношении лимфаденоза Фишера L5178Y in vitro и in vivo, где достигнуто излечение ~40% мышей [41, 314]. Как и для других ферментов, 29 разрушающих аминокислоты, считается, что механизм противоопухолевого действия PAL связан с уменьшением концентрации L-фенилаланина [50]. (6) 1.1.6. Тирозин-фенол-лиаза (КФ 4.1.99.2) Тирозин-фенол-лиаза катализирует обратимую реакцию β-элиминирования и реакцию βзамещения L-тирозина с образованием фенола, пирувата и аммиака. Тирозин-фенол-лиаза обладает широкой субстратной специфичностью и также эффективно катализирует реакцию βэлиминирования L-серина, L-цистеина, β-хлораланина и ряда других аминокислот и их производных [11, 358]. Как и MGL, относится к пиридоксальфофсфат зависимым ферментам. Тирозин-фенол-лиаза обнаружена у ряда энтеробактерий и насекомых [116, 129]. Показано наличие противоопухолевой активности на модели меланомы B16 мышей [225]. 1.2. Рибонуклеазы Антипролиферативные свойства рибонуклеаз панкреатического типа впервые описаны в начале 1950-х годов, когда in vitro и in vivo был выявлен противоопухолевый эффект РНКазы А. В частности, панкреатическая РНКаза при в/бр введении на 30–50% пролонгировала жизнь мышей с асцитной карциномой Эрлиха или саркомой Уокера 256 [208]. Антипролиферативное действие рибонуклеаз связывают с регуляцией РНК-зависимых механизмов клеточной пролиферации и апоптоза, а также их взаимодействием с Ca2+-активируемыми калиевыми каналами [231]. Существует предположение, что цитотоксичность рибонуклеаз напрямую связана с уровнем экспрессии ras-онкогенов [19]. 1.2.1. Ранпирназа (онконаза) Изучение ранпирназы как противоопухолевого фермента началось во второй половине 1980-х годов с выделения из ооцитов леопардовой лягушки Rana pipiens белка P-30, обладающего цитостатической активностью in vitro [103]. Ранпирназа принадлежит к суперсемейству рибонуклеаз панкреатического типа, активных в отношении высокомолекулярной РНК [56]. Механизм антипролиферативного действия фермента объясняется разрушением фосфодиэфирных связей рибосомальной РНК, которое приводит к угнетению синтеза белка опухолевыми клетками [352]. Ранпирназа угнетает синтез циклина D3 и стимулирует p27KIP1, p16INKA и p21WAF1/CIP1, что препятствует фосфорилированию pRb в фазе G0/G1 и приводит к остановке клеточного цикла в сверочной точке, контролируемой циклином D и 30 циклинзависимыми киназами Cdk4/6 [181]. Существуют также данные о том, что фермент потенцирует действие ФНОα на опухолевые клетки и вызывает апоптоз [108]. В 1990 г. была установлена противоопухолевая активность ранпирназы in vivo на ксенографтах рака поджелудочной железы ASPC-1 и немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) А549 у бестимусных мышей [209, 210]. На ксенографтах рака толстой кишки показано потенцирующее действие ранпирназы на противоопухолевый эффект винкристина [285]. Среди гемобластозов к ранпирназе оказались чувствительными клетки промиелоцитарного лейкоза HL-60, гистиомоноцитарной лимфомы U937 и множественной миеломы RPMI-8228 [168]. В конце 1990-х годов были созданы рекомбинантные штаммы E. coli, позволяющие существенно повысить результативность получения фермента [6, 252]. В 2002 г. опубликованы результаты II фазы клинического изучения ранпирназы у 105 пациентов с мезотелиомой плевры, практически не чувствительной к стандартной химиотерапии. У 77% пациентов был зарегистрирован объективный эффект, прогностически значимый для выживаемости. Положительные эффекты были отмечены также при раке молочной железы, почки и НМРЛ [100, 229]. На III фазе изучения показано, что эффективность ранпирназы в монорежиме при мезотелиоме плевры сопоставима со стандартом лечения доксорубицином, а их комбинация превосходит по активности результаты монохимиотерапии [273]. Применение ранпирназы не сопровождается гематологической, кардио- или гепатотоксичностью, а также мукозитами. Наиболее частым клиническим проявлением побочного действия ранпирназы является нефротоксичность, которая выражается в протеинурии с азотемией или без нее и периферических отеках [100, 339]. В последние годы опубликованы результаты изучения in vitro и in vivo конъюгата ранпирназы с иммунотоксином 2L-Rap-hLL1-γ4P, состоящего из двух молекул ранпирназы, конъюгированных с N-концом легкой цепи hLL1, антитела к CD74. Применение конъюгата у мышей с ксенографтами лимфомы Беркитта CD74+ Raji и Daudi продемонстрировало возможность излечения у большинства животных [94]. Многообещающие результаты были получены на тех же моделях для конъюгатов ранпирназы с моноклональными антителами к CD22. Так, продолжительность жизни мышей с диссеминированной лимфомой Daudi (после в/в трансплантации опухолевых клеток) увеличивалась в 1,3 раза (на 135%) [247]. 1.2.2. Амфиназа Аналог ранпирназы, выделена также из ооцитов Rana pipiens. Антипролиферативная активность показана на культурах клеток лейкозов человека промиелоцитарного HL60, Tклеточного Jurkat и моноцитарного U937, причем по сравнению с ранпирназой при эквимолярных концентрациях амфиназа оказалась более активной [55]. 31 1.2.3. Биназа Биназа — секретируемая микробная рибонуклеаза Bacillus intermedius, принадлежит к семейству рибонуклеаз N1/T1 и обладает эндонуклеазной активностью в отношении гидролиза РНК и динуклеозидфосфатов. Биназа оказывает цитотоксическое действие на фибробласты, трансформированные онкогенами ras, fms, src, AML и AML/ETO [18, 231]. На культуре клеток острого миелобластного лейкоза Kasumi-1 продемонстрирован выраженный эффект биназы, сопровождающийся усилением экспрессии целого ряда проапоптотических генов [232]. Возможным маркером прогноза чувствительности клеток гемобластозов к биназе может служить экспрессия онкогенов KIT и AML1-ETO [233]. Для уточнения перспектив использования биназы в онкологии необходимы дальнейшие исследования. 1.3. Современные подходы к созданию и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов Среди основных задач экспериментального изучения ферментов c противоопухолевой активностью можно выделить следующие: ♦ поиск перспективных субстанций ферментов; ♦ разработка методов получения субстанции в препаративных количествах; ♦ оптимизация способов наработки биомассы и очистки фермента; ♦ определение физико-химических, каталитических, структурных свойств и субстратной специфичности; ♦ оценка антипролиферативной активности на опухолевых моделях in vitro и in vivo; ♦ поиск методов оптимизации терапевтических характеристик, в т.ч. путем их прогнозирования на этапе конструирования белка и создания модифицированных ферментов; ♦ оценка безопасности и элементов фармакокинетики; ♦ создание готовой лекарственной формы (ГЛФ) и проведение доклинических исследований. Тактика экспериментального изучения ферментов в основном не отличается от изучения других белковых препаратов, однако имеет ряд особенностей, обусловленных источником выделения, ферментативной активностью по отношению к конкретному субстрату и его структурным аналогам, а также образованием активных продуктов реакций. Это, с одной стороны, облегчает оценку физико-химических свойств, с другой, может требовать специфических моделей культивирования и оценки антипролиферативной активности. Апробированные экспериментальные подходы к разработке различных ферментных препаратов, описаны ниже. 1.3.1. Поиск перспективных субстанций Изначально поиск перспективных субстанций осуществлялся среди ферментов, расщепляющих аминокислоты или рибонуклеиновые кислоты (см. разделы 1.1 и 1.2). Чувствительность 32 опухолевых клеток к дефициту отдельных аминокислот устанавливалась, как правило, эмпирически, в результате ингибирования их пролиферации соответствующими ферментами [64, 77, 92, 164, 199, 315, 364]. Это кардинально отличает ферменты от терапевтических моноклональных антител, обладающих высокоспецифичным механизмом антипролиферативной активности, направленным против заранее известной мишени. Появление методов виртуального скрининга «in silico» (Structure-Based Drug Design, FastTree tool, Clustal Omega, RAxML, TeXshade, Сhimera и др.) не облегчило задачу выбора кандидата с ферментативной активностью, поскольку компьютерное моделирование «идеального» фермента, подходящего к субстрату как «ключ к замку» и обладающего максимальной специфичностью, оказалось невозможным. Известное программное обеспечение позволяет моделировать структуру или активный центр белка, главным образом, на основании структурных прототипов (метод гомологии). Несмотря на явную целесообразность этого подхода к направленной модификации известных белковых соединений, его полезность для математического моделирования структуры оригинального фермента спорна. В настоящее время остается не доказанной и связь антипролиферативных свойств ферментов с количественными физико-химическими (длина аминокислотной цепочки, число заряженных аминокислот и др.) или кинетическими (Km, kcat и др.) характеристиками. Для расщепляющих аминокислоты ферментов нет прямых доказательств зависимости антипролиферативной активности от скорости разрушения конкретной аминокислоты [96, 99, 123]. Необходимо признать, что несмотря на наличие массива данных о физико-химических свойствах ферментов, до настоящего времени мало работ, посвященных корреляции биохимических/кинетических и биологических свойств ферментов, и в основе поиска новых кандидатов лежит эмпирический метод. Повысить результативность выбора кандидата может поиск закономерностей и выявление статистически значимой взаимосвязи антипролиферативных и других биологически значимых свойств с кинетическими параметрами реакции ферментов. Прогностической ценностью обладают не только сведения о кинетических характеристиках, но и моделирование пространственной структуры белка и квантовомехнические методы моделирования механизма ферментативной реакции [138]. 1.3.2. Разработка методов выделения субстанции в препаративном количестве Несмотря на то, что в настоящее время уже описаны методики лабораторного синтеза ряда ферментов (рибонуклеаз, лизоцима, ферредоксина, цитохрома с и др.), сложно ожидать, что их синтетическое получение получит широкое распространение в ближайшем будущем вследствие высокой трудоемкости [148, 234]. Основным современным способом получения ферментов остается их выделение из биологических объектов, как правило, путем создания 33 рекомбинантных штаммов-продуцентов, несущих ген целевого белка, для которых используются различные бактериальные, грибные клетки, клетки млекопитающих (клетки яичника китайского хомячка CHO, клетки почки эмбриона человека HEK293 и др.). Особенность наработки ферментных препаратов заключается в наличии специфической активности, приводящей к разрушению аминокислот или нуклеиновых кислот, что делает крайне сложным использование требовательных к ростовым факторам клеток млекопитающих. Именно по этой причине большинство известных рекомбинантных ферментов производятся c помощью генетически модифицированных клеток E. coli или дрожжей. Используемая в онкологии EcA применяется в высоких дозах, и требует наработки большого количества белка, производство которого в клетках млекопитающих оказывается экономически менее эффективным и менее технологичным. В частности, различные штаммы E. coli были использованы в качестве продуцентов для: ♦ ферментов бактериального происхождения: например, различные L-аспарагиназы (E. coli, Erw. chrysanthemi, H. pylori, Thermus thermofilus, Withania somnifera) [89, 140, 259, 274], аргиназа Bacillus caldovelox [71]; ♦ ферментов земноводных: рибонуклеаза Rana pipiens [252, 344]; ♦ ферментов человека: аргиназа гепатоцитов (штамм KY1436) [167]; митохондриальная аргиназа II типа [97]. В качестве альтернативных бактериальных экспрессионных систем использовалась Bacillus subtilis (для L-аспарагиназы) или Bacillus licheniformis (щелочная фосфатаза и α-амилаза) [177]. К преимуществам прокариотических экспрессионных систем (E. coli или Bacillus) относятся быстрый рост культуры, относительно простой состав среды культивирования, наличие валидированных использованием сильных индукторов промоторов, или возможность изменением состава контролируемой среды, низкая экспрессии с себестоимость крупнотоннажного получения белковых продуктов. Недостатки состоят в отсутствии механизмов контроля и осуществления пост-трансляционных модификаций, а также возможности образования экспрессируемых белков в виде нарестворимых телец включения в процессе ферментации. Наиболее хорошо изученные дрожжевые экспрессионные системы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Штаммы Saccharomyces cerevisiae отличаются относительно медленным ростом на простых средах, хорошо охарактеризованы на генетическом уровне, демонстрируют эффективную ферментацию, однако плохо увеличивают биомассу до высокой плотности в непрерывной культуре и повышают степень гликозилирования секретируемых белков. Для Pichia pastoris характерен высокий уровень экспрессии при использовании промотора из строго регулируемого гена AOX1. 34 Дрожжевые системы экспрессии на основе Saccharomyces cerevisiae описаны в качестве продуцентов L-аспарагиназы [131] и аргиназы I печени человека (rhARG1) [368]. Из редких известных экспрессионных систем для получения ферментов известны Aspergillus (глюкоамилаза), Trichoderma (кислая целлюлаза), Streptomyces (глюкоза/ксилоза изомераза). Биотехнологическое производство современных лекарственных препаратов при использовании бактериальных продуцентов требует постоянной селекции штаммов для устойчиво высокой продуктивности. Аналогично в процессе получения рекомбинантных продуцентов или при возникновении мутаций возможно появление смешанных культур, что определяет необходимость выделения чистой наиболее продуктивной культуры [140, 150]. Многие из известных методов тестирования активности ферментов микроорганизмов являются фотометрическими. Так для определения активности L-аспарагиназы широко используется метод «прямой нессеризации», основанный на фотометрическом выявлении с помощью реактива Несслера аммиака, выделяющегося при гидролизе L-аспарагина. [222, 342, 350]. Меньшее распространение получили реакция Бертолле и способы, основанные на определении аспарагиновой кислоты с помощью электрофореза, хроматографии на бумаге или с помощью аминокислотного анализатора [84, 91, 155, 162, 297, 298], а также образования малеиновой кислоты при участии NAD-зависимой аспартатоксалоацетат трансаминазы [99]. Ряд методов определения активности L-аспарагиназ основан на изменении оптической плотности при превращении L-аспарагина в L-аспарагиновую кислоту [162], а также на реакции гидроксиламинолиза L-аспарагина и L-глутамина в присутствии гидроксиламина [123]. Существуют также способы изучения дезамидазной активности ферментов, основанные на гидролизе аналога аспарагина диазо-4-окси-L-норвалина (DONV). В качестве аналогов аспарагина может также использоваться β-аспартилгидроксамовая кислота [123, 173]. Активность других ферментов, метаболизирующих аминокислоты, также тестируют с помощью фотометрических методов: по образованию транскоричной килоты (для PAL), αкетомасляной кислоты (для MGL), H2O2 (для LO) и др. Практически все традиционные методы позволяют определять активность только в жидкой среде, что затрудняет отбор отдельных клонов. Для выделения чистых культур используют, как правило, метод поверхностных рассевов на пластинчатом агаре в чашках Петри, т.е. на плотной среде. Попытки разработки метода отбора штаммов-продуцентов на плотной среде велись на протяжении последних 30 лет, но даже самый известный из них с использованием плотной синтетической среды и фенолового красного отличался плохой воспроизводимостью и низкой специфичностью [146]. Кроме этого, недостатком такого подхода является использование синтетической среды, состав которой не всегда позволяет поддерживать рост ауксотрофных микроорганизмов, что несет опасность 35 потери активного продуцента. Указанные недостатки определяют актуальность создания метода отбора штаммов-продуцентов на плотной среде. 1.3.3. Оценка физико-химических и кинетических свойств ферментов Для физико-химической характеристики ферментов используются как методики, традиционные для всех белковых препаратов, так и специфичные именно для ферментов. К стандартным методам оценки подлинности всех белковых субстанций относятся, в частности, определение аминокислотной последовательности, аминокислотного состава, N- и С-концевых последовательностей, количества свободных SH-групп и дисульфидных мостиков, посттрансляционных модификаций (сайты гликозилирования), пептидное картирование, определение молекулярной массы и размера белка, коэффициенты экстинкции, профили на электрофорезе, жидкостной хроматографии, спектроскопии и др. [128, 165]. Стандартный инструментарий для подтверждения базовых параметров качества белков, предназначенных для медицинского применения, отражен в рекомендациях ICH и EMA, и включает ВЭЖХ, SDSPAAG электрофорез, масс-спектрометрию, изоэлектрофокусирование, вестерн-блот, капиллярный электрофорез и др. [165]. Физико-химические свойства ферментов определяются параметрами протекания ферментативной реакции и включают оценку стандартных кинетических параметров (Km, kcat, Vmax и др.) в различных условиях. Исследование кинетических характеристик фермента позволяет изучать механизм их энзимологического действия, влияние точечных замен аминокислот в структуре на активность, а также изменения активности фермента при различных условиях реакционной среды. Исследования активного центра позволяют уточнить молекулярные механизмы действия фермента, и включают изучение связывания активным центром субстрата, использование аналогов субстрата, изменение аминокислотных остатков активного центра и др. Ферментативная активность зависит, в основном, от следующих факторов: концентрация фермента и субстрата, рН, присутствия ингибиторов и активаторов, состав инкубационной смеси и температура среды. В случае реакции с одним субстратом задача определения активности сводится к получению серии данных, характеризующих зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата. В случае двух- или трехсубстратной реакции необходимо изменять концентрацию одного из субстратов, чтобы обеспечить присутствие другого в насыщающей концентрации. При оценке кинетических параметров ферментов, разрушающих аминокислоты, необходимо учитывать возможность катализа нескольких реакций, что характерно для MGL и отчасти для L-аспарагиназ. Каждая из реакций может вносить вклад в реализацию антипролиферативного и токсического эффектов. 36 За исключением небольшого числа ферментов, которые могут быть обнаружены непосредственно при спектральном анализе, наличие ферментов определяется по протеканию катализируемых реакций. Выделяют флуоресцентные, манометрические, поляриметрические, электродные, определения разрушающих вискозиметрические, ферментативной аминокислоты, спектрофотометрические активности. наиболее Для методы определения широко количественного активности применяются ферментов, высокочувствительные спектрофотометрические методы, основанные на способности субстратов и продуктов ферментативных реакций поглощать свет в определенных участках спектра [26, 342, 350]. Для определения кинетических параметров особенно важно соблюдать условия инкубации, при которых обеспечивается постоянство всех параметров, кроме исследуемого (в частности, не должна изменяться температура и рН среды), а также обеспечить условия измерения начальной скорости реакции, поскольку скорость ферментативной реакции со временем снижается. Уменьшение скорости ферментативной реакции объясняется снижением степени насыщения фермента субстратом, который расходуется в процессе реакции; увеличением скорости обратной реакции (если реакция обратима); возможным ингибированием фермента образующимися продуктами; изменением условий, например, рН; инактивацией фермента и др. Примерный перечень изучаемых физико-химических свойств ферментов представлен в соответствующих руководствах [12]. Из физико-химических свойств наибольшее практическое значение имеют оптимальные рН и температура протекания реакции, а также стабильность белка при хранении. 1.3.4. Оценка антипролиферативной активности ферментов Цитотоксическая активность, прескрининг (large-scale screening). На сигнальных культурах опухолевых клеток человека проводится первичное определение антипролиферативной активности субстанции водорастворимого фермента с определением 50% ингибирующей концентрации (inhibition concentration, IC50), значимой для экспериментов in vivo [32, 301]. Дополнительными результатами тестирования являются: выбор чувствительной опухолевой модели, ориентир дозового диапазона для опытов in vivo и предполагаемый механизм действия. На культурах клеток с приобретенной лекарственной устойчивостью можно получить информацию об активности новых аналогов известных ферментов [147]. Стандартный метод изучения цитотоксичности включает пассирование клеток в 96-луночные микропланшеты с последующим внесением тестируемого агента и определением в лунках по окончании периода инкубации количества живых клеток с помощью красителя для расчета основного показателя прескрининга — 50% ингибирующей концентрации (ИК50, inhibition concentration IC50). С этой целью обычно применяют МТТ-колориметрический метод и 3-(4, 5- 37 диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2H-тетразолия бромид. К альтернативным методам оценки жизнеспособности клеток относятся использование анионного красителя сульфородамина В, а также XTT (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид) [32, 78]. Использование клеточных культур с известной экспрессией белков, ответственных за синтез определенной аминокислоты (например, ASS1) позволяет верифицировать механизм антипролиферативной активности ферментов, разрушающих аминокислоты. Для большинства культур клеток, не типированных по субстрату для фермента, необходим индивидуальный поиск мишени, прогностически значимой для антипролиферативного эффекта. Результаты тестирования белковых препаратов in vitro, в отличие от низкомолекулярных соединений, более близки к результатам исследований in vivo, поскольку белки, как правило, обладают типичной последовательностью метаболических процессов, которая может быть смоделирована в условиях in vitro. Необходимо, однако, учитывать видовую и тканевую принадлежность клеток, использованных в моделях in vitro. Оценка противоопухолевой активности (screening). Отобранный in vitro активный фермент в тестах in vivo проходит стандартный путь экспериментального изучения основных биологических характеристик, определяющих его перспективность для применения у человека: специфическая противоопухолевая активность, токсичность и элементы фармакокинетики с выявлением или подтверждением возможного механизма действия [32, 93]. Все исследования выполняют на адекватных моделях последовательно с субстанцией и лекарственной формой фермента. Вначале определяются основные критерии противоопухолевого эффекта: ♦ наличие значимой, воспроизводимой и патоморфологически верифицированной противоопухолевой активности на прогностически значимых моделях опухолевого роста; ♦ достаточно широкий диапазон терапевтических доз (терапевтический индекс 2–5) при оптимальном пути введения. Субстанция, соответствующая указанным критериям, поступает на доклиническое изучение ГЛФ, которое начинается с разработки модели ГЛФ для оптимального пути введения. Затем после доказательства эффективности выбранной лекарственной формы в сравнении с субстанцией по реперным точкам биологической активности проводятся эксперименты на трудно курабельных опухолевых моделях: развившихся, метастазирующих опухолях, c лекарственной устойчивостью, ксенографтах опухолей человека у иммунодефицитных мышей. На завершающем этапе оценивается возможность сочетания нового фермента в комбинированной терапии с известными противоопухолевыми препаратами с учетом той локализации, для которой прогнозируется его применение [36]. Результат исследований in vivo — доказательная база противоопухолевой активности стандартизованной субстанции и ГЛФ 38 ферментного препарата при оптимальном пути введения, основным показателем которой служат дозовые характеристики. Для экспериментальной оценки противоопухолевого эффекта могут быть использованы опухолевые модели как животного, так и человеческого происхождения. Опухолевые модели животного происхождения (как правило, мышей и крыс) вплоть до 1990-х годов были обязательным компонентом первичного скрининга новых агентов на наличие противоопухолевой активности in vivo [22, 38, 260]. В настоящее время их применение ограничено числом прогностически значимых моделей (в рекомендациях [32] исключены спонтанные и несингенные опухоли, а также перевиваемые опухоли крыс) и дополнено использованием современных технологий контроля результатов. Например, для более точного контроля динамики роста опухоли и ее метастазов в настоящее время применяются ПЭТ, КТ и другие методы визуализации, для статистической обработки данных используются методы Каплана–Майера, тест Фишера и др. Критерии эффективности новых агентов на моделях опухолей животного происхождения перечислены в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ под ред. Н.И. Миронова [32]. В спектр релевантных входят такие модели перевиваемых опухолей мышей, как лимфолейкозы мышей L1210, P388, метастазирующие в легкие эпидермоидная карцинома легкого Льюис и меланома B16/F10 [347]. Изучение противоопухолевой активности новых агентов на моделях перевиваемых опухолей человека стало возможным после создания в 1960-x гг. генномодифицированных иммунодефицитных мышей, лишенных тимуса (бестимусных) и, соответственно, отвечающей за трансплантационный иммунитет Т-клеточной популяции лимфоцитов, т.е. за отторжение чужеродных трансплантатов. Для оценки противоопухолевого эффекта новых агентов опухолевые клетки человека трансплантируются подкожно, измерения и оценка результатов проводятся по методам, аналогичным для моделей у иммунокомпетентных животных. Характеристики опухолевого роста подкожных гетеротрансплантатов, рекомендуемых к использованию NCI, а также их чувствительность к традиционным противоопухолевым препаратам представлены в работе Alley M.C. et al. [47]. Коллекция перевиваемых опухолей человека, созданная в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, насчитывает собрание более 60 штаммов, выделенных из операционного материала от больных, либо полученных из American Type Cell Collection (ATCC, США) и адаптированных к росту in vivo на мышах Balb/c nude разведения РОНЦ [37]. Использование таких моделей на этапе доклинического изучения ферментных препаратов позволяет сформировать важную часть доказательной базы эффективности, особенно в плане прогностической ценности, для лечения конкретной опухоли в клинике. 39 Ограничением использования этих моделей для первичной оценки противоопухолевого эффекта, связанного с наличием определенной мишени (клеточной или биохимической), является крайне низкая частота встречаемости адекватных мишеней. Опыт экспериментального изучения L-аспарагиназ показал, насколько сложен выбор чувствительной опухолевой модели: из нескольких десятков опухолей мышей и крыс к терапии оказался EcA высокочувствительным только лимфаденоз Фишера [38]. Другим аспектом, определяющим специфику изучения противоопухолевого эффекта ферментов, является необходимость участия в реакциях коферментов, в частности, для MGL требуется наличие пиридоксальфосфата (ПЛФ). Естественный уровень ПЛФ в плазме крови мышей недостаточен для поддержания реакции в течение периода циркуляции фермента, поэтому для выявления противоопухолевого эффекта MGL необходимо дополнительное введение ПЛФ [318, 360]. Так, базовый уровень ПЛФ в плазме крови мышей составляет 0,3 мкМ, для демонстрации эффекта MGL необходимо увеличить его концентрацию до стабильного уровня 5–10 мкМ в течение 2–5 ч после введения MGL [360]. Так, в ряде работ в качестве возможного источника кофермента были использованы подкожно имплантируемые помпы с известным высвобождением ПЛФ из резервуара [360] или использование рациона с повышенным содержанием пиридоксина [134]. В отсутствие дополнительного введения ПЛФ концентрация метионина снижается до <5% исходной непосредственно после введения МGL в средних дозах, а инактивация MGL в результате диссоциации ПЛФ у мышей происходит через 2 ч после введения [195, 361]. Однако методики, демонстрирующие эффективность MGL в эксперименте (например, подкожные помпы) не удобны в клинической практике, и остается актуальной разработка моделей и схем применения коферментов, которая может быть перенесена в клиническую практику без опасности снижения эффективности терапии. Таким образом, особенности изучения антипролиферативного эффекта ферментов, разрушающих аминокислоты, определяются, с одной стороны, малым числом чувствительных опухолей, эссенциально зависимых от дефицита конкретной аминокислоты, а с другой, необходимостью поддержания в среде культивирования или в плазме крови мышей достаточной концентрации кофермента. Следовательно, к актуальным задачам усовершенствования методов оценки антипролиферативного эффекта ферментов следует отнести увеличение числа чувствительных к новым ферментам моделей, а также разработку простых и воспроизводимых методов использования коферментов в экспериментах in vivo. 1.3.5. Поиск способов оптимизации терапевтических характеристик Современные подходы к улучшению терапевтического потенциала базируются на традиционных представлениях о механизмах антипролиферативного и токсического действия. 40 В этой связи значимыми характеристиками ферментов являются сродство к основному субстрату, расчетная продолжительность циркуляции в плазме крови, а также иммуногенность. Именно эти свойства определяют благоприятное соотношение риска и пользы лекарственного средства. Практически все известные способы модификации фермента нацелены на улучшение фармакокинетического профиля и снижение токсичности, в т.ч. иммунного ответа. Под этим углом зрения возможно условное деление подробно описанных в разделе 1.1 методов модификации ферментов на следующие группы: ♦ модификация молекулы белка различными высокомолекулярными соединениями без изменения его первичной структуры для оптимизации фармакокинетических характеристик и снижения иммуногенности (показано для EcA, ErA, ADI, MGL и рибонуклеаз) [156, 280, 284, 322]; ♦ проведение точечных замен с целью изменения физико-химических свойств или антигенных детерминант (для ряда L-аспарагиназ) [109, 235]; ♦ создание химерных белков, конъюгированных с Fab-фрагментами антител или биологически активными пептидами; ♦ инкапсулирование в эритроциты (EcA) [44]. Помимо перечисленных модификаций появились отдельные работы по созданию химерных белков (как правило, рибонуклеаз) [101]. Введение в первичную структуру белка дополнительных доменов дает добавленный эффект, например, обеспечивает рецепторный путь внутриклеточной доставки фермента и позволяет повышать цитотоксичность. Так, конъюгат рибонуклеазы Rana catesbeiana (RC-RNase) с короткой цепью HAb25 (hHscFv) способен избирательно связываться с клетками гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 [101]. Конъюгат ранпирназы 2L-Rap-hLL1-γ4P, состоящий из двух молекул рибонуклеазы, связанных с Nконцом легкой цепи hLL1, антитела к CD74, оказался достоверно более активным in vitro в отношении CD74+ клеточных линий (Daudi, Raji, and MC/CAR) и in vivo на ксенографтах лимфомы Беркитта Daudi и Raji по сравнению с hLL1 и ранпирназной [94]. Преимущества химерных белков в виде конъюгатов антител с рибонуклеазами сформулированы в обзорной работе Andrady C. et al [52]. Помимо антител или их фрагментов для конъюгирования с ферментами могут быть использованы также и другие белки, пептиды или высокомолекулярные соединения. Так, показано, что конъюгат человеческой панкреатической рибонуклеазы РНКазы1 c фактором роста фибробластов FGF обладает как рибонуклеазной, так и антиангиогенной активностью. Кроме того, химерный домен h-bFGF препятствует связыванию ингибитора рибонуклеазы с активным центром путем стерической блокады места связывания [357]. Примером эффективной конъюгации может быть химерная рибонуклеза, которая на фоне угнетения неоангиогенеза 41 ингибировала рост ксенографтов плоскоклеточного рака легкого человека А431 у иммунодефицитных мышей. Таким образом, перспективными путями улучшения терапевтических характеристик ферментов, в частности, расщепляющих аминокислоты, можно считать оптимизацию физикохимических свойств для приближения к физиологическим условиям оптимума pH и/или температуры и создание химерных белков. Технологически для этого может быть использован сайт-направленный мутагенез, позволяющий выявить соответствующие особенности зависимостей структуры и функций фермента. 1.3.6. Оценка элементов фармакокинетики Для ферментных препаратов нет особых рекомендаций для изучения фармакокинетических параметров. На этапе доклинических исследований допускается анализ ограниченного числа параметров: пиковая концентрация в плазме крови, площадь под фармакокинетической кривой (AUC) и Т1/2 [32]. Более полный анализ накопления, распределения и выведения лекарственного средства с выявлением возможных метаболитов проводят на этапе клинического изучения. Для белковых субстанций важным является определение биологической активности в кровотоке, поскольку даже частичная денатурация может приводить к ее потере. Возможно определение следующих параметров: ♦ ферментативная активность в плазме крови через определенные промежутки времени; ♦ Т1/2 радиоактивной метки; ♦ концентрация циркулирующего белка хроматографическим или иммуноферментным методом (с отбором образцов плазмы крови через определенные промежутки времени). Все вышеперечисленные подходы обладают рядом очевидных недостатков, которые не позволяют точно прогнозировать фармакокинетические параметры фермента в плазме крови человека. В частности, при определении концентрации белка сохраняется вероятность снижения сродства к субстрату с сохранением первичной структуры. Использование меченого белка для оценки скорости выведения метки приводит к завышенным значениям результата, так как метка может сохраняться в организме и после разрушения белка. При оценке ферментативной активности в плазме крови возможно искажение результатов из-за наличия в плазме дополнительных белков и химически активных молекул. Существующие отечественные и международные рекомендации не содержат универсальных методов оценки фармакокинетики для противоопухолевых ферментов. Кроме того, существующие методы определения элементов фармакокинетики ферментных препаратов у животных не вполне адекватны, так как не имеют значимой корреляции с фармакокинетическими параметрами у человека. 42 Таким образом, сравнительный анализ результативности известных методов для разработки новых простых и воспроизводимых методов определения основных фармакокинетических параметров ферментов медицинского назначения остается актуальным. 1.4. Актуальность разработки новых подходов к поиску и экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов Анализ биохимических свойств и основных фармакологических эффектов позволяет выделить ряд существенных преимуществ описанных выше противоопухолевых ферментов по сравнению с классическими цитостатиками. Очевидно, что ферменты с антипролиферативной активностью: ♦ обладают оригинальным механизмом действия и относительно высокой специфичностью по отношению к конкретному молекулярному субстрату; ♦ могут иметь достоверные биологические маркеры, позволяющие прогнозировать их клиническую эффективность (например, отсутствие ASS1 или аспарагин-синтетазы в опухолевых клетках); ♦ не имеют традиционных для классических цитостатиков лимитирующих побочных эффектов (например, выраженной миелосупрессии), что позволяет включать их в многокомпонентные схемы высокодозной комбинированной химиотерапии. Анализ современного состояния проблемы позволяет объединить известные ферменты с доказанной эффективностью in vivo или в клинических исследованиях в две группы, различающиеся по особенностям механизма антипролиферативного действия (табл. 1). Таблица 1. Группы противоопухолевых ферментов Группа Представители Ферменты, участвующие в метаболизме аминокислот L-аспарагиназа L-метионин–γ-лиаза L-лизин–α-оксидаза L-аргиназа L-аргинин дезиминаза L-фенилаланин:аммиак-лиаза L-тирозин–фенол-лиаза Ферменты, разрушающие нуклеиновые кислоты Ранпирназа Амфиназа Барназа 43 Ферменты первой группы вызывают регрессию опухоли, препятствуя поступлению в опухолевую клетку незаменимых аминокислот извне, что отличает их от большинства других современных противоопухолевых препаратов, которым для реализации эффектов необходим либо непосредственный контакт с мембранными белками, либо проникновение внутрь клетки. Однако некоторые рибонуклеазы, напротив, оказывают непосредственное действие на внутриклеточные процессы, аналогично «классическим» цитостатикам — антиметаболитам, алкилирующим агентам, ингибиторам топоизомераз и др. Следует учитывать, что конечные продукты ферментативной реакции, как правило, также вовлекаются в биохимические реакции в организме. Это может свидетельствовать о том, что механизм действия ферментных препаратов, изменяющих метаболизм аминокислот, может быть связан не только с уменьшением поступления в опухолевую клетку определенной аминокислоты. Наиболее ярким примером является LO и пероксид водорода, оказывающий выраженный прямой цитотоксический эффект. Кроме того, имеющиеся данные о способности относительно хорошо изученных ферментов –– L-аспарагиназ — взаимодействовать с различными белками, экспрессирующимися на поверхности опухолевых клеток [53, 133, 216], позволяют считать, что молекулярные механизмы реализации противоопухолевых эффектов могут быть множественными, и даже не связанными с реакцией расщепления субстрата, что требует отдельного изучения. Следует также отметить ряд других существенных отличий, требующих дифференцировать ферменты от других групп противоопухолевых препаратов и уточнять рекомендации по их экспериментальному изучению. Во-первых, экзогенные ферменты являются чужеродными для человека белками и проявляют выраженные антигенные свойства, что предопределяет гуморальный ответ, обусловливает аллергенность, возможность развития анафилактических реакций и быструю наработку резистентности. Во-вторых, ферментные противоопухолевые препараты, как показала клиническая практика, имеют достаточно узкий спектр чувствительных опухолевых локализаций. Первый недостаток можно снизить, например, путем пегилирования или последовательного применения ферментов с разными антигенными свойствами. Что касается второго, то попытаться решить проблему поиска чувствительной локализации в эпоху «таргетных» препаратов для ферментов с собственной цитотоксичностью можно уже при доклиническом изучении. Для этого целесообразно проводить направленные молекулярно-биологические исследования с выявлением как рецепторных, так и внутриклеточных маркеров. В основу изучения биохимических свойств и молекулярных механизмов реализации иммунобиологического и других фармакологических эффектов противоопухолевых ферментов 44 в настоящее время положены требования, сформулированные Т.Т. Березовым в ряде обзорных работ [3, 4]. Особое место на этапе доклинического изучения должно занимать выявление специфики противоопухолевого и токсического эффектов с привлечением данных фармакокинетики. Так, для некоторых новых ферментов, например, LO, чрезвычайно важна разработка схемы в/в введения, т.к. лизиновое голодание при длительном поступлении фермента в кровоток может привести к серьезному нарушению синтеза белка и диспротениемии. Для ранпирназы или ADI целесообразен поиск комбинаций, ориентированных на лечение конкретных типов опухолей в клинической практике, с оптимальными терапевтическими лекарственное характеристиками взаимодействие). (противоопухолевый Определяющим эффект, перспективность токсичность для и клинического применения новых препаратов рибонуклеаз является поиск путей повышения избирательности действия на опухолевые клетки, например, путем создания конъюгатов с антителами против конкретных специфичных мембранных белков. При этом для действующего вещества основным критерием результативности конъюгирования является незначительная потеря ферментативной, а для антител — иммунологической активности. Для всех без исключения новых ферментных препаратов актуальны экспериментальные разработки, направленные на адекватный подбор прогностически значимых для клинического изучения опухолевых моделей, а также на повышение специфичности действия и снижение иммуногенности лекарственной формы. Трудоемкость и относительно низкий выход белка при получении противоопухолевых ферментов из природного источника решается путем использования традиционных и современных трансгенных технологий, в частности, создания рекомбинантных бактериальных штаммов-продуцентов. Однако, несмотря на большое количество как отечественных, так и зарубежных публикаций, рассматривающих отдельные этапы создания или изучения ферментов с противоопухолевой активностью, проблемы повышения эффективности ферментов из известных групп и внедрения новых ферментов остаются нерешенными. Отсутствуют или практически не используются методы прогнозирования противоопухолевого эффекта на основании данных аналитического изучения ферментов; отсутствуют или остаются трудоемкими технологии отбора наиболее активных продуцентов, доклинического изучения противоопухолевого эффекта (например, ферментов, требующих наличия кофермента или особого режима использования), изучения эффективности схем комбинированной терапии на доклиническом этапе. Все вышеупомянутое определяет актуальность настоящей диссертационной работы. 45 Глава 2. Материалы и методы 2.1. Изученные ферменты и их источники L-аспарагиназы 1) L-аспарагиназа Eshcherichia coli II типа (EсА), рекомбинантная, официнальный препарат, Medak (Германия), лиофилизат, 10 000 МЕ во флаконе) 2) L-аспарагиназа Erwinia carotovora II типа (EwA), рекомбинантная, получена и выделена в ИБМХ им. В.Н. Ореховича» 3) L-аспарагиназа Yersinia pseudotuberculosis II типа (YpA), рекомбинантная, получена и выделена в рамках настоящей работы 4) L-аспарагиназа Rhodospirillum rubrum I типа (RrA), рекомбинантная, получена и выделена в рамках настоящей работы 5) L-аспарагиназа Wolinella succinogenes II типа (WsA), рекомбинантная, получена и выделена в ФГУП «ГосНИИгенетика» 6) L-аспарагиназа Wolinella succinogenes II типа, c заменами V23Q и K24T в сайте протеолиза трипсином, конъюгированная с гепарин-связывающим пептидом KRKKKGKGLGKKR (WsAHep), рекомбинантная, получена и выделена в ФГУП «ГосНИИгенетика» 7) 10 мутантных форм RrA с точечными аминокислотными заменами: рекомбинантные, получены и выделены в рамках настоящей работы L-метионин–γ-лиазы 8) L-метионин–γ-лиаза Clostridium sporogenes, рекомбинантная, получена и выделена в ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» 9) L-метионин–γ-лиаза Clostridium tetani, рекомбинантная, получена и выделена в ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» 10) L-метионин–γ-лиаза Citrobacter freundii, рекомбинантная, получена и выделена в ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» L-фенилаланин:аммиак-лиаза 11) L-фенилаланин:аммиак-лиаза Rhodosporidium toruloides, рекомбинантная, получена и выделена в НИИ биотехнологии Кемеровского технологического института пищевой промышленности L-лизин–α-оксидаза 12) L-лизин–α-оксидаза Trichoderma cf. aureoviride Rifai ВКМF-4268D, нативная, выделена на кафедре биохимии медицинского факультета Российского университета дружбы народов Рибонуклеазы 13) РНКаза А из поджелудочной железы крупного рогатого скота, реактив Sigma-Aldrich 46 14) Рибонуклеаза Bacillus intermedius (биназа), рекомбинантная, получена и выделена на Кафедре микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета 15) ИммуноРНКаза: рибонуклеаза Bacillus amyloliquefaciens (барназа), конъюгированная с антиген-связывающими одноцепочечными вариабельными фрагментами антител к Her2/neu (4D5 scFv), получена и выделена в ФГБУН «ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова». Физико-химические свойства отдельных ферментов изучали, используя растворы субстанций (см. ниже). Для исследования антипролиферативной активности указанных ферментов использовали лиофилизированные субстанции, подлинность которых была подтверждена паспортами с описанием необходимых физико-химических свойств. 2.2. Реактивы L-аспарагин («Reanal», Венгрия); глицин, акриламид, N'N'-метиленбисакриламид, SDS, бромфеноловый синий, гликоген, β-меркаптоэтанол, персульфат аммония, Tween-20, Triton Х100, TRIS, TEMED, EDTA, декстроза, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, KCl («Serva», Германия); Lглутамин, реактив Несслера, ТХУ, бакто-триптон, бакто-дрожжевой экстракт, пиридоксина гидрохлорид, L-метионин («Fluka», Швейцария); бакто-агар («Ferak», Германия); NaOH, Na2B4O7×10Н2O («Merck», Германия); TRIS, набор белков с известной молекулярной массой (алкокольдегидрогеназа 150 кДа, бычий сывороточный альбумин 67 кДа, α-химотрипсин 25 кДа, цитохром С 13 кДа) («BIO-Rad», США); этанол, HCl, CH3COOH, CaCO3, CH3COONa («Реахим», Россия); агароза, о-дианизидин, L-лизин, L-орнитин, L-аргинин, Coomassie Brilliant Blue, этидиум бромид, BSA, IPTG, глицерин, NaCl, NH4Cl, СuSO4×5Н2О, K3Fe(CN)6, MgSO4×7Н2О, CaCl2 («Sigma-Aldrich», CША); глюкоза («Panreac», Испания), вода для LC-MS, ацетонинтрил («Biosolve B.V», Нидерланды). При клонировании генов RrA и YpA использованы векторы рET23a («New England Biolabs») и pBad24 («Invitrogen»), TaqSE-ДНКполимераза («CибЭнзим», Россия). 2.3. Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов При работе с ДНК применяли стандартные методы молекулярной биологии [218]. Клонирование. Ген RrA был выделен из штамма Rhodospirillum rubrum (коллекция кафедры микробиологии МГУ GCCCCTTCCCTTGCCACAGG, им. М.В. Ломоносова). Использованы праймеры GGACACCCAAGCTTCCCTTTTСCG, CACAGGATCCTCAAGGCAAATGGCCG, рестриктазы («Fermentas» и «SibEnzyme»). Использованные штаммы-реципиенты. Векторы, содержащие гены, кодирующие YpA или RrA, были использован для трансформации следующих штаммов E. coli: 1) BL21 (DE3) [F- omp T hsdSB (rB-mB-)gal dcm (DE3)] (Центр «Биоинженерия» РАН); 47 2) BL21 (DE3) plysS [F- ompT hsdSB (rB-mB-)gal dcm (DE3)pLysS(CmR0] (Центр «Биоинженерия» РАН); 3) TOP10 [(F' mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Ф80lacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara- leu)7697, galU, galK, rpsL(StrR), endA1, nupG] (ФГУП «ГосНИИгенетика»); 4) JM83 [F- f80dlacZΔM15 Δ(lac-proAB) ara rpsL] recA+, rK+, mK+ (ФГУП «ГосНИИгенетика»). Для создания мутантных форм RrA использовали метод сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Single-Primer Reactions in Parallel) [120], предотвращающий праймер-праймер гибридизацию, вероятную при использовании ПЦР с двойным праймером. Использовали TaqSE-ДНК-полимеразу и набор олигонуклеотидов, синтезированных OOO «ДНК-Синтез». Олигонуклеотиды были подобраны при помощи программ NCBI/Primer-BLAST (Primer3), OligoAnalyzer 3.1, jPCR Tool & FastPCR. Олигонуклеотиды, использованные для мутагенеза, представлены в табл. 2. Таблица 2. Олигонуклеотиды, использованные для мутагенеза Номер Олигонуклеотиды Сайт мутации 1 CGGGTGGGGTTAAGCGCCGCGG; Sfr3031 CCGCGGCGCTTAACCCCACCCG 2 GCTATGCACGGCAGGCCTTTCGACCCG; Pce1 CGGGTCGAAAGGCCTGCCGTGCATAGC 3 CCGAGGTCGACCGCAAAGCG; SalI CGCTTTGCGGTCGACCTCGG 4 GGATAGCCTGAAGTTAACCGAGG; HpaI CCTCGGTTAACTTCAGGCTATCC 5 CCCACCCCACTCACACCAAGGTTGAAACC; Bsp191, удален GGTTTCAACCTTGGTGTGAGTGGGGTGGG 6 CCGGCCACGTGAGGGGAAGCG; PspCI CGCTTCCCCTCACGTGGCCGG 7 CGGCGGGACCAGCACTAAACACTATCGC; Bsa291, удален GCGATAGTGTTTAGTGCTGGTCCCGCCG 8 GGTCGTCGGCCAGCTGTTCGTCGCC; PvuII GGCGACGAACAGCTGGCCGACGACC 9 GTTCGAGCCCACCTAGGACCAGGAGTAG; AspA21 CTACTCCTGGTCCTAGGTGGGCTCGAAC Примечание. Подчеркнуты нуклеотидные последовательности, узнаваемые эндонуклеазами рестрикции. Процедуры молекулярного клонирования в плазмидных векторах выполняли по стандартным методикам [287]. ПЦР проводили согласно протоколу фирмы-производителя «CибЭнзим» для TaqSE-ДНК-полимеразы при снижении температуры отжига до 54–50 °С. Первичный отбор мутантов осуществляли по появлению нового сайта рестрикции или удаления существующего в целевом гене. Изменения рестрикционой карты выявляли методом электрофореза в 1% 48 агарозном геле. Мутации подтверждали секвенированием по методу Сэнгера [290]. 2.4. Наработка биомассы и очистка L-аспарагиназ Культивирование продуцентов. Наработку биомассы трансформированных штаммов E. coli проводили в колбах Эрленмейера объемом 1000 мл, содержащих 200 мл среды LB c ампициллином (100 мкг/мл) при 28 или 37 °С на качалке «GFL 3033» (Германия) при скорости перемешивания 200 об/мин. Плотность культуры определяли на спектрофотометре «Aquarius 7000» при длине волны 600 нм и выражали в оптических единицах (ОЕ600). Для индукции экспрессии в середине логарифмической фазы роста (оптическая плотность 1,5–1,6) вносили индукторы (арабинозу до конечной концентрации 0,2–0,5%; лактозу до 0,2% и IPTG до 0,001М). После индукции инкубацию продолжали в течение 17–20 ч. Основными критериями оптимизации являлись выход биомассы и продуктивность клеток после разрушения (озвучивание 1 мин; дезинтегратор УЗДН-2Т) или без него. Продуктивность культуры оценивали как отношение общей активности к оптической плотности при длине волны 600 нм (МЕ/ОЕ). Выделение и очистка ферментов. После окончания инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 2500 g). Биомассу ресуспендировали в буфере А (10 мМ NaH2PO4, 1 мМ глицина, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5–7,8) и подвергали ультразвуковой обработке (дезинтегратор УЗДН-2Т, Россия) в течение 10 мин (1 мин озвучивания, 1 мин перерыв). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием озвученной суспензии (60 мин, 35000 g). Экстракт наносили на колонку с Q-Sepharose (2,0×30,0 см), уравновешенную буфером А. Белок элюировали линейным градиентом 0–1,0 М NaCl. Фракции оценивали по содержанию белка путем спектроскопии при 280 нм и наличию ферментативной активности. Активные фракции собирали и проводили хроматографию на колонке с DEAE-Toyopearl 650 m (2,5×37 см) аналогично вышеописанной методике. Для разных мутантных форм RrA использовали буферные растворы с различным значением рН. На заключительном этапе выделения раствор фермента обессоливали и концентрировали в ячейке «Amicon», содержащей фильтр Millipore (NMWL 10 000 для RrA и 30 000 для YpA). Все стадии очистки проводили при +4 °С. 2.5. Определение ферментативной активности Определение активности L-аспарагиназ. Активность ферментов определяли методом прямой несслеризации [342, 350]. За единицу активности L-аспарагиназы принимали количество фермента, которое катализирует высвобождение 1 мкмоль аммиака за 1 мин при 37 °С. Глутаминазную активность оценивали аналогичным образом, используя в качестве субстрата Lглутамин. 49 Определение активности L-фенилаланин:аммиак-лиазы. Активность PAL измеряли фотометрически по методике фирмы «Sigma». Образование транс-коричной кислоты определяли при 270 нм с использованием спектрофотометра UV-2401 PC («Shimadzu», Япония). Для оценки активности добавляли 40 мкл белка со специфической активностью 0,025–0,125 МЕ/мл в 0,5 мл 0,2 M Tris-HCl буфера, pH 8,5 содержащего 0,04 мл (0,05 M) L-фенилаланина и 0,42 мл деионизированной воды MilliQ («Millipore», Франция). Образование транскоричной кислоты определяли по оптическому поглощению при 270 нм и 25 °C по формуле: активность, МЕ/мл = [(ΔOD270/мин, PAL – ΔOD270/мин, контрольный образец) × Vmixture × f] / 19,73 × Vsample, где Vmixture — объем смеси, мл; f — коэффициент разведения PAL; 19,73 — миллимолярный коэффициент поглощения транскоричной кислоты при 270 нм; Vsample — объем образца, мл. За 1 МЕ принимали количество PAL, катализирующее превращение 1 мкмоль L-фенилалаланина за 1 мин при 30 °C и pH 8,5. Оценка активности L-метионин–γ-лиаз. Активность препаратов в реакции γ-элиминирования определяли по скорости образования α-кетомасляной кислоты в сопряженной реакции с D-2гидроксиизокапроатдегидрогеназой в условиях, описанных в работе [26]. За единицу ферментативной активности принимали количество MGL, катализирующее образование 1,0 мкМ/мин α-кетобутирата при 30 °С. Оценка активности L-лизин-α-оксидазы. Активность измеряли спектрометрически по образованию H2O2 при 25 °C. Стандартная реакционная смесь содержала 0,05 M натрийфосфатного буфера, pH 7,4, 1,0 мM L-лизина, 2,5×10-7 пероксидазы, 0,2 мM o-дианизидина и 104 ×10-3 МЕ/мл LO. При указанных условиях реакции коэффициент молярной экстинкции o- дианизидина составил 1,1×10-3 M-1см-1. За 1 МЕ принимали количество фермента, расщепляющего 1 мкМ L-лизина в минуту при оптимальных условиях реакции. Контрольные образцы содержали те же компоненты, за исключением L-лизина. 2.6. Определение физико-химических свойств Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [219]. Изоэлектрическая точка. Определение проводили путем изоэлектрофокусирования на колонке фирмы «LKB» (Швеция) при pH 4,0–10,0 [29]. Для расчета значений pI для мутантных форм RrA использовали программу ProtParam, ‘‘http://www.expasy.org’’. Молекулярную массу белков определяли с помощью электрофореза и масс-спектрометрии. Электрофорез проводили по методу Леммли. Для калибровки использовали набор маркерных белков с изветными молекулярными массами («Pharmacia», Amersham #17-0446-01). 50 Масс-спектрометрический анализ осуществляли на времяпролетном масс-спектрометре Bruker Ultraflex II («Bruker Daltonics», Германия) в режиме положительных ионов с использованием десорбции Nd:YAG лазером (длина волны 355 нм), при ускоряющем напряжении 25 кВ. Регистрацию спектров проводили в режиме рефлектона, для спектров пептидного картирования (идентификации белков) и в линейном режиме для определения молекулярных масс целого белка. Полученные масс-спектры были обработаны с использованием программы Bruker Flex Analisys 2.4. Оценка зависимости активности от pH, температуры и ионной силы. Зависимость активности от pH изучали при 37 ºС в стандартных буферных растворах: натрий-ацетатном (pH 3,0–6,0), натрий-фосфатном (pH 6,0–8,0), ТRIS-HCl (pH 7,0–9,0), боратном (pH 9,0–11,0) [13]. Зависимость активности RrA от ионной силы исследовали, изменяя концентрацию КСl от 100 до 3000 мМ в натрий-фосфатном буферном растворе. Влияние температуры на активность изучали в диапазоне 30–80 ºС при рН 7,2. Температурный оптимум мутантных форм RrA определяли в 0,1 М натрий-фосфатном буфере при pH 7,4. Оценка стабильности. Для изучения стабильности препараты инкубировали в фосфатном буфере в течение 3 мин при различных температурах до 80 °С, а также в течение 1 ч с различными концентрациями мочевины (0,0–8,0 М), после чего оценивали ферментативную активность стандартным способом. За 100% принимали активность фермента, определяющуюся при 37 °С или в отсутствие мочевины. Оценка кинетических характеристик L-аспарагиназ. Определение Km проводили по скорости образования аммиака при ферментативном гидролизе L-аспарагина и L-глутамина. Lаспарагиназную активность определяли в термостатируемой при 37 °C ячейке, рН 8,0. Аликвоту 1 мл раствора субстрата L-аспарагина (0,01–0,04 М) смешивали с 0,2 мл 12,5 мМ боратного буфера, затем вносили 0,1 мл раствора L-аспарагиназ в различных концентрациях. Измерение аммиака проводили с использованием реактива Несслера. Реакцию останавливали, добавляя 0,6 мл 10% раствора ТХУ. Величину поглощения определяли при длине волны 480 нм. Графическую обработку полученных данных и расчет Km и Vmax проводили при помощи программы Microsoft Excel по методу двойных обратных величин Лайнуивера–Берка. 2.7. Исследования зависимости «структура-функция» Определение олигомерных структур мутантных форм RrA. Для определения четвертичной структуры ферментов использовали метод гель-фильтрации (SEC). Исследования проводили на колонке Bio-Gel P150 1×100 см в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,25 с 0,02% NaN3, элюция при 4,5 мл/ч. Собирали фракции по 0,45 мл. Колонку калибровали с использованием белков с известной молекулярной массой: бычий сывороточный альбумин (БСА) — мономер 51 (66,5 кДа) и димер (133 кДа), яичный альбумин (44,5 кДа), миоглобин миокарда лошади (17 кДа). Свободный объем колонки (V0) был определен как объем элюции голубого декстрана, общий объем колонки (Vt) как объем элюции п-нитрофенола. Белок определяли по поглощению при 280 нм, L-аспарагиназную активность определяли, как указано выше. Kav, коэффициент распределения, характеризующий подвижность белка, рассчитывали по формуле: Kav= Ve – V0/Vt – V0, где Ve — объем элюата, V0 — свободный объем колонки (20,4 мл), Vt — общий объем колонки (73 мл). Ve калибрующих белков определяли по соответствующим пикам А280 на кривых элюции, Ve мутантных форм RrA определяли как пики при элюции активных фракций. Калибровочную кривую строили как зависимость Kav от logM, где М — молекулярная масса калибруемого белка. Молекулярное моделирование. Для построения пространственных моделей L-аспарагиназ были использованы первичные аминокислотные последовательности ближайших гомологов с известной пространственной структурой в банке данных RCSB Protein Data Bank (PDB). Выравнивание последовательностей проводили по методу DNASIS (Hitachi Software Engineering Co.) и ClustalW (Kyoto University Bioinformatics Center). Трехмерную структуру мономера RrA строили с использованием SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) [57]. Анализ структуры проводили с использованием SYBYL8.1.program (Tripos Inc, USA). Прогнозирование антигенных эпитопов. Выравнивание аминокислотных последовательностей EcA, WsA, EwA, YpА и RrA проводили при помощи PROMALS3D [265]. Для построения трехмерных структур L-аспарагиназ использовали I-TASSER [371]. Известные антигенные эпитопы ErA [235] сопоставляли с новыми L-аспарагиназами методом выравнивания sequenceto-profile, Clustal Omega [302]. Для прогнозирования эпитопов использовали ПО Discotope [200], Ellipro [272], EPSVR [214]. Для визуализации пространственных структур использовали UCSF Chimera [269]. Доступность для растворителя (solvent accessibility) тетрамера L-аспарагиназ раcсчитывали с помощью DSSP [182]. 2.8. Оценка цитотоксичности Культуры клеток. Активность ферментов тестировали на линии клеток лимфаденоза Фишера мышей L5178Y, меланомы мышей B16F10, хронического миелолейкоза человека К-562, рака яичников человека SKOV-3, гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2, лимфомы Беркитта человека LBR2, меланомы человека MeWo, рака толстой кишки человека LS 174T и HT-29 (коллекция опухолевых штаммов РОНЦ), клеток рака предстательной железы человека линии DU 145 PSA–, PC-3 PSA– и LNCaP PSA+, рака молочной железы человека MDA-MB-231, SKBR3 и MCF7, НМРЛ человека А549 (ATCC, США). Клетки культивировали при 37°С и 5% СО2 в среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки 52 (HyClone Laboratories, Logan, UK), 2 мM L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина (ПанЭко, Россия). Достигшие логарифмической фазы роста клетки пассировали в плоскодонные 96луночные микропланшеты («Costar») по 5–6×104 клеток на лунку и преинкубировали в течение 24 ч перед добавлением тестируемых ферментов в указанных выше условиях. Световую микроскопию клеток проводили с помощью системы AxioVision 4 (Zeiss, Германия). Жизнеспособность клеток определяли по исключению красителя трипанового синего (ПанЭко, Россия). Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Оценка цитотоксичности in vitro. Препараты ферментов в растворе Хенкса (ПанЭко, Россия) в широком диапазоне прогрессивно уменьшающихся концентраций добавляли в лунки с клеточной культурой. Препараты L-аспарагиназ в растворе Хенкса («ПанЭко») использовали в концентрациях 0,000062–50 МЕ/мл, PAL — 0,0001–10 МЕ/мл. Диапазон концентраций MGL в среде культивирования соответствовал 0,000001–6,2 МЕ/мл, в дополнение к MGL среда содержала 5×10–4 М ПЛФ. Препараты L-аспарагиназ, PAL или рибонуклеаз коинкубировали в течение 72 ч. LO добавляли в диапазоне концентраций от 10-1 до 10-12 Е/мл (10-3–10-14 мг/мл), коинкубировали в течение 48 ч. В качестве контроля использовали клеточную культуру, которую инкубировали в питательной среде, содержащей раствор Хенкса в количестве, эквивалентном добавленному в опытные пробы. При оценке цитотоксической активности MGL контрольные пробы, помимо раствора Хенкса, содержали 5×10–4 М ПЛФ. Уровень клеточного метаболизма по окончании периода инкубации определяли с помощью стандартного МТТ-колориметрического метода [238] Оптическое поглощение окрашенных растворов диметилсульфоксида измеряли на планшетном фотометре Multiskan MS (Labsystem, Финляндия) при λ=540 нм. Влияние тестируемых растворов ферментов на жизнеспособность клеточных культур оценивали по формуле: (Nо/Nк)×100%, где No — оптическое поглощение в опытных пробах, Nк — оптическое поглощение в контроле. Для каждого фермента методом нелинейной регрессии рассчитывали ингибирующую концентрацию в среде, которая вызывала снижение количества живых клеток на 50% (IC50), а также определяли минимальную эффективную концентрацию (Сmin), вызывающую достоверное по отношению к контролю ингибирование пролиферации. Получение мезенхимальных стромальных клеток (МСК). Клетки получали из костного мозга мышей линии C57BL/6J, согласно модифицированной методике [356]. Мононуклеарные клетки изолировали на градиенте плотности фиколла-урографина (ПанЭко, Россия) после центрифугирования 30 мин 1500 об/мин и дважды отмывали в растворе Хенкса («ПанЭко», Россия). Затем клетки ресуспендировали в полной питательной среде RPMI 1640 («ПанЭко», Россия), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки, 25 мМ Hepes («ПанЭко», Россия), 250 мг/л L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина, 1 мкМ дексаметазона («Sigma» 53 США), и пассировали во флаконы объемом 25 мл по 6,8×105 клеток. Культивирование проводили в СО2-инкубаторе со следующими параметрами: 37 ºС, 5 % СО2, 80% влажности. Через 24–48 ч неадгезировавшуюся клеточную фракцию удаляли. При достижении 80–90% конфлюентности клетки снимали с пластика раствором трипсина-версена в соотношении 1:1 («ПанЭко», РФ) и пассировали во флаконы в концентрации 2,5×103 кл/мл. Подсчет концентрации живых клеток проводили в камере Горяева. Для дальнейших исследований использовали мезенхимальные клетки третьего пассажа. Оценка влияния MGL на экспрессию МСК CD95 и СD11с. Мезенхимальные стромальные клетки мышей (3×105 клеток в 1 мл) коинкубировали с исследуемыми ферментами (2,88 МЕ/мл) в течение 3 суток в СО2-инкубаторе при 37º С, 5% СО2, 70–80% влажности. Затем клетки коинкубировали с меченными антителами anti-mouse CD45, anti-mouse CD11c, anti-mouse CD95 (Becton Dickinson, USA). После инкубации с антителами клетки двукратно отмывали фосфатносолевым буфером. Фенотип мезенхимальных стромальных клеток оценивали методом проточной цитометрии на цитофлюориметре BD Canto II («Becton Dickinson», USA). В каждом образце анализировали не менее 10000 CD45-негативных клеток, оценивая относительную концентрацию клеток, экспрессирующих молекулы CD11c и CD95. В качестве группы сравнения использовали клетки, инкубировавшиеся в среде с 5×10–4 М ПЛФ. Статистический анализ результатов проводили в программах FACS Diva version 3.1.0. и Cyflogic, рассчитывая относительную концентрацию в суспензии клеток, несущих мембраносвязанные молекулы СD11c и CD95. 2.9. Оценка специфической противоопухолевой активности Животные. Для трансплантации перевиваемых штаммов мышей использовали иммунокомпетентных мышей массой тела не менее 18 г из разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» (РОНЦ) или питомника ООО «Столбовая, питомник лабораторных животных»: cамцов гибридов первого поколения (C57Bl/6J × DBA/2)F1; мышей обоего пола линии C57Bl/6J; самок линии DBA/2. Для оценки противоопухолевого эффекта на опухолях человека использовали иммунодефицитных мышей обоего пола Balb/c nude массой тела 18–22 г разведения РОНЦ. Иммунокомпетентных мышей содержали в виварии отдела лабораторных животных НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН при естественном освещении на брикетированном корме с постоянным доступом к воде. Перед началом лечения мышей распределяли на группы (n=6–14). В одной группе мышей препараты не вводили и считали ее контрольной (n=10–12). 54 Иммунодефицитных мышей Balb/c nude разводили и содержали в специализированном кондиционированном отсеке с избыточным притоком стерилизованного на входе воздуха, в стерильных условиях при естественном освещении на брикетированном корме (ООО «МЭСТ», РФ), стерильной бумажной подстилке и постоянном доступе к стерильной воде (конвенциональные условия содержания). Перед лечением мышей распределяли на группы (n=10–14). Одну из групп оставляли без лечения и считали контрольной (n=10–12). Опухолевые модели. Использовали перевиваемые опухоли мышей из Банка РОНЦ и Коллекции опухолевых штаммов человека, рекомендованные для доклинического изучения противоопухолевой активности новых агентов [32]. На соответствующих мышах-донорах поддерживали in vivo опухоли 3–15-й генераций: ● опухоли мышей: лимфолейкоз P388 или L1210, лимфаденоз Фишера L5178Y (в/бр трансплантация); солидные аденокарцинома молочной железы Са755, эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC), саркома 180, аденокарцинома толстой кишки АКАТОЛ, рак шейки матки РШМ-5, плазмацитома МОПС-406, меланома В16/F10 (подкожная или внутримышечная (в/м) трансплантация); ● подкожные гетеротрансплантаты (ксенографты) опухолей человека: аденокарциномы толстой (ободочной) кишки HCT116 и LS174T; рак молочной железы SKBR3 Her2/neu+ и T74D ER+; рак яичников SKOV3 Her2/neu+, гепатоцеллюлярная карцинома Alex, беспигментная меланома Mel7 (Bro). Дозы и режимы введения ферментов. Лечение мышей с асцитными опухолями проводили на 2– 10-е сутки (начало лечение через 24 ч после трансплантации), с солидными опухолями — на 3– 11-е сутки (начало лечения через 48 ч после трансплантации). Все ферменты вводили в/бр или в/в многократно в изотоническом растворе натрия хлорида, в концентрациях и дозовых режимах, указанных при описании результатов соответствующих экспериментов. Эффективность новых ферментов сравнивали с соответствующим прототипом в сопоставимом диапазоне доз. Оценка эффективности и переносимости комбинированной химиотерапии с LO. В качестве комбинантов использованы препараты с различным механизмом действия: цисплатин, иринотекан, этопозид. Комбинированную химиотерапию выполняли одновременно последовательно, первым вводили иринотекан, цисплатин или этопозид. Пути введения препаратов были разобщены для исключения возможной инактивации при прямом контакте с ферментом в кровотоке. Цисплатин использован в виде лиофилизированной лекарственной формы (Эбеве, Польша) во флаконах по 10 мг. Для введения мышам препарат растворяли в физиологическом растворе натрия хлорида и вводили мышам в 0,1% концентрации в/б однократно или многократно в 55 терапевтических дозах, определенных с учетом оценки «острой» токсичности цисплатина в рамках настоящей работы и опубликованных данных о его эффективности in vivo на выбранных моделях. Иринотекан инъекционный раствор («TEVA», Аргентина) вводили в 0,3–0,6% концентрации однократно в дозах, определенных на основании литературных данных и проведенной оценки «острой» токсичности. Максимальная терапевтическая доза и в/б путь введения были выбраны согласно данным [145], что при в/б пути введения иринотекан более эффективен и значительно менее токсичен, чем при в/в введении. Этопозид инъекционный раствор («TEVA», Нидерланды) вводили в 0,1% концентрации. Режим и в/б путь введения был выбран при учете клинической практики троекратного введения этопозида в течение цикла полихимиотерапии и данных [193], согласно которым в/б введение мышам с лейкозом P388 этопозида в эквивалентных дозах равноценно или даже несколько превосходит по эффекту введение в/в при сопоставимой переносимости. Об эффективности комбинации судили по терапевтическому выигрышу по стандатным показателям эффективности лечения в сравнении с группами, получавшими монотерапию комбинантами. Оценка эффективности лечения. Эффективность монотерапии оценивали по стандартным критериям: торможению роста солидной опухоли (ТРО%) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ%) мышей с лейкозом. Значимыми считали ТРО≥50%, УПЖ≥25%. Эффективность лечения бестимусных мышей с гетеротрансплантатами опухолей человека оценивали по изменению размеров опухоли в леченной группе в сравнении с контрольной группой («treatment/control», Т/С), которое рассчитывали как отношение среднего размера опухоли в обеих группах и выражали в процентах (в контрольной группе Т/С=100%). Значимым считали Т/С<42%. Излеченными считали мышей, проживших более 60 суток без признаков опухолевого процесса на аутопсии (асцит и поражение брыжеечных лимфатических узлов при в/бр трансплантированных лейкозах или узловой рост для солидных опухолей). При расчете СПЖ излеченных мышей не учитывали. Эффективность комбинированной химиотерапии оценивали по синергичности действия, сравнивая эффект по стандартным критериям в группах комбинированной терапии и монотерапии. Эффект синергизма оценивали как аддитивное действие — (фармакологический эффект комбинации препаратов выраженнее, чем действие одного из компонентов, но меньше предполагаемого эффекта их суммы), суммацию (эффект комбинации препаратов равен сумме эффектов каждого из компонентов) или потенцирование (конечный эффект комбинации препаратов по выраженности больше суммы эффектов каждого компонента). 56 Оценка переносимости лечения в терапевтических экспериментах. О переносимости терапии судили в сравнении с группой контроля без специфического лечения. В процессе выполнения экспериментов по состоянию, поведению и динамике массы тела мышей следили за возможными проявлениями интоксикации. Гибель мышей фиксировали во время и после лечения. При аутопсии павших или умерщвленных мышей оценивали косвенные признаки общей токсичности по массе тела (≥10%) и наличию патологических изменений внутренних органов или гематологической токсичности по достоверному уменьшению массы селезенки. Завершение экспериментов. Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза с соблюдением гуманных методов, принятых в РФ, трупный материал подвергали кремации в специализированном подразделении РОНЦ [32]. 2.10. Оценка токсичности Оценка «острой» токсичности препаратов, входящих в схемы комбинированной терапии c LO. Опыты проведены на здоровых мышах-самцах линии Balb/c средней массой тела 20–22 г. Препараты вводили в/б однократно в следующих дозах: ♦ LO с удельной активностью 95 МЕ/мг вводили в дозах 300, 600, 900, 1200, 2400 и 3000 МЕ/кг (более высокие дозы не использовали, т.к. более концентрированные растворы LO нестабильны); ♦ цисплатин — 0,1–0,3% раствор в дозах 9; 12; 15; 18; 21 мг/кг; ♦ этопозид — 0,5–2,0% раствор в дозах 30; 60; 90; 120; 150 мг/кг; ♦ иринотекан— 2% раствор в дозах 120; 180; 210; 240; 270; 300; 360 мг/кг. Учитывая циркадные ритмы и зависимость токсичности препаратов в разное время суток [211], опыты проводили в осенне-зимний период, введение препаратов выполняли в 10–11 ч утра. У мышей оценивали общее состояние, особенности поведения, потребления корма и воды, изменения в физиологических отправлениях, количество павших животных, сроки гибели и динамику массы тела, а также изменение массы селезенки. За состоянием и поведением животных наблюдали в течение 3 ч после введения препаратов и затем ежедневно в течение 60 дней. Взвешивали животных один раз в 5 дней на электронных лабораторных весах «CAS MWII» с ценой деления 0,1 г. Выживших после введения препаратов животных умерщвляли на 60-е сутки путем передозировки эфирного наркоза. Затем проводили вскрытие и аутопсию внутренних органов, визуально оценивая наличие патологических изменений. Селезенки извлекали и взвешивали на электронных весах. Количественную токсичность каждого препарата определяли по методу наименьших квадратов с использованием пробит-анализа. Рассчитывали величину средне-смертельной дозы LD50 по методу Литчфилда–Уилкоксона при помощи ПО «StatPlus-2006» [2]. 57 2.11. Оценка элементов фармакокинетики Определение фармакокинетики LO. Для определения фармакокинетических параметров использованы мыши линии Balb/c средней массой тела 20 г из питомника лабораторных животных ИБХ. В каждую группу было включено 16 мышей. Для получения первичных антител к LO использованы 2 кролика породы Шиншилла массой тела до 3 кг. Всех животных содержали в виварии НИИ Митоинженерии (г. Москва). Непосредственно перед введением LO разводили водой для инъекций до концентрации 1 мг/мл, затем 0,9% раствором хлорида натрия до концентрации 0,1 или 0,2 мг/мл. LO вводили в/в в концентрации 0,1 мг/мл (для доз 1,0 и 1,5 мг/кг) или 0,2 мг/мл (для дозы 3,0 мг/кг). Общий объем инъекционного раствора составлял 160–340 мкл. Для оценки фармакокинетики LO при повторном в/в введении использовали 5-кратное введение LO в терапевтических дозах 1,0– 1,5 мг/кг с интервалом 48 ч. У мышей отбирали по 50 мкл крови из ретроорбитального синуса (сроки до 3 ч) или по 100 мкл из яремной вены после умерщвления путем дислокации шейных позвонков (сроки 9 ч и 24 ч). От 8 животных из каждой экспериментальной группы кровь забирали через 10 мин, 1 и 9 ч, от второй половины группы — через 30 мин, 3 и 24 ч после введения фермента. Время взятия крови для каждого животного рассчитывали индивидуально в соответствии со временем введения LO. В течение 1 ч после взятия кровь центрифугировали (3000 об/мин, 1 мин) и отбирали сыворотку. При многократном введении LO пробы отбирали после 1-й и 5-й инъекций через 15 мин, 1–3–9–24–48 часов. Использована оригинальная методика определения количественного содержания LO в сыворотке крови. 96-луночные планшеты для ИФА были покрыты чистым антигеном LO. Исследуемый образец наносили на планшет, затем вносили иммунную сыворотку в рабочем разведении. Антитела, не связавшиеся с образцом, связывались с покрытием. После отмывки планшетов их обрабатывали вторичными антителами к иммуноглобулину кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена. Затем планшеты снова промывали и в реакции с тетраметилбензидином определяли связавшуюся пероксидазу. В качестве нулевого уровня брали максимальный сигнал в лунке без добавления образца. Оптическую плотность в лунках после окрашивания определяли спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Первичные антитела к LO были получены после двукратной иммунизации двух кроликов. Для каждой иммунизации было использовано по 2 мг LO в 1 мл фосфатного буфера с добавлением 1 мл полного (при первой иммунизации) или неполного (при второй иммунизации) адъюванта Фройнда. Фермент вводили внутрикожно. Вторую иммунизацию выполняли через 30 дней после первой. Кровь отбирали каждые 3 дня в период от 10 по 20-й дни после второй инъекции. 58 По данным предварительного титрования для проведения исследования использована сыворотка крови с максимальным титром антител к LO. Перед выполнением исследования 96-луночные планшеты обрабатывали раствором LO (50 мкг/мл) в карбонатном буфере при +4 оС в течение 12 ч. В пилотных исследованиях для покрытия каждой лунки использовали по 5 мкг LO. После определения остальных параметров исследовали чувствительность теста при использовании LO в дозах 10, 5 и 2 мкг. Лучшие результаты были получены при использовании 2 мкг LO. Затем лунки промывали фосфатносолевым буфером рН 7,4, содержащим 0,05% Tween 20, после чего в каждую лунку планшета помещали по 300 мкл 10% раствора сыворотки теленка и инкубировали в фосфатном буфере в течение 2 ч. Серийные 2-кратные разведения LO в сыворотке теленка, начиная с 1 мкг/мл до 1 нг/мл, исследовали с серийными 10-кратными разведениями гипериммунной кроличьей сыворотки, начиная от 1:100 до 1:1 000 000. Затем исследование повторяли в полученном диапазоне разведений сыворотки, используя 3,2-кратные (0,5 log) разведения. Оптимальным считали разведение сыворотки, при котором было возможно определение минимальной концентрации LO при достаточном уровне сигнала (оптическая плотность выше 0,5). Определение концентрации LO проводили в соответствии с описанным выше способом. Для каждой 96-луночной плашки использовалась индивидуальная калибровочная кривая в диапазоне от 10 до 1000 нг/мл. В соответствии с рабочим диапазоном метода образцы, собранные на сроки до 3 ч включительно, исследовались в разведении 1:100, образцы, собранные в более поздние сроки — в разведении 1:10. Для образцов, выпадавших из рабочего диапазона метода, проводилось повторное исследование после коррекции рабочего разведения. Основные фармакокинетические параметры рассчитывали модельно-независимым методом: AUC0–24, мкг/мл×ч; C0, мкг/мл; Kel, ч–1; T1/2, мин; Cl, мл/мин; Vd, мл. Для отображения полученных данных в координатах Дедрика хронологические времена отбора проб крови пересчитывали в соответствующие «фармакокинетические времена» по уравнению: tpk=t/m0,25, где tpk — «фармакокинетическое время», m — масса тела мыши, кг [106]. Значение Т1/2 выражали в «фармакокинетическом времени» (Т1/2, pk), на основе чего рассчитывали продолжительность Т1/2 у человека (T1/2, h) по уравнению: T1/2, h = T1/2, pk × 700,25. Определение фармакокинетики MGL. Для определения фармакокинетических параметров MGL С. freundii, C. sporogenes и С. tetani использованы мыши-самки C57Bl6 средней массой тела 23 г разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина. В каждую группу было включено 3 мыши. Непосредственно перед введением MGL разводили изотоническим раствором натрия хлорида до концентрации 50 МЕ/мл. MGL вводили в/в в дозах 500 и 1000 МЕ/кг. У мышей отбирали по 100 мкл крови после умерщвления путем дислокации шейных позвонков из ретроорбитального 59 синуса. В каждой экспериментальной группе кровь забирали через 10 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч и 24 ч. Время взятия крови для каждого животного рассчитывали индивидуально в соответствии со временем введения MGL. В течение 10 мин после взятия кровь центрифугировали (3000 об/мин, 1 мин) и отбирали сыворотку. Содержание MGL определяли по стандартной методике (см. раздел. 2.5). Определение содержания пиридоксина и L-метионина в сыворотке крови мышей после введения MGL проводили хроматографическим методом. Использовали соответствующие растворы концентрации 10 мкмоль/л. Для осаждения белков плазму крови объемом 100 мкл разбавляли в 3 раза ацетонитрилом и центрифугировали в течение 10 мин при 13400 rpm. Хроматографию проводили на UPLC (LC-30 Nexera X2, «Shimadzu Europa GmbH»). Для разделения использовали режим инъекции с полным заполнением петли образцом 10 мкл на колонке Shim-pack FC-ODS C18 (2 мм × 150 мм, 3 мкм), при температуре 35 °С. Для элюции использовали градиент 0,1% раствора муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и ацентонитрил (расвторитель В) со скоростью потока 0,2 мл/мин. Использовался следующий градиент: B 0% (0 мин) →55% (10 мин) →0% (10,01–20 мин). Масс-спектрометрический анализ првоодили на тандемном масс-спектрометре Shimadzu LCMS-8050 («Shimadzu Europa GmbH»). Пиридоксин и L-метионин определяли методом ионизации электрораспылением с режимом детекции положительно заряженных ионов со следуюшими значениями MRM: отношение массы к заряду m/z 170,2 > 152,1 и 170,2 > 134,3 для пиридоксина и m/z 150,2 > 104,2 и 150,2 > 61,2 для L-метионина. Параметры измерений: капиллярное напряжение 4 кВ, напряжение на конусе 30 В, скорость потока распыляемого газа 5,0 л/мин, скорость потока осушающего газа 10,0 л/мин, скорость потока нагревающего газа 10,0 л/мин, температура DL 250 °C, температура обогревателя блока цилиндров 400 °С, температура поверхности раздела 300 °С. В качестве газа для соударений использовался аргон при давлении 270 кПа. Определение стабильности MGL в плазме крови. 10 образцов плазмы крови человека были получены от здоровых доноров из ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава РФ. Ферменты инкубировали в плазме при 37 °С в течение 24 ч. Стабильность препаратов MGL в плазме крови человека оценивали, отбирая аликвоты в течение 24 ч и определяя специфическую активность MGL описанным выше методом. В качестве контроля ферменты инкубировали в аналогичных условиях в натрий-фосфатном буфере при pH 7,4. 2.12. Оценка иммуногенности В опытах использовали 45 мышей-самок С57Bl6 массой тела 18–24 г разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, которых содержали в виварии РОНЦ при естественном освещении на брикетированном корме и постоянном доступе к воде. Перед введением препаратов мышей 60 распределяли на группы (n=5). Для иммунизации мышей использовали EcA (Medac, Германия); а также выделенные и изученные в настоящей работе EwA; YpA, RrA, WsA и WsA-Hep. Для оценки IgM-ответа антигены вводили однократно в/в по 500 мкг на мышь. При изучении IgG-ответа белки вводили мышам в/в в 300 мкл изотонического раствора натрия хлорида по 300 мкг на мышь троекратно с интервалом 14 сут. Для оценки перекрестного иммунного ответа среди наиболее близких L-аспарагиназ EcA, EwA и YpA вводили в/в троекратно в сниженной дозе 50 мкг на мышь. Мышам контрольной группы в таком же режиме вводили изотонический раствор натрия хлорида в аналогичном объеме. Кровь получали на 7-е сутки после последнего введения и получали из нее сыворотку. Мышей усыпляли медицинским эфиром и отбирали кровь из подглазничного венозного синуса и выводили из эксперимента, умертвляя методом цервикальной дислокации. Для получения сыворотки полученную кровь выдерживали 30 мин при 37 °С для ускорения свертывания и затем ночь при +4ºС. После ретракции сгустка пробирки с кровью центрифугировали 10 мин при 400 g для уплотнения сгустка/осадка. Образовавшуюся сывоторку крови отбирали в отдельные пробирки Eppendorf. Антигенный ответ на вводимые L-аспарагиназы определяли по наличию антиген-специфичных IgM или IgG в сыворотке крови иммунизированных мышей методом ИФА (ELISA). Непосредственно перед исследованием сыворотку осветляли, центрифугируя 10 мин при 10000 rpm на центрифуге Eppendorf 1500. Реакцию проводили в плоскодонных 96-луночных планшетах для ИФА Maxisorb (Nunc). В лунки вносили по 100 мкл растворов антигенов в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе в концентрации 5 мкг/мл и инкубировали 12 ч при +4°С. Затем для определения перекрестной реактивности анти-аспарагиназных IgM-антител cыворотки крови иммунизированных мышей раститровывали на подложках из анализируемых L-аспарагиназ с 1/50 до 1/6400. Для выявления специфичных антител применяли биотинилированные антитела к IgM мыши GoatAnti-Mouse IgM (μ), Hu Ads Biotin Conjugate («Invitrogen») в разведении 1/10000 и стрептавидиновый конъюгат с пероксидазой хрена STREPTAVIDIN HRP («AbD Serotec») в разведении 1/10000. При оценке IgG-ответа сыворотки раститровывали с разведения 1/50 до 1/256000. Для выявления специфичных антител применяли биотинилированные антитела к IgG мыши Goat anti mouse IgG, HU ADS biotin conjugate («Invitrogen») в разведении 1/10000 и стрептавидиновый конъюгат с пероксидазой хрена Streptavidin-HRP conjugate («Perkin Elmer») в разведении 1/10000. Реакцию проявляли с помощью раствора субстрата Н2О2 и хромогенного косубстрата офенилендиамина пероксидазы хрена, содержащего в качестве хромогена ортофенилендиамин. Результаты ИФА учитывали, определяя оптическую плотность (ОП) на ридере Мультискан FC 61 при длине волны 490 нм. Титром сыворотки считали ее разведение, при котором значения ОП вдвое превышали контрольные значения. При оценке IgG-ответа сыворотки крови считали отрицательными (–) по определяемым антителам при титре 1/125, слабоположительными (+) 1:250–1:2000; положительными (++) 1:4000–1:64 000; сильноположительными (+++) >128 000. Для IgM-ответа: (–) при титре < 1:90; (+) 1:90–1:140; (++) 1:140–1:500; (+++) >1:500. 2.13. Статистическая обработка Статистическую обработку данных выполняли в среде SPSS21. Статистический анализ результатов экспериментов на культурах клеток проводили, рассчитывая значения медианы и размах 25-го и 75-го квартилей данных в группах (Med, 25–75%). Критическое значение уровня значимости (p) при всех исследованиях принимали равным 0,05. Взаимосвязи IC50 и Km изучали с помощью корреляционного анализа Пирсона. Рассчитывали коэффициенты корреляции как по сгруппированным данным о цитотоксичности в различных клеточных линиях, так и в несгруппированных данных. В первом случае в корреляционный анализ включали среднее геометрическое значение IC50 для различных культур клеток. Во втором случае цитотоксичность на каждой клеточной линии рассматривали отдельно, данные предварительно логарифмировали для симметризации закона распределения. Для сравнения цитотоксичности ферментов использовали однофакторный дисперсионный анализ. Поскольку дисперсии IC50 в группах значительно различались, проводили анализ логарифмированных данных. Рассчитывали значения Mean ± SD — среднее арифметическое и стандартное отклонение; среднее геометрическое (антилогарифм средних логарифмированных значений). Статистическую значимость различий цитотоксической активности в отдельных группах (апостериорные тесты) оценивали по методу Тьюки. Статистическую рассчитывая обработку стандартные данных фармакокинетических погрешности средних исследований сравниваемых проводили, величин. Величины концентраций LO на терминальных участках фармакокинетических кривых подвергали статистической обработке по однофакторному ANOVA-тесту. Достоверность полученных результатов в экспериментах по оценке противоопухолевой активности определяли по методу Фишера–Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова, вычисляя доверительные интервалы средних сравниваемых величин. Статистическую обработку выживаемости мышей проводили с использованием логрангового теста (log-rank) и построением кривых Каплана–Мейера. Достоверными считали различия при p ≤0,05. Сравнение долей излеченных животных проводили с помощью анализа таблиц сопряженности с расчетом критерия χ-квадрат, либо точного метода Фишера и меры связи для данных в 62 порядковой шкале — D Сомера [246]. D Сомера интерпретируется аналогично коэффициенту корреляции, рассчитываемому для количественных признаков: положительные значения означают прямую связь, отрицательные — обратную, и чем ближе абсолютные значения показателя D к единице, тем теснее взаимосвязь между признаками. Рассчитывали 95% доверительные интервалы (ДИ) долей по методу Клоппера–Пирсона [245]. Для оценки тесноты взаимосвязи между Km L-аспарагиназы и показателями эффективности in vitro (IC50) и in vivo (СПЖ) рассчитывали коэффициенты корреляции Спирмена. В опытах in vivo показателю «время жизни» излеченных мышей присвоен максимальный срок наблюдения 90 суток, который при расчете коэффициента корреляции Спирмена получал максимальный ранг. В анализируемой экспериментальной модели лежит гипотеза, что если животные были живы на 60-е сутки после трансплантации L5178y, то в дальнейшем на их продолжительность жизни будут влиять преимущественно иные факторы риска, нежели опухолевый процесс. Для оценки совместного влияния дозы L-аспарагиназы и ее Кm на выживаемость животных с опухолями применяли регрессионную модель Кокса. Последнюю строили в трёх вариантах для различных диапазонов разовых доз ферментов: 500–1000; 2000–8000; ≥12000 МЕ/кг. Метод построения модели — пошаговый с включением. В качестве возможных факторов риска гибели рассматривали Km фермента и разовую дозу, а каждый из предикторов — как номинальный признак. Таким образом, компьютерный алгоритм вычислял коэффициенты регрессии отдельно для каждой из заданных градаций признака по сравнению с референсной категорией. Для Km за референс было взято самое низкое значение активности с Km = 0,017 мМ, а для разовой дозы в диапазоне доз 2000–8000 МЕ/кг — минимальная доза 2000 МЕ/кг. 63 Глава 3. Экспериментальные подходы к созданию и отбору продуцентов ферментов 3.1. Новый метод отбора штаммов-продуцентов L-аспарагиназ1 С целью разработки метода отбора продуцентов L-аспарагиназ на плотной среде была предпринята попытка модифицировать известные методы с использованием плотных дифференциальных сред Эндо или LB путем включения различных индикаторов (бромтимоловый синий, метиловый красный, бромкрезоловый пурпурный, бромфеноловый синий). Добавление индикаторов к средам не позволило дифференцировать продуценты Lаспарагиназ от неактивных штаммов, вероятно, по причине диффузии растворимых окрашенных продуктов реакции в агаре. Принцип нового разработанного метода основан на способности L-аспарагина и Lаспарагиновой кислоты образовывать прочные хелатные комплексы с металлами (Cu, Ni, Co) [304]. Выявление активных продуцентов L-аспарагиназы основано на образовании красных комплексов меди с анионом гексацианоферрата при ферментативном разрушении синих комплексов меди с L-аспарагином. В результате реакции с восстанавливающими ингредиентами агара, входящего в состав плотной питательный среды (например, LB или М9), гексацианоферрат (III) восстанавливается до гексацианоферрата (II). При ферментативном гидролизе аспарагина и разрушении прочного хелатного комплекса этой аминокислоты с Сu(II) ионы меди связываются с анионом гексацианоферрата(II), что сопровождается выпадением красно-коричневого осадка. 2Сu2+ + [Fe(CN)6]2– Cu2[Fe(CN)6]; рН 7 Таким образом, основой предлагаемого метода выявления штаммов-продуцентов L- аспарагиназы является цветовая индикация ферментативного гидролиза аспарагина. Нами были изучены также реакции комплексообразования с Ni или Co, но их использование было менее информативным из-за слабого внешнего эффекта (неяркие продукты реакции). Ниже приведены примеры приготовления сред. В качестве модифицируемых сред использованы стандартные среды LB и М9 с добавлением 1,5% агара [24, 144]. Модифицированная среда LB. Сначала готовится стандартная среда LB; рН 7,6 [70] с добавлением 0,2–0,8 г CaCO3. К 100 мл расплавленной стерильной среды LB, содержащей 1,5% бакто-агара, последовательно добавляют 4,0 г L-аспарагина; 3,0 мл 0,2 М СuSO4×5Н2О, и 2,5 мл 0,1 M K3Fe(CN)6 до конечной концентрации 0,3 M L-аспарагина, 0,0057 М СuSO4×5H2O и 0,0024 М К3Fe(CN)6. После добавления каждого компонента смесь тщательно перемешивают. 1 Эксперименты выполнены совместно с к.б.н. М.В. Покровской, ИБМХ им. В.Н. Ореховича 64 Модифицированная среда М9. Сначала готовится стандартная среда М9; рН 7,6. После автоклавирования и охлаждения в среду добавляют следующие компоненты: 1 М MgSO4×7Н2О 2 мл; 20% глюкоза 10 мл; 1 М CaCl2 1 мл. Три последних раствора стерилизуются фильтрованием. К 100 мл расплавленной стерильной среды М9, cодержащей 1,5% агара, последовательно добавляют 4,0 г L-аспарагина, а также 4,5 мл 0,2 М СuSO4×5Н2О и 3,5 мл 0,1 M K3Fe(CN)6 до конечной концентрации 0,3 M L-аспарагина, 0,0083 М СuSO4×5H2O и 0,0032 М К3Fe(CN)6. После добавления каждого компонента смесь тщательно перемешивают. При необходимости в среду вносят антибиотики и индукторы, например, при выращивании штаммов BL-21(DE3)/pBAD/ECARLANS (E. coli/pACYC) вносят L-арабинозу (Е. coli/pBAD) до 0,0015 М и BL-21(DE3)/pАСYC177-LANS или IPTG (isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside) до 0,001 М, соответственно. Среду, содержащую комплексные соединения с медью, необходимо готовить непосредственно перед употреблением. Автоклавирование питательной среды и растворов проводят в стандартных условиях. Среду разливают в чашки Петри и подсушивают в ламинаре в течение 20 мин. Приготовленная горячая среда имеет желто-зеленый цвет, холодная — приобретает голубоватый оттенок, обусловленный наложением синего комплекса меди и желтого гексацианоферрата калия. Герметично закрытые чашки с готовой средой могут храниться при комнатной температуре в течение месяца. Покрасневшая или побуревшая среда вследствие выпадения осадка Cu2[Fe(CN)6] для диагностических целей непригодна. Исследуемые микроорганизмы высевают на поверхность приготовленной диагностической среды истощающим мазком, выдерживают посевы в термостате при оптимальной температуре роста в течение 12–20 или 24–48 ч соответственно, после чего учитывают результаты по окраске выросших колоний. Красный цвет колоний и красный ореол вокруг них указывают на способность исследуемого микроорганизма разрушать аспарагиновые комплексы, в то время как неактивные свой естественный цвет не изменяют. Для тестирования сред из коллекции лаборатории медицинской биотехнологии ИБМХ им. В.Н. Ореховича были отобраны рекомбинантные штаммы E. coli с высокой L-аспарагиназной активностью от 12 до 34 МЕ/мг белка: BL-21(DE3)/pBAD/ECARLANS (Е.coli/pBAD) и BL21(DE3)/pАСYC177-LANS (E. coli/pACYC); стандартные генетически модифицированные штаммы E. coli, используемые в биотехнологии с низкой L-аспарагиназной активностью (до 10 МЕ/мл белка): JM 109, DH-52, MC 1061, BL-21(DE3); а также природные штаммы: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei var. rhamnosus, Васillus megaterium, Ваcillus subtilis и Еrwinia carotovora N1 (коллекция микроорганизмов БГУ, Минск) с активностью 0,003–0,007 и 0,1–0,3 МЕ/мг белка, соответственно. 65 Исследуемые штаммы выращивали на среде LB в течение ночи в качалке со скоростью перемешивания 180 об/мин при температуре 37 °С до OD600=1,5–2,0 ОЕ. После стандартных 10кратных разведений бактериальную культуру шпателем или петлей высевали на поверхность приготовленной диагностической среды. Посевы выдерживали в термостате при температуре 37 °С в течение 12–20 (среда на основе LB) или 24–48 ч (среда на основе М9) соответственно, после чего результаты учитывали по окраске выросших колоний и сопоставляли с данными стандартного метода прямой несслеризации (табл. 3). Показано, что покраснение колоний и диаметр окрашенной зоны вокруг них находятся в прямой зависимости от L-аспарагиназной активности изучаемых штаммов, концентрации реагирующих компонентов, а также времени инкубации. Видно, что красное окрашивание колоний коррелирует с активностью штамма, определенной при помощи стандартного метода. Показано, что только колонии Lactobacillus plantarium, Lactobacillus casei var. rhamnosus, Bacillus subtilis и Bacillus megaterium с активностью 0,007 МЕ/мг белка оставались неокрашенными при любых сроках инкубации и любой окраске среды. Штаммы, демонстрирующие невысокую активность, окрашиваются в розовый цвет. Рекомбинантные штаммы E. coli BL-21(DE3)/pBAD/ECARLANS и E. coli BL21(DE3)/ pACYC177-LANS, активность которых составляет 28 и 34 МЕ/мг белка соответственно, окрашены в ярко красный цвет. На рис. 1 в бесцветных секторах находятся штаммы E. coli XL-blue и Lactobacillus plantarium, в окрашенном секторе — E. coli BL21(DE3)/pACYС177-LANS. Рис. 1. Внешний вид колоний на дифференциальнодиагностической среде на основе LB. 66 Таблица 3. Активность штаммов разных микроорганизмов, использованных для валидации дифференциально-диагностической среды Время инкубации** Тестируемый штамм Цвет отдельных колоний Активность, с реактивом среда на среда на Несслера, основе М9 основе LB МЕ/мг белка E. coli XL-blue E. coli BL-21 (DE3) E. coli DH-52 E. coli MC 1061 Красный с индукцией, розовый без индукции Красный с индукцией и без индукции* Розовый Розовый Розовый Розовый Bacillus megaterium Белый 48 48 0,007 Bacillus subtilis Белый 48 48 0,006 Erwinia carotovora Белый 48 48 0,3 Lactobacillus plantarium Белый 48 48 0,003 E. coli BL-21(DE3)/ pBAD/ ECARLANS E. coli BL-21(DE3)/ pACYC177-LANS 24 12–15 28 24 13–16 34 48 48 48 48 16–18 16–18 16–18 16–18 4,3 5,2 3,4 3,2 Lactobacillus casei Белый 48 48 0,005 varrhamnosus Примечания: *В отсутствии индуктора красный ореол вокруг колоний связан с подтеканием промотора, в присутствии индуктора ореол значительно больше, чем без него; **время инкубации до появления цвета при высеве истощающим мазком. Контрольные чашки на протяжении всех опытов оставались зеленовато-серыми или желтыми без очагов покраснения в течение 1–2 суток. В отсутствии гексацианоферрата чашки оставались голубыми даже в присутствии заведомо активных продуцентов. При подборе концентраций реагентов оптимальные результаты были получены при добавлении 2–7 мл глицерина; 4 г L-аспарагина; 3 мл 0,2 М сульфата меди (СuSO4×5Н2О); 2,5 мл 0,1 М гексацианоферрата калия (K3Fe(CN)6) и 0,2 г CaCO3 на 100 мл среды LB или М9, рН=7,6–7,8. Приведенная в прописях сред концентрация СuSО4×5Н2О эквивалентна содержанию связующих компонентов среды. Увеличение концентрации СuSО4×5Н2О и появление свободных ионов меди, сопровождающееся неспецифическим красным окрашиванием, приводит к невозможности роста клеток, уменьшение — снижает чувствительность среды. Гексацианоферрат калия является не только необходимым компонентом, связующим медь, но и индикатором, свидетельствующим о наличии или отсутствии свободных ионов меди. 67 Конечный результат реакции зависит не только от ферментативного разрушения комплекса меди с L-аспарагином, но также и от значения рН среды. Продукты неполного окисления, метаболиты, выделяемые в среду в процессе жизнедеятельности клеток (прежде всего, альдегиды и кетоны) влияют на рН и окислительно-восстановительный потенциал системы, а, следовательно, и на процесс тестирования. Более длительная инкубация приводит к неспецифическому окрашиванию среды. При уменьшении концентрации глицерина до 0,03 г/мл интенсивность окрашивания колоний снижалась, при увеличении более 0,09 г/мл окрашивание было неспецифическим. Добавление в среду CaCO3 до 2,5 мг/дл позволяло нейтрализовать образующуюся Lаспарагиновую кислоту и предотвратить диффузию кислоты в среду из области роста активных колоний, а покраснение ограничивалось зонами, занимаемыми отдельными колониями. Ионы кальция, по-видимому, связывают полуацетальную форму восстанавливающих сахаров и тем самым блокируют образование альдегидных форм, что препятствует нежелательному восстановлению меди, разрушению комплексов с L-аспарагином и выпадению неспецифического красного осадка. Длительное нагревание готовой среды или автоклавирование в жестких условиях может вызывать разрывы полисахаридных цепей агара и появление альдегидных форм. Незначительное изменение концентрации хлоридов или нитратов не вызывает значимого изменения результата. Однако существенное изменение ионного состава осложняет анализ, поэтому для приготовления среды желательно использовать бакто-триптон и дрожжевой экстракт с контролируемым содержанием примесей. В то же время, несмотря на колебания химического состава некоторых ингредиентов сред (бакто-триптон и дрожжевой экстракт), подбор концентраций реагентов позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты не только на синтетических средах, такой как М9, но даже в среде LB. Таким образом, предложенный комплексонометрический способ и разработанные на его основе дифференциально-диагностические среды позволяют: 1) выявлять бактериальные штаммы с L-аспарагиназной активностью не менее 0,01–0,1 МЕ/мг белка, в т.ч. проводить первичный отбор единичных активных колоний прямо на плотной среде; 2) оценивать чистоту культуры по биохимической активности в отношении L-аспарагина; 3) сохранять испытуемые колонии живыми и использовать их в дальнейшей работе, т.к. клетки растут на привычной среде, ионы гексацианоферрата по мере дезамидирования L-аспарагина удаляются из раствора в виде осадка с медью, а ионы меди постоянно находятся в связанном состоянии и на рост культуры практически не влияют. 68 Метод специфичен, поскольку разработанная среда содержит основной субстрат фермента — L-аспарагин, достаточно прост в применении, и позволяет использовать не только синтетические среды, но и традиционную среду LB, на которой растет большинство микроорганизмов. К относительным недостаткам можно отнести сложный состав среды и использование компонентов, потенциально способных провоцировать мутагенез, а также необходимость учитывать особенности метаболизма исследуемых штаммов при оценке результатов. В целом, разработанный способ выявления штаммов-продуцентов L-аспарагиназы представляет собой новый специфичный, быстрый, простой и удобный метод выявления активных продуцентов L-аспарагиназы. 3.2. Создание новых рекомбинантных штаммов-продуцентов Lаспарагиназ Для создания рекомбинантных штаммов-продуцентов были выбраны L-аспарагиназа II типа Y. pseudotuberculosis (YpA), идентичная на 99% L-аспарагинзе высокопатогенной Y. pestis, а также L-аспарагиназа I типа Rhodospirillum rubrum (RrA), которая отличается в 2 раза меньшей молекулярной массой и перспективна с точки зрения уменьшения иммуногенности и как модель для изучения механизма действия L-аспарагиназ. RrA дикого типа лишена сигнального пептида и является внутриклеточным ферментом, что подтверждено с помощью Signal P 4.0 [267]. 3.2.1. Создание штамма-продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы Yersinia pseudotuberculosis2 Плазмида pET23a, несущая ген YpA (получена в ФГУП «ГосНИИгенетика»), трансформирована в штамм E. coli BL-21 (DE3). Существенный недостаток полученного продуцента — нерегулируемая и нестабильная экспрессия, снижающаяся при пересевах. Катаболическая регуляция глюкозой, использование сред LB, М9 и на основе рыбного гидролизата, культивирование при повышенной до 39 °С и пониженной до 24 °С температуре, изменение условий аэрации и концентрации индуктора ИПТГ от 0 до 10 мМ, а также перенос плазмиды в штамм E. coli BL21(DE3)pLysS под более строгий контроль экспрессии белков существенно не влияли на уровень экспрессии. Это послужило основанием для переноса гена YpA в другую экспрессионную систему под жесткий контроль — pBad24. Плазмида pET23a, несущая ген YpA, была обработана эндонуклеазами рестрикции HindIII и XbaI. Фрагмент, содержащий искомый ген, был выделен и очищен методом электрофореза в агарозном геле, а затем клонирован в плазмиду pBad24 по соответствующим сайтам рестрикции. В дальнейшем при трансформации 2 Эксперименты выполнены совместно с к.б.н. М.В. Покровской, ИБМХ им. В.Н. Ореховича 69 различных штаммов-реципиентов для получения продуцентов рекомбинантной YpA использовали вектор pBad24/YERS (рис. 2). Рис. 2. Генетическая карта плазмиды pBAD24/YERS. Стабильность полученной генетической конструкции в течение 20 пассажей была подтверждена рестрикционным анализом (табл. 4). Секвенирование клонированного фрагмента ДНК размером 1055 п.н. показало, что его последовательность отличается от последовательности гена ansB Y. pseudotuberculosis IP 32953 наличием нуклеотидной замены, приводящей к аминокислотной замене Lys165Thr (рис. 3). Таблица 4. Размер фрагментов по данным рестрикционного анализа Использованные рестриктазы ClaI + NcoI ClaI + SmaI ClaI + KpnI KpnI EcoRV + HindIII Размер фрагментов, п.н. 1316, 4322 1326, 4312 1324, 4314 5638 2071, 3567 70 M K Y I K L T V L A G I F V G I S S P V ATGAAATATATAAAGCTAACGGTACTCGCCGGAATATTTGTAGGGATCAGTAGCCCGGTT 20 F A L P N I T L L A T G G T I A G G G D TTTGCTCTGCCTAATATCACTTTATTGGCAACCGGGGGCACCATCGCAGGGGGAGGTGAT 40 S A T K S N Y T A G K L G V D A L V E A TCTGCTACAAAATCCAATTATACCGCCGGTAAATTGGGGGTAGATGCGCTGGTAGAGGCC 60 V P A I K D I A N I Q G E Q V V N I G S GTCCCGGCCATAAAAGACATTGCGAATATCCAGGGCGAACAAGTGGTGAATATCGGCTCA 80 Q D M N D D V W L T L A K K I N K D C T CAAGATATGAATGACGATGTTTGGCTCACATTGGCGAAAAAAATCAATAAAGACTGCACG 100 K T D G F V I T H G T D T L E E T A Y F AAAACAGACGGTTTTGTCATCACTCATGGAACGGATACTTTAGAAGAAACGGCTTATTTC 120 L D L T V N C D K P V V I V G A M R P A CTCGATTTAACCGTCAATTGTGATAAACCCGTGGTGATAGTCGGCGCAATGCGCCCGGCA 140 T A L G A D G P L N L Y N A V V V A S E ACGGCATTAGGGGCCGACGGCCCGTTGAACCTCTACAACGCGGTGGTGGTCGCCAGTGAG 160 A D S A Т R G V L V A M N D M V F T G R GCAGACTCGGCT AСA CGGGGTGTGCTGGTGGCGATGAATGACATGGTTTTCACTGGGCGT 180 D V V K T N T T S V Q T F Q S P N T G P GATGTGGTAAAAACCAACACCACATCAGTGCAAACATTCCAATCACCGAATACAGGGCCA 200 L G Y I Y D G K V N Y L H Q P A A R Q P TTGGGGTATATCTATGATGGTAAAGTTAATTATTTGCATCAACCAGCAGCAAGACAACCC 220 A F D I S K L N T L P K V G I I Y N Y A GCGTTTGATATCAGTAAGCTAAATACGTTACCGAAAGTTGGCATTATTTATAACTATGCA 240 N A S D I P A K A L I A D G Y Q G I V S AATGCATCGGACATACCCGCAAAGGCATTGATTGCCGATGGTTATCAGGGGATTGTCAGT 260 A G V G N G N L Y H T V F D T L A T A A GCTGGCGTGGGGAACGGTAATCTCTATCATACGGTTTTCGATACGCTGGCAACCGCCGCA 280 S H G V A V V R S S R V P S G S T T E G AGTCACGGGGTTGCAGTTGTGCGCTCGTCTCGTGTGCCCAGTGGTTCAACCACAGAAGGT 300 A E I D D A K Y G F V A A G A L N P Q K GCTGAAATTGATGACGCTAAATACGGCTTTGTCGCTGCGGGTGCACTTAATCCACAGAAA 320 A R V L L Q L A L T Q T Q K P Q E I Q K GCACGGGTTTTATTACAGTTAGCATTAACGCAAACTCAAAAACCACAAGAAATTCAAAAA 340 L F H T Y TTATTCCACACATATTGA 345 Рис. 3. Нуклеотидная последовательность и полная аминокислотная последовательность гена YpA, использованного в работе. Выделен участок мутации (ААА → ACA). 71 По данным создателей плазмиды pBad, рекомендуемыми штаммами-реципиентами являются Е. coli BL-21 (DE3), Е. coli BL-21 (DE3) plysS; Е. coli TOP10, Е. coli JM83, которые и были использованы для трансформации: Е. coli BL-21 (DE3), Е. coli BL-21 (DE3) plysS (ГУ Центр «Биоинженерия» РАН); Е. coli TOP10, Е. coli JM83 (ФГУП «ГосНИИгенетика»). Штаммы E. coli, трансформированные pBad24/YERS, культивировали в стандартных условиях. Индуктор (арабинозу) вносили при оптической плотности 0,80–1,98 ОЕ до конечной концентрации 0,2%. Без индукции у продуцентов JM83 и TOP10 L-аспарагиназная активность не определялась, у BL21 (DE3) и BL21 (DE3) plysS не превышала 2,0 МЕ/мл. В течение 17 ч после внесения индуктора максимальная активность фермента до 11,9 МЕ/мл отмечалась у штамма BL21 (DE3), активность L-аспарагиназы у BL21 (DE3) plysS составила 10,9 МЕ/мл; а у JM83 и ТОP10 не превышала 5,7 и 2,7 МЕ/мл, соответственно. Продуктивность штаммов BL21 (DE3), BL21 (DE3) plysS и ТОP10 была сопоставимой и составляла 3,2–3,4 МЕ/ОЕ, однако для BL21 (DE3) отмечено большее накопление биомассы и, соответственно целевого белка. Через 17 ч после индукции плотность культуры для BL21 (DE3), BL21 (DE3) plysS, JM83 и ТОP10 составила 6,15; 5,8; 5,41 и 2,51 при OП600, соответственно. Максимальная оптическая плотность культуры достигалась примерно через 17 ч и сохранялась на этом же уровне впоследствии. Существенного увеличения активности после 17 ч культивирования не наблюдалось. Как видно из табл. 5 и 6, отмечен высокий стабильный уровень экспрессии гена YpA в штамме BL-21 (DE3), который превышал таковой у других штаммов в 2 раза (по критериям активности и продуктивности), экспрессия сохранялась в течение 20 пассажей. Накопление биомассы остальных штаммов в течение трех пассажей существенно снижалось, что сопровождалось уменьшением активности. Таблица 5. Активность и накопление биомассы различных продуцентов в процессе культивирования Продуцент Активность, МЕ/мл Оптическая плотность, ОЕ 1-й пассаж 20-й пассаж 1-й пассаж 20-й пассаж E. coli BL-21 (DE3)/pBad/YERS 11,90 12,10 6,15 6,28 E. coli BL-21 (DE3) plysS 10,90 н/о 5,80 н/о E. coli JM83/pBad/YERS 5,70 н/о 5,41 н/о E. coli TOP10/pBad/YERS 2,70 н/о 2,51 н/о /pBad/YERS Примечание: параметры определяли через 17 ч после внесения индуктора, н/о — не определась (базовый уровень, <2 МЕ/мл) 72 Таблица 6. Динамика L-аспарагиназной активности в процессе культивирования продуцентов Показатель Активность, МЕ/мл Время после E. coli BL-21 E. coli JM83/ E. coli TOP10/ индукции, ч (DE3)/pBad/YERS pBad/YERS pBad/YERS 1 3,48 1,33 0,89 2 6,78 3,54 3,86 3 9,90 5,50 5,20 4 11,15 5,20 5,05 17 11,90 5,70 2,70 Плотность 1 1,34 2,16 1,36 культуры, ОЕ 2 1,86 2,54 1,53 3 2,69 3,13 1,51 4 3,24 3,56 1,71 17 6,15 5,41 2,51 Таким образом, максимальная продуктивность была отмечена у штамма E. coli BL-21 (DE3)/pBad24/YERS. Это позволило выбрать именно его с целью наработки фермента для проведения последующих исследований. 3.2.2. Создание штамма продуцента L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum3 Ген RrA был выделен из штамма Rhodospirillum rubrum (коллекция кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова). Для амплификации гена-предшественника RrA были подобраны следующие синтетические дезоксирибоолигонуклеотидные праймеры: GCC CCT TCC CTT GCC ACA GG, GGA CAC CCA AGC TTC CCT TTT СCG, CAC AGG ATC CTC AAG GCA AAT GGC CG. Ген RrA был клонирован в векторе pET23a по сайтам рестрикции HindIII и Bam НI, получена плазмида, содержащая ген, pET23a/RrA (рис. 4). Стабильность полученной конструкции была подтверждена рестрикционным анализом в течение 10 пассажей. Секвенирование показало идентичность вставки с последовательностью гена Rru_A3730 из Rhodospirillum rubrum (ATCC 11170/NCIB 8255), за исключением двух нуклеотидных замен (рис. 5). Замена С261Т не изменила аминокислотную последовательность. Мутация А445G привела к замене E149K. Полученный фермент состоит из 172 аминокислотных остатков. В результате проверки на L-аспарагиназную активность в чашечном тесте (см. раздел 3.1) была подтверждена перспективность использования продуцента. Полученный продуцент проявлял высокую L-аспарагиназную активность, уровень которой не снижался при 12 пересевах. 3 Эксперименты выполнены совместно с к.б.н. М.В. Покровской, ИБМХ им. В.Н. Ореховича 73 Рис. 4. Генетическая карта плазмиды pET23a/RrA. DNA: ATGGCCGTTTCCCCCTCGCCCCTGCGCATCTTCACCGCCGGCGGGACCATC +1: M A V S P S P L R I F T A G G T I DNA: GATAAAGACTATCGCCTGGAAGAAAACGGGCTGGTCGTCGGCGACCCCTTC +1: D K D Y R L E E N G L V V G D P F DNA: GTCGCCGAGGTCCTGAAAACGGCCCGTCTGGCGGGCGCGGTGTCGATTGTC +1: V A E V L K T A R L A G A V S I V DNA: GCGCTGTCTCGCAAGGATAGCCTGGATTTCACCGAGGCCGACCGCGAAGCG +1: A L S R K D S L D F T E A D R E A DNA: ATCGGCCGGGCGGTCGGCCAAGCCGTGGAGGATCATATCCTTCTCACCCAC +1: I G R A V G Q A V E D H I L L T H DNA: GGCACTGACACCATGGTTGAAACCGCCCGCTATCTTGGCGGCTTGCCCGAA +1: G T D T M V E T A R Y L G G L P E DNA: CTCGCCGGAAAGACCGTGGTGTTGAGCGGCGCGATGGTCCCCGGCCGGGTG +1: L A G K T V V L S G A M V P G R V DNA: GGGGGAAGCGACGCGGCTTTCAATATCGGTTTCGCCTGCGCTGCGGCGTTG +1: G G S D A A F N I G F A C A A A L DNA: ATGCTGGCGCCGGGAGTCTATATTGCTATGCACGGCGAGGTTTTCGACCCG +1: M L A P G V Y I A M H G K V F D P DNA: GCGAAAACCCGGAAGAATCGCGGCCTTGGCCGGTTCGAGCCCATCGACGAC +1: A K T R K N R G L G R F E P I D D DNA: CAGGAGTAG +1: Q E 51 102 153 204 255 306 357 408 459 510 519 Рис. 5. Ген и аминокислотная последовательность RrA. Выделены замены в нуклеотидной и белковой последовательности по сравнению с нативной RrA. 74 3.2.3. Создание продуцентов мутантных форм L-аспарагиназы R. rubrum4 Создание мутантных форм RrA имело как научный интерес (идентификация функциональноактивных участков молекулы), так и практический (повышение активности при физиологических значениях рН). Методом сайт-направленного мутагенеза на основе плазмиды pET23, несущей ген RrA, было получено 10 многоточечных мутантных форм RrA: заменяли отрицательно заряженные и незаряженные остатки в различных участках белка, мутации подтверждены секвенированием (табл. 7). Таблица 7. Мутантные формы RrA Шифр RrAF RrAG RrAD RrAC RrAH RrAE RrAI RrAJ RrAB RrAK Нуклеотидные замены T50G, G52A, A53C, G58C G94C, C96G, C98T, C99G G178A, T180G, C183A C191T, G199A G256C, G257C, G262C, T269A C191T, G199A, G445A, A446G, G448C, T449C G361T, G362T, A368C G353A, G354C, G358A G445A, A446G, G448C, T449C G445A, A446G, G448C, T449C, T503C, G505T, C507G Аминокислотные замены I17S, D18T, D20H D32Q, P33L D60K, F61L A64V, E67K G86P, D88H, M90K A64V, E67K, E149R, V150P G121L, D123A R118H, G120R E149R, V150P E149R, V150P, I168T, удалена последовательность DDQE(169– 172) L-аспарагиназная активность мутантных форм RrAI, RrAH, RrAF и RrAG в экспрессионной системе E. coli не превышала 2 МЕ/мл. Мутации в RrAK приводили к появлению терминирующего кодона, удалению терминальных аминокислот (DDQE) и замене I168T, при этом полученный белок терял ферментативную активность в циклах замораживанияразмораживания, при УЗ-озвучивании или хранении при +4 °С. Осаждение белков сульфатом аммония (60% насыщения) [13] приводило к необратимой инактивации. Для дальнейшего изучения были отобраны пять мутантных форм с постоянной активностью (RrAD, RrAC, RrAJ, RrAB и RrAE), которые были стабильными по данным электрофореза в течение 10 пассажей в LB. Активность проявлялась после УЗ обработки, что подтверждало внутриклеточную локализацию фермента. Полученные с применением чашечного теста результаты совпадали с данными определения активности с использованием реактива Несслера (рис. 6). 4 Эксперименты выполнены совместно с к.б.н. М.В. Покровской, ИБМХ им. В.Н. Ореховича 75 А Б Рис. 6. Развитие окраски через 17 ч (А) и 27 ч (Б) после посева истощающим мазком. 1 — RrAD, 2 — RrAI, 3 — RrAJ, 4 — RrA нативная, 5 — RrAB, 6 — RrAC, 7 — RrAЕ, 8 — RrAG. 3.3. Выделение и очистка полученных L-аспарагиназ5 3.3.1. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы Y. pseudotuberculosis Накопление биомассы. Максимальная продуктивность клеток отмечалась при внесении индуктора арабинозы в середине логарифмической фазы роста (1,0–1,5 ОЕ): активность через 17 ч после добавления индуктора составила 16–21 МЕ/мл, продуктивность — 3,2–4,1 МЕ/ОЕ. Различия в концентрации индуктора — арабинозы в пределах 0,1–0,5% существенно не влияли на продуктивность. Результаты очистки фермента представлены в табл. 8. Аспарагиназная активность в бесклеточном экстракте составляла 8,7 МЕ/мг, что соответствует 3–5% от общего количества белка. При последующем центрифугировании терялось 10–20% ферментативной активности, но на этой стадии происходило и удаление почти 50% балластных белков. Таблица 8. Результаты очистки YpA Этап очистки Объем, Общий Активность, Удельная Выход, мл белок, мг МЕ/мл активность, % МЕ/мг Бесклеточный экстракт 54,0 2256 363,5 8,7 100 Q-Sepharose 28,5 336,3 564,0 47,8 85 DEAE-Toyopearl 26,0 257,4 619,4 62,0 82 5 Эксперименты выполнены совместно с к.б.н. С.С. Александровой, ИБМХ им В.Н. Ореховича 76 На хроматографической стадии потерь ферментативной активности практически не было, в то время как удельная активность фермента возрастала до 62,0 МЕ/мг, что более чем в 7 раз превышает значение исходной активности. YpA элюировалась с колонок одним пиком при концентрации КCl 0,3 М. На заключительном этапе выделения раствор фермента обессоливали и концентрировали в ячейке «Amicon», содержащей фильтр Millipore (NMWL 30.000). При электрофорезе очищенного препарата YpA в 12% SDS-PAGE выявлялся один компонент с молекулярной массой около 36,4 кДа (рис. 7). Рис. 7. Результаты электрофореза в 12% SDS-PAGE очищенного препарата YpA. 1 — Fermentas, #SM0671: 170, 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17 кДа. 2 — бесклеточный экстракт без индукции. 3 — бесклеточный экстракт после индукции. 4 — YpA после хроматографического этапа очистки. 3.3.2. Накопление биомассы и очистка L-аспарагиназы R. rubrum Индуктор (лактоза или IPTG), добавляли в среду при ОП600 0,9–1,9 до конечной концентрации 0,04% и 0,001 М, соответственно. В течение 10 ч роста после индукции активность Lаспарагиназы в клетках определялась только после разрушения клеток ультразвуком, что можно объяснить внутриклеточной локализацией RrA в рекомбинантном штамме-продуценте. Lаспарагиназная активность в клетках достигала 25,3–27,3 МЕ/мл через 8,5–11,5 ч после внесения лактозы и 21,8–24,2 МЕ/мл через 10–13 ч после индукции IPTG. Через 11,5 ч 77 культивирования начинался лизис клеток, о чём косвенно свидетельствовало снижение ОП600 от максимальной 5,4–6,8 (для лактозы) и 5,7–6,0 (для IPTG) до 4,2–5,1 и 4,0–4,6 к концу выращивания, соответственно. Активность фермента в клетках без озвучивания ― 13 МЕ/мл, продуктивность ― 3,0 для обоих индукторов. Накопление биомассы после индукции IPTG было более медленным. Максимальная продуктивность штамма при внесении лактозы или IPTG составила 5,4 (через 8,5 ч после индукции) и 4,9 (через 13 ч), соответственно. Доля RrA от общего клеточного белка в полученном продуценте составляла 15–25%. Методика выделения фермента из клеток штамма-продуцента и его очистки включала ультразвуковую обработку суспензии клеток, удаление дебриса с помощью центрифугирования и две стадии ионообменной хроматографии на колонках с Q-Sepharose и DEAE-Toyopearl 650m. На первой стадии хроматографического разделения происходило удаление большей части балластных белков, и, хотя при этом терялось около 10% фермента, при этом удельная активность возрастала в 3 раза (табл. 9). На последующих этапах очистки потери активности фермента практически не происходило на фоне увеличения удельной активности еще в 2,5 раза. При электрофорезе очищенного препарата RrA в 12% SDS-PAGE выявлялась одна полоса в области 19–21 кДа (рис. 8). Данные электрофореза были обработаны с помощью программы Gel-Pro analyzer 3.1.00.00 («Media Cybernetics», США); по результатам расчетов степень очистки целевого фермента в полученном препарате составила 92%. Таблица 9. Результаты очистки RrA Стадия очистки Общий белок, мг Суспензия клеток Активность общая, МЕ Удельная активность, МЕ/мг Выход, % 157000 – 100 Бесклеточный экстракт 4506 137000 30,4 87 Хроматография на QSepharose 2900 125000 43,1 80 Хроматография на DEAEToyopearl 650m 602 104200 173 66 Обессоливание, концентрирование 600 104000 173 66 78 Рис. 8. Результаты электрофореза в 12% SDS-PAGE очищенного препарата RrA. 1-3 — RrА после УЗ обработки; 30 МЕ/мл, в 1 мкл 10 мкг белка; 1, 3, 5 мкл; 4 — молекулярные стандарты (Amersham #17-0446-01); 5-7 — RrA после очистки; 608 МЕ/мл, в 1 мкл 10,96 мкг белка; 2, 5, 10 мкл; 8, 9 — EcA 0,5; 1 мкл. Две последовательных однотипных стадии очистки с использованием сорбентов DEAEToyopearl и Q-sepharose были использованы для повышения степени очистки целевого белка: так, при использовании для очистки RrA только одного сорбента (Q-sepharose) удельная активность составляла 43,1 МЕ/кг, при общем содержании белка 2900 мг. Дополнительная стадия очистки на DEAE-Toyopearl 650m повышала удельную активность до 173 МЕ/кг при уменьшении содержания общего белка до 602 мг. Попытка использования катионообменных сорбентов (в частности, SP-Sephadex С-25) в качестве второй стадии очистки приводила к тому, что целевой белок элюировался непосредственно после нанесения на колонку со значительными примесями балластных белков. Условия хроматографии на катионообменных сорбентах, при которых белок может быть элюирован (pH<5.1), могут приводить к денатурации белка. Выделение и очистка мутантных форм RrA. Процедура очистки была оптимизирована для каждой мутантной формы индивидуально. При хроматографии на Q-сефарозе нативная RrA и RrAD элюировались при концентрации NaCl 0,3–0,5 М; RrAE, RrAC и RrAJ — 0,4–0,7 М, RrAB — 0,6–0,8 M. Для окончательной очистки рекомбинантных белков были использованы колонки с 79 Toyopearl-DEAE 650 m. Значения pH буферных растворов составили: для RrA, RrAJ и RrAB 7,8; для RrAE, RrAD и RrAC — 6,1. Мутантные формы RrA, RrAB, RrAD, RrAC и RrAJ элюировались при концентрациях NaCl 0,2–0,3 М; 0,125–0,3 M, 0,4–0,5 M, 0,7–0,85 M и 0,5–0,75 М, соответственно; RrAE с сорбентом не связывалась. Очищенные препараты L-аспарагиназ обессоливали и концентрировали на фильтрах Amicon Millipore Ultracel 10 кДа, добавляли глюкозу до 0,5% и лиофилизировали. Образцы ферментов хранили при –20 °С. В процессе очистки удельная активность повышалась до 140–210 МЕ/мг. Результаты SDS-PAGE электрофореза представлены на рис. 9. Рис. 9. Результаты электрофореза в 12% SDS-PAGE различных вариантов RrA. 1, EcA (Medak); 2, RrAD; 3, RrAC; 4, RrAE; 5, RrAJ; 6, RrAB; 7, RrA; 8, белковый маркер # SM0431 (Fermentas). При электрофорезе в SDS-PAGE у всех мутантных форм RrA определялась основная полоса с молекулярной массой 18–20 кДа с содержанием целевого фермента на уровне 70–80% от общего белка (по данным Gel-Proanaluser 3.1.00.00 («Media Cybernetics», США)). Таким образом, были получены рекомбинантные штаммы-продуценты, несущие плазмиду с мутантным геном RrA и отработана лабораторная технология очистки новых L-аспарагиназ, позволяющая получать целевой белок с чистотой не менее 90%. Для дальнейшего изучения были отобраны следующие L-аспарагиназы: YpA, нативная RrA и пять мутантных форм: RrAD, RrAC, RrAJ, RrAB и RrAE. 80 Глава 4. Физико-химические и кинетические характеристики полученных ферментов 4.1. Оптимальные условия протекания ферментативных реакций Физико-химические свойства оценивали у полученных в рамках настоящей работы Lаспарагиназ YpA, нативной RrA, пяти мутантных форм: RrAD, RrAC, RrAJ, RrAB и RrAE, выделенной ранее в ИБМХ L-аспарагиназы EwA, а также полученных и выделенных в ФГУП «ГосНИИгенетика» L-аспарагиназ WsA и WsA-Hep, и PAL Rhodosporidium toruloides, предоставленной НИИ биотехнологии Кемеровского технологического института пищевой промышленности. 4.1.1. Оптимумы рН и температуры новых L-аспарагиназ Зависимость активности от pH. Зависимость активности от pH изучали у полученных Lаспарагиназ (YpA и RrA, ее мутантных форм), а также WsA и ее модифицированной формы WsA-Hep, L-аспарагиназ EcA и EwA. Все изученные ферменты (YpA, WsA, RrA, EwA, EcA и WsA-Hep) каталитически активны в широком диапазоне рН и имеют характерные колоколообразные кривые зависимости от рН. Аналогичная зависимость характерна и для других изученных периплазматических бактериальных L-аспарагиназ II типа [7, 66, 215]. Для апроксимации полученных измерений использованы полиномиальные степенные тренды. Максимальная активность YpA отмечена при pH 8,0; в диапазоне рН 6,0–9,0 сохраняется не менее 87% активности. При рН 7,4 активность составляет 96% от максимальной. Увеличение pH выше 10,0 приводит к снижению активности YpA, но несколько меньшему, чем для EcA (рис. 10). Оптимум pH YpA сопоставим с такими ферментами, как EcA и L-аспарагиназа Pseudomonas aeruginosa [124]. WsA и WsA-Hep активны в широком диапазоне pH >6,0. Максимальная активность немодифицированной WsA определяется в диапазоне 7,8–10,5, оптимум конъюгированной WsA-Hep определяется при pH 8,0. При физиологических значениях pH=7,4 определяется не менее 90% активности обоих ферментов. Активность фермента не зависит от состава буферного раствора. WsA и ее конъюгат активны в более широком диапазоне рН, чем EcA. Оптимум pH RrA и EwA находится при 9,0–9,2. При физиологических значениях рН ≈ 7,4 активность RrA составляет 30–40% от максимальной (рис. 10). В отличие от EcA и EwA активность RrA зависит от состава буферного раствора. Так, при использовании 0,2 M натрий-ацетатного и 0,0125 М боратного буфера активность была примерно на 30% ниже, чем в 0,05 М Tрис-HCl. 81 А В Рис. 10. Зависимость активности Lаспарагиназ от pH. A: 1 — EcA, 2 — YpA; Б: 1 — WsA; 2 — WsA-Hep; В: 1 — EwA, 2 — RrA. По оси ординат % активности, по оси Б абсцисс рН. При изучении мутатных форм RrA, как и для нативной RrA, была показана зависимость активности от состава буферного раствора. Так, при использовании буфера на основе Трис активность всех вариантов RrA возрастала в 1,5–2 раза. Повышение активности в Триссодержащем буферном растворе может быть связано с наличием неспецифического аллостерического центра фермента, взаимодействие с которым может индуцировать конформационные изменения в структуре белка и, соответственно, изменение каталитических свойств фермента. При этом активность этих форм RrA в буферных растворах, не содержащих аминогруппы (ацетатный, фосфатный и боратный), была сопоставимой — исключение из анализа данных, полученных в Трис, дало классическую сглаженную кривую (рис. 11). 82 Рис. 11. Зависимость активности отдельных мутантных форм RrA от рН. 1 — RrAD; 2 — RrA, 3 — RrAB, 4 — RrAЕ. По оси ординат % активности, по оси абсцисс рН. Для уточнения характера зависимости активности от рН мутантных RrA была проведена серия экспериментов с исключением фактора влияния состава буферного раствора на активность: в диапазоне pH 7,9–9,6 c использованием боратного буферного раствора и шагом измерений 0,1. Для отобранных мутантных RrA были построены кривые зависимости активности от рН (рис. 12). Выявлено отсутствие достоверных отличий между оптимумами pH ферментов: оптимум pH нативной RrA и ее мутантных форм не изменился, и оставался в пределах 9,2–9,5. Только для RrAC было показано незначительное снижение оптимума рН до 9.0. Однако у мутантных форм с практически одинаковой активностью при физиологических значениях рН обнаружены существенные отличия в активности при оптимальных значениях рН. Так, активность RrAD при рН 9,3 превышала активность при рН 7,4 в 3,1 раза, активность RrAC и RrAE — в 2,6 раза, в то время как для нативной RrA, RrAJ и RrAB это соотношение составило 2,9. В оптимальных условиях активность RrAD двукратно превосходила активность RrAE и RrAC. Активность при рН 7,9 составляет для RrA, RrAD, RrAЕ, RrAB 46,5; 50,1; 66,1; 60,1% от максимальной, соответственно. Отличия между RrA и RrAЕ достоверны. Зависимость активности нативной RrA и ее мутантных форм от рН аналогична кривой зависимости Km от pH для ErA с максимумом в узком диапазоне рН 9,5–10,0 [66, 215]. Это может быть связано со значительным ослаблением субстратной специфичности в узком диапазоне рН, вызванном изменением заряда активного центра в конкретном интервале рН или может отражать изменения конформации молекулы. Несмотря на отсутствие достоверного биологически значимого сдвига оптимума рН при замене заряженных аминокислот, модификация активности путем проведения точечных замен заряженных аминокислот позволила несколько расширить диапазон pH, при котором сохраняется >50% активности, в кислую сторону. Активность, МЕ/мг 83 0,57 2 RrA 1 RrA6 2 y = -0,1701x + 3,1096x - 13,681 RrA5 3 RrA16 4 0,47 2 y = -0,0749x + 1,3752x - 5,9394 0,37 2 y = -0,1251x + 2,2857x - 10,066 0,27 2 y = -0,0932x + 1,6645x - 7,1444 0,17 7,5 8 8,5 9 9,5 10 рН Рис. 12. Кривые зависимости активности RrA (1), RrAЕ (2), RrAD (3), RrAB (4) от pH в диапазоне 7,0–9,6 в боратном буферном растворе. Зависимость активности от температуры. Температурный оптимум действия всех изученных ферментов отмечается при температуре 54–60 ºС, превышение которой приводит к денатурации. Как и в случае EcA [266], понижение температуры до 36–37 ºС привело к снижению активности YpA и EwA до 60–70% от максимальной, RrA — до 72%, мутантных форм RrA — не менее 60%. Мутантные варианты RrAB, RrAE, RrAJ, как и нативная форма RrA, характеризовались температурным оптимумом 54–56 °С, RrAD — 58 °C, RrAC — 53 °C. В аналогичном диапазоне была отмечена максимальная активность WsA и WsA-Hep. Увеличение активности ферментов при повышении температуры может быть вызвано уменьшением энергии активации реакции, а последующее снижение связано с тепловой денатурацией белка [266]. Динамика изменения активности всех мутантных форм RrA в зависимости от температуры реакционной смеси одинакова. Зависимость активности от ионной силы. Изменение ионной силы в присутствии 100– 3000 мМ КСl практически не влияет на активность периплазматических L-аспарагиназ (EcA, HpA, EwA, WsA и др.) при рН 7,4. RrA и ее мутантные формы демонстрируют отчетливую зависимость ферментативной активности от ионной силы среды реакции: при повышении ионной силы активность снижается. Динамика изменения активности всех мутантных форм RrA в зависимости от ионной силы раствора одинакова: увеличение концентрации KCl c 0 до 1 М приводит к снижению активности на 25–30%, при концентрации 2–3 М остаточная активность составляет не более 1/3 от исходной. Зависимость активности RrA и ее мутантных форм от ионной силы демонстрирует важность электростатических взаимодействий при 84 связывании молекулы субстрата с активным центром и о возможности ее изменения в условиях in vivo при различном электролитном составе плазмы крови. 4.2. Чувствительность к химической и температурной денатурации 4.2.1. Стабильность полученных L-аспарагиназ Термостабильность. При хранении растворов всех изученных ферментов при –70…–20 ºС в буфере А (10 мМ NaH2PO4, 1 мМ глицина, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5–7,8) активность не снижается в течение 12 мес. При инкубации всех ферментов в диапазоне температур от +4 до 37 °С L-аспарагиназная активность сохраняется на уровне >95% от начальной в течение месяца. Так, через 1 мес инкубации YpA и EwA при 24 °С их активность составляет 100 и 105%, соответственно. Через 2 мес хранения активность YpA и EwA при 37 °С составляет >30%, при 24 °С — 8 и 96% исходного уровня. Таким образом, при 24 °С EwA является более стабильной, чем YpA. Резкое падение активности начинается у всех ферментов после предварительного прогревания в течение 3 мин при температуре выше 55 °С. К температурной денатурации RrA несколько более устойчива, чем EcA, возможно, из-за меньшей длины пептидной цепи: инкубация в течение 3 мин при 60 °С приводит к практически полной инактивации EcA (8% от активности, наблюдаемой при 37 °С) при сохранении активности RrA на уровне 27%. Аналогично EcA, при 60 °С EwA теряет практически всю активность в течение 3 мин (0,9% контрольного уровня), в то время как YpA сохраняет 33% активности через 1 мин инкубации и 6% — через 5 мин. При 80 °С все ферменты практически полностью инактивируются. При 80 °С активность снижается до 1% от исходной после инкубации ErA в течение 3 мин, RrA и YpA в течение 10 мин. Сравнение зависимости активности мутантных форм RrA после инкубации при различных температурах показало, что они обладают сопоставимой динамикой снижения активности вследствие денатурации белка при температурах >54 °C. Однако при 56 °С были отмечены некоторые различия между полученными ферментами: для RrA, RrAС, RrAE, RrAB активность составила 70, 62, 22 и 26% от максимальной. Таким образом, из полученных мутантов наиболее чувствительными к нагреванию оказались RrAЕ, RrAB. Значимой ренатурации при понижении температуры ни для одного из ферментов не происходит. Аналогичная динамика зависимости активности от температуры характерна также для EcA и HpA, однако они более стабильны при высоких температурах (выше 59 °С) [7]. Сравнительное изучение профилей термостабильности исходной WsA и WsA-Hep, показало, что они существенно не отличаются: денатурация обоих ферментов начинается при температуре 52 °С, при этом активность WsA и конъюгированного фермента не определяется, 85 соответственно, уже при 56 °С и 54 °С. Для обоих ферментов получены кривые, характерные также и для других типов периплазматических аспарагиназ: EcA, YpA, EwA. Стабильность в циклах замораживания и оттаивания. YpA, EwА, WsA и WsA-Hep сохраняют активность в течение не менее 10 циклов замораживания-оттаивания. Практически полное сохранение активности показано для коммерчески доступной лекарственной формы EcA (Medac, Германия). Нативная форма RrA, а также мутантные формы RrAB и RrAE сохраняли более 68% активности, RrAC — более 78% активности после 5–6 циклов замораживанияоттаивания или хранения при температуре 4 °С в течение 2 мес. Для RrAD и RrAJ не обнаружено каких-либо изменений активности в указанных условиях. По литературным данным, HpA сохраняет активность на уровне 80% от исходной после 50 циклов замораживания-оттаивания [9]. ErA теряет активность после нескольких последовательных циклов заморозки-оттаивания: снижение ферментативной активности, вероятно, связано с диссоциацией тетрамеров на мономеры, некоторые из которых расщепляются на меньшие фрагменты, аггрегируют и преципитируют [174]. Стабильность в растворе мочевины. Инкубирование EwA, YpA, WsA и EcA в течение 1 ч c 0– 4 М мочевиной, рН 7,4, показало устойчивость всех трех ферментов (сохраняется не менее 80% активности). При дальнейшем увеличении концентрации мочевины активность начинала постепенно снижаться, в присутствии 8 М мочевины активность ≥40%. При инкубации RrA в течение 1 ч с 0–2 М мочевиной обнаружено снижение до ≥50% активности), дальнейшее повышение концентрации >4 М cопровождалось полной инактивацией. Нативная RrA и RrAB имели практически идентичный профиль денатурации в присутствии мочевины. Наиболее стабильными к изменению концентрации мочевины при физиологическом значении рН оказались RrAD и RrAJ. При концентрации мочевины 3 М RrAD сохраняет ≈50% от исходной активности, в то время как остальные варианты демонстрировали лишь следовую активность. Остаточная активность нативной RrA, RrAD, RrAJ, и RrAB в 2–3 М растворе мочевины при рН 9,35 была в 2–7 раз выше, чем при рН 7,4. С другой стороны, для RrAE и RrAB была обнаружена меньшая стабильность при увеличивающейся концентрации мочевины: RrAE инактивировалась уже при концентрации мочевины 1,5 М, в то время как нативная RrA cохраняла ≈50% от исходной активности. По литературным данным, HpA и EcA сохраняют свою активность в 3 М растворе мочевины [7]. Мутантная форма EcA2 (S122A) демонстрировала незначительные изменения кинетических характеристик и высокую стабильность в растворах мочевины, замена D124A значительно снижала стабильность EcA даже в отсутствие денатурирующих агентов [110]. Показано, что мочевина не стимулирует развертывание L-аспарагиназы Pyrococcus furiosus [67]. Замена H87A и H197L в EcA приводит к незначительному изменению активности и стабильности фермента в 86 растворе мочевины. Чувствительность различных мутантов RrA к присутствию мочевины даже в относительно небольшой концентрации 1 М при рН 7,4 указывает на слабость водородных связей белка и важность пространственной структуры для реализации ферментативной функции. Тот факт, что RrAC и RrAE обладали нормальной активностью, но существенно сниженной стабильностью в присутствии мочевины, особенно при рН 7,4, позволяет предполагать, что на стабилизацию олигомерного белка большое значение оказывают аминокислотные остатки А64 и Е67. 4.3. Кинетические параметры полученных L-аспарагиназ Кинетические параметры полученных L-аспарагиназ. Для всех изученных ферментов характерна гиперболическая зависимость скорости гидролиза L-аспарагина от концентрации. Km для YpA в отношении L-аспарагина составила 17 мкМ, Vmax 4,8 мМ/мин, kcat=0,22 c–1. Величина Km для EcA составила также 17 мкМ, Km для WsA 54 мкМ. Значение Km RrA для Lаспарагина — 221 мкM, Vmax 5,9 мМ/мин, kcat=2,53 c–1 (табл. 10). Таблица 10. Кинетические параметры RrA и ее мутантных форм Фермент Km для Lаспарагина, мкМ Vmax, для L-аспарагина, Удельная мкМ/мин активность, МЕ/мг pI RrA 221±98 5,9±0,5 173 5,05 RrAD 237±70 9,7±0,5 170 5,39 RrAE 707±107 6,9±1,4 210 5,56 RrAC 717±98 6,5±1,2 209 5,37 RrAB 756±118 6,3±1,2 140 5,37 RrAJ 337±73 7,3±1,4 173 5,21 Как видно из табл. 10, при рН 7,5 точечные замены, повышающие pI RrA, увеличивают Vmax в отношении L-аспарагина всех мутантных форм RrA при одинаковой концентрации фермента, наибольшее изменение отмечено для RrAD — в 1,7 раза. Удельная активность RrAD и RrAJ не изменялась по сравнению с нативной RrA, RrAB снижалась на 20%, а RrAC и RrAE увеличивалась на 20%. При рН 9,35 удельная активность RrAD и RrAJ превосходила активность нативной RrA в 1,7 и 1,3 раза, соответственно. Значения Km для нативной RrA, RrAD и RrAJ оказались практически идентичными, величина Km RrAB была в 2,7 раза, а RrAE и RrAC — в 2,5 раза больше по сравнению с RrA. Мутантные формы EcA T89V и T89S имели сопоставимую или даже несколько меньшую Km по сравнению 87 с нативной формой, при этом активность мутанта T89V практически отсутствовала, а у T89S сохранялось около 20% активности от таковой у фермента дикого типа [261]. По литературным данным дезамидирование ErA по сайтам Asn41 и Asn281 существенно не изменяет удельной активности в отношении L-аспарагина (1062 и 924 МЕ/мг, соответственно, 908 МЕ/мг для дикой формы). Однако одновременная замена N41D и N281D достоверно увеличивает удельную активность до 1261 МЕ/мг. Мутация N41D несколько повышает kcat по сравнению с нативной ErA (657 с-1 против 565 с-1), в случае обеих мутаций kcat составляет 798 с1 . Увеличение числа α-спиралей по данным спектроскопии кругового дихроизма в случае замены N41D коррелирует с различиями kcat, но не Km [137]. Субстратная специфичность новых L-аспарагиназ. Опубликован целый ряд работ, подтверждающих роль отдельных аминокислотных остатков для L-глутаминазной активности. Формы ферментов с мутациями в Gly11, His87, Gly88, Gly57, Gln59, His183, His197 и Asn248 в EcA обладали сниженной L-глутаминазной активностью, которая обычно сопровождалась снижением L-аспарагиназной [43, 109, 137]. L-глутаминазная активность WsA, WsA-Hep и RrA составляет не более 0,1% от Lаспарагиназной, определить Km методом прямой несслеризации не представляется возможным [112]. L-глутаминазная активность YpA, аналогично EcA, не превышала 6% от Lаспарагиназной. Все изученные мутантные формы RrA обладали высокой специфичностью в отношении Lаспарагина. D-аспарагиназная активность для RrAE, RrAC, RrA, RrAJ, RrAD и RrAB вариантов составила 0,9; 1,2; 1,3; 1,4; 1,6 и 1,6% от L-аспарагиназной. L- и D-глутаминазная активность RrA и ee мутантных форм не превышала 0,01% от L-аспарагиназной. Основные физикохимические и каталитические свойства полученных и выделенных L-аспарагиназ обобщены в табл. 11. Полученные данные показывают, что YpA по основным физико-химическим и кинетическим параметрам, за исключением kcat, близка EcA. Сравнительные физикохимические характеристики YpA и EcA, обобщенные в табл. 11, показывают сходные значения оптимумов pH, изоэлектрических точек и кинетических констант для L-аспарагина, что соответствует данным о 74% гомологичности аминокислотных последовательностей. Активные центры YpA и EcA также совпадают: взаимодействующие с NH2-группой и карбоксильными группами субстрата Trp12, Gly59, Ser58, Trp89, Asp90, Ala114, Gln283; непосредственно участвующий в катализе Tyr25; важные для стабилизации нативного тетрамера EcA Tyr181 и Tyr326, a также Asn248, отвечающий за L-глутаминазную активность EcA и образующий водородную связь с остатком Asp90 [109, 110, 220]. На основании рассчитанных кинетических параметров можно предполагать наличие у YpA максимального противоопухолевого эффекта в сравнении с другими изученными L-аспарагиназами. 88 Таблица 11. Основные физико-химические свойства и кинетические параметры полученных L-аспарагиназ Параметр YpA RrA EwA WsA EcA Молекулярная масса мономера, кДа 36,5 18,1 36,5 34,8 36,9 Число аминокислотных остатков 345 172 346 330 348 Оптимум рН 7,7 9,2 9,0 8,5 7,2 pI 5,4 5,1* 8,1 7,8 5,0 Кm для Lаспарагина, мМ 0,017±0,001 0,22±0,01 kcat, c-1 kcat/Km (M-1c-1) 0,073±0,005 0,054±0,003 0,017±0,001 501,2 253,1 318,2 152,5 22,9 294,8×105 11,5×105 43,6×105 28,2×105 13,5×105 L-глутаминазная 5–6 <0,1 10–12 <0,1 ≈5 активность, % от Lаспарагиназной Примечание. Расчетные значения pI для мутантных форм RrA составили: RrA — 5,05; RrAF — 5,55; RrAG — 5,19; RrAD — 5,39; RrAC — 5,37; RrAH — 5,56; RrAI — 5,19; RrAJ — 5,21; RrAB — 5,37; RrAK — 5.61 (ProtParam, ‘‘http://www.expasy.org’’). Напротив, RrA по физико-химическим и кинетическим параметрам отличается от других ранее описанных L-аспарагиназ. В частности, относительно низкая Km (0,22±0,01 мМ), несмотря на внутриклеточную локализацию фермента, не позволяет однозначно отнести RrA к Lаспарагиназам I типа. Существуют и другие внутриклеточные ферменты, классифицированные как L-аспарагиназы II типа, например, из Saccharomyces cerevisiae [74]. С учетом этих данных RrA можно отнести к L-аспарагиназам II типа. По более жестким критериям, предложенным D.T. Bonthron и M. Jaskolski, которые основаны на особенностях первичной структуры, RrA относится к L-аспарагиназам I типа, поскольку вместо высококонсервативной для Lаспарагиназ II типа последовательности трех остатков 122 122 SADGP126 (EcA) содержит последовательность из SDA124 (RrA), характерную для L-аспарагиназ I типа [74]. Еще одной особенностью рекомбинантной RrA, роднящей ее с другими L-аспарагиназами II типа, является крайне низкая L-глутаминазная активность. Изучение физико-химических свойств показало перспективность дальнейшей разработки потенциального противоопухолевого препарата на основе WsA-Hep или WsA, обладающих низкой L-глутаминазной активностью, благоприятный профиль сохранения активности при 89 физиологических значениях рН. К положительным характеристикам RrA можно отнести короткую аминокислотную последовательность и крайне низкую L-глутаминазную активность, что определяет перспективность полученного фермента. Преимущества применяемой в настоящее время в клинической практике EcA не очевидны. YpA перед 90 Глава 5. Отдельные биологические характеристики полученных ферментов 5.1. Антигенные свойства и перекрестная иммуногенность новых Lаспарагиназ6 5.1.1. IgG-иммунный ответ Для оценки IgG-ответа были использованы охарактеризованные ранее субстанции YpA, RrA, WsA, EwA в сравнении с препаратом EcA. Выявленные титры антител представлены в табл. 12. Титры антител к антигенам, которыми мыши был проиммунизированы, выделены заливкой. Таблица 12. Иммуногенность L-аспарагиназ, IgG-ответ Группа/ антиген для иммунизации Контроль EcA WsA YpA RrA EwA EcA – + + ++ + + Сенсибилизируемый антиген WsA YpA RrA – – ++ + – – – – – +++ – – EwA – – – ++ ++ – – + – – – ++ Видно, что у мышей контрольной группы антитела ко всем изученным препаратам отсутствовали (титр <1/50). Из исследованных L-аспарагиназ наиболее иммуногенной оказалась YpA, которая единственная в условиях проведенного эксперимента вызывала образование антител в титре до 1/128000. L-аспарагиназы WsA, RrA и EwA проявляли близкую иммуногенность, однако EwA все же была несколько менее иммуногенна — 1/125– 1/16000 против 1/8000–1/64000 и 1/16000–1/32000 для WsA и RrA соответственно. Наименее иммуногенной оказалась L-аспарагиназа EcA (титры 1/500 и менее). Т.е. по степени снижения иммуногенности исследованные L-аспарагиназы можно распределить в следующей последовательности: YpA > RrA, WsA ≥ EwA > EcA. 5.1.2. IgМ-иммунный ответ Для оценки IgM-ответа использованы охарактеризованные ранее субстанции YpA, RrA, WsAHep, EwA в сравнении с препаратом EcA. Однократное в/в введение исследуемых Lаспарагиназ вызывало иммунный ответ у иммунизируемых животных, однако титр образующихся антител в среднем по группам не превышал 1/800, за исключением YpA: 1:400–1:1600 для YpA; 1:400–1:800 для RrA; 1:200–1:800 для EcA, EwA и WsA. Наиболее иммуногенной оказалась YpA, L-аспарагиназы WsA, RrA и EwA проявляли близкую 6 Эксперименты выполнены совместно с к.б.н. И.Н. Дьяковым, НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова 91 иммуногенность (табл. 13). При этом, наименее иммуногенным при этом оказался коммерческий препарат EcA. Таблица 13. Иммуногенность L-аспарагиназ, IgМ-ответ Группа/ антиген для иммунизации Контроль EcA WsA-Hep YpA RrA EwA Сенсибилизируемый антиген WsA-Hep YpA RrA EcA – ++ – + – – – – +++ + – – – – – +++ + + EwA – – + + +++ – – – + – – +++ 5.1.3. Перекрестная иммуногенность L-аспарагиназ Перекрестную реактивность можно оценивать относительно двух точек отсчета: Lаспарагиназы как антигена для иммунизации и L-аспарагиназы как мишени для образовавшихся антител. Для оценки перекрестной иммуногенности были использованы результаты экспериментов по оценке IgG и IgM-иммунного ответа при введении ферментов в дозах 300 мкг на мышь троекратно и 500 мкг однократно, а также результаты дополнительного эксперимента с использованием низкой дозы 50 мкг троекратно. L-аспарагиназа как антиген для иммунизации. Сыворотки мышей, троекратно иммунизированных YpA в дозе 300 мкг на мышь, были положительны к EcА и RrA и слабо положительны к WsA (см. табл. 12). С EcA реагировали также сыворотки мышей, иммунизированных WsA, RrA и EwA. Сыворотки мышей, иммунизированных EcA, реагируют с EwA, однако титр антител при этом очень низкий (1/250) и может не оказывать сильного влияния на элиминацию фермента. Антитела, вырабатываемые в ответ на введение EcA, обладают наименьшей перекрестной реактивностью. Сыворотки мышей, иммунизированных WsA, демонстрировали небольшую перекрестную реакцию только с EcA. Таким образом, при иммунизации ЕсА определяется незначительная перекрестная реакция IgG с EwA, но не с WsA, WsA-Hep, YpA или RrA. Вероятнее всего, это объясняется низкой иммуногенностью EcA. L-аспарагиназа как мишень для образовавшихся антител. Из представленных данных видно (табл. 12), что к EcA образуются IgG при введении любой L-аспарагиназы. C WsA связывались только антитела сыворотки мышей, иммунизированных YpA. Это может быть обсусловлено как наличием общих эпитопов, так и незначительных белковых примесей, полученных при выделении L-аспарагиназ в общей экспрессионной системе E. coli. К L-аспарагиназам WsA, WsA-Hep и RrA образуются антитела при введении YpA, причем в случае IgG-ответа титр антител к RrA может достигать 1/4000. При этом интенсивность реакции как с EcA, так и с 92 другими L-аспарагиназами пропорциональна интенсивности иммунного ответа. Наиболее выраженное связывание отмечается для YpA. Слабее всего с антителами, вырабатываемыми в ответ на другие L-аспарагиназы, реагирует EwA. При использовании низкой дозы 50 мкг троекратно во всех случаях подтверждена стандартная зависимость интенсивности реакции сыворотки от титра одноименного антигена, использованного для иммунизации и показано наличие перекрестной реакции сыворотки мышей, иммунизированных EcA, c YpA в высоких титрах. Наибольшую перекрестную реактивность имеют сыворотки крови мышей, получивших YpA — они давали перекрестную реакцию со всеми остальными препаратами L-аспарагиназ, кроме EwA — EcA, RrA, WsA. Сыворотки мышей, иммунизированных коммерческим препаратом EcA, давали перекрестную реакцию только с EwA (IgG-ответ, доза 300 мкг троекратно) и с YpA (IgG-ответ, доза 50 мкг троекратно, в высоких титрах). Сыворотки крови мышей, иммунизированных WsA, RrA и EwA, давали перекрестную реакцию только с EcA, а с другими препаратами не реагировали. Несоответствие перекрестной реактивности при рассмотрении одной и той же L-аспарагиназы в качестве антигена для иммунизации и мишени для антител можно объяснить различным расположением эпитопов, вызвавших образование антител (внутренние или наружные) или же наличием незначительного числа белковых примесей в полученных препаратах. Результаты изучения иммуногенности ферментов показали, что наиболее иммуногенна YpA, т.е. к этой L-аспарагиназе можно ожидать наиболее быстрое образование антител в высоких титрах. Наименее иммуногенной оказалась EcA, что предполагает возможность наиболее длительного ее применения без снижения клинической эффективности. Тем не менее, к EcA чаще всего образуются перекрестно реагирующие антитела при введении других L-аспарагиназ. Наименьшую перекрестную реактивность антитела проявляют к EwA и YpA. Учитывая данные проведенного анализа для оптимизации клинической эффективности применения L-аспарагиназ можно предложить использование WsA (WsA-Hep) или RrA после EcA (во второй линии терапии). Наиболее подходящей L-аспарагиназой для второй линии из отобранных представляется WsA (WsA-Hep), поскольку по сравнению с YpA она обладает существенно меньшей иммуногенностью, и антитела мышей после иммунизации WsA не реагируют с остальными L-аспарагиназами RrA, EwA и YpA. После иммунизации WsA-Hep было отмечено образование IgM против RrA и EwA в минимальном титре. 93 5.2. Основные фармакокинетические параметры 5.2.1. Элементы фармакокинетики L-лизин-α-оксидазы у мышей7 В качестве модельного фермента для оценки элементов фармакокинетики была выбрана LO, обладающая двойственным механизмом антипролиферативной активности. Определение выполнено с использованием LO удельной активностью 95 МЕ/мг, которую вводили животным однократно в/в в диапазоне доз 1,0–3,0 мг/кг. Для оценки количественного содержания LO в сыворотке крови мышей использована разработанная оригинальная методика модифицированного ИФА. В соответствии с ожидаемым диапазоном концентрации LO в сыворотке крови 100–3000 нг/мл были выбраны рабочее разведение сыворотки 1:160 000 и диапазон концентраций LO 50–320 нг/мл. Максимальная чувствительность методики составила 10 нг/мл при разведении сыворотки 1:320 000. Помимо ИФА, позволяющего определить концентрацию белка, было выполнено прямое определение каталитически активной LO в сыворотке крови. Результаты, измеренные ИФА и путем определения ферментативной активности в сыворотке крови мышей представлены на рис. 13. Рис. 13. Активность (■) и концентрация LO в сыворотке крови, определенная методом ИФА (♦), после однократного в/в введения фермента мышам в дозе 1,5 мг/кг. При многократном введении LO показано, что динамика изменения концентрации фермента в сыворотке крови не зависит от числа предшествующих введений при длительности курса 10 дней: концентрации LO на различные периоды наблюдения после 1-й и после 5-й инъекции Исследования проведены совместно с д.м.н. А.Н. Лукашевым, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова 7 94 существенно не отличались. Таким образом, курсовое введение с выбранным интервалом не сопровождается изменением фармакокинетической кривой, полученной при однократном введении. 5000 Концентрация в плазме крови, нг/мл 4000 3000 2000 1000 0 0 5 10 15 20 25 Время после введения, ч Рис. 14. Фармакокинетические профили LO в сыворотке крови мышей после однократного в/в введения. Дозы: ▲ — 3 мг/кг; ■ — 1,5 мг/кг; ♦ — 1 мг/кг (n=8 на каждую временную точку, χ ± SEM). На рис. 14 представлены усредненные для каждой группы животных фармакокинетические кривые, когда исследуемое соединение определяли 6-кратно на протяжении 24 ч после однократного введения LO. Вне зависимости от дозы снижение концентрации LO в крови носило ярко выраженный двухфазный характер: первоначально в смешанной фазе распределения и элиминации концентрация препарата снижалась быстрее, чем в фазе элиминации. Попытка нормирования концентраций LO в плазме крови относительно введенной дозы оказалась безуспешной и не привела к совмещению всех трех фармакокинетических кривых. Общим апроксимирующим уравнением двухчастевой модели с комплексными параметрами C(t)=A e–αt + B e–βt удовлетворительно описывались лишь профили, полученные при введении LO в дозах 1,0 и 1,5 мг/кг. Для дозы 3,0 мг/кг расчетные значения концентрации оказались значительно выше фактических, что обусловлено искажением линейной фармакокинетики и подтверждается достоверным уменьшением соотношения AUC/D при увеличении доз от 1,0 до 3,0 мг/кг (табл. 14). Поскольку LO выводится из организма после разрушения, T1/2 LO зависит от величины введенной дозы, и ее фармакокинетический профиль характеризуется нелинейной зависимостью, что типично для всех белков, подвергающихся ферментативному разрушению в кровотоке [95, 343]. LO быстро разрушается в кровотоке, на 95 что указывают значения плазменного клиренса (Cl) 0,81–1,13 мл/ч, констант скорости элиминации (Kel) 0,444–0,618 ч–1, а также относительно короткий Т1/2. Значения Kel и T1/2 для различных доз LO статистически не отличаются. Видно, что увеличение дозы с 1,5 до 3,0 мг/кг приводит к увеличению Cl, что снижает AUC, поэтому повышение дозы до 3,0 мг/кг не увеличивает экспозицию препарата. Полученные кинетические параметры LO сопоставимы с аналогичными показателями при в/в введении мышам ЕсА [275]. Таблица 14. Расчетные фармакокинетические параметры LO Cl, мл/ч Kel, ч–1 83,6 [48,82–117,30] AUC, мкг/ч/мл–1 4,34 0,91 0,499 3,2470 93,6 [59,19–128,10] 7,31 0,81 0,444 4,2519 67,2 [39,06–95,29] 6,88 1,13 0,618 Доза, мг/кг 1,0 C0, мкг/мл 2,1678 T1/2, мин, ДИ=95% 1,5 3,0 Таким образом, двумя различными методами определено содержание LO в плазме крови мышей после однократного в/в введения. Совпадение динамики изменения концентрации LO в крови, определенной методом ИФА, с динамикой уменьшения ферментативной активности свидетельствует о функциональной активности находящейся в кровотоке субстанции. Отсутствие достоверных различий при определении фармакокинетических параметров методами прямого измерения ферментативной активности в сыворотке крови и ИФА показано также для EcA [59]. Более того, по сравнению с измерением ферментативной активности в плазме крови ИФА позволяет с более высокой специфичностью определить содержание конкретного белка в низкой концентрации [186, 212]. Таким образом, использование разработанного метода позволяет рассчитать фармакокинетические характеристики фермента, учитывающие его специфическую активность. 5.2.2. Прогнозирование фармакокинетических параметров L-лизин-αоксидазы у человека Одной из основных фармакокинетических характеристик фермента, определяющей его функциональную активность в кровотоке, является Т1/2. Скорость выведения белкового препарата из плазмы крови не имеет установленной видовой специфичности и определяется, главным образом, его разрушением протеолитическими ферментами, а при повторных введениях еще и образующимися in vivo антителами [95]. Прогностическая ценность экспериментального изучения фармакокинетики лекарственного средства во многом определяется возможностью межвидовой экстраполяции полученных данных. Одним из методов такой экстраполяции является аллометрический подход Дедрика. В соответствии с этим подходом фармакокинетические профили агента у млекопитающих разных видов могут 96 быть сведены к одному, если для каждого вида используется не хронологическое, а «фармакокинетическое» время, которое определяется скоростью протекания фармакокинетических процессов, присущей данному виду [106]. Экстраполированная по методу Дедрика продолжительность Т1/2 LO для человека соответственно изученным дозам 1,0; 1,5 и 3,0 мг/кг у мышей при в/в введении составила, соответственно 8,84; 10,38 и 7,10 ч без достоверных различий. Теоретически рассчитанные значения Т1/2 LO при в/в введении в изученных дозах человеку сопоставимы с аналогичным параметром для ErA при в/м введении, но существенно меньше, чем Т1/2 нативной или пегилированной EcA при в/м введении [59]. 5.2.3. Элементы фармакокинетики L-метионин–γ-лиаз у мышей8 Фармакокинетические параметры MGL у мышей, рассчитанные путем прямой оценки остаточной ферментативной активности в плазме, представлены в табл. 15. Как и LO, MGL быстро разрушается и выводится из кровотока. Видно, что наименьшим клиренсом и наиболее длительной экспозицией в плазме крови человека обладает MGL С. sporogenes: значения Т1/2 и AUC в 1,5–2,0 раза выше, чем аналогичные параметры MGL С. freundii и C. tetani, что повидимому, связано с большей устойчивостью к протеазам плазмы крови. На рис. 15 представлены усредненные для каждой группы животных фармакокинетические кривые. Для всех ферментов снижение концентрации MGL в крови носило ярко выраженный двухфазный характер: первоначально в смешанной фазе распределения и элиминации концентрация препарата снижалась быстрее, чем в фазе элиминации. Профили всех MGL удовлетворительно описывались общим апроксимирующим уравнением двухчастевой модели с комплексными параметрами C(t)=A e–αt + B e–βt. Таблица 15. Расчетные фармакокинетические параметры MGL Cl, мл/ч Kel, ч–1 73,1 AUC, МЕ/ч/мл–1 10,98 1,04 0,569 6,25 86,5 12,99 0,88 0,481 6,25 123,3 18,55 0,62 0,337 C0, МЕ/мл 6,25 T1/2, мин C. tetani C. sporogenes MGL C. freundii Исследования проведены совместно с к.б.н. Е.А. Морозовой, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта 8 97 Рис. 15. Активность MGL в сыворотке крови мышей после однократного в/в введения в дозе 500 МЕ/кг. 1 — MGL С. sporogenes, 2 — MGL C. tetani, 3 MGL C. freundii. 5.2.4. Стабильность L–метионин-γ-лиаз в плазме крови человека Высокая стабильность в плазме крови человека может служить критерием выбора фермента из ряда аналогичных. Для выбора наиболее стабильного фермента были использованы образцы MGL из трех источников: С. freundii, С. tetani и С. sporogenes. Исходная удельная ферментативная активность в начале эксперимента составляла 9,43, 4,07 и 1,16 МЕ/мл для MGL С. freundii, С. tetani и С. sporogenes. При инкубации в плазме крови была выявлена активация всех ферментов в течение 1–2 ч с повышением активности до 125–190% от исходных значений, а к 4 ч инкубации уровень активности всех ферментов возвращался к изначальному, а активность MGL C. tetani снижалась до 25% от исходного уровня. При этом активность в контрольных образцах (в буферном растворе) не снижалась (рис. 16). Полученные результаты могут быть связаны с влиянием электролитного и белкового состава плазмы крови на определение активности MGL или способностью MGL к активации компонентами плазмы крови. В любом случае в течение 4 ч была показана высокая стабильность MGL С. freundii и С. sporogenes в плазме крови. При оценке уровня активности MGL C. tetani и MGL С. sporogenes в плазме крови человека через 24 ч после инкубации было выявлено резкое уменьшение активности до 5% от исходной. MGL С. freundii сохраняла активность через 24 ч после инкубации на уровне 90%. Это позволяет предположить, что протеолитические ферменты плазмы крови человека не влияют на стабильность MGL С. freundii. 98 1 Рис. 16. Изменения активности различных MGL в плазме крови человека при инкубации в течение 4 ч. 1 — MGL С. freundii, 2 — MGL С. tetani, 3 — MGL С. sporogenes. Тонкими линиями показана динамика активности MGL в контрольных образцах. Рассчитаные по методу Дедрика значения T1/2 для человека на основании определенных данных у мышей составляют для MGL С. freundii, C. tetani и С. sporogenes 9,1; 10,4 и 13,7 ч. Как и в случае LO, теоретически рассчитанные значения Т1/2 MGL при в/в введении сопоставимы с аналогичным параметром для ErA при в/м введении [59]. 99 Глава 6. Прескрининг на культурах опухолевых клеток новых ферментов различной природы 6.1. Цитотоксичность новых L-аспарагиназ На ряде сигнальных культур опухолевых клеток человека была оценена цитотоксичность YpA, RrA и WsA-Hep в сравнении с EwA и EcA. Результаты экспериментов приведены в табл. 16. Все изученные ферменты демонстрировали достоверную цитотоксичность с разбросом IC50 от 1 до 50 МЕ/мл для отдельных клеточных культур. К действию L-аспарагиназ более чувствительной оказалась линия эритромиелобластного лейкоза человека K562, IC50=0,8–11,1 МЕ/мл. Таблица 16. Значения IC50 L-аспарагиназ на различных линиях клеток опухолей человека IC50, МЕ/мл Линии клеток YpA RrA WsA-Hep EcA EwA MDA-MB-231 10,0 34,6 – 14,3 50,0 MCF7 9,6 43,3 35,1 10,9 35,1 DU 145 – 9,2 – 2,3 19,6 К-562 – 1,8 6,6 0,8 11,1 А549 2,2 – – – – – – 7,0 – – SKOV-3 1 2 Рис. 17. Цитотоксическая активность полученных L-аспарагиназ на клетках линии К562. 1 — EwA, 2 — RrA, 3 — EcA. 100 RrA EcA EwA 10 МЕ/мл 2 МЕ/мл 0,4 МЕ/мл Контроль Рис. 18. Цитотоксическая активность RrA, EcA, EwA на клетках эритробластного лейкоза человека линии К562 в сравнении с интактным контролем. Окраска МТТ. Увеличение ×200. L-аспарагиназы бактериального происхождения II типа — наиболее хорошо изученная группа ферментов, цитотоксичность которых подтверждена в целом ряде работ (см. главу 1). Целью настоящего исследования было изучение цитотоксичности RrA I типа, которая, согласно традиционным представлениям, ее не проявляет. В ходе экспериментов было установлено, что RrA высоко цитотоксична для клеток линий К 562 и DU 145, на К 562 достоверную цитотоксическую активность наблюдали при концентрациях 0,016–50 МЕ/мл. Как следует из данных, представленных на рис. 17 и 18, RrA обладает сопоставимой с EсA цитотоксической 101 активностью: IC50=1,80 против 0,82 МЕ/мл, но RrA на порядок превосходит цитотоксичность EwA, для которой IC50=11,06 МЕ/мл. 1 2 3 Рис. 19. Цитотоксическая активность полученных аспарагиназ на клетках рака предстательной железы человека линии DU 145. 1 — EwA, 2 — RrA, 3 — EcA. RrA EcA EwA 10 МЕ/мл 2 МЕ/мл Контроль Рис. 20. Цитотоксическая активность RrA, EcA, EwA на клетки рака предстательной железы линии DU 145 в сравнении с интактным контролем. Окраска МТТ. Увеличение ×100. 102 На клетках DU145 RrA продемонстрировала цитотоксическую активность в концентрациях 0,4– 50 МЕ/мл. (рис. 19, 20). При этом близкий эффект RrA и EcA получен при концентрациях 10 и 50 МЕ/мл. Соответственно, для RrA IC50=9,19 МЕ/мл, для EcA IC50=2,33 МЕ/мл, для EwA IC50=19,61 МЕ/мл. Тестирование цитотоксичности на клетках линии MDA-MB-231 показало, что диапазон эффективно действующих концентраций полученных ферментов находится в пределах 2–50 МЕ/мл. При высоких концентрациях RrA и EcA (10–50 МЕ/мл) выживаемость клеток составляет 44–48% и 51–54%, соответственно, однако диапазон ингибирующих концентраций EcA существенно шире и составляет 0,0016–50 МЕ/мл. Для RrA IC50=34,62 МЕ/мл, для EcA — 14,32 МЕ/мл, для EwA — 50,01 МЕ/мл. 2 3 1 Рис. 21. Цитотоксическая активность на клетках рака молочной железы человека линии MDAMB-231. 1 — EwA, 2 — RrA, 3 — EcA. Из всех использованных в исследовании культур клеток менее чувствительной к RrA оказалась MCF7. Диапазон ингибирующих концентраций RrA составил 10–50 МЕ/мл, IC50=43,30 МЕ/мл в сравнении с EcA (диапазон 0,016–50 МЕ/мл) и EwA (диапазон 2–50 МЕ/мл). В отличие от EcA (IC50=10,94 МЕ/мл), коинкубация с EwA в диапазоне IC50 >50 МЕ/мл не дала значимого угнетения пролиферации этой линии клеток (рис. 22, 23). 103 2 1 3 Рис. 22. Цитотоксическая активность на клетках линии рака молочной железы человека MDAMB-231. 1 — EwA, 2 — RrA, 3 — EcA. RrA EcA EwA 10 МЕ/мл Контроль Рис. 23. Цитотоксическая активность RrA, EcA, EwA на клетки линии MCF7 в сравнении с интактным контролем. Окраска МТТ. Увеличение ×100. Таким образом, анализ значений IC50 изученных ферментов свидетельствует о том, что RrA более цитотоксична чем EwA, но уступает EcA. Для YpA и WsA-Hep показано наличие цитотоксичности в стандартном для L-аспарагиназ диапазоне ингибирующих концентраций. Все изученные новые L-аспарагиназы (YpA, WsA-Hep и RrA) прошли прескрининг, показав наличие цитотоксической активности на линиях опухолевых клеток различного генеза, и перспективны для скрининга in vivo. 104 6.2. Цитотоксичность L-метионин–γ-лиаз из новых источников MGL принадлежат к группе ферментов, расщепляющих аминокислоты, однако в отличие от Lаспарагиназ публикаций об их цитотоксичности относительно немного (см. главу 1). Наиболее полно охарактеризованной является MGL P. putida, оказывающая цитотоксический эффект в отношении целого ряда опухолевых клеток в диапазоне концентраций 0,04–0,2 МЕ/мл против 0,75–4 МЕ/мл для нормальных клеток при коинкубации в течение 4 сут [327]. В этой связи особый интерес вызывала цитотоксичность MGL из новых источников и проведение прямых сравнительных экспериментов для сравнительной оценки цитотоксичности ферментов различного происхождения на панели культур клеток. Использованы MGL С. freundii, С. sporogenes, C. tetani. Расчетные значения IC50 представлены в табл. 17. Наиболее чувствительной к действию ферментов оказались клетки линии рака предстательной железы РС3 и эритробластного лейкоза человека К562: IC50 составили 0,1–0,4 МЕ/мл и 0,4–1,3 МЕ/мл, соответственно. Чувствительность клеток K-562 и MCF7 к MGL отличается значительной вариабельностью, что можно объяснить различной потребностью клеток в метионине. К MGL оказались малочувствительными линии опухолевых клеток человека: рак предстательной железы LNCaP, рак молочной железы SKBR3, меланома MeWo и мышиная меланома B16F10. Таблица 17. Значения IC50 MGL для культур опухолевых клеток человека и мышей Культуры клеток K-562 PC-3 LNCaP MCF7 L5178Y SKOV-3 SKBR-3 1,3 0,1 >2,9 0,5 1,7 13,3 >21,4 IC50, МЕ/мл MGL C. sporogenes 0,9 0,4 >2,9 0,04 >2,9 2,4 >5 MeWo >21,4 >5 7,5 MTP 1,4 >5 64 B16F10 >21,4 >5 >37,5 MGL С. freundii MGL C. tetani 0,4 – >6,2 3,2 – 5,3 >37,5 Для выбора МGL с максимальной цитотоксичностью значения IC50 для K-562, MCF7, SKOV-3, PC-3 были усреднены и составили 3,82 МЕ/мл для MGL С. freundii, 0,94 МЕ/мл для MGL Cl. sporogenes, 3,16 МЕ/мл для MGL Cl. tetani. Указанный подход не является традиционным, но позволяет отобрать более перспективный фермент уже в пилотных экспериментах на 105 сопоставимых по условиям культивирования клетках, сравнивая уровень цитотоксичности агентов одной группы [327]. Показано, что MGL обладают сопоставимой цитотоксичностью по сравнению с известными ферментами, в частности, EcA. Определение кинетических параметров (Кm) и цитотоксической активности MGL из трех бактериальных источников показало, что ферменты из C. sporogenes и P. putida близки по уровню цитотоксичности. Результаты тестирования на культурах клеток K562, МCF7 и PC3 позволяют считать отобранные MGL перспективными для изучения in vivo и рекомендовать использованную тест-панель культур клеток человека для прескринигнга новых потенциально активных ферментов из этой группы. 6.3. Цитотоксичность L-фенилаланин:аммиак-лиазы Rhodosporidium toruloides PAL R. toruloides обладала выраженной цитотоксичностью в отношении ряда линий опухолевых клеток человека и мышей (табл. 18). Уровень цитотоксичности сопоставим с EcA (рис. 24), L-аргининдеиминазой и онконазой [197, 296]. Наиболее чувствительными к действию PAL оказались культуры MCF7, SKOV-3 и K-562 с IC50 1,9–2,5 МЕ/мл. Для линий MDA-MB231, Hep G2 и LBR2 цитотоксичность PAL проявлялась при IC50 >10 МЕ/мл. Проведенные эксперименты подтвердили перспективность дальнейшего изучения PAL in vivo в качестве потенциального противоопухолевого агента. Таблица 18. Цитотоксичность PAL Культура клеток IC50 МЕ/мл MCF7 2,0 SKOV-3 1,9 K-562 2,5 DU 145 7,3 MDA-MB-231 >10 Hep G2 >10 LBR2 >10 106 a b Рис. 24. Цитотоксичность PAL (■) и EcA (♦) на культурах клеток рака молочной железы человека MCF7 (a) и рака предстательной железы человека DU 145 (b). 6.4. Цитотоксичность L-лизин–альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai LO обладала высокой цитотоксичностью на различных культурах опухолевых клеток человека, включая рак предстательной железы линии PC-3, яичников SKOV-3, толстой кишки LS 174T и HT-29, молочной железы MCF7 и эритробластного лейкоза K-562 (табл. 19). На всех указанных культурах клеток значимая цитотоксичность была выявлена в широком диапазоне при прямой зависимости от концентрации, что свидетельствует о высокой избирательности антипролиферативного эффекта LO. Клетки рака молочной железы и яичников оказались более чувствительными к LO, чем клетки рака предстательной железы. Наиболее чувствительны к LO клетки линии K-562: IC50 3×10-6 МЕ/мл (3,2×10-8 мг/мл). В максимальной из испытанных концентраций (10-1 МЕ/мл) LO приводила практически к 100% гибели клеток линии LS174T, при концентрации 10-3 МЕ/мл отмечалась гибель не менее 70% клеток, а 50% лизис опухолевых клеток линии LS 174T наблюдался при воздействии LO в концентрации 10-7 МЕ/мл. На клетки линии НТ-29 LO также оказывает достоверное антипролиферативное действие в диапазоне концентраций 1,0–0,01 МЕ/мл. В концентрациях ниже 1,0×10-3 МЕ/мл LO практически не оказывала влияния на пролиферативную активность клеток рака толстой кишки человека НТ-29. Таблица 19. Цитотоксичность LO на различных линиях опухолевых клеток Культуры клеток HT-29 LS 174T MCF7 SKOV-3 РС-3 K-562 IC50 МЕ/мл 7,8×10-2 5,3×10-5 7,9×10-5 9,3×10-5 2,4×10-4 3,0×10-6 Мг/мл 8,2×10-4 5,6×10-7 8,4×10-7 9,9×10-7 2,6×10-6 3,2×10-8 107 Полученные нами данные согласуются с литературными данными: по сравнению с другими противоопухолевыми ферментами, LO оказалась на несколько порядков более активной, чем L-аспарагиназы, L-аргининдеиминаза и онконаза [197, 296]. Полученные данные подтверждают перспективность доклинического изучения LO в качестве потенциального противоопухолевого средства. 6.5. Цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius Прескрининг рибонуклеазы Bacillus intermedius (биназы) проведен в сравнении с панкреатической РНКазой А. Показано (табл. 20), что в изученном диапазоне концентраций биназа практически не проявляет цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток. Лишь при тестировании на линии клеток MCF7 биназа была более активна, чем РНКаза А. Относительно низкий эффект рибонуклеаз в изученных концентрациях, возможно, связан с произвольным выбором линий клеток для первичного тестирования. Таблица 20. Цитотоксичность биназы в сравнении с РНКазой А Ферменты Биназа РНКаза А K-562 >0,2 0,6 IC50, МЕ/мл LNCaP >0,2 >1 PC-3 >0,2 >1 MCF7 0,05 0,4 L5178Y >0,2 1,0 6.1.6. Отбор ферментов на основании данных прескрининга Прескрининг на культурах опухолевых клеток для большинства противоопухолевых препаратов является наиболее простым способом первичной оценки антипролиферативного эффекта субстанции [301]. Кроме того, для ферментов, разрушающих аминокислоты, тестирование чувствительности на широкой панели клеточных линий позволяет установить зависимость эффекта от метаболических особенностей клеток — дефицита тех или иных ферментов или биохимическую мишень [77, 223, 322, 327, 351]. Исследованные субстанции различных белковых препаратов с ферментативной активностью дают существенный разброс диапазонов активных концентраций (и при сравнительной оценке зависимости цитотоксичности от удельной активности, и зависимости цитотоксичности от массовой концентрации фермента) для различных культур клеток. Цитотоксичностью в минимальной концентрации обладала только LO. Это может быть связано как с двойственностью механизма действия LO и прямым цитотоксическим эффектом пероксида водорода, который не образуется при использовании других изученных ферментов, так и с тем фактом, что L-лизин является незаменимой аминокислотой для клеток человека. L-аспарагиназы, PAL и MGL проявили сопоставимую цитотоксичность (при сравнении по 108 концентрации фермента). При этом среди MGL наиболее активным оказался фермент из C. sporogenes. Изученные L-аспарагиназы в порядке убывания цитотоксичности располагаются следующим образом: EcA ≈ YpA ≈ RrA ≈ WsA-Hep > ErA. Рибонуклеазы не обнаружили достоверной цитотоксичности, и для их изучения требуются дополнительные исследования. Для дальнейшего экспериментального изучения по результатам первичной оценки цитотоксичности на культурах клеток наиболее интересными представляются LO (как фермент с избирательной цитотоксичностью), RrA (как первый представитель внутриклеточных L-аспарагиназ с доказанным антипролиферативным эффектом), PAL (как фермент из нового класса с неизвестными характеристиками антипролиферативного эффекта) и MGL Cl. sporogenes (как обладающий наиболее высокой стабильностью в плазме крови и цитотоксичностью из группы MGL). 109 Глава 7. Противоопухолевая активность новых ферментов различной природы и механизма действия 7.1. Скрининг противоопухолевой активности отобранных ферментов 7.1.1. Скрининг и диапазон терапевтических доз новых L-аспарагиназ По результатам исследований физико-химических, кинетических свойств и цитотоксической активности для скрининга in vivo были отобраны три новые L-аспарагиназы: YpA, RrA и ее мутантные формы, а также WsA-Hep. В качестве ферментов сравнения были использованы EcA, EwA и WsA. В качестве сигнальной модели для скрининга был выбран высокочувствительный к L-аспарагиназам лимфаденоз Фишера L5178Y [38]. L-аспарагиназа Yersinia pseudotuberculosis (YpA). Для сравнительной оценки противоопухолевой активности на модели L5178Y использовали стандартный режим ежедневного 10-кратного введения (10-кратно с интервалом 24 ч, начало лечения через 24 ч после трансплантации клеток) и охарактеризованную ранее эффективную разовую дозу EcA 1000 МЕ/кг, суммарная доза 10 000 МЕ/кг [38]. YpA вводили в аналогичном режиме. Применение ЕсА вызывало 31% полных ремиссий (излечение) при существенном УПЖ=84% у неизлеченных животных (n=13, p<0,05). YpA была менее эффективна, УПЖ=36%, полных ремиссий 15% (n=13, p<0,05) (рис. 25). Большая вариабельность индивидуальной ПЖ в группе YpA привела к отсутствию значимых различий показателей эффективности с EcA (p>0,05). Переносимость всех видов лечения была удовлетворительной, масса тела мышей практически не уменьшалась. Таким образом, сделан вывод о том, что YpA при близких к EcA кинетических параметрах проявляет сопоставимый противоопухолевый эффект, но не превосходит его в примененной дозе. Рис. 25. Кривая выживаемости мышей 100 DBA/2 с лимфаденозом Фишера L5178y. 80 1 — YpA (n=13), 2 — контрольная группа (n=11). YpA вводили на 1–10 сутки после 60 трансплантации лейкоза. 40 По оси ординат: выживаемость, %, по оси абцисс: продолжительность жизни, 20 1 2 дни 0 10 20 L-аспарагиназа 30 40 Time Rhodospirillum 50 60 rubrum (RrA) и ее мутантные формы. Изучение противоопухолевой активности RrA проводили в диапазоне доз в сравнении с EcA и EwA. Использован охарактеризованный ранее диапазон разовых терапевтических доз EcA от 500 до 110 8000 МЕ/кг, суммарные дозы 5000–80000 МЕ/кг, 10-кратный курс лечения [38]. Разовые дозы EwA составляли от 1000 до 8000 МЕ/кг, суммарные дозы — 10000–80000 МЕ/кг. Для RrA была использована максимальная разовая доза 16000 МЕ/кг, суммарная доза — 160 000 МЕ/кг. Результаты представлены в табл. 21. Таблица 21. Сравнительная эффективность L-аспарагиназ RrA и EwA на модели лимфаденоза Фишера Разовая* доза, УПЖ, % Излечение МЕ/кг RrA EwA EcA RrA EwA EcA 500 12 – 45 0/7 – 2/8 1000 21 7 84* 0/8 0/8 4/13 2000 26 8 118 0/8 0/8 6/8 4000 72** 12 102 1/7 0/8 4/7 8000 86** 71** 123 2/8 1/8 5/8 16000 125** – – 4/8 – – Примечание: *в/бр ежедневно 10-кратно, ** p <0,05. Из полученных данных следует, что эффективность RrA и EwA в изученных дозах была практически одинаковой, при максимальной разовой дозе 8000 МЕ/кг УПЖ=86 и 71%, а излечение — 25 и 13%, соответственно. Уменьшение дозы приводило к снижению эффекта, при этом EwA в разовой дозе 4000 МЕ/кг была неэффективной (УПЖ=12%), а RrA вызывала достоверное УПЖ=72% (p<0,05) и излечение 14% мышей. EcA была более эффективной, чем EwA или RrA, вызывая УПЖ=84–123% независимо от величины примененной дозы в диапазоне 1000–8000 МЕ/кг с излечением 31–75% мышей. Снижение разовой дозы EcA до 500 МЕ/кг приводило к уменьшению эффекта по обоим критериям. Таким образом, терапевтические дозы RrA и EcA отличаются примерно на порядок: для достижения сопоставимого эффекта доза RrA должна быть примерно в 10 раз больше дозы EcA. Переносимость лечения обоими ферментами была удовлетворительной, при применении препаратов в разовых дозах ≤4000 МЕ/кг масса тела мышей практически не снижалась. Через сутки после окончания лечения потеря массы тела мышей составила ≤19% (p<0,05). Масса селезенки также практически не менялась. Данные, полученные при 10-кратном введении агентов, показывают, что в случае EcA достоверное уменьшение массы тела мышей возникает при разовых дозах >8000 МЕ/кг, тогда как для RrA или EwA эта доза была переносима без похудания мышей. 111 Мутантные формы RrA (RrAD, RrAE, RrAB) были изучены в диапазоне разовых доз 1000– 4000 МЕ/кг, суммарные дозы 10000–40000 МЕ/кг. Результаты представлены в табл. 22. Ни для одной из мутантных форм не удалось получить большего эффекта, чем для нативной RrA. Переносимость всех видов лечения была удовлетворительной, масса тела мышей не снижалась. Таблица 22. Выживаемость мышей с лимфаденозом Фишера после 10-кратного курса лечения мутантными формами RrA Разовая доза, УПЖ, % МЕ/кг RrA RrAD RrAE RrAB 1000 21 30 14 19 2000 26 17 30 24 4000 72* 60* 32 40* Примечание: *различия с контролем достоверны, p ≤0,05 (n=7). Средняя продолжительность жизни мышей в контрольной группе составила 16,7 дней. В противоположность существующим представлениям об отсутствии антипролиферативного эффекта у бактериальных L-аспарагиназ I типа [192, 367], результаты исследования показали, что внутриклеточная RrA обладает подобным действием. Иллюстрацией является значимое ингибирование лимфаденоза Фишера in vivo и высокая цитотоксичность в отношении культур клеток опухолей человека: эритромиелолейкоза К562, рака предстательной железы DU145 и двух штаммов рака молочной железы MDA-MB-231, MCF7. Антипролиферативная активность RrA в диапазоне разовых доз 4000–8000 МЕ/кг превышает эффект EwA. Описанное в литературе отсутствие антипролиферативного эффекта in vivo у L-аспарагиназ I типа Pseudomonas geniculata и L-глутаминазы-L-аспарагиназы Pseudomonas acidovorans можно отнести на счет недостаточно эффективной схемы применения и/или невысокой чувствительности лимфомы Гарднера 6C3HED к L-аспарагиназам [192, 367]. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что обнаружена и выделена первая внутриклеточная противоопухолевая L-аспарагиназа I типа, короткая аминокислотная последовательность и крайне низкая L-глутаминазная активность которой предполагают высокую избирательность антипролиферативного действия. Из-за отсутствия значимых преимуществ перед EcA этот фермент можно рассматривать как новую L-аспарагиназу, перспективную для второй линии лечения в случае прогнозируемой иммунологической резистентности. L-аспарагиназа Wolinella succinogenes, конъюгированная с гепаринсвязывающим пептидом (WsA-Hep). Изучение противоопухолевой активности WsA-Hep проводили в диапазоне доз в 112 сравнении с нативной WsA и EcA в стандартном 10-кратном режиме введения. Использован охарактеризованный ранее диапазон разовых терапевтических доз EcA от 1000 до 8000 МЕ/кг, суммарные дозы 10000–80000 МЕ/кг. Для уточнения минимальной эффективной дозы изучена противоопухолевая эффективность WsA-Hep в диапазоне разовых доз от 75 до 500 МЕ/кг. Результаты представлены в табл. 23. Таблица 23. Сравнительная эффективность L-аспарагиназы WsA-Hep c WsA и EcA на модели лимфаденоза Фишера Разовая* УПЖ, % Излечение доза, МЕ/кг WsA-Hep WsA EcA WsA-Hep WsA 75 29** 48** н/д 0/7 1/7 н/д 125 80** 64** н/д 1/7 0/7 н/д 250 113 84** 95** 5/7 0/7 2/7 500 – 61** 78** 7/7 4/7 4/7 1000 77 92** 66** 5/7 4/6 3/7 2000 – 87** 102** 7/7 5/7 3/7 4000 – н/д 89** 7/7 н/д 4/7 8000 – н/д 103** 7/7 н/д 4/7 EcA Примечание: *в/бр ежедневно 10-кратно, ** p <0,05. К 21-м суткам эксперимента мыши контрольных групп пали при прогрессировании опухолевого процесса (адинамия, выраженный асцит), в то время как все мыши, получившие WsA-Hep, WsA или EcA, оставались живыми без каких-либо признаков заболевания. На 27–43 сутки в группе EcA началась гибель мышей от опухоли, при этом в группе WsA-Hep, получивших лечение в дозах 2000; 4000 или 8000 МЕ/кг, была зафиксирована полная ремиссия (излечение). Таким образом, WsA-Hep в разовых дозах 2000; 4000 и 8000 МЕ/кг оказывает значимый достоверный противоопухолевый эффект, превышающий эффективность препарата сравнения EcA по критерию излечения. По сравнению с WsA применение WsA-Hep в дозе 2000 МЕ/кг было достоверно более эффективным по показателю излечения. Высокий процент излечения для WsA-Hep в дозе 2000 МЕ/кг при 10-кратном курсе на уровне 100% был воспроизводим. Дальнейшее снижение дозы WsA-Hep приводило к снижению эффекта: излечение при разовых дозах 500; 250; 125 и 75 МЕ/кг составило 100, 71, 14 и 0%, соответственно. Таким образом, диапазон однократных терапевтических доз WsA-Hep составляет 125–8000 МЕ/кг (суммарные дозы 1250–80000 МЕ/кг), при этом дозы выше 500 МЕ/кг (суммарные дозы 5000 МЕ/кг и более) могут давать излечение 100% мышей. 113 WsA во всех изученных дозах не приводила к 100% излечению, уровень которого составил от 0 до 5 из 7 животных, при значительном УПЖ павших от опухолевого процесса мышей — от 61 до 92%. Существенных отличий по суткам гибели для животных в группах WsA-Hep и WsA не наблюдалось. Переносимость терапии была удовлетворительной: гибели животных от токсичности не отмечали, потеря массы тела в процессе лечения составила не более 10%. Аутопсия пролеченных животных показала отсутствие каких-либо патологических изменений. Для оценки чувствительности эффекта к кратности введения WsA-Hep в сравнительном эксперименте была оценена эффективность 5-кратного введения WsA-Hep или EcA c интервалом 48 ч (табл. 24). При использовании суммарных доз WsA-Hep 5000 и 10000 МЕ/кг было получено 100% излечение, применение аналогичных доз EcA давало излечение только 5 и 6 мышей из 7, соответственно. Таблица 24. Сравнительная эффективность L-аспарагиназы WsA-Hep c EcA на модели лимфаденоза Фишера при 5-кратном внутрибрюшинном введении Разовая* УПЖ, % Излечение доза, МЕ/кг WsA-Hep EcA WsA-Hep EcA 1000 – 87 7/7 5/7 2000 – 60 7/7 6/7 Примечание: *в/бр 5-кратно с интервалом 48 ч, ** p <0,05. Таким образом, противоопухолевого лимфаденозом в серии эффекта Фишера в экспериментов WsA-Hep, стандартных подтверждено выражающегося условиях в наличие излечении эксперимента. достоверного животных Диапазон с разовых терапевтических доз составляет от 1000 до 8000 МЕ/кг при 10-кратном в/бр введении. Использование разовых доз от 2000 до 8000 МЕ/кг дает 100% излечение при отсутствии признаков токсического действия. Эффективность WsA-Hep превышает таковую WsA в выбранном диапазоне доз: так, WsA не дает 100% излечения мышей. Попытка воспроизвести полученный эффект на малочувствительной к EcA модели в/бр лимфолейкоза Р388 у мышей DBA2 оказалась безуспешной. При использовании выбранного режима применения ни один из ферментов не дал достоверного излечения. УПЖ при использовании EcA, WsA и WsA-Hep в средних и средне-высоких терапевтических дозах составила 14, 32 и 0–19%, соответственно. Достоверное пограничное (р <0,05) УПЖ отмечали в группах EcA c разовой дозой 8000 МЕ/кг и WsA-Hep 2000 МЕ/кг. Достоверное биологически значимое УПЖ=32% отмечали при использовании WsA в дозе 4000 МЕ/кг. Переносимость всех 114 видов терапии была удовлетворительной, гибели животных от токсичности не отмечали (табл. 25). Таблица 25. Сравнительная эффективность L-аспарагиназы WsA-Hep c WsA и EcA на модели лимфолейкоза Р388 Разовая* доза, УПЖ МЕ/кг WsA-Hep WsA EcA 2000 19** н/д н/д 4000 0 32** 14 8000 14 н/д 14** Примечание: *в/бр ежедневно 10-кратно, ** p< 0,05, n=8. По результатам эксперимента подтверждена известная по литературным данным низкая чувствительность лимфолейкоза мышей Р388 к EcA [38]. Эффективность WsA-Hep в диапазоне изученных доз не уступает активности EcA по критерию УПЖ, но и не превышает ее. Продолжительность жизни мышей после применения немодифицированной WsА в средней терапевтической дозе 4000 МЕ/кг оказалось достоверно лучше не только контрольной группы (УПЖ=32%), но также и WsA-Hep в аналогичной дозе и EcA в дозе 8000 МЕ/кг. 7.1.2. Оценка антипролиферативной активности in vivo Lфенилаланин:аммиак-лиазы PAL (30 МЕ/мл) в разовых дозах 200 или 400 МЕ/кг вводили мышам в/в 5-кратно на 1, 3, 5, 7, 9 сутки после трансплантации лимфаденоза Фишера. После лечения независимо от величины примененной дозы выживаемость мышей не превышала УПЖ=12–16% (различия с контрольной группой недостоверны, р >0,05), и была идентична PAL из Rhodotorula glutinis [50] (рис. 26). У мышей, получивших PAL, не было отмечено каких-либо признаков непереносимости терапии, гибели животных от токсического действия не было. Настоящее исследование показало, что PAL из Rhodosporidium toruloides обладает невысокой противоопухолевой активностью на лимфаденозе Фишера. С точки зрения физико-химических характеристик, PAL отвечает необходимым требованиям для попытки разработки на ее основе противоопухолевого препарата. Так, она имеет высокую ферментативную активность при физиологическом уровне pH, достаточную ермостабильность in vivo и другие физикохимическиие характеристиками, важными для энзимотерапии. Для уточнения перспектив ее применения в качестве противоопухолевого средства необходимо развернутое доклиническое исследование противоопухолевой активности с поиском чувствительных моделей. 115 Рис. 26. Выживаемость мышей DBA/2 с лимфаденозом Фишера L5178y под действием PAL. 1 — контрольная группа (n=8), 2 — 200 МЕ/кг 5-кратно через 48 ч (n=8), 3 — 400 МЕ/кг 5-кратно через 48 ч (n=8). По оси ординат: выживаемость, %, по оси абцисс: продолжительность жизни, дни Существенную информацию для понимания механизмов действия и определения потенциально чувствительных опухолей может дать изучение биохимических особенностей различных опухолевых клеток с выявлением наиболее чувствительных к дефициту L-фенилаланина. Для поиска возможной биохимической мишени с целью повышения антипролиферативной активности целесообразно проведение анализа третичной структуры различных PAL, выявление активных центров и антигенных эпитопов с целью отбора фермента с наиболее привлекательными терапевтическими характеристиками. 7.1.3. Оптимизация схемы внутривенного введения противоопухолевого фермента L-лизин–альфа-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai9 По результатам скрининга LO была охарактеризована как перспективный противоопухолевый фермент, проявляющий антипролиферативную активность in vitro и in vivo при многократном в/бр введении в отношении опухолей, не чувствительных к L-аспарагиназам [38]. Первоначально для LO был предложен режим многократного в/бр введения с фиксированными интервалами между инъекциями. LO при монотонном 5-кратном в/бр введении с интервалами 24 или 48 ч в разовых дозах 100–350 МЕ/кг вызывала умеренный противоопухолевый эффект на Ca755 (ТРО=80%) и Р388 (УПЖ=22%) без каких-либо побочных эффектов. С целью отработки оптимального в/в режима использования LO были изучены два режима: «монотонный» с одинаковой разовой дозой на каждую инъекцию с интервалами 48 ч или 24 ч и «дискретный» с высокой стартовой дозой 100–200 МЕ/кг и последующим многократным введением ½ или ⅔ от стартовой дозы. В «монотонном» режиме ЛО вводили 3-кратно в разовых дозах от 150 до 200 МЕ/кг (суммарно 450–300 МЕ/кг); 4-кратно в разовой дозе 150 МЕ/кг (суммарно 600 МЕ/кг) или 5кратно в разовых дозах от 35 до 150 МЕ/кг (суммарно 175–750 МЕ/кг). 9 Эксперименты выполнены совместно с Седаковой Л.А., РОНЦ им. Н.Н. Блохина 116 В «дискретном» режиме ЛО вводили только 5-кратно с интервалом 48 ч, дозовый ряд 200– 75–75–75–75 МЕ/кг (cуммарно 500 М/кг); дозовый ряд 150–100–100–100–100 МЕ/кг (cуммарно 550 МЕ/кг); дозовый ряд 150–75–75–75–75 МЕ/кг (cуммарно 450 МЕ/кг); дозовый ряд 150–50– 50–50–50 МЕ/кг (cуммарно 350 МЕ/кг); дозовый ряд 100–50–50–50–50 МЕ/кг (cуммарно 300 МЕ/кг); дозовый ряд 100–33–33–33–33 МЕ/кг (cуммарно 232 МЕ/кг). Эффективность и переносимость всех видов в/в терапии сравнивали с лучшей терапевтической схемой в/бр лечения 150 МЕ/кг ежедневно 5-кратно (суммарно 750 мг/кг). Режим «монотонный». В/в введение LO в разовой дозе 150 МЕ/кг при 5-дневном курсе приводило к достоверному ТРО=68–78% (p<0,05) у мышей с Сa755, сравнимому с в/б лечением, но вызывало единичную лекарственную гибель после 3–4-й инъекций на фоне резкого уменьшения массы тела. Снижение величины разовой дозы LO до 125 МЕ/кг в этом режиме привело к улучшению переносимости лечения и отсутствию гибели, однако при этом на фоне уменьшения суммарной дозы до 625 МЕ/кг эффективность снижалась за пределы минимально значимой, ТРО=45–47% (p>0,05) (табл. 26). Таблица 26. Результаты оптимизации внутривенной терапии LO на Ca755: монотонный режим Суммар ная доза, МЕ/кг Число введений 750 Разовая доза, МЕ/кг ТРО, %) а сутки после окончания лечения 4 7–10 Уменьшение массы тела на 3– 5-е сутки после лечения, % Гибель от токсичности 1-ая 2–5-я 5 150 150 78* 68* <30 1/8 625 5 125 125 45 47 <20 0/10 450 3 150 150 76* 58 <30 2/10 *p <0,05 Сокращение монотонного курса лечения до 3 дней с максимальным приближением к эффективной суммарной дозе 750 МЕ/кг апробировано на в/б P388. Показано, что 3-кратный курс лечения с увеличенными до 175 или 200 МЕ/кг разовыми дозами (суммарно 450–750 МЕ/кг) неэффективен при ухудшении переносимости: УПЖ=1% при гибели более половины мышей от токсичности на фоне снижения массы тела более 25% (табл. 27). Таблица 27. Результаты оптимизации внутривенной терапии LO на Р388: монотонный режим Суммарная доза, МЕ/кг 600 525 Число инъекций 4 3 3 Разовая доза, МЕ/кг 1-ая 2–4-я УПЖ % 150 200 175 150 200 175 1 0 3 Уменьшение массы тела на 3–5-е сутки после лечения, % <30 <30 <30 Гибель от токсичности 3/6 2/6 2/6 117 Таким образом, терапия LO при многократном монотонном в/в введении в диапазоне разовых доз 125–200 МЕ/кг (суммарные дозы 500–750 МЕ/кг, соответственно) оказалась плохо переносимой и относительно малоактивной на Са755 или неактивной на Р388 в сравнении с в/б введением. Пик дефицита массы тела наблюдался на 3–5-е сутки после окончания в/в терапии LO независимо от величины суммарной дозы. Режим «дискретный». На модели Са755 в серии опытов было показано, что дискретное в/в введение LO с первой разовой дозой 100–200 МЕ/кг и последующими дозами 75 или 100 МЕ/кг (суммарные дозы 450–550 МЕ/кг, соответственно) дает сопоставимый с в/б терапией значимый достоверный противоопухолевый эффект на уровне ТРО=60–90% без гибели мышей. Достигнутый эффект сохранялся в течение 10 дней (p<0,05) при удовлетворительной переносимости и отсутствии гибели от токсичности (табл. 28). Определенный таким образом режим в/в введения LO был апробирован на Р388 и LLC. На лейкозе была подтверждена хорошая переносимость в/в LO без гибели мышей от токсичности при отсутствии ответа на лечение. На LLC с использованием LO в суммарной дозе 550 МЕ/кг при удовлетворительной переносимости без гибели получен длительный достоверный противоопухолевый эффект на уровне ТРО=74–81%. Снижение или увеличение суммарной дозы на 50–100 МЕ/кг приводило к уменьшению эффекта до ТРО=29–42%, что ниже минимально значимого уровня (табл. 28, 29). Таблица 28. Результаты оптимизации внутривенной терапии LO на Ca755: дискретный режим Суммар ная доза, МЕ/кг Число введений 550 Разовая доза, МЕ/кг ТРО, %) а сутки после окончания лечения 4 7–10 Уменьшение массы тела на 3– 5-е сутки после лечения, % Гибель от токсичн ости 1-ая 2–5-я 5 150 100 83* 62* <10 0/10 500 5 200 75 80** 72** <10 0/10 450 5 150 75 77** 60** <10 0/10 *p <0,05 Таблица 29. Результаты оптимизации внутривенной терапии LO на Р388: дискретный режим Суммарн ая доза, МЕ/кг Число введений 600 Разовая доза, МЕ/кг УПЖ% Уменьшение массы тела на 3–5-е сутки после лечения, % Гибель от токсичност и <10 0/7 <10 0/8 1-ая 2–5-я 5 200 100 450 5 150 75 29* 19 350 5 150 50 13 <5 0/6 300 5 100 50 10 0 0/6 232 5 100 33 13 0 0/6 *p <0,05 118 Таблица 30. Результаты оптимизации внутривенной терапии LO на LLC: дискретный режим Суммарная Число доза, МЕ/кг введений ТРО% на сутки после Разовая доза, МЕ/кг окончания лечения 1-ая 2–5-я 1–3 8–11 16–17 600 5 200 100 42 30 30 550 5 150 100 81* 82* 74* 450 5 150 75 29 29 7 300 5 100 50 23 3 0 Примечания: * p<0,05, n=10. Таким образом, в результате исследования на мышах с чувствительными к в/бр LO опухолями под контролем динамики массы тела и последующей гибели животных разработан режим «дискретный» для проведения многократной в/в терапии LO с интервалом 48 ч. Опыты на мышах с солидными карциномами молочной железы и легкого показали, что режим «дискретный» с интервалом 48 ч дает возможность провести 5-кратный в/в курс лечения LO с характерной для в/б лечения активностью при удовлетворительной переносимости. Для в/в введения величина разовых доз 125 и 150 МЕ/кг определена в пределах эффективных суммарных, длительность курса — 3 или 5 дней с интервалом 48 или 24 ч. Режим заключается во введении первой относительно высокой стартовой дозы и последующих поддерживающих доз, составляющих ½ или ⅔ от первой. Показана эффективность и удовлетворительная переносимость режима «дискретный» при 5-кратном в/в курсе в суммарных дозах 450–550 МЕ/кг. Терапия LO в режиме «дискретный» не вызывает значимого дефицита массы тела мышей и сопряженной с ним гибели животных. Научное обоснование использования дискретного режима при в/в использовании LO основано на предположении о развитии белкового голодания при нарушении биосинтеза белка из-за нарастающего дефицита незаменимой аминокислоты L-лизина в условиях постоянно возрастающей концентрации LO в крови. Доказательство этому было получено при определении Т1/2 у мышей в/в введенной LO. Оказалось, что динамика изменения концентрации LO в сыворотке крови при 5-дневном ежедневном введении не зависит от количества инъекций, а Т1/2 LO из плазмы крови мышей составляет 67–93 мин (см. раздел 5.2.1). Сохраняющиеся через 24 ч после инфузии разовых доз 1–3 мг/кг значительные концентрации фермента (6,3–8,4 нг/мл) достаточны для практически полного расщепления L-лизина в крови. Сравнительный анализ биологических эффектов LO в разовой дозе 150 МЕ/кг при монотонном и дискретном в/в режимах позволил предположить, что найденный 48-часовой интервал 119 является оптимальным для дискретного режима. Он позволяет нивелировать влияние уменьшения уровня L-лизина в плазме крови и увеличить амплитуду колебания концентрации L-лизина непосредственно перед инъекцией LO и после нее. Так, показано, что у мышей BDF1 в/в введение LO в однократной дозе 70 МЕ/кг сразу и на период до 12 ч снижает содержание Lлизина в плазме крови до ничтожно малых, практически не определяемых значений. Восстановление концентрации L-лизина наступает лишь через 24 ч [203]. Это объясняет полученный нами феномен сохранения противоопухолевого эффекта без гибели мышей от дефицита лизина. Скорее всего, поддерживающие дозы LO позволяют обеспечить концентрацию L-лизина на уровне, минимально достаточном для жизни только нормальных клеток. Дефектное кровоснабжение опухоли не обеспечивает активно делящиеся клетки с интенсивным синтезом белка, особенно в G1 фазе клеточного цикла, постоянным поступлением незаменимых аминокислот и, соответственно, делает их более уязвимыми к колебаниям концентрации L-лизина в плазме крови, чем здоровые клетки. Косвенно это подтверждается данными фармакокинетики LO в плазме крови у мышей. Так, расчетный Т1/2 при в/в введении LO в диапазоне терапевтических доз не зависит от дозы, а снижение концентрации LO в крови носит ярко выраженный двухфазный характер: в начальной фазе (смешанная фаза распределения и элиминации) концентрация препарата снижается быстрее, чем в конечной (фаза элиминации). Наличие длительной фазы элиминации свидетельствует об отсроченном начале восстановления уровня L-лизина в плазме крови после введения фермента. Полученные данные позволяют считать, что улучшение переносимости LO при дискретном в/в введении связано с повышением избирательности цитотоксического действия фермента на опухолевые клетки при изменении амплитуды и характера колебаний уровня L-лизина в плазме крови. Пик дефицита массы тела мышей при ежедневном в/в введении LO, наступающий через 3-5 дней после окончания курса лечения независимо от величины суммарной дозы, подтверждает кумулятивный характер этого побочного эффекта. Более того, при в/в дискретной терапии в сравнении с монотонным в/бр введением показана возможность уменьшения равноэффективной суммарной дозы на 200 МЕ/кг (750 МЕ/кг против 550 МЕ/кг). Все вышесказанное является основанием рекомендовать использование дискретного режима для в/в введения LO при проведении доклинических и клинических исследований. 7.1.4. Спектр чувствительных опухолей к L-лизин–альфа-оксидазе Trichoderma cf. aureoviride Rifai10 Для оценки чувствительности к LO в отработанной заранее схеме введения были использованы различные 10 перевиваемые штаммы опухолей мышей: саркома 180, меланома Эксперименты выполнены совместно с к.м.н. Н.В. Андроновой и Л.А. Седаковой, РОНЦ им. Н.Н. Блохина В16, 120 аденокарцинома толстой кишки АКАТОЛ, рак шейки матки РШМ-5, эпидермоидная карцинома легкого Льюис LLC, плазмацитома МОПС406. Все указанные опухолевые штаммы продемонстрировали стандартный рост. Так, саркома 180 в контрольной группе достигла к 25-м суткам после п/к трансплантации Vср=5805 мм3, меланома B16 —Vср=9904 мм3 (к 22-м суткам после п/к трансплантации), АКАТОЛ — Vср=4818 мм3 (к 22-м суткам после п/к трансплантации), РШМ-5 — Vср=12068 мм3 (к 25-м суткам после п/к трансплантации), LLC — Vср=18574 мм3 (к 23-м суткам после п/к трансплантации), МОПС406 — Vср=4492 мм3 (к 24-м суткам после п/к трансплантации). При в/в терапии LO в режиме «дискретный» помимо Са755 и LLC чувствительными оказались все чувствительные к в/б LO солидные опухоли мышей (табл. 31). Противоопухолевое действие LO соответствовало ТРО=57–92% (p<0,05), которое в случае РШМ5 было максимальным и удерживалось в течение не менее 14 дней. Так, при воспроизведении полученных результатов на LLC и Са755 подтвержден высокий длительный достоверный противоопухолевый эффект на уровне ТРОmax=82% и 90%, соответственно (p<0,05). Высоко чувствительной к в/в терапии LO оказалась также плазмацитома МОПС-406, ТРОmax=92% (p<0,05). Умеренную чувствительность показала саркома 180, ТРОmax=77% (p<0,05), пограничный эффект на уровне ТРОmax=57–59%, (p<0,05) получен на аденокарциноме АКАТОЛ и раке шейки матки РШМ-5. Малочувствительной к в/в LO оказалась меланома В16, ТРОmax=46%. По отношению к в/в терапии LO опухоли расположены в следующем порядке убывания чувствительности: МОПС406, РШМ-5, саркома-180, АКАТОЛ, меланома В16. Таблица 31. Спектр чувствительных трансплантированных подкожно опухолей мышей к внутривенной терапии LO в суммарной дозе 450–550 МЕ/кг при режиме «дискретный» ТРО%, на сутки после окончания лечения Опухолевый штамм 1 6 11–14 Саркома 180 (n=10) 77* 21 10 Меланома В16 (n=10) 46* 9 0 АКАТОЛ (n=9) 57* 38 30 РШМ-5 (n=10) 59* 50* 47* МОПС-406 (n=9) 83* 92* 53* Примечания: *Результаты достоверны, p<0,05. 121 Во всех экспериментах динамика массы тела мышей достоверно не отличалась от контрольных групп, дефицита массы тела не отмечали, переносимость терапии была удовлетворительной, гибели от токсичности не отмечали. Таким образом, разработанный режим в/в введения позволяет реализовать противоопухолевый эффект LO в отношении практически всего спектра чувствительных к в/б терапии опухолевых моделей: аденокарцинома молочной железы Са755, меланома В16, аденокарцинома толстой кишки АКАТОЛ, рак шейки матки РШМ-5, эпидермоидная карцинома легкого Льюис и плазмацитома МОПС-406. Спектр чувствительных опухолей представлен 6 солидными опухолями различной видовой специфичности (гистотип аденокарциномы, рак и меланома), а также двумя гемобластозами (лимфома и лимфолейкоз). Среди клинически значимых на сегодня эффективных противоопухолевых препаратов аналогичный LO спектр противоопухолевой активности проявляют такие препараты, как циклофосфамид и метотрексат. По уровню противоопухолевой активности на чувствительных мышиных опухолевых моделях LO близка к антиметаболиту 5-фторурацилу. Близкий спектр действия LO и 5-фторурацила (а также других препаратов с аналогичным механизмом действия — капецитабином, УФТ, S1, тегафуром и др.), составляющих основу схем химиотерапии рака толстой кишки в онкологической клинике, позволяет считать фермент перспективным для изучения возможности использования с целью лечения этой патологии. Таблица 32. Сравнительный анализ спектра чувствительных к LO опухолей мышей в сравнении с другими ферментами Препараты Р388 Ca755 LLC В16 АКАТОЛ РШМ-5 МОПС406 L5178Y С 180 + – – + – ? ? +++ – + – – – – – – +++ – EwA – – – + – ? ? ++ – YpA –/? –/? –/? ? –/? ? ? ++ –/? RrA –/? –/? –/? ? –/? ? ? ++ –/? PAL ? ? ? ? ? ? ? + ? LO + +++ ++ + + ++ +++ – ++ EcA WsA Примечания. «–» — нет эффекта; «–/?» — на основании имеющихся данных эффект не ожидается, однако отсутствие эффекта не подтверждено; «+» — в ряде исследований показан пограничный эффект; «++» — достоверный эффект; «+++» — наиболее выраженный эффект. Помимо собственных данных, в таблице учтены данные Е.М. Трещалиной [38]. 122 При сравнении с собственными и литературными данными об активности различных ферментов на моделях перевиваемых опухолей мышей следует заключить, что LO обладает максимально широким спектром чувствительных опухолей по сравнению со всеми изученными противоопухолевыми ферментами. Так, в отличие от L-аспарагиназы LO существенно более активна по широте спектра противоопухолевого действия на солидных опухолях и принципиально отличается отсутствием эффективности на лимфаденозе Фишера L5178Y (табл. 32). 7.1.5. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius Рибонуклеазу Bacillus intermedius вводили в изотоническом растворе NaCl в концентрации 0,5– 4 мкг/мл мышам в/в 1 раз в сутки на 2–4–6–8–10 дни после трансплантации опухолевых клеток. Использовали дозы 5, 10 и 50 мкг/кг, соответственно суммарные дозы составили 25, 50 и 250 мкг/кг. Контрольным препаратом служила РНКаза А, которую вводили в/в 1 раз в сутки на 2-46-8-10 дни после трансплантации опухолевых клеток. Использовали дозы 5, 10 и 50 мкг/кг, соответственно суммарные дозы составили 25, 50 и 250 мкг/кг. Средний объем опухолей на 10, 14 и 18-е сутки после трансплантации меланомы составил 1644, 3381 и 6857 мм3, соответственно. В основных группах мышей, получавших РНКазу А в разных дозах ТРОmax=22-29%, достоверных отличий с контрольной группой не выявлено (p>0,05) (табл. 33). Таким образом, при в/в введении РНКазы А на модели метастазирующей меланомы В16 в диапазоне доз 5–50 мкг/кг 5-кратно с интервалом 48 ч значимого достоверного противоопухолевого эффекта получить не удалось ни по критериям непосредственного эффекта, ни по отдаленным результатам. Различий эффекта в зависимости от дозы субстанции выявлено также не было. Таким образом, меланома В16 характеризуется сопоставимой с карциномой легкого Льюис чувствительностью к РНКазе А, примененной в/в многократно в диапазоне суммарных доз от 25 до 250 мкг/кг. Ингибирующее действие РНКазы А кратковременное и не зависит от величины дозы. Полученные данные дают основания считать обе модели пригодными для изучения новых более эффективных рибонуклеаз при использовании в качестве препарата сравнения РНКазы А в примененной схеме и дозах. При использовании биназы был зафиксирован достоверный эффект на 10-е сутки после трансплантации (в день последнего введения препарата) на уровне ТРО 62%, который, однако, не привел к длительному ТРО и значимому УПЖ. Отдельный интерес представляет то, что эффект был получен при использовании минимальной дозы из изученных (5 мкг/кг пятикратно). 123 Таблица 33. Эффективность биназы в сравнении с РНКазой А на модели меланомы В16 Препарат Разовая доза, мкг/кг ТРО%, на сутки после УПЖ% трансплантации РНКаза А Биназа 10 14 18 5 19 22 20 11 10 24 16 29 0 50 24 10 8 7 5 62* 33 13 1 10 23 28 15 0 50 20 17 7 9 * p<0,05 по сравнению с контрольной группой, n=10. Переносимость всех видов терапии в использованном дозовом диапазоне была одинаково удовлетворительной: состояние и поведение мышей без особенностей. Гибели от токсичности при всех видах лечения не отмечали, масса селезенки достоверно не отличалась от контрольной группы. Проведенные эксперименты показали наличие у биназы при введении в/в (5 мкг/кг пятикратно) умеренного кратковременного противоопухолевого эффекта. Однако, этот эффект представляет интерес с точки зрения дальнейшего изучения, поскольку он был выше, чем в контрольной группе и группе сравнения (РНКаза А). 7.2. Доклиническое изучение новых ферментов на подкожных ксенографтах опухолей человека у иммунодефицитных мышей 7.2.1. Спектр противоопухолевой активности L-лизин–альфа-оксидазы Противоопухолевая активность LO была изучена на следующих моделях подкожных ксенографтов опухолей человека: SKBR3 Her2+++, T47D ER+, меланома Мел-7 (Bro), HCT116, LS174T, SKOV3 Her2+++, гепатоцеллюлярная карцинома Alex. У всех животных через 1–2 нед после трансплантации опухоли были измеряемые опухоли. На модели Bro и T47D время удвоения объема опухоли составило <3 дней, что позволяет их считать наиболее агрессивно растущими. На момент завершения лечения в день 11, средний размер опухолей в контрольных группах составил 273[129÷297]мм3 и 239[135÷343]мм3, соответственно. Использован отработанный ранее режим дискретного введения LO для парентерального применения. 124 А В Д Б Г Е Рис. 27. Эффективность LO на ксенографтах опухолей человека у мышей Balb/c nude: SKBR-3 Her2+++ (А), HCT116 (Б), Мел-7 (В), SKOV-3 Her2+++ (Г), Alex (Д), LS 174T (Е), T47D ER+ (Ё). Мыши контрольной группы получали Ё изотонический раствор натрия хлорида (◆), * p <0,05. LO вводили в/б 150 МЕ/кг в день 2; 75 МЕ/кг в дни 4, 6, 8, 10 после трансплантации. По оси ординат: объем опухоли, мм3, по оси абсцисс: сутки после трансплантации 125 В/бр введение LO в дискретном режиме в дозах 150–75–75–75–75 МЕ/кг продемонстрировало торможение роста всех изученных опухолей со следующими Т/Сmin: SKBR3 — 49% (p>0,05), HCT116 — 12% (p<0,05), Мел-7 — 51% (p>0,05), SKOV3 — 35% (p>0,05), Alex — 54% (p>0,05), T47D — 36% (p<0,05) и LS174T — 37%. Таким образом, LO обладает значимой противоопухолевой активностью на моделях ксенографтов рака толстой кишки HCT116 и LS174T, а также аденокарциномы молочной железы T47D. Кривые роста представлены на рис. 27. Во всех случаях использование LO задерживало рост опухоли на 12–15 дней, однако затем размер опухоли становится сопоставимым с контрольной группой. Переносимость лечения во всех группах была удовлетворительной. Достоверных отличий от контрольной группы по критериям общей токсичности (уменьшение массы тела, гибель животных от токсичности) или специфических побочных эффектов не отмечали. Полученные результаты свидетельствуют о хорошей переносимости LO в/б у бестимусных мышей. Различная чувствительность клеточных линий и моделей опухолей человека in vivo у бестимусных мышей может быть связана с различной чувствительностью клеток разных опухолей к дефициту L-лизина и оксидативному стрессу. Поскольку базовый уровень цитотоксичности определяется образованием H2O2, возможно, различия в чувствительности различных клеток к LO в большей степени определяются чувcтвительностью к дефициту Lлизина. Полученные данные на ксенографтах опухолей человека у бестимусных мышей подтверждают потенциальную возможность использования LO для лечения рака толстой кишки. Так, эффективность LO на модели HCT116 сопоставима с препаратами, используемыми в клинике, например, иринотеканом [286]. 7.2.2. Противоопухолевая активность иммуноРНКазы 4D5 scFvдибарназы11 Для выявления вклада рибонуклеазной активности химерной молекулы в реализацию ее противоопухолевого эффекта, а также для выявления терапевтически эффективных доз 4D5 scFv-дибарназы были использованы ксенографты рака молочной железы человека SKBR-3 у бестимусных мышей. Были изучены следующие кандидаты: ♦ мини-антитела (4D5 scFv); ♦ смесь барназы и 4D5 scFv; ♦ химерная молекула-конъюгат 4D5 scFv с двумя молекулами барназы (4D5 scFv-дибарназа). 11 Эксперименты выполнены совместно с к.м.н. Н.В. Андроновой, РОНЦ им. Н.Н. Блохина 126 4D5 scFv. Эффективность лечения (начало при среднем объеме опухоли 52 мм3) оценивали при в/б введении препарата в разовой дозе 1 мг/кг. Проведено 8 инъекций тремя курсами по 2-3 ежедневных инъекции с интервалами 3 и 6 дней, суммарная доза составила 8 мг/кг. После первого курса введения Т/С=62%, после второго курса (интервал между курсами 3 дня) Т/С=59%, через неделю после второго курса и перед третьим курсом эффект уменьшился до Т/С=77%, после окончания третьего курса Т/С=72%. Таким образом, антитела 4D5 scFv имели удовлетворительную переносимость при отсутствии достоверного эффекта (Т/Сmin=59%). Однако анализ скорости роста опухоли в опытной группе против контроля показал, что применение мини-антител привело к существенному снижению скорости роста опухоли в процессе лечения (приблизительно в 1,5–2 раза), особенно выраженному при первых двух курсах. Наличие пограничного эффекта может быть связано с частичной блокадой антителами рецепторов Her2/neu с реализацией эффекта по механизму, близкому к механизму действия трастузумаба. Смесь барназы и 4D5 scFv. При изучении влияния на рост опухоли простой смеси белков, входящих в состав изучаемой иммуноРНКазы, 6×106 клеток SKBR3 вводили мышам Balb/c nude подкожно. Смесь 4D5 scFv и барназы в количестве 1,8 и 1,6 мг/кг вводили в/в, затем в/б на 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 14, 16, 18 сутки (табл. 34). Общая доза белка составила 23,4 и 20,8 мг/кг, соответственно. Величина Т/Сmin составила 87%, таким образом, достоверного эффекта при использовании смеси белков зарегистрировано не было. Переносимость лечения была удовлетворительной, гибели мышей от токичности не отмечали. 4D5 scFv-дибарназа. При подкожной трансплантации 6×106 клеток SKBR3 минимальный T/C при использовании 4D5 scFv-дибарназы наблюдался на 11-е сутки после трансплантации и составил 65%, что выше, чем в случае простой смеси 4D5 scFv и барназы (табл. 34). Уменьшение прививочной противоопухолевого эффекта дозы до химерного 1,5×106 белка. клеток При этом увеличило общая выраженность доза введенного иммунотоксина была уменьшена с 9 до 7 мг/кг, вводили 4D5 scFv-дибарназу в/б с интервалом 24-72 ч на 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 19, 21 и 23 сутки в разовой дозе 0,7 мг/кг (табл. 35). Отмечено уменьшение темпов роста опухоли как в процессе введения препарата, так и, главным образом, после окончания терапии: в ходе лечения отставание роста опухоли от контроля выражалось в Т/С=93-41%, а после окончания лечения на 5-13 сутки Т/С=38–33% (p<0,05). Таким образом, 4D5 scFv-дибарназа показала достоверный противоопухолевый эффект при раннем в/б лечении, проведенном с 5 по 23 сутки после трансплантации опухоли с интервалом 24–72 ч. Полученные эффекты удовлетворяют критерию эффективности агента на развившейся опухоли человека у бестимусных мышей (Т/С≤42%). Уменьшение дозы до 0,25 мг/кг в/б 9-кратно снижало 127 эффективность терапии Т/Сmin=45%. Переносимость лечения в группе была хорошей, побочных эффектов не наблюдали. Полученный эффект сравним с литературными данными для аналогичного иммунотоксина, включающего панкреатическую рибонуклеазу А [104, 105]. Изучение токсичности на здоровых мышах-самках BDF1 показало, что 4D5 scFv-дибарназа при однократном в/в введении в дозе 7 мг/кг (10-кратная разовая терапевтическая доза) не вызывает гибели мышей и не влияет на состояние и поведение мышей, массу тела и внутренних органов, а также на биохимические показатели крови. Выявленная через 7 дней после введения иммуноРНКазы лейкопения находится в границах физиологической нормы. Этот эффект совпадает с пиком иммунного ответа на человеческие антитела у изогенных мышей и, вероятно, является его следствием. 128 Таблица 34. Эффективность агентов на основе мини-антител против Her/2 neu и барназы, SKBR3 у мышей Balb/c nude Гибель Группа 4D5 scFv-дибарназа Смесь 4D5 scFv и дибарназы Разовая доза, мг/кг 3,5 1,8 и 1,6 Сутки терапии 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 14 в/в 16, 18 в/бр 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 14 в/в 16, 18 Т/С, на сутки после трансплантации опухоли Путь введения 7 11 16 21 100 65 78 81 87 90 92 93 0/5 0/5 в/бр Таблица 35. Эффективность 4D5 scFv-дибарназы, SKBR3 у мышей Balb/c nude Группа Разовая доза, мг/кг Сутки терапии 0,7 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 19, 21, 23 0,25 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 Путь введения* Т/С, на сутки после трансплантации опухоли 7 14 18 21 25 28 37 в/бр 94 71 51 42 – 38* 33* в/бр 76 45 – 50 – 66 – 4D5 scFv-дибарназа * отличие от контроля достоверно, р <0,05, n=8; ** после 1-го введения разовая доза уменьшена в 4 раза, а после 7-го введения в/в инъекции прекращены из-за тромбоза вен. 129 Таким образом, определены переносимые дозы изученных кандидатов и выявлены положительные эффекты у двух из них. Полученные данные позволяют отобрать 4D5 scFvдибарназу для дальнейшего углубленного изучения. Противоопухолевая активность и низкая токсичность изученной иммуноРНКазы позволяет рассматривать барназу в качестве агента для создания на ее основе конъюгированных с антителами противоопухолевых препаратов. Более высокий эффект конъюгата 4D5 scFvдибарназы по сравнению только с мини-антителами 4D5 scFv свидетельствует о наличии существенного вклада ферментативной активности в реализацию противоопухолевого эффекта. 7.2.3. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius (биназы) Для подтверждения противоопухолевого эффекта биназы (рибонуклеазы Bacillus intermedius) были использованы модели ксенографтов меланомы человека MeWo и НМРЛ человека А549 у мышей Balb/c nude. Лечение начинали через 48 ч после трансплантации опухолевых клеток, субстанцию биназы вводили в дозе 5 мкг/кг 5-кратно с интервалом 48 ч — в режиме, продемонстрировавшем достоверный эффект у мышей с меланомой В16. Результаты лечения в опытной группе сравнивали с группой без специфического лечения и с группой активного контроля, в которой мыши получали РНКазу А в аналогичном дозовом режиме. Результаты показали, что в случае MeWo ни в одной из опытных групп не было получено значимого достоверного торможения роста опухоли по сравнению с контрольной группой, ТРОmax составила 20 и 22% для биназы и РНКазы А, соответственно, на 21-е сутки после трансплантации опухоли. Следовательно, можно сделать вывод о низкой чувствительности меланомы человека MeWo к терапии рибонуклеазами (табл. 36). Таблица 36. Результаты лечения подкожных ксенографтов меланомы MeWo у мышей Balb/c nude Группа ТРО%, на сутки после имплантации опухоли/окончания лечения 13/3 17/7 21/11 25/15 29/19 Биназа, n=10 4 2 20 15 6 РНКаза А, n=10 7 -2 22 10 -4 На модели ксенографтов НМРЛ непосредственно после окончания лечения было зарегистрировано ТРО 54% и 33% в группах биназы и РНКазы А, соответственно, однако различия между опытными группами, а также между опытными и контрольной группой были недостоверными (p>0,05). Переносимость терапии была удовлетворительной, гибели мышей от токсичности не наблюдали (табл. 37). 130 Таблица 37. Результаты лечения подкожных ксенографтов немелкоклеточного рака легкого А549 у мышей Balb/c nude Группа ТРО%, на сутки после имплантации опухоли/окончания лечения 14/4 54 33 Биназа, n=10 РНКаза А, n=10 20/10 39 31 25/15 34 22 30/20 27 15 35/25 17 16 Таким образом, пилотные эксперименты на мышах с ксенографтами опухолей человека не подтвердили наличие достоверного противоопухолевого эффекта биназы, однако продемонстрировали близкое к пограничному эффекту торможение роста опухоли. Учитывая это обстоятельство, для дальшейших исследований представляется перспективным изучение биназы в качестве модификатора эффекта противоопухолевых препаратов с доказанным достоверным эффектом с целью его увеличения на основании данных о механизме действия комбинантов. 7.3. Разработка модели для доклинической оценки противоопухолевого эффекта L-метионин–γ-лиаз Были изучены и сопоставлены фармакокинетические характеристики пиридоксина, MGL из различных источников, а также концентрация метионина в плазме крови мышей после введения MGL и MGL в сочетании с пиридоксином. Данные об основных фармакокинетических параметрах MGL С. freundii, MGL C. sporogenes и MGL C. tetani (подробно приведены в главе 5) демонстрируют, что в течение 6 ч фермент практически полностью инактивируется в плазме крови мышей. Пиридоксин метаболизируется до ПЛФ и практически полностью выводится в течение 3 ч после введения (табл. 38). С целью оценки влияния пиридоксина на концентрацию метионина были изучены в сравнительном эксперименте концентрации метионина после введения MGL 500 МЕ/кг в/в, а также MGL в сочетании с пиридоксином 300 мг/кг в/бр. Показано, что в группе MGL C. tetani дополнительное введение пиридоксина не изменяет содержание метионина в плазме крови мышей: в обоих случаях концентрация метионина остается неопределимой в течение 3 ч после введения фермента. В случае с MGL C. freundii снижает уровень метионина непосредственно после введения: только при дополнительном введении пиридоксина концентрация метионина сохраняется на неопределимом уровне в течение 60 мин, в случае с MGL Cl. sporogenes — возможно, пролонгирует эффект MGL: в монорежиме следовые количества метионина начинают определяться на 9 час после введения препарата (концентрация сохраняется на неопределяемом уровне в течение 6 ч), в случае дополнительного введения пиридоксина через 9 ч после введения концентрация также не определяется (рис. 28). 131 Таблица 38. Содержание пиридоксина в плазме крови в различные сроки после однократного внутрибрюшинного введения пиридоксина Время, мин 10 30 60 180 360 540 1440 мкМ/л Pn, нг в 100 мкл плазмы 3157,4 2684,2 2040,8 76,1 13,3 5,5 1,5 Pn (среднее), мкМоль в 1 литр, мкМ 186,6 158,6 120,6 4,5 0,8 0,3 0,1 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 А 0,2 10 мин 0,15 30 мин MGL 60 мин 540 мин MGL + ПЛФ 0,1 0,05 0 10 мин 30 мин MGL 60 мин MGL + ПЛФ 540 мин Б Рис. 28. Концентрация метионина в плазме крови мышей после введения MGL в монорежиме или в сочетании с пиридоксином. А — MGL C. freundii, Б — MGL Cl. sporogenes. Полученные данные позволили предположить, что дополнительное введение пиридоксина при лечении мышей с опухолью MGL может повышать эффективность терапии благодаря более длительному сохранению «нулевого» уровня концентрации метионина плазмы крови. Для подтверждения возможности использования пиридоксина как источника ПЛФ in vivo у мышей с опухолью на первом этапе была использована сигнальная мышиная модель лимфолейкоза P388, не охарактеризованная по чувствительности к MGL по литературным данным. Препараты 132 (MGL С. sporogenes и пиридоксин) вводили одновременно, MGL — в/в, пиридоксин — п/к или в/бр. Был использован диапазон доз MGL С. sporogenes от 50 до 400 МЕ/кг в/в четырехкратно с интервалом 48 ч и пиридоксин в дозе 250 мг/кг (табл. 39). Согласно исходному замыслу, введенный пиридоксин должен был по мере метаболизма поддерживать концентрацию ПЛФ, необходимую для реализации противоопухолевого эффекта MGL. Таблица 39. Эффективность MGL C. sporogenes на модели P388 с дополнительным введением пиридоксина Разовая доза MGL С. sporogenes, МE/кг Разовая доза пиридоксина, мг/кг, путь введения Продолжительность жизни n УПЖ, % – – 7 11,7 [11,0÷12,4] – – 250 в/б 7 12,7 [12,0÷13,4] 9% – 250 п/к 7 12,3 [11,6÷13,0] 5% 400 – 7 11,4 [10,3÷12,5] –3% 200 – 7 12,6 [11,9÷13,1] 7% 100 – 7 11,6 [10,2÷13,0] –1% 50 – 6 12,2 [11,3÷13,1] 4% 400 250 п/к 7 11,9 [11,2÷13,6] 1% 200 250 п/к 8 11,9 [11,3÷13,5] 1% 100 250 п/к 7 11,7 [11,0÷12,4] 0% 50 250 п/к 7 12,1 [11,0÷13,2] 4% 200 250 в/б 7 12,7 [12,0÷13,4] 9% 100 250 в/б 7 12,4 [11,7÷13,1] 6% 50 250 в/б 7 12,6 [12,2÷13,0] 7% * MGL вводили в/в, 4-кратно с интервалом 48 ч, пиридоксин вводили в/б или п/к 4-кратно с интервалом 48 ч Как видно из полученных результатов (см. табл. 39), терапия MGL С. sporogenes в изученном диапазоне доз была переносимой, но неэффективной ни в «монорежиме», ни в сочетании с одновременным введением пиридоксина. Активный контроль с пиридоксином также не дал достоверного УПЖ. Полученные результаты могли быть связаны как с исходной нечувствительностью опухолевой модели Р388 к MGL, независимо от реализации ферментативной функции, так и с недостаточностью поддерживаемой концентрации ПЛФ в период циркуляции MGL С. sporogenes в плазме крови. На втором этапе была предпринята попытка использования охарактеризованной по чувствительности к MGL P. putida модели эпидермоидной карциномы легкого LLC (табл. 40) [366]. MGL C. sporogenes вводили в/в четырехкратно в дозах 200 и 400 МЕ/кг в монорежиме и в сочетании с пиридоксином в/бр в дозе 250 мг/кг. 133 Таблица 40. Эффективность MGL C. sporogenes на модели LLC с дополнительным введением пиридоксина Группа Дозы разовые Дозы ТРО, % (сутки после трансплантации) суммарные УПЖ, % 10 18 26 400 МЕ/кг 1600 МЕ/кг 24 6 0 5 200 МЕ/кг 800 МЕ/кг 8 13 0 0 250 мг/кг 1000 мг/кг 21 13 4 3 400 МЕ/кг 1600 МЕ/кг MGL 250 мг/кг 1000 мг/кг 55* 34 15 7 Пиридоксин 200 МЕ/кг 800 МЕ/кг 250 мг/кг 1000 мг/кг 36 38 18 2 MGL Пиридоксин *p <0,05, n=10 Полученные результаты продемонстрировали пограничный эффект MGL С. sporogenes в разовой дозе 400 МЕ/кг сочетании с пиридоксином в дозе 250 мг/кг в/бр. Монотерапия MGL С. sporogenes или введение пиридоксина не дали достоверного эффекта ни по критерию ТРО, ни по критерию УПЖ. Переносимость всех видов терапии была удовлетворительной, гибели мышей от токсичности не отмечали. Для воспроизведения эффекта и подтверждения возможности использования в качестве модели для изучения эффективности новых MGL эпидермоидной карциномы легкого Льюис с дополнительным введением пиридоксина был проведен эксперимент с MGL С. freundii в дозах 200 или 400 МЕ/кг и пиридоксина в дозе 500 мг/кг (табл. 41). Видно, что монотерапия MGL С. freundii, как и монотерапия MGL Cl. sporogenes, не давала достоверного эффекта на модели LLC. Добавление пиридоксина в дозе 500 мг/кг дало достоверный эффект у MGL С. freundii как в дозе 400 МЕ/кг, так и 200 МЕ/кг. Значение ТРО на 10-е сутки после трансплантации составило 67 и 56%, достоверное ТРО сохранялось на протяжении 18 суток после трансплантации (9 суток после окончания лечения). Однако получить достоверное значение УПЖ, как и в случае с MGL С. freundii, не удалось. Переносимость терапии была удовлетворительной, гибели мышей от токсичности не отмечалось. 134 Таблица 41. Эффективность MGL С. freundii на модели LLC с дополнительным введением пиридоксина Дозы Дозы разовые суммарные MGL 400 МЕ/кг Пиридоксин Группа ТРО, % (сутки после трансплантации) УПЖ, % 10 18 1600 МЕ/кг 13 +11 –2 500 мг/кг 2000 мг/кг 18 4 8 400 МЕ/кг 1600 МЕ/кг MGL 500 мг/кг 2000 мг/кг Пиридоксин 200 МЕ/кг 800 МЕ/кг 500 мг/кг 2000 мг/кг –2 56* 35** 67** 50** –2 * p <0,05, достоверно по отношению к контрольной группе и группе монотерапии MGL, n=10, ** p <0,05, достоверно по отношению к контрольной группе и группам монотерапии MGL и пиридоксином, n=10. Таким образом, эмпирически обнаруженный режим использования пиридоксина в дозах 250 и 500 мг/кг в/бр позволяет получать достоверный эффект двух различных MGL на модели эпидермоидной карциномы легкого Льюис. Для верификации модели и уточнения биохимичеcких аспектов механизма действия MGL целесообразно определение в динамике концентрации ПЛФ в плазме крови мышей после введения пиридоксина и определение оптимального режима введения пиридоксина при использовании других опухолевых моделей, а также сопоставление эффекта фермента при использовании предложенной модели и других описанных в литературе моделей оценки эффекта MGL. 7.4. Доклиническое изучение in vivo эффективности и переносимости комбинаций с L-лизин-альфа-оксидазой 7.4.1. Оценка «острой» токсичности L-лизин-альфа-оксидазы и препаратов для комбинаций Для определения оптимальных доз и режимов использования в комбинированной терапии с LO была изучена острая токсичность следующих препаратов: иринотекана, цисплатина и этопозида. В экспериментах LO вводили в/в, остальные препараты — в/бр. Острая токсичность LO12. Видно, что при однократном в/в введении LO в изученном диапазоне доз 100% гибель недостижима. Гибель от токсичности наступила при применении 2400 МЕ/кг. Таким образом, расчетная величина ЛД50 для LO в изученном диапазоне доз оказалась недостижимой (табл. 42). Доза 2400 Е/мл близка к максимально переносимой (МПД, 12 Эксперименты выполнены совместно с к.м.н. И.Д. Трещалиным, НИИНА им. Г.Ф. Гаузе 135 ЛД5-10). В дальнейших экспериментах для оценки эффективности использовали разовые дозы LO от 33 до 200 МЕ/кг. Доза 2400 МЕ/кг превышает разовую терапевтическую дозу в 15–20 раз, а максимальную суммарную дозу почти в 6 раз. Таблица 42. Зависимость гибели мышей-самцов Balb/c от дозы после однократного введения L-лизин–α-оксидазы Доза Число павших мышей из мг/кг МЕ/кг группы 2,1 200 0/6 3,2 300 0/6 4,2 400 0/6 6,3 600 0/6 12,6 1200 0/6 25,3 2400 2/6 «Острая» токсичность иринотекана. Показано, что после введения иринотекана в интервале доз ≥210 мг/кг часть мышей погибала через 20–40 мин при явлениях дезориентации, адинамии и ареактивности. Двигательная активность выживших мышей восстанавливалась через 2 ч. На протяжении недели после введения препарата независимо от дозы иринотекана у всех животных отмечали диарею различной степени выраженности. Через 7–10 сут после введения препарата средняя масса тела выживших мышей уменьшалась на 30%. Отмечено 2 пика гибели мышей, характерных для иринотекана: сразу после введения (нейротоксичность) и на 4–8 сутки (гематологическая и гастроинтестинальная токсичность) [20]. При аутопсии мышей, получивших иринотекан в интервале доз от 210 до ≥270 мг/кг, обнаружены изъязвления и отечность серозной оболочки тонкой кишки с кровоизлияниями, расцененными как проявление лимитирующей гастроинтестинальной токсичности. Расчетная величина ЛД50 иринотекана для мышей-самцов линии Balb/c (табл. 43) составила 231,32 [218,8÷243,9] мг/кг, что согласуется с известными данными [201]. В качестве лечебных для однократного введения иринотекана были выбраны разовые дозы 50–100 мг/кг, составляющие примерно 1/2–1/4 МПД. 136 Таблица 43. Зависимость гибели мышей-самцов Balb/c от дозы после однократного введения иринотекана Доза, мг/кг Сутки гибели Число павших мышей из группы 120 – 0/6 180 – 0/6 210 5, 5 2/6 240 4, 4, 4, 6 4/6 270 1, 1, 4, 6, 8 5/6 300 1, 4, 4, 4, 7, 7 6/6 «Острая» токсичность цисплатина. Цисплатин в токсических дозах вызывал гибель животных на 4–6 сутки на фоне снижения двигательной активности и потери массы тела. При вскрытии павших мышей выявлено уменьшение средней массы селезенки до 52 мг, что свидетельствует о выраженной гематологической токсичности. У выживших мышей в течение 17–21 суток после введения препарата отмечено снижение массы тела на 15–25% с восстановлением к 25–30 суткам. Расчетная величина ЛД50 составила 15,89 [14,7÷17,1] мг/кг; что согласуется с данными, полученными ранее [35]. В качестве терапевтических доз для цисплатина были выбраны разовые дозы 0,75–3 мг/кг при троекратном введении. Суммарная доза составила 2,25–9,00 мг/кг, что примерно соответствует 1/4–3/4 МПД. Таблица 44. Зависимость гибели мышей-самцов Balb/c от дозы после однократного введения цисплатина Доза, мг/кг Сутки гибели Число павших мышей из группы 9 – 0/6 12 5 1/6 15 4, 4 2/6 18 5, 6, 6, 6 4/6 21 4, 5, 5, 5, 5, 5 6/6 Острая токсичность этопозида. После введения этопозида в диапазоне переносимых доз на протяжении опыта поведение и внешний вид мышей существенно не изменялись. Через 7– 10 сут после введения отмечали значимую потерю массы тела мышей на 20–25%, масса селезенки уменьшалась до 43 мг. Гибель мышей наступала на 4–14-е сутки при значительном снижении двигательной активности, причем на 13–14-е сутки погибали животные, получившие относительно невысокие дозы 60 или 90 мг/кг (табл. 45). Указанные сроки 137 гибели характерны для гематологической токсичности, ранее показанной для этопозида на здоровых мышах [20]. Для этопозида расчетная величина ЛД50=98,87 [86,7÷111,1] мг/кг, что согласуется с известными данными [312]. Таблица 45. Зависимость гибели мышей-самцов Balb/c от дозы после однократного введения этопозида Доза, мг/кг Сутки гибели Число павших мышей из группы – 13 13, 14 4, 5, 5, 8 4, 4, 4, 4, 5, 5 30 60 90 120 150 0/6 1/6 2/6 4/6 6/6 Расчетные токсические дозы всех изученных препаратов, использованные в дальнейшем при выборе оптимальных терапевтических доз для схем комбинированной терапии, представлены в табл. 46. Таблица 46. Расчетные токсические дозы иринотекана, цисплатина, этопозида и L-лизин–αоксидазы для мышей-самцов Balb/c при внутрибрюшинном введении Расчетные токсические дозы, мг/кг Препараты ЛД16 ЛД50 ЛД84 ЛД100 Иринотекан 193,73 231,32 [218,8÷243,9] 268,91 287,71 Цисплатин 12,23 15,89 [14,7÷17,1] 19,54 21,37 Этопозид 62,32 98,87 [86,7÷111,1] 135,42 153,69 <25 н/д н/д н/д LO 7.4.2. Эффективность и переносимость комбинации иринотекана с Lлизин–альфа-оксидазой Эффективность и переносимость терапии иринотеканом с добавлением LO была оценена на малочувствительной к LO опухолевой модели — лимфолейкозе Р388, а также на более чувствительной эпидермоидной карциноме легкого Льюис. LO вводили в/в в заранее отработанной схеме «дискретного» 5-кратного режима введения, со снижением поддерживающих доз на 50–66% по сравнению с нагрузочной. Иринотекан вводили в/б однократно, в ½ или ¼ заранее определенной МПД. Изучены схемы как с одновременным началом лечения — через 24 ч после трансплантации опухолевых клеток, так и с отсрочкой начала курса введения LO до 72 или 120 ч после трансплантации. 138 Результаты изучения эффективности и переносимости комбинации иринотекана с LO на модели лимфолейкоза Р388 представлены в табл. 47. Монотерапия иринотеканом дала достоверный высокий эффект, УПЖ=105% или 175% (p<0,05), при отсутствии излеченных мышей. LO в монотерапии дала минимально значимый эффект, УПЖ=29%. Добавление LO при одновременном начале лечения не дало достоверного повышения эффекта по сравнению с монотерапией иринотеканом: УПЖ=82–120%. Тенденция к повышению эффективности комбинации получена при применении относительно невысоких доз препаратов: 50 мг/кг иринотекана (¼ МПД) и суммарной дозы LO 300–450 МЕ/кг: УПЖ=114–120% против 82–86% (<0,05). Таблица 47. Эффективность комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза на модели внутрибрюшинного лимфолейкоза Р388 Группа Дозы разовые Сутки Дозы введения суммарные УПЖ% Излечение 1-я 2–5-я 100 мг/кг – 1 100 мг/кг 175* 0/11 50 мг/кг – 1 50 мг/кг 105* 0/9 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 1, 3, 5, 7, 9 600 МЕ/кг 29 0/6 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 1, 3, 5, 7, 9 450 МЕ/кг 19 0/6 150 МЕ/кг 50 МЕ/кг 1, 3, 5, 7, 9 350 МЕ/кг 13 0/6 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 1, 3, 5, 7, 9 300 МЕ/кг 10 0/6 100 МЕ/кг 33 МЕ/кг 1, 3, 5, 7, 9 232 МЕ/кг 13 0/6 100 мг/кг – 1 100 мг/кг 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 1, 3, 5, 7, 9 600 МЕ/кг 86* 0/6 50 мг/кг – 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 84* 0/5 Иринотекан 50 мг/кг – LO 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 82* 0/5 50 мг/кг – 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 120* 0/5 50 мг/кг – 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 114* 0/6 Иринотекан LO 1 1, 3, 5, 7, 9 1 3, 5, 7, 9, 11 1 5, 7, 9, 11, 13 1 1, 3, 5, 7, 9 50 мг/кг 600 МЕ/кг 50 мг/кг 600 МЕ/кг 50 мг/кг 450 МЕ/кг 50 мг/кг 300 МЕ/кг * достоверно по отношению к контролю (p<0,05) Переносимость комбинации или монотерапии была удовлетворительной, гибели животных от токсичности не отмечали. В группах с иринотеканом наблюдали умеренную диарею со снижением массы тела на 10–20%, более выраженным при использовании иринотекана в дозе 100 мг/кг и LO в суммарной дозе 600 МЕ/кг. Монотерапия LO не давала осложнений. Таким образом, на модели в/бр лейкоза Р388 показана высокая эффективность иринотекана, на фоне 139 которой терапевтический выигрыш комбинации с LO можно уловить только при применении невысоких терапевтических доз. Наиболее эффективный для мышей с Р388 дозовый режим был изучен на модели LLC. Результаты представлены в табл. 48. Видно, что на этой модели монотерапия LO или иринотеканом в низких терапевтических дозах была одинаково эффективной. Для иринотекана в дозах ≥50 мг/кг ТРОmax составило 87% с сохранением ТРО>50% в течение 2 нед. Комбинация иринотекана 50 мг/кг и LO в суммарной дозе 300 мг/кг дала ТРОmax=94% против ТРОmax=40–43% при применении одного иринотекана в дозах 20 и 40 мг/кг и ТРОmax=42% при монотерапии LO. Ингибирующий эффект комбинации, сопоставимый с эффектом иринотекана в дозе 100 мг/кг, был более существенным, т.к. в отличие от всех групп монотерапии сопровождался достоверным продлением жизни мышей, УПЖ=35% (p<0,05). Следовательно, добавление LO к невысокой дозе иринотекана позволяет получить терапевтический выигрыш и улучшить выживаемость мышей. Изменение срока начала введения LO (48 или 96 ч после трансплантации опухоли) или увеличение суммарной дозы LO >300 МЕ/кг не сказывались на эффективности комбинации. Переносимость комбинации иринотекан + LO в использованном дозовом диапазоне или обоих препаратов по отдельности была одинаково удовлетворительной: состояние и поведение мышей без особенностей. В группах мышей, получивших иринотекан, в течение 10 суток отмечали умеренную диарею при небольшой потере массы тела (<10%), что соотносится с данными других авторов [20]. Гибели от токсичности при всех видах лечения не отмечали. Добавление к иринотекану LO не приводило к усилению характерной для иринотекана гастроинтестинальной токсичности и не давало новых побочных эффектов у мышей с подкожной LLC. Таким образом, на модели LLC комбинация иринотекан ¼ МПД + LO 300–450 МЕ/кг дает значимый суммационный терапевтический выигрыш с увеличением продолжительности жизни мышей до 35%. Удовлетворительная переносимость комбинации и отсутствие усиления проявлений гастроинтестинальной токсичности позволяют перспективной для углубленного доклинического изучения. считать эту комбинацию 140 Таблица 48. Эффективность комбинации иринотекан + L-лизин-α-оксидаза на модели эпидермоидной карциномы легкого Льюис LLC Дозы разовые Группа Иринотекан LO Иринотекан LO 1-я n Сутки введения 2-5-я ТРО, % (сутки после трансплантации) Дозы суммарные УПЖ, % 10 18 26 20 мг/кг – 9 2 20 мг/кг 40* 18 7 2 40 мг/кг – 9 2 40 мг/кг 43* 19 17 0 50 мг/кг – 10 2 50 мг/кг 65* 64* 30 16 60 мг/кг – 10 2 60 мг/кг 87* 55* 18* 29 100 мг/кг – 10 2 100 мг/кг 83* 63* 46* 9 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 10 2, 4, 6, 8, 10 600 МЕ/кг 42 30 30 1 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 10 2, 4, 6, 8, 10 450 МЕ/кг 29 29 7 6 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 10 2, 4, 6, 8, 10 300 МЕ/кг 23 3 0 0 100 мг/кг – 10 2 100 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 2, 4, 6, 8, 10 300 МЕ/кг 89* 53* 39* 13 100 мг/кг – 2 100 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 4, 6, 8, 10, 12 300 МЕ/кг 94* 69* 42* 35* 50 мг/кг – 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 79* 46* 14 3 50 мг/кг – 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 61* 57* 14 13 50 мг/кг – 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 79* 77* 39 35* 50 мг/кг – 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 88* 57* 32* 18 10 10 2 2, 4, 6, 8, 10 10 2 2, 4, 6, 8, 10 10 2 2, 4, 6, 8, 10 9 2 4, 6, 8, 10, 12 Примечание: *Достоверно по отношению к контролю (p<0,05) 50 мг/кг 600 МЕ/кг 50 мг/кг 450 МЕ/кг 50 мг/кг 300 МЕ/кг 50 мг/кг 300 МЕ/кг 141 7.4.3. Эффективность и переносимость комбинации цисплатин + L-лизинальфа-оксидаза Оценка эффективности сочетания цисплатин и L-лизин-α-оксидазы на P388. Видно (табл. 49), что сочетание цисплатина и LO, примененной в суммарных дозах 300 или 450 МЕ/кг, не улучшает результаты лечения в сравнении с одним цисплатином независимо от величины его однократной дозы. Тенденция к улучшению эффективности выявлена при дозе цисплатина 6 мг/кг: УПЖ=83-89% против 56%, однако различия недостоверны (p>0,05). Переносимость схем с однократным применением цисплатина и в зависимости от его дозы была хуже вплоть до гибели мышей. Таким образом, на Р388 однократное введение цисплатина в сочетании с LO не позволяет достичь синергизма, возможно, из-за усиления общей токсичности. Трехкратное лечение цисплатином привело к другим результатам. Сочетанное лечение с использованием относительно низкой суммарной дозы цисплатина 2,25 мг/кг даже в сочетании с максимальной суммарной дозой LO 600 МЕ/кг не дало синергизма. Значимый результат получен при разовых дозах 1,5–3,0 мг/кг цисплатина и LO 100–200 МЕ/кг (первая) и 50–100 МЕ/кг (последующие). В этих основных группах эффективность была достоверно выше, чем в адекватной по дозе группе цисплатина: УПЖ=183–208% против УПЖmax=128% (p<0,05). Терапевтический выигрыш по действию на первичную опухоль составил 26–51%. Переносимость всех видов лечения была удовлетворительной без гибели животных от токсичности и соответствовала таковой в группах цисплатина. Таким образом, на Р388 сочетание цисплатина и LO реализует дозозависимый синергизм по длительности выживания мышей без ухудшения переносимости лечения. В сочетании суммарная доза цисплатина при 3кратном введении должна быть ≥4,5 мг/кг, а при 5-кратном введении LO ≥600 МЕ/кг. Оценка синергизма сочетания цисплатин и L-лизин-α-оксидазы на LLC. Сочетанное лечение LLC с 3-кратным введением цисплатина и 5-кратным курсом LO иллюстрирует табл. 50. Видно, что умеренно чувствительная к цисплатину карцинома легкого идентично отвечает на сочетанное лечение как по действию на опухолевый узел, так и по выживаемости мышей: ТРОmax=85% против 79%, УПЖ=37% против 15% (значимых различий нет, p>0,05). Переносимость всех схем лечения была удовлетворительной и идентичной группе цисплатина: состояние и поведение мышей без особенностей, гибели от токсичности не отмечали. Таким образом, сочетание цисплатина и LO при равной переносимости не дает синергизма по эффективности на LLC. 142 Таблица 49. Эффективность комбинации цисплатин + L-лизин-α-оксидаза на модели лимфолейкоза P388 Группа Дозы разовые Дозы УПЖ% Гибель от 1-я 2–3-я (5-я) суммарные 6 мг/кг – 6 мг/кг 56* 0/5 3 мг/кг – 3 мг/кг 33 0/5 1,5 мг/кг – 1,5 мг/кг 13 0/5 3 мг/кг 3 мг/кг 9 мг/кг 128* 0/6 1,5 мг/кг 1,5 мг/кг 4,5 мг/кг 85* 0/5 0,75 мг/кг 0,75 мг/кг 2,25 мг/кг 25* 0/5 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 600 МЕ/кг 29 0/6 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 450 МЕ/кг 19 0/6 150 МЕ/кг 50 МЕ/кг 350 МЕ/кг 13 0/6 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 300 МЕ/кг 10 0/6 100 МЕ/кг 33 МЕ/кг 232 МЕ/кг 13 0/6 6 мг/кг – 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 6 мг/кг – 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 3 мг/кг – 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 3 мг/кг – 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 1,5 мг/кг – 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 1,5 мг/кг – Цисплатин 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг LO 3 мг/кг 3 мг/кг 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 3 мг/кг 3 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 1,5 мг/кг 1,5 мг/кг 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 1,5 мг/кг 1,5 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 0,75 мг/кг 0,75 мг/кг 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 0,75 мг/кг 0,75 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг * достоверно по отношению к контролю (p<0,05) 6 мг/кг 450 МЕ/кг 6 мг/кг 300 МЕ/кг 3 мг/кг 450 МЕ/кг 3 мг/кг 300 МЕ/кг 1,5 мг/кг 450 МЕ/кг 1,5 мг/кг 300 МЕ/кг 9 мг/кг 600 МЕ/кг 9 мг/кг 300 МЕ/кг 4,5 мг/кг 600 МЕ/кг 4,5 мг/кг 300 МЕ/кг 2,25 мг/кг 600 МЕ/кг 2,25 мг/кг 300 МЕ/кг 89* 2/6 83* 1/6 45* 0/6 35* 0/6 25 0/6 28 0/6 183* 0/6 208* 0/6 115* 0/6 75* 0/6 45* 0/5 29* 0/7 Цисплатин LO токсичности 143 Таблица 50. Эффективность комбинации цисплатин + L-лизин-α-оксидаза на модели эпидермоидной карциномы легкого Льюис LLC Дозы разовые Дозы Группа 1-я Цисплатин LO 2-3-я (5-я) ТРО, % (сутки после трансплантации) суммарные 10 18 26 УПЖ, % 3 мг/кг 3 мг/кг 9 мг/кг 85* 61* 51* 37* 1,5 мг/кг 1,5 мг/кг 4,5 мг/кг 37 14 0 0 0,75 мг/кг 0,75 мг/кг 2,25 мг/кг 15 1 0 0 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 600 МЕ/кг 42 30 30 1 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 450 МЕ/кг 29 29 7 6 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 300 МЕ/кг 23 3 0 0 79* 50* 30 0 64* 38 18 15 72* 54* 25 0 52 29 15 10 29 18 8 8 28 9 1 0 28 4 7 11 3 мг/кг 3 мг/кг 9 мг/кг 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 600 МЕ/кг 3 мг/кг 3 мг/кг 9 мг/кг 150 МЕ/кг 75 МЕ/кг 450 МЕ/кг 3 мг/кг 3 мг/кг 9 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 300 МЕ/кг Цисплатин 1,5 мг/кг 1,5 мг/кг 4,5 мг/кг LO 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 600 МЕ/кг 1,5 мг/кг 1,5 мг/кг 4,5 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 300 МЕ/кг 0,75 мг/кг 0,75 мг/кг 2,25 мг/кг 200 МЕ/кг 100 МЕ/кг 600 МЕ/кг 0,75 мг/кг 0,75 мг/кг 2,25 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 300 МЕ/кг * достоверно по отношению к контролю (p<0,05), n=10. Оценка синергизма сочетания цисплатин и L-лизин-α-оксидазы на меланоме B16. Результаты лечения представлены в табл. 51. Видно, что сочетание цисплатина в суммарной дозе 9 мг/кг и LO в курсовой дозе 300 МЕ/кг было более эффективно, чем один цисплатин. Терапевтический выигрыш достигнут по всем показателям: ингибированию первичного узла, ТРОmax=87% против 58% (p<0,05); длительности удержания эффекта на достоверном уровне (p<0,05), 13 против 5 дней; увеличению выживаемости, УПЖ=29% (p<0,05) при отсутствии достоверного отличия показателя в группе цисплатина. Переносимость лечения была удовлетворительной, гибели от токсичности или ухудшения переносимости терапии в сравнении с группой цисплатина не отмечали. Эти результаты показывают, что сочетанная последовательная терапия цисплатином и LO, особенно в период активного метастазирования В16, достоверно аддитивно усиливает торможение роста первичного узла и пролонгирует время его удержания, что реализуется в достоверном увеличении выживаемости мышей. Этот эффект был ожидаем, поскольку известно, что LO контролирует процесс метастазирования [23]. Отсутствие каких- 144 либо побочных эффектов данной схемы дает основания предполагать, что интенсификация дозового режима лечения может привести к усилению достигнутого синергизма. Таблица 51. Эффективность комбинации цисплатин + L-лизин-α-оксидаза на модели меланомы В16 Дозы разовые Группа Цисплатин Цисплатин LO 1-я Дозы 2-3-я (5-я) суммарные 3 мг/кг 3 мг/кг 9 мг/кг 3 мг/кг 3 мг/кг 9 мг/кг 100 50 МЕ/кг 300 МЕ/кг ТРО, % (сутки после трансплантации) УПЖ, % 10 18 58* 19 24 87* 55* 29* МЕ/кг * достоверно по отношению к контролю (p<0,05), n=10. Таким образом, синергизм сочетания цисплатина и LO зависит от опухолевой модели и сроков лечения и может быть достигнут при одновременном последовательном введении цисплатина и LO. Синергизм сочетания в режиме одновременного последовательного (без интервала) введения достигается в/бр ежедневным в течение 3 дней введением цисплатина в разовых дозах 1,5 или 3,0 мг/кг и в/в 5-кратным через 48 ч введением LO в суммарных дозах 300–600 МЕ/кг в отработанном ранее дискретном режиме. Цисплатин и LO реализуют достоверный (p<0,05) терапевтический выигрыш против цисплатина по аддитивному увеличению выживаемости мышей с Р388 (лечение на 2–9 сутки), УПЖ=208% против 128%; усилению ингибирования роста первичного узла меланомы В16 (лечение на 5–12 с), ТРОmax=87% против 58% с пролонгированием времени его удержания, 13 против 5 дней и выживаемости мышей, УПЖ=29%. 7.4.4. Эффективность и переносимость комбинированной терапии этопозид + L-лизин-альфа-оксидаза Оценка синергизма сочетания этопозида и L-лизин-α-оксидазы на P388. Эффективность и переносимость монотерапии этопозидом оценивали в однократном режиме применения в дозах 30, 15 и 7,5 мг/кг, которые составляют 1/2, 1/4 и 1/8 расчетной МПД этопозида, а также при троекратном введении дозы 5 мг/кг с интервалом 24 ч (суммарная доза 15 мг/кг). LO вводили в низкой терапевтической дозе, продемонстрировавшей синергизм в сочетании с цисплатином. Показано, что монотерапия этопозидом была высокоэффективной и приводила к излечению 3 из 5 мышей при введении максимальной дозы 30 мг/кг однократно или при использовании 5 мг/кг троекратно (табл. 52). Монотерапия LO не давала достоверного эффекта, добавление LO к этопозиду не приводило к достоверному улучшению эффекта ни в одной из изученных групп. 145 Переносимость комбинированной терапии была удовлетворительной без гибели животных от токсичности и соответствовала таковой в группах монотерапии этопозидом. Таблица 52. Эффективность комбинации этопозид + L-лизин–α-оксидаза на модели лимфолейкоза P388 Группа Этопозид LO Дозы разовые Дозы УПЖ% Излечение 1-я 2–3-я (5-я) суммарные 30 мг/кг – 30 мг/кг 158 3/5 15 мг/кг – 15 мг/кг 121* 1/5 7,5 мг/кг – 7,5 мг/кг 93* 0/5 5 мг/кг 5 мг/кг 15 мг/кг 163 3/5 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 300 МЕ/кг 16 0/5 219* 2/5 121* 1/5 83* 0/5 169* 2/5 30 мг/кг – 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 15 мг/кг – Этопозид 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг LO 7,5 мг/кг – 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг 5 мг/кг 5 мг/кг 100 МЕ/кг 50 МЕ/кг * достоверно по отношению к контролю (p<0,05) 30 мг/кг 300 МЕ/кг 15 мг/кг 300 МЕ/кг 7,5 мг/кг 300 МЕ/кг 15 мг/кг 300 МЕ/кг Таким образом, на Р388 как однократное, так и троекратное введение этопозида в сочетании с LO не позволило повысить эффективность терапии. 146 Глава 8. Новые аспекты изучения механизмов действия и прогнозирования биологической активности ферментов 8.1. Оценка взаимосвязей «структура-функция» с использованием сайт-направленного мутагенеза L-аспарагиназы Rhodospirillum rubrum13 Типичная структура мономеров бактериальных L-аспарагиназ II типа представляет собой двухдоменный белок, состоящий из примерно 300 аминокислотных остатков, 12–14 бета-тяжей и 8 альфа-спиралей. L-аспарагиназы II типа активны как гомотетрамеры с четырьмя активными сайтами, каждый из расположен между N- и С-терминальными доменами рядом расположенных мономеров (рис. 29). Ядро активного сайта расположено в месте сближения первого и третьего параллельного тяжей N-концевого домена и окружено подвижными выступающими петлями N- и С-концевого доменов прилежащих мономеров [320]. Кристаллографические и структурные исследования показали, что бактериальные Lаспарагиназы имеют два высококонсервативных треонин-содержащих мотива: [LIVM-x(2)-T-GG-T-[IV]-[AGS] и G-x-[LIVM]-x(2)-H-G-T-D-T-[LIVM], с абсолютно консервативным остатком Lys162 (в последовательности EcAI) [75]. Наличие этого консервативного мотива в Lаспарагиназах, независимо от длины первичной последовательности и локализации фермента, свидетельствует о том, что именно эта область имеет исключительное значение для реализации ферментативной функции [289]. Анализ аминокислотных последовательностей YpA с помощью CLUSTAL 2.0.10 multiple sequence alignment показал 99% идентичность YpA с L-аспарагиназой Yersinia pestis. YpA и EcA идентичны на 74%, причем N-концевые участки более близки по последовательности аминокислот, чем С-концевые. C EwA степень гомологии ниже и составляет 44%. EwA по аминокислотному составу на 77% гомологична ErA, более близки N-концевые участки. Филогенетически все изученные L-аспарагиназы II типа (YpA, EwA и WsA) близки применяемой в клинической практике EcA. Наибольший интерес для изучения взаимосвязей «структура-функция» представляла RrA, поскольку она существенно короче других Lаспарагиназ с доказанным антипролиферативным эффектом. Модели пространственных структур RrA и YpA, вперые выделенных в настоящей работе, представлены на рис. 29. Исследования проведены совместно с к.б.н. М.Д. Казановым, Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича и д.б.н. А.В. Веселовским, ИБМХ им. В.Н. Ореховича 13 147 а б в г Рис. 29. Пространственная структура EcA (а), филогенетическое древо изученных L-аспарагиназ (б), наложение пространственных структур мономеров RrA (в) и YpA (г) наEcA. 148 Поиск гомологов RrA с известной пространственной структурой на сервере RCSB PDB показал, что ближайшим является L-аспарагиназа I типа из Pyrococcus horikoshii (код PDB 1wls, код UniProt O57797). L-аспарагиназа P. horikoshii представляет собой гомодимер, каждая субъединица состоит из двух доменов: N-концевого домена (остатки 1–198 и С-концевого домена (остатки 199–328). Выравнивание аминокислотных последовательностей этих двух белков показало (рис. 30), что они могут быть выравнены по N-концевому домену. Идентичность последовательностей составляла 28%. Такая идентичность лежит на нижней условной границе, принятой для моделирования пространственной структуры белка по методу гомологии. Рис. 30. Выравнивание аминокислотных последовательностей RrA (Q2RMX1) и L-аспарагиназы Pyrococcus horikoshii (O57797). Коэффициент Kav, характеризующий мобильность RrA и ее мутантных форм RrAD, RrAE, RrAC, RrAB, RrAJ составляет около 0,071–0,074 (Ve в диапазоне 24,2–24,4 mL) и соответствует молекулярной массе 80 кДа. Это свидетельствует о том, что RrA обладает максимальной активностью, главным образом, в форме тетрамера, аналогично ферментам с большей молекулярной массой, таким как EcA, ErA и др. В доступной литературе практически нет результатов изучения структурно-функциональных взаимосвязей для L-аспарагиназ I типа с короткой аминокислотной цепочкой [289]. Однако как и в случае периплазматических Lаспарагиназ с длинной первичной последовательностью, для RrA характерно наличие высококонсервативного фрагмента THGTDTMVETA (рис. 31). 149 Рис. 31. Выравнивание консервативных фрагментов различных аминокислотных последовательностей: 3ECA_A T89V и 3ECA_A T89S — мутантные формы EcA с соответствующими аминокислотными заменами; RrAH — мутантная форма RrA c заменами G86P, D88H, M90K); 2WLT — HpA; 2P2D — цитопламатическая аспарагиназа E. coli; 1WNF — L-аспарагиназа Pyrococcus horikoshii; 3ECA — нативная EcA; 3PGA — L-аспарагиназаглутаминаза Pseudomonas; 1WSA — WsA; 1AGX — L-аспарагиназа-глутаминаза Acinetobacter glutaminasificans; RrA — нативная RrA. Построенная в SYBYL8.1. модель пространственной структуры мономера RrA (рис. 32) показала ожидаемую величину стандартного отклонения (Z-score) в программе SWISSMODEL-3.06, что указывало на правдоподобность построенной модели. Кроме того, правдоподобие построенной структуры было также оценено с помощью ProCheck (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/PROCHECK/) [206]. Проведенный анализ показал, что в модели пространственной структуры RrA более 80% аминокислотных остатков находились в разрешенных областях на карте Рамачандрана, и только 4 остатка, расположенные в петлях, попадали в запрещенные области. Все эти остатки находятся на неструктурированных участках белка. Один из них (Asp32) был заменен в RrAG; согласно построенной модели неблагоприятное положение этого остатка стабилизируется солевым мостиком с Arg116. Рис. 32. Положения аминокислотных замен в структуре RrA. Замены в мутантных формах, сохраняющих активность, помечены голубым цветом. Мутации, приведшие к потере ферментативной активности, помечены красным (RrAF, RrAG) или фиолетовым цветом (RrAI, RrAH). 150 Сравнение структур активных центров RrA и EcA показало, что многие аминокислотные остатки, формирующие активные центры в N-концевом домене EcA и RrA, совпадают, включая каталитически наиболее значимый Thr16 RrA (Thr12 EcA). Необходимо отметить, что активные центры всех известных L-аспарагиназ формируются при взаимодействии двух субъединиц. Участие только двух аминокислотных остатков C-концевого домена другой субъединицы в формировании активного центра EcA, также подтверждает правильность модели фолдинга RrA. Тем не менее, наши экспериментальные данные показали, что в растворе RrA существует главным образом в форме тетрамера, поэтому вопрос олигомеризации RrA остается предметом дальнейших исследований. Анализ положений аминокислотных замен показал, что в процессе олигомеризации могут принимать участие остатки D60 и F61 у RrAD и R118 и G120 у RrAJ. В обоих случаях полученные мутантные белки были более стабильны в растворе мочевины и более эффективно катализировали гидролиз субстрата. Возможно также, что в этом процессе участвуют аминокислотные остатки C-конца, поскольку удаление четырех C-концевых остатков приводило к разрушению четвертичной структуры. Расчет электростатического потенциала на поверхности RrA согласно построенной модели показал наличие большого количества отрицательно заряженных участков и ограниченного числа кластеров с положительным зарядом. Учитывая, что для RrA характерно снижение ферментативной активности при повышении ионной силы раствора, можно предположить, что в формировании олигомеров большую роль играют также электростатические взаимодействия. Сайт-направленный мутагенез EcA [60, 111, 149, 206, 348], а также результаты рентгеноструктурного анализа [261] показали, что остатки Tyr25, Thr12, Thr89 и Lys162 непосредственно участвуют в катализе, в то время как Asp90, Ser58, Asn248, Ala114 и Glu283 ответственны за связывание субстрата с помощью водородных связей. Гидроксильные группы в положениях 89 и 12 необходимы для реакции расщепления L-аспарагина [149, 261]. В случае RrA аминокислотные замены G86P, D88H, M90K (RrAH), a также I17S, D18T, D20H (RrAF) изменяют заряд фермента и его конфигурацию рядом с каталитически значимыми остатками Thr16, Thr87 и Thr89, что полностью снижает ферментативную активность до базового уровня и подтверждает важность этого участка белка для ферментативной реакции (табл. 53). Замены D60K и F61L (RrAD), а также R118H и G120R (RrAJ) приводят к улучшению кинетических характеристик и стабилизации фермента, возможно, вследствие устранения стерических препятствий при олигомеризации. 151 Таблица 53. Сопоставление аминокислотных остатков, формирующих активные центры в RrA и EcA EcA Gly11 Thr12 Ile13 Val27 Gly57 Ser58 Gln59 His87 Gly88 Thr89 Asp90 Thr91 Ala114 Met115 Lys162 RrA Gly15 Thr16 Leu17 Lys19 Asp57 Ser58 Leu59 His85 Gly86 Thr87 Asp88 Thr89 Ala113 Met114 Lys158 Рис. 33. Структуры активного центра RrA (а) в сравнении с EcA (б). В активном центре EcA выявлены две наиболее значимые группы из трех аминокислотных остатков «триады»: Thr89-Lys162-Asp90 и Thr12-Tyr25-Glu283 [109]. Аминокислотные остатки в триадах связаны между собой водородными связями наподобие каталитических триад сериновых протеаз, образованных аспарагиновыми, гистидиновыми и сериновыми аминокислотными остатками. В случае RrA для осуществления гидролиза L-аспарагина критично важно наличие остатка L-аспарагиновой кислоты не только в положении 88, но также и в положении 123, поскольку показано, что мутации в RrAI (G121L, D123A) приводят к потере ферментативной активности. Несмотря на удаленность этих аминокислотных остатков друг от 152 друга, можно предположить, что эти участки сближаются при фолдинге белка и формируют активный центр с несколькими остатками треонина. Снижение отрицательного заряда в непосредственной близости контакта субъединиц фермента может уменьшать отталкивание мономеров, заряженных, главным образом, отрицательно, и повышать конформационную стабильность. Стабильность четвертичной структуры также возрастает при образовании дополнительных ионных связей и формировании неполярных контактов. Замены A64V и E67K, особенно в сочетании с E149R и V150P (RrAE), существенно дестабилизируют фермент. В этом случае конформационная нестабильность при физиологических значениях рН, возможно, является причиной ухудшения кинетических параметров и снижения биологической активности. Все основные активные центры EcA (взаимодействующие с NH2-группой и карбоксильными группами субстрата остатки Thr12, Gln59, Ser58, Thr89, Asp90, Ala114, Glu283) совпадают с YpA [220]. Совпадают также Tyr25, непосредственно участвующий в катализе, Tyr181 и Tyr326, важные для стабилизации нативного тетрамера EcA, a также Asn248, отвечающий за Lглутаминазную активность EcA и образующий водородную связь с остатком Asp90 [109, 110]. У ErA и EwA общий участок 12TGGTIAG19, включая высоко консервативный для L-аспарагиназ Thr15, атакующий γ-амидную группу субстрата [43]. Однако величина Km EwA для Lаспарагина существенно выше, чем у ErA и других ферментов сравнения. Различие Km для EwA и ErA может объясняться заменами Ala22Thr и Asn23Gly в подвижной петле активного центра EwA, которые изменяют сеть водородных связей этого участка и, соответственно, снижают специфичность EwA в отношении L-Asn [21]. Другой причиной отличия Km для L-аспарагина у EwA может быть замена Glu289, которая участвует в связывании L-аспарагина и является консервативным остатком для всех L-аспарагиназ, на Ala289 [43]. Таким образом, путем сайт-направленного мутагенеза были идентифицированы отдельные участки RrA, отвечающие за фолдинг белка и его ферментативную активность. Отсутствие Lаспарагиназной активности у RrAH, RrAF, RrAI, RrAG подтверждают важность аминокислотных остатков I17, D18, D20, D32, P33, G86, D88, M90, G121, D123 для ферментативной активности. Замены D60K, F61L, R118H, G120R приводят к улучшению кинетических характеристик и стабилизации фермента. Замены A64V, E67K, особенно в сочетании с E149R и V150P, заметно дестабилизируют его. YpA, WsA и EwA близки к другим L-аспарагиназам II типа и, вероятно, обладают идентичным молекулярным механизмом гидролиза L-аспарагина. 153 8.2. Взаимосвязь между антипролиферативной и ферментативной активностью14 8.2.1. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта L-аспарагиназ Совокупность современных научных знаний предполагает наличие многофакторного механизма антипролиферативного действия L-аспарагиназ, однако считается, что ведущая роль принадлежит расщеплению L-аспарагина. В опубликованных работах пока нет доказательств прямой связи между сродством к субстрату и антипролиферативной активностью Lаспарагиназ. Выделение L-аспарагиназ из новых источников и получение новых данных об их кинетических характеристиках и антипролиферативной активности расширило возможности сопоставления различных параметров их ферментативной и антипролиферативной активности с целью выявления возможных закономерностей. Для оценки связи между антипролиферативной и ферментативной активностью нами были использованы собственные данные, полученные при изучении пяти различных L-аспарагиназ YpA, RrA, WsA, EwA в сравнении с EcA. Были отобраны сопоставимые количественные параметры ферментативной (Km) и антипролиферативной активности (IC50) изученных ферментов и оценена статистическая значимость их взаимосвязи. Зависимость антипролиферативной активности in vitro от Km. Поскольку предварительно определенная цитотоксическая активность RrA c Km 0,221 мМ (рис. 34) не укладывалась в общую закономерность, было проведено два варианта корреляционного анализа: по всем проведённым наблюдениям и только по внеклеточным L-аспарагиназам II типа WsA, YpA, EcA и EwA (табл. 54). Для этих ферментов выявлен отчетливый тренд: с повышением Km увеличивалась IC50: r=0,66, р=0,007. Однако при включении в анализ всех полученных Lаспарагиназ коэффициент корреляции закономерно снижался до статистически незначимой величины 0,39 (р=0,097), т.к. связь оказалась нелинейной. На основе полученных данных формально возможно построение нелинейной регрессии с квадратичной формой зависимости: IC50 = –1,9 + 556,6×Km – 2023×Km2 (рис. 35). Таблица 54. Коэффициенты корреляции между IC50 и Km изученных L-аспарагиназ Варианты Только по периплазматическим L-аспарагиназам, без RrA По всему исследованному массиву сравнения r 0,66 0,39 p 0,007 0,097 n 15 19 Исследования проведены совместно с к.б.н. М.В. Комаровой, Самарский государственный аэрокосмический университет им. С.П. Королева 14 154 Рис. 34. Парный график разброса зависимости цитотоксичности L-аспарагиназ от ферментативной активности по соотношению IC50 и Km для разных клеточных линий перевиваемых опухолей человека и мышей Рис. 35. Моделирование зависимости цитотоксичности L-аспарагиназ от ферментативной активности с помощью нелинейной регрессии 155 Модель статистически значима (F=3,65; р=0,049), коэффициент детерминации модели R2=0,31 (соответственно, коэффициент множественной корреляции R=0,56), однако биохимический механизм оптимизации антипролиферативных свойств RrA с высокой Km 0,221 остаётся недостаточно понятным. Использование аналогичных методов для прогнозирования цитотоксической активности на основе kcat и kcat/Km не показало какой-либо достоверной связи между изучаемыми параметрами. Зависимость антипролиферативной активности in vivo от Km. Анализ выполнен в популяции из 205 мышей, получивших лечение L-аспарагиназами, и 40 мышей из групп контроля роста опухоли (табл. 55). В группах мышей, получивших лечение, получено достоверное дозозависимое увеличение выживаемости с излечением мышей. Для сравнения L-аспарагиназ с различными Кm по уровню противоопухолевой активности величины разовых доз сгруппировали в 3 диапазона: 500–1000; 2000–8000; 12000–20000 МЕ/кг, выделяя в каждом долю павших мышей (табл. 55). Таблица 55. Распределение мышей по группам в зависимости от разовой дозы L-аспарагиназы Разовая доза, МЕ/кг Число мышей в каждой группе YpA EcA Всего WsA 500 0 8 1000 13 13 2000 0 8 4000 0 7 8000 0 8 12000 0 0 16000 0 0 20000 0 0 Итого 57* *Km 0,017 мМ, значения объединены. EwA 7 13 14 7 7 0 0 0 48 RrA 0 8 8 8 8 8 8 8 56 7 8 8 7 8 0 6 0 44 22 55 38 29 31 8 14 8 205 Видно, что при первом дозовом ранге 500–1000 МЕ/кг разброс в долях неизлеченных мышей большой и составляет 35–100% и 24–65% (2=23,22, р<0,001), зависимость неизлеченности от Km фермента выявить не удалось (D=0,13). Возможно, этот результат обусловлен также несоразмеримостью анализируемых показателей высокоактивной L-аспарагиназы WsA с умеренной Km, не соответствующей её положению в ряду ферментных препаратов, ранжированных по сродству к L-аспарагину. 156 Таблица 56. Статистическая значимость соотношения числа излеченных и неизлеченных мышей с лимфаденозом Фишера для L-аспарагиназ с различной Km в зависимости от дозы Диапазон Исход разовых доз, МЕ/кг, n 500–1000, Излеч. n=77 Неизлеч. Абсолютное число мышей, % Величина Km, мМ 0,017 0,054 0,073 0,221 8 (24%) 26 (76%) 13 (65%) 7 (35%) – 8 (100%) – 15 (100%) 2000–8000, n=98 Излеч. Неизлеч. 15 (65%) 8 (35%) 26 (93%) 2 (7%) 1 (4%) 23 (96%) 3 (13%) 20 (87%) ≥12000, n=30 Излеч. Неизлеч. – – – – 7 (29%) 17 (71%) 3 (50%) 3 (50%) Статистическая значимость и теснота связи р<0,001 2=23,22 D=0,13 p<0,001 2=51,1 D=0,50 р=0,333 2=0,94 D= –0,17 Более наглядные результаты получены при втором дозовом ранге 2000–8000 (n=98). В группах ферментов с различной Km статистически доказана взаимосвязь противоопухолевой активности от Km: чем больше Km, тем выше неизлеченность (D=0,52; р<0,001) при статистически значимой доле неизлеченных мышей (2=17,8, р<0,001). Внутри выделенных дозовых диапазонов расчёт доверительных интервалов частот неизлеченных животных показал сопоставимый уровень противоопухолевой активности (рис. 36). Соответственно, в группе высокоактивных аспарагиназ YpA и EcA с Km 0,017 мМ доля неизлеченных мышей составила 35% (95% ДИ, 16–57%), а для WsA с Km 0,054 мМ — 7% (95% ДИ, 1–24%). Доверительные интервалы перекрываются, что свидетельствует об идентичной эффективности L-аспарагиназ с Km 0,017 и 0,054 мМ. Аналогично, среди ферментов с низкой ферментативной активностью число неизлеченных животных составило 96% (95% ДИ: 79–100%) для EwA с Km 0,073 мМ и 87% (95% ДИ: 66–97%) для RrA с Km 0,221 мМ. Таким образом, сопоставляя критерий излечения с уровнем ферментативной активности при дозовом диапазоне 2000–8000 МЕ/кг, прогностически перспективными по критерию излечения можно считать L-аспарагиназы с Km 0,017 и 0,054 мМ. При оценке антипролиферативной активности L-аспарагиназ у мышей с лейкозом показано, что при дозах >12000 МЕ соотношение долей излеченных и неизлеченных идентично (р=0,333), значение Сомера низкое, D= –0,17, p>0,05. Это свидетельствует об отсутствии связи между антипролиферативной и ферментативной активностью L-аспарагиназ при достижении высоких терапевтических доз. 157 Доля умерших 100% 80% 60% 40% 20% 0% Km=0,017 Km=0,054 Km=0,073 Km=0,221 Рис. 36. Доля павших в результате развития опухоли мышей после применения L-аспарагиназ с различной Km в разовых дозах 2000–8000 МЕ/кг. Оценка этой взаимосвязи выполнена также по продолжительности жизни (ПЖ) мышей с лимфаденозом Фишера. При расчете медианы ПЖ учитывали только неизлечивающие дозы. Кривые Каплана–Мейера, построенные по индивидуальным показателям ПЖ мышей, приведены на рис. 37. При дозовом ранге 500–1000 МЕ/кг для L-аспарагиназ с Km 0,017 медиана ПЖ=31 день, с Km 0,073 — 15 дней и с Km 0,221 — 19 дней. Для WsA медиану ПЖ в расчет не включали из-за >50% излечения. При дозовом ранге 2000–8000 МЕ/кг для Lаспарагиназ с Km 0,073 и 0,221 медиана ПЖ составила 17 и 25 дней, в случае Km 0,017 определение показателя невозможно из-за высокого процента излечения. Логранговый тест (табл. 57) позволил установить, что различия в ПЖ мышей в зависимости от величины Km значимы для L-аспарагиназ с Km 0,054 и 0,017 мМ при дозовом ранге 500–1000, МЕ/кг (р=0,001), а для L-аспарагиназ с Кm 0,073 и Кm 0,221 (р<0,00) при дозовом ранге 12000– 8000 МЕ/кг (р=0,013). В случае применения L-аспарагиназ с Кm 0,017 выживаемость мышей была значимо больше по сравнению с двумя менее активными ферментами (р<0,001). При лечении L-аспарагиназами в разовых дозах от 12000 МЕ/кг и выше различия в ПЖ между EwA и RrA не выявлены. 158 Рис. 37. Кривые выживаемости мышей, получивших L-аспарагиназы в/бр в различных разовых дозах. 159 Таблица 57. Статистическая значимость различий выживаемости мышей при применении трех дозовых диапазонов L-аспарагиназ с различной ферментативной активностью Кm сравниваемых пар ферментов 0,017 и 0,054 0,017 и 0,073 0,017 и 0,221 0,054 и 0,073 0,054 и 0,221 0,073 и 0,221 500–1000 Log Rank=10,6 р=0,001 Log Rank=54,1 р<0,001 Log Rank=40,8 р<0,001 Log Rank=33,8 р<0,001 Log Rank=42,9 р<0,001 Log Rank=26,4 р<0,001 Диапазон доз, МЕ/кг 2000–8000 Log Rank=6,2 р=0,013 Log Rank=32,0 р<0,001 Log Rank=20,2 р<0,001 Log Rank=50,9 р<0,001 Log Rank=41,3 р<0,001 Log Rank=12,0 р<0,001 ≥12000 н/д н/д н/д н/д н/д Log Rank=2,0 р=0,160 Следует отметить, что кривые Каплана–Мейера не дают оценку направленности взаимосвязи факторов риска и выживаемости или смертности. Именно по этой причине для оценки тесноты связи излеченности и биохимических свойств фермента мы провели корреляционный анализ. Расчет коэффициентов корреляции при диапазоне разовых доз 500–1000 МЕ/кг показал обратную зависимость между Кm и эффективностью L-аспарагиназ: чем больше Км, тем меньше ПЖ мышей (r= –0,47, р<0,001) (табл. 58). При разовых дозах 2000–8000 МЕ/кг данная взаимосвязь была подтверждена (r= –0,58, р<0,001), а при высоких дозах отмечен обратный тренд (r= +0,37, р=0,045), возможно из-за неодинаковой выборки для сравнения: в дозах до 8000 МЕ/кг были сравнены все ферменты из пяти микроорганизмов, а в разовых дозах ≥12000 МЕ только EwA и RrA. Поскольку в высокодозные группы по биоэтическим соображениям не включены самые активные ферменты с Кm 0,017 и 0,054 мМ, ПЖ мышей, получивших терапию в дозах ≥12000 МЕ/кг неизвестна, сравнение коэффициентов корреляции в группах с разным числом ферментов не вполне корректно. При корреляционном анализе в общей популяции из 205 животных подтверждается обратная зависимость между Km и продолжительностью жизни животного с L5178 (r= –0,44; р<0,001). Таблица 58. Статистические показатели взаимосвязи между продолжительностью жизни мышей с лимфаденозом Диапазон доз, МЕ/кг n r Km L-аспарагиназ p 500–1000 77 –0,47 <0,001 2000–8000 98 –0,58 <0,001 >12000 30 0,37 0,045 Всего 205 –0,44 <0,001 Примечания: r — коэффициент корреляции Спирмена между Km и ПЖ, р — статистическая значимость коэффициента корреляции, n — число наблюдений. и 160 Помимо описанных выше расчетов, для выявления взаимосвязи ферментативной и антипролиферативной активности была использована регрессионная модель Кокса. Хотя эта модель и не предлагает никакой меры тесноты связи, она хорошо отрабатывает цензурированные наблюдения (излеченные животные, у которых истинная ПЖ неизвестна, известно только время до окончания наблюдения за ними). Как известно, регрессионная модель Кокса — полупараметрическая, т.е. она не позволяет вычислить непосредственно риск гибели от опухолевого процесса (неизлеченности), но показывает, во сколько раз он возрастает с увеличением значений предикторов — предсказывающих переменных в модели. Km и доза препарата были рассмотрены как номинальные признаки, когда каждая градация (т.е. каждая отдельная Km или дозовый диапазон) сравнивается с референсной категорией. Связано это с отсутствием достоверных признаков линейности взаимосвязи Km и дозы препарата с риском неизлеченности. При этом параметры модели — экспоненциальные коэффициенты — показывают, во сколько раз больше риск неизлеченности при данном значении признака по сравнению с референсом (табл. 59). Таблица 59. Моделирование риска неизлеченности мышей с лимфаденозом с помощью регрессионной модели Кокса в зависимости от предиктора (Km/доза) L-аспарагиназы Дозовый диапазон, МЕ/кг 500–1000 Наблюдений Всего Излечено Предиктор Градации предиктора ОР (95% ДИ) р 1 – 0,28 (0,12–0,65) 0,003 Km 4,84E+06 (7,42E-94 – 3,16E+106) 0,896 0,221 10,77 (4,69–24,75) <0,001 2000– 98 45 Km 0,017* 1 – 8000 0,054 0,16 (0,03–0,75) 0,020 0,073 26,83 (9,82–73,33) <0,001 0,221 6,63 (2,72–16,18) <0,001 Доза, МЕ/кг 2000* 1 – 4000 0,53 (0,26–1,05) 0,136 8000 0,19 (0,08–0,44) <0,001 Примечание: *референс; ОР (95% ДИ) — относительный риск неизлеченности и его 95% ДИ Моделирование показало, что для L-аспарагиназ при разовой дозе 1000 МЕ/кг величина Km не 77 21 0,017* 0,054 0,073 имеет выраженной однонаправленной связи с антипролиферативной активностью. Так, для WsA с Km 0,054 мМ прогноз риска неизлеченности меньше по сравнению с референсным ферментом с Km 0,017 мМ: ОР=0,28 (95% ДИ: 0,12–0,65). А для RrA со значительно меньшей ферментативной активностью риск неизлеченности был больше: ОР=10,77 (95% ДИ: 4,6–24,75). Для EwA с Km 0,073 мМ статистический анализ по данному параметру не значим, влияние на выживаемость мышей отсутствует. 161 При средних разовых дозах L-аспарагиназ (от 2000 до 8000 МЕ/кг) на выживаемость мышей с лимфаденозом оказывали влияние и Km и доза. При увеличении разовой дозы до 8000 МЕ/кг риск неизлеченности ожидаемо уменьшался: ОР=0,19 (95% ДИ: 0,08–0,44). Что касается Km, то зависимость противоопухолевой активности от Кm и в этой модели оказалась нелинейной. Использование WsA с Km 0,054 мМ снижало риск неизлеченности (ОР=0,16 (95% ДИ: 0,03– 0,75), а ферментов с Km 0,073 и 0,221 мМ резко его увеличивало по сравнению с референсным ферментом с Km 0,017 мМ: ОР=26,83 (95% ДИ: 9,82–73,33) и ОР=6,63 (95% ДИ: 2,72–16,18), соответственно. В представленных результатах в качестве референсного препарата были выбраны Lаспарагиназы с максимальным сродством к субстрату (Km 0,017 мМ). Если построить аналогичные модели, но использовать в качестве референса фермент с минимальным сродством к субстрату (Km 0,221 мМ), риск неизлеченности достоверно снижался для L-аспарагиназ с Кm 0,017 и 0,054 мМ. При использовании эквивалентных доз относительные риски для самых активных ферментов (YpA и EcA) составили 0,09 (95% ДИ: 0,04–0,21) и 0,15 (95% ДИ: 0,06– 0,37) для 500–1000 и 2000–8000 МЕ/кг. Соответственно, для WsA относительные риски были равны 0,03 (95% ДИ: 0,01–0,08) и 0,02 (95% ДИ: 0,01–0,11). Таким, образом, для ферментов с Km 0,017 мМ по сравнению с RrA (Кm 0,221 мМ) риск неизлеченности снижался в 7–10 раз в зависимости от величины примененной дозы, а для WsA — в 39–42 раза. В изученном диапазоне доз по уменьшению риска неизлеченности мышей ферменты распределяются следующим образом: EwA (Km 0,073 мМ) > RrA (Km 0,221 мМ) > YpA/EcA (Km 0,017 мМ) > WsA (Km 0,054 мМ). Следовательно, WsA, в отличие от математически предполагаемых исходов, имеет меньший риск неизлеченности в данном ряду. Попытка использовать в качестве сопоставляемых параметров kcat и противоопухолевый эффект в аналогичном диапазоне доз показала, что с увеличением kcat возрастает доля мышей, павших от опухолевого процесса. Порядковая мера связи D оказалась статистически значимой для дозового диапазона 500–1000 и 2000–8000 МЕ/кг (табл. 60). В случае использования показателя, наиболее точно характеризующего эффективность катализа (kcat/Km), никаких достоверных взаимосвязей обнаружено не было, что говорит о том, что помимо ферментативной активности, противоопухолевый эффект определяется и другими свойствами и функциями L-аспарагиназ в организме. На основании полученных данных можно сделать предположение, что максимальным противоопухолевым эффектом обладает фермент с низкой Km и низкой kcat, при этом причины такой зависимости требуют детального последующего изучения. 162 Таблица 60. Статистическая значимость соотношения числа излеченных и неизлеченных мышей с лимфаденозом Фишера для L-аспарагиназ с различной kcat в зависимости от дозы Дозовый диапазон (МЕ/кг), n 500-1000 n=84 Исход Абсолютное число (%) мышей kcat 22,9 152,5 253,1 318,2 501,2 Излеч. Неизлеч. 2000-8000 n=98 Излеч. Неизлеч. 12000 и больше n=32 Излеч. Неизлеч. 13 (37%) 22 (63%) 26 (59%) 18 (41%) – 8 (62%) 0 0 5 (39%) 8 (100%) 1 (4%) – – 15 (100%) 3 (13%) 20 (87%) 4 (50%) 4 (50%) 5 (71%) 2 (29%) – Статистическая значимость и теснота связи 2 (15%) 11 (85%) – p=0,001 2=18,9 D=0,25 p<0,001 2=29,9 D=0,46 – 23 (96%) 7 (29%) 17 (71%) – p=0,283 2=1,2 D=0,19 – 8.2.2. Роль ферментативной активности в реализации антипролиферативного эффекта L-метионин–γ-лиаз В дополнение к данным, полученным для L-аспарагиназ, представлялось интересным оценить вклад ферментативной активности в реализацию цитотоксического эффекта MGL. Поскольку в отличие от L-аспарагиназ, MGL катализирует различные реакции и обладают сродством к целому ряду субстратов, особый интерес для MGL представлял анализ зависимости антипролиферативного эффекта от Km для различных субстратов. В анализ были включены данные, полученные в рамках настоящей работы, а также сведения из литературы о цитотоксичности и кинетических параметрах MGL Pseudomonas putida [327]. При статистическом анализе не обнаруживается взаимосвязи между цитотоксичностью MGL от Кm в отношении разных субстратов в ряду сгруппированных показателей. Однако установлена тенденция к положительной взаимосвязи между Кm по отношению к L-метионину и IC50 во всей совокупности изученных культур клеток (r=0,549, р=0,100), что косвенно подтверждает наличие связи между ферментативным уменьшением уровня метионина в среде и цитотоксической активностью. Однако при привлечении дополнительных данных литературы для MGL из P. putida к оценке взаимосвязи Кm MGL и их цитотоксичности in vitro статистически значимых корреляций не выявлено как для исходных, так и для логарифмированных значений IC50. По данным однофакторного дисперсионного анализа выявлены статистически значимые различия в активности ферментов (рANOVA=0,005) P. putida и C. tetani. 163 Ввиду небольшой выборки для статистического анализа такого плана, а также значительных различий в спектре клеточных культур, оцененных по чувствительности к ферменту, выделенному из различных источников, статистически значимой корреляции установить не удалось. Однако выявленная тенденция к повышению IC50 при увеличении Кm может позволить осторожно прогнозировать возможность увеличения цитотоксичности по мере повышения сродства к L-метионину. Это не противоречит общепринятому положению об используемых в онкологии ферментах как о препаратах, противоопухолевый эффект которых связан с повышенной чувствительностью злокачественных клеток к дефициту аминокислот. 8.3. Прогнозирование иммуногенности и анализ структуры эпитопов L-аспарагиназ15 В рамках настоящей работы проведена сравнительная оценка структуры и аминокислотной последовательности прогнозирования предполагаемых структуры и эпитопов локализации EcA, WsA, эпитопов EwA, YpА и L-аспарагиназ RrA. Для использовали экспериментальные данные, опубликованные для гомологичных белков, и биоинформатические алгоритмы. В качестве исходных данных было выбрано пространственное расположение экспериментально установленных эпитопов ErA — близкого гомолога EwA, YpA и WsA. У ErA основной 282 антигенный GIVPPDEELPG292), эпитоп причем локализуется самыми в важными С-концевом остатками участке для (остатки распознавания поликлональными антителами являются Pro285 и Pro286 [235]. EwA на 78% гомологична ErA, основная антигенная детерминанта — участок 282GIVPPD287 у них совпадает. Гомология EwA и EcA составляет 42%, причем основной антигенный эпитоп EcA (195RKH197) ни у EwA, ни у YpA не дублируется [178]. В качестве трехмерной структуры EcА была использована структура из PDB, пространственные структуры остальных ферментов были построены методом гомологии. Согласно полученным данным, антигенными эпитопами теоретически могут быть 9 участков (рис. 38). Исследования проведены совместно с к.б.н. М.Д. Казановым, Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича 15 164 Рис. 38. Выравнивание последовательностей различных L-аспарагиназ: «solv.access» — данные о вторичной структуре и доступности для растворителей отдельных участков тетрамера EcA. EPSVR, Discotope, и ElliPro — предполагаемые эпитопы по данным соответствующих программ, Experiment — экспериментально верифицированные эпитопы ErA. Пять из девяти участков представляют собой петли активного центра ферментов (рис. 39): три расположены в N-концевом домене и два – в С-концевом. В качестве четырех других потенциальных антигенных эпитопов могут быть рассмотрены две С-концевых спирали, участок, состоящий из двух параллельных бета-тяжей, формирующих межсубъединичные контакты и внутридоменные связи. Поскольку эпитопы прогнозировали, основываясь, главным образом, на моделях мономеров ферментов, для оценки их доступности для антител было определено положение отобранных фрагментов в четвертичной структуре (см. рис. 39). Среди потенциально возможных эпитопов два наиболее вероятных расположены в активном центре: в наиболее длинной и выступающей петле на N-конце (active site loop #1, см. рис. 39); и на спирали С-конца, расположенной рядом с петлей, участвующей в связывании субстрата [320]. 165 Рис. 39. Ленточная модель пространственной структуры EcA, отмечены предполагаемые эпитопы (синий цвет — маловероятные, красный — высоковероятные), EPSRV. Multi-subunit interface — область межсубъединичного контакта, Domain linker — петля, соединяющая домены, Active site loops — петли активного центра. Проведено сравнение структур возможных эпитопов для всех пяти изученных L-аспарагиназ. Совмещение доменов N-конца всех ферментов не показало каких-либо значимых структурных отличий для трех петель активного центра (рис. 40a); единственным значимым отличием была длина петель RrA. Предполагаемые эпитопы, расположенные на петлях и спиралях C-концевого участка всех изученных ферментов кроме RrA (из-за отсутствия у последней C-концевого домена), также структурно весьма схожи (рис. 40b), за исключением более короткой петли активного центра EwA (active site loop #5, рис. 40b). Два антипараллельных бета-тяжа контактирующих поверхностей субъединиц показали почти полную идентичность (рис. 40c). Небольшие структурные отличия отмечены среди доменных линкеров. Так, YpA имеет самый короткий доменный линкер по сравнению с другими тремя ферментами, самый длинный — у EcA и WsA. 166 Рис. 40. Наложение пространственных структур фрагментов с предполагаемыми эпитопами EcA (красный), EwA (желтый), WsA (зеленый), YpA (синий): С-концевые петли активного сайта (а); междоменные линкеры (b); N-концевые петли активного сайта (с); участок соприкосновение субъединиц (d). При анализе аминокислотного состава предполагаемых эпитопов оценивали также наличие остатков аминокислот, способных повышать иммуногенность: тирозина, триптофана и заряженных аминокислот [283]. N-концевые петли активного центра L-аспарагиназ II типа EcA, ErA, YpA и WsA имеют примерно одинаковый аминокислотный состав, у RrA число заряженных аминокислотных остатков больше. Предполагаемые эпитопы С-концевых участков также консервативны, у EwA число заряженных аминокислотных остатков также выше. Контактирующие поверхности субъединиц представлены двумя антипараллельными цепями, содержащими 3 остатка тирозина и 2 заряженных аминокислоты в молекулах YpA и WsA, 2 остатка тирозина и 2 заряженных аминокислоты в EcA, одним остатком тирозина и одной заряженной аминокислотой в EwA. В аминокислотном составе междоменного линкера в ряду рассмотренных ферментов значимых отличий нет. Анализ вторичных структур показал, что эпитопы консервативны и, как правило, располагаются на петлях белка, что соотносится с литературными данными [283]. Доступность для растворителей и протрузия рассматриваемых петель (факторы с доказанным влиянием на иммуногенность) практически идентичны в ряду изученных ферментов, за исключением N- 167 терминальных петель активного сайта RrA, которые намного короче по сравнению с другими ферментами. Также выявлены некоторые отличия в длине интердоменной линкерной области. Несмотря на то что изучение иммуногенности L-аспарагиназ (см. раздел 5.1) показало статистически значимые отличия в ряду рассмотренных ферментов, мы не обнаружили очевидных взаимосвязей между экспериментальными данными и структурой. Анализ аминокислотного состава ферментов позволил выявить некоторые различия в содержании заряженных аминокислот и остатков тирозина на контактирующих поверхностях субъединиц. Однако структурные характеристики этих областей – наличие двух бета-тяжей и ограниченная доступность для растворителей нетипичны для антигенных эпитопов. Помимо предсказанных эпитопов также могут рассматриваться N- и С-концы белков, в случае если они имеют достаточную длину и подвижность для формирования выступающих участков. Вероятной причиной более высокой иммуногенности YpA по сравнению с другими L-аспарагиназами II типа может быть длинный N-конец, содержащий заряженные аминокислоты и тирозин (KYIK). 8.4. Влияние L-метионин–γ-лиазы на отдельные звенья механизма индукции апоптоза16 Как известно, цитотоксическое воздействие биологических агентов на клетки может быть реализовано через неспецифический эффект, вызывающий некроз (например, путем влияния на билипидный компонент мембраны поверхностно-активных агентов), или, чаще, специфический, запускающий программируемую смерть клетки — апоптоз. Инициация апоптоза осуществляется под воздействием факторов разной природы, реализующих сигнальную функцию через специализированные клеточные рецепторы, в частности, через трансмембранный белок I типа CD95. Этот белок известен как «домен смерти», который обеспечивает трансдукцию цитотоксического сигнала, запускающего процесс гибели клетки после взаимодействия с Fas-лигандом [27, 333]. CD95 присутствует на мембране клеток различной природы, в том числе и на некоторых опухолевых клетках [27]. Относительное увеличение популяции клеток, экспрессирующих его на своей мембране, прямо коррелирует с увеличением вероятности готовности клетки к апоптозу по Fas-зависимому пути. От ферментов, разрушающих аминокислоты, MGL отличается способностью катализировать реакции расщепления целого ряда субстратов, кроме того, существуют данные об индукции апоптоза под воздействием MGL [375]. Механизмы индукции апоптоза под действием MGL составляют предмет отдельного изучения и могут быть исследованы как на уровне клеточного цикла, так и отдельных молекулярных маркеров. В качестве клеточной модели нами были использованы МСК мышей третьего пассажа, характеризующиеся выраженной способностью к адгезии и умеренной экспрессией молекул, обеспечивающих инициацию апоптоза. Результаты 16 Эксперименты выполнены совместно с д.б.н. Н.Ю. Анисимовой, РОНЦ им. Н.Н. Блохина 168 воздействия протестированных образцов фермента на экспрессию целевых молекул на мембране МСК мышей приведены в табл. 61. Таблица 61. Влияние MGL на количество мезенхимальных стволовых клеток, несущих мембраносвязанные молекулы CD95 и CD11c Фермент CD11c+ CD95– CD11c+ CD95+ CD11c– CD95+ MGL C. freundii 0,2±0,24 0,7±1,24 0±0,69 MGL C. sporogenes 0,9±0,74* 1,2±0,58* 0,3±0,24 Контроль с ПЛФ 0,2±1,08 0,6±0,75 0,1±0,33 * Достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе Анализ полученных данных свидетельствует о достоверном нарастании среди МСК CD45– CD11c+CD95+ клеток после коинкубации с MGL C. sporogenes. Относительная концентрация этой субпопуляции увеличилась в 2 раза в сравнении с интактным контролем (р<0,001). Одновременно наблюдали увеличение субпопуляции CD11c+CD95– МСК более, чем в 4 раза (р=0.011). Согласно полученным данным в среде с MGL C. sporogenes было отмечено существенное увеличение относительного количества клеток, экспрессирующих на мембране CD95, причиной которого, вероятно, был индуцированный de novo синтез этого антигена, очевидно протекавший одновременно с синтезом CD11c. Это объясняет двукратное увеличение субпопуляции CD45–CD11c+CD95+ клеток по окончании коинкубации с упомянутым ферментом. Молекулы CD11с (Integrin alpha X, ITGAX) участвуют в межклеточной кооперации и обеспечивают клеточную адгезию [308]. Кроме того, было показано, что некоторые МСК экспрессируют на своей мембране антигены CD11с при дифференцировке. Таким образом, наблюдаемый ресинтез мембраносвязанных белков можно считать характерным скорее для апоптоза, чем для некроза. Это позволяет предполагать, что цитотоксическое воздействие MGL C. sporogenes на опухолевые клетки отчасти может быть обусловлено инициацией в них апоптоза через экспрессию одного из важнейших проапоптотических факторов CD95 (Fas/APO1), а также интегрина CD11c, отвечающего за межклеточные взаимодействия. Эти данные свидетельствуют о возможности существования параллельных неферментативных механизмов реализации цитотоксического эффекта, что требует дополнительного изучения. 169 Глава 9. Обсуждение полученных данных с оценкой перспектив поиска и экспериментального изучения ферментов с противоопухолевой активностью 9.1. Поиск и создание ферментов с противоопухолевой активностью Как следует из обзора литературы, исторически сложившимся методом поиска и создания ферментов с противоопухолевой активностью следует считать эмпирический. Противоопухолевая активность сыворотки крови морской свинки была обнаружена случайно, что впоследствии привело к открытию противоопухолевых свойств у EcA. Эмпирически было выявлено наличие противоопухолевого эффекта и у других ферментов: ранпирназы, LO и др. [34, 83, 208]. Общий подход к поиску ферментов с противоопухолевой активностью, использовавшийся с 1970-х годов, подразумевал и учитывал две основных вводных: ♦ использование ферментов из двух групп: расщепляющие аминокислоты или рибонуклеазы; ♦ источник выделения — микроорганизмы, продуцирующие специфический фермент в препаративных количествах. В качестве источников выделения в рамках эмпирического скрининга потенциальных кандидатов из указанных групп использовали живые объекты: бактерии, грибы, простейшие, реже растения, земноводные, моллюски, млекопитающие [1, 7, 15, 25, 89, 90, 130, 163, 169, 218, 248, 268, 274, 277, 282, 293, 330]. По мере накопления новых данных (секвенирование геномов микроорганизмов, выстраивание филогенетических карт) открылась возможность выделения определенных генов и создания рекомбинантных продуцентов с использованием различных экспрессионных систем. На этом этапе к первым двум вводным были добавлены еще две: ♦ разработка простых рекомбинантных экспрессионных систем-суперпродуцентов целевого белка; ♦ перспективный поиск аналогов известного фермента, имеющих лучшие фармакологические характеристики. Указанные вводные используются в качестве опорных и в настоящее время, не изменяя общего эмпирического направления поиска новых ферментов с оригинальными аминокислотными последовательностями. В последние годы для единственного успешного клинического противолейкозного фермента ЕсА предпринимаются усилия по улучшению терапевтических характеристик путем использования методов, апробированных для других белковых препаратов, не обладающих ферментативной активностью (пегилирование, заключение в липосомы, иммобилизация на 170 гидрогеле ПЭГ-альбумина, конъюгирование с протеинами шелка и др.) [135, 136, 175, 276]. Указанные методы односторонне улучшают свойства фермента, снижая, в основном иммуногенность за счет изменения фармакокинетики, не изменяя при этом специфичность действия, определяемую биохимической мишенью (субстратом), а также молекулярными механизмами. Новые подходы. В настоящей работе апробирована возможность улучшения биологических характеристик известных противоопухолевых ферментов с помощью двух походов: ♦ сайт-направленный мутагенез; ♦ получение химерных молекул путем ковалентного конъюгирования с другими биологически активными белками и пептидами. Направленный мутагенез, как правило, преследует несколько целей: ♦ повышение специфичности действия в отношении конкретного молекулярного субстрата — замены в активном центре (центрах) фермента; ♦ уменьшение иммуногенности (замены в конкретном антигенном эпитопе); ♦ оптимизация методов выделения или очистки белка (точечные замены заряженных аминокислот); ♦ изменение физико-химических свойств белка — оптимумов температуры и pH, стабильности; ♦ уточнение механизма биологической активности путем выявления структурно- функциональных взаимосвязей и участков белка, ответственных за ее реализацию. Новые формы RrA, полученные методом сайт-направленного мутагенеза. На примере мутантных форм RrA в работе апробирована возможность оптимизировать физико-химические свойства фермента за счет смещения оптимума рН из щелочной области, повышения активности при близких к физиологическим значениях pH и идентифицировать функциональные районы белковой молекулы. Для этого нами в составе белка были проведены многоточечные замены заряженных аминокислот, определяющие электростатическую стабилизацию белковой молекулы и влияющие на взаимодействие с другими заряженными молекулами, а также зависимость активности от изменений ионного состава среды и pH. Кроме того, выполнены сопутствующие замены незаряженных аминокислот в составе белка. Исследования показали, что проведенная модификация не позволяет получить достоверный сдвиг оптимума рН, но лишь несколько расширяет его диапазон в кислую сторону. Проведение сайт-направленного мутагенеза позволило также установить функционально-значимые аминокислотные остатки в молекуле RrA. Мутантная форма WsA, конъюгированная с гепаринсвязывающим пептидом. В рамках настоящей работы были изучены физико-химические и антипролиферативные свойства гибридной биомодифицированной WsA, коньюгированной с гепарин-связывающим пептидом. 171 Проведённая оптимизация WsA17 была нацелена на получение препарата, устойчивого к деградации под действием трипсина, имеющего менее выраженные антигенные свойства и увеличенную продолжительность циркуляции в кровотоке по сравнению с WsA. Изучение устойчивости рекомбинантной WsA к действию ферментов трипсинового ряда позволило установить, что триспсин гидролизует белок по пептидной связи между остатками Lys24 и Ser25. В результате направленного ПЦР-опосредованного мутагенеза был получен структурный ген и на его основе сконструирован штамм-продуцент модифицированного варианта WsA c заменами V23Q и K24T, который был успешно экспрессирован в клетках штамма BL21(DE3)/pET28-WsA. Полученный мутантный штамм приобрел устойчивость к действию трипсина и не деградировал даже после 60 мин инкубации, в то время как исходная WsA гидролизовалась полностью в аналогичных условиях уже за 15 мин инкубации. Теоретическим обоснованием выбора пептида для конъюгации послужили данные о том, что стабилизация и удлинение времени циркуляции белка в кровотоке, а также потенцирование активности ряда белков крови может достигаться в результате их взаимодействия с гепарансульфатсодержащими протеогликанами (ГСПГ) на поверхности клеток и в составе внеклеточного матрикса [79, 114, 309, 353, 355]. В организмах млекопитающих ГСПГ вовлечены во множество физиологических процессов и участвуют во взаимодействии с целым рядом белков, включая ферменты, регуляторные, ростовые факторы и цитокины, содержащие гепарин-связывающие структурные элементы [355]. Связывание этих белков с ГСПГ отражается на их распределении в организме, фармакокинетике и специфической активности [79, 114]. Показано, что гепарин-связывающие белки взаимодействуют с ГСПГ стенок сосудов [374]. Высокая аффинность ГСПГ обусловлена наличием в их составе большого количества отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп, представляющих собой сильные природные полианионы, способных к электростатическим взаимодействиям со многими белковыми и синтетическими соединениями поликатионной природы. Нами было сделано предположение, что взаимодействие мутантной WsA с ГСПГ in vivo может привести к депонированию фермента и позволит снизить его уязвимость к протеолитическому и иммуноопосредованному разрушению. Основой для получения гепарин-связывающего варианта аспарагиназы была выбрана генетическая коньюгация N-концевого гепарин-связывающего пептида HB-EGF-(21-33) (21KRKKKGKGLGKKR33) из состава гепарин-связывающего фактора роста HB-EGF человека [334] с последовательностью WsA c заменами V23Q и K24T, обусловливающими устойчивость к протеолизу трипсином. Вклад этого пептида в общую гепаринсвязывающую активность полноразмерного HB-EGF человека был оценен в 77–80% [334]. 17 Работы выполнены в ФГУП ГосНИИгенетика под руководством к.б.н. С.В. Яроцкого и к.б.н. Д.Г. Козлова 172 Для выделения описанного гибридного фермента WsA-Hep в препаративных количествах был сконструирован штамм в результате трансформации клеток BL21(DE3) вектором, содержавшим сконструированный ген гибридного белка-предшественника под контролем промотора фага Т7. В отличие от секретируемых аспарагиназ EcA и ErA экспрессия рекомбинантных вариантов WsA осуществлялась в цитозоле клеток E. coli. В то же время известно, что цитоплазматические белки бактериального происхождения, в особенности, получаемые в условиях сверхпродукции, способны сохранять высокоиммуногенный N-концевой формилметионин [68]. В этой связи для получения безметионинового варианта гибридной WsA-Hep, принципиально не содержащий Nконцевого метионина, была использована технология цитоплазматического интеин- опосредованного процессинга белка — предшественника зрелой WsA-Hep. В клетках штаммапродуцента процессинг предшественника направляла последовательность интеина Int4bm, являвшегося мутантным производным интеина Pch PRP8 Intein Penicillium chrysogenum. Последовательность интеина Int4bm была локализована в N-концевой части предшественника. Мутации Cys1Ala и Cys8Tyr в составе Int4bm инактивировали его способность к сплайсингу, но не затрагивали способность к эффективному С-концевому автокаталитическому процессингу, опосредовавшему получение в клетках штамма-продуцента зрелой безметиониновой формы гибридной аспарагиназы WsA-Hep. Выделенный фермент обладал минимальной глутаминазной активностью, устойчивостью к протеолизу трипсином и способностью к связыванию с гепарином в условиях хроматографии, проведенной на колонке HiTrap Heparin (GE Healthcare), содержавшей 1 мл сорбента и способностью к связыванию с ГСПГ на культуре клеток НМРЛ человека А-549. На примере сравнительного изучения конъюгированной WsA-Hep и нативной WsA нами показано, что конъюгат достоверно более эффективен по критерию излечения мышей с чувствительной опухолью (100% против 71%) при сопоставимой переносимости. В качестве объективной причины можно обсуждать положительное изменение характеристик распределения WsA-Hep с увеличением Т1/2. Можно также предположить, что в результате конъюгирования новый комплекс приобрел способность связываться с клетками крови и формировать сладжи, однако это предположение нуждается в детальном изучении. Результатом проведенных нами исследований стала гибридная аспарагиназа WsA-Hep, к числу основных достоинств которой следует отнести: ♦ минимальный уровень глутаминазной активности, приближенный к активности RrA и перспективного мутантного варианта ЕсА (N24A R195S) [255]); ♦ устойчивость к протеолизу под действием трипсина; ♦ отсутствие N-концевого формилметионина, способного служить источником повышенной иммуногенности белка; 173 ♦ высокотехнологичый способ получения, не ограничиваемый секреторным потенциалом клеток; ♦ сниженная иммуногенность in vivo благодаря иммобилизации фермента на поверхности клеток и внеклеточного матрикса; ♦ высокая противоопухолевая эффективность, значительно превышающая эффективность препаратов сравнения в экспериментах на релевантной модели in vivo. Конъюгат 4D5 scFv-дибарназы. Результативность конъюгирования с антителами против белков, гиперэкспрессирующихся на поверхности опухолевых клеток, оценена на примере конъюгата 4D5 scFv-дибарназы — иммуноРНКазы, состоящей из мини-антител (антигенсвязывающих одноцепочечных вариабельных фрагментов антител, scFv) и рибонуклеазы Bacillus amyloliquefaciens — барназы. Методами генной инженерии были получены18 рекомбинантные мини-антитела к антигену HER2/neu, который относится к наиболее специфичным маркерам злокачественных опухолей, прежде всего, рака молочной железы и яичника [8, 10]. Были созданы анти-НЕR2/neu-мини-антитела (4D5 scFv), слитые с двумя молекулами барназы и доказано, что созданный химерный белок способен интернализовываться внутрь клеток, экспрессирующих НЕR2/neu и показана его цитотоксическая активность [40, 39]. Попадая внутрь клетки в составе химерного белка анти-НЕR2/neu-мини-антитело-дибарназа (4D5 scFv-дибарназа), барназа может реализовывать антипролиферативное действие как рибонуклеаза. Было сделано предположение, что активность такого конъюгата будет повышена за счет усиления адресности биохимической связи (две мишени на клетке) и, как следствие, ее избирательности. Результаты показали справедливость такого предположения: в отличие от неконъюгированных антител 4D5 scFv и простой смеси барназы и 4D5 scFv, химерная молекула-конъюгат 4D5 scFv с двумя молекулами барназы (4D5 scFv-дибарназа) была достоверно более эффективна на модели ксенографтов SKBR3, Т/С 37–39% против 59–87%. Помимо непосредственно рибонуклеазной активности, барназа представляет также интерес как компонент комплекса с ее природным ингибитором — цитоплазматическим белком барстар. Обладая уникально высоким сродством друг к другу, барназа и барстар способны быстро образовывать очень прочный комплекс (Kd~10-14 M) [151, 295]. По данным рентгеноструктурного анализа N- и С-концы обоих белков расположены вне области их взаимодействия [85] и потому доступны для генно-инженерного слияния с нацеливающими мини-антителами, цитотоксическими агентами, диагностическими метками. Уникальное сродство между барназой и барстаром делает связывание частиц необратимым даже в высокосолевых буферных средах, что позволяет получать стабильные многофункциональные Работы выполнены в ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова под руководством проф., чл.-кор. РАН С.М. Деева 18 174 структуры с возможностью строгого контроля их состава и строения. В отличие от других самоассоциирующихся белков и пептидов и барназа, и барстар хорошо растворимы и стабильны в индивидуальном состоянии, что позволяет раздельно их хранить и получать надмолекулярные комплексы по образцу «молекулярного конструктора». Более того, продемонстрировано, что в составе рекомбинантных белков барназа выступает в роли внутримолекулярного шаперона, увеличивая их растворимость и стабильность [224]. Высокая конформационная стабильность барназы (температура плавления, Т=54°С) обеспечивает также ее устойчивость к протеолитической деградации. Наличие нескольких сайтов связывания комплекса барназабарстар позволяет получать молекулы, несущие одновременно как сайт связывания с опухолевой клеткой (например, мини-антитела Her2-neu), так и цитотоксический агент, способный оказывать действие непосредственно в клетке или вблизи клеточной мебраны. Таким образом, полученные рамках настоящей работы результаты свидетельствуют о том, что изменение первичной структуры белка на этапе конструирования гена может улучшить терапевтически значимые физико-химические и биологические свойства ферментов. Уточнению подлежит планирование точечных замен, т.к. для их топологии важно моделирование трехмерной структуры белка in silico с определением активного центра и роли каждой из аминокислот в молекулярном механизме взаимодействия с субстратами. При отсутствии предварительного моделирования и достаточных данных о структурных и кинетических особенностях белка (расположение активного центра и/или антигенных эпитопов, конформация фермента и его активного центра и др.) проведение точечных замен есть опасность изменения третичной структуры или активного центра, полной потере ферментативной и снижения антипролиферативной активности получаемого белка. Перспективы открытия новых противоопухолевых ферментов неразрывно связаны также со знанием каскадов внутриклеточных цепей передачи сигналов, участвующих в сигнальных процессах пролиферации, и уточнением роли отдельных пептидов, микроРНК и полисахаридов плазмы крови, ответственных за канцерогенез, а также ферментов, способных катализировать реакции с их участием. 9.2. Анализ выбора продуцента фермента Существующие методы биохимического тестирования ферментов относительно трудоемки, т.к. требуют наращивания биомассы в жидкой среде с последующим определением активности в условиях, индивидуальных для каждого фермента [26, 342, 350]. Применение технологий получения рекомбинантных белков в различных экспрессионных системах повысило актуальность быстрого и результативного отбора клеток, наиболее активно экспрессирующих белок после трансформации. Кроме того, качественные экспресс-методы определения активности культуры, в т.ч. на плотной среде, недостаточно адресны, т.к. востребованы также 175 для оценки изменения активности штамма в процессе пассирования, изучения влияния других факторов на экспрессию белка, сравнительного изучения активности различных штаммовпродуцентов и др. Новый подход. В рамках настоящей работы обоснован и предложен более адресный метод определения активности бактериальной культуры непосредственно на плотной среде по образованию продуктов ферментативной реакции в процессе экспрессии. Использован феномен высокой реактогенности низкомолекулярных субстратов, образующихся при расщеплении активных молекул фермента, которые могут вступать в химические реакции с компонентами среды (аммиак, пероксид водорода и др.). При определенном подборе состава среды продукты указанных реакций могут давать характерную окраску, видимую невооруженным глазом, что позволяет непосредственно в ходе культивирования отдельных колоний на плотной среде качественно определять наличие/отсутствие у них специфической активности. Таким образом, о ферментативной активности экспрессируемого белка можно достоверно судить по окрашенным продуктам реакции. Для совершенствования разработки новых L-аспарагиназ нами предложен быстрый и результативный комплексонометрический метод определения активности продуцентов (патент РФ №2398876, приоритет от 03.06.2008), который позволяет не только отбирать наиболее активные колонии на плотной среде, но и сравнивать различные продуценты по активности. Результаты метода коррелируют с традиционными методами оценки активности. 9.3. Прогнозирование антипролиферативной активности на основании кинетических характеристик фермента Недостаток сведений о взаимосвязи физико-химических, прежде всего, кинетических характеристик ферментов и их антипролиферативной активности является одной из наиболее серьезных проблем разработки противоопухолевых ферментов. Причиной этого является отсутствие данных о первичной структуре, параметрах кинетических реакций и физикохимических свойствах белка после первичного изучения биохимических свойств, что не позволяет составить достоверный количественный прогноз антипролиферативного эффекта. Особенно это важно для ферментов, катализирующих несколько реакций (например, для MGL), вклад каждой из которых в реализацию противоопухолевого и токсического эффектов неизвестен [25, 92, 327, 330]. Для L-аспарагиназ существуют отдельные разрозненные данные о влиянии ряда биохимических параметров на определенные биологические эффекты (наиболее изучена из них Lглутаминазная активность), однако отсутствуют системные подходы к прогнозированию антипролиферативного эффекта конкретного фермента [112, 262, 278]. Анализ структурнофункциональных особенностей различных L-аспарагиназ позволил лишь сгруппировать 176 ферменты по наличию или отсутствию антипролиферативной активности и особенностям первичной структуры, на основании которой с учетом локализации (внутриклеточной или периплазматической) были выделены два типа ферментов бактериального происхождения [75]. При этом постулировалось, что антипролиферативное действие проявляют только периплазматические бактериальные L-аспарагиназы II типа с существенно более высоким сродством к L-аспарагину. Отсутствие данных по установлению взаимосвязи ферментативной и антипролиферативной активности L-аспарагиназ in vitro можно объяснить невозможностью их сопоставления из-за вариабельности данных в силу неоднородности исследований, проведенных разными исследователями с ферментами различного происхождения. В результате для одного и того же фермента описаны разные величины IC50. Это обстоятельство справедливо и для экспериментов in vivo, вариабельность которых касается как биологических характеристик модели, так и условий тестирования фермента (прививочная доза и чувствительность опухоли, схема применения). Перечисленные недостатки усложняют подбор релевантного математического метода прогноза, поскольку для достаточной статистической выборки обязательными является соблюдение двух условий: наличие ряда ферментов, идентичных по биохимическому механизму действия, а также сопоставимые модели и условия эксперимента. Использование первичных данных, полученных разными авторами в различных экспериментах дает несопоставимые результаты. Важно также и то, что величина Km существенно зависит от метода определения, а диссоциация L-аспарагиназ на мономеры или димеры существенно влияет на параметры реакции. Новые подходы. Использование предложенного нами математического алгоритма оценки зависимости противоопухолевого эффекта от кинетических параметров ферментативной реакции (Кm или соотношение kcat/Km) с учетом данных, полученных для выборки ферментов, позволяет решить эту проблему на самом раннем этапе. В основе предложения лежит общепризнанный биохимический механизм антипролиферативного эффекта ферментов (в частности, расщепляющих аминокислоты). Поскольку ретроспективные данные оказались несопоставимыми для анализа искомой взаимосвязи, нами в условиях одинакового дизайна выполнено проспективное исследование значимых показателей кинетической ферментативной и антипролиферативной активности in vitro/in vivo ряда новых L-аспарагиназ. В качестве основных сопоставляемых параметров были выбраны Km, характеризующая сродство фермента к конкретному субстрату, и количественные параметры цитотоксической (IC50) или противоопухолевой активности (ТРО%, УПЖ%, % излечения). Идентичность дизайна и одномоментность определения показателей активности гарантировали полную сопоставимость результатов экспериментов. На основе полученных 177 данных формально возможно построение нелинейной регрессии с квадратичной формой зависимости: IC50 = –1,9 + 556,6×Km – 2023×Km2, которую можно использовать для первичного прогнозирования цитотоксической активности вновь синтезированных L-аспарагиназ II типа на основании значений Km. Анализ зависимости цитотоксической активности от Km в ряду периплазматических Lаспарагиназ II типа EcA, EwA, YpA и WsA позволил выявить отчетливую зависимость: IC50 с повышением Km увеличивалась: r=0,66, р=0,007. Соотношение показателей выживаемости и К m для диапазона разовых доз 2000–8000 МЕ/кг активных L-аспарагиназ позволило выделить группы, сочетающие высокую или низкую ферментативную активность и высокую или низкую эффективность при, соответственно, низкой или высокой неизлеченности. При данном диапазоне доз лучшими по выживаемости и излечению оказались L-аспарагиназы с Km 0,017 и 0,054 мМ по сравнению с L-аспарагиназами с меньшей ферментативной активностью, что подтверждено соответствующими значениями относительных рисков в регрессионной модели Кокса. Под действием L-аспарагиназ продолжительность жизни животных до гибели от опухоли или до прекращения наблюдения тем больше, чем меньше Km. При этом обратная связь показателей наиболее тесная при дозовом диапазоне 2000–8000 МЕ (r= –0,58) и несколько меньше в других дозовых диапазонах. Исключение составляет L-аспарагиназа I типа RrA с Km 0,221 мМ, которая обладает более высокой активностью, чем это прогнозировала гипотеза линейной зависимости кинетических свойств и антипролиферативного эффекта. Это проявилось в культуре клеток, где прослежена нелинейная зависимость IC50 от Km и подтвердилось in vivo на модели лимфаденоза.. Лучший профиль соотношения Km и антипролиферативной активности in vitro/in vivo показала WsА. Это подтверждено не только кривыми Каплана–Мейера с попарным сравнением логранговым тестом, но также и методом регрессии Кокса, позволяющим рассчитать относительный риск неизлеченности. Риск неизлеченности мышей с L5178 при применении WsА в диапазоне разовых доз 500–1000 МЕ/кг и 2000–8000 МЕ/кг по сравнению с препаратами L-аспарагиназ с Km 0,017 мМ был достоверно меньше в 4–6 раз, ОР=0,16 против ОР=0,28, соответственно. Для MGL также установлена тенденция к положительной взаимосвязи между К m в отношении L-метионина и IC50 (r=0,497, р=0,084) при использовании критерия Пирсона и предварительном логарифмировании полученных значений IC50. Выявленные тенденции могут быть в дальнейшем использованы для количественного прогноза антипролиферативного эффекта на основании данных о кинетических свойствах фермента. Полученные результаты активности и подтвердили позволили прогностическую предложить простой значимость инструмент L-аспарагиназной прогнозирования антипролиферативного эффекта фермента на основании данных Km. Однако статистический 178 анализ показал, что для отдельных ферментов прогноз эссенциально связан с диапазоном терапевтических доз. В частности, для диапазона высоких эффективных доз, близких к токсическим >12 000 МЕ такая взаимосвязь может отсутствовать. Очевидно, что сродство к Lаспарагину хотя и служит в ряде случаев достоверным признаком активности в отношении определенных типов злокачественных клеток, но не является патогномоничным фактором этой связи. В качестве возможных альтернативных причинно-следственных связей биологической активности в данной группе ферментов известны, по крайней мере, две: сродство к другим аминокислотам (прежде всего, к L-глутамину) и возможность связывания с другими эндогенными белками. В заключение можно сказать, что множественность биохимических реакций, протекающих с участием L-аспарагиназ, остается предметом пристального внимания для выявления факторов прогноза эффективности противоопухолевых ферментов. Особенно это важно на этапе конструирования первичной аминокислотной последовательности и определения биохимических свойств фермента с оптимизированной фармакологической активностью. В сочетании с возможностью прогнозировать субстратную специфичность путем компьютерного моделирования четвертичной структуры белка на основании данных об аминокислотной последовательности предварительный выбор оптимального с точки зрения противоопухолевого эффекта фермента из конкретной группы может быть проведен in silico. 9.4. Прогнозирование основных фармакокинетических параметров противоопухолевого фермента у человека на основе данных in vivo В настоящее время описан ряд методик определения фармакокинетических параметров ферментных препаратов in vivo: ♦ оценка ферментативной активности в плазме крови; ♦ оценка остаточной радиоактивной метки; ♦ оценка содержания циркулирующего белка хроматографическим методом. Каждая из указанных методик имеет ряд очевидных недостатков, которые не позволяют точно прогнозировать фармакокинетические параметры фермента в плазме крови человека. В частности, при определении концентрации белка сохраняется вероятность снижения активности связывания с субстратом при сохранении первичной структуры. Использование меченого белка для оценки скорости выведения метки приводит к завышению результата, так как метка может сохраняться в организме и после разрушения белка. При анализе ферментативной активности в плазме крови возможно искажение результатов из-за наличия в плазме дополнительных белков и химически активных молекул. Существующие отечественные и международные рекомендации не содержат универсальных подходов к изучению фармакокинетики противоопухолевых ферментов. Кроме того, существующие методы 179 определения элементов фармакокинетики ферментных препаратов у животных не вполне адекватны, так как не имеют значимой корреляции с фармакокинетическими параметрами у человека. Новый подход. В рамках настоящей работы для прогнозирования фармакокинетических параметров у человека предложены две новые методики: ♦ определения концентрации белка иммуноферментным/хроматографическим методом с последующим пересчетом основных фармакокинетических параметров для человека по методу Дедрика; ♦ оценку специфической активности фермента в плазме крови в определенном промежутке времени. На примере LO показана сопоставимость показателей динамики концентрации фермента in vivo, определенной методами ИФА и прямого измерения активности в сыворотке крови. По методу пересчета концентрации низкомолекулярных соединений для человека (метод Дедрика), Т1/2 LO при однократном в/в введении составляет 7–10 ч, что сопоставимо с аналогичными фармакокинетическими параметрами L-аспарагиназ. В ряду MGL Citrobacter freundii, Clostridium tetani и Clostridium sporogenes при однократном в/в введении получены значения Т1/2 73, 87 и 123 мин, соответственно. В плазме крови человека наиболее стабильна MGL C. sporogenes. 9.5. Оценка очередности использования ферментных препаратов одной группы с учетом перекрестной иммуногенности Последовательное использование ферментных препаратов с одинаковым механизмом действия, но различными антигенными свойствами практикуется для оптимизации схемы лечения путем исключения антигенопосредованных побочных эффектов [142, 341, 369]. На сегодняшний день практических рекомендаций по оценке перекрестной иммуногенности таких препаратов не существует, однако с точки зрения клинической целесообразности резонно в первую очередь использовать фермент, вызывающий образование антител с наименьшей перекрестной реактивностью. Важно, чтобы первый препарат не вызывал образования антител ко второму. При этом иммуногенность каждого последующего фермента в отношении предшествующих значения не имеет. Другими словами, при очередности введения препаратов №1→№2→№3, антитела к препарату №1 не должны реагировать с препаратами №2 и №3, антитела к препарату №2 не должны взаимодействовать только с препаратом №3, а реактивность антител к препарату №3 в отношении двух других не важна. Новый подход. В настоящей работе с использованием метода ELISA изучен способ оценки перекрестной реакции против антигена, который включает предварительную иммунизацию мышей ферментом в определенной дозе и последующим изучением способности 180 образовавшихся антител связывать ферменты-аналоги. Интервал между введениями, а также дозы определяются с учетом относительно низкой иммуногенности большинства известных ферментных препаратов. Метод апробирован на примере L-аспарагиназ, которые обладают различной иммуногенностью и перекрестной реактивностью. Наименее иммуногенной была EcA, что предполагает возможность наиболее длительного ее применения без снижения клинической эффективности. Наиболее иммуногенной оказалась YpA, т.е. к этой L-аспарагиназе можно ожидать наиболее быстрое образование антител в высоких титрах. Перекрестная реактивность в условиях проведенного эксперимента проявлялась не всегда, что свидетельствует о возможности замены в процессе терапии L-аспарагиназ теми же ферментами, но имеющими другое происхождение. Учитывая данные проведенного анализа, рекомендуемую очередность лечения препаратами Lаспарагиназы можно представить следующим образом: после первой EcA во второй линии терапии могут быть использованы WsA или RrA в любой очередности, поскольку они не обладают перекрестной иммуногенностью как в отношении EcA, так и в отношении друг друга. Возможность применения EwA после EcA остается спорной, поскольку антитела к EcA обладают слабой перекрестной реактивностью с EwA. В последнюю очередь следует использовать YpA из-за ее высокой перекрестной иммуногенности (при этом, как уже упоминалось, антитела к YpA при введении других L-аспарагиназ не образуются). Таким образом, по результатам проведенного исследования можно рекомендовать следующую очередность применения препаратов: EcA → WsA (RrA) → RrA (WsA) → YpA. Структурный анализ эпитопов новых L-аспарагиназ показал, что вероятной причиной более высокой иммуногенности YpA по сравнению с другими L-аспарагиназами II типа, может быть протяженный N-конец, содержащий заряженные аминокислоты и триптофан (KYIK). В целом, хотя выявленные структурные отличия предполагаемых эпитопов пяти изученных Lаспарагиназ полностью не проясняют ситуацию с их иммуногенностью, полученные данные могут составить основу для дальнейшего изучения структурно-функциональных особенностей ферментов с целью оптимизации их иммунных характеристик. 9.6. Алгоритм экспериментального изучения антипролиферативной активности потенциальных противоопухолевых ферментов Анализ описанных методов изучения свидетельствует о том, что, как правило, исследователи при изучении различных ферментов придерживаются традиционного алгоритма экспериментального изучения новых противоопухолевых ферментных препаратов [36, 38]: ♦ Этап 1. «Взаимодействие с биохимической мишенью или мишенями» ♦ Этап 2. «Определение количественной цитотоксичности на линии клеток, в т.ч. экспрессирующих сигнальный ген или гены». 181 ♦ Этап 3. «Получение терапевтических характеристик с учетом биохимических особенностей механизма действия и данных фармакокинетики»: 3.1. «Дозовый диапазон» при однократном и многократном парентеральном введении с разными интервалами. 3.2. «Оптимизация схемы применения» под контролем переносимости (если субстрат – незаменимая аминокислота). 3.3. «Спектр активности» на панели перевиваемых опухолей мышей в порядке убывания чувствительности L5178Y(к L-аспарагиназе), затем МОПС-406 (или C180 к LO), затем P388, L1210, LLC, B16 и другие. ♦ Этап 4. «Противоопухолевая активность на ксенографтах опухолей человека, экспрессирующих сигнальный ген или гены». В этом алгоритме первый этап продиктован основным механизмом антипролиферативной активности ферментов, связанным с биохимическими свойствами. Кроме того, в отличие от синтетических цитостатиков и некоторых белков (например, терапевтических моноклональных антител), действие которых на мишень прямо зависит от изменения концентрации в плазме крови, кинетика специфического ответа ферментов зависит от изменения концентрации расщепляемого субстрата, т.е. опосредовано. Другими словами, в отличие от стандартной для других препаратов прямой зависимости «доза препарата → противоопухолевый эффект», для ферментных препаратов, разрушающих аминокислоты, прослеживается зависимость «доза препарата → концентрация субстрата в плазме крови → противоопухолевый эффект». Это требует учета еще одной «переменной» при планировании оптимального режима введения — скорости и механизмов восстановления концентрации субстрата в плазме крови после введения препарата. Резкое снижение концентрации субстрата с последующим медленным восстановлением после прекращения действия фермента, различная чувствительность опухолевых и здоровых клеток к дефициту определенных аминокислот, а также необходимость длительного подавления синтеза белков опухолевыми клетками диктуют необходимость использования многократного введения. Однако выбранный режим введения должен поддерживать минимально достаточную концентрацию аминокислоты в плазме для функционирования крови, которая будет нормальных клеток недостаточной для функционирования и деления злокачественных клеток. Особую сложность представляет подбор схем и режимов введения ферментных препаратов, разрушающих незаменимые аминокислоты, поскольку к колебаниям концентрации этих аминокислот высокочувствительны не только опухолевые, но и нормальные клетки. Таким образом, для рационального использования ферментных препаратов оправдана разработка дискретных режимов введения, заключающихся в использовании первой относительно высокой 182 стартовой дозы и последующих поддерживающих доз, составляющих ½ или ⅔ от первой. Так, в настоящей работе показана эффективность и удовлетворительная переносимость дискретного режима при 5-кратном в/в введении LO. Использование дискретного режима позволяет нивелировать влияние депрессии уровня L-лизина в плазме крови и увеличить амплитуду колебания концентрации L-лизина непосредственно перед инъекцией LO и после нее. Так, показано, что у мышей BDF1 в/в введение LO в однократной дозе 70 МЕ/кг сразу и на период до 12 ч снижает уровень L-лизина в плазме крови до ничтожно малого, практически не определяемого уровня. Восстановление концентрации L-лизина наступает лишь через 24 ч [203]. На основании этих расчетов и полученных нами фармакокинетических данных, можно считать, что поддерживающие дозы LO позволяют обеспечить концентрацию L-лизина на уровне, минимально достаточном для жизни только нормальных клеток. Плохое кровоснабжение опухоли не обеспечивает активно делящиеся клетки с интенсивным синтезом белка, особенно в G1 фазе клеточного цикла, постоянным поступлением незаменимых аминокислот и, соответственно, делает их более уязвимыми к колебаниям концентрации Lлизина в плазме крови, чем здоровые клетки. Косвенно это подтверждается данными фармакокинетики LO в плазме крови у мышей. Таким образом, для обоснования алгоритма экспериментального изучения важной особенностью противоопухолевых ферментов при многократном введении является сопряженное увеличение избирательности антипролиферативного эффекта при изменении амплитуды и характера колебаний уровня аминокислот в плазме крови. Сложность изучения противоопухолевой активности ряда ферментов определяется необходимостью наличия в среде кофермента для реализации ферментативной активности. Одним из примеров кофермента ряда ферментов, катализирующих разнообразные реакции превращений аминокислот и аминов является ПЛФ. Молекулярные механизмы реакций, катализируемых ПЛФ, были предложены практически одновременно и независимо А.Е. Браунштейном и М.М. Шемякиным, и Д. Мецлером и Э. Снеллом [5, 226]. Способность ПЛФ катализировать различные реакции объясняется двумя особенностями его химической структуры: образованием иминов с аминогруппами аминокислот и аминов и «оттягиванием» электронов в образовавшемся имине к атому азота пиримидинового кольца кофермента, что приводит к ослаблению связей заместителей при атоме углерода альдиминной связи. Во всех пиридоксальфосфат-зависимых ферментах кофермент образует основание Шиффа (или внутренний альдимин) с аминогруппой остатка лизина активного центра. При взаимодействии с субстратом он образует внешний альдимин путем реакции трансальдиминирования. Все 183 дальнейшие превращения, катализируемые этими ферментами, происходят путем миграции протонов и/или отщеплением заместителей у углеродных атомов аминокислоты-субстрата. ПЛФ является коферментом целого ряда ферментов, некоторые из которых обладают антипролиферативной активностью. В зависимости от местоположения атомов углерода, расположенных вблизи разрываемых связей, выделяют: ♦ α: аминотрансферазы, декарбоксилазы, ацилтрансферазы, некоторые рацемазы, альдолазы, а также β-элиминирующие лиазы (тирозин-фенол-лиаза и триптофан-индол-лиаза); ♦ β: ферменты, катализирующие реакции β-замещения и β-элиминирования: L- и Dсериндегидратазы, треонин дегидратаза, триптофансинтаза, треонинсинтаза и цистеинсинтаза; ♦ γ: ферменты, катализирующие реакции γ-замещения и γ-элиминирования: цистатионин-γлиаза и MGL [11]. Существующего в плазме крови мышей исходного уровня ПЛФ для поддержания реакции в течение всего периода циркуляции фермента недостаточно, поэтому для выявления противоопухолевого эффекта MGL необходимо дополнительное введение ПЛФ [318, 360]. Базовый уровень ПЛФ в плазме крови мышей составляет 0,3 мкМ, для проявления эффекта MGL необходимо увеличить его концентрацию до стабильного уровня 5–10 мкМ в течение 2–5 ч после введения фермента [360]. В отсутствие дополнительного введения ПЛФ концентрация метионина снижается до <5% исходной непосредственно после введения МGL в средних дозах, а инактивация MGL в связи с диссоциацией ПЛФ у мышей происходит через 2 ч после введения [195, 361]. В качестве возможных источников кофермента ранее были изучены подкожно имплантируемые помпы с постоянным высвобождением ПЛФ из резервуара [360] и рацион с повышенным содержанием пиридоксина [134]. К достоинствам первой методики относится контролируемое высвобождение ПЛФ и возможность получения постоянной прогнозируемой концентрации в плазме крови, к достоинствам второй — неинвазивность. Однако адаптация подобных методик использования MGL в клинической практике трудоемка и обладает крайне низкой комплаентностью: требует либо имплантации подкожной помпы, либо постоянного мониторинга уровня ПЛФ в плазме крови. В этой связи представлялась актуальной разработка простого и воспроизводимого метода оценки противоопухолевого эффекта MGL с использованием доступных препаратов, который может быть применен в клинической практике без опасности снижения эффективности терапии. В такой модели в качестве источника ПЛФ может быть использован его предшественник — пиридоксин, существующий в виде препарата, разрешенного для парентерального применения у человека. В качестве базовых предпосылок при разработке модели были использованы известные параметры фармакокинетики, метаболизма и токсичности пиридоксина у мышей [98, 360], а также возможность его применения вместе с MGL по примеру компонентов 184 комбинированной терапии, что может быть относительно легко перенесено в клиническую практику. 9.7. Особенности выбора препаратов для комбинированного применения с противоопухолевыми ферментами Как известно из более чем полувекового опыта применения L-аспарагиназы, ферменты удачно комбинируются с другими цитостатиками при ОЛЛ, лимфосаркоме и ретикулосаркоме. Lаспарагиназа нарушает синтез ДНК и РНК и считается циклоспецифичным препаратом. Максимальное действие L-аспарагиназы по подавлению пролиферации отмечается в постмитотической G1 фазе клеточного цикла. Эффективность лечения при комбинации Lаспарагиназы с другими цитостатиками проявляется на этапах индукции и консолидации ремиссии. В схемах поддерживающей терапии использование препаратов L-аспарагиназы не рекомендуется вследствие быстрого развития резистентности. Для больных с благоприятным и промежуточным прогнозом наиболее эффективным для индукции ремиссии является сочетание L-аспарагиназы с винкристином, преднизолоном и каким-либо из препаратов антрациклинового ряда (адриабластин, идарубицин). Для больных с неблагоприятным прогнозом эффективной для терапии пре-В и В-клеточных вариантов ОЛЛ считается схема AdOAP без L-аспарагиназы, однако в третьем курсе лечения вместо антрациклинов или циклофосфана в схему включают метотрексат и L-аспарагиназу. Таким образом, на примере L-аспарагиназы видно, в чем проявляются особенности биохимического подхода многокомпонентной терапии злокачественного процесса. Разработка схем комбинированного лечения с использованием ферментных препаратов — задача трудная, и сопряжена с особенностями лекарственных взаимодействий ферментов. К преимуществам ферментов как компонентов комбинированной терапии относится оригинальный механизм действия, отличный от других известных противоопухолевых препаратов, а также нетипичный для цитостатиков спектр побочных эффектов. Однако эмпирический подбор комбинаций в эксперименте осложняется сложностью подбора модели, чувствительной ко всем комбинантам. На ряде моделей ферментный препарат может являться модификатором активности основного цитостатика, как в случае сочетаний LO с иринотеканом или цисплатином. Изучение такой комбинации особенно сложно, поскольку в отсутствие прямого достоверного противоопухолевого эффекта предполагать возможность синергизма можно только на основании данных о синергическом механизме антипролиферативной активности комбинантов, их влиянии на клеточный цикл и сравнительной фармакокинетике сочетаемых агентов. Например, при использовании в комбинации с этопозидом следует учитывать, что этопозид способен останавливать клеточный цикл в G2/M фазе и, соответственно, синхронизировать популяцию опухолевых клеток [243, 359]. Назначение 185 ферментного препарата, разрушающего аминокислоты в фазах активного синтеза белков постмитотической и G2 фазе, может повысить чувствительность опухолевых клеток к такой схеме. Примером подобного подхода служат изученные в настоящей работе схемы комбинированной терапии с LO, в которых показано, что перспективны комбинации LO с иринотеканом, но не с этопозидом или цисплатином. На модели LLC комбинация иринотекан ¼ МПД + LO 300–450 МЕ/кг давала значимый суммационный терапевтический выигрыш с увеличением продолжительности жизни мышей до 35%. 9.8. Новые подходы к экспериментальному изучению противоопухолевых ферментов Осуществленные нами разработки новых и апробация известных методических подходов, способных оптимизировать некоторые этапы создания противоопухолевых ферментов, лежат в основе кратких рекомендаций по рациональному использованию этих подходов в процессе создания и изучения противоопухолевых ферментов. Предлагаемые рекомендации учитывают также ряд существующих в настоящее время: отечественные [33] и международные ICH (S6, S4, S9, Q5A-Q5E), EMA, Директива ЕС 2010/63/EU). Учитывая слабые звенья, выявленные на отдельных этапах изучения, ее положения охватывают весь период разработки фермента как потенциального лекарственного средства, начиная с этапа валидации мишени. Последнее особенно важно, так как при создании продукции для импортозамещения одной из нерешенных проблем является отсутствие отечественных биологически идентичных зарубежным релевантных моделей. Таким образом, положения рекомендаций включают: ♦ создание и выделение фермента; ♦ изучение качества и физико-химических свойств фермента; ♦ оценка специфической антипролиферативной активности фермента в последовательных экспериментах in vitro и in vivo с изучением основных терапевтических характеристик; ♦ оценка элементов фармакокинетики фермента; ♦ разработка оптимальной лекарственной формы фермента; ♦ стандартное токсикологическое изучение фермента в готовой лекарственной форме. При оценке специфической активности может быть дополнительно проведено сравнительное изучение с зарубежным аналогом, апробация эффективности и переносимости схем комбинированной терапии с включением ферментного препарата, исследование токсикомодифицирующего действия в сочетании с клиническим цитостатиком, оценка эффективности в адъювантном (послеоперационном) режиме; изучение антиметастатического действия и действия на развившуюся опухоль, эффективности на опухолевых моделях (in 186 vitro/in vivo) с приобретенной лекарственной резистентностью. Сравнительные исследования должны проводиться на основе адекватных, современных валидированных методов. Методики перечислены в табл. 62. Таблица 62. Отдельные методики, предлагаемые к использованию при создании и изучении ферментных препаратов с противоопухолевой активностью Этап Валидация мишени Поиск источников ферментов Получение рекомбинантных ферментов Снижение иммуногенности Улучшение терапевтических характеристик Отбор штаммовпродуцентов Оценка цитотоксичности in vitro Изучение Традиционные методики Новые методики Выявление сигнальных маркеров опухолевых клеток, наиболее Эмпирическая чувствительных к дефициту определенной аминокислоты Основанный на данных о геноме и Эмпирический биохимических характеристиках различных микро- и макроорганизмов Создание экспрессионных систем Создание различных получения ферментов, выделение про- и эукариотических которых технически упрощено экспрессионных систем (например, 6-His-Tag) Направленный мутагенез в области антигенных эпитопов Изучение перекрестной иммуногенности и последовательное применение ферментов с различными антигенными свойствами Иммобилизация белка (пегилирование, Установление активного центра белка и полисиалирование, направленный мутагенез с конъюгация с использованием моделирования in silico различными пространственной структуры и реакции макромолекулами) связывания с субстратом Конструирование мутантных форм с точечными заменами, химерных белков, связанных с Fc-фрагментами антител или биологически активными пептидами Отбор в процессе культивирования на В «ручном» режиме плотных дифференциальнопутем определения диагностических средах, основанных на активности в жидкой образовании окрашенных продуктов среде реакции Культуры клеток, валидированные по отсутствию в них фермента, способного Стандартные культуры синтезировать аминокислоты (для ферментов, расщепляющих клеток линии NCI60 и другие валидированные аминокислоты) методики Прогнозирование на основании кинетических параметров антипролиферативной активности Использование ИФА и Прогнозирование на основании данных Ссылки на источники [77, 132, 223, 322, 351] [3, 4] [368] [235] Раздел 5.1 [109] Разделы 3.2, 9.1 Раздел 3.1 [77, 130, 189, 190, 303, 321, 364] Раздел 8.2 Раздел 187 элементов фармакокинетики Скрининг in vivo Выбор оптимально й схемы введения Изучение спектра противоопу холевого действия Изучение эффективно сти комбиниров анной терапии определение активности, использование радиоактивной метки Использование отдельных перевиваемых опухолей животных и человека Использование стандартных схем многократного или однократного введения [ICH S9] Панели опухолей мышей, чувствительные к действию ферментов Эмпирический in vivo фармакокинетических параметров у человека по методу Дедрика 5.2.2. [32, 38] Использование чувствительных перевиваемых опухолей человека на основании данных in vitro Использование дискретного режима введения с нагрузочной и поддерживающей дозами на основании данных о механизме действия и фармакокинетике Панели перевиваемых опухолей человека у бестимусных мышей Модель опухолей мышей с дополнительным одновременным введением предшественника кофермента Оценка токсикомодифицируещего действия фермента на цитостатический препарат Подбор препаратов для комбинированной терапии на основе данных фармакокинетики и определения «острой» токсичности комбинантов. Оценка эффективности и переносимости комбинаций с расчетными дозами (1/2, 1/4, 1/8 МПД) в прямых сравнительных экспериментах Раздел 7.1.3 [37] Раздел 7.3 [31] Раздел 7.4 Раздел 7.4 Примечания. Оценка подлинности белковой субстанции, качества и физико-химических свойств, оценка кинетических характеристик и связывания с субстратом, моделирование четвертичной структуры, регуляторное токсикологическое изучение проводятся в соответствии с текущими стандартными рекомендациями. Выводы 1. Оптимизированы методические подходы к различным этапам изучения противоопухолевых ферментов, в том числе: отбору продуцентов рекомбинантных белков, оценке элементов фармакокинетики, изучению перекрестной иммуногенности и прогнозированию антипролиферативной активности in vitro и in vivo на основании кинетических и биологических характеристик активности. 2. Созданы 10 новых штаммов-продуцентов нативных и мутантных форм L-аспарагиназ Rhodospirillum rubrum (RrA) и Yersinia pseudotuberculosis (YpA), оптимизированы параметры 188 экспрессии и очистки целевых ферментов. Охарактеризованы физико-химические свойства новых L-аспарагиназ из Erwinia carotovora (EwA), Wolinella succinogenes (WsA), Wolinella succinogenes, конъюгированной с гепаринсвязывающим пептидом (WsA-Hep), YpA и RrA. Cравнительный анализ показал идентичность YpA и референсного препарата L-аспарагиназы Escherichia coli (EcA), в т.ч. по Km и L-глутаминазной активности, а также близкий профиль физико-химических свойств RrA, ее мутантных форм и EwA при в два раза меньшей молекулярной массе и ничтожно малой L-глутаминазной активности (<0,1%). Методом сайтнаправленного мутагенеза установлены функционально значимые аминокислотные остатки RrA. 3. Разработан и валидирован новый комплексонометрический метод отбора штаммовпродуцентов на высокоспецифичной дифференциальной плотной среде с прямой оценкой Lаспарагиназной активности, позволяющий выявлять штаммы бактерий, продуцирующих фермент с удельной активностью >0,1 МЕ/мг белка. 4. Оценена иммуногенность и разработана методика оценки перекрестного IgG- и IgMиммунного ответа для L-аспарагиназ, иммуногенность снижается в ряду: YpA > RrA ≈ WsA (WsA-Hep) ≈ EwA > EcA. Максимальная перекрестная реактивность обнаружена у YpA с EcA и с RrA. L-аспарагиназы WsA или WsA-Hep перспективны для второй линии лечения после EcA. 5. L-аспарагиназы YpA, WsA, WsA-Hep, RrA и EwA цитотоксичны на культурах клеток опухолей человека MDA-MB-231, MCF7, DU145, K562 и A549 при IC50 от 0,82 до 50,01 МЕ/мл (p <0,05) и in vivo при 10-кратном курсе в разовых дозах 1000–8000 МЕ/кг на лимфаденозе L5178y с излечением до 100%. По критерию излечения активность убывает в ряду WsA-Hep > EcA = WsA > YpA > RrA > EwA. Для внутриклеточной L-аспарагиназы I типа RrA впервые доказан антипролиферативный эффект in vivo. В ряду периплазматических L-аспарагиназ II типа EcA, EwA, YpA и WsA уровень ферментативной активности определяет прогноз эффективности in vitro/in vivo: c повышением Km увеличивается IC50 (r=0,66, р=0,007). Риск неизлеченности достоверно ниже в 4–6 раз у WsА в сравнении с EcA и YpA, ОР=0,16 и ОР=0,28 при диапазонах разовых доз 500–1000 МЕ/кг и 2000–8000 МЕ/кг, соответственно. 6. L-метионин–γ-лиазы (MGL) Citrobacter freundii, Clostridium tetani и Clostridium sporogenes с Т1/2 73, 87 и 123 мин, соответственно, активны на культурах клеток K562, МCF7 и PC3 (IC50 0,04–3,2 МЕ/мл). В плазме крови человека наиболее стабильна MGL C. sporogenes. На примере MGL С. freundii и C. sporogenes для пиридоксальфосфат зависимых ферментов разработана скрининговая модель с внутрибрюшинным введением пиридоксина мышам с эпидермоидной карциномой легкого Льюис, критерий отбора ТРО≥40%. 7. В сыворотке крови мышей после внутривенного введения L-лизин-α-оксидазы Trichoderma cf. aureoviride Rifai ВКМF-4268D (LO) с помощью модифицированного иммуноферментного 189 метода и методики прямого определения получены величины AUC=398–579 мкг/мин/мл–1 и Т1/2=55,4–81,0 мин с расчетной продолжительностью Т1/2 для человека 7,1–10,4 ч. Установлена взаимозаменяемость использованных методов. 8. Под контролем фармакокинетических параметров для внутривенного введения LO разработан дискретный режим с нагрузочной и поддерживающими дозами, позволяющий без побочных эффектов достоверно ингибировать рост широкого спектра опухолей мышей (Са755, В16/F10, АКАТОЛ, РШМ-5, LLC, МОПС-406) и человека на уровне Т/Сmin 12%, 37% и 36% (HCT116, LS174T, T47D). Более чувствительным к ферменту оказался колоректальный рак человека. 9. Включение LO в схемы лечения с ¼ МПД цисплатина или иринотекана дает суммационный или аддитивный терапевтический выигрыш против монотерапии по выживаемости мышей с Р388 (УПЖ=208% против 128%) или ингибированию роста LLC и B16/F10 (ТРОmax=87% против 58% с удержанием в течение 13 против 5 дней и УПЖ=29%). Наиболее перспективна комбинация иринотекан + LO, ориентрованная на лечение колоректального рака. 10. Установлена значимая активность in vitro L-фенилаланин:аммиак-лиазы Rhodosporidium toruloides (IC50 1,9–7,3 МЕ/мл) и in vivo рибонуклеазы Bacillus intermedius (IC50 0,4–1,0 мкг/мл) с ТРОmax=62% (p<0,05) на B16, а также выявлено достоверное преимущество эффективности химерной молекулы-конъюгата Her2/neu-специфических антител 4D5 scFv с двумя молекулами барназы (4D5 scFv-дибарназа) на SKBR3 против неконъюгированных антител 4D5 scFv и простой смесью барназы и 4D5 scFv, Т/С=37–39% против 59–87%. Практические рекомендации 1. В результате проведенных исследований для решения проблемы оптимизации экспериментального изучения новых противоопухолевых ферментов на основе новых фундаментальных и методологических подходов в области онкологии и биохимии предложен оптимизированный алгоритм создания перспективных кандидатов. Одним из практических результатов являются «Технические требования к технологиям разработки инновационных лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний, утвержденные Министерством промышленности и торговли РФ» («5.5 Онкотребования 2011»). 2. Разработанные подходы и критерии к отбору противоопухолевых ферментов использованы в деятельности рабочей группы Министерства образования и науки РФ по рассмотрению тематики работ в рамках мероприятий 5 «Доклинические исследования инновационных лекарственных средств» и 22 «Разработка новых образовательных программ и образовательных модулей для профильных высших и средних специальных учебных заведений» ФЦП «Развитие 190 фармацевтической и медицинской промышленности Российской федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу». 3. Комплексонометрический метод определения L-аспарагиназной активности бактериальных штаммов-продуцентов при разработке новых препаратов L-аспарагиназ (патент РФ №2398876) апробирован и внедрен в лабораторную практику ИБМХ им. В.Н. Ореховича, Центре Биоинженерия РАН, Department of experimental medicine, University of Pavia и рекомендован к внедрению в практику лабораторий, занимающихся созданием и изучением новых Lаспарагиназ. 4. L-метионин–γ-лиаза C. sporogenes с высокой субстратной специфичностью, длительной стабильностью в плазме крови человека и избирательной цитотоксичностью имеет практическую перспективу в качестве потенциального противоопухолевого ферментного препарата с оригинальным действием. 5. Препараты L-аспарагиназы с низкой L-глутаминазной активностью из Rhodospirillum rubrum и Wolinella succinogenes, конъюгированная с гепаринсвязывающим пептидом, имеют практическую значимость для терапии ОЛЛ при наличии иммунологической резистентности к L-аспарагиназе E. сoli. 6. L-лизин-α-оксидаза Trichoderma cf. aureoviride Rifai ВКМF-4268D в дискретном режиме перспективна для моно- и комбинированной системной химиотерапии колоректального рака и других солидных опухолей человека. 191 Благодарности Приношу глубокую благодарность проф. Е.М. Трещалиной и проф. Н.Н. Соколову за многолетнюю поддержку и терпение, без которых выполнение работы было бы невозможно; проф. Т.В. Демидкиной, проф. Е.В. Лукашевой, д.б.н. Н.Ю. Анисимовой, к.б.н. С.В. Яроцкому, к.б.н. Д.Г. Козлову, к.б.н. C.C. Александровой, к.б.н. М.В. Покровской за длительное научное сотрудничество, помощь в выполнении и написании работы; проф. Е.Ф. Колесановой, проф. В.М. Бухману и проф. Г.С. Тумян за рецензирование, помощь в подготовке окончательного варианта диссертации и рекомендации по представлению и обработке экспериментальных данных; к.б.н. Е.А. Морозовой, к.б.н. О.О. Бабич, к.б.н. П.В. Зеленихину, проф., чл.-кор. РАН С.М. Дееву за наработку и предоставление для проведения экспериментов препаратов ферментов; к.б.н. И.Н. Дьякову, к.м.н. Н.В. Андроновой, к.б.н. В.И. Романенко, к.ф-м.н. М.Д. Казанову, проф. А.В. Веселовскому, к.б.н. Н.М. Омельянюк, д.м.н. А.Н. Лукашеву, к.б.н. С.Ш. Каршиевой, к.б.н. М.В. Комаровой за содействие в выполнении отдельных экспериментов; к.б.н. Н.А. Лесной, проф., чл.-кор. РАН Н.Е. Кушлинскому, проф. М.В. Киселевскому за дружескую поддержку в написании работы. 192 Литература 1. Абакумова, О.Ю. Противоопухолевая активность L-аспарагиназы из Yersinia pseudotuberculosis / О.Ю. Абакумова, О.В. Подобед, А.А. Борисова и др. // Биомедицинская химия. — 2008. — Т. 54. — № 6. — С. 712–719. 2. Беленький, М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / М.Л. Беленький. — Л.: Медгиз, 1961. — 152 с. 3. Березов, Т.Т. Молекулярные и биохимические основы энзимотерапии опухолей / Т.Т. Березов // Биомедицинская химия. — 2005. — T. 51. — C. 235–247. 4. Березов, Т.Т. Ферментная терапия опухолей / Т.Т. Березов // Вестник АМН СССР. — 1984. — № 8. — C. 11–24. 5. Браунштейн, А.Е. Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами / А.Е. Браунштейн, М.М. Шемякин // Биохимия. — 1953. — т. 18. — 393–411. 6. Воробьев, И.И. Структурно-функциональное исследование рекомбинантных форм онконазы / И.И. Воробьев, Н.А. Пономаренко, О.М. Дурова и др. // Биоорганическая химия. — 2001. — Т. 27. — №4. — С. 257–264. 7. Гладилина, Ю.А. Клонирование, экспрессия и выделение L-аспарагиназы Helicobacter pylori / Ю.А. Гладилина, Н.Н. Соколов, Ю.В. Красоткина // Биомедицинская химия. — 2008. — Т. 54. — №4. — С. 482–486. 8. Глинка, Е.M. Эукариотические экспрессирующие векторы и иммуноконъюгаты для терапии рака / Е.M. Глинка, Э.Ф. Эдельвейс, С.М. Деев // Биохимия. — 2006. — Т. 71(6). — C. 742–753. 9. Гогичаева, Н.В. Получение конъюгатов L-лизин-a-оксидазы с антителами / Н.В. Гогичаева, Е.В. Лукашева, Е.М. Гаврилова и др. // Вопросы медицинской химии. — 2000. — Т. 46. — №4. — С. 410–418. 10. Деев, С.М. Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения / С.М. Деев, Е.Н. Лебеденко // Acta Naturae. — 2009. — №1. — C. 32–50. 11. Демидкина, Т.В. Тирозин-фенол-лиаза: структура и функции / Т.В. Демидкина. Автореф. дис… д-ра хим. наук. М., 1998. — 203 с. 12. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1966. — 816 с. 13. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс. — М., Мир, 1991. — 544 c. 14. Жукова, О.С. Влияние L-лизин--оксидазы на кинетику клеточного цикла культивируемых клеток лимфомы Беркита / О.С. Жукова, С.Х. Хадуев, Я.В. Добрынин и др. // Экспериментальная онкология. — 1985. — Т. 7. — №. 6. — С. 42–44. 193 15. Занин, В.А. Выделение и некоторые физико-химические и каталитические свойства L-лизинальфа-оксидазы из Pseudomonas putida / В.А. Занин, В.И. Лукина, Т.Т. Березов // Вопр. мед. химии. — 1989. — № 4. — С. 84–89. 16. Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность). Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. — М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России, 2013. — 289 с. 17. Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. — М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России», 2015. — 250 с. 18. Ильинская, О.Н. Избирательная цитотоксичность биназы в отношении фибробластов, экспрессирующих онкогены ras и AML/ETO / О.Н. Ильинская, П.В. Зеленихин, А.И. Колпаков и др. // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. — 2008. — Т. 150, кн. 4. — С. 268–273. 19. Кабрера Фуентес, Э.А. Сравнительная цитотоксичность биназы по отношению к опухолевым и нормальным клеткам / Э.А. Кабрера Фуентес, П.В. Зеленихин, А.И. Колпаков, К. Прайсснер, О.Н. Ильинская // Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. — 2010. — Т. 152(3). — C. 143–148. 20. Карпова, Г.В. О миелотоксичности ингибиторов ядерных энзимов иринотекана и этопозида / Г.В. Карпова, Е.В. Абрамова, Т.И. Фомина и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2006. — №1. — C. 42–47. 21. Кучумова, А.В. Пегилирование рекомбинантной аспарагиназы Erwinia carotovora полиэтиленгликолем 5000 / А.В. Кучумова, Ю.В. Красоткина, П.З. Хасигов, Н.Н. Соколов // Биомедицинская химия. — 2007. — Т. 53. — №1. — С. 107–111. 22. Ларионов, Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей / Л.Ф. Ларионов // М., Медицинская литература. — 1962. — 480 с. 23. Лукашева, Е.В. L-лизин-α-оксидаза: физико-химические и биологические свойства / Е.В. Лукашева, Т.Т. Березов // Биохимия. — 2002. — Т. 67. — № 10. — С. 1394–1402. 24. Мазин, А.В. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / А.В. Мазин, К.Д. Кузнеделов, А.С. Краев и др. — Новосибирск: Наука, 1990. — 248 с. 25. Манухов, И.В. L-метионин–гамма-лиаза Citrobacter freundii: клонирование гена и кинетические параметры фермента / И.В. Манухов, Д.В. Мамаева, Е.А. Морозова и др. // Биохимия. — 2006. — Т. 74. — №4. — С. 454–463. 26. Морозова, Е.А. Кинетические и спектральные параметры взаимодействия Citrobacter freundii метионин-гамма-лиазы с аминокислотами / Е.А. Морозова, Н.П. Бажулина, Н.В. Ануфриева, Д.В. Мамаева, Я.В. Ткачев, С.А. Стрельцов, В.П. Тимофеев, Н.Г. Фалеев, Т.В. Демидкина // Биохимия. — 2010. — Т. 75. — C. 1435–1445. 194 27. Новиков, В.В. Молекулярно-иммунологические механизмы терапевтического действия озона при раке молочной железы / В.В. Новиков, А.В. Алясова, К.Н. Конторщикова, Е.М. Михайлова, А.Ю. Барышников, А.В. Караулов // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. — 2007. — №5. — C. 68–74. 28. Омельянюк, Н.М. Оптимизация экспрессии рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora / Н.М. Омельянюк, А.А. Борисова, С.С. Александрова и др. // Биотехнология. — 2005. — № 3. — С. 27–34. 29. Остерман, Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.А. Остерман. — М., Наука, 1983. — 304 с. 30. Пехов, А.А. Цитостатический эффект L-метионин–γ-лиазы на раковые клетки в культуре / А.А. Пехов, О.С. Жукова, В.А. Занин, Т.Т. Березов // Бюл. эксп. биол. мед. — 1983. — № 5. — С. 87–89. 31. Покровский, В.С. Влияние аранозы на «острую» токсичность некоторых противоопухолевых препаратов / В.С. Покровский, Н.А. Лесная, М.И. Трещалин, Е.М. Трещалина // Токсикологический вестник. — 2010. — №6. — C. 36–40. 32. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая / Под ред. А.Н. Миронова. — М.: Гриф и К, 2012. — 966 с. 33. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. / Под ред. А.Н. Миронова. — М.: Гриф и К, 2013. — 328 с. 34. Смирнова, И.П. L-лизин-альфа-оксидазная активность некоторых видов Trichoderma / И.П. Смирнова, С.Х. Хадуев // Микробиология. — 1984. — Т. 53. — C. 163–165. 35. Трещалин, И.Д. Советский противоопухолевый препарат платин. Токсикология, фармакокинетика и снятие нефротоксичности (экспериментальное исследование). Дисс… канд. мед. наук / И.Д. Трещалин. — М. — 1983. — 131 с. 36. Трещалина Е.М. Дизайн доклинического изучения противоопухолевой активности различных агентов / Е.М. Трещалина // Российский биотерапевтический журнал. — 2009. — Т. 8. — 22. 37. Трещалина, Е.М. Коллекция опухолевых штаммов человека / Е.М. Трещалина. — М., Практическая медицина, 2009. — 172 с. 38. Трещалина, Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения / Е.М. Трещалина. — М., Практическая медицина, 2005. — 270 с. 39. Эдельвейс, Э.Ф. Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии рака. Автореф. дисс. канд. биол. наук / Э.Ф. Эдельвейс, М., 2010. — 24 с. 195 40. Эдельвейс, Э.Ф. Иммуноконъюгат анти-EGFR-мини-антитело–барназа высокотоксичен для опухолевых клеток человека / Э.Ф. Эдельвейс, Т.Г. Баландин, О.А. Стремовский, С.М. Деев, Р.В. Петров // Доклады Академии наук. — 2010. — Т. 434(4). — C. 558–561. 41. Abell, C.W. An in vivo evaluation of the chemotherapeutic potency of phenylalanine ammonialyase / C.W. Abell, D.S. Hodgins, W.J. Stith // Cancer Res. — 1973. — Vol. 33. — N. 10. — P. 2529– 2532. 42. Abuchowski, A. Cancer therapy with chemically modified enzymes. I. Antitumor properties of polyethylene glycol-asparaginase conjugates / A. Abuchowski, G.M. Kazo, C.R. Jr. Verhoest et al. // Cancer Biochem Biophys. — 1984. — Vol. 7(2). — P. 175–186. 43. Aghaiypour, K. Do bacterial L-asparaginases utilize a catalytic triad Thr-Tyr-Glu? / K. Aghaiypour, A. Wlodawer, J. Lubkowski // Biochimica et Biophysica Acta. — 2001. — Vol. 1550(2). — P. 117– 128. 44. Agrawal, V. Red blood cell-encapsulated L-asparaginase: potential therapy of patients with asparagine synthetase deficient acute myeloid leukemia / V. Agrawal, J.H. Woo, G. Borthakur, H. Kantarjian, A.E. Frankel // Protein Pept Lett. — 2013. — Vol. 20(4). — P. 392–402. 45. Ahn, M.Y. Characterization and cytotoxicity of L-amino acid oxidase from the venom of king cobra (Ophiophagus hannah) / M.Y. Ahn, B.M. Lee, Y.S. Kim // Int J Biochem Cell Biol. — 1997. — Vol. 29. — 911–919. 46. Ahn, M.Y. Cytotoxicity and L-amino acid oxidase activity of crude insect drugs / M.Y. Ahn, K.S. Ryu, Y.W. Lee, Y. Kim // Arch Pharm Res. — 2000. — Vol. 23. — 477–481. 47. Alley, M.C. Human tumor xenograft models in NCI drug development / M.C. Alley, M.G. Hollingshead, D.J. Dykes, W.R. Waud // Anticancer Drug Development Guide. 2nd ed. Eds.: Teicher B.A., Andrews P.A. — Totowa, New Jersey: Humana Press, 2004. — P. 125–152. 48. Alvarez, O.A. Pegaspargase-induced pancreatitis / O.A. Alvarez, G. Zimmerman // Med. Pediatr Oncol. — 2000. — Vol. 34(3). — P. 200–205. 49. Alves, R.M. Evidence of caspase-mediated apoptosis induced by L-amino acid oxidase isolated from Bothrops atrox snake venom / R.M. Alves, G.A. Antonucci, H.H. Paiva, A.C. Cintra, J.J. Franco, E.P. Mendonça-Franqueiro, D.J. Dorta, J.R. Giglio, J.C. Rosa, A.L. Fuly, M. Dias-Baruffi, A.M. Soares, S.V. Sampaio // Comp Biochem Physiol A. Mol Integr Physiol. — 2008. — Vol. 151(4). — P. 542–550. 50. Ambrus, C.M. Extracorporeal enzyme reactors for depletion of phenylalanine in phenylketonuria / C.M. Ambrus, S. Anthone, C. Horvath et al. // Ann. Intern. Med. — 1987. — Vol. 106. — P. 531–537. 51. Ande, S.R. Mechanisms of cell death induction by L-amino acid oxidase, a major component of ophidian venom / S.R. Ande, P.R. Kommoju, S. Draxl, M. Murkovic, P. Macheroux, S. Ghisla, E. Ferrando-May // Apoptosis. — 2006. — Vol. 11(8). — P. 1439–1451. 196 52. Andrady, C. Antibody-enzyme fusion proteins for cancer therapy / C. Andrady, S.K. Sharma, K.A. Chester // Immunotherapy. — 2011. — N. 2. — P. 193–211. 53. Ankel, E.G. Effect of asparaginase on cell membranes of sensitive and resistant mouse lymphoma cells / E.G. Ankel, J. Zirneski, B.J. Ring, J.S. Holcenberg // In Vitro. — 1984. — Vol. 20(5). — P. 376–384. 54. Appel, I.M. Changes in hypercoagulability by asparaginase: a randomized study between two asparaginases / I.M. Appel, W.C. Hop, R. Pieters // Blood Coagul Fibrinolysis. — 2006. — Vol. 17. — P. 139–146. 55. Ardelt, B. Cytostatic and cytotoxic properties of Amphinase: a novel cytotoxic ribonuclease from Rana pipiens oocytes / B. Ardelt, W. Ardelt, P. Pozarowski et al. // Cell Cycle. — 2007. — Vol. 24. — P. 3097–3102. 56. Ardelt, W. Amino acid sequence of an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. Homology to pancreatic ribonucleases / W. Ardelt, S.M. Mikulski, K. Shogen // Biol. Chem. — 1991. — Vol. 266. — N. 1. — P. 245–251. 57. Arnold, K. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modeling / K. Arnold, L. Bordoli, J. Kopp, T. Schwede // Bioinformatics. — 2006. — Vol. 22(2). — P. 195–201. 58. Ascierto, P.A. Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic melanoma: results from phase I and II studies / P.A. Ascierto, S. Scala, G. Castello et al. // J. Clin. Oncol. — 2005. — Vol. 23. — P. 7660–7668. 59. Asselin, B.L. Comparative pharmacokinetic studies of three asparaginase preparations / B.L. Asselin, J.C. Whitin, D.J. Coppola et al. // J. Clin. Oncol. — 1993. — N. 11. — P. 1780–1786. 60. Aung, H.P. Dynamics of a mobile loop at the active site of Escherichia coli asparaginase / H.P. Aung, M. Bocola, S. Schleper, K.H. Rohm // Biochimica et Biophysica Acta. — 2000. — Vol. 1481(2). — P. 349–359. 61. Avramis, V.I. Asparaginase (native ASNase or pegylated ASNase) in the treatment of acute lymphoblastic leukemia / V.I. Avramis, P.N. Tiwari // Int. J. Nanomed. — 2006. — Vol. 1. — N. 3. — P. 241–254. 62. Avramis, V.I. Pharmacokinetic/pharmacodynamic relationships of asparaginase formulations: the past, the present and recommendations for the future / V.I. Avramis, E.H. Panosyan // Clin. Pharmacokinet. — 2005. — Vol. 44. — P. 367–393. 63. Bach, S.J. Creatine synthesis by tumor-bearing rats / S.J. Bach, G.A. Maw // Biochim. Biophys. Acta. — 1953. — Vol. 11. — N. 1. — P. 69–78. 64. Bach, S.J. Some aspects of the role of arginine and arginase in mouse carcinoma 63 / S.J. Bach, I. Lasnitzki // Enzymologia. — 1947. — Vol. 12. — N. 3. — P. 198–205. 197 65. Baguley, B.C. In vitro modeling of human tumour behavior in drug discovery programmes / B.C. Baguley, E.S. Marshall //Eur. J. Cancer. — 2004. — Vol. 40. — P. 794–801. 66. Balcao, V.M. Structural and functional stabilization of L-asparaginase viasubunit: immobilization onto highly activated supports / V.M. Balcao, C. Mateo, L. Fernandez, R. Lafuente, F.X. Malcota, J.M. Guisan // Biotechnology Progress. — 2001. — Vol. 17(3). — P. 537–542. 67. Bansal, S. Structural stability and functional analysis of L-asparaginase from Pyrococcus furiosus / S. Bansal, D. Gnaneswari, P. Mishra, B. Kundu // Biochemistry (Mosc). — 2010. — Vol. 75. — N. 3. — P. 375–381. 68. Ben-Bassat A., Bauer K. Amino-terminal processing of proteins / Ben-Bassat A., Bauer K. // Nature. — 1987. — Vol. 326. — P. 315. 69. Bendich, A. Immunological effects of native and polyethylene glycol-modified asparaginases from Vibrio succinogenes and Escherichia coli in normal and tumour-bearing mice / A. Bendich, D. Kafkewitz, A. Abuchowski, F.F. Davis // Clin. Exp. Immunol. — 1982. — Vol. 48. — P. 273–278. 70. Bertani, G. Studies on Lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli / G. Bertani // J. Bacteriology. — 1952. — Vol. 62. — P. 293–300. 71. Bewley, M.C. The cloning, expression and crystallisation of a thermostable arginase / M.C. Bewley, J.S. Lott, E.N. Baker, M.L. Patchett // FEBS Lett. — 1996. — Vol. 386(2–3). — P. 215–218. 72. Bockholt, R. Partial amino acid sequence of an L-amino acid oxidase from the cyanobacterium Synechococcus PCC6301, cloning and DNA sequence analysis of the aoxA gene / R. Bockholt, B. Masepohl, V. Kruft, B. Wittmann-Liebold, E.K. Pistorius // Biochim Biophys Acta. — 1995. — Vol. 1264. — 289–293. 73. Böhmer, A. A novel L-glutamate oxidase from Streptomyces endus. Purification and properties / A. Böhmer, A. Müller, M. Passarge, P.Liebs, H. Honeck, H.G. Müller // Eur J Biochem. — 1989. — Vol. 182. — 327–332. 74. Bonthron, D.T. Why a "benign" mutation kills enzyme activity. Structure-based analysis of the A176V mutant of Saccharomyces cerevisiae L-asparaginase I / D.T. Bonthron, M. Jaskolski // Acta Biochim. Pol. — 1997. — Vol. 44. — P. 491–504. 75. Borek, D. Sequence analysis of enzymes with asparaginase activity / D. Borek, M. Jaskolski // Acta Biochimica Polonica. — 2001. — Vol. 48(4). — P. 893–902. 76. Bourget, L. Artificial cell-microencapsulated phenylalanine ammonia-lyase / L. Bourget, T.M. Chang // Appl. Biochem. Biotechnol. — 1984. — Vol. 10. — P. 57–59. 77. Bowles, T.L. Pancreatic cancer cell lines deficient in argininosuccinate synthetase are sensitive to arginine deprivation by arginine deiminase / T.L. Bowles, R. Kim, J. Galante et al. // Int. J. Cancer. — 2008. — Vol. 123. — P. 1950–1955. 198 78. Boyd, M.R. The NCI human tumor cell line (60-cell) screen / M.R. Boyd // Anticancer Drug Development Guide. 2nd ed. Eds.: Teicher B.A., Andrews P.A. — Totowa, New Jersey: Humana Press, 2004. — P. 41–60. 79. Bramono, D.S. Bone marrow-derived heparan sulfate potentiates the osteogenic activity of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) / D.S. Bramono, S. Murali, B. Rai, L. Ling, W.T. Poh, Z.X. Lim, G.S. Stein, V. Nurcombe, A.J. van Wijnen, S.M. Cool // Bone. — 2012. — Vol. 50(4). — P. 954–964. 80. Braun, M. Purification and some properties of an extracellular l-amino acid oxidase from Cellulomonas cellulans AM8 isolated from soil / M. Braun, J.M. Kim, R.D. Schmid // Appl Microbiol Biotechnol. — 1992. — Vol. 37. — 594–598. 81. Brearley, G.M. Purification and Partial Characterisation of a Broad-Range L-Amino Acid Oxidase from Bacillus carotarum 2Pfa Isolated from soil / G.M. Brearley, C.P. Price, T. Atkinson, P.M. Hammond // Appl Microbiol Biotechnol. — 1994. — Vol. 41. — 670–676. 82. Bregge-Silva, C. Isolation and biochemical, functional and structural characterization of a novel Lamino acid oxidase from Lachesis muta snake venom / C. Bregge-Silva, M.C. Nonato, S. de Albuquerque et al. // Toxicon. — 2012. — Vol. 60(7). — 1263–1276. 83. Broome, J.D. Evidence that the L-asparaginase activity of guinea pig serum is responsible for its antilymphoma effects / J.D. Broome // Nature. — 1961. — Vol. 191. — P. 1114–1115. 84. Broome, J.D. Factors which may influence the effectiveness of L-asparaginase as tumor inhibitors / J.D. Broome // Brit. J. Cancer. — 1968. — Vol. 22. — P. 595–602. 85. Buckle, А.М. Protein-protein recognition: crystal structural analysis of a barnase-barstar complex at 2.0-A resolution / А.М. Buckle, G. Schreiber, A.R. Fersht // Biochemistry. — 1994. — Vol. 33. — P. 8878–8889. 86. Butzke, D. Cloning and biochemical characterization of APIT, a new L-amino acid oxidase from Aplysia punctate / D. Butzke, R. Hurwitz, B. Thiede, S. Goedert, T. Rudel // Toxicon. — 2005. — Vol. 46(5). — 479–489. 87. Calabrese, J.C. Crystal structure of phenylalanine ammonia-lyase: multiple helix dipoles implicated in catalysis / J.C. Calabrese, D.B. Jordan, A. Boodhoo et al. // Biochemistry. — 2004. — Vol. 43. — P. 11403–11416. 88. Campbell, H.A. Two L-asparaginases from Escherichia coli B. Their separation, purification, and antitumor activity / H.A. Campbell, L.T. Mashburn, E.A. Boyse, L.J. Old // Biochemistry. — 1967. — Vol. 6. — P. 721–730. 89. Cappelletty, D. Helicobacter pylori L-asparaginase: A promising new chemotherapeutic agent / D. Cappelletty, L.R. Chiarelli, M.V. Pasquetto et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2008. — Vol. 377. — P. 1222–1226. 199 90. Carta De-Angeli, L. Effect of L-asparaginase from Aspergillus terreus on ascites sarcoma in the rat / L. Carta De-Angeli, F. Pocchiari et al. // Nature (London). — 1970. — Vol. 225. — P. 549–550. 91. Cedar, H. Isolation of two L-asparaginases in anaerobically grown E. coli / H. Cedar, J. Schwartz // J. Biol. Chem. — 1967. — Vol. 242. — P. 3753–3757. 92. Cellarier, E. Methionine dependency and cancer treatment / E. Cellarier, X. Durando, M.P. Vasson et al // Cancer Treat Rev. — 2003. — Vol. 29. — P. 488–489. 93. Chabner, B.A. Enzyme therapy: L-asparaginase / B.A. Chabner, T.L. Loo // Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice. 2nd Edition. — 1996. — P. 485–492. 94. Chang, C.H. Effective therapy of human lymphoma xenografts with a novel recombinant ribonuclease/anti-CD74 humanized IgG4 antibody immunotoxin / C.H. Chang, P. Sapra, S.S. Vanama et al. // Blood. — 2005. — Vol. 106(13). — P. 4308–4314. 95. Chen, Z. Qualitative and quantitative studies on human B7.1-Fc fusion protein and the application in pharmacokinetic study in rhesus monkeys / Z. Chen, R. Liu, J. Che et al. // J. Pharm. Biomed. Anal. — 2011. — Vol. 54(1). — P. 133–140. 96. Cheng, P.N. Pegylated recombinant human arginase inhibits the in vitro and in vivo proliferation of human hepatocellular carcinoma through arginine depletion / P.N. Cheng, T.L. Lam, W.M. Lam et al. // Cancer Res. — 2007. — Vol. 67. — N. 1. — P. 309–317. 97. Colleluori, D.M. Expression, purification, and characterization of human type II arginase / D.M. Colleluori, S.M. Jr. Morris, D.E. Ash // Arch Biochem Biophys. — 2001. — Vol. 389(1). — P. 135– 143. 98. Colombini, C.E. Vitamin B6 metabolism. The utilization of [14C]pyridoxine by the normal mouse / C.E. Colombini, E.E. McCoy // Biochemistry. — 1970. — Vol. 9(3). — P. 533–538. 99. Cooney, D.A. Investigation of L-asparagine metabolism in animals and human subjects / D.A. Cooney, R.E. Handschumacher // Proc. Am. Ass. Cancer Res. — 1968. — Vol. 9. — P. 15. 100. Costanzi, J. Ribonucleases as a novel pro-apoptotic anticancer strategy: review of the preclinical and clinical data for ranpirnase / J. Costanzi, D. Sidransky, A. Navon et al. // Cancer Invest. — 2005. — Vol. 23. — N. 7. — P. 643–650. 101. Cui, L. Recombinant hHscFv-RC-RNase protein derived from transgenic tobacco acts as a bifunctional molecular complex against hepatocellular carcinoma / L. Cui, H. Peng, R. Zhang, Y. Chen, L. Zhao, K. Tang // Biotechnol Appl Biochem. — 2012. — Vol. 59(5). — P. 323–329. 102. Curley, S.A. Regression of hepatocellular cancer in a patient treated with arginine deiminase / S.A. Curley, J.S. Bomalaski, C.M. Ensor et al. // Hepatogastroenterology. — 2003. — Vol. 50. — N. 53. — P. 1214–1216. 200 103. Darzynkiewicz, Z. Cytostatic and cytotoxic effects of Pannon (P-30 Protein), a novel anticancer agent / Z. Darzynkiewicz, S.P. Carter, S.M. Mikulski et al. // Cell Tissue Kinet. — 1988. — Vol. 21. — N. 3. — P. 169–182. 104. De Lorenzo, C. A fully human antitumor immunoRNase selective for ErbB-2-positive carcinomas / C. De Lorenzo, A. Arciello, R. Cozzolino, D.B. Palmer, P. Laccetti, R. Piccoli, G. D'Alessio // Cancer Res. — 2004. — Vol. 64(14). — P. 4870–4874. 105. De Lorenzo, C. A human, compact, fully functional anti-ErbB2 antibody as a novel antitumour agent / C. De Lorenzo, A. Tedesco, G. Terrazzano, R. Cozzolino, P. Laccetti, R. Piccoli, G. D'Alessio // Br J Cancer. — 2004. — Vol. 91(6). — P. 1200–1204. 106. Dedrick, R.L. Animal scale-up / R.L. Dedrick // J. Pharmacokinet. Biopharm. — 1973. — Vol. 1. — 435–461. 107. Delage, B. Promoter methylation of argininosuccinate synthetase-1 sensitises lymphomas to arginine deiminase treatment, autophagy and caspase-dependent apoptosis / B. Delage, P. Luong, L. Maharaj et al. // Cell Death Dis. — 2012. — Vol. 3. — e342. 108. Deptala, A. Potentiation of tumor necrosis factor induced apoptosis by onconase / A. Deptala, H.D. Halicka, B. Ardelt et al. // Int. J. Oncol. — 1998. — Vol. 13. — N. 1. — P. 11–16. 109. Derst, C. Engineering the substrate specificity of Escherichia coli asparaginase II. Selective reduction of glutaminase activity by amino acid replacements at position 248 / C. Derst, J. Henseling, K.H. Röhm // Protein Science. — 2000. — Vol. 9. — P. 2009–2017. 110. Derst, C. Probing the role of threonine and serine residues of E. coli asparaginase II by sitespecific mutagenesis / C. Derst, J. Henseling, K.H. Rohm // Protein Engineering. — 1992. — Vol. 5(8). — P. 785–789. 111. Derst, C. States and functions of tyrosine residues in Escherichia coli asparaginase II / C. Derst, A. Wehner, V. Specht, K.-H. Rohm // FEBS European Journal of Biochemistry. — 1994. — Vol. 224. — P. 533–540. 112. Distasio, J.A. Glutaminase-free asparaginase from Vibrio succinogenes: an antilymphoma enzyme lacking hepatotoxicity / J.A. Distasio, A.M. Salazar, M. Nadji, D.L. Durden // Int. J. Cancer. — 1982. — Vol. 30(3). — P. 343–347. 113. Distasio, J.A. Purification and characterization of L-asparaginase with anti-lymphoma activity from Vibrio succinogenes / J.A. Distasio, R.A. Niederman // J. Biol. Chem. — 1976. — Vol. 251. — N. 22. — P. 6929–6933. 114. Dubrac, A. Functional divergence between 2 chemokines is conferred by single amino acid change / A. Dubrac, C. Quemener, E. Lacazette, F. Lopez, C. Zanibellato, W.-G. Wu, A. Bikfalvi, H. Prats // Blood. — 2010. — Vol. 116(22). — 4703–4711. 201 115. Duerre, J.A. L-amino acid oxidases of Proteus rettgeri / J.A. Duerre, S. Chakrabarty // J Bacteriol. — 1975. — Vol. 121. — 656–663. 116. Duffey, S.S. Biosynthesis of phenol and guaiacol by the hemipteran Leptoglussus phyllopus / S.S. Duffey, J.R. Aldrich, M.S. Blum // Compt. Biochem. Physiol. — 1977. —Vol. 56B. — 101–102. 117. Durden, D.L. Kinetic analisys of hepatotoxicity associated with antineoplastic asparaginases / D.L. Durden, A.M. Salazar, J.A. Distasio // Cancer Res. — 1983. — Vol. 43. — P. 1602–1605. 118. Duval, M. Comparison of Escherichia coli asparaginase with Erwinia asparaginase in the treatment of childhood lymphoid malignancies: results of a randomized European Organisation for Research and Treatment of Cancer-Children's Leukemia Group phase 3 trial / M. Duval, S. Suciu, A. Ferster et al. // Blood. — 2002. — Vol. 99. — N. 8. — P. 2734–2739. 119. Eckstein, M.R. Amino acid oxidase of leukocytes in relation to H2O2-mediated bacterial killing / M.R. Eckstein, R.L. Baehner, D.G. Nathan // J. Clin. Invest. — 1971. — Vol. 50(9). — 1985–1991. 120. Edelheit, O. Simple and efcient sitedirected mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies / O. Edelheit, A. Hanukoglu, I. Hanukoglu // BMC Biotechnol. — 2009. — Vol. 61(9). — P. 1–8. 121. Eden, O.B. Non-randomised study comparing toxicity of Escherichia coli and Erwinia asparaginase in children with leukaemia / O.B. Eden, M.P. Shaw, J.S. Lilleyman, S. Richards // Med. Pediatr. Oncol. — 1990. — Vol. 18(6). — P. 497–502. 122. Ehara, T. Antimicrobial action of achacin is mediated by L-amino acid oxidase activity / T. Ehara, S. Kitajima, N. Kanzawa, T. Tamiya, T. Tsuchiya // FEBS Lett. — 2002. — Vol. 531(3). — 509–512. 123. Ehrman, M. L-asparaginase II of E. coli studies on the enzymatic mechanism of action / M. Ehrman, H. Cedar, H. James, J.H. Schwartz // J. Biol. Chem. — 1971. — Vol. 246. — P. 88–94. 124. El-Bessoumy, A.A. Production, isolation and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation / A.A. El-Bessoumy, M. Sarhan, J. Mansour // J. Biochem. Mol. Biol. — 2004. — Vol. 37. — P. 387–393. 125. El-Sayed, A.S. Microbial L-methioninase: production, molecular characterization, and therapeutic applications / A.S. El-Sayed // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2010. — Vol. 86. — P. 445–467. 126. El-Sayed, A.S. Pharmacokinetics, immunogenicity and anticancer efficiency of Aspergillus flavipes L-methioninase / A.S. El-Sayed, S.A. Shouman, H.M. Nassrat // Enzyme Microb Technol. — 2012. — 51(4). — 200–210. 127. El-Sayed, A.S. Purification and characterization of a new L-methioninase from solid cultures of Aspergillus flavipes / A.S. El-Sayed // J Microbiol. — 2011. — Vol. 49(1). — P. 130–140. 128. EMA Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: quality issues (revision 1). EMA/CHMP/BWP/247713/2012. 202 129. Enei, H. Microbiological synthesis of L-tyrosine and 3,4-dihydrophenyl-L-alanine. I. Distribution of tyrosine phenol-lyase in microorganisms / H. Enei, H. Matsui, H. Yamashita, S. Okumura, H. Yamada // Agr. Biol. Chem. — 1972. — Vol. 36. — 1861–1868. 130. Ensor, C.M. Pegylated arginine deiminase (ADI-SS PEG20,000 mw) inhibits human melanomas and hepatocellular carcinomas in vitro and in vivo / C.M. Ensor, F.W. Holtsberg, J.S. Bomalaski, M.A. Clark // Cancer Res. — 2002. — Vol. 62. — P. 5443–5450. 131. Ferrara, M.A. Kinetics of asparaginase II fermentation in Saccharomyces cerevisiae ure2dal80 mutant: effect of nitrogen nutrition and pH / M.A. Ferrara, J.M. Mattoso, E.P. Bon, N.Jr. Pereira // Appl Biochem Biotechnol. — 2004. — Vol. 113–116. — P. 299–305. 132. Feun, L.G. Negative argininosuccinate synthetase expression in melanoma tumours may predict clinical benefit from arginine-depleting therapy with pegylated arginine deiminase / L.G. Feun, A. Marini, G. Walker et al. // Br. J. Cancer. — 2012. — Vol. 106(9). — 1481–1485. 133. Fidler, I.J. Effects of L-asparaginase on lymphocyte surface and blastogenesis / I.J. Fidler, P.C. Montgomery // Cancer Res. — 1972. — Vol. 32(11). — P. 2400–2406. 134. Furth-Walker, D. Changes in pyridoxal phosphate and pyridoxamine phosphate in blood, liver and brain in the pregnant mouse / D. Furth-Walker, D. Leibman, A. Smolen // J Nutr. — 1989. — Vol. 119(5). — P. 750–756. 135. Gaspar, M.M. Biological characterization of L-asparaginase liposomal formulations / M.M. Gaspar, R. Perez-Soler, M.E. Cruz // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1996. — Vol. 38(4). — P. 373–377. 136. Gaspar, M.M. Formulation of L-asparaginase load poly(lactide-to-glycolide) nanoparticles: influence of polymer properties on enzyme loading, activity and in vitro release / M.M. Gaspar, D. Blanco, M.E. Cruz, M.J. Alonso // J. Controlled Release. — 1998. — Vol. 52. — P. 53–62. 137. Gervais, D. Recombinant deamidated mutants of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase have similar or increased activity compared to wild-type enzyme / D. Gervais, N. Foote // Molecular Biotechnology. — 2014. — Vol. 56(10). — P. 865–877. 138. Gesto, D.S. Unraveling the enigmatic mechanism of L-asparaginase II with QM/QM calculations / D.S. Gesto, N.M. Cerqueira, P.A. Fernandes, M.J. Ramos // J Am Chem Soc. — 2013. — Vol. 135(19). — P. 7146–7158. 139. Geyer, A. Structure and characterization of the glycan moiety of L-amino-acid oxidase from the Malayan pit viper Calloselasma rhodostoma / A. Geyer, T.B. Fitzpatrick, P.D. Pawelek, K. Kitzing, A. Vrielink, Ghisla S., P. Macheroux // Eur J Biochem. — 2001. — Vol. 268. — 4044–4053. 140. Gilbert, H.J. Cloning and expression of the Erwinia chrysanthemi asparaginase gene in Escherichia coli and Erwinia carotovora / H.J. Gilbert, R. Blazek, H.M. Bullman et al. // J.Gen. Microbiol. — 1986. — Vol. 132. — P. 151–160. 203 141. Glazer, E.S. Phase II study of pegylated arginine deiminase for nonresectable and metastatic hepatocellular carcinoma / E.S. Glazer, M. Piccirillo, V. Albino et al. // J. Clin. Oncol. — 2010. — Vol. 28. — N. 13. — P. 2220–2226. 142. Goldberg, A.I. The effects of immunization to L-asparaginase on antitumor and enzymatic activity / A.I. Goldberg, D.A. Cooney, J.P. Glynn et al. // Cancer Res. — 1973. — Vol. 33. — P. 256– 261. 143. Gong, H. Arginine deiminase inhibits proliferation of human leukemia cells more potently than asparaginase by inducing cell cycle arrest and apoptosis / H. Gong, F. Zölzer, G. von Recklinghausen et al. // Leukemia. — 2000. — Vol. 14(5). — P. 826–829. 144. Guennadi, S. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth / S. Guennadi, D. Joseleau-Petit, R. D`Ari // J. Bacteriology. — 2007. — Vol. 189. — P. 8746–8749. 145. Guichard, S. Comparison of the pharmacokinetics and efficacy of irinotecan after administration by the intravenous versus intraperitoneal route in mice / S. Guichard, E. Chatelut, I. Lochon et al. // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1998. — Vol. 42(2). — P. 165–170. 146. Gulati, R. A rapid plate assay for screening L-asparaginase producing micro-organisms / R. Gulati, R.K. Saxena, R. Gupta // Lett. Appl. Microbiol. — 1997. — Vol. 24. — P. 23–26. 147. Hanauske, A.-R. Human tumor screening / A.-R. Hanauske, S.G. Hilsenbeck, D.D. von Hoff // Anticancer Drug Development Guide. 2nd ed. Eds.: Teicher B.A., Andrews P.A. — Totowa, New Jersey: Humana Press, 2004. — P. 63–76. 148. Harmand, T.J. New chemistries for chemoselective peptide ligations and the total synthesis of proteins / T.J. Harmand, C.E. Murar, J.W. Bode // Curr Opin Chem Biol. — 2014. — Vol. 22. — 115– 21. 149. Harms, E. A catalytic role for threonine-I2 of E. coli asparaginase TI as established by sitedirected mutagenesis / E. Harms, A. Wehner, H.P. Aung, K.H. Rohm // FEBS Letters. — 1991. — Vol. 285(8). — P. 55–58. 150. Harms, E. Construction of expression system for Escherichia coli asparaginase II and two-step purification of the recombinant enzyme from periplasmic extracts / E. Harms, A. Wehner, M. Jennings et al. // Protein Expr. Purif. — 1991. — Vol. 2. — P. 144–150. 151. Hartley, R.W. Barnase-barstar interaction / R.W. Hartley // Methods Enzymol. — 2001. — Vol. 341. — P. 599–611. 152. Hernandez, C.P. Pegylated arginase I: a potential therapeutic approach in T-ALL / C.P. Hernandez, K. Morrow, L.A. Lopez-Barcons et al.// Blood. — 2010. — Vol. 115. — N. 25. — P. 5214–5221. 204 153. Hervas-Stubbs, S. Direct effects of type I interferons on cells of the immune system / S. HervasStubbs , J.L. Perez-Gracia , A. Rouzaut, M.F. Sanmamed, A. Le Bon, I. Melero // Clin Cancer Res. — 2011. — Vol. 17(9). — P. 2619–2627. 154. Heymach, J.V. Phase II study of the farnesyl transferase inhibitor R115777 in patients with sensitive relapse small-cell lung cancer / J.V. Heymach, D.H. Johnson, F.R. Khuri et al. // Ann Oncol. — 2004. — Vol. 15. — P. 1187–1193. 155. Ho, P.P.K. Crystalline L-asparaginase from E. coli B / P.P.K. Ho, H. Frank, P.J. Burch // Science — 1969. — Vol. 165. — P. 510–512. 156. Hoffman, R.M. PEG-methioninase / R.M. Hoffman // Adv Exp Med Biol. — 2003. — Vol. 519. — P. 69–79. 157. Holbeck, S.L. Update on NCI in vitro drug screen utilities / S.L. Holbeck // Eur. J. Cancer. — 2004. — Vol. 40. — P. 785–793. 158. Hollingshead, M.G. NCI Specialized procedures in preclinical drug evaluations / M.G. Hollingshead, M.C. Alley, G. Kaur, C.M. Pacula-Cox, S.F. Stinson // Anticancer Drug Development Guide. 2nd ed. Eds.: Teicher B.A., Andrews P.A. — Totowa, New Jersey: Humana Press, 2004. — P. 153–182. 159. Holtsberg, F.W. Poly(ethylene glycol) (PEG) conjugated arginine deiminase: effects of PEG formulations on its pharmacological properties / F.W. Holtsberg, C.M. Ensor, M.R. Steiner et al. // J. Control Release. — 2002. — Vol. 80. — P. 259–271. 160. Hori, H. Gene cloning and characterization of Pseudomonas putida L-methionine-alpha-deaminogamma-mercaptomethane-lyase / H. Hori, K. Takabayashi, L. Orvis et al // Cancer Res. — 1996. — Vol. 56(9). — P. 2116–2122. 161. Hoshiya, Y. Methionine starvation modulates the efficacy of cisplatin on human breast cancer in nude mice / Y. Hoshiya, T. Kubota, S.W. Matsuzaki et al. // Anticancer Res. — 1996. — Vol. 16. — N. 6B. — P. 3515–3517. 162. Howard, J.B. L-asparaginase from Erwinia carotovora. Substrate specificity and enzymatic properties / J.B. Howard, F.H. Carpenter // J. Biol. Chem. — 1972. — Vol. 247. — P. 1020–1030. 163. Hsueh, E.C. Deprivation of arginine by recombinant human arginase in prostate cancer cells / E.C. Hsueh, S.M. Knebel, W.H. Lo et al. // J Hematol Oncol. — 2012. — 5:17. doi: 10.1186/17568722-5-17. 164. Hu, J. Methionine depletion with recombinant methioninase: in vitro and in vivo efficacy against neuroblastoma and its synergism with chemotherapeutic drugs / J. Hu, N.K. Cheung // Int. J. Cancer. — 2009. — Vol. 124. — N. 7. — P. 1700–1706. 165. ICH Topic Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/ Biological Products. CPMP/ICH/365/96 205 166. Iijima, R. L-amino acid oxidase activity of an antineoplastic factor of a marine mollusk and its relationship to cytotoxicity / R. Iijima, J. Kisugi, M. Yamazaki // Dev Comp Immunol. — 2003. — Vol. 27(6–7). — P. 505–512. 167. Ikemoto, M. Expression of human liver arginase in Escherichia coli. Purification and properties of the product / M. Ikemoto, M. Tabata, T. Miyake, T. Kono, M. Mori, M. Totani, T. Murachi // Biochem J. — 1990. — Vol. 270(3). — P. 697–703. 168. Ita, M. Remarkable enhancement of cytotoxicity of onconase and cepharanthine when used in combination on various tumor cell lines / M. Ita, H.D. Halicka, T. Tanaka et al. // Cancer Biol. Ther. — 2008. — Vol. 7(7). — P. 1104–1108. 169. Ito, S. Purification and characterization of methioninase from Pseudomonas putida / S. Ito, T. Nakamura, Y. Eguchi // J. Biochem. — 1976. — Vol. 79. — N. 6. — P. 1263–1272. 170. Izidoro, L.F. Biochemical and functional characterization of an L-amino acid oxidase isolated from Bothrops pirajai snake venom / L.F. Izidoro, M.C. Ribeiro, G.R. Souza et al. // Bioorg Med Chem. — 2006. — Vol. 14(20). — P. 7034–7043. 171. Izzo, F. Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma: results from phase I/II studies / F. Izzo, P. Marra, G. Beneduce et al. // J. Clin. Oncol. — 2004. — Vol. 22. — P. 1815–1822. 172. Jaccard, A. L-asparaginase-based treatment of 15 western patients with extranodal NK/T-cell lymphoma and leukemia and a review of the literature / A. Jaccard, B. Petit, S. Girault et al. // Ann. Oncol. — 2009. — Vol. 20. — N. 1. — P. 110–116. 173. Jackson, R.C. Escherichia coli L-asparaginase. Catalytic activity abd subunit nature / M. Ehrman, H. Cedar, H. James, J.H. Schwartz // Biochemistry. — 1970. — N. 9. — P. 3585–3590. 174. Jameel, F. Investigation of physicochemical changes to L-asparaginase during freeze-thaw cycling / F. Jameel, R. Bogner, F. Mauri, D. Kalonia // Journal of Pharmacy and Pharmacology. — 1997. — Vol. 49(5). — P. 472–477. 175. Jean-François, J. Immobilization of L-asparaginase into a biocompatible poly(ethylene glycol)albumin hydrogel: evaluation of performance in vivo / J. Jean-François, E.M. D'Urso, G. Fortier // Biotechnol. Appl. Biochem. — 1997. — Vol. 26 (Pt 3). — P. 203–212. 176. Jensen, P.B. Antitumor activity of the two epipodophyllotoxin derivatives VP-16 and VM-26 in preclinical systems: a comparison of in vitro and in vivo drug evaluation / P.B. Jensen, H. Roed, T. Skovsgaard еt al. // Cancer Chemother Pharmacol. — 1990. — Vol. 27(3). — P. 194–198. 177. Jia, M. Cloning, expression, and characterization of L-asparaginase from a newly isolated Bacillus subtilis B11-06 / M. Jia, M. Xu, B. He, Z. Rao // J Agric Food Chem. — 2013. — Vol. 61(39). — P. 9428–9234. 206 178. Jianhua, C. Probing the antigenicity of E. coli L-asparaginase by mutational analysis / C. Jianhua, W. Yujun, J. Ruibo, W. Min, W. Wutong // Mol. Biotechnol. — 2006. — Vol. 33(1). — P. 57– 65. 179. Jorge, J.C. Liposomal palmitoyl-L-asparaginase: characterization and biological activity / J.C. Jorge, R. Perez-Soler, J.G. Morais, M.E. Cruz // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1994. — Vol. 34(3). — P. 230–234. 180. Juan, G. G1 arrest of U937 cells by onconase is associated with suppression of cyclin D3 expression, induction of p16INK4A, p21WAF1/CIP1 and p27KIP and decreased pRb phosphorylation / G. Juan, B. Ardelt, X. Li et al. // Leukemia. — 1998. — Vol. 12 — N. 8. — P. 1241–1248. 181. Jung, S.K. Purification and cloning of an apoptosis-inducing protein derived from fish infected with Anisakis simplex, a causative nematode of human anisakiasis / S.K. Jung, A. Mai, M. Iwamoto, N. Arizono, D. Fujimoto, K. Sakamaki, S. Yonehara // J. Immunol. — 2000. — Vol. 165. — 1491–1497. 182. Kabsch, W. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features / W. Kabsch, C. Sander // Biopolymers. — 1983. — Vol. 22(12). — P. 2577– 2637. 183. Kanzawa, N. Achacin induces cell death in HeLa cells through two different mechanisms / N. Kanzawa, S. Shintani, K. Ohta, S. Kitajima, T. Ehara, H. Kobayashi, H. Kizaki, T. Tsuchiya // Arch Biochem Biophys. — 2004. — Vol. 422(1). — P. 103–109. 184. Keen, J.H. Receptor-mediated endocytosis of diphtheria toxin by cells in culture / J.H. Keen, F.R. Maxfield, M.C. Hardegree, W.H. Habig // Proc Natl Acad Sci USA. — 1982. — Vol. 79. — 2912– 2916. 185. Kelly, M.P. Arginine deiminase PEG20 inhibits growth of small cell lung cancers lacking expression of argininosuccinate synthetase / M.P. Kelly, A.A. Jungbluth, B.W. Wu et al. // Br. J. Cancer. — 2012. — Vol. 106(2). — 324-32. 186. Keshishian, H. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution / H. Keshishian, T. Addona, M. Burgess et al. // Mol. Cell Proteomics. — 2007. — Vol. 6. — P. 2212–2229. 187. Khan, A. Atopic hypersensitivity to L-asparaginase: resistance to immunosupression / A. Khan, J.M. Hill // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. — 1971. — Vol. 40. — N. 3. — P. 463–569. 188. Kidd, J.G. Regression of transplanted lymphomas induced in vivo by means of normal guinea pig serum / J.G. Kidd // J. Exp. Med. — 1953. — Vol. 98. — P. 565–582. 189. Kim, H.J. Anti-tumor activity of arginine deiminase via arginine deprivation in retinoblastoma / H.J. Kim, J.H. Kim, Y.S. Yu et al. // Oncology reports. — 2007. — Vol. 18. — P. 1373–1377. 207 190. Kim, R.H. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis / R.H. Kim, J.M. Coates, T.L. Bowles et al. // Cancer Res. — 2009. — Vol. 69. — P. 700–708. 191. Kitani, Y. Antibacterial action of L-amino acid oxidase from the skin mucus of rockfish Sebastes schlegelii / Y. Kitani, N. Kikuchi, G.-H. Zhang, S. Ishizaki, K. Shimakura, K. Shiomi, Y. Nagashima // Comp. Biochem. Physiol. — 2008. — Vol. B149. — 394–400. 192. Kitto, G.B. Tumor inhibitory and non-tumor inhibitory L-asparaginases from Pseudomonas geniculata / G.B. Kitto, G. Smith, T. Thiet, M. Mason, L. Davidson // J. Bacteriol. — 1979. — Vol. 137. — P. 204–212. 193. Kiue, A. Enchancement of antitumour activity of etoposide by dihydropyridines on drug-sensitive and drug-resistant leukaemia in mice / A. Kiue, T. Sano, A. Naito et al. // Br. J. Cancer. — 1991. — Vol. 64. — P. 221–226. 194. Ko, K.C. Identification of potent bactericidal compounds produced by escapin, an L-amino acid oxidase in the ink of the sea hare Aplysia californica / K.C. Ko, B. Wang, P.C. Tai, C.D. Derby // Antimicrob. Agents Chemother. — 2008. —Vol. 52(12). — 4455–4462. 195. Kokkinakis, D.M. Effect of long-term depletion of plasma methionine on the growth and survival of human brain tumor xenografts in athymic mice / D.M. Kokkinakis, S.C. Jr. Schold, H. Hori, T. Nobori // Nutr. Cancer. — 1997. — Vol. 29. — N. 3. — P. 195–204. 196. Kokkinakis, D.M. Synergy between methionine stress and chemotherapy in the treatment of brain tumor xenografts in athymic mice / D.M. Kokkinakis, R.M. Hoffman, E.P. Frenkel et al. // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. — P. 4017–4023. 197. Kozai, M. Growth inhibition of human melanoma cells by a recombinant arginine deiminase expressed in Escherichia coli / M. Kozai, E. Sasamori, M. Fujihara, T. Yamashita, H. Taira, R. Harasawa // J Vet Med Sci. — 2009. — Vol. 71. — P. 1343–1347. 198. Kreis, W. Biological effects of enzymatic deprivation of L-methionine in cell culture and an experimental tumor / W. Kreis, C. Hession // Cancer Res. — 1973. — Vol. 33. — N. 8. — P. 1866– 1869. 199. Kreis, W. Isolation and purification of L-methionine-alpha-deamino-gamma-mercaptomethanelyase (L-methioninase) from Clostridium sporogenes / W. Kreis, C. Hession // Cancer Res. — 1973. — Vol. 33. — P. 1862–1865. 200. Kringelum, J.V. Reliable B cell epitope predictions: impacts of method development and improved benchmarking / J.V. Kringelum, C. Lundegaard, O. Lund, M. Nielsen // PLoS Comput Biol. — 2012. — Vol. 8(12). — e1002829. 208 201. Kunimoto, T. Antitumor activity of 7-Ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]carbonyloxycampthothecin, a novel water-soluble derivative of camptothecin, against murine tumors / T. Kunimoto, K. Nitta, T. Tanaka et al. // Cancer Res. — 1987. — Vol. 47. — P. 5944–5947. 202. Kusakabe, H. A new antitumor enzyme, L-lysine alpha-oxidase from Trichoderma viride. Purification and enzymological properties / H. Kusakabe, K. Kodama, A. Kuninaka et al. // J. Biol. Chem. — 1980. — Vol. 255. — N. 3. — P. 976–981. 203. Kusakabe, H. Occurrence of a novel enzyme, L-lysine oxidase with antitumor activity in culture extract of Trichoderma viride / H. Kusakabe, K. Kodama, H. Machida, Y. Midorikawa, A. Kuninaka, H. Misono et al. // Agricult. Biol. Chem. — 1979. — Vol. 43(2). — P. 337–343. 204. Kwon, Y.M. L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia / Y.M. Kwon, H.S. Chung, C. Moon et al. // J. Control Release. — 2009. — Vol. 139(3). — P. 182–189. 205. Lara, P.J. Bortezomib in relapsed or refractory extensive-stage small-cell lung cancer: a phase II trial / P.J. Lara, K. Chansky, A.M. Davies et al. // J Thorac Oncol. — 2006. — Vol. 1. — P. 996–1001. 206. Laskowski, R.A. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures / R.A. Laskowski, M.W. MacArthur, D.S. Moss, J.M. Thornton // Journal of Applied Crystallography. — 1993. — Vol. 26(2). — P. 283–291. 207. Leal-Egaña, A. Silk-based materials for biomedical applications / A. Leal-Egaña, T. Scheibel // Biotechnol. Appl. Biochem. — 2010. — Vol. 55(3). — P. 155–167. 208. Ledoux, L. Action of ribonuclease on two solid tumours in vivo / L. Ledoux// Nature. — 1955. — Vol. 176. — P. 36–37. 209. Lee, I. Antitumor efficacy of the cytotoxic RNase, ranpirnase, on A549 human lung cancer xenografts of nude mice / I. Lee, A. Kalota, A.M. Gewirtz, K. Shogen // Anticancer Res. — 2007. — Vol. 27. — N. 1A. — P. 299–307. 210. Lee, I. Effect of onconase +/- tamoxifen on ASPC-1 human pancreatic tumors in nude mice / I. Lee, Y.H. Lee, S.M. Mikulski, K. Shogen // Adv. Exp. Med. Biol. — 2003. — Vol. 530. — P. 187–196. 211. Lemmer, B. Clinical chronopharmacology: the importance of time in drug treatment / B. Lemmer // Ciba Found Symp. — 1995. — Vol. 183. — P. 235–247. 212. Lewis, G.D. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies / G.D. Lewis, I. Figari, B. Fendly et al. // Cancer Immunol. Immunother. — 1993. — Vol. 37. — P. 255–263. 213. Li Lee, M. Antiproliferative activity of King Cobra (Ophiophagus hannah) venom L-amino acid oxidase / M. Li Lee, I. Chung, S. Yee Fung, M.S. Kanthimathi, N. Hong Tan // Basic Clin Pharmacol Toxicol. — 2014. — Vol. 114(4). — P. 336–343. 209 214. Liang, S. EPSVR and EPMeta: prediction of antigenic epitopes using support vector regression and multiple server results / S. Liang, D. Zheng, D.M. Standley, B. Yao, M. Zacharias, C. Zhang // BMC Bioinformatics. — 2010. — Vol. 11. — P. 381. 215. Liboshi, Y. L-Asparaginase inhibits the rapamycin-targeted signaling pathway / Y. Liboshi, P.J. Papst, S.P. Hunger, N. Terada // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 1999. — Vol. 260(2). — P. 534–539. 216. Liu, J.J. Inhibition of lymphoma cell proliferation by peroxisomal proliferator-activated receptorγ ligands via Wnt signaling pathway / J.J. Liu, X.J. Dai, Y. Xu, P.Q. Liu, Y. Zhang, X.D. Liu, Z.G. Fang, D.J. Lin, R.Z. Xiao, R.W. Huang, H.Q. Huang // Cell Biochem Biophys. — 2012. — Vol. 62(1). — P. 19–27. 217. Lockwood, B.C. Purification and characterization of methionine gamma-lyase from Trichomonas vaginalis / B.C. Lockwood, G.H. Coombs // Biochem. J. — 1991. — Vol. 279. — P. 675–682. 218. López-Lázaro, M. Dual role of hydrogen peroxide in cancer: possible relevance to cancer chemoprevention and therapy / M. López-Lázaro // Cancer Lett. — 2007. — Vol. 252(1). — 1–8. 219. Lowry, O.H. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. — 1951. — V. 193(1). — P. 265–275. 220. Lubkowski, J. Structural characterization of Pseudomonas 7A glutaminase-asparaginase / J. Lubkowski, A. Wlodawer, H.L. Ammon, T.D. Copeland, A.L. Swain // Biochemistry. — 1994. — Vol. 33(34). — P. 10257–10265. 221. Mai-Prochnow, A. Hydrogen peroxide linked to lysine oxidase activity facilitates biofilm differentiation and dispersal in several gram-negative bacteria / A. Mai-Prochnow, P. Lucas-Elio, S. Egan, T. Thomas, J.S. Webb, A. Sanchez-Amat, S. Kjelleberg // J Bacteriol. — 2008. — Vol. 190(15) — 5493–5501. 222. Maister, A. Glutaminase, asparaginase and α-keto acid-ω-amidas / A. Maister // Methods Enzymol. — 1955. — N. 2. — P. 380–385. 223. Manca, A. Induction of arginosuccinate synthetase (ASS) expression affects the antiproliferative activity of arginine deiminase (ADI) in melanoma cells / A. Manca, M.C. Sini, F. Izzo et al. // Oncol. Rep. — 2011. — Vol. 25(6). — P. 1495–1502. 224. Martsev, S.P. Fusion of the antiferritin antibody VL domain to barnase results in enhanced solubility and altered pH stability / S.P. Martsev, Y.I. Tsybovsky, О.А. Stremovsky, S.G. Odincov, T.G. Balandin, P. Arosio, Z.I. Kravchuk, S.M. Deyev // Protein Eng Des Sel. — 2004. — Vol. 17. — P. 85– 93. 225. Meadows, G.G. Some biological properties and in vivo evaluation of tyrosine phenol-lyase on growth of B16 melanoma / G.G. Meadows, J. Di Govannoi, L. Minor, G.W. Elmer // Cancer Res. — 1976. — Vol. 36. — 167–171. 210 226. Mezler, D.E. A general mechanism for vitamin B6-catalyzed reactions / D.E. Mezler, M. Ikawa, E.E. Snell // J. Am. Chem. Soc. — 1954. — Vol. 76. — 648–652. 227. Michalska, K. Structural aspects of L-asparaginases, their friends and relations / K. Michalska, M. Jaskolski // Acta Biochim. Pol. — 2006. — Vol. 53. — P. 627–640. 228. Miki, K. Novel prodrug enzyme-activation gene therapy for cancer using methionine α,γ-liase and selenomethionine / K. Miki, A. Gupta, W. Al-Refaie et al. // Abstr. 10th Int. Congress on Anti-Cancer Treatment. — 2000. — 193. 229. Mikulski, S.M. Phase II trial of a single weekly intravenous dose of ranpirnase in patients with unresectable malignant mesothelioma / S.M. Mikulski, J.J. Costanzi, N.J. Vogelzang et al. // J. Clin. Oncol. — 2002. — Vol. 20. — N. 1. — P. 274–281. 230. Mikulski, S.M. Striking increase of survival of mice bearing M109 Madison carcinoma treated with a novel protein from amphibian embryos / S.M. Mikulski, W. Ardelt, K. Shogen et al. // J. Natl. Cancer Inst. — 1990. — Vol. 82. — N. 2. — P. 151–153. 231. Mitkevich, V.A. Binase cleaves cellular noncoding RNAs and affects coding mRNAs / V.A. Mitkevich, N.A. Tchurikov, P.V. Zelenikhin et al. // FEBS J. — 2010. — Vol. 277. — N. 1. — P. 186– 196. 232. Mitkevich, V.A. Ribonuclease binase apoptotic signature in leukemic Kasumi-1 cells / V.A. Mitkevich, O.V. Kretova, I.Y. Petrushanko et al. // Biochimie. — 2013. — 95(6). — 1344–1349. 233. Mitkevich, V.A. Sensitivity of acute myeloid leukemia Kasumi-1 cells to binase toxic action depends on the expression of KIT and АML1-ETO oncogenes / V.A. Mitkevich, I.Y. Petrushanko, P.V. Spirin et al. // Cell Cycle. — 2011. — Vol. 10(23). — P. 4090–4097. 234. Mong, S.K. Rapid total synthesis of DARPin pE59 and barnase / S.K. Mong, A.A. Vinogradov, M.D. Simon, B.L. Pentelute // Chembiochem. — 2014. — 15(5). — 721–733. 235. Moola, Z.B. Erwinia chrysanthemi L-asparaginase: epitope mapping and production of antigenically modified enzymes / Z.B. Moola, M.D. Scawen, T. Atkinson, D.J. Nicholls // Biochem. J. — 1994. — Vol. 302 (Pt 3). — P. 921–927. 236. Moore, A.M. Gefitinib in patients with chemo-sensitive and chemo-refractory relapsed small-cell cancers: phase II trial / A.M. Moore, L.H. Einhorn, D. Estes et al. // Lung Cancer. — 2006. — Vol. 53. — P. 255. 237. Morris, R.E. Receptor-mediated entry of diphtheria toxin into monkey kidney (Vero) cells: electron microscopic evaluation / R.E. Morris, A.S. Gerstein, P.F. Bonventre, C.B. Saelinger // Infect Immun. — 1985. — Vol. 50. — 721–727. 238. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays / T. Mosmann // J. Immunol. Methods. — 1983. — V. 65. — P. 55–63. 211 239. Moustafa, I.M. Crystal structure of LAAO from Calloselasma rhodostoma with an Lphenylalanine substrate: insights into structure and mechanism / I.M. Moustafa, S. Foster, A.Y. Lyubimov, A. Vrielink // J. Mol. Biol. — 2006. — Vol. 364. — 991–1002. 240. Murthy, S.N. Identification of L-amino acid/L-lysine alpha-amino oxidase in mouse brain / S.N. Murthy, M.K. Janardanasarma // Mol. Cell Biochem. — 1999. — Vol. 197. — 13–23. 241. Nakano, M. Crystalline mammalian L-amino acid oxidase from rat kidney mitochondria / M. Nakano, T.S. Danowski // J. Biol. Chem. — 1966. — Vol. 241(9). — 2075–2083. 242. Nakayama, T. Purification and properties of l-methionine γ-lyase from Aeromonas sp. / T. Nakayama, N. Esaki, W-J. Lee et al // Agric. Biol. Chem. — 1984 — Vol. 48 — P. 2367–2369. 243. Nam, C. Etoposide induces apoptosis and cell cycle arrest of neuroepithelial cells in a p53-related manner / C. Nam, H. Yamauchi, H. Nakayama, K. Doi // Neurotoxicol Teratol. — 2006. — Vol. 28(6). — P. 664–672. 244. Naumann, G.B. Cytotoxicity and inhibition of platelet aggregation caused by an L-amino acid oxidase from Bothrops leucurus venom / G.B. Naumann, L.F. Silva, L. Silva et al. // Biochim Biophys Acta. — 2011. — N. 7. — P. 683–694. 245. Newcombe, R.G. Two-sided confidence intervals for the single proportion: comparison of seven methods / R.G. Newcombe // Statistics in Medicine. — 1998. — Vol. 17. — P. 857–872. 246. Newson R. Parameters behind ''nonparametric" statistics: Kendall's tau, Somers' D and median differences / R. Newson // The Stata Journal. — 2002. — Vol. 2(1). — P. 45–64. 247. Newton, D.L. Potent and specific antitumor effects of an anti-CD22-targeted cytotoxic ribonuclease: potential for the treatment of non-Hodgkin lymphoma / D.L. Newton, H.J. Hansen, S.M. Mikulski et al // Blood. — 2001. — Vol. 97(2). — P. 528–535. 248. Ni, Y. Expression of arginine deiminase from Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039 in Escherichia coli and its anti-tumor activity / Y. Ni, Z. Li, Z. Sun et al. // Curr. Microbiol. — 2009. — Vol. 58. — N. 6. — P. 593–598. 249. Ni, Y. Rapid evolution of arginine deiminase for improved anti-tumor activity / Y. Ni, Y. Liu, U. Schwaneberg et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2011. — Vol. 90(1). — P. 193–201. 250. Niedermann, D.M., Lerch K. Molecular cloning of the L-amino-acid oxidase gene from Neurospora crassa / D.M. Niedermann, K. Lerch // J Biol Chem. — 1990. — Vol. 265(28). — 17246– 17251. 251. Noh, E.J. Arginine deiminase enhances dexamethasone-induced cytotoxicity in human Tlymphoblastic leukemia CCRF-CEM cells / E.J. Noh, S.W. Kang, Y.J. Shin et al. // Int. J. Cancer. — 2004. — Vol. 112. — P. 502–508. 212 252. Notomista, E. Effective expression and purification of recombinant onconase, an antitumor protein / E. Notomista, V. Cafaro, R. Fusiello et al. // FEBS Lett. — 1999. — Vol. 463. — N. 3. — P. 211–215. 253. Nuutinen, J.T. Identification of nitrogen mineralization enzymes, L-amino acid oxidases, from the ectomycorrhizal fungi Hebeloma spp. and Laccaria bicolor / J.T. Nuutinen, S. Timonen // Mycological Research. — 2008. — Vol. 112(12). —1453–1464. 254. Obama, K. L-asparaginase induced complete remission in Epstein-Barr virus positive, multidrug resistant, cutaneous T-cell lymphoma / K. Obama, M. Tara, K. Niina // Int. J. Hematol. — 1999. — Vol. 69. — N. 4. — P. 260–262. 255. Offman, M.N. Rational engineering of L-asparaginase reveals importance of dual activity for cancer cell toxicity / M.N. Offman, M. Krol, N. Patel, S. Krishnan, J.Z. Liu, V. Saha, P.A. Bates // Blood. — 2011. — Vol. 117. — P. 1614–1621. 256. Ollenschläger, G. Asparaginase-induced derangements of glutamine metabolism: the pathogenetic basis for some drug-related side-effects / G. Ollenschläger, E. Roth, W. Linkesch et al. // Eur. J. Clin Invest. — 1988. — Vol. 18(5). — P. 512–516. 257. Osunkoya, B.O. Effect of arginine deficiency on synthesis of DNA and immunoglobulin receptor of Burkitt lymphoma cells / B.O. Osunkoya, W.H. Adler, R.T. Smith // Nature. — 1970. — 227. — P. 398–399. 258. Ott, P.A. Phase I/II study of pegylated arginine deiminase (ADI-PEG 20) in patients with advanced melanoma / P.A. Ott, R.D. Carvajal, N. Pandit-Taskar et al. // Invest New Drugs. — 2013. — 31(2). — 425–434. 259. Oza, V.P. Cloning, expression and characterization of l-asparaginase from Withania somnifera L. for large scale production / V.P. Oza, P.P. Parmar, D.H. Patel, R.B. Subramanian // J Biotech. — 2011. — N. 1. — P. 21–26. 260. Page, M. High-volume screening / M. Page // Anticancer Drug Development Guide. 2nd ed. Eds.: Teicher B.A., Andrews P.A. — Totowa, New Jersey: Humana Press, 2004. — P. 3–21. 261. Palm, G.J. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: crystal structure of a Thr89-Val mutant / G.J. Palm, J. Lubkowski, C. Derst, S. Schleper, K.H. Rohm, A. Wlodawer // FEBS Letters. — 1996. — Vol. 390(2). — P. 211–216. 262. Panosyan, E.H. Deamination of glutamine is a prerequisite for optimal asparagine deamination by asparaginases in vivo (CCG-1961) / E.H. Panosyan, R.S. Grigoryan, I.A. Avramis et al. // Anticancer Res. — 2004. — Vol. 24(2C). — P. 1121–1125. 263. Park, I.S. Arginine deiminase: a potential inhibitor of angiogenesis and tumour growth / I.S. Park, S.W. Kang, Y.J. Shin et al. // Br. J. Cancer. — 2003. — Vol. 89. — P. 907–914. 213 264. Pawelek, P.D. The structure of L-amino acid oxidase reveals the substrate trajectory into an enantiomerically conserved active site / P.D. Pawelek, J. Cheah, R. Coulombe, P. Macheroux, S. Ghisla, A. Vrielink // EMBO J. — 2000. — Vol. 19(16). — P. 4204–4215. 265. Pei, J. PROMALS3D: a tool for multiple protein sequence and structure alignments / J. Pei, B.H. Kim, N.V. Grishin // Nucleic Acids Res. — 2008. — Vol. 36(7). — P. 2295–2300. 266. Peng, G. Isolation, characterization and electron microscopic single particle analysis of the NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from the hyperthermophilic eubacterium Aquifex aeolicus / G. Peng, G. Fritzsch, V. Zickermann, H. Schägger, R. Mentele, F. Lottspeich, M. Bostina, M. Radermacher, R. Huber, K.O. Stetter, H. Michel // Biochemistry. — 2003. — Vol. 42. — P. 3032– 3039. 267. Petersen, T.N. Signal P 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions / T.N. Petersen, S. Brunak, G. von Heijne, H. Nielsen // Nature methods. — 2011. — Vol. 8(10). — P. 785– 786. 268. Peterson, L.E. L-asparaginase production by Erwinia aroideae / L.E. Peterson, A. Ciegler // Appl. Microbiol. — 1969. — Vol. 18. — P. 64–67. 269. Pettersen, E.F. UCSF Chimera, a visualization system for exploratory research and analysis / E.F. Pettersen, T.D. Goddard, C.C. Huang, G.S. Couch, D.M. Greenblatt et al. // J Comput Chem. — 2004. — Vol. 25(13). — P. 1605–1612. 270. Piedras, P. Purification and characterization of an L-amino-acid oxidase from Chlamydomonas reinhardtii / P. Piedras, M. Pineda, J. Munoz // Planta. — 1992. — Vol. 188. — 13–18. 271. Ponnudurai, G. Purification and properties of the L-amino acid oxidase from Malayan pit viper (Calloselasma rhodostoma) venom / G. Ponnudurai, M.C. Chung, N.H. Tan // Arch Biochem Biophys. — 1994. — Vol. 313. — 373–378. 272. Ponomarenko, J. ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes / J. Ponomarenko, H.H. Bui, W. Li, N. Fusseder, P.E. Bourne et al. // BMC Bioinformatics. — 2008. — Vol. 9. — P. 514. 273. Porta, C. Ranpirnase and its potential for the treatment of unresectable malignant mesothelioma / C. Porta, C. Paglino, L. Mutti // Biologics. — 2008. — Vol. 2. — N. 4. — P. 601–609. 274. Pritsa, A.A. Antitumor activity of L-asparaginase from Thermus thermophilus / A.A. Pritsa, K.T. Papazisis, A.H. Kortsaris et al. // Anticancer Drugs. — 2001. — N. 12. — P. 137–142. 275. Puetter, J. Investigations on distribution and elimination of administered L-asparaginase / J. Puetter, I. Flenker // Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. — 1976. — Vol. 1(3). — 149–154. 276. Qian, G. The chemical modification of E. coli L-asparaginase by N, O-carboxymethyl chitosan / G. Qian, J. Zhou, D. Wang, B. He // Artif. Cell. Blood Substit. Immobil. Biotechnol. — 1996. — Vol. 24. — P. 567–577. 214 277. Reddy, V.V.S. Inhibitory activity of L-asparaginase from Mycobacterium tuberculosis on Yoshida ascites sarcoma in rats / V.V.S. Reddy, H.N. Jayaram, M. Sirsi, T. Ramakrishnan // Arch. Biochem. Biophys. — 1969. — Vol. 132. — P. 262–267. 278. Reinert, R.B. Role of glutamine depletion in directing tissue-specific nutrient stress responses to L-asparagine / R.B. Reinert, L.M. Oberle, A.S. Wek et al. // J. Biol. Chem. — 2006. — Vol. 281. — P. 31222–31233. 279. Ritter, H. Structural basis for the entrance into the phenylpropanoid metabolism catalyzed by phenylalanine ammonia-lyase / H. Ritter, G.E. Schulz // Plant Cell. — 2004. — Vol. 16. — P. 3426– 3436. 280. Roberts, J. A comparative study of the antitumor effectiveness of E. coli and Erwinia asparaginases / J. Roberts, F.A. Schmid, L.J. Old, E. Stockert // Cancer Biochem Biophys. — 1976. — Vol. 1(4). — P. 175–178. 281. Rotoli, B.M. Inhibition of glutamine synthetase triggers apoptosis in asparaginase-resistant cells / B.M. Rotoli, J. Uggeri, V. Dall’Asta et al. // Cell Physiol. Biochem. — 2005. — Vol. 15 (6). — P. 281–292. 282. Rowley, B. Partial purification and antilymphoma activity of Serratia marcescens L-asparaginase / B. Rowley, J.C. Wriston // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1967. — Vol. 28. — P. 160–165. 283. Rubinstein, N.D. Computational characterization of B-cell epitopes / N.D. Rubinstein, I. Mayrose, D. Halperin, D. Yekutieli, J.M. Gershoni, T. Pupko // Molecular Immunology. — 2008. — Vol. 45(12). — P. 3477–3489. 284. Rutkoski, T.J. Human ribonuclease with a pendant poly(ethylene glycol) inhibits tumor growth in mice / T.J. Rutkoski, J.A. Kink, L.E. Strong, R.T. Raines // Transl. Oncol. — 2013. — Vol. 6(4). — P. 392–397. 285. Rybak, S.M. Enhancement of vincristine citotoxicity in drug-resistant cells by simultaneous treatment with onconase, an antitumor ribonuclease / S.M. Rybak, J.W. Pearson, W.E. Fogler et al. // J. Natl. Cancer Inst. — 1996. — Vol. 88(11). — P. 747–753. 286. Sabatino, M.A. Enhancement of in vivo antitumor activity of classical anticancer agents by combination with the new, glutathione-interacting DNA minor groove-binder, brostallicin / M.A. Sabatino, T. Colombo, C. Geroni, S. Marchini, M. Broggini // Clin Cancer Res. — 2003. — N. 9. — P. 5402–5408. 287. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. — Cold Spring Habor Laboratory press, 1989. — 479 p. 288. Samel, M. Isolation and characterization of an apoptotic and platelet aggregation inhibiting Lamino acid oxidase from Vipera berus berus common viper venom / M. Samel, H. Vija, G. Rönnholm, J. Siigur, N. Kalkkinen, E. Siigur // Biochim Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1764(4). — P. 707–714. 215 289. Sanches, M. Structure, substrate complexation and reaction mechanism of bacterial asparaginases / M. Sanches, S. Kravchenko, I. Polikarpov // Curr Chem Biol. — 2007. — Vol. 1(1). — P. 75–86. 290. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // PNAS USA. — 1977. — Vol. 74(12). — P. 5463–5467. 291. Sarkissian, C.N. A different approach to treatment of phenylketonuria: phenylalanine degradation with recombinant phenylalanine ammonia lyase / C.N. Sarkissian, Z. Shao, F. Blain et al. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96(5). — P. 2339–2344. 292. Sarkissian, C.N. Phenylalanine ammonia lyase, enzyme substitution therapy for phenylketonuria, where are we now? / C.N. Sarkissian, A. Gamez // Mol. Gen. Metab. — 2005. — Vol. 86(Suppl 1). — P. 22–26. 293. Sato, D. Expression, purification and crystallization of L-methionine gamma-lyase 2 from Entamoeba histolytica / E.S. Glazer, M. Piccirillo, V. Albino et al. // Acta. Crystallogr. — 2006. — Vol. 62. — N. 10. — P. 1034–1036. 294. Savoca, K.V. Cancer therapy with chemically modified enzymes. II. The therapeutic effectiveness of arginase, and arginase modified by the covalent attachment of polyethylene glycol, on the taper liver tumor and the L5178Y murine leukemia / K.V. Savoca, F.F. Davis, T. van Es et al. // Cancer Biochem. Biophys. — 1984. — Vol. 7. — N. 3. — P. 261–268. 295. Schreiber, G. Methods for studying the interaction of barnase with its inhibitor barstar / G. Schreiber // Mol. Biol. — 2001. — Vol. 160. — P. 213–226. 296. Schulenburg, C. The interdependence between catalytic activity, conformational stability, and cytotoxicity of onconase / C. Schulenburg, B. Ardelt, W. Ardelt, U. Arnold, K. Shogen et al. // Cancer Biol Ther. — 2007. — Vol. 6. — P. 1233–1239. 297. Schwartz, J.H. Two asparaginases from E. coli and their action against tumors / J.H. Schwartz, J.V. Reeves, J.D. Broome // Proc. US Nat. Acad. Sci. — 1966. — Vol. 56. — P. 1516–1519. 298. Schwartz, M.K. L-asparaginase activity in plasma and other biological fluids / M.K. Schwartz, E.D. Lash, H.F. Oettgen, F.A. Tomao // Cancer. — 1970. — Vol. 25. — P. 244–252. 299. Shepherd, F. Prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of marimastat after response to first-line chemotherapy in patients with small-cell lung cancer / F. Shepherd, G. Giaccone, L. Seymour et al. // J Clin Oncol. — 2002. — Vol. 21. — P. 4434–4439. 300. Shibatani, T. Crystallization and properties of L-arginine deiminase of Pseudomonas putida / T. Shibatani, T. Kakimoto, I. Chibata // J. Biol. Chem. — 1975. — Vol. 250. — N. 12. — P. 4580–4583. 301. Shoemaker, R.H. The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen / R.H. Shoemaker // Nature Reviews Cancer. — 2006. — Vol. 6. — P. 813–823. 302. Sievers, F. Clustal Omega, accurate alignment of very large numbers of sequences / F. Sievers, D.G. Higgins // Methods Mol Biol. — 2014. — Vol. 1079. — P. 105–116. 216 303. Sigimura, K. High sensitivity of human melanoma cell lines to the growth inhibitory activity of mycoplasmal arginine deiminase in vitro / K. Sigimura, T. Ohno, T. Kusuyama, I. Azuma // Melanoma Res. — 1992. — Vol. 2. — P. 191–196. 304. Sillen, L.G. Stability constants of metal-ion complexes / L.G. Sillen, A.E. Martell // Chem. Soc. Spec. Publ. — Suppl. N1. — London. — 1971. 305. Singh, S. Optimization of medium and cultivation conditions for L-amino acid oxidase production by Aspergillus fumigatus / S. Singh, B.K. Gogoi, R.L. Bezbaruah // Can. J. Microbiol. — 2009. — Vol. 55(9). — 1096–1102. 306. Singh, Y. Extracellular L-asparaginase from a protease-deficient Bacillus aryabhattai ITBHU02: purification, biochemical characterization, and evaluation of antineoplastic activity in vitro / Y. Singh, R.K. Gundampati, M.V. Jagannadham, S.K. Srivastava // Appl Biochem Biotechnol. — 2013. — Vol. 171(7). — P. 1759–1774. 307. Skeel, R.T. Handbook of Cancer Chemotherapy. 8th ed. / R.T. Skeel, S.N. Khleif // Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. — 2011. — 865 p. 308. Solovjov, D. Distinct roles for the alpha and beta subunits in the functions of integrin alphaMbeta2 / D. Solovjov, E. Pluskota, E. Plow // J. Biol. Chem. — 2005. — Vol. 280. — P. 1336– 1345. 309. Sommer, A. Interaction of heparin with human basic fibroblast growth factor: protection of the angiogenic protein from proteolytic degradation by a glycosaminoglycan / A. Sommer, D.B. Rifkin // J Cell Physiol. — 1989. — Vol. 138(1). — P. 215–220. 310. Souza, D.H. Isolation and structural characterization of a cytotoxic L-amino acid oxidase from Agkistrodon contortrix laticinctus snake venom: preliminary crystallographic data / D.H. Souza, L.M. Eugenio, J.E. Fletcher, M.S. Jiang, R.C. Garratt, G. Oliva et al // Arch Biochem Biophys. — 1999. — Vol. 368. — 285–290. 311. Spiess, K. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials / K. Spiess, A. Lammel, T. Scheibel // Macromol. Biosci. — 2010. — Vol. 10(9). — P. 998–1007. 312. Stahelin, H. Activity of a new glycosidic lignan derivative (VP 16-213) related to podophyllotoxin in experimental tumors / H. Stahelin // Eur. J. Cancer. — 1973. — Vol. 9. — P. 215– 221. 313. Steiner, M. Distinct fluctuations of ammonia levels during asparaginase therapy for childhood acute leukemia / M. Steiner, A. Attarbaschi, U. Kastner et al. // Pediatr. Blood Cancer. — 2007. — Vol. 9(5). — P. 640–642. 314. Stith, W.J. Effects of phenylalanine ammonia-lyase and phenylalanine deprivation on murine leukemic lymphoblasts in vitro / W.J. Stith, D.S. Hodgins, C.W. Abell // Cancer Res. — 1973. — Vol. 33. — N. 5. — P. 966–971. 217 315. Storr, J.M. The effects of arginine deficiency on lymphoma cells / Storr J.M., Burton A.F. // Br. J. Cancer. — 1974. — Vol. 30. — P. 50–59 316. Storti, E. Dysmetabolic and neurological complications in leukemic patients treated with Lasparaginase / E. Storti, D. Quaglino. In: Experimental and clinical effects of L-asparaginase. Ed. E. Grundmann, H.F. Oettgen. — Berlin-Heidelberg-NY: Springer-Verlag, 1970. — P. 344–349. 317. Sun, L.K. Apoptotic effect in the glioma cells induced by specific protein extracted from Okinawa Habu (Trimeresurus flavoviridis) venom in relation to oxidative stress / L.K. Sun, Y. Yoshii, A. Hyodo, H. Tsurushima, A. Saito, T. Harakuni, Y.P. Li, K. Kariya, M. Nozaki, N. Morine // Toxicol In vitro. — 2003. — Vol. 17(2). — P. 169–177. 318. Sun, X. In vivo efficacy of recombinant methioninase is enhanced by the combination of polyethylene glycol conjugation and pyridoxal 5'-phosphate supplementation / X. Sun, Z. Yang, S. Li et al. // Cancer Res. — 2003. — Vol. 63. — N. 23. — P. 8377–8383. 319. Sun, Y. Characterization and expression of L-amino acid oxidase of mouse milk / Y. Sun, E. Nonobe, Y. Kobayashi, T. Kuraishi, F. Aoki, K. Yamamoto, S. Sakai // J Biol Chem. — 2002. — Vol. 277(21). — 19080–19086. 320. Swain, A.L. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy / A.L. Swain, M. Jaskólski, D. Housset, J.K. Rao, A. Wlodawer // PNAS USA. — 1993. — Vol. 90(4). — 1474–1478. 321. Szlosarek, P.W. In vivo loss of expression of argininosuccinate synthetase in malignant pleural mesothelioma is a biomarker for susceptibility to arginine depletion / P.W. Szlosarek, A. Klabatsa, A. Pallaska et al. // Clin. Cancer Res. — 2006. — N. 12. — P. 7126–7131. 322. Szlosarek, P.W. Metabolic response to pegylated arginine deiminase in mesothelioma with promoter methylation of argininosuccinate synthetase / P.W. Szlosarek, P. Luong, M.M. Phillips et al. // J Clin Oncol. — 2013. — 31(7). — e111–113. 323. Takaku, H. In vivo anti-tumor activity of arginine deiminase purified from Mycoplasma arginini / H. Takaku, M. Takase, S. Abe et al. // Int. J. Cancer. — 1992. — Vol. 51. — N. 2. — P. 244–249. 324. Takamatsu, N. Molecular cloning of the defense factor in the albumen gland of the sea hare Aplysia kurodai / N. Takamatsu, T. Shiba, K. Muramoto, H. Kamiya // FEBS Lett. — 1995. — Vol. 377(3). — 373–376. 325. Tan, N.H. Purification and properties of the L-amino acid oxidase from monocellate cobra (Naja naja kaouthia) venom / Tan N.H., Swaminathan S. // Int J Biochem. — 1992. — Vol. 24. — 967–973. 326. Tan, Y. Anticancer efficacy of methioninase in vivo / Tan Y., Xu M., Guo H. et al. // Anticancer Res. — 1996. — Vol. 16. — N. 6C. — P. 3931–3936. 218 327. Tan, Y. Broad selective efficacy of recombinant methioninase and polyethylene glycol-modified recombinant methioninase on cancer cells in vitro / Y. Tan, M. Xu, R.M. Hoffman // Anticancer Res. — 2010. — Vol. 30. — P. 1041–1046. 328. Tan, Y. Efficacy of recombinant methioninase in combination with cisplatin on human colon tumors in nude mice / Y. Tan, X. Sun, M. Xu et al. // Clin. Cancer Res. — 1999. — Vol. 5. — N. 8. — P. 2157–2163. 329. Tan, Y. Serum methionine depletion without side effects by methioninase in metastatic breast cancer patients / Y. Tan, J.Sr. Zavala, M. Xu et al // Anticancer Res. — 1996.— Vol. 16. — N. 6C. — P. 3937–3942. 330. Tanaka, H. A versatile bacterial enzyme: L-methionine y-lyase / H. Tanaka, N. Esaki, K. Soda // Enzyme Microb. Technol. — 1985. — Vol. 7. — P. 530–537. 331. Tanaka, H. Purification and properties of methioninase from Pseudomonas ovalis / H. Tanaka, N. Esaki, T. Yamamoto, K. Soda // FEBS Lett. — 1976. — Vol. 66. — N. 2. — P. 307–311. 332. Tardito, S. The inhibition of glutamine synthetase sensitizes human sarcoma cells to Lasparaginase / B.M. Rotoli, J. Uggeri, V. Dall’Asta et al. // Cancer Chemother. Pharmacol. — 2007. — Vol. 60 (5). — P. 751–758. 333. Tartaglia, L.A. A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death / L.A. Tartaglia, T.M. Ayres, G.H. Wong, D.V. Goeddel // Cell. — 1993. — Vol. 74. — P. 845–853. 334. Thompson, S.A. Characterization of sequences within heparin-binding EGF-like growth factor that mediate interaction with heparin / S.A. Thompson, S. Higashiyama, K. Wood, N.S. Pollitt, D. Damm, G. McEnroe, B. Garrick, N. Ashton, K. Laus, N. Hamock, M. Klagsbrun, J.A. Abraham // The Journal of Biological Chemistry. — 1994. — Vol. 269(4). — P. 2541–2543. 335. Tokoro, M. Identification and characterization of two isoenzymes of methionine gamma-lyase from Entamoeba histolytica: a key enzyme of sulfur-amino acid degradation in an anaerobic parasitic protist that lacks forward and reverse trans-sulfuration pathways / M. Yoshimura, Y. Nakano, Y. Yamashita et al // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278. — P. 42717–42727. 336. Torii, S. Apoxin I, a novel apoptosis-inducing factor with L-amino acid oxidase activity purified from Western diamondback rattlesnake venom / S. Torii, M. Naito, T. Tsuruo // J Biol Chem. — 1997. — Vol. 272(14). — P. 9539–9542. 337. Tsai, W.B. Resistance to arginine deiminase treatment in melanoma cells is associated with induced argininosuccinate synthetase expression involving c-Myc/HIF-1alpha/Sp4 / W.B. Tsai, I. Aiba, S.Y. Lee et al. // Mol. Cancer Ther. — 2009. — Vol. 8(12). — P. 3223–3233. 338. Uren, J.R. Immunological and pharmacological characterization of poly-DL-alanyl-modified Erwinia carotovora L-asparaginase / G. Qian, J. Zhou, D. Wang, B. He // Cancer Res. — 1982. — Vol. 42. — P. 4068–4071. 219 339. Vasandani, V.M. Reversible nephrotoxicity of onconase and effect of lysine pH on renal onconase uptake / V.M. Vasandani, J.A. Burris, C. Sung // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1999. — Vol. 44(2). — P. 164–169. 340. Villa, P. L-asparaginase effects on inhibition of protein synthesis and lowering of the glutamine content in cultured rat hepatocytes / P. Villa, M. Corada, I. Bartosek // Toxicol. Lett. 1986. — Vol. 32(3). — P. 235–241. 341. Vrooman, L.M. Erwinia asparaginase after allergy to E. coli asparaginase in children with acute lymphoblastic leukemia / L.M. Vrooman, J.G. Supko, D.S. Neuberg et al. // Pediatr. Blood Cancer. — 2010. — Vol. 54(2). — P. 199–205. 342. Wade, H.E. Automated determination of bacterial asparaginase and glutaminase / H.E. Wade, B.P. Phillips // Anal. Bioch. — 1971. — Vol. 44. — P. 189–193. 343. Wang, W. Prediction of human clearance of therapeutic proteins: simple allometric scaling method revisited / W. Wang, T. Prueksaritanont // Biopharm. Drug Dispos. — 2010. — Vol. 31(4). — P. 253–263. 344. Wang, X.M. Recombinant expression, different downstream processing of the disulfide-rich antitumor peptide Ranpirnase and its effect on the growth of human glioma cell line SHG-44 / X.M. Wang, Z.Y. Guo // Biomed Rep. — 2013. — Vol. 1(5). — P. 747–750. 345. Warrell, R.P.Jr. Phase I evaluation of succinylated Acinetobacter glutaminase-asparaginase in adults / R.P.Jr. Warrell, T.C. Chou, C. Gordon et al. // Cancer Res. — 1980. — Vol. 40(12). — P. 4546–4551. 346. Watanabe, S. The ex vivo production of ammonia predicts L-asparaginase biological activity in children with acute lymphoblastic leukemia / S. Watanabe, K. Miyake, C. Ogawa et al. // Int. J. Hematol. — 2009. — Vol. 90(3). — P. 347–352. 347. Waud, W.R. Murine L1210 and P388 leukemias / W.R. Waud // Anticancer Drug Development Guide. 2nd ed. Eds.: Teicher B.A., Andrews P.A. — Totowa, New Jersey: Humana Press, 2004. — P. 79–97. 348. Wehner, A. The catalytic mechanism of Escherichia coli asparaginase II / A. Wehner, C. Derst, V. Specht, H.P. Aung, K.H. Rohm // Physiol. Chem. — 1994. — Vol. 375. — P. 108. 349. Woods, J.S. Hepatic homeostasis of plasma L-asparagine / J.S. Woods, R.E. Handschumacher // Am. J. Physiol. — 1971. — Vol. 221. — P. 1785–1790. 350. Wriston, J.C. Asparaginase / J.C. Wriston // Methods Enzymol. — 1970. — Vol. 17A. — P. 732– 742. 351. Wu, L. Expression of argininosuccinate synthetase in patients with hepatocellular carcinoma / L. Wu, L. Li, S. Meng et al. // J Gastroenterol Hepatol. — 2013. — 28(2). — 365-8. 220 352. Wu, Y. A cytotoxic ribonuclease. Study of the mechanism of onconase cytotoxicity / Y. Wu, S.M. Mikulski, W. Ardelt et al. // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol. 268. — N. 14. — P. 10686–10693. 353. Xia, X. Pharmacokinetic properties of 2nd-generation fibroblast growth factor-1 mutants for therapeutic application / X. Xia, J.P. Babcock, S.I. Blaber, K.M. Harper, M. Blaber // PLOS one. — 2012. — Vol. 7(11). — e48210. 354. Xin, L. Stealth cationic liposomes modified with anti-CAGE single-chain fragment variable deliver recombinant methioninase for gastric carcinoma therapy / L. Xin, J. Cao, H. Cheng et al. // J. Nanosci. Nanotechnol. — 2013. — 13(1). — 178–183. 355. Xu, D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions / D. Xu, J.D. Esko // Annu. Rev. Biochem. — 2014. — Vol. 83. — P. 129–157. 356. Xu, W. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro / W. Xu, X. Zhang, H. Qian, W. Zhu, X. Sun, J. Hu, H. Zhou, Y. Chen // Exp. Biol. Med. — 2004. — V. 229. — P. 623–631. 357. Yagi, H. Anti-tumor effect in an in vivo model by human-derived pancreatic RNase with basic fibroblast growth factor insertional fusion protein through antiangiogenic properties / H. Yagi, M. Ueda, H. Jinno, K. Aiura, S. Mikami, H. Tada, M. Seno, H. Yamada, M. Kitajima // Cancer Sci. — 2006. — Vol. 97(12). — P. 1315–1320. 358. Yamada, H. Synthesis of L-tyrosine-related amino acids by β-tyrosinase / H. Yamada, H. Kumagai // Adv. Appl. Microbiol. — 1975. — Vol. 19. — 249–288. 359. Yamauchi, H. Etoposide induces TRP53-dependent apoptosis and TRP53-independent cell cycle arrest in trophoblasts of the developing mouse placenta / H. Yamauchi, K. Katayama, M. Ueno et al. // Biol Reprod. — 2009. — Vol. 80(4). — P. 813–822. 360. Yang, Z. Circulating half-life of PEGylated recombinant methioninase holoenzyme is highly dose dependent on cofactor pyridoxal-5'-phosphate / Z. Yang, X. Sun, S. Li et.al. // Cancer Res. — 2004. — Vol. 64(16). — P. 5775–5778. 361. Yang, Z. PEGylation confers greatly extended half-life and attenuated immunogenicity to recombinant methioninase in primates / Z. Yang, J. Wang, Q. Lu, J. Xu, Y. Kobayashi, T. Takakura, A. Takimoto, T. Yoshioka, C. Lian, C. Chen, D. Zhang, Y. Zhang, S. Li, X. Sun, Y. Tan, S. Yagi, E.P. Frenkel, R.M. Hoffman // Cancer Res. — 2004. — Vol. 64. — P. 6673–6678. 362. Yao, M. Structure of the type I L-asparaginase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii at 2.16 angstroms resolution / M. Yao, Y. Yasutake, H. Morita, I. Tanaka // Acta Crystallogr. — 2005. — Vol. 61. — P. 294–301. 363. Yong, W. L-аsparaginase-based regimen in the treatment of refractory midline nasal/nasal-type T/NK-cell lymphoma / W. Yong, W. Zheng, Y. Zhang et al. // Int. J. Hematol. — 2003. — Vol. 78. — N. 2. — P. 163–167. 221 364. Yoon, C.Y. Renal cell carcinoma does not express argininosuccinate synthetase and is highly sensitive to arginine deprivation via arginine deiminase / C.Y. Yoon, Y.J. Shim, E.H. Kim et al. // Int. J. Cancer. — 2008. — Vol. 120. — P. 897–905. 365. Yoshimura, M. Formation of methyl mercaptan from L-methionine by Porphyromonas gingivalis / M. Yoshimura, Y. Nakano, Y. Yamashita et al // Inf. Immun. — 2000. — Vol. 68. — P. 6912–6916. 366. Yoshioka, T. Anticancer efficacy in vivo and in vitro, synergy with 5-fluorouracil, and safety of recombinant methioninase / T. Yoshioka, T. Wada, N. Uchida et al. // Cancer Res. — 1998. — Vol. 58. — N. 12. — P. 2583–2587. 367. Yun, M.K. Crystal structure and allosteric regulation of the cytoplasmic Escherichia coli Lasparaginase I / M.K. Yun, A. Nourse, S.W. White, C.O. Rock, R.J. Heath // J. Mol. Biol. — 2007. — Vol. 369. — P. 794–811. 368. Zakalskiy, A.E. Overexpression of (His)6-tagged human arginase I in Saccharomyces cerevisiae and enzyme purification using metal affinity chromatography / A.E. Zakalskiy, O.M. Zakalska, Y.A. Rzhepetsky, N. Potocka, O.V. Stasyk, D. Horak, M.V. Gonchar // Protein Expr Purif. — 2012. — Vol. 81(1). — P. 63–68. 369. Zalewska-Szewczyk, B. The cross-reactivity of anti-asparaginase antibodies against different Lasparaginase preparations / B. Zalewska-Szewczyk, A. Gach, K. Wyka et al. // Clin. Exp. Med. — 2009. — N. 2. — P. 113–116. 370. Zhang, L. ACTX-8, a cytotoxic L-amino acid oxidase isolated from Agkistrodon acutus snake venom, induces apoptosis in Hela cervical cancer cells / L. Zhang, L.J. Wei // Life Sci. — 2007. — Vol. 80(13). — P. 1189–1197. 371. Zhang, Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction / Y. Zhang // BMC Bioinformatics. — 2008. — Vol. 23. — P. 9–40. 372. Zhang, Y.J. Molecular characterization of Trimeresurus stejnegeri venom L-amino acid oxidase with potential anti-HIV activity / Y.J. Zhang, J.H. Wang, W.H. Lee, Q. Wang, H. Liu, Y.T. Zheng, Y. Zhang // Biochem Biophys Res Commun. — 2003. — Vol. 309(3). — P. 598–604. 373. Zhang, Y.Q. Synthesis, characterization and immunogenicity of silk fibroin-L-asparaginase bioconjugates / Y.Q. Zhang, W.L. Zhou, W.D. Shen et al. // J. Biotechnol. — 2005. — Vol. 120(3). — P. 315–326. 374. Zhao, B. Endothelial cell capture of heparin-binding growth factors under flow / B. Zhao, C. Zhang, K. Forsten-Williams, J. Zhang, M. Fannon // PLoS Computational Biology. — 2010. — Vol. 6(10). — e1000971. 375. Zhao, R. Apoptosis induced by selenomethionine and methioninase is superoxide mediated and p53 dependent in human prostate cancer cells / R. Zhao, F.E. Domann, W. Zhong // Mol Cancer Ther. — 2006. — Vol. 5(12). — P. 3275–3284.
