отзыв
advertisement
1 отзыв официального оппонента на кандидатскую диссертацию АНДРЕЕВОЙ АЛЕКСАНДРЫ ЮРЬЕВНЫ на тему «МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭРИТРОЦИТОВ SCORPAENA PORCUS L. в условиях гипоксии (эксперименты in vitro)», представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.03.01 физиология. Изучение состояния экосистем в шельфовой зоне Мирового представляет существенный теоретический и практический интерес в океана связи с тем, что эти зоны характеризуются часто наблюдаемыми гипоксическими условиями и выработанными у обитателей этих зон адаптациями. В основе этих адаптаций лежат приспособительные механизмы, изучение которых и явилось задачей с представленной функциональной работы морфологии и использованием проточной набора цитометрии. методов Актуальность поставленной задачи несомненна. Примененные диссертантом для этих целей объекты исследования и использованные методы исследования являются адекватными и современными. Диссертация Андреевой А.Ю. написана по стандартному плану и содержит все необходимые разделы: введение, большой литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 162 стр., хорошо иллюстрирована 6 таблицами и 34 рисунками. В списке литературы цитируются данные преимущественно иностранных авторов (248) из общего числа (263) всех работ. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей в рецензированных журналах и 9 тезисов на отечественных и международных конференциях. Литературный обзор написан в соответствии с темой исследования и достаточно широкий и полный. В нем разбираются вопросы, непосредственно альтернативных режимов связанные дыхания, с темой работы - изменение двигательной использование активности и вертикальные или горизонтальные миграции. Эти, наиболее простые виды борьбы 2 с гипоксией, выработанные эволюцией, имеют значение при небольшом недостатке кислорода. Существует более сложный вид дыхания, связанный с воздушным дыханием - получением кислорода не через воду в жабры, а путем контакта пузырька воздуха с тонким эпителием, через который кислород диффундирует в кровь. Таким способом дыхание может осуществляться в основном через кожу, кишечник и плавательный пузырь. Еще одним видом физиологической адаптации является изменение подвижности рыб. Все перечисленные реакции являются только начальным этапом адаптационного процесса. При более длительной гипоксии уже требуются более эффективные физиологические процессы, которые подробно разбираются в работе А.Ю. Андреевой. Прежде всего, это касается повышения интенсивности дыхания, использования морфологических перестроек структуры жабр (размер, увеличение диффузной площади, морфоструктуры жабр). Это осуществляется путем активации процессов апоптоза и пролиферации клеток филаментов эпителия, в результате чего общая диффузионная поверхность жабр возрастает, что позволяет повысить интенсивность газообмена при недостаточном количестве кислорода. Этому также способствует и адаптивное приспособление сердечно­ сосудистой системы (эффект брадикардии). При прогрессирующей гипоксии этих изменений оказывается недостаточно для компенсации дефицита кислорода и включаются более глубокие механизмы, связанные с биохимическими перестройками в крови. Как известно, у рыб существует множественность форм гемоглобина тесно, связанных с его количеством и pH среды (эффект Бора). Следует отметить, что рыбы, по сравнению с другими позвоночными, обладают большим разнообразием способов адаптации к гипоксии на уровне эритроцитов. В отличие от безъядерных эритроцитов у высших позвоночных, в случаях недостатков ферментов внутриклеточные гликолиза биохимические эритроциты процессы рыб широко энергетического используют обмена для компенсации состояния гипоксии. Как известно из работ многих авторов, 90% энергетических потребностей ядерных эритроцитов обеспечивается за счет процессов аэробного метаболизма. В ядерных эритроцитах рыб широко 3 применяются разнообразные пути синтеза АТФ. В зависимости от вида рыб кроме глюкозы могут использоваться непосредственно пируват и аминокислоты плазмы крови в качестве субстратов аэробного обмена. Существенным является строгое поддержание градиентов концентрации ионов Na+ и К+ в мембранах клетки. В литературе есть только единичные указания о прямом воздействии кислорода на активность ионных каналов в мембране эритроцитов. Наиболее распространенной реакцией на гипоксию у рыб является набухание эритроцитов. В связи с этим, непосредственной задачей исследования являлось исследование влияния гипоксии на морфофункциональные параметры ядерных эритроцитов Scorpaena porcus L. в условия in vitro с использованием методов функциональной морфологии и проточной цитометрии. Задачи исследования четко установлены и сформулированы, что обеспечило и надежные результаты. Материалы и методы написаны детально. Важно, что дано четкое описание всех этапов работы морфометрический ядерных и анализ, эритроцитов, методов анализа разработка метода цитофотометрия). (цитометрический прижизненой Все анализ, морфометрии полученные результаты подвергались необходимой статистической обработке. В результате хорошо разработанных методических подходов и тщательности выполнения экспериментов, получены четкие и существенные результаты, многие из которых являются новыми и важными для понимания процессов адаптации к гипоксии ядерных эритроцитов рыб. Разработанный метод прижизненной морфометрии ядерных эритроцитов позволяет регистрировать линейные размеры нативных клеток. Для окраски ядер клеток авторы применяли витальные красители, концентрации которых подбирали эмпирически. Клетки и ядра фотографировали под световым и флюоресцентным микроскопом при освещении и при затемнении, что давало возможность на фотографии иметь для измерения и клетки и ядра. Андреевой А.Ю. показано, что показатель формы эритроцитов закономерно изменялся в зависимости от степени гипоксии. Изменялся, соответственно, и клеточный объем, вероятнее изменения ионных градиентов и изменения выхода всего за счет из клетки осмолитов. 4 Активация канала, вероятно, происходит за счет активизации анаэробных процессов и ростом уровня лактата. Применение витальных красителей позволило диссертанту измерить линейные размеры клеток и их ядер (длину, ширину, толщину) на нативном материале. Как условиях показали результаты умеренного экспериментов, дефицита кислорода ранжированная приводила к гипоксия в закономерному изменению длины, ширины и толщины клетки. Андреева А.Ю. показала, что при умеренной степени гипоксии клетка становится более вытянутой, при этом ее объем снижается, а при увеличении степени гипоксии клетка набухает и ее форма становится округлой. Гипоксия влияет и на линейные размеры ядра - в зависимости от степени гипоксии они изменяются также как и сама клетка. Изменение геометрических характеристик эритроцитов и их ядер в целом было однонаправленным, что характеризует общие закономерности. Как уже упоминалось, форма эритроцита закономерно изменялась: при нарастании гипоксии эритроциты приобретали более округлую форму, а объем клеток увеличивался. Изменение площади поверхности эритроцитов в условиях экспериментальной гипоксии в большой степени совпадало с изменением объема клетки, удельная Андреевой А.Ю. поверхность эритроцита также исследование геометрических изменялась. Проведенное характеристик ядерных эритроцитов при различных уровнях гипоксии показало, что изменение формы эритроцита происходит за счет всех его линейных параметров. Представляет интерес проведенное диссертантом расчетное определение толщины эритроцита. При умеренной гипоксии толщина клетки понижалась, а при экстремально низких значениях кислорода повышалась. В условиях умеренной гипоксии наиболее выгодным является более удлиненная форма эритроцита, что способствует протеканию диффузионных процессов и облегчению оксигенации гемоглобина. Впервые в исследовании эритроцитов рыб автором был применен ряд флуорохромов (R123, FDA, SYBR Green Г и PI) для оценки состояния ядерных эритроцитов скорпены. Показано, что гипоксия индуцирует флуоресценцию 5 большинства из них, что косвенно отражает изменение функционального состояния клеточных систем. Применение диацетата флуоресцеина и проподиума иодида позволило оценить состояние мембран эритроцитов при гипоксиях. Мембранный потенциал митохондрий оценивали по флюоресценции родамина 123, а состояние ядер по флюоресценции SYBR Green I. Автор впервые обнаружил увеличение интенсивности свечения родамина в условиях гипоксии, что, вероятно, связано с уменьшением проницаемости мембран эритроцитов за счет конформационных перестроек функционирующих ионных каналов. Логично, что это приводит к уменьшению нагрузки на митохондрии. Однако пока это еще предположение, которое требует прямых доказательств. Отмечено, что направление изменений флюоресценции SYBR Green I в ядрах имеет двухфазную природу. При экстремальных состояниях гипоксии имеет место достоверное увеличении интенсивности флюоресценции, которое при гипоксии умеренной гипоксии снижается. В экспериментах с пропидиум йодидом автором показано, что гипоксия не оказывала необратимого влияния на жизнеспособность и целостность эритроцитов. Приведенное обсуждение результатов работы диссертанта свидетельствует о тщательном и обоснованном анализе всего широкого набора полученного материала. В результате проделанной разработанных методических проработанный материал, приемов работы с применением большого числа был на основании получен которого огромный, тщательно сформулированы четкие выводы. Диссертантом усовершенствован ряд методик, что характеризует его как прекрасно подготовленного специалиста. Полученные А.Ю. Андреевой данные расширяют представления об адаптациях рыб к гипоксии. Автором глубоко проанализированы пути адаптивных эритроцитарных перестроек в условиях экспериментальной гипоксии. Впервые показано, что экстремальные формы гипоксии индуцируют рост функциональной активности ядер эритроцитов. Определена последовательность морфофункциональных изменений глубокой гипоксии. ядер при Принципиальных замечаний к диссертационной работе не имею, однако хочу уточить ряд вопросов: 1. Как изменяется при гипоксии рыб состав и характеристики гемоглобинов? 2. Все опыты выполнены in vitro и in vivo сохраняются ли полученные Вами результаты? 3. Что является определяющим в структуре эритроцитов у рыб при гипоксии? Считаю, что диссертация Андреевой Александры Юрьевны полностью соответствует критериям, изложенным в «Положении о порядке присуждения ученых степеней», утвержденным Постановлением Правительства РФ от 24 сентября 2013 г. № 842, а сама Андреева Александра Юрьевна заслуживает искомой степени кандидата биологических наук по специальности - физилогия 03.03.01. Д.б.н., профессор /М.Н.Маслова / главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова Российской академии наук 01.10.2014.г. :лярией ИЬНОГО Е И б у Д в р С Т В ______ гого____ бю ____________ дж етного ^ Ькдени s^Kayк и И н сти тута эволю ционной физиологий и б и о хи м уб им. И .М . С еченова Р оссийской академии наук
