Очистка и выделение ферментов при помощи

Задача №7
Очистка и выделение ферментов при помощи высокоэффективной
белковой хроматографии и проведения белкового электрофореза в
денатурирующих условиях
Хроматографическая система Pharmacia FPLC
Высокоэффективная хроматографическая система среднего давления предназначена для
полупрепаративного и быстрого выделения индивидуальных белков из сложных белковых
смесей – клеточных лизатов, культуральных жидкостей и пр.
Хроматографическая система имеет блочную архитектуру и состоит из следующих
компонентов:
- двух насосов среднего давления P-500 (1)
- динамического миксера (2)
- узла ввода пробы с дозирующей петлей MV-7 (3)
- модульного фотометрического детектора, состоящего из фотометрической ячейки и
блока усиления UV-M (4)
- блок программирования и управления системой LCC-500 (5, 5а)
- самописца Rec-102 (6)
- коллектора белковых фракций Frac-100(7)
- высокоэффективной хроматографической колонки (8)
- емкостей с элюентами (9) (см. Рис.1)
9
А
3
8
4
Б
4
1
5а
2
1
7
6
5
Рис. 1. А.Общий вид высокоэффективного белкового хроматографа Pharmacia FPLC;
Б. вид панели управления прибора
На рис. 2 представлена схема потоков в зависимости от положения крана MV-7. В
исходном положении 1 (LOAD) поток от насоса через порт 7 и 1 попадает в
хроматографическую колонку. В этом положении крана происходит заполнение
дозирующей петли через порт 3. При переключении крана MV-7 в положение 2
происходит изменение схемы прохождения потоков. Элюент от насоса вымывает
обратным током из петли образец, который наносится на хроматографическую колонку.
Положение крана 3 предназначено для промывки системы и замены буферов в насосах.
Порты ввода пробы, петля и колонка в этом положении заблокированы.
1
2
3
Рис. 2. Схема потоков в зависимости от положения крана узла ввода пробы MV-7.
1. Положение LOAD (заполнение дозирующей петли); 2. положение INJECT (нанесение
образца из петли на колонку); 3. положение WASH (промывка насосов и замена элюентов)
Управление хроматографической системой
Управление потоками элюентов, а также устройсвом ввода пробы, коллектором фракций и
самописцем возможно в двух режимах – ручное (Manual) и с помощью
запрограммированного метода.
С помощью ручного режима можно управлять потоками насосов в изократическом
варианте, т.е. при постоянной скорости потока и концентрации состава элюента во
времени. Обычно этот режим используется для промывки колонки или нанесения образца.
Для выбора параметров ручного режима на панели управления нажать клавишу
«MANUAL», затем используя клавиши «STEP FORWARD» «STEP BACK» для
перемещения по пунктам меню, ввести необходимые значения и нажать клавишу «DO».
В качестве примера для установки скорости потока 1 мл/мин и состава элюента (в
процентах) 40% буфера А и 60% буфера В следует набрать:
«MANUAL» «60» «DO»
«STEP FORWARD» «1» «DO»
Насосы включатся и начнут прокачивать элюент выбранного состава с суммарной
скоростью 1 мл/мин.
Создание программы (метода) управления потоками для создания градиента
Программирование (метод) используется для управления хроматографической системой
без участия оператора, а также для градиентного элюирования образца. В методе можно
задавать скорости потоков (или их изменение), создавать градиенты различной формы,
автоматизировать процесс нанесения образца и сбора белковых фракций, контролировать
самописец или другие внешние устройства.
Создание нового метода и редактирование уже существующих производится c блока
управления системой LСС-500 клавишей «METHOD FILE». Перемещаться по меню
можно клавишами «STEP FORWARD» «STEP BACK». В строчке вводится время и
соответствующая инструкция, после чего надо нажать клавишу «DO».
Чтобы сохранить метод в памяти прибора необходимо сначала выбрать номер метода, а
после создания программы, метод автоматически сохранится в памяти прибора под этим
номером. В память прибора можно ввести до 10 различных методов.
Пример: для того, чтобы запрограммировать хроматограф на работу при скорости потока
1 мл/мин с промывкой 5 мл Буфера А, элюированием 20-ю мл буфера с линейным
изменением концентрации Буфера В от 0 до 100% и последующей промывкой 5 мл
стартового буфера следует создать следующий метод (ввести следующую программу):
Время
(Time)
0.0
0.0
5.0
25.0
25.0
30.0
Инструкция
(Function)
Conc B%
ml/min
Conc B%
Conc B%
Conc B%
Conc B%
End of method
Значение
(Value)
0
1.0
0
100
0
0
Описание
Задание состава элюента (100% Буфера А)
Задание скорости потока и старт
Линейное изменение концентрации Буфера В
в составе элюента от 0 до 100% за 20 мин
Промывка колонки 5 мл буфера А и
подготовка к следующему разделению
Рис. 3. графически отражает вышеописанную программу.
Концентрация В, %
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Время, мин
Рис. 3 Графический вид программы с линейным градиентным элюированием в течение 20
минут и промывкой Буфером А в течение 5 минут до и после градиента.
Подготовка хроматографической системы к работе
Элюенты, применяемые в процессе разделения, должны быть отфильтрованы через
фильтр с размером пор 0,22 мкм и тщательно дегазированы. Образец необходимо
отцентрифурировать при 12000-14000g в течение 4-5 минут.
Перед началом работы необходимо заполнить насосы свежей порцией буферов, промыть
узел ввода пробы и миксер. Для этого перевести кран узла ввода пробы в положение 3
(WASH) и включить программу промывки насосов.
На блоке управления (рис. 3) нажать клавишу «MANUAL» и клавишей «STEP
FORWARD» дойти до пункта меню «Valve», набрать на клавиатуре «1 . 3» и нажать
красную клавишу «DO».
Клапан узла ввода пробы перейдет в положение 3 (WASH) (см. рис.2).
Затем снова нажать «MANUAL» и клавишей «STEP FORWARD» дойти до пункта меню
«Wash A.B» и набрать на клавиатуре «1 . 1». Программа промывки насосов запустится. По
окончании промывки нажать клавишу «END», клапан узла ввода пробы вернется в
исходное положение 1 (LOAD).
Хроматографические носители
Высокоэффективная анионообменная хроматография на колонке Mono Q (Source Q)
Колонка предназначена для разделения белков, пептидов, полинуклеотидов и других
биомолекул. Колонка Mono Q (Source Q) изготовлена из специального стекла и
выдерживает давление до 100 атм (20 атм для SourceQ). Колонки серии Mono Q
упакованы сферическими частицами размером 10 мкм, а серии Source Q – размером 15
мкм из гидрофильного полимера с пришитыми ионообменными группами
–CH2-N+(CH3)3. Концентрация ионообменных групп позволяет наносить до 20-50 мг
белка молекулярной массой до 107 на 1 мл геля.
Все используемые элюенты и образцы должны быть тщательно дегазированы и
отфильтрованы через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Типичная скорость потока при работе с колонкой Mono Q НR 5/5 составляет 1 мл/мин, для
колонок серии Source рекомендуется использовать линейную скорость потока в диапазоне
60-300 см/час
Выбор стартового буфера
Для проведения разделения при различных значения рН рекомендуется применять
следующие буферные системы: (табл. 1)
Табл. 1 Рекомендуемые буферы для различных областей рН
Диапазон рН Буфер
Концентрация Противоион
4,5 – 5,0
N-метилпиперазин
20 мМ
Cl5,0 – 6,2
Пиперазин
20 мМ
ClНСОО5,5 – 6,0
L-гистидин
20 мМ
Cl5,8 – 6,5
Бис-трис
20 мМ
Cl6,4 – 7,3
Бис-триспропан
20 мМ
Cl7,3 – 7,7
Триэтаноламин
20 мМ
ClОАс7,5 – 8,0
Трис
20 мМ
Cl-
рКа
4,75
5,68
6,15
6,50
6,80
7,77
8,16
Выбор соответствующего стартового буфера обусловлен изоэлектрическими
точками белков, которые будут наноситься на анионообменную колонку.
Образец перед нанесением необходимо перевести в стартовый буфер.
Для нанесения и элюирования образца необходимо использовать катионные
буферы или буферы на основе цвиттерионов (напр. гистидин). Нельзя
использовать анионные буферы (напр. фосфатные), поскольку они связываются
с носителем колонки.
Подготовка элюирующего буфера
Нанесение образца происходит в буфере при низкой ионной силе (Буфер А), а
элюирование связавшихся с колонкой белков происходит в градиенте ионной силы
раствора элюента. Для создания линейных градиентов используют Буфер В с высокой
ионной силой. В процессе разделения концентрация Буфера В плавно изменяется от 0 до
100%, таким образом создавая плавное изменение ионной силы в объеме колонки.
Для создания градиента обычно используют объем элюента, эквивалентный 20-30
объемов колонки. Поскольку различные анионы обладают различной элюирующей
способностью, то для достижения оптимального разделения необходимо рассчитать
концентрацию элюирующего аниона в Буфере В. В табл. 2 приведены рекомендованные
скорости изменения концентрации элюирующего аниона на единицу объема колонки (мл).
Табл. 2. Рекомендуемое скорости изменение концентрации анионов при создании
градиентов
Анион
Изменение концентрации
аниона/объем колонки (мМ/объем)
Cl17,5
HCOO
30
OAc35
Таким образом, если использовать NaCl в качестве элюирующей соли и объем градиента
эквивалентный 30 объемам колонки, то концентрация элюирующего аниона в буфере В
должна
быть
30 (объемов) * 17,5 (мМ/объем) = 525мМ.
Подготовка колонки Mono Q к работе
Подготовка включает три шага:
1. промывка колонки 5-ю объемами стартового буфера А с низкой ионной силой
2. промывка 10 объемами буфера В (с высокой ионной силой) для замены
противоиона
3. промывка 5-10 объемами стартового буфера А до установления ровной базовой
линии.
Подготовка образца
Объем и концентрацию образца подбирают таким образом, чтобы наносить 10-30 мг белка
на 1 мл ионообменного носителя. Рекомендуется использовать концентрацию белка не
более 2 мг/мл.
Белковый препарат переводят в стартовый буфер А, после чего образец центрифугируют
при 12000g в течение 4-5 минут. Аккуратно отбирают супернатант и переносят в чистую
пробирку. Образец должен быть прозрачным и не содержать взвешенных частиц. При
необходимости проводят повторное центрифугирование.
Нанесение образца
Дозирующую петлю промывают при помощи шприца с тупой иглой Буфером А. Для этого
шприцем отбирают 3-4 объема петли и через порт ввода 3 заполняют элюентом петлю.
Подготовленный образец отбирают шприцем и в положении 1 (LOAD) клапана полностью
заполняют дозирующую петлю. Важно, чтобы объем образца был несколько больше (на
10-15%), чем объем дозирующей петли, чтобы полностью заполнить петлю и не допустить
попадания пузырьков воздуха в хроматографическую колонку. После заполнения петли
клапан узла ввода пробы переводят в положение 2 (INJECT) и образец из дозирующей
петли обратным током наносится на колонку.
Обычно большая часть образца связывается с анионообменным носителем в стартовых
условиях, однако часть в виде несвязавшегося проскока выходит из колонки.
Элюирование связавшегося образца
Связавшийся с колонкой образец элюируют в возрастающем градиенте ионной силы,
постепенно увеличивая концентрацию Буфера В в элюенте. Выход белковых пиков
регистрируют при помощи фотометрического детектора.
Для нанесения и элюирования образца целесообразно создать следующий метод:
Время
(Time)
0.0
0.0
1.0
Инструкция
(Function)
Conc B%
ml/min
Valve.pos
Значение
(Value)
0
1.0
1.2
2.0
Valve.pos
1.1
7.0
27.0
27.0
32.0
Conc B%
Conc B%
Conc B%
Conc B%
End of method
0
100
0
0
Описание
Задание состава элюента (Буфер А)
Задание скорости потока и старт
Переключение клапана узла ввода пробы в
положение 2 «INJECT» и начало введения
образца из петли в колонку
Переключение клапана узла ввода пробы в
положение 1 «LOAD» и начало промывки
колонки 5-ю мл Буфера А
Линейное изменение концентрации Буфера В
в составе элюента от 0 до 100% за 20 мин
Промывка колонки 5 мл буфера А и
подготовка к следующему разделению
По окончанию метода насосы останавливаются.
На рис. 4 изображен профиль изменения состава элюирующей фазы, а также
предполагаемый вид белковой хроматограммы.
Концентрация В, %
100
Белки,
элюирующиеся
в градиенте
«Проскок»
80
60
40
20
0
0
Начало
нанесения
образца
5
Конец
нанесения
образца
10
15
20
25
30
35
Время, мин
Рис. 4 Профиль изменения ионной силы и вид белковой хроматограммы
Высокоэффективная гидрофобная хроматография на колонке Source ISO
Колонка предназначена для проведения высокоэффективного разделения биомолекул по
степени их гидрофобности. Колонка Source ISO изготовлена из специального стекла и
выдерживает давление до 20 атм (2 МПа). Source ISO упакована сферическими частицами
размером 15 мкм из гидрофильного полимера с пришитыми, частично гидрофобными,
изопропильными группами –CH(CH3)2. Концентрация гидрофобных участков на
поверхности гранул позволяет наносить до 5-10 мг белка на 1 мл геля.
Все используемые элюенты и образцы должны быть тщательно дегазированы и
отфильтрованы через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Буфер для нанесения образца
Хроматографическое разделение по степени гидрофобности обычно начинается с
адсорбирования интересующих белков на поверхность гидрофобного носителя. Образец
наносится при высокой ионной силе (обычно в 1,5-2,0 М растворе (NH4)2SO4) на колонку,
уравновешенную таким же буфером (Буфер А).
Выбор элюирующего буфера
После адсорбции смеси белков при высокой ионной силе на поверхности гидрофобного
носителя, необходимо провести селективное элюирование индивидуальных белковых
компонетов. Для этого обычно применяют постепенное снижение ионной силы элюента,
при этом белки вымываются из колонки по мере ослабления гидрофобных
взаимодействий.
Можно также использовать альтернативные способы элюирования.
Поскольку анионы различаются по высаливающему эффекту на белковые молекулы, а
катионы – по хаотропному (табл. 3), можно использовать эти свойства для элюирования.
Табл. 3 Высаливающий и хаотропный эффекты, создаваемые различными ионами
Увеличение высаливающего эффекта
32Анионы
PO4 , SO4 , CH3COO , Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCNКатионы
NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+
Увеличение хаотропного эффекта
С увеличением высаливающего эффекта происходит повышение силы гидрофобных
взаимодействий, в то время как с увеличением хаотропного эффекта гидрофобные
взаимодействия ослабевают. Таким образом, повышая концентрацию аниона с низкой
высаливающей
способностью,
можно
достичь
постепенной
десорбции
гидрофобносвязанных белков.
На гидрофобные связи оказывает влияние температура – при понижении температуры
сила гидрофобных взаимодействий снижается. При этом еще улучшается симметричность
пиков за счет уменьшения диффузии.
Гидрофобные взаимодействия можно разрушить путем понижения полярности среды
(напр. Добавлением этиленгликоля) или при введении в элюирующий буфер
поверхностно-активного вещества.
В большинстве случаев используют элюирование при постепенном снижении ионной
силы раствора. В качестве Буфера А используют раствор 1,7 М (NH4)2SO4 в 50мМ буфере
со значением рН, благоприятным для разделяемых белков, а в качестве Буфера В - 50 мМ
буфер без добавления сульфата аммония.
Объем градиента обычно составляет 15-25 объемов колонки. Увеличение объема
градиента больше 30 объемов колонки приводит, обычно, не к улучшению разрешения, а
лишь к размыванию белковых фракций.
Подготовка колонки Source ISO к работе
Подготовка достаточно проста и сводится к промывке колонки стартовым буфером до
установления стабильной базовой линии. Для этого с помощью управляющего блока в
режиме ручного управления ввести следующие параметры:
Концентрация буфера В – 0% (100% Буфера А)
Скорость потока – 1 мл/мин
и провести промывку колонки в течение 4-5 минут.
По окончании разделения промыть колонку 3-5 объемами буфера В.
Подготовка образца
Объем и концентрацию образца подбирают таким образом, чтобы наносить 5-10 мг белка
на 1 мл носителя. Рекомендуется использовать концентрацию белка не более 2 мг/мл.
Белковый препарат переводят в стартовый буфер А, после чего образец центрифугируют
при 12000g в течение 4-5 минут. Аккуратно отбирают супернатант и переносят в чистую
пробирку. Образец должен быть прозрачным и не содержать взвешенных частиц и
пузырьков. При необходимости проводят повторное центрифугирование.
Важно: образец должен быть свободен от жира или ионогенных ПАВ, напр. Na-додецилсульфата.
Нанесение образца
Дозирующую петлю промывают Буфером А при помощи шприца с тупой иглой. Для этого
шприцем отбирают 3-4 объема петли и через порт ввода 3 промывают элюентом петлю.
Подготовленный образец отбирают шприцем и, в положении 1 (LOAD) клапана ввода
пробы, полностью заполняют дозирующую петлю. Важно, чтобы объем образца был
несколько больше (на 10-15%), чем объем дозирующей петли, чтобы полностью
заполнить петлю и не допустить попадания пузырьков воздуха в хроматографическую
колонку. После заполнения петли включают насос А (скорость потока 1 мл/мин) и
переводят клапан узла ввода образца в положение 2 «INJECT». По окончании нанесения
образца из петли на колонку переводят клапан в положение 1 (LOAD) и промывают
колонку буфером А до установления ровной базовой линии.
Элюирование образца
Для элюирования образца целесообразно использовать заранее созданный метод. Пример
метода (программы), включающего стадию нанесения образца из петли на колонку с
последующими промывкой колонки и элюированием, приведен в Табл. 4. Объем
наносимого образца – 1 мл, объем носителя в колонке – 1 мл, градиент – 30 объемов
колонки.
Табл. 4. Пример программы для автоматизированной хроматографической системы создания простого линейного градиента
Время
Инструкция
Значение Описание
(Time)
(Function)
(Value)
Задание состава элюента (100 % Буфер А,
0.0
Conc B%
0
1,7М (NH4)2SO4)
Задание скорости потока и старт
0.0
ml/min
1.0
Обнуление сигнала УФ-детектора
3.0
Autozero
Переключение клапана узла ввода пробы в
3.5
Valve.pos
1.2
положение 2 «INJECT» и начало введения
образца из петли (объем 1 мл) в колонку
Переключение клапана узла ввода пробы в
4.5
Valve.pos
1.1
положение 1 «LOAD» и начало промывки
колонки 5,5-ю мл Буфера А
100% Буфер А от 0 до 10 минут
10.0
Conc B%
0
Линейное изменение концентрации Буфера В
40.0
Conc B%
100
в составе элюента от 0 до 100% за 30 мин
Промывка колонки 5 мл буфера В для
45.0
Conc B%
100
полного удаления связавшихся белков
End of method
Таким образом, происходит нанесение 1 мл образца, промывка 5,5 объемами стартового
элюента с последующим градиентным элюированием.
Такой вариант хроматографического метода удобен в качестве «пристрелочного». В
дальнейшем происходит оптимизация как на стадии нанесения образца, так и на стадии
элюирования.
По окончании хроматографического процесса, после выхода всех связавшихся белков,
необходимо промыть колонку стартовым Буфером А (5-10 объемов).
При снижении эффективности разделения
рекомендуется последовательно промыть колонку:
- 4-5 объемами воды,
- 1 объемом 40% раствором уксусной кислоты,
- 4-5 объемами воды
- 100% ацетонитрилом с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты
- 4-5 объемами воды
- 0,1 М раствором NaOH
- 3-5 объемами воды, после чего 5 объемами стартового буфера (напр. 1,7M (NH4)2SO4).
Гель-проникающая хроматография
Гель-проникающая хроматография (ГПХ) или гель-фильтрация является еще одним часто
используемым методом при разделении биомолекул. Разделение происходит в порах
носителя, причем, в отличие от других видов хроматографии, не происходит
взаимодействия между материалом носителя и разделяемым веществом. Молекулы, чей
размер крупнее самых больших пор хроматографического носителя, не проникают внутрь
гранул и мигрируют с потоком элюента. Таким образом, они выходят в первую очередь
(рис. 5).
Более мелкие молекулы имеют возможность проникать в поры носителя и задерживаться
там, причем, чем мельче молекулы, тем более продолжительное время они могут
находиться в порах сорбента и, соответственно, элюируются позже других.
- Носитель
- Крупный белок
- Маленький белок
Рис. 5. Схема разделения белков гель-фильтрацией.
Таким образом, происходит разделение молекул по их геометрическим размерам, начиная
с самых крупных и заканчивая самыми маленькими.
Чем больше путь проходит разделяемый образец по колонке, тем более высокое
разрешение можно получить. Поэтому, колонки для гель-фильтрации, в отличие от
ионообменных колонок, делают длинными и тонкими.
Другим важным фактором, влияющим на разрешение при проведении гель-фильтрации,
является объем наносимого образца. Чем он меньше, тем выше разрешение. При
аналитическом разделении, когда разрешение является важнейшим фактором, объем
образца (и, как следствие, ширина стартовой зоны) должны быть минимальными.
Обычно, при аналитическом разделении смеси биомолекул, объем образца не должен
превышать 1,5-2% от объема колонки для ГПХ.
При проведении препаративного разделения, когда необходимо получить максимальное
количество интересующего вещества, а также при обессоливании белкового образца,
когда разница в массах разделяемых молекул составляет десятки или сотни раз, допустима
более высокая загрузка колонки. В этом случае, объем образца должен быть
максимальным, чтобы достичь желаемого разделения. На рис. 6 представлены виды
хроматограмм при различном объеме загрузки образца.
А280
А
B
C
1
2
3
Объем элюента
Рис. 6. Хроматографические профили при различных объемах загружаемого образца
1). Объем образца очень мал, по сравнению с объемом колонки, аналитический вариант.
2). Максимальный объем образца, при котором происходит отделение хотя бы одного
компонента смеси (в данном случае компонента А, зоны В и С перекрываются).
3). Максимальный объем образца, при котором происходит полное разделение всех трех
компонентов.
Существует достаточно широкий спектр типов носителей для гель-проникающей
хроматографии, которые используются для разделения смесей различного состава.
Каждые из них характеризуется различными механическими, химическими свойствами, а
также способностью разделять молекулы в определенном диапазоне молекулярных масс.
Если анализируемые молекулы имеют массу, бόльшую, чем верхний предел эксклюзии
для данного носителя, то они не будут задерживаться и полностью выйдут из колонки
вместе с фронтом элюента. Молекулы, имеющие массу равную или меньше нижнего
предела эксклюзии, элюируются, обычно, в объеме примерно равном полному объему
хроматографической колонки. Свойства носителей типа Sephadex, широко применяемых
при гель-проникающей хроматографии белков, приведены в табл. 5.
Табл. 5. Диапазон фракционирования для глобулярных белков и пептидов носителей типа
Sephadex
Типа носителя
Диапазон фракционирования, Да
Sephadex G-10
Sephadex G-15
Sephadex G-25
Sephadex G-50
Sephadex G-75
Sephadex G-100
Sephadex G-150
Sephadex G-200
- 700
- 1500
1000 – 5000
1500 – 30000
3000 – 70000
4000 – 150000
5000 – 400000
5000 – 800000
Степень набухания
сухого геля в воде, мл/г
2–3
2,5 – 3,5
4–6
9 – 11
12 – 15
15 – 20
20 – 30
30 – 40
Для эффективного разделения веществ при помощи гель-фильтрации необходимо
пользоваться следующими правилами:
- носитель должен иметь диапазон фракционирования, охватывающий все интересующие
разделяемые вещества и не должен быть значительно шире. Напр. не следует
использовать носитель с диапазоном фракционирования 103-2*106 при разделении двух
белков с массами 10 и 25 кДа или для обессоливания образца.
- материал носителя не должен взаимодействовать с разделяемыми веществами, в
противном случае невозможно будет добиться разделения строго по геометрическим
размерам молекул. Практически любой носитель для гель-фильтрации может
неспецифически взаимодействовать с некоторыми типами молекул. Так, широко
распространенные носители Sephadex на основе поперечносшитых декстранов,
взаимодействуют с ароматическими молекулами, то приводит к их удерживанию в
колонке, а носители на основе силикагелевой матрицы задерживают заряженные
молекулы разделяемых веществ из-за электростатического взаимодействия. Эти эффекты,
в значительной степени, можно скорректировать при использовании соответствующих
элюентов, ослабляющих гидрофобные или электростатические взаимодействия.
- используемый элюент не должен оказывать значительного воздействия на разделяемые
молекулы и материал носителя. Использование сильных кислот в составе элюентов
совместно с носителями на основе сшитых полисахаридных матриц может привести к
частичному гидролизу гликозидных связей, а даже слабощелочные (рН выше 7,5) условия
приводят к быстрому разрушению силикагелевых матриц. Органические компоненты
элюента способны приводить к существенным конформационным изменениям
разделяемых молекул, и, как следствие, непредсказуемому порядку их выхода из
хроматографической колонки.
- эффективность разделения возрастает при использовании носителей с более мелкими
зернами. Однако при переходе от крупнозернистого к мелкозернистому носителю
значительно повышается противодавление, поэтому применение колонок с
мелкозернистым носителем на обычных хроматографических системах низкого давления
представляется затруднительным. Использование высокоэффективной хроматографии
высокого давления приводит к значительному повышению (иногда в десятки раз) затрат
на разделение белков. Следует отметить, что чем ближе форма частиц носителя к
сферической и чем ýже распределение этих частиц по размерам – тем меньше создаваемое
носителем противодавление. Поэтому использование сферических мелкодисперсных
носителей с узким распределением частиц по размерам является предпочтительным.
Применения гель-проникающей хроматографии
Анализ состава многокомпонентных образцов
Гель-фильтрация используется для разделения и количественного определения небольших
объемов образца, поскольку при этом не происходит взаимодействия между материалом
хроматографической колонки и образцом. Детектирование компонентов, выходящих из
хроматографической колонки можно осуществлять непосредственно в процессе
разделения, используя физико-химические свойства разделяемых молекул (напр.
поглощение при определенной длине волны, оптическую активность или показатель
преломления). Кроме того, можно собрать небольшие фракции, выходящие из колонки и
затем провести различные физические, химические или биологические тесты для
определения интересующих фракций.
Чаще всего гель-фильтрация применяется, когда необходимо провести разделение
макромолекул по молекулярным массам, особенно, когда другие методы не позволяют
сделать это эффективно. На рис. 7 показано разделение смеси раффинозы, сахарозы и
глюкозы друг от друга и отделение от NaСl на носителе Sephadex G-15.
Сахароза
NaCl
Раффиноза
70
Глюкоза
80
90
100
110
Объем, мл
Рис. 7. Разделение олигосахаридов и обессоливание методом гель-фильтрации
Пожалуй, наиболее интересное свойство носителей для гель-проникающей
хроматографии заключается в их способности к разделению биомолекул в соответствии с
их молекулярными массами. Время (объем) элюирования глобулярных белков
коррелирует с их молекулярными массами. Внутри диапазона фракционирования для
данного носителя объем элюирования и логарифм молекулярной массы белка почти
идеально связаны линейной функцией. Метод гель-фильтрации можно также применять
для определения молекулярной массы пептидов, олигонуклеотидов и других
макромолекул. Следует отметить, что для каждого типа разделяемых веществ (белки,
полисахариды и пр.) существует своя функция, связывающая объем элюирования и
молекулярную массу, поэтому необходимо пользоваться соответствующими
калибровками.
Обессоливание
Обессоливание образцов было одним из первых применений техники гель-фильтрации и
до сих пор остается одним из важнейших. Термин «обессоливание» не только означает
удаление солей из раствора, но и отделение низкомолекулярных компонентов от раствора
макромолекул. Для процесса обессоливания подбирают такой тип носителя, чтобы
высокомолекулярная фракция выходила в свободном объеме колонки, в то время, как
низкомолекулярные примеси распределяются между порами геля и подвижной фазой. А
поскольку разделение между низко- и высокомолекулярными фракциями весьма хорошее,
возможно проводить нанесение больших объемов образца (до 30% от общего объема
колонки).
Здесь следует отметить еще один немаловажный аспект. При проведении гельхроматографии происходит разбавление нанесенного образца по мере его прохождения по
хроматографической колонке. При малых объемах наносимого образца, разбавление на
выходе может достигать 4 и более раз. При загрузке больших объемов образца степень
разбавления снижается, напр. при загрузке образца объемом около 30% от объема
колонки, он разбавляется не более, чем на ¼.
Обессоливание при помощи гель-фильтрации значительно эффективнее и быстрее
диализа, поэтому используется при работе с лабильными биологическими объектами.
После проведения химических модификаций макромолекул избыток реагентов может
быть также удален гель-фильтрацией.
Концентрирование
Раствор, содержащий высокомолекулярные компоненты, может быть сконцентрирован
при помощи носителя для гель-проникающей хроматографии с мелкими порами. Сухой
носитель помещают в раствор, при этом вода и низкомолекулярные компоненты
впитываются в разбухающий материал носителя, а высокомолекулярные вещества, не
способные проникнуть внутрь гранул носителя, остаются в растворе и могут быть легко
отделены центрифугированием или фильтрованием под вакуумом. Обычно фактор
концентрирования при использовании такого метода достигает трех, причем рН и ионная
сила раствора остаются неизменными. Данный метод концентрирования очень простой
быстрый, что делает его особенно привлекательным при работе с лабильными
биомолекулами.
Методика проведения электрофореза белков в присутствии
додецилсульфата натрия (электрофорез в денатурирующих условиях).
Приготовление 12% полиакриламидного геля.
Гель состоит из двух частей: в нижней части – элюирующий гель, в верхней –
концентрирующий гель.
Нижний гель (элюирующий)
1,675 мл H2O (лучше бидистиллированной, можно дистиллированной)
1,25 мл 1,5 М Tрис/HCl pH 8,8
2 мл 30% АА/BAA (акриламид/бисакриламид)
cмесь аккуратно перемешать и дегазировать 5-10 мин с помощью водоструйного насоса;
добавить 20 мкл TEMEД (TEMED- N,N,N’,N’-tetramethylethylendiamine);
добавить 20 мкл 10% р-ра персульфата аммония (готовить свежий ежедневно!)
смесь быстро, но аккуратно перемешать, и залить такой объем геля, чтобы при заливании
верхнего (концентрирующего) геля расстояние между карманами гребенки и
гребенка
верхний
гель
5 мм
нижний гель
спейсер
нижним (элюирующим) гелем составляло примерно 5 мм (см. рисунок). Перемешивать и
заливать гель следует достаточно быстро, чтобы не допустить его преждевременную
полимеризацию. Сразу после заливания геля его поверхность выравнивают, для этого
аккуратно добавляют бутанол-1 (примерно 50 мкл). Обычно полимеризация геля между
стеклами протекает достаточно быстро, поэтому уже через 10-15 мин нижний гель
становится достаточно плотным, чтобы можно было заливать верхний (концентрирующий)
гель. Проверить, достаточно заполимеризовался гель или нет, можно простым способом:
наклонить вбок стекла с гелем (предметный столик), если гель готов, то стекать будет только
бутанол, а гель останется неизменным.
Верхний гель (концентрирующий)
1,750 мл H2O (лучше бидистиллированной, можно дистиллированной)
0,625 мл 0,5 М Tрис/HCl pH 6,8
0,375 мл 30% АА/BAA (акриламид/бисакриламид)
смесь аккуратно перемешать и дегазировать 5-10 мин с помощью водоструйного насоса;
добавить 15 мкл TEMEД (TEMED- N,N,N’,N’-tetramethylethylendiamine)
добавить 10 мкл 10% р-ра персульфата аммония (готовить свежий ежедневно!)
перемешать и залить гель, вставить гребенку (аккуратно, чтобы не допустить попадания
пузырьков воздуха)
Полученный гель для электрофореза должен окончательно полимеризоваться в течение
нескольких часов (минимум 2 ч). Наилучшие результаты получаются, если гель залить
вечером и оставить его полимеризоваться на ночь в холодильнике (+40С).
Проведение электрофореза.
Гель помещают в электролитическую ячейку и заливают электродным буфером так,
чтобы гель оказался полностью в него погруженным (требуется примерно 800-900 мл
электродного буфера). Во внешнюю камеру допускается заливание старого буфера, в то
время как во внутреннюю камеру всегда заливают “хороший” электродный буфер (свежий
или использованный не более 2 раз; объем внутренней камеры составляет примерно 130 мл).
В этом случае по окончании электрофореза нельзя смешивать буфер из внутренней и
внешней камеры.
В “карманы” геля наносят образцы, для этого используют наконечники с оттянутым
концом. Обычно наносят 20 мкл пробы в “карман” большой (на 10 образцов) гребенки.
Ячейку подключают к источнику питания. Сначала условия электрофореза следующие
(указана последовательность нажатия кнопок для источника питания BIO-RAD 3000 Xi):
LIMIT VOLT 200V ENT
LIMIT CURRENT 50mA ENT
LIMIT POWER 10W ENT
VOLT 100V ENT
START
После того, как полосы войдут в элюирующий гель, напряжение повышают до 200V:
STOP
VOLT 200V ENT
START
Если введено неправильное значение, то нажимают CLR, затем вводят правильное значение.
Если несмотря на принятые усилия (см. далее в тексте пункт о подготовке образцов
для электрофореза), образцы все-таки содержат некоторое количество соли, то условия
электрофореза следующие:
LIMIT VOLT 200V ENT
LIMIT CURRENT 50mA ENT
LIMIT POWER 10W ENT
VOLT 60V ENT
START
После того, как полосы войдут в элюирующий гель, напряжение повышают до 120V:
STOP
VOLT 120V ENT
START
Когда образец пройдет примерно половину нижнего (элюирующего) геля, повышают
напряжение:
STOP
VOLT 200V ENT
START
Когда образцы достигнут нижней границы элюирующего геля (это видно по фронту
красителя), выключают источник питания. Вынимают пластину с гелем, снимают стекло,
аккуратно поворачивая спейсеры: левый по часовой, правый против часовой стрелки,
ополаскивают гель дистиллированной водой, помещают его в ванну с фиксирующим
раствором, где осторожно отделяют гель от второго стекла пластиковым шпателем.
Отделенный гель ставят на качалку и осторожно перемешивают его 15-30 мин, закрыв ванну
крышкой. Моют стекла и ячейку сразу, т.к. длительный контакт стекла и пластика с
электродным буфером вреден!
Окрашивание белковых полос в геле.
Окрашивание белковых полос в геле возможно двумя способами: Кумасси
бриллиантовым синим или серебром. Обычно на практике используется первый способ;
окраска серебром применяется в случае, если наносятся образцы с низкой концентрацией
белка. Окрашивание серебром – более чувствительный, но более трудоемкий метод.
Методика окрашивания белковых полос серебром рассмотрена в конце настоящей методики.
Окрашивание белковых полос Кумасси бриллиантовым синим.
Сливают фиксирующий раствор (не выбрасывают его, так как фиксирующий раствор
можно использовать многократно), ополаскивают гель дистиллированной водой, наливают в
ванну с гелем раствор красителя, помещают на качалку и осторожно перемешивают 30-60
мин. По окончании данной процедуры необходимо отмыть фоновый краситель (т.е.
краситель, который связался не с белковыми полосами), чтобы получить четкую картинку
электрофореграммы - синие белковые полосы на белом фоне.
Отмывка фонового красителя.
Сливают раствор красителя (не выбрасывают его, так как краситель можно
использовать многократно), ополаскивают гель дистиллированной водой, помещают гель в
ванну с отмывкой и ставят перемешиваться на качалку. По мере отмывания периодически
меняют использованную отмывку на свежую. Гель отмывают до тех пор, пока белковые
полосы не станут четкими, а фоновая область станет максимально прозрачной. В случае,
если в результате чрезмерно интенсивной отмывки смыта окраска и белковых полос, гель
заново окрашивают, при этом время окраски увеличивают (1 ч или более). Использованную
отмывку регенерируют, пропуская ее через угольный фильтр.
Примечание: возможно длительное нахождение геля в фиксирующем растворе или
красителе (вплоть до нескольких дней). Оставлять окрашенный гель длительное время в
отмывке не рекомендуется. Отмытый гель можно хранить в дистиллированной воде
некоторое время (до нескольких дней), добавив туда небольшое количество уксусной
кислоты (1-2%). Во всех случаях ванна с гелем должна быть закрыта крышкой или пленкой,
и объем жидкости должен быть достаточно большим, чтобы не допустить высыхания геля!
Подготовка образцов для электрофореза.
Образец белка для должен быть обессолен. Концентрация белка в пробе должна быть:
5-6 о.е. по А280 – для комплексных препаратов
0,3-2 мг/мл (по Лоури или А280) – для гомогенных образцов или образцов с
небольшим количеством компонентов. Чем меньше компонентов в пробе, тем меньшие
концентрации белка можно брать.
При окрашивании белковых полос серебром можно брать в 5-10 раз меньшие
концентрации белка и в случае комплексных препаратов, и в случае гомогенных образцов
(см. методику окрашивания серебром ниже).
Если концентрация белка в пробе меньше требуемой, пробу концентрируют (см.
далее). Перед нанесением пробы в карман ее смешивают с буфером для образцов (sample
buffer):
10 мкл пробы + 12 мкл буфера для образцов (sample buffer), инкубируют 10-20 минут
при 1000С в кипящей водяной бане, далее центрифугируют (2 мин, 12000 об/мин).
Полученные пробы наносят в “карманы” геля (по 20 мкл).
Концентрирование проб.
Концентрирование
белков
можно
осуществить
с
помощью
диализа,
ультрафильтрации, ультрацентрифугирования, специфического связывания с каким-либо
сорбентом и т.д. На практике удобно концентрировать белки, осаждая их ацетоном.
Перед осаждением пробу охлаждают в холодильнике (+40С), ацетон охлаждают в
морозильнике (-180С). Смешивают 400 мкл пробы с 1,2 мл холодного ацетона (можно брать
и меньшие объемы в тех же соотношениях). Пробы оставляют в морозильнике (-180С) на
ночь, затем центрифугируют (5 мин, 12000-13000 об/мин), ацетон сливают, пробы сушат в
вакуумном эксикаторе.
В зависимости от желаемой степени концентрирования высушенный осадок (который
на практике часто не заметен глазом) растворяют в меньшем, чем начальный, объеме
дистиллированной воды. Например, если пробу требуется сконцентрировать в 10 раз,
осаждают 400 мкл пробы, осадок после высушивания растворяют в 40 мкл воды.
Приготовление реактивов для электрофореза в присутствии додецилсульфата
натрия (SDS-фореза).
БУФЕР ДЛЯ ОБРАЗЦОВ (SAMPLE BUFFER)
4 мл дист. H2O
1 мл 0,5 М Tрис/HCl, рН 6,8
1,6 мл 10% р-ра додецилсульфата натрия (SDS, lauril sulfate) (10 г SDS
растворяют в дистиллированной воде, доводят водой объем до 100 мл)
0,8 мл глицерина (использовать очищенный глицерин фирмы ICN)
0,2 мл 0,05% р-ра бромфенолового синего (5 мг бромфенолового синего
растворяют в 10 мл дистиллированной воды)
Меркаптоэтанол следует добавлять непосредственно перед использованием, т.к.
буфер для образцов (sample buffer) с меркаптоэтанолом плохо хранится (не более 2-3
недель). Смешивают 400 мкл буфера для образцов (sample buffer) с 20 мкл 2меркаптоэтанола. Хранят в холодильнике (+40С).
5Х КОНЦЕНТРАТ ЭЛЕКТРОДНОГО БУФЕРА (ELECTRODE RUNNING
BUFFER), pH 8,3
На 400 мл:
6 г Триса (Tris, electrophoresis grade)
28,8 г Глицина (Glycin, electrophoresis grade)
2 г додецилсульфата натрия (SDS, lauril sulfate)
Cмешать и довести до 400 мл дистиллированной водой. Хранят в холодильнике (+40С). Если
при хранении выпадает осадок, нагревают при 370С до растворения осадка.
ЭЛЕКТРОДНЫЙ БУФЕР (ELECTRODE RUNNING BUFFER), pH 8,3
Разбавляют в 5 раз дистиллированной водой 5Х КОНЦЕНТРАТ ЭЛЕКТРОДНОГО
БУФЕРА рН 8,3. Можно хранить при комнатной температуре.
1,5 М Tрис/HCl pH 8,8
45,37 г Триса (Tris, electrophoresis grade)
1 г додецилсульфата натрия (SDS, lauril sulfate)
Растворяют Tрис в 240 мл дистиллированной воды, доводят рН до 8,8 с помощью 2-4
М НСl, фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 или 0,45 мкм, добавляют
додецилсульфат натрия (SDS), перемешивают и доводят объем до 250 мл дистиллированной
водой. Хранят в холодильнике (+40С). При отстутствии фильтров 0,2 или 0,45 мкм
допускается использование фильтровальной бумаги.
0,5 М Tрис/HCl pH 6,8
15,1 г Триса (Tris, electrophoresis grade)
1 г додецилсульфата натрия (SDS, lauril sulfate)
Растворяют Tрис в 240 мл дистиллированной воды, доводят рН до 6,8 с помощью 2-4
М НСl, фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 или 0,45 мкм, добавляют
додецилсульфат натрия (SDS), перемешивают и доводят объем до 250 мл дистиллированной
водой. Хранят в холодильнике (+40С). При отстутствии фильтров 0,2 или 0,45 мкм
допускается использование фильтровальной бумаги.
30% АА/ВАА (акриламид/бисакриламид)
29,2 г Акриламида (Acrylamide, electrophoresis grade)
0,8 г N’N-Бис-метилен-акриламида (N’N-Bis-methylene-acrylamide)
Растворяют смесь в 60 мл дистиллированной воды, доводят объем до 100 мл
дистиллированной водой, фильтруют через фильтр 0,2 или 0,45 мкм, при их отсутствии -
через бумажный фильтр. АА/ВАА крайне опасен, поэтому все операции с ним лучше
проводить в перчатках! Хранят в холодильнике (+40С).
Примечание: концентрированная соляная кислота (36%) имеет молярную концентрацию 12
моль/л.
10% раствор персульфата аммония
10 мг персульфата аммония
100 мкл дистиллированной воды
Перемешивают до полного растворения персульфата аммония. Готовят ежедневно!
Краситель для электрофореза
27% этанола
10% уксусной кислоты
0,1% Кумасси бриллиантового синего (Coomassie-BrilliantBlue G250 или
R250 for electrophoresis)
0,5% сульфата меди CuSO4
На 100 мл красителя: 0,1 г Кумасси бриллиантового синего (Coomassie-BrilliantBlue) + 0,5
г CuSO4 (или 0,782 г CuSO45H2O) + 10 мл ледяной уксусной кислоты + 63 мл
дистиллированной воды, перемешать до растворения Кумасси и сульфата меди, добавить
27 мл этанола (96%). Спирт всегда добавлять в последнюю очередь! Раствор
перемешивают и фильтруют через фильтровальную бумагу. Хранят при комнатной
температуре.
Фиксирующий раствор для электрофореза
40% метанола
10% уксусной кислоты
На 100 мл: 40 мл метанола + 10 мл ледяной уксусной кислоты + 50 мл дистиллированной
воды. Раствор перемешивают. Хранят при комнатной температуре.
Отмывка для электрофореза
20% метанола
10% уксусной кислоты
На 100 мл: 20 мл метанола + 10 мл ледяной уксусной кислоты + 70 мл дистиллированной
воды. Раствор перемешивают. Хранят при комнатной температуре.
Высушивание полученного геля.
Для того, чтобы сохранить на длительное время полученную электрофореграмму,
гель с окрашенными полосами высушивают на специальной сушилке. В нашем
распоряжении имеется вакуумная сушилка BIO-RAD GEL DRYER MODEL 543.
Техника сушки следующая:
1. Подключают сушилку к водоструйному насосу, включают насос
2. Гель помещают в большую ванну с дистиллированной водой
3. Вырезают из специальной плотной фильтровальной бумаги (бумаги для сушки
гелей) подложку прямоугольной формы для геля. Размер ее должен превышать размеры
геля (чтобы после сушки осталось место для подписей дорожек).
4. Вырезанную подложку подкладывают под гель (делают это прямо в ванне с
водой), выравнивают гель так, чтобы он нормально расположился на смоченной бумаге.
5. Аккуратно вынимают полученную композицию (можно отобрать жидкость из
ванночки при помощи
резиновой
груши)
и кладут
на поверхность
сушилки
(предварительно открыв крышку сушилки и убрав ее прокладку). Для того, чтобы
избежать растрескивания геля в процессе сушки, рекомендуется положить под подложку с
гелем смоченную фильтровальную бумагу (обычную).
6.
Осторожно
накрывают
гель
прокладкой,
предварительно
смочив
ее
дистиллированной водой, натягивают ее (аккуратно!) и прижимают до тех пор, пока
между поверхностью сушилки и прокладкой не создастся вакуум. Если вакуум не
создается, следует проверить вакуумный насос. Если вакуумный насос в порядке, следует
проверить, герметична ли прокладка. Выгоняют пузыри между поверхностью геля и
прокладкой (осторожно продвигая их пальцем).
7. Закрывают сушилку крышкой, нажимают START. Режим сушки используется
все время одинаковый (2 ч, 800С). Изменить режим сушки можно, используя кнопки на
передней панели сушки (при этом поставить коллег в известность!!!), для того, чтобы
проверить, какой режим выставлен, следует нажать на соответствующую кнопку.
Например, чтобы узнать температуру сушилки, следует нажать TEMP.
Вакуум отключать в процессе сушки нельзя, т.к. гель растрескается!
8. По окончании сушки вакуумный насос не отключают. Следует выждать хотя бы
20-40 минут (чтобы дождаться остывания сушилки с гелем). Затем открывают крышку
сушилки, аккуратно снимают прокладку геля, выключают вакуумный насос. Высушенный
гель рекомендуется прижать к ровной поверхности (например, положить его между
страницами большой ненужной книги на ночь), чтобы избежать его скручивания.
9. Подписывают дорожки геля, анализируют полученные результаты.