Министерство здравоохранения Российской Федерации «Нижегородская государственная медицинская академия»
advertisement
Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» На правах рукописи УДК 576/577:616.8.001.6 МИТРОШИНА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ N-АРАХИДОНОИЛДОФАМИНА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ОСТРОЙ ГИПОКСИИ IN VIVO И IN VITRO 03.03.01 – физиология 03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, профессор И.В.Мухина; доктор биологических наук Л.Г. Хаспеков Нижний Новгород 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….. 5 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………. 12 1.1. Эндогенная каннабиноидная система……………………………... 12 1.1.1. Лиганды каннабиноидных рецепторов. Nарахидоноилдофамин.................................................................................. 13 1.1.2. Биосинтез и деградация эндоканнабиноидов……………………. 17 1.1.3. Каннабиноидные рецепторы и их локализация в головном мозге. ……………………………………………………………………… 20 1.1.4. Прочие рецепторы, связывающие каннабиноиды…...........……... 23 1.2. Сигнальные пути, запускаемые эндоканнабиноидной системой………………………………………………………………….. 25 1.2.1. Ретроградная модуляция синаптической передачи эндоканнабиноидами…………………………………………………….. 27 1.3. Нейропротекторное действие эндоканнабиноидов…… …............. 30 1.4. Роль эндоканнабиноидов в коррекции гипоксических и ишемических состояний мозга………………………………………….. 40 1.5. Изучение сетевой активности нейронов.................................. 45 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………. 48 2.1. Объект исследования………………………………………………… 48 2.2. Схема эксперимента…………………………………………………. 48 2.2.1. Схема экспериментов in vitro …………………………………….. 48 2.2.2. Схема экспериментов in vivo …………………………………….. 50 2.3. Культивирование первичных диссоциированных клеток гиппокампа……………………………………………………………….. 51 2.4. Методы оценки сетевой активности нейронов in vitro…………… 53 2.4.1. Биоэлектрическая спонтанная активность………………………. 53 2.4.1.1. Мультиэлектродные матрицы МЕD64 и MEA60……………… 53 2.4.1.2. Регистрация и анализ спонтанной сетевой биоэлектрической 3 активности нейронов….………………………………………………. 54 2.4.2. Функциональный кальциевый имиджинг………………………. 55 2.5. Иммуноцитохимические методы…………………………………… 57 2.6. Оценка жизнеспособности культивируемых клеток в диссоциированной культуре…………………………………………….. 59 2.7. Моделирование нормобарической гипоксии in vitro……………. 59 2.8. Моделирование острой гипобарической гипоксии in vivo………. 61 2.9.Методы оценки антигипоксического и нейропротекторного действия исследуемого соединения при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo…........................................................... 62 2.9.1. Тест «открытое поле» ……………………………........................... 62 2.9.2. Тест «Водный лабиринт Морриса»…..…………………………... 63 2.10. Статистическая обработка результатов…………………………… 64 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ……… 66 3.1. Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия N-арахидоноилдофамина при моделировании гипоксии in vitro …………………………………………….................................................. 66 3.1.1. Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии.................................................................... 66 3.1.2. Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии...............................................................................………………. 76 3.1.3. Влияние N-арахидоноилдофамина на выживаемость культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии....................................................................…………....………… 3.1.4. Влияние N-арахидоноилдофамина на распределение каннабиноидных рецепторов первого и второго типов в диссоциированных культурах гиппокампа при моделировании 84 4 гипоксии ……...........................................……………………………... 87 3.2. Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия N-арахидоноилдофамина при моделировании гипоксии in vivo ……………………………………………………………………… 91 3.2.1. Влияние N-арахидоноилдофамина на выживаемость животных при моделировании острой гипобарической гипоксии………................ 91 3.2.2. Влияние N-арахидоноилдофамина на показатели двигательной и ориентировочно-исследовательской активности мышей в тесте «Открытое поле»……..........................................................…………….. 95 3.2.3. Влияние N-арахидоноилдофамина на навигационное научение и долговременную память у мышей в тесте «Водный лабиринт Морриса» …................................................................................................ 104 ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………….. 112 ВЫВОДЫ………………………………………………………………… 119 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................... 120 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………. 123 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Регуляция физиологических функций организма является одной из актуальных проблем как физиологии, так и медицины. Поиск новых молекулярных мишеней управления позволяет не только изучить фундаментальные основы жизнедеятельности организма, но и разработать новые пути коррекции и предупреждения функциональных нарушений, возникающих при воздействии срессогенных факторов. Эндоканнабиноиды принадлежат к одному из активно изучаемых в последнее время семейств нейроактивных регуляторных липидов. Согласно современным концепциям о роли и функции эндогенной каннабиноидной системы в организме, нейроактивные липиды играют важную роль в регуляции процессов метаболизма, воспаления, боли, модуляции синаптической передачи и поддержании нормального функционирования нервной системы, в том числе процессов обучения, памяти, пищевого и оборонительного поведения (Хаспеков, Бобров, 2006; Riedel, Davies, 2005; Pertwee, 2006; Sagie et al., 2013; Davis, 2014; Morena, Campolongo, 2014; Tan et al., 2014; Younts, Castillo, 2014; Kano, 2014). N-арахидоноилдофамин (N-ADA) - относительно недавно описанный и синтезированный эндоканнабиноид. N-ADA относится к группе N- ацилдофаминов (амидов длинноцепочечных жирных кислот) и представляет собой амид арахидоновой кислоты с дофамином (Walker et al., 2004; Bobrov et al., 2008), имеющий высокое сродство с канабинидными рецепторами 1-го и 2-го типов (CBR-1 и CBR-2) и практически не связывающийся с дофаминовыми рецепторами (Bisogno et al., 2000). Поскольку N-ADA также активирует и ванилоидные рецепторы (TRPV1) (Caterina, Julius, 2001; van der Stelt, Di Marco, 2004; Bradshow, Walker, 2005), его характеризуют как CBR1/TRPV1-гибридный лиганд. Активация CBR-1 в новой коре (особенно в ее 6 фронтальных отделах), мозжечке, гиппокампе, стволе головного мозга, базальных ганглиях, миндалине, гипоталамусе (Mackie et al., 2005) отвечает за поведенческие реакции животных, называемые классической каннабиноидной тетрадой: гипотермия, каталепсия, анальгезия, сниженная двигательная активность (Compton et al., 1993; Adams, Martin, 1996; Zimmer et al., 1996). На субклеточном уровне CBR-1 преимущественно локализованы на пресинаптических аксонных терминалях, в том числе в пресинаптической активной зоне, где они участвуют в регуляции высвобождения нейромедиаторов (Katona et al., 1999; Kofalvi et al., 2007), а также на мембранах митохондрий нейронов, где непосредственно регулируют клеточное дыхание и выработку энергии. Активация митохондриальных CBR-1 экзогенными каннабиноидами снижает концентрацию цАМФ, активность протеинкиназы А, активность I ферментативного комплекса и дыхание в митохондриях нейронов (Benard G. et al., 2012). Физиологический механизм регуляции синаптической передачи в возбуждающих и тормозных синапсах N-арахидоноилдофамином путем ретроградного ингибирования выброса нейротрансмиттеров, т.е. через активацию обратной отрицательной связи, для поддержания гомеостаза нейронной сети предполагает возможность включения этого нейролипина в состав эндогенной стресс-лимитирующей системы мозга, участвующей в ограничении повреждений тканей в условиях ответной реакции клеток на стрессогенные факторы, одним из которых является гипоксия. Снижение поступления кислорода к тканям приводит к дисрегуляции окислительного фосфорилирования и процессов синаптической передачи, гибели клеток и разрушению нейронных сетей (Netto et al., 1993; Hodges, 1996; Virley et al., 1999; Лукьянова, Ушаков, 2004). Суммарно все эти процессы способствуют нарушению мнестических и когнитивных функций мозга (Yamomoto et al., 1993; Tanaka et al., 1998; Netto et al., 1993; Karasava et al., 1994; Nakagura, 2002). 7 Изучение роли эндогенной каннабиноидной системы в цитопротекции при гипоксии позволит найти новую мишень для разработки способов коррекции и предупреждения возникающей при гипоксии дисфункции мозга. В настоящее время существует значительное количество работ, посвященный изучению нейропротекторных свойств различных агонистов CBR (анандамида, 2-арахидоноилглицерина, WIN 55.212-2 и ряда других) при различных видах повреждения головного мозга (Nagayama et al., 1999; Panikashvili et al., 2001; Maresz et al., 2007; Mechoulam and Shohami, 2007; Koch et al., 2010; Pazos et al., 2013; Lara-Celador et al., 2013; Chiarlone et al., 2014; Dhopeshwarkar & Mackie, 2014). При этом нейропротекторные свойства N-ADA изучены пока недостаточно. В ряде работ показано, что N-ADA обладает антиоксидантными и нейропротекторными свойствами, сокращая объем очага инфаркта у животных при моделировании фокальной ишемии и повышая выживаемость нейронов в культуре in vitro при моделировании окислительного стресса, активации апоптоза и эксайтотоксичности (Bobrov et al., 2008; Бобров с соавт., 2010; Grabiec et al., 2012). Однако в целом механизмы его нейропротекторных свойств остаются на сегодняшний день мало изученными, а экспериментальные данные по объяснению эффектов NADA противоречивы и являются предметом дискуссии. Исследование активности влияния нейронов и N-ADA на сохранение функциональной жизнеспособности нервных клеток при моделировании гипоксии in vitro, а также на поддержание поведенческих и когнитивных функций животных при гипоксических повреждениях ЦНС на сегодняшний день не проводилось. Таким образом, вопросы, связанные с ролью N-ADA в регуляции синаптической передачи и функций ЦНС, остаются открытыми. Изучение эффекта, оказываемого N-ADA при гипоксическом воздействии in vitro и in vivo, позволит выявить роль нейролипинов в составе антистрессорной системы организма и предложить новые терапевтические подходы к 8 коррекции состояний, связанных с неадекватным снабжением тканей и органов, и прежде всего нервной системы, кислородом. Цель работы Целью работы явилось изучение антигипоксических и нейропротекторных свойств N-ADA при моделировании острой гипоксии в культуре клеток гиппокампа и острой гипобарической гипоксии in vivo. Задачи исследования 1. Изучить влияние N-ADA на индуцированные гипоксией изменения спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети в первичной культуре клеток гиппокампа. 2. Исследовать ранние и отдаленные эффекты действия N-ADA на индуцированные гипоксией изменения спонтанной кальциевой активности нейронной сети в первичной культуре клеток гиппокампа. 3. Изучить влияние N-ADA на выживаемость клеток в первичной культуре клеток гиппокампа, подвергнутых гипоксии. 4. Исследовать антигипоксические и нейропротекторные свойства N-ADA в условиях острой гипобарической гипоксии in vivo. 5. Оценить вклад каннабиноидных и ванилоидных рецепторов в реализацию цитопротекторного действия N-ADA при моделировании гипоксии in vitro и in vivo. Научная новизна Впервые выявлены ранние и отдаленные эффекты, оказываемые NADA на индуцированные острой нормобарической гипоксией изменения спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети в культуре клеток 9 гиппокампа, проявляющиеся в поддержании сетевой биоэлектрической активности нейронов в период гипоксии, а также сохранении паттерна сетевой пачки импульсов в отдаленном постгипоксическом периоде. Впервые обнаружено, что N-ADA уменьшает индуцированные гипоксией изменения спонтанной кальциевой активности нейронной сети в культуре клеток гиппокампа, что выражается в нормализации длительности и частоты спонтанных кальциевых осцилляций в отдаленном постгипоксическом периоде. Установлено, что превентивная аппликация N-ADA (10 мкМ) при моделировании острой нормобарической гипоксии и в 1 сутки после нее предотвращает гибель клеток гиппокампа in vitro, вызванную кислородной депривацией. Установлено, что ведущую роль в реализации антигипоксического и нейропротекторного эффектов N-ADA играет активация каннабиноидных рецепторов 1 типа (СВR-1) и ванилоидных рецепторов (TRPV1). Показано, что распределение CBR-1 и CBR-2 в культивируемых клетках гиппокампа изменяется в результате воздействия острой нормобарической гипоксии. Введение N-ADA во время гипоксии и в первые сутки после нее предотвращает снижение размеров и числа кластеров CBR-2 и повышает количество кластеров CBR-1, сохраняя их нормальные размеры. Впервые парентерального изучен антигипоксический применения N-ADA при эффект превентивного моделировании острой гипобарический гипоксии у мышей. Показано, что N-ADA повышает резистентность к острой гипобарической гипоксии, что проявляется в более высоком проценте выживаемости животных на высоте «смертельной площадки», а также сохранении мнестических функций ЦНС мышей в отдаленном постгипоксическом периоде. 10 Научно-практическая значимость Полученные результаты расширяют имеющиеся фундаментальные знания о нейропротекторной роли N-ADA и выявляют его антигипоксические свойства. Показано, что превентивная аппликация NADA при моделировании острой гипоксии in vitro поддерживает функциональную активность нейронных сетей в культуре клеток гиппокампа мыши как по данным биоэлектрической активности, так и по параметрам изменения содержания внутриклеточного кальция. При моделировании гипоксии in vivo превентивное применение N-ADA повышает резистентность мышей к гипоксии, улучшает восстановление мнестических функций после реоксигенации. Продемонстрированы рецептор-зависимые механизмы антигипоксического действия N-ADA. Полученные результаты являются экспериментальным обоснованием возможности практического использования N-ADA в качестве фармакологического агента, способного препятствовать патологическим морфофункциональным изменениям в нервной системе при острой гипоксии и активировать репаративные процессы в постгипоксический период. Основные положения, выносимые на защиту 1. N-ADA обладает выраженным антигипоксическим и нейропротекторным действием при моделировании острой гипоксии in vitro и in vivo. 2. Антигипоксическое действие N-ADA опосредуется прежде всего через каннабиноидные рецепторы 1 типа (СВR-1) и ванилоидные рецепторы (TRPV1), тогда как активация каннабиноидных рецепторов 2 типа (СВR-2) оказывает менее выраженный нейропротекторный эффект. 11 Апробация работы Основные положения диссертации доложены на Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics — 2009» (Нижний Новгород, 2009), XIV Нижегородской сессии молодых ученых «Естественные науки науки» (Нижний Новгород, 2009), XV Международной конференции по нейрокибернетике (Нижний Новгород, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология»» (Пущино, 2009), VI международном конгрессе «Оптика – XXI век» (Санкт – Петербург, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), 7-м Международном Европейском форуме нейронаук (7th FENS forum of European Neuroscience, Amsterdam, 2010), Международной конференции «Speckle2010:speckle fields forever” (Brazil, Florianopolis, 2010), Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics — 2011» (St. Peterburg – Nizhny Novgorod, 2011), X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011), IV Всероссийском Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), Международном конгрессе «International Brain Injury Association's Ninth World Congress on Brain Injury» (Edinburgh, Scotland, 2012); Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics-2013» (Нижний Новгород, 2013); ХХII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013); X международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2014); Международном симпозиуме «International Scientific School «Frontiers in modern neuroscience» (Nizhny Novgorod, 2014); Международном симпозиуме «8th International Symposium on Neuroprotection and Neurorepair» (Magdeburg, Germany, 2014); 9-м Международном Европейском форуме нейронаук «9th FENS Forum of Neuroscience» (Milan, Italy, 2014). 12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Эндогенная каннабиноидная система Азиатское растение cannabis, или конопля (Cannabis sativa/indica) применяется различными народами мира в медицинских целях более 5000 лет. Оно относится к семейству Cannabacea и порядку Urticales. Препараты из листьев и цветов этого растения обладают психотропным эффектом и используются для производства марихуаны и гашиша. Первым изолированным растительным каннабиноидом был каннабинол, полученный из экстракта конопли еще в конце XIX века. Химический синтез каннабинола впервые осуществлен в 1940 г. в лабораториях Р. Адамса в США и Тодда в Англии (Pertwee, 2006). Научный интерес к Cannabis sativa значительно возрос в середине 60-х годов XX века, после того, как группой исследователей под руководством Gaoni было показано, что основным действующим началом экстрактов конопли является Δ 9- тетрагидроканнабинол (ТГК) (Gaoni et al., 1964). После определения химической структуры растительных каннабиноидов и дальнейшего синтеза их высокоэффективных аналогов были выявлены и клонированы каннабиноидные рецепторы первого и второго типов, CBR-1 и CBR-2 (Mechoulam et al., 1995; Sugiura et al., 1995). Это позволило предположить существование эндогенных лигандов CBR – эндоканнабиноидов (ЭК), первым из которых был обнаружен амид арахидоновой кислоты с этаноламином, получивший название анандамид (Devane et al., 1992). По современным представлениям, CBR и их эндогенные лиганды входят в состав эндогенной каннабиноидной системы (ЭКС), которая включает в себя также белки биосинтеза, деградации и, возможно, транспорта ЭК (Хаспеков, Бобров, 2006; Zhang et al., 2009). На сегодняшний день известно, что ЭКС играет важную роль в регуляции процессов метаболизма, боли, воспаления, а также обучения, памяти, пищевого и оборонительного поведения (Riedel, Davies, 2005; Pertwee, 2006). Важно отметить, что активация CBR-1 ответственна за поведенческие реакции у животных, представляющие собой 13 классическую каннабиноидную тетраду (гипотермия, каталепсия, анальгезия, сниженная двигательная активность) (Adams, Martin, 1996). Установлено, что ЭК участвуют в регуляции синаптической передачи, активируя CBR на пресинаптических терминалях различных типов нейронов, что приводит к торможению выброса нейромедиаторов (Kano et al., 2009; Szabo, Schlicker, 2005). При этом ЭКС вносит ощутимый вклад в процессы кратковременной пластичности, а ее активация может вызывать длительную депрессию по пока недостаточно изученному механизму (Hashimotodani et al., 2007). 1.1.1. Лиганды каннабиноидных рецепторов. N-арахидоноилдофамин Все агонисты CBR (фитоканнабиноиды), принято эндогенные подразделять и на растительные синтетические. Среди фитоканнабиноидов (рис. 1), в состав которых входит более 60 соединений, полученных из растения C. sativa, впервые выделенным и наиболее хорошо изученным является Δ9-тетрагидроканнабинол (ТГК), который отвечает за психоактивные эффекты экстрактов конопли и является агонистом обоих типов CBR. Другой фитоканнабиноид, каннабидиол, не является лигандом CBR, однако он оказывает значительное каннабимиметическое действие, проявляя антиоксидантные свойства, ингибируя деградацию анандамида и, возможно, взаимодействуя с другими, пока не изученными, CBR. Наиболее известными эндогенными лигандами CBR (рис. 2) в настоящее время являются анандамид (АNА) и 2-арахидоноилглицерин (2AG). Среди других ЭК выделяют ноладиновый эфир (2- арахидоноилглицерил эфир), виродамин и N-арахидоноилдофамин (N-ADA), однако их биологическая роль и биохимические характеристики в значительной степени остаются неизученными (Pertwee, 2006). 14 Рисунок 1. Химическая структура фитоканнабиноидов (Szabo, 2008) Наиболее известными эндогенными лигандами CBR (рис. 2) в настоящее время являются анандамид (АNА) и 2-арахидоноилглицерин (2AG). Среди других ЭК выделяют ноладиновый эфир (2- арахидоноилглицерил эфир,), виродамин и N-арахидоноилдофамин (N-ADA), однако их биологическая роль и биохимические характеристики в значительной степени остаются неизученными (Pertwee, 2006). Различные канабиноиды проявляют различную аффинность к разным типам CBR: некоторые являются агонистами преимущественно CBR-1 (N-ADA, АNА, ноладиновый эфир), другие представляют собой неселективные агонисты обоих типов CBR (2-AG, виродамин и др.) (Bisogno et al., 2000; Howlett et al., 2004; Massi et al, 2008; Szabo, 2008). Синтетические лиганды CBR характеризуются большим разнообразием химического состава. Обычно их подразделяют на следующие категории: классические каннабиноиды, сохраняющие трициклическую дитерпеновую структуру ТГК (HU-210, HU-234, каннабидиол и т.д.), неклассические каннабиноиды (CP55940, CP47497, CP55244), аминоалкилиндолы (WIN 55.212- 2 и селективные агонисты CBR-1) и эйкозаноиды, которые метаболически более устойчивы и обладают большей селективностью, чем 15 классические каннабиноиды (O-1861, O-585, и O-689) (Szabo, 2008; Palazuelos et al., 2006). Рисунок 2. Химическая структура эндогенных лигандов каннабиноидных рецепторов (Szabo, 2008) N-ADA относится длинноцепочечных жирных к группе кислот) N-ацилдофаминов и представляет (амидов собой амид арахидоновой кислоты с дофамином (Bobrov et al., 2008). Изначально N-ADA был синтезирован для изучения эндованилоидной системы из-за его сходства с капсаицином (агонистом TRPV1), в котором молекула дофамина также сопряжена с арахидоновой кислотой. Затем его определили, как эндогенное соединение, которое синтезируется в основном в стриатуме, черной субстанции, гиппокампе, мозжечке и является агонистом СВR (Huang et al., 2002). Было показано, что он в 40 раз селективнее связывается с CBR-1, чем с CBR-2, и практически не связывается с дофаминовыми рецепторами (Bisogno et al., 2000). Поскольку N-ADA также активирует и TRPV1 (Caterina, Julius, 2001; van der Stelt, Di Marco, 2004; Bradshow, Walker, 2005), его 16 характеризуют как CBR-1/TRPV1 гибридный лиганд. Было показано, что связывание N-ADA с TRPV1 и CBR-1 приводит к деполяризации мембраны и повышению концентрации внутриклеточного кальция ([Ca2+]i) в дорсальных ганглиях (Huang et al., 2002; Sagar et al., 2004). Однако рядом других исследователей кальциевый ответ на действие N-ADA или капсаицина в культурах нейронов гиппокампа не обнаружен (Crawford et al., 2009). Показано, что в гиппокампе N-ADA усиливает тормозные процессы за счет стимуляции ГАМК-ергической передачи (Huang et al., 2002). N-ADA при связывании с CBR-1 в присутствии антагониста TRPV1, IRTX, в концентрации пресинаптических 10 мкМ терминалей тормозит выброс дофаминергических глутамата нейронов из черной субстанции, и, напротив, усиливает выброс глутамата при связывании с TRPV1 в присутствии антагониста CBR-1 АМ 281 (Marinelli et al., 2007). Авторами было показано, что для эффективного связывания с TRPV1 необходимо участие мембранного транспортера эндоканнабиноидов (EMT), что объясняется расположением связывающего сайта. Следует отметить, что в отсутствие антагонистов CBR-1 или TRPV1, высвобождение глутамата нейронами черной субстанции существенно не изменялось, что, очевидно, связано с одновременной стимуляцией рецепторов обоих типов. Кроме регуляции синаптической передачи, N-ADA индуцирует термальную гипералгезию, стимулирует спонтанную и термически вызванную активность в спинальных ноцицептивных нейронах и оказывает действие на сократительную активность гладких мышц за счет активации TRPV1, а также проявляет сосудорасширяющее действие, активируя как CBR-1, так и TRPV1 мелких сосудов брыжейки (Price et al, 2004; O'Sullivan et al, 2004; Huang and Walker, 2006) При парентеральном введении животным N-ADA в концентрациях 1-10 мг/кг вызывает классическую каннабиноидную тетраду (гипотермия, анальгезия, снижение локомоторной активности и каталепсия), действуя, так же, как и классический агонист CBR-1. Этот эффект блокируется 17 антагонистом CBR-1, но не блокируется антагонистами дофаминовых рецепторов (Bisogno et al., 2000). Таким образом, N-ADA может действовать как про-, так и эндоканнабиноид, в зависимости от того, взаимодействует ли он с TRPV1 или CBR-1, соответственно. 1.1.2. Биосинтез и деградация эндоканнабиноидов Каннабиноиды синтезируются и реализуются локально on demand (по требованию). Таким образом, уровень их генерации не является постоянным, а кинетика их деградации является основным фактором их активности. В естественных условиях, как полагают, синтез анандамида происходит путем ферментативного гидролиза фосфолипазой D мембранного предшественника - N-арахидоноил фосфотидилэтаноламина (Schmid et al., 1983; Deutsch, Chin, 1993). N–арахидоноил фосфотидилэтаноламин формируется путем ферментативного переноса арахидоновой кислоты из sn-1 положения мембранного фосфотидилхолина на аминогруппу фосфотидилэтаноламина (Cadas et al., 1997; Sugiura et al., 2002). Никаких конкретных трансацилаз, катализирующих данный процесс, на сегодняшний день не идентифицировано, однако некоторым исследователям удалось клонировать специфичную для N–арахидоноил фосфотидилэтаноламина фосфолипазу D (Okamoto et al., 2004). Возможны и другие варианты синтеза анандамида. Так, например, в желудке секреторная фосфолипаза А2 может катализировать конверсию N-ацил фосфотидилэтаноламина в N-ацил лизофосфотидилэтаноламид. Далее под действием лизофосфолипазы D образуются соответствующие N-ацилэтаноламиды, в том числе, анандамид (Sun et al., 2005). Другой альтернативный путь был описан в RAW246.7макрофагах, где происходит гидролиз N-арахидоноил фосфотидилэтаноламина до фосфоанандамида с участием фосфолипазы С и дальнейшим действием фосфатазы (Liu et al., 2006). 18 Для N-ADA предполагались два возможных пути биосинтеза. Первый возможный путь – это прямое сопряжение арахидоновой кислоты и дофамина, а другой – через метаболизм предполагаемого N- арахидоноилтирозина (NA-тирозин) (рис. 3). Рисунок 3. Два предполагаемых метаболических пути биосинтеза NADA (Hu et al., 2009) Показано, что NA-тирозин не является промежуточным продуктом в ходе биосинтеза N-ADA, который синтезируется в первую путем ферментативного сопряжения арахидоновой кислоты с дофамином (Hu et al., 2009). Хотя это сопряжение, вероятно, включает в себя комплекс ферментов, показано прямое участие гидролазы амидов жирных кислот в биосинтезе NADA. Эндоканнабиноиды не хранятся в синаптических везикулах, как другие нейротрансмиттеры. Напротив, они, благодаря своей липидной 19 природе, через постсинаптическую мембрану попадают в синаптическую щель, где связываются с соответствующими рецепторами, часто расположенными пресинаптически. Таким образом, ЭК могут выступать в качестве сигнальных молекул. Дальнейшие сигнальные пути, опосредуемые CBR, приводят к ингибированию реализации нейромедиаторов, главным образом ГАМК или глутамата, таким образом, ретроградно модулируя синаптическую передачу (Gómez-Ruiz et al., 2007). Чтобы прекратить влияние ЭКС, эндогенные лиганды СВR, как и другие нейротрансмиттеры, должны быть инактивированны. Эта инактивация происходит в 2 этапа: ЭК должны быть транспортированы в клетку, возможно, специальной транспортной системой, а затем гидролизованы под действием специальных ферментов (Bari et al., 2006). Анандамид гидролизуется до двух компонентов (арахидоновой кислоты и этаноламина) под действием гидролазы амидов жирных кислот (ГАЖК, FAAH), а 2-арахидоноилглицерол – до арахидоновой кислоты и глицерина под действием моноацилглицероллипазы (МАГЛ, MAGL) (Dinh et al., 2002). В 1994 г. было обнаружено, что захват анандамида обратно в клетку происходит путем облегченной диффузии (Di Marzo et al., 1994), и что этот процесс зависит от ряда факторов (температуры, чувствительности к субстрату, насыщаемости). Также была показана его независимость от ионных градиентов и гидролиза АТФ, однако возможно влияние оксида азота (Maccarrone et al., 2000). Хотя в последние годы было предпринято немало попыток идентификации специфического транспортера ЭК, его природа до сих пор остается не известной, что порождает все новые споры о его существовании (Glaser et al., 2003). На сегодняшний день, как правило, принято считать, что движение анандамида через клеточную мембрану – процесс насыщаемый, а также предложены различные механизмы поглощения анандамида, в том числе облегченная диффузия (Fegley et al., 2004), простая диффузия с ГАЖК-опосредованным расщеплением 20 анандамида, простая диффузия с внутриклеточной секвестрацией анандамида, или эндоцитоз (McFarland et al., 2004). В отличие от анандамида, об обратном захвате 2-AG практически ничего не известно. Некоторые авторы предполагают, что он попадает в клетку опосредованно специальным транспортером, другие – что использует транспортер анандамида (Bisogno et al., 2000), либо это происходит путем простой диффузии (Beltramo, Piomelli, 2000). В дополнение к основным ферментам, в процессе утилизации анандамида и 2-AG могут участвовать различные оксигеназы, например, липоксигеназа, цитохром Р450, циклооксигеназа, превращая ЭК в соответствующие соединения простагландина (van der Stelt et al., 2002). Физиологическая роль данных реакций пока не ясна. 1.1.3. Каннабиноидные рецепторы и их локализация в головном мозге Доказательства существования CBR в мозге были получены в середине 80-х годов (Howlett, Fleming, 1984). На сегодняшний день наиболее полно изучено молекулярное строение и фармакологические свойства двух типов CBR, CBR-1 и CBR-2, принадлежащих к суперсемейству А рецепторов, сопряженных с G-белком. Оба рецептора имеют 7 трансмембранных доменов (альфа-спирали), расположенный внутриклеточно С-конец и внеклеточный гликозилированный N-конец. Филогенетически CBR близки к рецепторам простагландинов (Howlett et al., 2002; Szabo 2008). Аминокислотная последовательность CBR разных видов животных практически идентична (97-99% гомологии). В состав CBR-1 человека входят 472 аминокислоты, а в CBR-1 мышей и крыс насчитывают 473 аминокислотных остатка. CBR-2 состоит из 360 аминокислот, состав и последовательность которых значительно отличаются от таковых для CBR-1. Сравнение аминокислотной последовательности у мыши и человека выявило 21 82% гомологии. При этом интересно отметить, что гомология между двумя типами рецепторов невысока и составляет всего 48% (68% в трансмембранных доменах), что свидетельствует о достаточно ранней эволюционной дивергенции СВR. Тем не менее, способность одинаково эффективно связывать некоторые каннабиноидные лиганды объединяет их в один класс. CBR – это типичные Gαi/o-протеин-ассоциированные рецепторы. Они блокируются коклюшным токсином, а их активация ингибирует аденилатциклазу (Howlett, 2005; Хаспеков, Бобров, 2006). Активация CBR-1 ингибирует N-, P/Q- и L-типы потенциал-зависимых кальциевых каналов (Twitchell et al., 1997). Также эти рецепторы модулируют некоторые типы калиевых каналов (Im, Ia) (Mackie et al., 1995). В то же время, активация CBR-2 не вызывает модулирования ионных токов через кальциевые каналы (Felder et al., 1995). При этом оба типа рецепторов могут активировать сигнальный каскад митоген-активируемой киназы (MARK) (Bouaboula et al., 1995; Bouaboula et al., 1996). Что касается распределения CBR в головном мозге, первые исследования локализации CBR-1 в различных его структурах проводилось методом радиоавтографии, с дальнейшим подтверждением результатов на CBR-1-нокаутных мышах. Эти, а также дальнейшие иммуногистохимические исследования показали, что наибольшая плотность CBR-1 у животных и человека наблюдается в новой коре (особенно в ее фронтальных отделах), мозжечке, гиппокампе, стволе головного мозга, базальных ганглиях, миндалине, гипоталамусе (Herkenham et al., 1991; Mackie et al., 2005). В целом можно сказать, что CBR-1 присутствуют практически во всех отделах головного мозга и, по мнению ряда авторов, являются самыми распространенными рецепторами в центральной нервной системе. Активация CBR-1 в указанных структурах отвечает за поведенческие реакции животных, называемые, как указывалось выше, классической каннабиноидной тетрадой: гипотермия, каталепсия, анальгезия, сниженная двигательная активность (Adams, Martin, 1996; Zimmer et al., 1996; Compton 22 et al., 1993). На субклеточном уровне CBR-1 преимущественно локализованы на пресинаптических аксонных терминалях, в том числе в пресинаптической активной зоне, где они участвуют в регуляции высвобождения нейромедиаторов (Katona et al., 1999; Kofalvi et al., 2007). Также показано их присутствие на мембранах митохондрий нейронов, где они непосредственно регулируют клеточное митохондриальных концентрацию дыхание CBR-1 цАМФ, и выработку экзогенными активность энергии. каннабиноидами протеинкиназы А, Активация снижала активность I ферментативного комплекса и дыхание в митохондриях нейронов. (Benard G. et al., 2012). Помимо нервной системы, CBR-1 обнаружены также в сердце, надпочечниках, костном мозге, легких, простате, тестикулах (Mackie et al., 2005). Результаты ряда исследований указывают на возможность вне- и постсинаптической локализации CBR-1. Так, природные и синтетические каннабиноиды модифицируют возбудимость нейронов путем регуляции калиевых токов на пре- и экстрасинаптической поверхности дендритов (Lozovaya et al., 2005). CBR-2 менее широко распространены в организме. В течение длительного времени считалось, что они экспрессируются исключительно в периферических тканях, в особенности, в органах иммунной системы: в селезенке, миндалинах, тимусе, костном мозге, на иммунных клетках: макрофагах, В-лимфоцитах, клетках микроглии (Munro et al., 1993). Однако работы недавнего времени могут изменить эти представления. Методами иммуногистохимии было показано наличие CBR-2 в мозжечке. Авторы связывают их экспрессию с нейронами или клетками микроглии. Кроме того, CBR-2 недавно были обнаружены на нейронах продолговатого мозга (Gong et al., 2006; Morgan et al., 2009; Brusco et al., 2008). CBR присутствуют также и на глиальных клетках. Клетки микроглии, по-видимому, способны экспрессировать оба типа рецепторов. CBR-2 обнаруживаются на вершинах ламеллоподий и микрошипиков клеток 23 микроглии, что указывает на их роль в процессах подвижности. Получены доказательства экспрессии CBR-1 и CBR-2 астроцитами в культуре ткани и в срезах мозга (Rodriguez et al., 2001). Экспрессия CBR обоих типов олигодендроцитами была недавно подтверждена экспериментами на культурах клеток и in vivo. Присутствие CBR на основных типах клеток нервной ткани свидетельствует об участии ЭКС в регуляции как их собственной активности, так и нейроглиальных взаимодействий (Хаспеков, Бобров, 2006). Однако, в отличие от CBR-1, активация CBR-2 не связана с психоактивными эффектами (Zhang et al., 2009). Первый селективный антагонист CBR-1, SR151716, получивший название римонабант, был описан в 1994 году (Barth, Rinaldi-Carmona, 1999). На его основе были получены другие антагонисты (АМ251, АМ281, SR147778). Однако существуют также антагонисты CBR-1, принадлежащие к другим химическим классам (например, LY320135) (Pertwee, 2006). Большинство антагонистов CBR не только блокируют эффекты экзоили эндогенных агонистов, но и оказывают инверсивное агонистическое действие, т.е. ингибируют конститутивно активные CBR (Pertwee R., 2010). Однако недавно были синтезированы антагонисты без инверсивного действия (NESS0327, VCHSR, O-2654 (Szabo, 2008). 1.1.4. Прочие рецепторы, связывающие каннабиноиды Поскольку не все эффекты, вызываемые каннабиноидами, можно объяснить активацией CBR-1 и CBR-2, предполагается также наличие других, еще не до конца охарактеризованных, типов каннабиноидных рецепторов. Особо следует обратить внимание на недавно описанный Gпротеин-связанный орфановый рецептор 55 (GPR55, G protein receptor GPR), который экспрессируеся в различной степени у разных видов животных. Он активируется рядом фитоканнабиноидов и некоторыми синтетическими и эндоканнабиноидами (Ryberg et al., 2007). Его разновидность, GPR55А, не 24 активирует Gi/o или Gs белки. Гомология между GPR55 и CBR-1 и CBR-2 низка и составляет менее 15%. Филогенетически эти рецепторы далеки друг от друга. Предполагается, что в пострецепторный каскад сигнальных реакций GPR55 вовлекаются Ga13 протеин и активируются малые GTP-связывающие протеины rhoA, cdc42 и rac1. Также существуют данные, показывающие, что этот рецептор активируется лизофосфатидилинозитолом, но не каннабиноидами. Таким образом, вопрос, является ли GPR55 рецептором каннабиноидов, остается открытым (Szabo, 2008). Другим интересным альтернативным рецептором может быть «аномальный каннабидиоловый рецептор», чьим основным лигандом является аномальный каннабидиол. Это соединение является неактивным каннабиноидом, который не связывается с CBR-1, однако опосредует эффекты у дикого типа и CBR-1 и CBR-1/CBR-2 - нокаутных мышей. (Gómez-Ruiz et al., 2007). Еще одним типом рецепторов, с которым могут связываться эндо- и экзоканнабиноиды, является упомянутый выше TRPV1 (The transient receptor potential cation channel subfamily V member 1), иначе называемый капсаициновым рецептором или ванилоидным рецептором 1 типа. Было показано, что активировать TRPV1 способны три различных класса эндогенных липидов. Это ненасыщенные N-ацилдофамины, в том числе NADA, метаболиты арахидоновой кислоты, образующиеся после воздействия на нее липооксигеназы, и эндоканнабиноид анандамид и ряд его аналогов (Van der Stelt, Di Marzo, 2004). TRPV1 – неселективный катионный канал, принадлежащий к группе транзиторных потенциал-зависимых каналов. Он активируется большим числом различных эндо- и экзогенных физических и химических стимулов. Наиболее известным агонистом TRPV1 является капсаицин, а из физических факторов – температура свыше 43оС (Szabo, 2008). В периферической нервной системе TRPV1 играют фундаментальную роль в регуляции болевых и термических ощущений (Caterina et al., 1997; Cui et al., 2006; Szallasi et al., 2007). Также их активация вызывает вазодилатацию 25 (McCollum et al., 2007). Данные об экспрессии и функции этих рецепторов в головном мозге противоречивы. Рядом исследований не обнаружено экспрессии мРНК TRPV1 рецепторов в мозге крыс (Caterina et al., 1997; Szallasi et al., 2007), в то время как другими авторами показано их присутствие в новой коре, гиппокампе, мозжечке и дорсальных спинных ганглиях (Sasamura, Kuraishi, 1999). Недавние исследования показали, что TRVP1 экспрессируются на нейронах и астроцитах гиппокампа, но не на клетках микроглии (Grabiec et al., 2012). Указывается также на крайне низкий уровень экспрессии TRVP1 почти во всех областях головного мозга, включая гиппокамп (Cavanaugh et al., 2011) CBR-1 и TRPV1 коэкспрессируются на сенсорных нервах с вазоактивными свойствами. Это свидетельствует о том, что активация этих рецепторов может оказывать эффект, действуя через TRPV1 (Ralevic et al., 2002) 1.2. Сигнальные пути, запускаемые эндоканнабиноидной системой Взаимодействие агонистов с CBR-1 и CBR-2 приводит к диссоциации сопряженных с ними Gi-белков на α субъединицу и βγ димер, которые участвуют в регуляции разнообразных путей внутриклеточной сигнализации. Свободная Giα-субъединица ингибирует аденилатциклазу (АЦ), снижая концентрацию цАМФ в клетке. Важно отметить, что в условиях функционально занятых Gi-белков CBR-1 могут взаимодействовать с Gsбелками и активировать АЦ (Glass, Felder, 1997). Кроме того, возрастание или снижение концентрации внутриклеточного цАМФ в результате активации CBR во многом зависит от экспрессии определенной изоформы АЦ в соответствующем типе клеток. Внутриклеточные реакции, связанные с активацией АЦ агонистами CBR, на сегодняшний день еще недостаточно изучены (Hashimotodani et al., 2007). 26 Ингибирование АЦ снижает уровень фосфорилирования калиевых каналов А-типа цАМФ-зависимой протеинкиназой А, что в свою очередь приводит к активации этих каналов. Регуляция ионных токов может осуществляться и без участия АЦ. Стимуляция CBR-1 с последующей активацией G-белков приводит к ингибированию потенциал-зависимых кальциевых каналов N-типа. Однако устойчивые к гидролизу аналоги цАМФ и ингибиторы фосфодиэстераз не влияли на действие каннабиноидов, что свидетельствует о непосредственном влиянии активированных G-белков на данный тип каналов. CBR-1 участвуют также в торможении кальциевых токов через расположенные пресинаптически потенциал-зависимые каналы P/Q-типа в нейронах гиппокампа (Kano et al., 2009). Внутриклеточные протеинкиназы также являются мишенью регуляции для CBR-1. Так, например, они могут активировать р38 киназу, активируемую митогенами (р38-МАРК), при этом не влияя на активность киназы JNK, а также вызывать фосфорилирование киназы фокальной адгезии, которая является важным интегрирующим звеном в перестройках цитоскелета. За счет инактивации АЦ и ПКА ЭК активируют киназы, регулируемые внеклеточными сигналами (ERK1/2 – еxtracellular regulated kinase). Было показано, что каннабиноиды активируют ERK1/2 за счет усиления фосфорилирования соответствующих киназ MEK1/2, при этом фосфоинозитол-3-фосфаткиназы в данном пути сигнализации не участвуют (Derkinderen et al., 2001, 2003). Введение животным ТГК либо анандамида приводит к экспрессии ранних генов c-fos, c-Jun и zif-268 в определенных областях мозга, а также экспрессию мРНК продуцируемого мозгом нейротрофического фактора (BDNF) в полях СА1 и СА2 гиппокампа (Glass, Dragunov, 1995; Patel et al., 1998). Таким образом, влияние ЭКС на ионную проницаемость и активность киназ, а также на экспрессию «ранних» генов и нейротрофических факторов свидетельствует об ее участии в процессах синаптической пластичности и в 27 реализации адаптивных механизмов в нервной ткани (Хаспеков, Бобров, 2006). 1.2.1. Ретроградная модуляция синаптической передачи эндоканнабиноидами CBR-1 представлены эргических, на пресинаптических глутаматэргических, норадреналинэргических нейронов, их окончаниях ГАМК- холинэргических и активация приводит к пресинаптическому ингибированию выброса нейротрансмиттера (Szabo, Schickler, 2005). Наиболее изучено воздействие каннабиноидов на глутамат- и ГАМКэргическую синаптическую передачу. Торможение пресинаптического выброса нейромедиаторов может происходить не только при экзогенном воздействии каннабимиметиков на CBR-1, но и под влиянием ЭК, синтезируемых из липидных предшественников в постсинаптическом нейроне в ответ на его деполяризацию афферентными стимулами. Постсинаптическая деполяризация вызывает поступление ионов Са2+ в постсинаптический нейрон через потенциал-зависимые кальциевые каналы, что ведет к активации синтеза и высвобождения каннабиноидов. Синтезированные постсинаптически, ЭК попадают в синаптическую щель и, активируя сопряженные с Gi/o-белками CBR-1, локализованные на пресинаптических терминалях, оказывают кратковременное (в течение одного-двух десятков секунд) негативное воздействие на высвобождение нейромедиатора (рис. 4). Высвобождающаяся β/γ- субъединица G-белка ингибирует потенциал зависимые кальциевые каналы на пресинаптическом окончании, что приводит к снижению [Ca2+]i и подавляет высвобождение нейромедиатора (Szabo et al., 1998, 2000; Kano, 2014)). Ретроградное ингибирование ГАМКергической синаптической передачи было названо подавлением торможения, 28 индуцированным деполяризацией (depolarization-induced suppression of inhibition, DSI) (Alger, Pitler, 1995), а глутаматергической – подавлением возбуждения, индуцированным деполяризацией (depolarization-induced suppression of exitation, DSE) (Kreitzer, Regehr, 2001) (рис.4). Установлено, что первичным сигналом, необходимым и достаточным для активации синтеза ЭК, с последующей индукцией как DSI, так и DSE, служит потенциалзависимое повышение [Ca2+]i в деполяризуемом постсинаптическом нейроне. Блокаторы потенциал зависимых кальциевых каналов и постсинаптическая аппликация хелаторов кальция препятствует развитию механизмов DSI/DSE (Lenz, 1998; Ohno-Sosaku, 2002). Таким образом, DSI/DSE представляют собой сходные формы обратимых кратковременных пластических регуляторных процессов, запускаемых одними и теми же посредниками (ЭК) и обладающих аналогичными сигнальными механизмами индукции и экспрессии. Рисунок 4. Ретроградное ингибирование синаптической передачи каннабиноидами (Szabo, 2008) 29 ЭК не накапливаются необходимости - в клетке, а синтезируются по мере "on demand", после чего высвобождаются кальций зависимо. Постсинаптическое повышение концентрации кальция и DSI/DSE происходит синхронно, поэтому количество выделенных каннабиноидов может отражать степень активации постсинаптических нейронов. Если бы каннабиноиды в одинаковой степени ингибировали и возбуждающие, и тормозные синаптические входы, они бы не изменяли возбудимость постсинаптического нейрона. Однако возбуждающие и тормозные афференты обладают разной степенью чувствительности к каннабиноидам. В то время как возбуждающие терминали равномерно и умеренно чувствительны, тормозные подразделены на 2 группы, одна из которых высокочувствительна, а вторая не реагирует на ЭК. Поэтому ЭК в зависимости от их концентрации вокруг синапсов могут ретроградно контролировать баланс между возбуждающими и тормозными пресинаптическими входами (Szabo, Shikler, 2005). Вследствие неравномерного распределения по соме и дендритам потенциал-зависимых кальциевых каналов и внутриклеточных депо кальция постсинаптическая деполяризация может индуцировать неравномерное повышение концентрации кальция, что приводит к гетерогенности концентрации ЭК, продуцируемых активированным нейроном. Поэтому вполне вероятно, что вклад той или иной формы подавления синаптической активности зависит от геометрии нейрона, а также распределения на нем синаптических контактов. Кроме того, показана прямая корреляция между выходом ЭК и стимуляцией метаботропных глутаматных рецепторов постсинаптического нейрона, которые сопряжены с Gq/11-белками и запускают каскад фосфолипазных реакций, участвующих в синтезе 2-АГ без существенного повышения кальция (Хаспеков, Бобров, 2006). Таким образом, эндоканнабиноидная система играет важную роль в обеспечении нормального функционального состояния синапсов и может способствовать сохранению их функции и восстановлению при патологии 30 ЦНС, связанной с нарушением регуляции нейромедиаторных процессов (Castillo et al., 2012). Однако механизмы действия различных каннабиноидов и, в том числе, N-ADA на уровне организации нейронных сетей изучены недостаточно полно и требуют дальнейших исследований. 1.3. Нейропротекторное действие эндоканнабиноидов Острые и хронические повреждения нервной системы, в том числе, травмы, ишемические или воспалительные заболевания, остаются серьезной проблемой современной медицины, приводя к нарушениям моторной, сенсорной и когнитивной функции у пациентов. Поэтому поиск способов защиты нервной ткани при различных повреждениях является актуальной и социально значимой проблемой неврологии и нейробиологии в целом (Thurman et al., 1999; Kaur et al., 2013). Перспективным подходом для решения данной задачи представляется применение природных и синтетических нейроактивных липидов. Накопленные на сегодняшний день данные указывают на то, что каннабиноиды могут выступать в качестве нейропротекторных факторов при различных механизмах повреждения мозга. Выяснению терапевтического потенциала различных ЭК посвящено большое количество работ. На различных моделях черепно-мозговой травмы, ишемического поражения мозга, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и эксайтотоксичности было продемонстрировано, что ЭК, такие как анандамид и 2-АГ, так же, как и синтетические лиганды CBR-1 и CBR-2, как, например, WIN55121-2, оказывают нейропротекторное действие (Nagayama et al., 1999; Sinor et al., 2000; Panikashvili et al., 2001; Moesgaard et al., 2003; Eljaschwitsch et al., 2006; Maresz et al., 2007; Mechoulam and Shohami, 2007; Koch et al., 2010; Kaur et al., 2013; Lai et al., 2013; Chiarlone et al., 2014). Часть этих работ свидетельствует о том, что защитное действие осуществляется преимущественно посредством активации нейрональных CBR-1 (Nagayama et 31 al., 1999; Mechoulam and Shohami, 2007; Chiarlone et al., 2014). Кроме того, активация CBR-2 также может вносить свой вклад в нейропротекторное действие каннабиноидов (Benito et al., 2008; Howlett et al., 2002; Maresz et al., 2005; Murikinati et al., 2010; Pazos et al., 2013; Dhopeshwarkar, Mackie, 2014). Первоначально исследования были направлены на активацию CBR-1 для защиты нейронов при эксайтотоксическом, ишемическом повреждении и аутоиммунных заболеваниях (Nagayama et al., 1999; van der Stelt, 2001; Muthian et al., 2004; Shouman et al., 2006). Существует три основных механизма, запускающих гибель нейронов в ЦНС при различных физиологических и патологических состояниях. Это избыточная активация ионотропных глутаматных рецепторов, приводящая к накоплению в клетках ионов натрия и кальция и, как следствие, гибели клеток в течение нескольких часов, окислительный стресс, вызывающий гибель нейронов в результате накопления активных форм кислорода и азота, и деструкция нейронов в результате апоптоза (Mehta et al., 2013). Глутамат является основным возбуждающим нейромедиатором центральной нервной системы, воздействуя на синаптическую передачу посредством активации различных, прежде всего ионотропных, рецепторов, чувствительных к Nметил-D-аспартату (NMDA-рецепторы), α-амино-3-гидрокси-5-метил-4- изокса-золпропионовой кислоте (AMPA-рецепторы) и каинату (каинатные рецепторы). Активация постсинаптических рецепторов глутамата имеет решающее значение для нормальной реализации различных неврологических функций, в том числе, таких как обучение и память (Won et al., 2002). Многочисленными исследованиями было доказано, что глутамат также играет ключевую роль в развитии процессов, приводящих к гибели нейронов при нарушении кровоснабжения мозга при ишемии. Нарушение нормального поступления кислорода и глюкозы в нервные клетки вызывает энергетический дефицит, который приводит к деполяризации мембраны нейрона и усилению высвобождения глутамата из пресинаптического окончания, анормальному накоплению его в синаптической щели в 32 результате нарушения захвата глутамата астроцитами, и, как следствие, чрезмерной активации глутаматных рецепторов, что приводит к быстрой гибели нейронов (Lai et al., 2013). Такое явление носит название глутаматной нейротоксичности, или эксайтотоксичности. Эксайтотоксичность играет ключевую роль при травмах головного и спинного мозга, инсультах, при развитии различных нейродегенеративных заболеваний, таких как эпилепсия, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Хангтингтона и др. (Mehta et al., 2013). Различают быструю и медленную эксайтотоксичность. Быстая эксайтотоксичности развивается преимущественно при активации NMDAрецепторов. NMDA-рецептор является лиганд-управляемым ионным каналом, хорошо проницаемым для ионов кальция, а также натрия и калия. Это пентамер, основными субъединицами которого являются NR1 и NR2A, 2В, 2С и 2D субъединицы. Деполяризация постсинаптической мембраны устраняет ингибирующий «магниевый блок» и приводит к открытию канала для ионов Ca2+. Даже сравнительно краткой (> 3 мин) активации NMDAрецепторов достаточно, чтобы вызвать гибель нейронов в результате чрезмерного поступления в клетку ионов Ca2+ (Lai et al., 2013). Также в реализации быстрой эксайтотоксичности принимают участие АМРАрецепторы глутамата, обладающие высокой проницаемастью для ионов Na+ и К+. AMPA-рецептор состоит из различных комбинаций 4 субъединиц (GluR1, 2, 3, 4). В отличие от NMDA-рецептора, необходима длительная (более 60 мин) активация АМРА-рецепторов, чтобы вызвать гибель нейронов за счет повышения концентрации Na+ внутри клетки (Koh et al.,1990). Большинство нейронов экспрессирует GluR2 субъединицу AMPA-рецептора, которая делает такие рецепторы мало проницаемыми для Са2+. Экспрессия и функция GluR2-субъединицы снижается в нейронах, подвергающихся гипоксическому воздействию. Ишемия переднего мозга приводит к замедленной гибели нейронов в гиппокампе в поле СА1, чему предшествует снижение экспрессии GluR2 мРНК (Gorter et al., 1997). Изменение соотношения экспрессии GluR2- 33 и GluR2-субъединиц AMPA-рецепторов обуславливает Ca2+-зависимую быструю АМРА-нейротоксичность, которая может лежать в основе потенциальных механизмов селективной гибели нейронов при гипоксическом/ишемическом повреждении мозга (Kim et al., 2001). Каинатные рецепторы нейронов быстро активируются и десенситизируются, проводят ионы Na+/K+ и проницаемы для Ca2+. Как и в случае АМРА-опосредованной медленной эксайтотоксичности, необходимо длительное (более 1 ч) воздействие каината, чтобы вызвать гибель нейронов (Won et al., 2002). Чрезмерное повышение [Ca2+]i приводит к активации нескольких ферментативных систем, в том числе NO-синтазы, протеаз, фосфолипазы А2 (ФлА2) и эндонуклеаз, что приводит к окончательной гибели клеток (Kostandy, 2012). Концентрация свободного Ca2+ в цитоплазме нейрона крайне низка (приблизительно 100 нМ), тогда как его внеклеточная концентрация достигает 1-2 мМ. Уровень [Ca2+]i в нейронах поддерживается следующими механизмами: (1) поступление Ca2+ в клетку из внеклеточной среды через лиганд-зависимые рецепторы или потенциал-управляемые Ca2+ каналы; (2) высвобождение Ca2+ из эндоплазматического ретикулума посредством стимуляции IP3-рецепторов или из митохондрий через Na+/Ca2+ обменник; (3) выход Ca2+ из клетки через Ca2+-АТФазу или Na+/Ca2+ обменник в плазматической мембране; (4) связывание Ca2+ кальцийсвязывающими белками эндоплазматическом цитоплазмы; ретикулуме при (5) депонирование участии Са2+-АТФазы Ca2+ в или в митохондриях по градиенту электрического потенциала. Гипоксическиишемическое воздействие вызывает накопление внутриклеточного свободного Ca2+ за счет усиления его поступления в клетку, прежде всего, через NMDA-рецепторы, и нарушения АТФ-зависимого удаления Ca2+ из клетки и его депонирования (Won et al., 2012). Длительное повышение [Ca2+]i приводит к запуску метаболических реакций и необратимой смерти нервных клеток с участием множества механизмов, которые включают в себя 34 активацию Са2+-зависимых эффекторных белков. Одним из таких белков является внутриклеточная протеаза кальпаин I. Активированный кальпаин расщепляет жизненно важные белки, такие как спектрин, фодрин, Ca 2+АТФазу и протеинкиназу С, транскрипционный фактор NF κВ. Это влечет за собой редукцию дендритов, разрушение плазмалеммы, модуляцию экспрессии генов и нейродегенерацию (Wang, 2000). Активация кальцийзависимого кальпаина-I приводит к превращению ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. При реперфузии, после поступлении О2 в ишемизированную ткань, происходят окисление ксантина и накопление большого количества супероксидного Сa2+/кальмодулин-зависимой NO-синтазы аниона. Активация обусловливает фермента избыточную продукцию радикала NO-. В результате создаются условия для образования пероксинитрита, что стимулирует генерацию гидроксильных радикалов и способствует нитрированию тирозиновых радикалов белков. Свободные радикалы индуцируют реакции белков с другими компонентами клетки, вызывая фрагментацию белковых молекул и нарушение их функций (Won et el., 2002) В процесс эксайтотоксичности вовлекаются и другие протеазы, такие как катепсин D, а также эндонуклеазы и фосфолипазы. Чрезмерное накопление Ca2+ в нейронах приводит к транслокации фосфолипазы А2 в мембране. Активация ФлA2 может способствовать гибели нейронов при эксайтотоксичности и гипоксии/ишемии за счет продукции свободных жирных кислот (например, арахидоновой кислоты) из глицерофосфолипидов. Арахидоновая кислота далее используется для производства простагландинов и лейкотриенов и сопутствующей продукции супероксида. Также увеличение дополнительно концентрации ингибирует свободной митохондриальное арахидоновой дыхание и кислоты оказывает непосредственное цитотоксическое действие (Sapirstein и Bonventre, 2000). Прерывание метаболических каскадов, приводящих к индуцированной глутаматом гибели клеток при ишемии, может предотвратить или уменьшить 35 ишемическое повреждение мозга. Однако, несмотря на тот факт, что многочисленные исследования in vivo и in vitro показали нейропротекторное действие антагонистов различных глутаматных рецепторов при ишемии, последние клинические испытания не смогли доказать эффективность данных соединений. Кроме того, терапевтический потенциал блокаторов NMDA-рецепторов ограничивается побочными поведенческими эффектами, такими как психоз и гиперлокомоция (Won et al., 2002; Xiong, 2009; Chao, Sheng-Tian, 2013). Таким образом, представляется необходимым поиск новых, более результативных препаратов для предотвращения глутаматной токсичности при ишемическом повреждении, одним из которых являются соединения класса эндоканнабиноидов, которые за счет специфического механизма – ретроградной регуляции синаптической передачи – препятствуют избыточному выбросу нейромедиаторов (в том числе, глутамата) в синаптическую щель, защищая таким образом клетку от эксайтотоксичности (рис. 5) (Mechoulam R. et al., 2002; Генрихс с соавт., 2010). Одной из первых работ, показавших нейропротекторный эффект эндоканнабиноидов, было исследование, обнаружившее, что синтетические агонисты CBR, WIN55,212-2 и CGS19755, уменьшают гибель клеток, вызванную низким содержанием магния в среде, причем нейропротекторный эффект блокировался римонабанотом (Shen, Thayer, 1998). При закрытой травмой головы у крыс 2-АГ уменьшал отек мозга и объем инфаркта, причем эффект блокировался SR141716А (Panikashvili et al., 2001). У CBR-1нокаутных мышей 2-АГ не оказывал защитного эффекта, а восстановление животных после травмы шло медленнее, чем у контрольной группы (Panikashvili et al., 2005). 36 Рисунок 5. Механизмы нейропротекторного эффекта эндоканнабиноидов (Mechoulam R. et al., 2002). Пояснения в тексте Молекулярные механизмы, лежащие в основе защитного действия каннабиноидов, изучены недостаточно. Показано, что активация CBR-1, вызванная эксайтотоксичностью, приводит к увеличению продукции нейротрофических факторов, таких как основной фактор роста фибробластов (bFGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) (Marsiano et al., 2003; Khaspekov et al, 2004; Aguado et al., 2007), а также регулирует продукцию оксида азота (Kim et al., 2006) и провоспалительных цитокинов, прежде всего, фактора некроза опухолей ФНОα (Mechoulam et al., 2002; Panikashvili et al., 2006) и ингибирует экспрессию транскрипционного фактора NFkB (Panikashvili et al., 2005). Показано, что защитное действие каннабидиола от бета-амилоид (Aβ)индуцированной токсичности в культуре клеток PC12 обусловлено его антиоксидантными и антиапоптотическими свойствами, независимыми от СВR (Harvey et al., 2012). Другие исследователи обнаружили, что Δ9-ТГК через активацию CBR-1 защищает нейроны спинного мозга крыс от токсичности, вызванной каиновой кислотой (Van der Stelt et al., 2001; 37 Shouman et al., 2006). Cинтетический каннабиноид WIN55212-2, как и Δ9ТГК, с участием CBR-1 защищал культивируемые нейроны гиппокампа от эксайтотоксичности (Gilbert et al., 2007). Вероятно, защитный эффект каннабиноидов может быть связан с регулированием деятельности NMDAрецепторов. Так, например, дексанабинол выступает в качестве стереоселективного ингибитора NMDA- рецепторов и препятствует NMDAиндуцированной нейротоксичности (Darlington, 2003), при которой степень нейропротекторного эффекта синтетических каннабиноидов WIN55212-2 и CP-55940 в культуре клеток гиппокампа прямо коррелирует с концентрацией каннабиноидов в среде и блокируется антагонистом CBR-1. Механизм защитного эффекта связан со снижением концетрации ионов Са2+ в клетке вследствие торможения активности ПКА с последующим ингибированием кальциевых каналов эндоплазматического ретикулума (ЭПР), сопряженных с рианодиновыми рецепторами (Хаспеков, Бобров, 2006; Zhang et al., 2007). Большое число исследований подтверждает, что изменение уровня экспрессии CBR-1 ассоциировано с развитием различных нейродегенеративных заболеваний. Одним из факторов патогенеза болезни Хангтингтона является резкое снижение количества CBR-1, предшествующее развитию двигательных нарушений (Glass et al., 2000; Dowie et al., 2009). Плотность CBR-1 у пациентов с болезнью Альцгеймера может снижаться (Westlake et al., 1994). Также имеются данные об изменении экспрессии CBR1 у трансгенных мышей с различными моделями болезни Альцгеймера (Fowler et al., 2010). Эксайтотоксичность, индуцированная каиновой кислотой, повышала уровень мРНК CBR-1 в гиппокампе крыс (Aguado et al., 2007). Целый ряд работ демонстрирует нейропротекторный эффект эндоканнабиноидов, не связанный с активацией CBR-1. Marsiano с соавт. исследовали нейропротективное действие ряда эндогенных и синтетических каннабиноидов при оксидативном стрессе, вызванном воздействием пероксида водорода. На культурах клеток мозжечка мышей дикого типа и 38 мышей, нокаутных по гену CBR-1, показано, что реализация нейропротекторного эффекта каннабиноидов не зависит от экспрессии клетками CBR-1. Δ9-ТГК и синтетический каннабиноид СР55,940 повышали выживаемость клеток мозжечка при оксидативном стрессе, а WIN 55,212-2 и метанандамид не оказывали нейропротекторного эффекта как в культурах клеток дикого типа, так и нокаутных животных. Этот эффект авторы связывают с наличием в структуре молекулы Δ9-ТГК и СР55940 фенольной группы, которая отсутствует у WIN 55,212-2 и метанандамида (Marsicano et al., 2002). Появление сведений об иммунорегуляторной роли активации CBR-2 привело к увеличению интереса к этим рецепторам как терапевтическим мишеням, способным уменьшить воспалительные явления при травмах ЦНС и нейродегенеративных заболеваниях, так как и острые, и хронические поражения головного воспалительную мозга компоненту. всегда имеют Основным в своем патогенетическим патогенезе фактором воспаления является повышение уровней воспалительных цитокинов в головном мозге, активация микроглии и появление лейкоцитов в результате повреждения гематоэнцефалического барьера. Активированная микроглия и астроциты выделяют большое количество провоспалительных и нейротоксических соединений (Dirnagl еt al., 1999; Centonze et al., 2007; Kadhim et al.,2009). Наличие CBR-2 на активированных клетках микроглии и иммунной системы позволяют предположить, что агенты, модулирующие их функции, могут иметь потенциально полезные свойства в терапии нейродегенеративных расстройств, причем, поскольку психотропное действие каннабиноидов, как правило, связано с активацией CBR-1 на нейронах, CBR-2-опосредованное нейропротективное действие каннабиноидов представляется особенно интересным в связи с отсутствием их центральных побочных эффектов (Ashton, Glass, 2007). Первые доказательства того, что селективная активация CBR-2 оказывает защитный эффект при экспериментальном аутоиммунном 39 энцефаломиелите (EAE), были получены при исследовании действия каннабиноида WIN55212-2 на прогрессирование ЕАЕ у мышей. Применение этого синтетического каннабиноида, который является агонистом как CBR-1, так и CBR-2, ослабляло прогрессирование EAE. Присутствие антагониста CBR-1, SR141716А, не влияло на защитный эффект, а антагониста CBR-2, SR144528, блокировало его. Был сделан вывод, что нейропротекторное действие WIN55212-2 опосредовано активацией CBR-2. Однако возможно, что активация CBR-1 играет нейропротекторную роль на более поздних стадиях заболевания (Baker et al., 2000; Maresz et al., 2007). В другом исследовании было показано, что трансгенные мыши с гиперэкспрессией CBR-2 более изменениям, устойчивы к поведенческим вызванным и нейродегенеративным интрацеребральным введением 6- гидроксидофамина. У трансгеных мышей были менее выражены реактивный астроглиоз, активация микроглии, изменения активности тирозингидроксилазы в черной субстанции и хвостатом ядре, моторные и эмоциональные изменения в поведении (Ternianov et al., 2012). Таким образом, накоплен большой объем данных, свидетельствующих об эффективной защитной роли ЭКС при различных патологических состояниях нервной системы, однако многие эндоканнабиноиды, входящие в ее состав, пока остаются мало исследованными (Pertwee et al., 2010). Одним из перспективных нейропротекторных соединений является Nарахидоноилдофамин (N-ADA). Ранее было показано, что N-ADA обладает антиоксидантными свойствами и оказывает защитное действие на культивируемые нейроны мозжечка крысы в моделях окислительного стресса, апопотоза и глутаматной токсичности (Bobrov et al., 2008). При моделировании NMDA-зависимой эксайтотоксичности in vitro N-ADA оказывал защитный эффект на клетки зубчатой извилины, причем его нейропротекторные свойства в низких (1 нмоль), но не высоких (10 ммоль) концентрациях блокировались антагонистом CBR-1, АМ251, и не проявлялись у CBR-1-нокаутных мышей. Антагонисты CBR-2 и TRPV1 не 40 влияли на защитный эффект (Grabiec et al., 2012). Однако данные о механизмах нейропротекторного действия N-ADA на сегодняшний день остаются противоречивыми и являются предметом дальнейших исследований. 1.4. Роль эндоканнабиноидов в коррекции гипоксических/ ишемических состояний головного мозга Гипоксия – широко распространенное состояние организма, возникающее как из-за дефицита кислорода во внешней среде, так и при самых различных патологиях, связанных с нарушениями кровообращения, дыхания и транспортной функции крови (Мухина, 2000). происходит снижение доставки кислорода к тканям При гипоксии до уровня, недостаточного для поддержания фунции, метаболизма и структуры клетки (Лукьянова, 1997). Кислородная недостаточность служит основой разнообразных патологических процессов, часто наблюдающихся в клинике, и является одной из центральных проблем медицины. При любом виде гипоксии в основе всех характерных для нее изменений лежит нарушение системы окислительного фосфорилирования в митохондриях (Лукьянова с соавт., 2007). Энергодефицит при гипоксии способствует накоплению Са2+ в цитоплазме клеток, активации Cа2+зависимых фосфолипаз, что ведет к распаду фосфолипидов клеточных мембран (Оковитый, Смирнов, 2001; Won et al., 2002). Нарушение поступления кислорода к нервной ткани приводит к изменению процессов синаптической передачи, гибели клеток и разрушению нейронных сетей головного мозга. В постгипоксическом периоде наблюдаются также нарушения в системах вторичных мессенджеров, таких как аденилатциклазной и инозитолфосфотазной систем (Nagakura, 2002; Чеснокова, 2006), что может играть определенную роль в отсроченной гибели нейронов. Изменяется активность таких ферментов, как МАО и 41 аминотрансфераза (Рубанова с соавт., 1991, Захарова, 1991). В совокупности все дегенеративные процессы приводят к избирательной гибели нейронов. Гипоксия может сопровождаться исчезновением целого слоя пирамидных нейронов гиппокампа (Проблемы гипоксии… под ред. Лукьяновой, Ушакова, 2004). Избирательно повреждается неокортекс, особенно сенсомоторный, а также гиппокамп (Netto et al., 1993; Hodges et al., 1996; Virley et al., 1999). В подкорковых структурах, в частности, в базальных ганглиях, также отмечаются значимые повреждения. Суммарно все эти изменения приводят к мнестическим и когнитивным патологиям (Netto et al., 1993; Yamamoto et al., 1993; Karasava et al., 1994; Tanaka et al., 1998; Nagakura, 2002). В зависимости от причин и механизма развития различают следующие основные типы гипоксии: 1. Экзогенная гипоксия, которая возникает при действии на систему обеспечения кислородом внешних факторов, и, в свою очередь, подразделяется на несколько типов: а) гипоксический тип (гипо- и нормобарический); б) гипероксический тип (гипер- и нормобарический). 2. Респираторная (дыхательная) гипоксия. 3. Циркуляторная (сердечнососудистая) гипоксия/ишемия. 4. Гемическая гипоксия, возникающая при анемии и вследствие инактивации гемоглобина. 5. Цитологическая гипоксия, возникающая при нарушении способности тканей поглощать кислород или при разобщении окисления и фосфорилирования (гипоксия разобщения). 6. Субстратная гипоксия (развивается на фоне дефицита энергетических субстратов). 7. Перегрузочная гипоксия ("гипоксия нагрузки"), возникающая при увеличении нагрузки на систему обеспечения кислородом; 8. Смешанная гипоксия (возникает при сочетании нескольких форм гипоксии). 42 Независимо от этиологии гипоксических состояний, в развитии и исходе основного патологического процесса решающую роль играет насыщение тканей кислородом и его участие в метаболических процессах (Проблемы гипоксии..., 2004; Лукьянова с соавт., 2007). Поиск способов коррекции повреждающего действия гипоксии является весьма актуальной задачей медицины и нейробиологии. В большинстве экспериментальных моделей гипоксии in vivo используют модель циркуляторной гипоксии (локальной ишемии) либо острой или хронической гипобарической гипоксии. Наиболее подходящим условием для изучения молекулярных и клеточных нейропротекторных механизмов служит моделирование гипоксической гипоксии in vitro. Как правило, для осуществления методики in vitro используются специальные инкубаторы, в которых можно вытеснять кислород при помощи вакуумного насоса. В экспериментах по моделированию циркуляторной гипоксии in vivo было показано, что ЭК, в том числе и N-ADA, способствуют защите нейронов от повреждений. Так, было обнаружено нейропротекторное действие синтетического каннабиноида WIN55212-2 при ишемическом повреждении мозга, причем снижение объема очага инфаркта блокировалось антагонистом CBR-1 римонабантом (Nagayama et al., 1999). Также одними из наиболее убедительных свидетельств нейропротекторного действия каннабиноидов, реализующегося через СВR-1, являются исследования, показавшие, что у мышей, нокаутных по гену CB1-/-, больше площадь очага инфаркта, ниже кровоток в области пенумбры и более выражен неврологический дефицит при окклюзии средней мозговой артерии, чем у гетерозигот CB1-/+ и у мышей дикого типа (Parmentier-Batteur et al, 2002). Кроме того, нокаутные эксайтотоксичности, животные вызванной были более глутаматом, чувствительны к инъецировынным непосредственно в кору головного мозга, и к оксидативной травме при интрацеребральном введении FeCl2 (Parmentier-Batteur et al, 2002; Kim et al., 2005). При фокальном ишемическом повреждении, индуцированном 43 фототромбозом кровеносных сосудов коры головного мозга крысы, N-ADA препятствовал увеличению объёма очага инфаркта (Бобров с соавт., 2011; Генрихс, 2012). Такое же нейропротекторное действие оказывали и Nацилэтаноламины, в частности, пальмитоилэтаноламин. Интересным представляется тот факт, что блокада СВR-1 и TRPV1 не препятствовала способности пальмитоилэтаноламина снижать объем очага инфаркта и неврологический дефицит ишемии/реперфузии. у животных, подвергшихся воздействию Применение пальмитоилэтаноламина существенно уменьшало развитие апоптоза и предотвращало вызванное ишемией увеличение экспрессии ряда белков, в том числе индуцибельной NО синтазы и фактора транскрипции NFkB (Garq et al., 2010). Исследования in vitro, проведенные Grabiec с коллегами, выявили, что аппликация N-ADA при моделировании NMDA-эксайтотоксичности на органотипических срезах гиппокампа предотвращает дегенерацию и гибель клеток-зерен зубчатой извилины и снижает количество клеток микроглии. Применение антагониста CBR-1 АМ630 полностью блокировало нейропротекторный эффект, оказываемый малыми дозами N-ADA, но эффект высоких доз сохранялся. Антагонисты CBR-2 и TRPV1 не оказывали влияния на нейропротекторный эффект N-ADA. У CBR-1-нокаутных мышей N-ADA протективного действия не оказывал (Grabiec et al., 2012). При индукции апоптоза и цитотоксическом действии глутамата в культуре клеток мозжечка и новой коры N-ацилдофамины оказывали дозозависимый нейропротекторный эффект, опосредуемый CBR-2 (Генрихс с соавт., 2010). Однако оценка воздействия N-ADA на сохранение когнитивных, мнестических и поведенческих функций при ишемических и гипоксических поражениях ЦНС на сегодняшний день не проводилась. Показано, что активация CBR-2-cелективными агонистами уменьшает воспалительные реакции, сопровождающие различные повреждения ЦНС. Продемонстрирован нейропротекторный эффект синтетического селективного агониста CBR-2 О-1966 при экспериментальном аутоиммунном 44 энцефаломиелите и при моделировании церебральной ишемии/реперфузии у мышей. Было обнаружено снижение адгезии лейкоцитов к капиллярам мозга, уменьшение инвазии иммунных клеток в паренхиму мозга и улучшение неврологических функций после инсульта. Применение агонистов CBR-2 препятствовало увеличению объема очага инфаркта через 24 часа после реперфузии (Zhang et al., 2009), а в присутствии антагониста CBR-2 SR144528 очаг инфаркта увеличивался. Антагонист CBR-1 SR141716А также оказывал нейропротекторный эффект, снижая объем очага инфаркта. Совместное применение селективного агониста CBR-2 и антагониста CBR-1 вызвало усиление мозгового кровотока во время периода окклюзии сосудов (Zhang et al., 2008). Аналогичные свидетельствующие данные, о нейропротекторном действии антагонистов CBR-1 при ишемии головного мозга, приводят и другие авторы (Berger et al., 2004; Muthian et al, 2004). Существует несколько объяснений подобного расхождения результатов. Один из возможных вариантов может быть связан с температурным режимом. Существует большое число работ, в которых активация CBR-1 не оказывала защитного эффекта при поддержании нормальной температуры тела у животных. Предполагается, что протекторный эффект связан с гипотермией, вызываемой активацией CBR-1 (Leker et al., 2003; Hayakawa et al., 2004). У CBR-1-нокаутных животных возможны нарушения при развитии ЦНС, которые усиливают чувствительность к ишемии. При этом нейропротекторный эффект антагониста CBR-1 SR141716A связан со свойствами самой молекулы антагониста, а не с блокированием рецепторов. В целом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что каннабиноиды, и, в частности, N-ADA, могут обладать потенциальным терапевтическим потенциалом, предотвращая патологические изменения клеток, инициирующие нейродегенеративные процессы, и таким образом способствуя восстановлению нормальных функций мозга (Campbell et al., 2008). Однако в связи с неоднозначностью экспериментальных данных требуются дальнейшие исследования нейропротекторных и 45 антигипоксических свойств эндоканнабиноидов, и, в том числе, N-ADA in vitro и in vivo для раскрытия механизмов их действия, что может явиться основой разработки новых лекарственных средств для коррекции ишемических и гипоксических повреждений нервной системы. Одним из адеватных методов оценки изменений функционального состояния нейронов при действии патогенетических факторов гипоксии/ишемии и фармакологической коррекции этих изменений является исследование биоэлектрической активности нейронных сетей, культивируемых на мультиэлектродной матрице. 1.5. Изучение сетевой активности нейронов Нейронная сеть мозга является структурно-функциональной единицей, отвечающей за процессы обработки, хранения и воспроизведения информации. Одним из маркеров функционирования нейронной сети является ее спонтанная биоэлектрическая активность, имеющая свои закономерности развития в онтогенезе и под воздействием факторов окружающей среды. В настоящее время наиболее оптимальной методикой изучения нейрональной мультиэлектродная активности система на регистрации сетевом уровне внеклеточных является потенциалов действия (multielectrode arrays) (Мухина с соавт., 2009). Нейроны гиппокампа после нескольких дней культивирования на мультиэлектродной матрице образуют между собой синаптические связи, о чем свидетельствует генерирование клетками случайных спайков (внеклеточных потенциалов действия) и типичных паттернов электрической активности в виде спайков (Gross and Kowalski, 1999). Спонтанная биоэлектрическая активность нейронов в культурах с высокой плотностью клеток отличается склонностью к синхронизации. В зависимости от возраста культуры, условий культивирования, фармакологических воздействий 46 происходит изменение рисунка пачки (Boehler et al., 2007; Xiang et al., 2007; Ham et al., 2008). Сетевая пачечная активность – это моментальная пространственновременная последовательность внеклеточных потенциалов действия (спайков) одного или нескольких нейронов, детектируемая на внеклеточных электродах, с короткими межспайковыми интервалами (Li et al., 2007; Madhavan et. al., 2007). Пачка (Burst) внеклеточно регистрируемых спайков характеризуется следующими признаками: 1. Количество спайков в пачке не менее 4. 2. Межспайковый интервал не более 100 мс (частота более 10 Гц). 3. Наличие пространственной и временной синхронизация пачечной активности в нейронной сети (Madhavan et. al., 2006; Pimashkin et al., 2011). В отличие от традиционных электрофизиологических методов, применение данной методики имеет ряд преимуществ: 1. Клеточная неинвазивность, отсутствие необходимости помещать электроды вручную. 2. Возможность одновременной регистрации сигналов и стимуляции клеток. 3. Возможность проведения хронических экспериментов (месяцы). 4. Изучение нейрофизиологии сетей. 5. Возможность фармакологических манипуляций, в том числе, лекарственный скрининг. Использование мультиэлектродных матриц дает уникальную возможность совмещения электрофизиологических методов с методами прижизненной визуализации (в частности, конфокальной лазерной микроскопии, КФЛМ) с использованием трансгенных флуоресцентных белков, ионных мультиэлектродной индикаторов. системой Совмещение регистрации и культуры стимуляции клеток с активности нейронов позволяет моделировать в динамике различные стадии развития 47 нейронных сетей, а также может быть использовано для изучения на клеточном и сетевом уровне таких свойств нервной системы, как научение и память (Мухина с соавт., 2009). 48 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объект исследования Объектом исследований in vitro служили первичные диссоциированные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных мышиных эмбрионов линии CBA (вид Mus musculus). Всего в экспериментах была использована 361 культура. В опытах in vivo использовано 116 4-х недельных самцов мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и были согласованы с этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России. 2.2. Схема экспериментов 2.2.1. Схема экспериментов in vitro Распределение экспериментальных групп представлено в табл.1. Культуры подвергали гипоксии на 21-й день in vitro (DIV). В интактной группе культур осуществлялась смена нормоксической культуральной среды. В культурах контрольной группы нормоксическую среду на 10 минут заменяли на гипоксическую, затем клетки возвращали нормоксическую среду, т.е. подвергали реоксигенации. В культуры других групп во время гипоксии, при реоксигенации и в течение суток после нее добавляли N-ADA 2,5 и 10 мкМ (синтезирован в лаборатории оксилипинов ИБХ РАН) и N-ADA в комбинации с антагонистом CBR-1, SR141716A (Sanofi), 1 мкМ, антагонистом CBR-2, SR144528 (Sanofi), 1 мкМ и антагонистом TRPV1, капсазепином (Tocris), 1 мкМ. 49 Таблица 1. Распределение экспериментальных групп in vitro Серия Влияние N-ADA на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур гиппокампа при гипоксии Влияние N-ADA на спонтанную кальциевую активность клеток диссоциированных культур гиппокампа Название группы DIV Интактные Контрольные (гипоксия без N-ADA) N-ADA 2,5 мкМ N-ADA 10 мкМ N-ADA 10 мкМ + SR141716A 1 мкМ N-ADA 10 мкМ + SR144528 1 мкМ N-ADA 10 мкМ + капсазепин 1 мкМ 21-28 Интактные Контроль (гипоксия без NADA) N-ADA 2,5 мкМ 21, 28 Количество культур 5 5 5 5 5 5 5 15 15 10 N-ADA 6 мкМ 10 N-ADA 10 мкМ 15 при гипоксии Влияние N-ADA на Интактные выживаемость Влияние N-ADA на Контроль (гипоксия без NADA) N-ADA 10 мкМ N-ADA 10 мкМ + SR141716A 1 мкМ N-ADA 10 мкМ + SR144528 1 мкМ N-ADA 10 мкМ + капсазепин 1 мкМ Интактные экспрессию CBR при Контрольные (гипоксия без гипоксии N-ADA) нервных клеток в диссоциированных культурах гиппокампа при гипоксии N-ADA 10 мкМ 21, 22, 24, 28, 31 40 40 40 40 40 40 28 21 50 Параметры, характеризующие спонтанную биоэлектрическую активность нейронной сети, регистрировали непосредственно до гипоксии, во время нее, после реоксигенации, через 2 часа и через каждые 24 часа в течение 7 дней после гипоксии. Спонтанную кальциевую активность регистрировали при гипоксии и на 7 сутки постгипоксического периода. Оценка жизнеспособности культур осуществляли до гипоксии, на 1, 3, 7 и 10 сутки постгипоксического периода. Иммуноцитохимические исследования проводили на 7 сутки после гипоксии. 2.2.2 Схема экспериментов in vivo Предварительно проводилась оценка двигательных и ориентировочноисследовательских показателей у животных. На следующий день после теста начинались сеансы навигационного научения в "водном лабиринте" Морриса, с перерывом в 48 часов. Через 24 часа после окончания пятого сеанса обучения животных подвергали острой гипобарической гипоксии (ОГБГ). Предварительно за 45 мин до подъема на высоту внутрибрюшинно вводили N-ADA в различных дозах (2,5 мг/кг, 6 мг/кг и 10 мг/кг), а также в комбинациях с блокаторами CBR-1 (SR141716A 1 мг/кг), CBR-2 (SR144528 1 мг/кг) и TRPV1 (капсазепин 1мг/кг). Животным контрольных групп внутрибрюшинно вводили физиологический раствор и растворитель N-ADA без препарата, группе сравнения – внутрибрюшинно Реамберин (150 мг/кг) как антигипоксический препарат. Через 24 часа после ОГБГ у выживших животных определяли отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти, а также оценивали двигательные и ориентировочноисследовательские показатели с повтором на 7 и 14 сутки после ОГБГ. Интактной группе проводили тестирование только двигательной активности по методике «открытое поле». Для контроля собственно действия N-ADA была протестирована группа животных, получивших внутрибрюшинную инъекцию N-ADA (6 мг/кг), но не подвергавшихся действию ОГБГ (табл. 2). 51 Таблица 2. Распределение групп животных и методик оценки антигипоксического действия N-ADA in vivo Название группы Тест «Открытое поле» ОГБГ Количество животных + Тест «Водный лабиринт Морриса» - Интактные - 10 N-ADA, 6 мг/кг + + - 10 Контроль (физ.раствор) + + + 10 Контроль 2 (растворитель) + + + 10 Группа сравнения (реамберин) + + + 10 N-ADA, 2,5 мг/кг + + + 13 N-ADA, 6 мг/кг + + + 10 N-ADA, 10 мг/кг + + + 13 N-ADA, 6 мг/кг + SR141716A N-ADA, 6 мг/кг + SR144528 N-ADA, 6 мг/кг + капсазепин + + + 10 + + + 10 + + + 10 2.3 Культивирование первичных диссоциированных клеток гиппокампа Диссоциированные клетки гиппокампа культивировали в течение 21-28 дней in vitro (DIV). Для исследования спонтанной биоэлектрической активности культуры выращивали на мультиэлектродных матрицах систем MEА60 (Multichannel Systems, Германия) и MED64 (AlfaMed Science, Япония). Для 52 исследования кальциевой активности и проведения иммуноцитохимических исследований клетки культивировали на покровных стеклах размером 18х18 мм, для оценки жизнеспособности культур – на 48-луночных планшетах (Сostar). Перед извлечением гиппокампа беременную мышь (Е18) эвтаназировали дислокацией шейных позвонков, извлекали матку с эмбрионами, из каждого эмбриона выделяли головной мозг, который помещали в стерильный раствор Хенкса. После извлечения гиппокампов их механически измельчали, измельченную ткань подвергали ферментативной обработке, помещая ее в 0,025% растворе трипсина на 20 мин в СО2-инкубатор при 35,5оС, затем тщательно промывали в фосфатном буфере, суспендировали пастеровской пипеткой в питательной среде: 92,5% нейробазальной среды NBM (Neurobasal medium, Invitrogen, США), 5% эмбриональной телячьей сыворотки FCS (ПанЭко, Россия), 2% биоактивной добавки B27 (Invitrogen, США) и 0,5% L-глутамина (Invitrogen, США), центрифугировали 1 мин при 1500 об/мин, удаляли супернатант, осажденную ткань промывали питательной средой и ресуспендировали. Полученную суспензию клеток использовали для культивирования на квадратных покровных стеклах (18х18 мм), помещенных в чашки Петри диаметром 30 мм, в 48-луночных планшетах или на мультиэлектродных матрицах, предварительно обработанных адгезивным субстратом (полиэтиленимином) в концентрации 0,5 мг/мл. В центр каждого стекла, лунки или матрицы наносили по 40 мкл суспензии и через 2 часа, после прикрепления клеток к субстату, к ним добавляли по 1 мл питательной среды. Культуры помещали в СО2-инкубатор (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при температуре 35,5оС. Через день после посадки половину среды во всех культурах заменяли на среду с низким содержанием сыворотки (94,5% NBM, 4% B27, 1% L-glutamin, 0,5% FCS). Каждые 3 дня в культурах на стеклах, в планшетах и на матрицах объем питательной среды по мере необходимости доводили до исходного (Мухина с соавт., 2009). 53 2.4 Методы оценки сетевой активности нейронов in vitro 2.4.1 Спонтанная биоэлектрическая активность 2.4.1.1 Мультиэлектродные матрицы MED64 и MEA60 Мультиэлектродная система MED64, основанная на технологии плоских микроэлектродов, позволяет непрерывно и неинвазивно регистрировать от различных участков препарата спонтанную и вызванную биоэлектрическую активность нейронов в виде внеклеточных потенциалов. Благодаря низкому импедансу микроэлектродов, регистрация активности осуществляется с низким уровнем шума. Мультиэлектродная система состоит из четырех компонентов: усилитель, зонд, коннектор, и набор программного обеспечения Conductor™ для получения данных. Стеклянное основание зонда (50x50x0,7мм) содержит цилиндрическую камеру диаметром 22 мм и высотой 5 мм, в центре которой на площади 1 мм2 расположена активности 64-электродная и матрица электрической для стимуляции регистрации спонтанной нейронов. Квадратные микроэлектроды состоят из прозрачного оксида индия и олова (Indium Tin Oxide, ITO), покрытого черной платиной (рис. 6). Размер электродов – 50х50 мкм, межэлектродное расстояние – 100 мкм. Изолирующее покрытие – полиакриламид. В возбужденном состоянии нейроны создают потоки ионов через мембраны, изменяя напряжение внутри и снаружи клетки. При регистрации активности нейронов электроды на MEA преобразовывают изменение напряжения окружающей среды (ионные потоки) в потоки, переносимые электронами (электрический ток). 54 Рисунок 6. Общий вид подложки с электродами, расположение электродов на мультиэлектродной матрице MED64 (Alfa Med Science, Япония) и их структура (пояснения в тексте) При регистрации электрической активности амплитуда потенциала на электроде находится в обратной зависимости от расстояния от этого электрода до клетки, продуцирующей потенциал. Таким образом, клетки по возможности должны находиться к электроду как можно ближе, что в случае диссоциированных культур достигается применением опорного субстрата, усиливающего адгезию клеток, например, полиэтиленимина. Второй использованной мультиэлектродной системой являлась MEA60 (Multichannel Systems, Германия) – аналог системы MED64, состоящий из 60 планарных круглых электродов, каждый диаметром 30 мкм, с межэлектродным расстоянием 200 мкм. Электроды сделаны из нитрида титана и изолированы нитридом кремния, что позволяет MEA60 подвергать стерилизации при высоких температурах перед посадкой культур и использовать их длительное время. 2.4.1.2 Регистрация и анализ спонтанной сетевой биоэлектрической активности нейронов Спонтанную биоэлектрическую активность нейронов регистрировали с использованием мультиэлектродной системы MED64 и MEA60 при 55 стандартных условиях окружающей среды: температура, содержание углекислого газа и кислорода, влажность. Для получения данных использовали набор программного обеспечения Conductor™ (Alpha Med Science, Япония) и MC RackTM (Multichannel Systems, Германия). Анализ спонтанной активности нейронов производили с использованием программы MATLAB и оригинального пакета алгоритмов MEAMAN. Детектирование спайков (внеклеточных потенциалов действия) шло по следующему алгоритму: среднеквадратичное выбиралась число. Если граница амплитуда равная 8σ, спонтанной где σ – активности превышало это число, то считалось, что данное событие – спайк, если не превышало, активность распознавалась как шум и не учитывалась при анализе данных. Далее по определенным алгоритмам программа детектировала количество пачек спайков в записи, высчитывала средний межпачечных интервал, среднее количество спайков в пачке, среднюю длительность пачки. Для разделения различных этапов записи программа снабжена функцией удаления спайков за определенный промежуток времени. 2.4.2 Функциональный кальциевый имиджинг Для имиджинговых исследований функциональной активности по параметру изменений [Ca2+]i, отражающих функциональное состояние кальциевого гомеостаза клеток, использовался лазерный сканирующий микроскоп LSM 510 (Zeiss, Германия). Методика позволяла визуализировать функциональную архитектуру нейрональной сети культуры на клеточном уровне. В качестве флуоресцентных зондов были выбраны специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 BAPTA-1 АМ (OGB1) (Invitrogen) с константой диссоциации Кd=170 нМ, возбуждаемый линией излучения аргонового лазера 488 нм, и Са2+-нечувствительный краситель Sulforhodamine 101 (SR101) (Sigma), возбуждаемый излучением гелийнеонового лазера 543 нм, селективно маркирующий глиальные клетки 56 (Nimmerjahn et al., 2004; Paredes et al., 2008). Эти длины волн близки к максимумам спектров поглощения соответствующих красителей. Излучение флуоресценции разделялось по каналам регистрации с помощью дихроичных зеркал и светофильтров с полосой пропускания 650-710 нм для выделения флуоресценции SR101 и 500-530 нм для выделения флуоресценции OGB1 (Митрошина с соавт., 2011). Регистрировались временные серии изображений поля флуоресценции красителей Sulfophodamine 101 (SR101) как глиального маркера, и OGB1 как индикатора свободного кальция. Первичная обработка полученных изображений заключалась в разделении спектров этих красителей в разные каналы регистрации для идентификации нейрональных и глиальных клеток и записи функции F(t) средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Интенсивность флуоресценции (усл. ед.) показывала [Ca2+]i зависимость от времени, свидетельствующую о метаболической активности клеток, связанных в сети определенной архитектуры. Выделение кальциевых осцилляций, полученных при помощи флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с использованием оригинального записи программного функции F(t) пакета средней «Astroscanner». интенсивности Анализировались флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Для определения времени начала (Tstart) и конца (Tend) осцилляции был взят порог отклонения от среднего значения в размере стандартной квадратичной ошибки F(t). Отмечалось также время достижения максимальной интенсивности флуоресценции (Tmax) для каждой осцилляции. Учитывались следующие параметры: длительность достижения максимума (длительность «фронта» осцилляции), общая длительности осцилляции и интервалы между максимумами (Митрошина с соавт., 2011; Захаров с соавт., 2012; Zakharov et al., 2013). 57 Исследование влияния N-ADA на спонтанную кальциевую активность проводилось на 21-й DIV после 10-минутного гипоксического воздействия. Опытным группам при замене среды на гипоксическую, при реоксигенации и на следующие сутки проводилась аппликация N-ADA в разных концентрациях, а также аппликация N-ADA в сочетании с антагонистами CBR. К контрольной группе культур исследуемые вещества не добавлялись. В интактной группе осуществлялась полная смена нормоксической среды. Функциональный кальциевый имиджинг проводился во время моделирования гипоксии и на 7 сутки постгипоксического периода (табл. 1). 2.5 Иммуноцитохимические методы Для характеристики состояния ЭКС при гипоксии в культуре клеток гиппокампа было проведено иммуноцитохимическое маркирование CBR-1 и CBR-2. Для маркирования CBR-1 использовались первичные кроличьи антитела (Аbcam) и вторичные козьи антитела, конъюгированные с Alexa 555 (Invitrogen), для маркирования CBR-2 – первичные козьи антитела (Sigma) и вторичные куриные антитела, конъюгированные с Alexa 555 (Invitrogen). Для идентификации глиальных клеток использовали первичные куриные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (Аbcam) и вторичные ослиные антитела, конъюгированные с Alexa 430 (Invitrogen). Нейроны маркировались мышиными антителами к белку цитоскелета MAP2 (Millipore) и вторичными ослиными антителами, когъюгированными с Alexa 647 (Invitrogen). После 15-минутной фиксации в 4% параформальдегиде культуры трижды отмывали фосфатным буферным раствором (PBS) (Sigma), затем в течение 30 минут проводили демаскирование антигенов 0,03% раствором тритона Х100. После демаскировки культуры гиппокампа в течение 2 часов инкбировали во влажной камере с раствором первичных антител с 1% бычьим сывороточным альбумином при комнатной температуре. Затем после 58 трехкратной промывки PBS культуры в течение 2 часов инкубировали с раствором вторичных антител с 5% бычьим сывороточным альбумином во влажной камере. После отмывки вторичных антител проводили визуализация полученных результатов. Для визуализации использовали конфокальный микроскоп LSM 510 (Zeiss, Германия). Максимальное значение коэффициента поглощения флуоресцентного маркера Alexa 647, с помощью которого визуализовались нейроны, регистрировалось при длине волны 647 нм, излучения – 668 нм. Флуоресценция маркера возбуждалась излучением аргонового лазера 633 нм выделялась полосовым светофильтром 650 - 710 нм и отображалась на экране монитора красным цветом. Для Alexa 430 максимальное значение коэффициента поглощения регистрируется при длине волны 434 нм, излучения – 539 нм. Флуоресценция маркера возбуждалась излучением гелий-неонового лазера 543 нм, выделялась полосовым светофильтром 500530 нм и выводилась на экран синим цветом. Для Alexa 555 максимальное значение коэффициента поглощения регистрируется при длине волны 555 нм, излучения – 565 нм. Флуоресценция возбуждалась излучением аргонового лазера 488 нм, выделялась полосовым светофильтром 500-550 нм и выводилась на экран зеленым цветом. Для исследования влияния N-ADA на экспрессию CBR при гипоксии, кульуры на покровных стеклах на 21-й DIV подвергали 10-минутному гипоксическому воздействию. В культуры опытных групп при замене среды на гипоксическую, при реоксигенации и на следующие сутки вводили NADA 10 мкМ. К культуры контрольной группы исследуемые вещества не добавлялись. В интактной группе осуществляли полную смену нормоксической среды. Иммунногистохимическое окрашивание проводили на 7 сутки постгипоксического периода (табл. 1). Для анализа полученных иммуноцитохимических результатов использовали программу ImageJ, для статистической обработки данных SigmaPlot 11.0. 59 2.6 Оценка жизнеспособности культивируемых клеток в диссоциированной культуре Оценка жизнеспособности клеток, культивируемых в 48-луночных планшетах, проводилась в период нормоксии (21 DIV) и через 1, 3, 7 и 10 суток после гипоксического воздействия. В культуры опытных группа при замене среды на гипоксическую, при реоксигенации и на следующие сутки добавляли N-ADA в разных концентрациях, а также N-ADA в сочетании с антагонистами CBR. В культуры контрольной группы исследуемые вещества не добавлялись. Для оценки жизнеспособности культур их окрашивали пропидий иодидом (Sigma) и бис-бензимидом (Sigma) с целью идентификации ядер погибших клеток и общего количества клеток в культуре, соответственно. С помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа DMIL HC (Leica, Германия) осуществлялся подсчет числа клеточных ядер, окрашенных пропидий иодидом и бис-бензимидом. Максимальный коэффициент поглощения у пропидий иодида регистрировался при 488 нм, флуоресцирует данный краситель в красной области спектра, максимум эмиссии составляет 562-588 нм. Максимальный коэффициент поглощения бис-бензимида регистрировался при 350 нм, флуоресценция регистрировалась в диапазоне 510-540 нм. Количество живых клеток рассчитывалось как разница между числом бис-бензимид-позитивных и пропидий иодид-позитивных клеток (Ведунова с соавт., 2012, 2013). 2.7 Моделирование нормобарической гипоксии in vitro Гипоксию in vitro моделировали на 21-й DIV путем замены на 10 минут нормоксической культуральной среды на среду без кислорода. Для вытеснения кислорода из среды ее насыщали инертным газом аргоном, 60 способным вытеснять кислород из жидкостей за счет большей растворимости по сравнению с кислородом. Химическая инертность аргона обеспечивает адекватные условия для проведения эксперимента. Аргон подавали из баллона по газоотводной трубке с иглой на конце, под давлением 1-1,5 МПа, течение 10 мин в среду, помещенную в герметичный сосуд. Для того, чтобы в сосуде не накапливалось избыточное давление, выше уровня жидкости находился конец второй иглы, соединенной с выводящей газоотводной трубкой. Концентрация растворенного кислорода в среде определяли методом йодометрического титрования (метод Винклера) (Лурье, 1973). Данный метод основан на способности гидроксида марганца (II) окисляться в щелочной среде до гидроксида марганца (IV), количественно связывая при этом кислород. В кислой среде гидроксид марганца (IV) снова переходит в двухвалентное состояние, окисляя при этом эквивалентное связанному кислороду количество йода. Выделившийся йод оттитровывают раствором тиосульфата натрия в присутствии крахмала в качестве индикатора. При насыщении среды инертным газом содержание кислорода снижалось с 3,26 мл/л (нормоксия) до 0,37 мл/л (гипоксия). Для предотвращения насыщения среды кислородом воздуха, культуры помещали в гипоксическую камеру, представляющей собой пластиковую чашку Петри (Corning) диаметром 100мм с двумя вмонтированными пластиковыми штуцерами для подключения газовых шлангов. Для герметизации нижняя часть чашки Петри проклеена уплотнительной резиной. К первому штуцеру присоединен шланг, который через редуктор соединен с газовым баллоном. Ко второму штуцеру присоединен газоотводный шланг. После замены нормоксической среды на гипоксическую культуру помещали в камеру, после чего в течение 1 мин через камеру пропускали аргон при открытом газоотводном шланге. Затем перекрывали сначала газоотводный шланг, а потом шланг, по которому поступал аргон. В таком положении камера с помещенной в нее клеточной культурой оставалась еще на 9 минут. Суммарное время гипоксичекого 61 воздействия составляло 10 минут. Затем культуру извлекали из камеры и заменяли гипоксическую среду на нормоксическую (Ведунова с соавт., 2012, 2013). Исследуемые вещества добавляли в гипоксическую среду при гипоксии и в течение первых суток после нее. Параметры спонтанной биоэлектрической активности, характеризующие реакцию нейронов на гипоксию, регистрировали сразу после реоксигенации, через 2 часа и каждые 24 часа в течение 7 дней после гипоксии. 2.8 Моделирование острой гипобарической гипоксии in vivo Для моделирования острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) in vivo использовалась вакуумная проточная барокамера при внешней температуре 20-22оС. Мыши помещались в условия, соответствующие подъему на высоту 10000—10500 м со скоростью 183 м/с (Мет. рекомендации...... под ред. Лукьяновой, 1990). Регистрируемыми параметрами являлись: 1. Время жизни (Тж, мин) на «смертельной площадке», отсчитывается от момента подъема на площадку до наступления летального исхода, либо появления второго агонального вдоха; 2. Время потери позы (Тпп, мин), период от начала подъема в барокамере до момента, когда животное принимает боковое положение и утрачивает способность поддерживать позу; 3. Время восстановления позы (Твп, мин), период времени от остановки дыхания до момента, когда животное при немедленном «спуске» на землю снова приобретает способность стоять на конечностях; 4. Коэффициент защиты (Кз), рассчитываемый по выживаемости животных, оценивается по количеству животных, которые выдержали пребывание на «смертельной площадке» в течение 10 мин 62 Кз = (а/б+1)/(в/д+1), где а и б — число выживших животных в опытной и контрольной группах, в и д — общее число животных в опытной и контрольной группах соответственно (Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств, 1990). При моделировании ОГБГ в популяции животных встречались особи, низкоустойчивые к гипоксии (НУ) с Тж менее 3 мин, среднеустойчивые с Тж от 3 до 9 мин и высокоустойчивые, которые выживал на «высоте» более 10 мин без видимых проявлений гипоксического повреждения. Эффективность антигипоксически свойств оценивали по изменению времени жизни опытных животных на «смертельной площадке» относительно времени жизни контрольных животных. 2.9. Методы оценки антигипоксического и нейропротекторного действия исследуемого соединения при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo 2.9.1 Тест «открытое поле» Установка для теста «открытое поле» представляет собой круглую камеру диаметром 90 см с пластиковыми стенками высотой 28 см. Пол изготовлен из белого пластика, на нем черной краской нанесена решетка, делящая его на 25 равных квадратов со стороной 15 см. Лампы накаливания (4 лампы по 75 Вт) располагаются по кругу диаметром 60 см на высоте 80 см от поверхности поля. Освещенность площадки во время опыта 200 Лк. 63 Животное помещалось в центральный квадрат и за ним велось наблюдение. Визуально подсчитывалось количество отдельных поведенческих актов (Буреш с соавт., 1991). С целью определения ориентировочно-исследовательской активности животных в «открытом поле» регистрировались следующие показатели поведенческой активности мышей: горизонтальная двигательная активность (ГДА) – число пересеченных квадратов в «открытом поле»; вертикальная двигательная активность (ВДА) – число стоек–подъемов на задние лапы. Также отмечались реакции принюхивания, замирания, верчения, пячения, акты груминга и дефекации. 2.9.2 Тест «Водный лабиринт Морриса» Для оценки способностей животных к формированию и сохранению пространственной долговременной памяти применялось тестирование в водном лабиринте Морриса. Лабиринт представляет собой циркулярный бассейн (диаметром 90 см), заполненный непрозрачной водой, в которую погружена небольшая платформа (диаметром 10 см), не видимая животному. Протокол теста состоял из пяти сеансов обучения, по пять попыток в каждом. Сеансы проводились в одно и то же время суток через 48 часов. Помещение животных с края бассейна в течение всего эксперимента производилось в одном и том же секторе лабиринта, выбранного случайным образом. Максимальная длительность первого сеанса составляла 90с. В том случае, если животное не могло самостоятельно найти платформу, экспериментатор помогал ему. После обнаружения платформы животное находилось на ней 30с. Последующие 4 сеанса по продолжительности составляли 60с. В случае не обнаружения платформы животное вынималось из бассейна и находилась за границами лабиринта в течение 30 с. Расположение платформы за все время проведения теста не менялось и находилось в противоположном от запуска животного секторе на границе зоны тигмотаксиса (Morris, 1982; 64 Morris, 1984; Dalm et al. 2000). Установка для видеорегистрации движения животного представляет собой видеокамеру, расположенную над бассейном. Камера фиксирует треки животного. Эта информация подается на персональный компьютер и сохраняется в виде avi-файлов. Проводится видеорегистрация траектории движения и компьютерный анализ данных. Через 24 часа после окончания обучения животные подвергались острой гипобарической гипоксии, через сутки после которой проводили тестирование на сохранение долговременной памяти. Тест состоял из одной пробы длительностью 60 с. При этом платформа в лабиринте отсутствовала. Определяли отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти (оКс), представляющий собой долю времени пребывания мыши в квадранте, где находилась платформа, по отношению в общему времени пребывания в водном лабиринте Морриса. При этом считается нормой, если животное провело в квадранте, где находилась платформа, около 25% общего времени пребывания в лабиринте (D’Hooge R. & De Deyn P.P, 2001). Анализ данных выполнялся с помощью разработанного в программной среде Matlab оригинального пакета алгоритмов MouseTrack и Traceman. При оценке результатов значимыми считались следующие показатели: время достижения платформы, траектория свободного плавания при поиске платформы. 2.10 Статистическая обработка результатов Полученные результаты in vivo и in vitro обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel, и SigmaPlot 11.0. Данные представлены в форме "среднее значение ± стандартная ошибка среднего". Проверка гипотезы о нормальном распределении проводилась с применением критерия Пирсона, который не зависит ни от вида распределения случайной величины, ни от ее размерности. Достоверность статистических различий выборок, имеющих нормальное распределение, 65 проверялась с помощью t-теста Стьюдента. Различия между выборками, имеющими распределение, отличающееся от нормального, оценивались с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни в программе SigmaPlot 11.0. Различия между выборками считались статистически значимыми при p < 0,05. 66 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия N-арахидоноилдофамина при моделировании гипоксии in vitro 3.1.1 Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии На 21–й DIV в культурах наблюдалась стабильная спонтанная сетевая биоэлектическая активность. В течение 10-минутной гипоксии происходило значительное (более чем в 6 раз) снижение спонтанной активности, тогда как реоксигенация вызывала ее усиление. Во время острой 10 минутной нормобарической гипоксии происходило снижение числа пачек с 25,03±6,12 за 10 минут до 4,28±1,52 (р<0,05). В период реоксигенации спонтанная биоэлектрическая активность значительно усиливалась, число малых сетевых пачек составило 68,5±19,87, что достоверно выше исходных значений (рис. 7). В дальнейшем в постгипоксическом периоде происходило необратимое достоверное снижение пачечной активности вплоть до ее практически полного прекращения к 7-м суткам, что свидетельствует о нарушении синаптических связей в сети, формирующей индивидуальный характер функционирования каждой культуры. Через 1 сутки после гипоксического воздействия количество малых сетевых пачек импульсов за 10 минут снижалось с 25,03±6,12 до 3,89±2,1, а через 7 суток – до 1,52±0,75. Главной причиной угнетения спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети во время гипоксии является недостаточность энергетических субстратов, необходимых для поддержания активного метаболизма клеток. Резкое падение парциального давления кислорода приводит к разобщению процессов окислительного фосфорилирования в 67 митохондриях, и, как следствие, происходит снижение синтеза АТФ (Проблемы гипоксии, 2004). Гликолиз не может удовлетворить энергетические потребности нейрона. Рисунок 7. Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (количество малых пачек импульсов за 10 минут), 21-28 DIV: 1 – до гипоксии, 21 DIV; 2 – гипоксия, 21 DIV; 3 -10 мин реоксигенации, 21 DIV; 4 – 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5 – 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 – 7 сутки после гипоксии, 28 DIV. * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни Повышенная сетевая активность нейронов после реоксигенации может быть связана с усиленным высвобождением возбуждающего нейротрансмиттера глутамата из пресинаптических терминалей пирамидных нейронов в составе сети, либо со снижением активности тормозных ГАМКергических нейронов. Усиление высвобождения глутамата, вероятно, обусловлено стимуляцией экзоцитоза повышенной [Cа2+]i в пресинаптических терминалях в результате его выброса из внутриклеточных депо, в частности, из деполяризованных при гипоксии митохондрий 68 (Stelmashook, 2010). Известно, что усиление выброса глутамата является критическим фактором развития эксайтотоксичности, опосредуемой повышением [Cа2+]i в постсинаптической клетке и запуском каскада патологических метаболических реакций, приводящих к гибели нейронов (Iwabuchi et al., 2013). Кроме того, недостаток кислорода стимулирует процессы свободно-радикального окисления в клетке, что может стать основной или дополнительной причиной гибели клетки при реоксигенации. Следует отметить, что структура малых сетевых пачек достоверно изменялась только в отдаленном постгипоксичеком периоде. Количество спайков в малой сетевой пачке импульсов в период гипоксии, при реоксигенации и через 2 часа после гипоксического воздействия изменялось незначительно, хотя наблюдалась тенденция к его увеличению (рис. 8). Через сутки после гипоксического воздействия число спайков в малой сетевой пачке достоверно снижалось (в 4-6 раз), в дальнейшем постгипоксическом периоде снижение количества спайков продолжалось и к 7 суткам постгипоксического периода число спайков в малых сетевых пачках импульсов снижалось в 10-20 раз относительно исходного уровня. Длительность пачек также практически не изменялась во время острой гипоксии и в период реоксигенации, существенных изменений не наблюдалось вплоть до 7 суток постгипоксического периода (рис. 9), когда происходило ее достоверное снижение (исходная длительность малой сетевой пачки импульсов составляла 0,18±0,61 с, а через 7 суток после гипоксии – 0,05±0,03 с). Аппликация N-ADA в концентрации 10 мкМ предотвращала нарушение биоэлектрической активности. Во время гипоксии количество сетевых пачек в присутствии N-ADA также достоверно снижалось относительно исходного уровня (9,58±2,1 пачки/10 мин), однако в период реоксигенации их число не отличалось от аналогичного показателя в культурах, не подвергавшихся гипоксии (рис.7). 69 Рисунок 8. Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (количество спайков в пачке), 21-28 DIV: 1 – до гипоксии, 21 DIV; 2 – гипоксия, 21 DIV; 3 – 10 мин реоксигенации, 21 DIV; 4 – 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5 – 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 – 7 суток после гипоксии, 28 DIV. * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни Вероятно, аппликация N-ADA предотвращала гиперактивацию нейронных сетей во время реоксигенации, поскольку механизм DSE ингибировал чрезмерный выброс возбуждающих нейромелиаторов, что позволяло клеткам сохранять свои энергетические ресурсы. В постгипоксическом периоде N-ADA поддерживал спонтанную биоэлектрическую активность нейронов, так что она по своим параметрам статистически не отличалась от исходного уровня (20,1±5,67 пачек/10 мин), в то время как в контрольных культурах уже на 1 сутки число пачек имульсов было достоверно ниже, чем до гипоксии. На 7 сутки постгипоксического периода количество малых сетевых пачек в группе опытных культур, которым апплицировался N-ADA 10 мкМ, достоверно снижалось по сравнению с исходными значениями, однако оставалось существенно выше, чем в отсутствие N-ADA (8,66±2,01 и 70 1,5±0,27, соответственно). Кроме того, N-ADA предотвращал изменение длительности сетевой пачки и среднего числа спайков в пачке (рис. 8 и 9), как минимум, в течение 7 суток после гипоксического воздействия. Рисунок 9. Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (длительность пачек импульсов), 21-28 день in vitro: 1 – до гипоксии, 21 DIV; 2 – гипоксия, 21 DIV; 3 – 10 мин реоксигенации, 21 DIV; 4 – 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5 – 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 – 7 сутки после гипоксии, 28 DIV. * различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни Построение графиков спайковой активности и растровых диаграмм, отражающих моменты возникновения спайков на электродах матрицы, позволило установить, что количество спайков в пачке за 50 мс в контрольных культурах через 24 часа после гипоксии в среднем статистически достоверно снижается относительно исходного уровня в 3,8 раза (р<0,05, критерий Манна-Уитни), с тенденцией к уменьшению длительности сетевой пачки импульсов (рис. 10). 71 Рисунок 10. Количество спайков за 50 мс (сверху) и растровые диаграммы спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа (снизу). А - контрольная культура; Б – культура с аппликацией N-ADA, 10 мкМ При гипоксии в присутствии N-ADA наблюдалось лишь незначительное (менее, чем на 30%) снижение количества спайков за 50 мс относительно исходной активности нейронов через сутки после гипоксии, тогда как длительность пачки оставалась неизменной. Таким образом, аппликация 10 мкМ N-ADA предотвращает вызванные гипоксией изменения структуры сетевой пачки импульсов и, следовательно, способствует сохранению паттерна функциональной активности нейронной сети. При аппликации N-ADA в концентрациях как 10, так и 2,5 мкМ во время гипоксии и в первые сутки после нее негативное влияние гипоксии и реоксигенации на спонтанную биоэлектрическую активность снижалось (рис. 11). 72 Рисунок 11. Показатели спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа относительно исходного уровня, принятого за 100% (количество пачек импульсов за 10 минут), 21-28 день развития in vitro: 1 – интактные; 2 – контроль; 3 – N-ADA 2,5 мкМ; 4 – N-ADA 10 мкМ; 5 – NADA+SR1; 6 — N-ADA+SR2; 7 - N-ADA+ Сpz; * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни Данный эффект проявлялся в сохранении пачечной активности сети как в первые сутки постгипоксического периода, так и в последующий отдаленный период. Через сутки после гипоксии число пачек снижалось всего на 40% и 41% при использовании обеих концентраций N-ADA (в контрольных культурах число пачек снизилось в 5 раз). На 7 сутки при применении N-ADA в концентрации 10 мкМ число пачек уменьшалось в 4 раза и составило 25,74±9,89% относительно исходного уровня, а при концентрации 2,5 мкМ – в 10,41±2,76% (в контрольных культурах уровень сетевой биоэлектрической активности на 7 сутки постгипоксического периода составил 6,01±1,2% от исходного). Гипоксия/реоксигениция вызывала достоверное уменьшение среднего числа спайков в пачке в первые сутки после гипоксии более чем на 75% (рис. 12). 73 Рисунок 12. Показатели спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа относительно исходного уровня, принятого за 100% (среднее количество спайков в пачке), 21-28 день развития in vitro: 1 – интактные; 2 – контроль; 3 – N-ADA 2,5 мкМ; 4 – N-ADA 10 мкМ; 5 – NADA+SR1; 6 — N-ADA+SR2; 7 - N-ADA+ Сpz; * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни При концентрациях N-ADA 2,5 и 10 мкМ уменьшение среднего числа спайков в пачке на 1 сутки после гипоксии составляло 39,28% и 42,87%, соответственно. К седьмым суткам при 10 мкМ N-ADA отмечалось некоторое увеличение количества спайков в пачке, в то время как при 2,5 мкМ N-ADA продолжалось неуклонное снижение числа спайков (их число составило 26,25% от исходного уровня). N-ADA может взаимодействовать с тремя типами рецепторов: CBR-1, CBR-2 и TRPV1. антигипоксического Вклад каждого эффекта типа N-ADA рецепторов (10 мкМ) в реализацию исследовался с использованием их селективных антагонистов: SR141716A (для CBR-1), SR14452 (для CBR-2) и капсазепина (для TRPV1). Спонтанная 74 биоэлектрическая активность в данной серии экспериментов регистрировалась на 1 и 7 сутки после гипоксии. Антагонисты CBR-1, CBR-2 и TRPV1 в интактной культуре клеток гиппокампа не оказывали влияния на активность сети. При гипоксии блокада CBR-1 антагонистом SR141716A (1мкМ) устраняла защитный эффект NADA, что выражалось в уменьшении количества малых сетевых пачек импульсов в 10 минут на 1 сутки после гипоксии более чем вдвое и составило 34,3±6,7% от исходного уровня, а на 7 сутки активность полностью отсутствовала (рис. 11). Капсазепин частично снижал антигипоксический эффект N-ADA. Через сутки после гипоксии с аппликацией N-ADA и капсазепина число пачек сетевых импульсов существенно (в 10 раз) снижалось и составляло 6,68±2,5% исходного уровня активности, однако дальнейшего торможения активности не происходило и далее ее уровень сохранялся неизменным вплоть до 7 суток постгипоксического периода. При блокаде CBR-2 антигипоксический эффект N-ADA сохранялся, уровень пачечной активности составил 70,1±14,5% от исходного на 1 сутки и 31,4±8,2 % на 7 сутки постгипоксического периода, что статичтисечки не отличается от группы N-ADA 10 мкМ. Интересно отметить, что блокада CBR-1 приводила при реоксигенации к резкой активации нейронной сети, что выражалось в виде увеличения количества и частоты спайков в пачке при снижении количества пачек, а в дальнейшем к полному исчезновению биоэлектрической активности (рис. 12). Мы предполагаем, что защитное действие N-ADA связано с предотвращением чрезмерного выброса возбуждающего нейромедиатора глутамата при гипоксии. При блокаде CBR-1 не происходит ретроградного ингибирования выброса глутамата из пресинаптических терминалей, нейронная сеть гиперактивируется. Чрезмерная стимуляция нейронов, очевидно, приводит к истощению энергетических ресурсов клетки и запуску каскада метаболических реакций, вызывающих гибель клетки. 75 Блокада CBR-2 при гипоксии достоверно снижала спонтанную биоэлектрическую активность (уменьшение количества спайков в малой сетевой пачке более, чем в 10 раз), однако активность сохранялась в течение всего срока наблюдения (7 суток после гипоксии) (рис. 11 и 12). Таким образом, устранение эффекта N-ADA было лишь частичным. Блокада TRPV1, также как и CBR-2, приводило к достоверному снижению активности нейронов и изменению ее паттерна (рис. 12), но в меньшей степени, чем при блокаде CBR-1. Количество спайков в пачке и их частота уменьшалось на 45,83% и 40,76% на первые сутки и на 52,13% и 36,76% на седьмые сутки, соответственно. Поскольку реализация антигипоксических и нейропротекторных свойств N-ADA полностью ингибируется при блокаде CBR-1, можно предположить, что ключевым молекулярным механизмом в реализации данного эффекта является ретроградное ингибирование выброса глутамата из пресинаптических терминалей по механизму DSE (Kreitzer, Regehr, 2001; Szabo, 2008; Castillo et al., 2012). Активация CBR-1 играет решающую роль в предотвращении нейротоксичности, вызванной активацией глутаматных рецепторов к N-метил-D-аспартату (NMDA-Rs). Данный тип нейротоксичности является одним из важных молекулярных путей запуска ее механизмов при гипоксическом повреждении нервной системы (Won et al., 2012; Mehta et al., 2013). Предотвращая активацию NMDA-Rs путем ингибировая выброса глутамата из пресинаптических терминалей, активация CBR-1 контролирует кальциевые токи, не допуская повышения концетрации кальция до цитотоксического уровня. Следовательно, каннабиноиды, и в том числе N-ADA, могут контролировать уровень активации NMDA-Rs. Одним из аспектов физиологической роли каннабиноидной системы является поддержание NMDA-Rs-активности в безопасных пределах, тем самым осуществляется защита нервных клетки от эксайтотоксичности (SánchezBlázquez et al., 2014). 76 Таким образом, проведенные нами исследования возможных механизмов действия N-ADA на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей в культуре клеток гиппокампа при острой нормобарической гипоксии показало, что все три типа рецепторов участвуют в реализации антигипоксического эффекта, однако ключевую роль играет активация CBR1, блокада которых на фоне введения N-ADA приводит к полному устранению антигипоксического эффекта каннабиноида. 3.1.2 Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии На 21-й день синхронизованная in vitro спонтанная в клетках кальциевая гиппокампа наблюдалась активность. Частота возникновения кальциевых осцилляций в нейронной сети составляла 6,83±1,78 осцилляций в 1 мин. Активность проявляло 83,9±5,57% клеток. При замене нормоксической культуральной среды на гипоксическую (0,37 мл/л О2) происходило снижение спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа вплоть до практически полного ее исчезновения к 3-й минуте наблюдения. Активность сохраняли всего 5,01±1,84 % клеток, частота осцилляций составила 0,14±0,03 осцилляции в минуту. После реоксигенации активность возобновлялась, однако процент активных клеток был существенно ниже, чем до гипоксического воздействия (22,1±7,2%) (рис.13). 77 Рисунок 13. Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа при моделировании гипоксии: А - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида) Б - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ) Антигипоксический эффект N-ADA проявлялся в частичном сохранении спонтанной кальциевой активности во время гипоксии и нормализации кальциевой активности в постгипоксическом периоде. Во время гипоксического воздествия активность сохраняло 24,5±6,91% клеток, изначально проявляющих активность. Частота кальциевых осцилляций во время гипоксического воздействия снизилась в пять раз (с 6,83±1,78 до 1,3±0,23 осцилляций в минуту). В период реоксигенации уровень кальциевой активности в группе культур, получавших аппликацию N-ADA 10 мкМоль во время гипоксии не отличался от контрольной группы. 78 Оценка гипоксического воздействия на кальциевую активность в отдаленном постгипоксическом периоде проводилась на 7 сутки после гипоксии. Доля клеток в поле зрения, в которых регистрировались спонтанные кальциевые осцилляции, через 7 суток после острой гипобарической гипоксии снижалось с 69,3±5,57 % до 19,06±7,0%. клеток (рис. 14). Рисунок 14. Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность клеток гиппокампа через 7 суток после острой нормобарической гипоксии. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, критерий Манна-Уитни # статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, критерий Манна-Уитни. Применение N-ADA 10 мкМ во время гипоксии и в первые сутки после него предотвращало потерю функциональной кальциевой активности клетками культур гиппокампа. В группе опытных культур, получавших аппликацию N-ADA, доля клеток, проявляющих кальциевую активность составила 56,37±8,69%, что достоверно больше, чем в контрольной группе культур, подвергшихся гипоксическому воздействию. Можно предположить, что существенное снижение уровня спонтанной кальциевой активности 79 связано с гибелью части нейронов в постгипоксическом периоде (см. раздел 3.1.3.), редукцией синаптических контактов и разрушением нейронных сетей. У 60% культур длительность и частота генерации кальциевых осцилляций клетками, сохранившими активность, после гипоксии существенно не изменялась, еще у 40% происходила существенная модификация формы кальциевых осцилляций. 10-минутная гипоксия в таких культурах вызывала достоверное увеличение длительности и уменьшение частоты кальциевых осцилляций в отдаленном постгипоксическом периоде, по сравнению с культурами, не подвергавшимися гипоксическому воздействию (рис. 15-16). Следует отметить, что увеличение длительности осцилляций после гипоксического воздействия происходит за счет появления в профиле активности клеток «суперосцилляций», длительность которых составляет до 100 с (рис. 17). В группе культур, подвергавшихся гипоксическому воздействию, длительность суперосцилляций Обнаруженные нами изменения составила 89,19±8,04 секунды. спонтанной кальциевой активности подтверждают гипотезу о том, что изменение активности нейронной сети после гипоксического воздействия связано с действием концентраций возбуждающего нейромедиатора глутамата. высоких 80 Рисунок 15. Длительность кальциевых суперосцилляций в культуре клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии. # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии в отсутствие N-ADA, парный критерий Стьюдента Повышенная стимуляция глутаматных рецепторов приводит к накоплению в нейронах Са2+ в результате его усиленного поступления через ионные каналы и, соответственно, к стойкому повышению [Ca2+]i, что проявляется в развитии суперосцилляций. Соответственно увеличению длительностей осцилляций, также отмечается уменьшение их частоты. Такие суперосцилляции могут быть разными по продолжительности, их характеризует временное повышение базовой [Ca2+]i, на фоне которого происходит несколько спонтанных осцилляций. Подобные суперосцилляции наблюдаются в ходе дифференцировки культур, однако их длительность не превышает 45-50 секунд (Митрошина с соавт., 2011, Широкова с соавт., 2013). 81 Рисунок 16. Параметры спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии: А - длительность кальциевых суперосцилляций Б - частота возникновения Са2+ осцилляций в культурах клеток гиппокампа. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, парный критерий Стьюдента, # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, парный критерий Стьюдента Аппликация N-ADA при гипоксии и в первые сутки после нее оказывает дозозависимый нейропротекторный эффект на кальциевую активность нейронных сетей. N-ADA в концентрации 2,5 мкМ не влияет на длительность суперосцилляций, а в концентрациях 6 и 10 мкМ достоверно уменьшает ее (41,37±2,03 с и 48,66±5,74 с, соответственно). 82 Рисунок 17. Характерные профили кальциевой активности нейронов на 7 день после моделирования гипоксии в культурах клеток гиппокампа. По оси абсцисс – время, с, по оси ординат – интенсивность флуоресценции, усл. ед.: 1 – интактные; 2 – контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида); 3 – N-ADA 2,5 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 2,5 мкМ; 4 – N-ADA 6 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 6 мкМ/л); 5 - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ/л) 83 О нормализации профиля кальциевой активности можно судить по приведенным ниже характерным растровым диаграммам (рис. 18), на котором штрихами отмечены моменты возникновения кальциевых осцилляций в клетках. Рис Рисунок 18. Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа: А - до гипоксии, 21 DIV; Б - через 2 часа после гипоксии, 21 DIV; В - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 6 мкМ N-АДА; Г - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 10 мкМ N-АДА. По оси ординат указан номер рассматриваемой клетки, по оси абсцисс - время. Моменты возникновения кальциевых осцилляций отмечены штрихами. Таким образом, применение N-ADA в концентрациях 6 мкМ и 10 мкМ позволяет нормализовать кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа в отдаленном постгипоксическом периоде. Можно 84 предположить, что в основе этого эффекта лежит реализация механизма DSE, описанного в обзоре литературы. Активация пресинаптических CBR тормозит пресинаптические кальциевые токи через потенциал-зависимые Са2+-каналы N- и P/Q-типов и в результате подавляется экзоцитоз глутамата, снижается вход кальция через постсинаптические NMDA рецепторы, что приводит к нормализации концентрации кальция в постсинаптическом окончании, зарегистрированной в наших экспериментах (Twitchell et al., 1997; Kano et al., 2009). 3.1.3 Влияние N-арахидоноилдофамина на выживаемость культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии Оценка соотношения живых и погибших клеток в культурах гиппокампа проводилась через 1, 3, 7 и 10 суток после гипоксического воздействия. Число живых клеток в интактных культурах на протяжении всего периода наблюдения практически не изменялось. Гипоксическое воздействие вызывало морфологические изменения и гибель культивируемых клеток. Уже через сутки после гипоксии число живых клеток в культурах, подвергнутых гипоксии, было достоверно ниже по сравнению с интактной группой (73,19±3,95% и 89,37±1,33%, соответственно). В течение последующих дней доля живых клеток в культурах, подвергавшихся гипоксическому воздействию, неуклонно снижалась и на 10 сутки составила 20,84±4,78% (рис. 19). Стоит отметить, что наиболее резкое снижение жизнеспособности клеток в культурах отмечалось между 7 и 10 днями после гипоксии/реоксигенации. Аппликация N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии и в первые сутки после реоксигенации существенно повышала выживаемость клеток. На первые сутки после гипоксии/реоксигенации в присутствии N-ADA происходило незначительное снижение жизнеспособности, сопоставимое с контрольными культурами, однако в дальнейшем она не снижалась и на 10 85 сутки после гипоксии/реоксигенации статистически значимых отличий между опытными и интактными культурами не обнаруживалось. Рисунок 19. Количество живых клеток в культуре клеток гиппокампа после гипоксии, *- статистически достоверные различия в сравнении с контрольной группой, p<0.05, **- различия в сравнении с контрольной группой # статистически достоверные различия с группой, подвергавшейся гипоксии (p<0,05, критерий Стьюдента). Число жизнеспособных клеток в культурах, подвергавшихся 10минутной гипоксии с аппликацией N-ADA, на 10 сутки после воздействия было более чем в 3 раза выше, чем в контрольных культурах (75,24±9,37% и 20,84±4,78%, соответственно). Таким образом, введение N-ADA во время гипоксии и в первые сутки после нее сохраняют жизнеспособность клеток как минимум в течение 10 суток после гипоксического воздействия. Для выявления возможных механизмов антигипоксического действия исследуемого вещества в культуры добавлялся N-ADA в сочетании с блокаторами различных рецепторов, связывающих каннабиноид. В отсутствие гипоксии антагонисты CBR-1, CBR-2 и TRPV1 не влияли на выживаемость клеток. Блокада CBR-1 селективным антагонистом 86 SR141716A на первые сутки после гипоксии/реоксигенации в культурах, подвергнутых гипоксии в присутствии N-ADA, вызывала, по сравнению с интактными культурами, достоверное снижение жизнеспособности клеток, которая на 3 сутки оставалась на прежнем уровне, но на 7 сутки продолжала снижаться. К 10 суткам постгипоксического периода число жизнеспособных клеток снижалось наиболее интенсивно (до 24,95±3,21%) и статистически не отличалось от контрольной группы, подвергутой гипоксии в отсутствие каннабиноида. Таким образом, блокада CBR-1 устраняла нейропротекторное действие N-ADA. Исследование роли активации CBR-2 в реализации нейропротекторного эффекта N-ADA показало, что под воздействием селективного антагониста CBR-2, SR144528, в течение первых 7 суток происходит постепенное достоверное снижение жизнеспособности клеток, сходное с ее изменениями в контрольной группе. Однако к 10 суткам, в отличие от контрольной группы, резкого снижения числа живых клеток не происходило. Их количество в присутствии N-ADA и SR144528 на 10 сутки после гипоксии было достоверно выше, чем в контрольной группе культур (62,0±2,43%). Эти данные свидетельствуют о том, что активация CBR-2 не оказывает существенного влияния на реализацию нейропротекторного эффекта N-ADA. Применение при гипоксии N-ADA (10 мкМ) в сочетании с антагонистом TRPV1 нейропротекторного капсазепином эффекта. (1 Количество мкМ) не оказывало жизнеспособных клеток снижалось уже на 1 сутки после гипоксического воздействия, а к 10 суткам постгипоксического периода их число в группе культур, инкубированных с N-ADA и капсазепином, составило всего 32,08±12,41, что не отличалось от контроля. Следовательно, активация TRPV1, так же, как и CBR-1, имеет важное значение в реализации нейропротекторного эффекта N-ADA при гипоксии. 87 Таким образом, аппликация N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии снижает гибель культивируемых клеток гиппокампа в постгипоксическом периоде, при этом защитный эффект эндоканнабиноида опосредуется прежде всего метаболическими каскадами, запускаемые при активации CBR-1 и TRPV1. 3.1.4 Влияние N-арахидоноилдофамина на распределение каннабиноидных рецепторов первого и второго типов в диссоциированных культурах гиппокампа при моделировании гипоксии Для оценки распределения CBR в диссоциированных культурах гиппокампа проводили иммуногистохимическое маркирование глиальных клеток, нейронов, а также CBR-1 и CBR-2. Для визуализации астроцитов маркировали глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), для визуализации нейронов - нейрон-специфичный белок МАР2, который в значительных количествах содержится в цитоскелете сомы и дендритах нейронов. Иммуноцитохимические исследования показали, что CBR-1 присутствуют в культурах на 28-й DIV, локализуясь на отростках нейронов (Рис. 20). Поскольку данные отростки не маркировались МAP2, мы предполагаем, что они являются аксонами нейронов. 88 А СВR-1 МАР2 GFAP В Б СВR-1 МАР2 GFAP СВR-1 МАР2 GFAP Рисунок 20. Иммуноцитохимическое маркирование CBR-1 в культуре клеток гиппокампа на 28-й DIV: А - интактная культура, Б - на 7 сутки после гипоксии, В - на 7 сутки после гипоксии при аппликации N-ADA 10 мкМ. Масштаб 20 мкм Полученные данные хорошо согласуются с существующими исследованиями, свидетельствующими о преимущественной локализации CBR-1 на аксонах (Katona et al., 1999), как синаптически, так и внесинаптически, хотя согласно литературным данным максимальная плотность экспрессии CBR-1 наблюдается на пресинаптической терминали, особенно в пресинаптической активной зоне (Kofalvi et al., 2007). 89 Для оценки воздействия острой гипоксии на распределение CBR-1 были охарактеризованы такие параметры, как количество кластеров этих рецепторов в расчете на 100 мкм длины отростка нейрона и средняя площадь кластера. Анализ полученных изображений проводился с помощью программы ImageJ. Распределение CBR оценивалось на 7 сутки постгипоксического периода. Нами было показано, что гипоксическое воздействие не вызывает изменения количества кластеров CBR-1 на отростках нейронов, но приводит к статистически значимому уменьшению среднего размера кластеров (с 0,72±0,07 мкм2 до 0,51±0,07 мкм2, рис.21). Рисунок 21. Распределение CBR-1 рецепторов в культурах клеток гиппокампа на 7 сутки после гипоксии. А - число кластеров СВ1 рецепторов на 100 мкм отростка нейрона, Б - средняя площадь кластера; * статистически достоверные различия с показателями «до гипоксии» (р<0,05, критерий Стьюдента) В группе культур, в которые при гипоксии в культуральную среду добавляли N-ADA, размер кластеров CBR-1 не отличался от их размеров в контрольной группе, не подвергавшейся гипоксии, а их количество достоверно увеличивалось. Иммуноцитохимическое маркирование CBR-2 показало их присутствие в культурах на 28-й DIV. Для характеристики их распределения оценивалось 90 количество кластеров CBR-2 на 100 мкм2 и средняя площадь кластера. CBR-2 преимущественно локализовались на глиальных клетках, что согласуется с данными литературы (Rodriguez et al., 2001), хотя встречались и на некоторых нейронах, что также показано другими авторами (Gong et al., 2006; Morgan et al., 2009; Brusco et al., 2008). В отдаленном постгипоксическом периоде количество кластеров CBR-2 существенно снижалось (рис. 22) на фоне достоверного уменьшения их среднего размера. Рисунок 22. Распределение CBR-2 рецепторов в культурах клеток гиппокампа на 7 сутки после гипоксии. А - число кластеров СВR-2 рецепторов на 100 мкм2, Б - средняя площадь кластера; * - статистически достоверные различия различия с показателями «до гипоксии» (р<0,05, критерий Стьюдента) При введении N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии и в первые сутки после нее в отдаленном постгипоксическом периоде количество и размер кластеров CBR-2 не отличались от аналогичных показателей в контрольной группе культур на фоне нормоксии. Таким образом, наше исследование показало, что аппликация Nарахидоноилдофамина во время гипоксии вызывало повышение количества кластеров CBR-2, сохраняя их нормальный размер, а также предотвращало индуцированное гипоксией снижение их количества и размеров. 91 3.2 Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия N-арахидоноилдофамина при моделировании гипоксии in vivo 3.2.1 Влияние N-арахидоноилдофамина на выживаемость животных при моделировании острой гипобарической гипоксии При моделировании острой гипобарической гипоксии ключевыми показателями, характеризующими устойчивость животных к гипоксии, являются время жизни на высоте (Тж, мин), коэффициент защиты, характеризующий выживаемость животных). Опытным группам животных за 45 минут до подъема на высоту внутрибрюшинно вводили N-ADA в концентрациях 2,5 мг/кг, 6 мг/кг и 10 мг/кг. Первой контрольной группе внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, второй – инъекционный раствор, использующийся для растворения N-ADA, группе сравнения – реамберин как эталонный препарат. Время жизни "на высоте" – это параметр, отражающий непосредственно устойчивость организма к дефициту кислорода. Данный параметр измерялся от момента подъема на «смертельную площадку» высотой 10000-10500 метров до появления второго агонального вдоха. Этот критерий отражает непосредственно устойчивость организма к дефициту кислорода. Превентивное введение N-ADA при моделировании ОГБГ дозозависимо увеличивало время жизни мышей на «высоте» (рис. 23). В дозе 2,5 мг/кг N-ADA увеличивал его до 8,2±0,67 мин, тогда как у контрольных животных оно составляло 5,82±1,06 мин. Время жизни контрольной группы, получавшей растворитель N-ADA, достоверно не отличалось от контрольной группы с физраствором (7,08±0,79 мин). Максимальный эффект отмечен при использовании дозы 10 мг/кг, когда время жизни «на высоте» возрастало в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой и составляло в среднем 92 8,95±0,55 мин, что даже несколько превосходило эффект реамберина (8,45±0,65 мин). Рисунок 23. Оценка времени жизни на высоте мышей линии C57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии. * - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, p < 0,05 (Критерий Манна-Уитни) По степени устойчивости к гипоксии всех животных можно было разделить на три группы: низко-, средне- и высокоустойчивые. Время жизни «на высоте» низкоустойчивых животных составляло менее 3 мин, среднеустойчивых – от 3 до 9 мин, высокоустойчивых – более 10 минут. Таким образом, различия между крайними группами были не менее чем трехкратными. Этот параметр, отражающий собственно устойчивость организма к дефициту кислорода, может быть использован в качестве одного из ключевых для оценки резистентности к повреждающему воздействию гипоксии. В контрольных группах, получавшей физиологический раствор и инъекционный раствор, встречались животные всех степеней устойчивости к гипоксии, при этом наиболее велика была численность среднеустойчивых животных (рис. 24). Распределение низко-, средне- и высокоустойчивых 93 животных составило 20, 50 и 30% в первой контрольной группе и 8,3, 58,3 и 33,3% во второй контрольной группе, соответственно. Рисунок 24. Распределение степени устойчивости в группах мышей линии С57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии (% от общего числа особей в группе). При превентивном применении N-ADA доля животных, средне- и высокорезистентных к гипоксии, возрастала, низкоустойчивых в этих группах не отмечено. Аналогичный эффект оказывал и препарат сравнения. Следует отметить, что эффект N-ADA на степень устойчивости животных к гипоксии дозозависим, наиболее велика доля высокоустойчивых животных в группе, получавшей N-ADA в дозе 10 мг/кг. При применении N-ADA в дозе 2,5 мг/кг 60% составили среднеустойчивые животные и 40% – 94 высокоустойчивые, 6 мг/кг – по 50%, 10 мг/кг – 37,5% и 62,5 % соответственно. Еще одним ключевым показателем, позволяющим оценить антигипоксическое действие вещества, является выживаемость животных на «смертельной площадке». Для оценки выживаемости рассчитывался коэффициент защиты исследуемого вещества (табл. 3). Таблица 3. Коэффициент защиты мышей линии C57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии Группа животных Кз Контроль 2 (растворитель N-ADA) 1,06 Реамберин 150 мг/кг 1,50 N-ADA 2,5 мг/кг 1,16 N-ADA 6 мг/кг 1,33 N-ADA 10 мг/кг 1,58 Растворитель, примененный для изготовления инъекционного раствора N-ADA, не проявлял антигипоксического действия. Коэффициент защиты реамберина (150 мг/кг) составил 1,5, тогда как N-ADA в дозах 2,5, 6 и 10 мг/кг – 1,16, 1,33 и 1,58, соответственно. Таким образом, превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA при острой гипобарической гипоксии дозозависимо повышает время жизни животных «на высоте», долю высокорезистентных к гипоксии животных и их выживаемость на «смертельной площадке», при максимальном защитном эффекте N-ADA в дозе 10 мг/кг, сопоставимом с эффектом Реамберина. Увеличение выживаемости животных может быть связанно с действием NADA на поведение крыс в течение стрессорного воздействия, поскольку активация каннабиноидных рецепторов N-арахидоноилдофамином вызывает классическую каннабиноидную тетраду, включающую в себя снижение двигательной активности (Adams, Martin, 1996; Bobrov et al., 2008), что 95 позволяет животным экономить энергетические ресурсы во время пребывания на "смертельной площадке", а также с действием N-ADA на метаболизм зрелых нервных клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что N-ADA обладает выраженным антигипоксическим эффектом, сопоставимым с действием антигипоксического препарата Реамберина. 3.2.2 Влияние N-арахидоноилдофамина на показатели двигательной и ориентировочно-исследовательской активности мышей в тесте «Открытое поле» Эффект, оказываемый N-ADA на восстановление рефлекторной деятельности в постгипоксическом периоде оценивалась по уровню поведенческой активности животных в тесте «открытое поле». Поскольку мыши являбтся ночными норными животными, при попадании на открытое пространство с условиями усиленной освещенности, у них наблюдаются стрессовые поведенческие реакции - ориентировочно-исследовательские и защитно-оборонительные. животного оценивается Ориентировочно-исследовательская по уровню горизонтальной и реакция вертикальной двигательной активности (число пересеченных квадратов открытого поля и количество вертикальных стоек), количеству реакций принюхивания. Эмоциональный статус животного оценивают по времени замирания, количеству реакций дефекации, мочеиспускания, груминга, верчения и пячения (Буреш, 1991; Худякова, Баженова, 2012). Действие различных стресас-факторов приводит к изменениям структуры поведения животных, изменяя метаболические процессы в организме. Исходный уровень горизонтальной двигательной активности (ГДА) статистически не отличался во всех группах животных. При исследовании воздействия N-ADA вне гипоксии на двигательную активность животных выявлено, что на 1 и 7 сутки после введения препарата изменений лвигательной активности не происходило. На 14 сутки отмечено снижение 96 горизонтальной двигательной активности, Число пересеченных квадратов составило 73,3% от исходного уровня ГДА (рис. 25) Рисунок 25. Влияние N-арахидоноилдофамина (6 мг/кг) на изменение горизонтальной двигательной активности мышей относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни) Данные по воздействию N-ADA при моделировани ОГБГ на уровень ориентировочно-исследовательской и защитно-оборонительной активности животных после моделирования ОГБГ представлены на рисунках 26-32. На первые сутки после гипоксического воздействия двигательная активность животных, получавших физиологический раствор (1 контрольная группа), достоверно снижалась по сравнению с интактными. Число пересеченных квадратов составило 27% от исходного количества. Через 14 дней двигательная активность мышей нормализовалась (86,5%) и достоверно не отличалась от исходного уровня (рис. 26). 97 Рисунок 26. Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение горизонтальной двигательной активности мышей после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормализованы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни), ** - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, получавшей физ.раствор, p < 0,05 (критерий МаннаУитни) Во 2 контрольной группе, получавшей инъекционный раствор, также отмечалось снижение двигательной активности, однако к 14 дню она не нормализовадась и на 14 сутки была достоверно ниже, чем у интактной группы (60% от исходного уровня). При превентивном введении N-ADA горизонтальная двигательная активность в первые сутки после гипоксического повреждения также снижалась, однако не так значительно, как в контроле. Статистически достоверных отличий двигательной активности мышей, получавших N-ADA перед моделированием ОГБГ, от интактных животных не обнаружено. Двигательная активность при введении N-ADA в дозах 2,5 и 6 мг/кг на первые сутки после гипоксии была достоверно выше по сравнению с 1 98 контрольной группой (59,5% и 77,1% от исходного уровня ГДА сообветственно). Аналогичная картина наблюдалась и у животных при введении реамберина. К 14 суткам постгипоксического периода отмечалась тенденция к дальнейшей нормализации двигательной активности животных, получавших как N-ADA, так и реамберин. Ни в одной из опытных груп достовеного отличия количества пересеченных квадратов от интактных животных не обнаружено. Такой же эффект поддержания уровня двигательной активности выявлен в группе животных, получавших антигипоксический препарат Реамберин. Для оценки уровня ориентировочно-исследовательской активности животных проводилаось исследование изменения уровня вертикальной двигательной активности (ВДА, количество вертикальных стоек) и числа реакций принюхивания. Нами установлено, что ОГБГ не оказывает достоверного влияния на вертикальую двигательную активность животных (рис. 27). Количество вертикальных стоек животных контрольных групп статистически не отличалось от тех же показателей у интактных животных. При применении N-ADA перед моделированием гипоксии достоверных отличий ориентировочно- исследовательской активности от интактных животных также не отмечено. Уровень вертикальной двигательной активности сохраняется на одном уровне в течение всего времени наблюдения за животными. Оценка непосредственного влияния N-ADA на ориентировочно-двигательную активность интактных животных показало, что число вертикальных стоек после введения препарата достоверно не изменяется (рис. 28). Также не обнаружено изменения количества актов принюхивания в контрольных группах животных после моделирования ОГБГ. В группах, получавших превентивные инъекции N-ADA в дозах 2,5 6 и 10 мг/кг не обнаружено достоверных отличий от исходного уровня. Однако нами было выявлено воздействие N-ADA вне гипоксии на число актов принюхивания (рис. 29, 30). 99 Рисунок 27. Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение вертикальной двигательной активности мышей после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни) Рисунок 28. Влияние N-арахидоноилдофамина 6 мг/кг на изменение вертикальной двигательной активности мышей. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу 100 Рисунок 29. Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение количества актов принюхивания после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия по сравнению с исходным уровнем, p < 0,05 (критерий МаннаУитни) Рисунок 30. Влияние N-арахидоноилдофамина 6 мг/кг на изменение количества актов принюхивания мышей в тесте «открытое поле». Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые отличия по сравннию с исходным уровнем, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни) 101 На первые сутки число актов принюхивания лдостоверно увеличилось относительно исходного уровня на 41,1%. На 7 сутки наблюдалось достоверное снижение количества реакций принюхивания и составило 74,7% от исходного уровня. К 14 сутки количество принюхиваний также было достоверно ниже исходного уровня (70%). При исследовании времени замирания при тестировании в «открытом поле» отмечено достоверное увеличение суммарного времени замирания относительно исходного уровня во всех исследуемых группах животных во всех последующих тестах (рис. 31). Исходное суммарное время замирания статистически не отличалось во всех исследуемых группах животных и составляло 1-10 с, в среднем от 1,88±0,26 с до 5,75±2,20 с для разных групп. Время замирания в группе интактных животных на 1, 7 и 14 сутки исследования увеличилось в 8,54, 10,46 и 6,61 раза соответственно (рис. 30) относительно исходной соответственно и составило 31,71± 4,26, 38,86±8,35 и 24,57±11,15 с. Можно предположить, что это связано с стрессирующим воздействием навигационного обучения в «водном лабиринте Морриса», что ухудшило эмоциональный статус животных и привело к усилению пассивнооборонительной стратегии поведения. В контрольной группе, получавшей физраствор, суммарная длительность времени замирания на 1, 7 и 14 сутки постгипоксического периода увеличилась в 10,9, 7,7 и 7,17 раза соответственно и составила 49,0±20,12 с, 34,7±10,6 с и 32,3±8,2 с. Во второй контрольной группе, получавшей инъекцию растворителя, длительности замираний увеличились в 13,5, 13,7 и 9,2 раза соответственно. Достоверных отличий между опытными, контрольными и интактными животными в соответствующие сроки исследования не отмечено. Суммарное время замирания в группе. получавшей инъекцию Реамберина составило 29,44±10,36 с на 1-е сутки постгипоксического периода, 21,0±4,01 с на 7-е сутки и 45,86±10,78 с на 14-е сутки. 102 Рисунок 31. Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение времени замирания мышей после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу; * статистически значимые различия по сравнению с исходным уровнем, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни) В опытной группе животных, превентивно получавших N-ADA в дозе 2,5 мг/кг суммарное время замирания составило 39,86±9,12 с, 55,63±16,74 с и 61,38±17,8 с соответственно. В группе интактных животных, получавшей NADA 6 мг/кг также отмечено увеличение времени замирания в 4,57, 13,05 и 17,47 раза (рис. 32). В группе N-ADA 10 мг/кг суммарное времени замирания на 1-е, 7-е и 14-е сутки постгипоксического периода увеличилось в 9, 16 и 21 раз и составило 20,0±8,28, 35,2±10,48 и 46,0±12,47 с соответственно. При исследовании собственного действия N-ADA вне гипоксии также отмечено достоверное увеличение времени замирания в течение всего периода наблюдения в 6,2 раза на 1-е сутки после введение эндоканнабиноида, 16,3 раза на 7-е сутки и 14,6 раза на 14-е сутки (рис. 31). 103 Рисунок 32. Влияние N-арахидоноилдофамина 6 мг/кг на изменение времени замирания мышей в тесте «открытое поле». Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу Таким образом, нами было выявлено, что гипоксическое повреждение вызывает достоверное снижение двигательной активности контрольной группы животных, получавших инъекцию физиологического раствора, на первые сутки после моделирования гипоксии с последующим ее восстановлением к 14 суткам постгипоксического периода. Во 2 контрольной группе, двигательная активность 14 дню она не нормализовалась и на 14 сутки была достоверно ниже, чем у интактной группы. Превентивное внутрибрюшинное введение N-арахидоноилдофамина позволяет предотвратить вызванное гипоксией снижение двигательной активности. При введении N-ADA в дозах 2,5 и 6 мг/кг двигательная активность уже на первые сутки после гипоксии была достоверно выше по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор и не отличалась от уровня активности интактных животных. На 14 сутки во всех опытных группах уровень двигательной активности не отличался от интактной группы. Аналогичная картина наблюдалась и у животных при введении реамберина. Было отмечено достоверное увеличение веремени замирания во всех группах животных после навигационного обучения. Снижение двигательной активности и эмоциональлного статуса вероятно связано с 104 развитием пассивно-оборонительной тактики поведения мышей в ответ на стрессорное воздействие «водного лабиринта Морриса». Гипоксия провоцирует массовую апоптотическую гибель нервных клеток, вызванную разобщением активацией окислительного свободно-радикальных процессов фосфорилирования, а и также эксайтотоксичностью (Проблемы гипоксии... 2004). Взаимодействие N-ADA с каннабиноидными рецепторами способно не только предотвращать апоптотическую гибель клеток (Bobrov et al., 2008), но и, вероятно, сохранять функциональные предотвращает связи между нарушение клетками поведенческих в нейронных реакций у сетях, что мышей в постгипоксическом периоде. 3.2.3 Влияние N-арахидоноилдофамина на навигационное научение и долговременную память у мышей в тесте «Водный лабиринт Морриса» Состояние долговременной памяти животных оценивалось через сутки после моделирования ОГБГ путем отсроченного тестирования в водном лабиринте Морриса. Тест состоял из одной пробы длительностью 60 секунд. При этом платформа в лабиринте отсутствовала. Были установлены основные стратегии поиска платформы. В процессе предварительного обучения у мышей наблюдалось формирование пространственной памяти. Время нахождения платформы сокращалось, поиск цели становился направленным, как правило, характеризующимся циркулярными и радиальными движениями. При проведении тестирования для оценки состояния долговременной памяти, платформу из лабиринта удаляли, и фиксировали траектория движения животного. Долговременная память оценивалась с помощью отсроченного коэффициента сохранения (оКс) – доли времени пребывания животного в секторе бассейна, где находилась платформа, по отношению в общему времени пребывания животного в 105 лабиринте. При этом считается нормой, если оКс составляет 23-30% (D'Hooge, De Deyn, 2001). Острая гипобарическая гипоксия оказывала негативное влияние на сохранение долговременной памяти. Отсроченный коэффициент сохранения в обеих контрольных группах был заметно ниже, чем у интактных животных (рис. 33). Рисунок 33. Значения отсроченного коэффициента сохранения долговременной памяти у мышей после воздействия острой гипобарической гипоксии, % (М±m), *-статистически значимые различия по сравнению с интактными животными, # - статистически значимые различия по сравнению с контролем 1 и контролем 2, p < 0,05 (критерий манна-Уитни). Коэффициент сохранения памяти снизился с 31,87±3,74 у интактных животных до 21,01±5,83 и 19,95±3,36 в контрольных группах 1 и 2 соответственно. Классический антигипоксант реамберин не оказывал влияния на сохранение долговременной памяти при ОГБГ. оКс в группе 106 мышей, превентивно получавших препарат сравнения, был достоверно ниже, чем у интактных животных (21,53±5,09). Применение N-ADA при ОГБГ позволяло сохранить долговременную память животных после навигационного научения на уровне интактных животных. Наилучший эффект отмечен при использовании N-ADA в дозах 2,5 мг/кг и 10 мг/кг. коэффициент сохранения памяти в группе N-ADA 2,5 мг/кг составил 33,08±3,11, в группе N-ADA 6 мг/кг 25,74±3,12, в группе NADA 10 мг/кг 34,17±7,43 Таким образом, нами показано, что N-ADA обладает нейропротекторным действием, предотвращая мнестические нарушения у животных после гипоксического воздействия (Митрошина с соавт., 2012). Для оценки собственного воздействия N-ADA на оКс долговременной памяти животным одной из подопытных групп был введен исследуемый эндоканнабиноид (6 мг/кг) в отсутствие гипоксического воздействия. В данной группе оКс, хотя и был несколько выше, чем у интактных животных (42,7±4,7), однако различие было статистически недостоверным. Чтобы выявить механизм нейропротекторного действия N-ADA, было исследовано его воздействие на сохранение долговременной памяти в комбинации с антагонистами CBR-1, CBR-2 и TRPV1 (Таблица 4). Блокада CBR-2 и TRPV1 не препятствовала нейропротекторному действию N-ADA, а блокада CBR-1 вызвала тенденцию к его снижению (оКс составил 22,38±3,57). Следовательно, одним из важных механизмом в реализации нейропротекторного эффекта N-ADA является активация каннабиноидных рецепторов 1 типа, однако существенную роль при системном действии NADA in vivo играют и другие рецепторы, в том числе CBR-2 и TRPV1, которые также вносят вклад в запуск адаптационных механизмов, позволяющих организму переносить гипоксическое повреждение и блокада одного из них не является критическим фактором. 107 Таблица 4. Значение отсроченного коэффициента сохранения долговременной памяти у мышей после моделирования ОГБГ Группа животных оКс, усл.ед. Интактные 31,87±3,74 Контроль 1 (с физ.раствором) 21,01±5,83 * Контроль 2 (растворитель) 19,95±3,36* N-ADA 6 мг/кг + SR1 1 мг/кг 22,38±3,57 N-ADA 6 мг/кг + SR2 1мг/кг 30,06±5,86 N-ADA 6 мг/кг + cpz 1 мг/кг 25,32±5,50 * - статистически значимые различия по сравнению с интактными животными, p < 0,05, критерий Манна-Уитни Возможно, свой вклад в нейропротекторное действие N-ADA вносит также либо нерецепторный путь воздействия эндоканнабиноида (Castillo et al., 2012), либо активация других типов рецепторов, к которым аффинны некоторые канабиноиды, например, GPR55 орфанового рецептора (Ryberg et al., 2007; Szabo, 2008). Однако литературные данные, является ли N-ADA лигандом GPR55 рецептора на сегодняшний день отсутствуют. С целью изучения влияния ОГБГ на процессы воспроизведения памяти, нами было изучено изменение стратегии поиска платформы при отсроченном тестировании, оцениваемой по изменению траектории животных при помощи графиков посещаемости секторов лабиринта Морриса. С помощью пакета программ Matlab лабиринт был условно разделен на секторы, оценивалось число посещений каждого сектора до того момента, когда мышь нашла бы платформу, если бы она была в лабиринте. Выявлено 3 основных стратегии поиска цели (рис. 34): первая стратегия – 1) прямое достижение цели – животное непосредственно направлялось к месту расположения платформы (время трека до достижения места латентного нахождения платформы 3-10сек); 2) активный поиск с учетом предыдущего опыта, время 108 нахождения платформы невелико (10-20сек); 3) хаотический поиск – отсутствие выраженной стратегии достижения цели (более 20 сек). Также в некоторых группах присутствовали животные, которые не достигли бы платформы за все время проведения тестирования (отрицательный результат). Рисунок 34. Основные стратегии поиска цели при тестировании долговременной памяти в лабиринте Морриса: А- прямой поиск, Б активный поиск, В - хаотический поиск, Г - отрицательный результат Воздействие острой гипобарической гипоксии негативно сказывалось на сохранении стратегии поиска цели животным в лабиринте Морриса. В интактной группе, не подвергавшейся действию ОГБГ, не было животных с отрицательным результатом поиска цели. Большая часть животных (55,5%) непосредственно находилась к месту расположения цели. Поиск с учетом предыдущего поиска и хаотический поиск представлены одинаково и встречались у 22,2% животных (рис. 35). После воздействия острой гипобарической гипоксии распределение животных по стратегиям поиска существенно нарушалось. В обеих контрольных группах (животные, которым вводили либо физиологический, либо инъекционный раствор) появлялись мыши, которые не нашли платформу за все время тестирования. Доля животных, показавших отрицательный результат, в обеих контрольных группах составила 43% (т.е. была наиболее велика), а тех, которые искали платформу хаотически, без учета прошлого опыта, составила в первой контрольной группе 28,5%, а во второй – 14,3%. 109 Рисунок 35. Распределение стратегий поиска цели в группах животных при отсроченном тестировании в водном лабиринте Морриса после воздействия ОГБГ Доля животных, которые твердо помнили расположение платформы и сразу направлялись к цели, в 1 контрольной группе была наименьшей и составила 14,4%, а во 2 такая стратегия поиска полностью отсутствовала. Таким образом, острая гипобарическая гипоксия вызывает грубые нарушения мнестических функций ЦНС у мышей, проявляющиеся в ухудшении долговременной памяти и изменении стратегии поиска цели при тестировании в «водном лабиринте» Морриса. Большая часть особей при 110 проведении тестирования демонстрировала циркулярные движения вдоль стенок бассейна, что можно объяснить врожденной программой поведения – тигмотаксисом, т.е. демонстрировали поведение, характерное для необученных животных. Превентивное введение N-ADA нивелировало негативные последствия гипоксического повреждения головного мозга. Во всех трех опытных группах, получавших N-ADA перед подъемом на высоту, животные, которые не смогли бы найти платформу, отсутствовали. В группах, получавших NADA в дозах 2,5 мг/кг и 10 мг/кг, наибольшую долю составляют животные, использующие стратегию поиска с учетом научения (55,5 и 60%, соответственно). Животные, направлявшиеся непосредственно к цели составляли 33,33 и 20%, соответственно. В группе, получавшей N-ADA в дозе 6 мг/кг, стратегии поиска распределились следующим образом: непосредственно к цели направлялось 37,5% животных, искали цель активно с учетом опыта 25% и искали цель хаотически 37,5%. Тестирование животных в «водном лабиринте» Морриса показало, что N-ADA существенно улучшает мнестические функции после гипоксического повреждения, сохраняя долговременную пространственную память и стратегию поиска цели. Максимальное нейропротекторное действие отмечено при использовании концентраций 2,5 и 10 мг/кг. Предварительными результатами в наших исследованиях было показано, что антагонисты CBR-1, CBR-2 и TRPV1 в отсутствие гипоксии не влияли на поведение животных как в открытом поле, так и при исследовании локомоторной памяти в тесте «лабиринт Морриса». При блокаде CBR-1 и TRPV1 во время гипоксии выявляются мыши, показывающие отрицательный результат (12,5% и 16,6 %, соответственно). Больше всего животных применяло стратегию активного поиска (37,5% и 33,3% соответственно). При блокаде CBR-1 во время гипоксии 25% животных использовало стратегию хаотичного поиска, 25% направлялись к месту нахождения цели. При блокаде TRPV1 во время гипоксии к цели направлялось 33,3% животных. 111 Блокада CBR-2 во время гипоксии существенных изменений стратегии поиска цели значительный не изменяла. вклад в Следовательно, нейропротекторный именно CBR-1 эффект вносят N-ADA при моделировании острой гипобарической гипоксии, и несколько меньший – TRPV1. Таким образом, превентивное введение N-ADA при моделировании острой гипобарической гипоксии способствует сохранению структур мозга, ответственных за воспроизведение долговременной памяти. Современные исследования мозга свидетельствуют, что актуализация следов памяти требует одновременной активации многих структур мозга, каждая из которых выполняет специфическую функцию по отношению к процессам памяти. Процессы памяти связывают с фронтальной, височной и париетальной корой, мозжечком, базальными ганглиями, миндалиной и, особенно, гиппокампом (Morris, 1982). В этих же структурах наблюдается наибольшая плотность экспрессии каннабиноидных рецепторов первого типа у животных и человека (Хаспеков, Бобров, 2006; Herkenham, 1991). В результате проведенного исследования нами было показано, что превентивное применение N-ADA способствует сохранению мнестических функций ЦНС животных в постгипоксическом периоде. Антигпоксический эффект при гипобарической гипоксии реализуется преимущественно за счет активации CBR-1 и TRPV1. 112 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Настоящая работа посвящена изучению антигипоксического и нейропротекторного эффекта эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии в первичной культуре клеток гиппокампа мышиных эмбрионов и острой гипобарической гипоксии мышей in vivo. В экспериментах in vitro было проведено комплексное исследование функциональной сетевой активости нейронов гиппокампа с применением современных электрофизиологических и имиджинговых методик, позволяющих изучить биоэлектрическую и химическую (кальциевую) активность нервных клеток. Применение мультиэлектродных систем регистрации внеклеточных потенциалов действия in vitro позволило провести долговременное исследование спонтанной биоэлектрической активности нейронных сетей и регистрацию мгновенных ответов в ответ на воздействие различных факторов, в том числе дефицита кислорода в среде. Благодаря применению методики использованием функционального лазерной сканирующей кальциевого имиджинга конфокальной с микроскопии проведено неинвазивное прижизненное исследование изменения содержания ионов Са2+ в цитоплазме диссоциированных клеток гиппокампа. На сегодняшний день изучение роли различных эндоканнабиноидов в составе стресс-лимитирующей системы поддержания гомеостаза сетевой активности нейронов представляет имеет важное значение как для теоретической, так и для практической науки о мозге. На различных моделях черепно-мозговой травмы, ишемического поражения мозга, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и эксайтотоксичности in vitro и in vivo было продемонстрировано, что различные эндоканнабиноиды, такие как анандамид и 2-арахидоноилглицерин, Nарахидоноилдофамин, так же, как и синтетические лиганды каннабиноидных рецепторов, как, например, WIN55121-2, оказывают нейропротекторное действие при различных видах повреждения головного мозга (Nagayama et 113 al., 1999; Sinor et al., 2000; Panikashvili et al., 2001; Moesgaard et al., 2003; Eljaschwitsch et al., 2006; Maresz et al., 2007; Mechoulam and Shohami, 2007; Bobrov et al., 2008; Koch et al., 2010; Генрихс и др. 2010; Grabiec et al., 2012; Pazos et al., 2013; Chiarlone et al., 2014; Dhopeshwarkar & Mackie, 2014). В то же время, данные о механизмах нейропротекторного действия эндоканнабиноидов, в том числе N-арахидоноилдофамина (N-ADA), и о вкладе конкретных каннабиноидных рецепторов в реализацию этого действия подчас противоречивы и недостаточно полны. В данной работе показано, что гипоксическое воздействие вызывает необратимое снижение спонтанной сетевой биоэлектрической активности культивируемых нейронов гиппокампа, вплоть до ее практически полного прекращения к 7-м суткам (число малых сетевых пачек снизжалось в 16,5 раз относительно исходного уровня), что свидетельствует о нарушении синаптических связей в нейронных сетях. Также происходило угнетение спонтанной кальциевой активности клеток (доля клеток, проявляющих спонтанную кальциевую активность на 7 день постгипоксического периода, снижалось в 6,3 раза по сравнению с интактными культурами). Количество жизнеспособных клеток в культурах сокращалось в 4,3 раза. Соедовательно, существенное снижение уровня спонтанной биоэлектрической и кальциевой активности связано с гибелью части нейронов в постгипоксическом периоде, редукцией синаптических контактов и разрушением нейронных сетей. N-ADA, апплицированный во время гипоксии и в первые сутки постгипоксического периода, препятствовал необратимым изменениям нейросетевой биоэлектрической и кальциевой активности, а также гибели культивируемых нейронов в течение как минимум 7 суток после гипоксии. В группе опытных культур, при аппликации N-ADA, доля клеток, проявляющих кальциевую активность, составляла 45,1±8,77% что было достоверно выше, чем в контрольной группе культур, подвергшихся гипоксическому воздействию (19,06±7,01%). Также аппликация N-ADA частично устраняла изменения длительности кальциевых осцилляций в 114 клетках, демонстрирующих появление суперосцилляций в постгипоксическом периоде. Максимальным защитным действием N-ADA обладал в концентрации 10 мкМ. Показано, что в отдаленном постгипоксическом периоде in vitro NADA сохраняет высокий уровень жизнеспособных нервных клеток, доля которых в присутствии N-ADA, составило 75,24±9,37%, что достоверно выше, чем в контрольных культурах (20,84±4,78%). Для выявления молекулярных механизмов нейропротекторного и антигипоксического действия N-ADA нами было проведено исследование роли различных рецепторов, с которыми он может взаимодействовать. Обнаружено, что антигипоксическое действие N-ADA опосредуется прежде всего через каннабиноидные рецепторы 1 типа (CBR-1) и ванилоидные рецепторы (TRPV1). Активация каннабиноидных рецепторов 2 типа (CBR-2) оказывает менее выраженный нейропротекторный эффект при гипоксии in vitro. Применение блокатора CBR-1 римонабанта (SR141716A, 1 мкМ) полностью устраняло нейропротекторный эффект, оказываемый N-ADA на жизнеспособность клеток и поддержание ими биоэлектрической активности в период гипоксии. Блокада TRPV1 капсазепином (1 мкМ) также препятствовала защитному эффекту N-ADA, количество жизнеспособных клеток в данной группе экспериментальных культур не отличалось от показателей контрольной группы, подвергавшейся гипоксии. Через сутки после моделирования нормобарической гипоксии с аппликацией N-ADA и капсазепина число пачек сетевых импульсов снижалось в 10 раз, однако дальнейшего снижения спонтанной биоэлектрической активности не происходило и такой уровень активности сохранялся не изменным вплоть до 7 суток постгипоксического периода. Применение блокатора CBR-2 (SR144528, 1 мкМ) менее существенно влияло на нейропротекторный эффект N-ADA. Количество жизнеспособных клеток, как и уровень биоэлектрической активности в группах при аппликации N-ADA и N-ADA в сочетании с блокатором CBR-2, не отличались друг от друга, однако 115 происходило достоверное изменение паттерна активности нейронов. Количество спайков в пачке и их частота уменьшалось на 45,8% и 40,8% на первые сутки и на 52,1% и 36,8% на седьмые сутки, соответственно. Было исследовано распределение CBR-1 и CBR-2 в культурах клеток гиппокампа при воздействии острой нормобарической гипоксии. Впервые было показано, что введение N-ADA в культуральную среду во время гипоксии и в первые сутки после нее предотвращает изменения размеров и количества кластеров CBR-2 и увеличивает количество кластеров CBR-1, сохраняя их нормальные размеры. На основании ключевой роли активации CBR-1 в реализации нейропротекторного и антигипоксического эффектов N-ADA можно предположить, что в их основе лежит реализация механизма ретроградного ингибирования выброса возбуждающего нейромедиатора Активация нейромедиаторов, пресинаптических глутамата в первую (Kreitzer, каннабиноидных очередь, Regehr, рецепторов 2001). тормозит кальциевые токи через пресинапптические потенциал-зависимые Са2+-каналы N- и P/Q-типов, в результате подавляется пресинаптическое высвобождение глутамата (Szabo, 2008; Kano et al., 2009; Castillo et al., 2012), что приводит к нормализации концентрации кальция в постсинаптическом окончании, вследствие чего, вероятно, в наших экспериментах отмечалось уменьшение длительности кальциевых суперосцилляций. Предотвращение гиперактивации NMDA-Rs путем ингибировая выброса глутамата из пресинаптических терминалей – один из наиболее изученных механизмов защиты нервных клетки от нейротоксичности (Sánchez-Blázquez et al., 2014). При исследовании антигипоксических свойств N-ADA in vivo было установлено, что превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA в дозах 6 мг/кг и 10 мг/кг достоверно повышает время жизни животных «на высоте», Время жизни на высоте у контрольных животных составляло 5,82±1,06 мин, максимальный эффект отмечен у группы, получавшей N-ADA 10 мг/кг, время жизни «на высоте» увеличилось в 1,5 раза по сравнению с 116 контрольной группой и составляло в среднем 8,95±0,55 мин. Также превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA увеличивало долю высокорезистентных к гипоксии животных (при введение N-ADA во всех исследованных дозах в опытных группах отсутствовали низкоустойчивые к гипоксии животные) и их выживаемость на «смертельной площадке», при максимальном защитном эффекте N-ADA в дозе 10 мг/кг, сопоставимом с эффектом реамберина. Коэффициент защиты реамберина (150 мг/кг) составил 1,5, тогда как N-ADA в дозах 2,5, 6 и 10 мг/кг – 1,16, 1,33 и 1,58, соответственно. Нами было выявлено, что гипоксическое повреждение вызывает достоверное снижение двигательной активности у животных, получавших инъекцию физиологического раствора, на первые сутки после моделирования гипоксии с последующим постгипоксического периода. ее восстановлением Двигательная к активность 14 суткам животных, получавших инъекцию растворителя N-ADA на 14 сутки была достоверно ниже, чем у интактной группы. Превентивное внутрибрюшинное введение NADA предотвращало вызванное гипоксией снижение двигательной активности. При использовании N-ADA в дозах 2,5 и 6 мг/кг двигательная активность уже на первые сутки после гипоксии не отличалась от уровня активности интактных животных. На 14 сутки во всех опытных группах уровень двигательной активности не отличался от интактной группы. Аналогичная картина наблюдалась и у животных при введении реамберина. Таким образом, превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA при острой гипобарической гипоксии дозозависимо повышает время жизни животных «на высоте», долю высокорезистентных к гипоксии животных и их выживаемость на «смертельной площадке» и предотвращает в дальнейшем изменения двигательной активности, индуцированные гипоксией. Максимальный защитный эффект N-ADA наблюдался в дозе 10 мг/кг. Полученные данные свидетельствуют о том, что N-ADA обладает 117 выраженным антигипоксическим эффектом, сопоставимым с действием известного антигипоксического препарата Реамберина. Для выявления действия N-ADA на сохранение мнестических функций ЦНС животных при гипоксическом повреждении нервной системы, было проведено тестирование показавшее, что острая нарушения мнестических животных в водном гипобарическая функций, лабиринте гипоксия Морриса, вызывает проявляющихся в грубые ухудшении долговременной памяти и изменении стратегии поиска цели. Коэффициент сохранения памяти снижался с 31,87±3,74 у интактных животных до 21,01±5,1 и 19,95±3,36 в контрольных группах, в которых были отмечены особи, получившие отрицательный результат поска цели, при этом большая их часть осуществляла антигипоксанта поиск Реамберина хаотически. не оказывало Применение действия на известного структуру пространственной памяти, в то время как превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA сохраняло мнестические функции, достоверно повышая значение отсроченного коэффициента сохранения долговременной памяти по сравнению с группой сравнения. Наилучший эффект отмечен при использовании N-ADA в дозе 10 мг/кг, коэффициент сохранения памяти составил 34,17±7,43, особей с отрицательным поиском цели не обнаружено, наибольшая доля особей (60%) представляли животные с активным поиском цели с учетом научения. Таким образом, результаты исследований in vivo свидетельствуют, что N-ADA обладает антигипоксическим действием, способствует сохранению воспроизведения долговременной памяти и предотвращает мнестические нарушения у животных после гипоксического воздействия. Также выявлен важный вклад CBR-1, и несколько меньший – TRPV1, в поддержание мнестических функций ЦНС при моделировании острой гипобарической гипоксии. Блокада этих рецепторов при гипоксии устраняла нейропротекторный эффект N-ADA, проявляющийся в сохранении стратегий поиска цели в водном лабиринте Морриса. 118 Отсутствие эффекта блокады CBR-1, CBR-2 и TRPV1 на активность нейроной сети гиппокампа и жизнеспособность клеток интактных культур in vitro и поведение интактных животных in vivo еще раз подтверждает гипотезу о включении механизма обратной связи и активацию пресинаптических каннабиноидных рецепторов только при гипоксии. Полученные результаты указывают на перспективу использования NADA в качестве фармакологического гипоксического повреждения мозга. агента для предотвращения 119 ВЫВОДЫ 1. N-ADA обладает антигипоксическим действием, способствуя сохранению уровня биоэлектрической активности нейронной сети в диссоциированных культурах клеток гиппокампа, структуры сетевой пачки импульсов во время острой нормобарической гипоксии in vitro и в постгипоксическом периоде. 2. N-ADA оказывает антигипоксический эффект на индуцированные гипоксией in vitro изменения спонтанной кальциевой активности нейронной сети, выражающийся в поддержании числа клеток, проявляющих активность, а также частичной нормализации длительности и частоты кальциевых осцилляций в постгипоксическом периоде. 3. Превентивная аппликация N-ADA (10 мкМ) предотвращает вызванную гипоксией гибель культивируемых клеток гиппокампа после гипоксии/реоксигенации. 4. Введение N-ADA во время гипоксии/реоксигенации in vitro предотвращает снижение размеров и числа кластеров каннабиноидных рецепторов 2 типа и повышает число кластеров каннабиноидных рецепторов 1 типа, сохраняя их нормальные размеры. 5. При превентивном парентеральном введении N-ADA оказывает антигипоксический эффект, способствуя сохранению двигательной активности и долговременной пространственной памяти после острой гипобарической гипоксии у мышей линии С57BL/6. Максимальный антигипоксический эффект оказывает применение N-ADA в дозе 10 мг/кг. 6. Ключевую роль в реализации антигипоксического и нейропротекторного эффектов N-ADA играет активация каннабиноидных рецепторов 1 типа (CBR-1) и ванилоидных рецепторов (TRPV1) и, в меньшей степени, каннабиноидных рецепторов 2 типа (CBR-2). 120 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2-АГ (2-AG) – 2-арахидоноилглицерин АМПА (AMPA) - α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота АНА (ANA) - анандамид АЦ – аденилатциклаза ВДА - вертикальная двигательная активность ГАЖК (FAAH) - гидролаза амидов жирных кислот ГАМК (GABA) - γ-аминомасляная кислота ГДА - горизонтальная двигательная активность ДАГ – диацилгдицерол Вж –выживаемость Кз – коэффициент защиты КФЛМ - конфокальная лазерная микроскопия МАГЛ (MAGL) - моноацилглицетроллипаза НМДА (NMDA) – N-метил-D-аспатрат ОГБГ – острая гипобарическая гипоксия оКс – отсроченный коэффициент сохранения памяти ТГК - Δ9-тетрагидроканнабинол Тж – время жизни «на высоте» Тпп - время потери позы Твп - время восстановления позы цАМФ – циклический аденозин монофосфат ЦНС – центральная нервная система ФлА2 - фосфолипаза А2 ФНОα - фактор некроза опухолей α ЭК – эндоканнабиноид ЭКС – эндоканнабиноидная система ЭПР - эндоплазматический ретикуллум 121 АМ630 - селективный антагонист CB1R АМ251 - селективный антагонист CB1R AMPAR – АМПА-рецептор BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор головного мозга CBR-1 – канабиноидный рецептор I типа CBR-2 – канабиноидный рецептор II типа cdc42 - ГТФ-связывающий протеин с-fos – ген раннего ответа с-jun – ген раннего ответа CP-55940 - синтетический каннабиноид Cpz - Capsazepine, селективный антагонист TRPV1 рецепторов DIV – day in vitro, день развития культуры in vitro DSE - depolarization-induced suppression of exitation, индуцированное деполяризацией ингибирование возбуждения DSI - depolarization-induced suppression of inhibition, индуцированное деполяризацией ингибирование торможения EAE - experimental allergic encephalomyelitis, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит ERK 1/2 - extracellular regulated kinase, внеклеточно регулируемая киназа GPR55 - G-protein receptor GPR, G-протеин-связанный орфановый рецептор 55 MAPK – митоген-активируемая протеинкиназа MEA (Multielectrode array) - мультиэлектродная система регистрации внеклеточных потенциалов действия MEK (MAPKK) 1/2 киназа - киназа МАР-киназ N-ADA – N-арахидоноилдофамин NF-kB (Nuclear factor-κB) - транскрипционный ядерный фактор каппа-В NMDAR – НМДА-рецептор О-1966 - селективный антагонист CB2R 122 OG - Oregon Green-488 BAPTA-1 АМ rac1 - ГТФ-связывающий протеин rhoA - ГТФ-связывающий протеин SR - Sulforhodamine 101, сульфородамин 101 SR1 - SR151716, римонабант, селективный антагонист СВ1 рецепторов SR2 - SR 141716A, селективный антагонист СВ2 рецепторов TRPV - transient receptor potential cation channel subfamily V WIN 55.212-2 - синтетический каннабиноид, агонист CB1R zif 268 -ген раннего ответа 123 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Бобров М.Ю., Генрихс Е.Е., Барсков И.В., Лыжин А.А., Фрумкина Л.Е., Андрианова Е.Л., Оборина М.В., Хаспеков Л.Г. Нейропротекторный эффект модуляторов эндогенной каннабиноидной системы при экспериментальной церебральной ишемии // В кн. «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2011. т. 1. С. 94-98. 2. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М., Высш. шк., 1991. 399с. 3. Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Сахарнова Т.А., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Влияние N- арахидоноилдофамина на функционирование нейронной мети первичной культуры гиппокампа при моделировании гипоксии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. №10. С.447-451. 4. Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Митрошина Е.В., Мухина И.В. Антигипоксические свойства нейротрофического фактора головного мозга при моделировании гипоксии в диссоциированных культурах гиппокампа // Журнал «Современные технологии в медицине». 2012. №4. С.17-23. 5. Генрихс Е.E. Защитное действие модуляторов эндогенной каннабиноидной системы при экспериментальной церебральной ишемии: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 2012 .- 22с. 6. Генрихс Е.Е., Бобров М.Ю., Андрианова Е.Л., Грецкая Н.М., Лыжин А.А., Блаженова А.В., Фрумкина Л.Е., Безуглов В.В., Хаспеков Л.Г. Модуляторы эндогенной каннабиноидной системы как нейропротекторы // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2010. Т. 4. № 4. С. 37-42. 7. Захаров Ю.Н., Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Коротченко С.А., Калинцева Я.И., Потанина А.В. Мухина И.В. Флуоресцентный анализ паттернов метаболическойактивности нейрон-глиальной сети // Оптический журнал. 2012. Vol. 79, № 6. P. 47–51. 124 8. Лебедев Р.Д., Бурцев М.С. Кластеризация пачек спонтанной активности нейрональной культуры // Сб. научных трудов Всероссийской научно-технической конференции "Нейроинформатика 2010": в 2-х частях. Ч. 1. М.: НИЯУ МИФИ, 2010. С. 296-303. 9. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1997. Т. 124, № 9. С. 244254. 10. Лукьянова Л.Д., Дудченко А.М., Цыбина Т.А., Германова Э.Л. Регуляторная роль митохондриалъной дисфункции при гипоксии и ее взаимодействие с транскрипционной активностью // Вестник Российской академии медицинских наук. 2007. № 2. С. 3-12. 11. Методические препаратов, рекомендации предлагаемых для по экспериментальному клинического изучения в изучению качестве антигипоксических средств. М., 1990. 18 с. 12. Митрошина Е.В., Ведунова М.В. Калинцева Я.И. Кальциевый имиджинг в клеточных культурах и тканях: Учебно-методическое пособие. Нижний Новгород: Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского. 2011. С. 1–26. 13. Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Широкова О.М., Захаров Ю.Н., Калинцева Я.И., Мухина И.В. Оценка динамики функционального состояния диссоциированной культуры гиппокампа in vitro // Вестник ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 2011. № 2(2). С. 283-286. 14. Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Миронов А.А., Сахарнова Т.А., Пимашкин А.С., Бобров М.Ю., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Нейропротекторное действие каннабиноида N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипобарической гипоксии мозга // Неврологический вестник (Журнал им. В.М. Бехтерева). 2012. №1. С. 14-19 15. Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г., Захаров Ю.Н., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Коротченко С.А., Корягина Е.А. Мультиэлектродные 125 матрицы – новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети // Современные технологии в медицине. 2009. №1. С. 8-15. 16. Мухина И.В. Влияние препаратов с антигипоксическими свойствами на функциональное состояние сердца и мозга: автореф. дис… докт. биол. наук: 03.00.13. / Мухина Ирина Васильевна. М.: Изд-во НИИ общей реаниматологии РАМН, 2000. 44 с. 17. Оковитый С.В., Смирнов А.В. Антигипоксанты // Экспер. и клин. фармакол. 2001. Т. 64, № 3. С. 76-80. 18. Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты: сб. ст. / под ред. Л.Д. Лукьяновой, И.Б. Ушакова. М. Воронеж: Издво «Истоки», 2004. С. 268-296. 19. Родина В.И., Крупина Н.А., Крыжановский Г.Н Новый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс // Журн. Патологическая физиология и общая патология. 1992. С.58-64. 20. Рубанова Н.А, Баландина М.В., Корягин А.С. Серотонинергическая система и функциональное состояние митохондриальных мембран мозга в ранние сроки гипоксии и при введении пептида дельта-сна // Фармакологическая коррекция гипоксических состояний: матер. II Всесоюзн. конфер, Гродно: Гродненский медицинский институт, 1991. С. 29-230. 21. Хаспеков Л.Г., Бобров М.Ю. Эндогенная каннабиноидная система и ее защитная роль при ишемическом и цитотоксическом повреждении нейронов головного мозга // Нейрохимия. 2006. Т. 23, №2. С. 85—105. 22. Худякова Н.А., Баженова Т.В. Поведенческая активность линейных и нелинейных мышей разных цветовых вариаций в тесте «Открытое поле». Вестник Удмуртского Университета. 2012. 2: 89-93. 23. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Молекулярно- клеточные механизмы цитотоксического действия гипоксии. Патогенез гипоксического некробиоза // Современные наукоемкие технологии. 2006. №7. С. 31-38. 126 24. Широкова О.М., Фрумкина Л.Е., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Ю.Н. Захаров, Л.Г. Хаспеков, И.В. Мухина Закономерности развития нейронных сетей в диссоциированных культурах клеток гиппокампа // Журнал "Современные технологии в медицине". - 2013.-Т.5, №2. - С.6-13. 25. Adams I.B., Martin B.R. Cannabis: pharmacology and toxicology in animals and humans // Addiction. 1996. Vol. 91. P. 1585-1616. 26. Aguado T., Romero E., Monory K., Palazuelos J., Sendtner M., Marsicano G., Lutz B.,Guzmán M., Galve-Roperh I. The CB1 cannabinoid receptor mediates excitotoxicity-induced neural progenitor proliferation and neurogenesis // J. Biol.Chem.2007. Vol. 282. P 23892–23898 27. Alger B.E., Pitler T.A. Retrograde signaling at GABAA-receptor synapses in the mammalian CNS // Trends Neurosci. 1995. Vol. 18. Is.8. P. 333-340. 28. Ashton J.C., Glass, M. The cannabinoid CB2 receptor as a target for inflammationdependent neurodegeneration // Curr. Neuropharmacol. 2007. Vol. 5. P. 73–80. 29. Bacci A. Verderio C., Pravettoni E., Matteoli M. Synaptic and intrinsic mechanisms shape synchronous oscillations in hippocampal neurons in culture // Europ. Jour. Neurosc. 1999.Vol.11. P.389-397. 30. Baker D., Pryce G., et al. Cannabinoids control spasticity and tremor in a multiple sclerosis model // Nature. 2000. Vol. 40. №6773. Р.84–87. 31. Bari M., Battista N., Fezza F. et al. New insights into endocannabinoid degradation and its therapeutic potential // Mini Rev. Med. Chem. 2006. Vol. 6. P. 257–268. 32. Barth, F.; Rinaldi-Carmona, M. The Development of Cannabinoid Antagonists // Current Medicinal Chemistry. 1999. Vol. 6. Is.8. P.745–755. 33. Beltramo M., Piomelli D. Carrier-mediated transport and enzymatic hydrolysis of the endogenous cannabinoid 2-arachidonylglycerol // Neuroreport. 2000. Vol.11. P. 1231–1235. 127 34. Boehler M., Wheeler B.C., Brewer G.J. Added astroglia promotes greater synapse density and higher activity in neuronal networks // Neuron Glia Biol. 2007. V. 3(2). P. 127–140. 35. Benard G., Massa F., Puente N., Lourenço J., Bellocchio L., Soria-Gómez E., Matias I., Delamarre A., Metna-Laurent M., Cannich A., Hebert-Chatelain E., Mulle C., Ortega-Gutiérrez S., Martín-Fontecha M., Klugmann M., Guggenhuber S., Lutz B., Gertsch J., Chaouloff F., López-Rodríguez M.L., Grandes P., Rossignol R., Marsicano G. Mitochondrial CB1 receptors regulate neuronal energy metabolism // Nature Neuriscience. 2012. Vol. 15, №4. P. 558-566. 36. Benito, C., Tolon, R.M., Pazos, M.R., Nunez, E., Castillo, A.I., Romero, J. Cannabinoid CB2 receptors in human brain in"ammation // Br. J. Pharmacol. 2008. Vol. 153. Р. 277-285. 37. Berger C., Schmid P.C., Schabitz W.R., Wolf M., Schwab S., Schmid H.H. Massive accumulation of N-acylethanolamines after stroke. Cell signalling in acute cerebral ischemia?// J. Neurochem. 2004. Vol. 88. Is.5. P.1159-1167. 38. Bisogno T., Melck D., Bobrov M.Yu., Gretskaya N.M., Bezuglov V.V., De Petrocellis L., Di Marzo V. N-acyl-dopamines : novel synthetic CB1 cannabinoidreceptor ligands and inhibitors of anandamide inactivation with cannabimimetic activity in vitro and in vivo // Biochem. J. 2000. Vol. 351. P. 817-824. 39. Bobrov M.Y., Lizhin A.A., Andrianova E.L., Gretskaya N.M., Frumkina L.E., Khaspekov L.G., Bezuglov V.V. Antioxidant and neuroprotective properties of N-arachidonoyldopamine // Neurosci. Lett. 2008. Vol. 431, №1. P. 6-11. 40. Bouaboula M, Poinot-Chazel C, Bourrié B, Canat X, Calandra B, Rinaldi- Carmona M, Le Fur G, Casellas P. Activation of mitogen-activated protein kinases by stimulation of the central cannabinoid receptor CB1 // Biochem. J. 1995. Vol. 312. P.637-641. 41. Bouaboula M, Poinot-Chazel C, Marchand J, Canat X, Bourrié B, Rinaldi- Carmona M, Calandra B, Le Fur G, Casellas P.Signaling pathway associated with stimulation of CB2 peripheral cannabinoid receptor. Involvement of both mitogen- 128 activated protein kinase and induction of Krox-24 expression. // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 237 (3) Р. 704–711. 42. Bradshaw H.B., Walker J.M. The expanding field of cannabimimetic and related lipid mediators // Br J Pharmacol. 2005. Vol. 144. Is.4. P. 459-65. 43. Brusco A., Taglioferro P., Saez T and Onaivi E.S. Postsynaptic localization of CB2 cannabinoid receptors in the rat hippocampus // Synapse. 2008. Vol. 62. P. 944-949. 44. Cadas H., di Tomaso E., Piomelli D. Occurrence and biosynthesis of endogenous cannabinoid precursor, N-arachidonoyl phosphatidylethanolamine, in rat brain // J. Neurosci. 1997. Vol. 17. P. 1226–1242. 45. Castillo Р., Younts Т., Chavez А., Hashimotodani Y., Dominick P Endocannabinoid Signaling and Synaptic Function // Neuron. 2012. Vol. 76. Р. 7081 46. Caterina M.J., Schumacher M.A., Tominaga M., Rosen T.A., Levine J.D., Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway // Nature. 1997. Vol. 389. Р. 816-824. 47. Cavanaugh D.J., Chesler A.T., Jackson A.C., Sigal Y.M., Yamanaka H., Grant R., O'Donnell D., Nicoll R.A., Shah N.M., Julius D., Basbaum A.I. Trpv1 reporter mice reveal highly restricted brain distribution and functional expression in arteriolar smooth muscle cells // J. Neurosci. 2011. Vol. 31. Р. 5067-5077. 48. Centonze D., Finazzi-Agrò A., Bernardi G., Maccarrone, M. The endocannabinoid system in targeting inflammatory neurodegenerative diseases // Trends Pharmacol. Sci. 2007. Vol.28. P.180–187. 49. Chao N, Sheng-Tian L. Synaptic and Extrasynaptic Glutamate Signaling in Ischemic Stroke // Curr Med Chem. 2014. Vol. 21. Is. 18. P. 2043-64. 50. Chiarlone A, Bellocchio L, Blázquez C, Resel E, Soria-Gómez E, Cannich A, Ferrero JJ, Sagredo O, Benito C, Romero J, Sánchez-Prieto J, Lutz B, Fernández-Ruiz J, Galve-Roperh I, Guzmán M. A restricted population of CB1 cannabinoid receptors with neuroprotective activity // Proc Natl Acad Sci USA. 2014. Vol. 111. Is. 22. P. 8257-62. 129 51. Compton DR, Rice KC, De Costa BR, Razdan RK, Melvin LS, Johnson MR, Martin BR. Cannabinoid structure-activity relationships: correlation of receptor binding and in vivo activities // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993. Vol. 265. Is.1. P. 218-226. 52. Crawford, D.C., Moulder, K.L., Gereau, R.W.t, Story, G.M., Mennerick, S.Comparative effects of heterologous TRPV1 and TRPM8 expression in rat hippocampal neurons // PLoS One. 2009. Vol. 4 Р. e8166. 53. Cui M., Honore P., Zhong C. et al. TRPV1 receptors in the CNS play a key role in broad-spectrum analgesia of TRPV1 antagonists // J. Neurosci. 2006. Vol. 26. Р. 9385-9393. 54. Darlington C.L. Dexanabinol: a novel cannabinoid with neuroprotective properties // IDrugs. 2003. Vol. 6, №10. P. 976-979. 55. D’Hooge R., De Deyn P.P. Application for the Morris water maze in the study of learning and memory // Brain Res. Rev. 2001. №36. Р. 60-90. 56. Dalm S., Grootendorst J., de Kloet E.R., Oitzl M.L. Quantification of swim patterns in the Morris water maze// Behav. Res Meth. 2000. №32. Р. 134-139. 57. Davis M.P. Cannabinoids in pain management: CB1, CB2 and non-classic receptor ligands // Expert Opin Investig Drugs. 2014. Vol. 23. Is. 8. P. 1123-1140. 58. Degn M., Lambertsen K.L., Petersen G., Meldgaard M., Artmann A., Clausen B.H., Hansen S.H., Finsen B., Hansen H.S., Lund T.M. Changes in brain levels of N-acylethanolamines and 2-arachidonoylglycerol in focal cerebral ischemia in mice // J. Neurochem. 2007. Vol. 103. P.1907-1916. 59. Derkinderen P., Ledent C., Parmentier M., Girault J.A. Cannabinoids activate p38 mitogen-activated protein kinases through CB1 receptors in hippocampus // J. Neurochem. 2001.Vol.77. Is.3. P.957-60. 60. Derkinderen P., Valjent E., Toutant M., Corvol J.C., Enslen H., Ledent C., Trzaskos J., Caboche J., Girault J.A. Regulation of extracellular signal-regulated kinase by cannabinoids in hippocampus // J. Neurosci. 2003. Vol. 23. Is.6. P. 23712382. 130 61. Deutsch D.G., Chin S.A. Enzymatic synthesis and degradation of anandamide, a cannabinoid receptor agonist // Biochem. Pharmacol. 1993. Vol. 46. P. 791–796. 62. Devane W.A., Hanus L., Breuer A. et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science. 1992. Vol. 258. P. 1946-1949. 63. Dhopeshwarkar A, Mackie K. CB2 cannabinoid receptors as a therapeutic target - What does the future hold? // Mol Pharmacol. 2014 Aug 8. pii: mol.114.094649. 64. Di Marzo V., Fontana A., Cadas H. et al. Formation and inactivation of endogenous cannabinoid anandamide in central neurons // Nature. 1994. Vol. 372. P. 686–691. 65. Dinh T.P., Carpenter D., Leslie F.M. et al. Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2002. Vol. 99. P. 10819–10824. 66. Dirnagl U., Becker K., Meisel A. Preconditioning and tolerance against cerebral ischaemia: from experimental strategies to clinical use // Lancet Neurol. 2009. Vol. 8, №4. P. 398–412. 67. Dowie M.J., Bradshaw H.B., Howard M.L., Nicholson L.F., Faull R.L., Hannan A.J. Glass M. Altered CB1 receptor and endocannabinoid levels precede motor symptom onset in a transgenic mouse model of Huntington's disease // Neuroscience. 2009. Vol. 163. P. 456–465. 68. Eljaschewitsch E., Witting A., Mawrin C., Lee T., Schmidt P.M., Wolf S., Hoertnagl H., Raine C.S., Schneider-Stock R., Nitsch R., Ullrich O. The endocannabinoid anandamide protects neurons during CNS in"ammation by induction of MKP-1 in microglial cells // Neuron. 2006. Vol. 49. Р. 67-79. 69. Fegley D., Kathuria S., Mercier R., Li C., Goutopoulos A., Makriyannis A., Piomelli D.. Anandamide transport is independent of fatty-acid amide hydrolase activity and is blocked by the hydrolysis-resistant inhibitor AM1172 // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2004. Vol.101. P. 8756–8761. 131 70. Felder C.C., Joyce K.E., Briley E.M., Mansouri J., Mackie K., Blond O., Lai Y., Ma A.L., Mitchell R.L. Comparison of the pharmacology and signal transduction of the human cannabinoid CB1 and CB2 receptors // Mol. Pharmacol. 1995. Vol. 48. Is.3. P.443-450. 71. Fowler C.J., Rojo M.L., Rodriguez-Gaztelumendi A. Modulation of the endocannabinoid system: neuroprotection or neurotoxicity? // Exp Neurol. 2010. Vol. 224, №1. P.37-47. 72. Franklin A., Parmentier-Batteur S., Walter L., Greenberg D.A., Stella N. Palmitoylethanolamide increases after focal cerebral ischemia and potentiates microglial cell motility // J. Neurosci. 2003. Vol. 27. P. 7767-7775. 73. Gaoni Y., Mechoulam R. Isolation, structure and partial synthesis of an active constituent of hashish // J. Am. Chem. Soc. 1964. 1964. Vol. 86. P. 1646– 1647. 74. Garq Р., Duncan R.S., Kaja S., Koulen Р. Intracellular Mechanisms of N- Acylethanolamine-Mediated Neuroprotection in a Rat Model of Stroke // Neuroscience. 2010. Vol. 166(1). Р. 252–262. 75. Glaser S.T., Abumrad N.A., Fatade F., Kaczocha M., Studholme K.M., Deutsch D.G. Evidence against the presence of an anandamide transporter // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2003. Vol.100. Is.7. P. 4269-4274. 76. Gilbert G.L., Kim H.J., Waataja J.J., Thayer S.A. Delta9- tetrahydrocannabinol protects hippocampal neurons from excitotoxicity // Brain Res. 2007 Vol. 1128, №1. P. 61-69. 77. Glass M., Dragunow M. Induction of the Krox 24 transcription factor in striosomes by a cannabinoid agonist // Neuroreport. 1995. Vol. 6, № 2. P. 241-244. 78. Glass M., Felder C. Concurrent stimulation of cannabinoid CB1 and dopamine D2 receptors augments cAMP accumulation in striatal neurons: evidence for a Gs linkage to the CB1 receptor // J. Neurosci. 1997. Vol. 17, №14. P.53275333. 79. Glass M., Dragunow M., Faull R.L. The pattern of neurodegeneration in Huntington's disease: a comparative study of cannabinoid, dopamine, adenosine 132 and GABAA receptor alterations in the human basal ganglia in Huntington's disease // Neuroscience. 2000. Vol. 97. P. 505–519. 80. Gómez-Ruiz M, Hernández M, de Miguel R, Ramos JA. An overview on the biochemistry of the cannabinoid system // Mol Neurobiol. 2007. Vol. 36. Is.1. P.3-14. 81. Gong J.P., Onaivi E.S., Ishiguro H., Liu Q.R., Tagliaferro P.A., Brusco A., Uhl G.R. Cannabinoid CB2 receptors: immunohistochemical localization in rat brain // Brain Res. 2006. Vol.1071. P.10-23. 82. Gorter, J. A., Petrozzino, J. J., Aronica, E. M., Rosenbaum, D. M., Opitz, T., Bennett, M. V., Connor, J. A. and Zukin, R. S. Global ischemia induces downregulation of Glur2 mRNA and increases AMPA receptor-mediated Ca2+ influx in hippocampal CA1 neurons of gerbil // J. Neurosci. 1997. Vol. 17. P. 6179-6188. 83. Grabiec U., Koch M., Kallendrusch S. Et al. The endocannabinoid N- arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB1) // Neuropharm. 2012. Vol. 62. Р. 1797-1807. 84. Gross G.W., Kovalski J.M. Origins of activity patterns in self-orgaizing neuronal networks in vitro // J. Intell. Mater. Syst. Struct. 1999. Vol. 10. P. 558564. 85. Ham M.I., Bettencourt L.M., McDaniel F.D., Gross G.W. Spontaneous coordinated activity in cultured networks: analysis of multiple ignition sites, primary circuits, and burst phase delay distributions // Journal of Computational Neuroscience. 2008. Vol. 24, №3. P. 346-357. 86. Harvey B.S., Ohlsson K.S., Mååg J.L., Musgrave I.F., Smid S.D. Contrasting protective effects of cannabinoids against oxidative stress and amyloid-β evoked neurotoxicity in vitro // Neurotoxicology. 2012. Vol. 33. Is.1. P. 138-146. 87. Hashimotodani Y., Ohno-Shosaku T., Kano M. Endocannabinoids and Synaptic Function in the CNS // Neuroscientist 2007. Vol.13 № 2. P. 127–137. 133 88. Hayakawa K, Mishima K, et al. Cannabidiol prevents infarction via the non-CB1 cannabinoid receptor mechanism // Neuroreport. 2004. Vol. 15. Р. 2381– 2385. 89. Herkenham M., Lynn A.B., Johnson M.R. et al. Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative in vitro autoradiographic study // J. Neurosci. 1991. Vol. 11. P.563—568. 90. Hodges H., Sowinski P., Fleming P., Kershaw T.R., Sinden J.D., Meldrum B.S., Gray J.A. Contrasting effects of fetal CA1 and CA3 hippocampal grafts on deficits in spatial learning and working memory induced by global cerebral ischaemia in rats // Neuroscience. 1996. Vol.72. P. 959-988. 91. Howlett A. C. Cannabinoid receptor signaling // Handb. Exp. Pharm. 2005. 168 р. Р. 53-79. 92. Howlett, A.C., Barth, F., Bonner, T.I., Cabral, G., Casellas, P., Devane, W.A., Felder, C.C., Herkenham, M., Mackie, K., Martin, B.R., Mechoulam, R., Pertwee, R.G. // International Union of Pharmacology. XXVII. Classifcation of cannabinoid receptors. Pharmacol. Rev. 2002. Vol. 54. Р. 161-202. 93. Howlett A.C., Breivogel C.S., Childers S.R. et al. Cannabinoid physiology and pharmacology: 30 years of progress // Neuropharmacology. 2004. Vol. 47. Suppl. 1. P.345–358. 94. Howlett A.C., Fleming R.M. Cannabinoid inhibition of adenylate-cyclase: pharmacology of the response in neuroblastoma cell membranes // Mol. Pharmacol. 1984. Vol. 26. P.532–538. 95. Hu S.S., Bradshaw H.B., Benton V.M., Chen J.S., Huang S.M., Minassi A., Bisogno T., Masuda K., Tan B., Roskoski R. Jr., Cravatt B.F., Di Marzo V., Walker J.M. The biosynthesis of N-arachidonoyl dopamine (NADA), a putative endocannabinoid and endovanilloid, via conjugation of arachidonic acid with dopamine // Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2009. Vol.81. Is.4. P.291301. 96. Huang S.M., Bisogno T., Trevisani M., Al-Hayani A., De Petrocellis L., Fezza F., Tognetto M., Petros T.J., Krey J.F., Chu C.J., Miller J.D., Davies S.N., 134 Geppetti P., Walker J.M., Di Marzo V. An endogenous capsaicin-like substance with high potency at recombinant and native vanilloid receptors // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. Vol. 99. P. 8400–8405. 97. Huang S.M., Walker J.M. Enhancement of spontaneous and heat-evoked activity in spinal nociceptive neurons by the endovanilloid/endocannabinoid Narachidonoyldopamine (NADA) // J. Neurophysiol. 2006. Vol. 95: P.1207–1212. 98. Iwabuchi S., Watanabe T., Kawahara K. Spatio-temporal spread of neuronal death after focal photolysis of caged glutamate in neuron/astrocyte co-cultures // Neurochem. Int. 2013. Vol. 62, Is.7. P.1020-1027. 99. Kadhim H.J., Duchateau J., Sébire G. Cytokines and brain injury: invited review // J. Intensive Care Med.2009. Vol. 23. P 236–249. 100. Kahlert S., Zundorf G. and Reiser G. Glutamate-mediated influx of extracellular Ca2+ is coupled with reactive oxygen species generation in cultured hippocampal neurons but not in astrocytes // J. Neurosci. Res. 2005; Vol.79. Р. 262–271. 101. Kano M, Ohno-Shosaku T, Hashimotodani Y, Uchigashima M, Watanabe M. Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission // Physiol Rev. 2009. Vol. 89, №1. Р. 309-80. 102. Kano M. Control of synaptic function by endocannabinoid-mediated retrograde signaling // Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 2014. Vol. 90, Is.7. P.235-50. 103. Karasava Y., Araki H., Otomo S. Changes in locomotor activity and passive avoidance task performance induced by cerebral ischemia in Mongolian gerbils // Stroke. 1994. Vol. 25, № 3. P. 645-650. 104. Katona I., Sperlagh B., Sik A., Kafalvi A., Vizi E.S., Mackie K., Freund T.F. Presynaptically located CB1 cannabinoid receptors regulate GABA release from axon terminals of specific hippocampal interneurons // J. Neurosci. 1999. Vol. 19. Р. 4544-4558. 105. Kaur H., Prakash A., Medhi B. Drug therapy in stroke: from preclinical to clinical studies // Pharmacology. 2013. Vol. 92, № 5-6. Р. 324-334. 135 106. Kim D. Y., Kim S. H., Choi H. B., Min C., Gwag B. J. High abundance of GluR1 mRNA and reduced Q/R editing of GluR2 mRNA in individual NADPHdiaphorase neurons // Mol. Cell Neurosci. 2001. Vol. 17. P. 1025-1033. 107. Kim S.H., Won S.J. Mao X.O., Jin K., Greenberg D.A. Involvement of protein kinase A in cannabinoid receptor-mediated protection from oxidative neuronal injury // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005. Vol. 313. P 88–94. 108. Khaspekov L.G., Brenz Verca M.S., Frumkina L.E., Hermann H., Marsicano G., Lutz B. Involvement of brain-derived neurotrophic factor in cannabinoid receptor-dependent protection against excitotoxicity // Eur.Neuroci. 2004. Vol. 19, №7. P. 1691-1698. 109. Koch M., Kreutz S., Bottger C., Benz A., Maronde E., Ghadban C., Korf H.W., Dehghani F. Palmitoylethanolamide protects dentate gyrus granule cells via peroxisome proliferator-activated receptor-alpha // Neurotox. Res. 2010. Vol. 19. Р. 330-340. 110. Kofalvi А., Pereira M.F., Rebola N., Rodrigues R.J., OliveiraC.R. and Cunha R.A. Anandamide and NADA bi-directionally modulate presynaptic Ca2 levels and transmitter release in the hippocampus // British Journal of Pharmacology. 2007. Vol. 151. Р.551–563. 111. Koh J. Y., Goldberg M. P., Hartley D. M. and Choi D. W. Non-NMDA receptor-mediated neurotoxicity in cortical culture // J. Neurosci 1990.Vol. 10. P. 693-705. 112. Kreitzer A.C., Regehr W.G. Cerebellar depolarization-induced suppression of inhibition is mediated by endogenous cannabinoids // J Neurosci. 2001. Vol. 2. Is.20. P.174-176. 113. Kostandy B.B. The role of glutamate in neuronal ischemic injury: the role of spark in fire // Neurol Sci. 2012. Vol.33, №2. P.223-237. 114. Lai T.W., Zhang S., Wang Y.T. Excitotoxicity and stroke: Identifying novel targets for neuroprotection // Prog. Neurobiol. 2013. Vol. 13. P.130-135. 136 115. Lara-Celador I, Goñi-de-Cerio F, Alvarez A, Hilario E. Using the endocannabinoid system as a neuroprotective strategy in perinatal hypoxicischemic brain injury // Neural. Regen. Res. 2013. Vol. 8, Is. 8. P.731-744. 116. Leker RR, Gai N, et al. Drug-induced hypothermia reduces ischemic damage: effects of the cannabinoid HU-210 // Stroke. 2003. Vol. 34. №8. Р. 2000– 2006. 117. Lenz R.A., Wagner J.J., Alger B.E. N- and L-type calcium channel involvement in depolarization-induced suppression of inhibition in rat hippocampal CA1 cells // J. Physiol. 1998. Vol. 512. P. 61-73. 118. Li Y., Zhou W., Li X., Zeng S., Liu M., Luo Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays // Biosens Bioelectron. 2007. Vol. 22, №12. P. 2976-2982. 119. Liu J., Wang L., Harvey-White J. et al. A biosynthetic pathway for anandamide // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2006. V. 103. P. 13345–13350. 120. Lozovaya N, Yatsenko N, Beketov A, Tsintsadze T, Burnashev N. Glycine receptors in CNS neurons as a target for nonretrograde action of cannabinoids // J. Neurosci. 2005. Vol. 25. Is.33. P.7499-7506. 121. Maccarrone M, Bari M, Lorenzon T, Bisogno T, Di Marzo V, Finazzi-Agrò A. Anandamide uptake by human endothelial cells and its regulation by nitric oxide // J. Biol. Chem. 2000. Vol.275. Is. 18. P.13484-13492. 122. Mackie K. Distribution of cannabinoid receptors in the central and peripheral nervous system // Handbook of experimental pharmacology. 2005. Vol. 168. P. 299-325. 123. Mackie K., Lai Y., Westenbroek R., Mitchell R. Cannabinoids activate an inwardly rectifying potassium conductance and inhibit Q-type calcium currents in AtT20 cells transfected with rat brain cannabinoid receptor // J. Neurosci. 1995. Vol.15. Is.10. P.6552-6561. 124. Madhavan R., Chao Z.C., Potter S.M. Spontaneous bursts are better indicators of tetanus-induced plasticity than responses to probe stimuli // 137 Proceeding of Second International IEEE EMBS Conference on Neural Engineering. 2006. P. 5-8. 125. Madhavan R, Chao ZC, Potter SM. Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks // Phys Biol. 2007. Vol.4, Is.3. p. 181-93. 126. Maresz K., Carrier E.J., Ponomarev E.D., Hillard C.J., Dittel B.N. Modulation of the cannabinoid CB2 receptor in microglial cells in response to inflammatory stimuli // J. Neurochem. 2005. Vol.95. Is.2. P.437-445. 127. Maresz K., Pryce G, et al. Direct suppression of CNS autoimmune inflammation via the cannabinoid receptor CB(1) on neurons and CB(2) on autoreactive T cells // Nat. Med. 2007. Vol .13. №4.492–497. 128. Marinelli S., Di Marzo V., Florenzano F., et al. N-Arachidonoyl-Dopamine Tunes Synaptic Transmission onto Dopaminergic Neurons by Activating both Cannabinoid and Vanilloid Receptors // Neuropsychopharmacology. 2007. Vol. 32, Р. 298–308. 129. Marsicano G., Moosmann B., Hermann H. et al. Neuroprotective properties of cannabinoids against oxidative stress: role of the cannabinoid receptor CB1 // J. Neurochem. 2002. Vol. 80, №3. P. 448–456. 130. Massi P., Valenti M., Bolognini D., Parolaro D. Expression and Function of the Endocannabinoid System in Glial Cells // Current Pharmaceutical Design. 2008. Vol. 14. № 23. P 2289-2298. 131. McCollum L., Howlett A.C., Mukhopadhyay S. Anandamide-mediated CB1/CB2 cannabinoid receptor--independent nitric oxide production in rabbit aortic endothelial cells // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007. Vol. 321. Is.3. P. 930-937. 132. McFarland M.J., Rakhshan F.R., Wilson J.L., Barker E.L. Endocytic and cellular trafficking processes involved with uptake and metabolism of anandamide // Exp. Biol. (Abstract). 2004. Vol. 397. P. 8. 133. Mechoulam R., Ben-Shabat S., Hanus L. et al. Identification of an endogenous 2-monoglyceride, present in canine gut, that binds to cannabinoid receptors // Biochem. Pharmacol. 1995. Vol. 50. P. 83–90. 138 134. Mechoulam R., Panikashvili D and Shohami E. Cannabinoids and brain injury: therapeutic implications // TRENDS in Molecular Medicine. - 2002.Vol.8, №2. P. 58 -61. 135. Mechoulam R., Shohami, E., 2007. Endocannabinoids and traumatic brain injury // Mol. Neurobiol. Vol. 36. Р. 68-74. 136. Mehta A., Prabhakar M., Kumar P., Deshmukh R., Sharma P.L. Excitotoxicity: bridge to v arious triggers in neurodegenerative disorders // Eur. J. Pharmacol. 2013. Vol. 698, №1-3. P. 6-18. 137. Moesgaard B., Hansen H.H., Hansen S.L., Hansen S.H., Petersen G., Hansen H.S. Brain levels of N-acylethanolamine phospholipids in mice during pentylenetetrazol-induced seizure // Lipids. 2003. Vol. 38. Is.4. P. 387-390. 138. Morena M, Campolongo P. The endocannabinoid system: an emotional buffer in the modulation of memory function // Neurobiol Learn Mem. 2014. Vol. 112. P. 30-43. 139. Morgan N.H., Stanford I.M., Woodhall G.L. Functional CB2 type cannabinoid receptors at CNS synapses // Neuropharmacology. 2009. Vol. 57. P. 356–368. 140. Morris R.G.M. Development of a water-maze procedure for studing spatial learning in the rat // Neurosci. Meth. 1984. №11. Р. 47-60. 141. Morris R.G.M., Garrud P., O’Keefe J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions // Nature. 1982. №297. Р. 681-683. 142. Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids // Nature. 1993. Vol. 365. P.61-65. 143. Murikinati S., Jutler E., Keinert T., Ridder D., Muhammad S., Waibler Z., Ledent C., Zimmer A., Kalinke U., Schwaninger M, Activation of cannabinoid 2 receptors protects against cerebral ischemia by inhibiting neutrophil recruitment // The FASEB Journal. 2010. Vol. 24. Р. 788-798 144. Muthian S, Rademacher DJ, et al. Anandamide content is increased and CB1 cannabinoid receptor blockade is protective during transient, focal cerebral ischemia // Neuroscience. 2004. Vol .129, №3. Р.743–750. 139 145. Nagakura A., Takagi N., Takeo S. Impairment of cerebral cAMP-mediated signal transduction system and of spatial memory function after microsphere embolism in rats // Neurosci. 2002. Vol. 113, № 3. P. 519-528. 146. Nagayama T., Sinor A.D., et al. Cannabinoids and neuroprotection in global and focal cerebral ischemia and in neuronal cultures // J. Neurosci. 1999. Vol 19, №8. Р. 2987–2995. 147. Netto C.A. et al Effects of fetal hippocampal field grafts on ischemicinduced deficits in spatial navigation in the water maze // Neurosci. 1993. Vol. 54, № 1. P. 69-92. 148. Nimmerjahn A, Kirchhoff F, Kerr JN, Heimchen F. Sulforphodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo // Nat. methods. 2004. Vol.1. P. 31-37 149. Nunez L., Sanchez A., Fonteris R.I., Garcia-Sancho J. Mechanisms for synchronous calcium oscillations in cultured rat cerebellar neurons // Eur.J. Neurosci. 1996. Vol.8.P. 192-201. 150. Núñez L, Senovilla L, Sanz-Blasco S, Chamero P, Alonso MT, Villalobos C, García-Sancho J. Bioluminescence imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in soma and neurites of individual adult mouse sympathetic neurons // J. Physiol. 2007. Vol. 580. P. 385-395. 151. Ohno-Shosaku T., Tsubokawa H., Mizushima I., Yoneda N., Zimmer A., Kano M. Presynaptic cannabinoid sensitivity is a major determinant of depolarization-induced retrograde suppression at hippocampal synapses // J Neurosci. 2002. Vol. 22. Is.10. P. 3864-3872. 152. Okamoto Y., Morishita J., Tsuboi K. et al. Molecular characterization of a phospholipase D generating anandamide and its congeners // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 5298–5305. 153. O'Sullivan S.E., Kendall D.A., Randall M.D. Characterisation of the vasorelaxant properties of the novel endocannabinoid N-arachidonoyl-dopamine (NADA) // Br. J. Pharmacol. 2004. Vol. 141. P. 803–812. 140 154. Palazuelos J., Aguado T., Egia A. et al. Non-psychoactive CB2 cannabinoid agonists stimulate neural progenitor proliferation // FASEB J. 2006. Vol. 20. P. 2405–2407. 155. Panikashvili D, Simeonidou C, Ben-Shabat S, et al. An endogenous cannabinoid (2-AG) is neuroprotective after brain injury // Nature. 2001. Vol. 413. р. 527-531. 156. Panikashvili D., Mecholam R. et al. CB1 cannabinoid receptors are involved in neuroprotection via NF-κB inhibition // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2005. Vol. 25. Р. 477–484. 157. Panikashvili D., Shein N.A., Mechoulam R., Trembovler V., Kohen R., Alexandrovich A., Shohami E. The endocannabinoid 2-AG protects the blood– brain barrier after closed head injury and inhibits mRNA expression of proinflammatory cytokines // Neurobiol. Dis.2006. Vol. 22. P 257–264. 158. Paredes M., Etzler J.C., Watts L.T., Zheng W., Lechleiter J.D. Chemical calcium indicators // Methods. 2008. Vol.46. P. 143-151. 159. Parmentier-Batteur S, Jin K, et al. Increased severity of stroke in CB1 cannabinoid receptor knock-out mice // J. Neurosci. 2002. Vol. 22, №22. Р. 9771– 9775. 160. Pazos MR, Mohammed N, Lafuente H, Santos M, Martínez-Pinilla E, Moreno E, Valdizan E, Romero J, Pazos A, Franco R, Hillard CJ, Alvarez FJ, Martínez-Orgado J. Mechanisms of cannabidiol neuroprotection in hypoxicischemic newborn pigs: role of 5HT(1A) and CB2 receptors // Neuropharmacology. 2013. Vol. 71. P. 282-291. 161. Patel N.A., Moldow R.L., Patel J.A., Wu G., Chang S.L. Arachidonylethanolamide (AEA) activation of FOS proto-oncogene protein immunoreactivity in the rat brain // Brain Res. 1998. Vol.797. Is.2. P. 225-233. 162. Pertwee R.G. Cannabinoid pharmacology: the first 66 years // British Journal of Pharmacology. 2006. Vol. 147. P. S163–S171. 141 163. Pertwee, R.G., Howlett, A.C., Abood, M.E et al. // International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXIX. Cannabinoid receptors and their ligands: beyond CB and CB. Pharmacol. Rev. 2010. Vol. 62. Р. 588-631. 164. Pimashkin A., Kastalskiy I., Simonov A., Koryagina E., Mukhina I., Kazantsev V. Spiking signatures of spontaneous activity bursts in hippocampal cultures // Frontiers in Computational Neuroscience. 2011. 5(46) doi: 10.3389/fncom.2011.00046. 165. Pine J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes // J. Neurosci. Methods. 1980. Vol. 2, №1. P.19–31. 166. Price T.J., Patwardhan A., Akopian A.N., Hargreaves K.M., Flores C.M. Modulation of trigeminal sensory neuron activity by the dual cannabinoid– vanilloid agonists anandamide, N-arachidonoyl-dopamine and arachidonyl-2chloroethylamide // Br. J. Pharmacol. 2006. Vol 141, №7. P. 1118-1130. 167. Ralevic V, Kendall D.A., Randall M.D., Smart D. Cannabinoid modulation of sensory neurotransmission via cannabinoid and vanilloid receptors: roles in regulation of cardiovascular function // Life Sci. 2002. Vol 71, №22. Р. 2577– 2594. 168. Riedel G, Davies S.N. Cannabinoid function in learning, memory and plasticity // / In: Cannabinoids. Handbook of Experimental Pharmacology. 2005. Vol. 168. P 445-477 169. Rodriguez J.J., Mackie K., Pickel V.M. Ultrastructural localization of the CB1 cannabinoid receptor in mu-opioid receptor patches of the rat Caudate putamen nucleus // Neurosci. 2001. V. 21.P. 823-833. 170. Ryberg E., Larsson N., Sjögren S., Hjorth S., Hermansson N.O., Leonova J., Elebring T., Nilsson K., Drmota T., Greasley P.J. The orphan receptor GPR55 is a novel cannabinoid receptor // British Journal of Pharmacology. 2007. Vol. 152, №7. Р. 1092–1101. 171. Sagar D.R., Smith P.A., Millns P.J., Smart D., Kendall D.A., Chapman V. TRPV1 and CB(1) receptor-mediated effects of the endovanilloid/endocannabinoid 142 N-arachidonoyl-dopamine on primary afferent ibre and spinal cord neuronal responses in the rat // Eur. J. Neurosci. 2004. Vol.20. Р. 175-184. 172. Sagie S, Eliasi Y, Livneh I, Bart Y, Monovich E. Short-and long-term effects of cannabinoids on memory, cognition and mental illness // Harefuah. 2013. vol. 152. Is. 12. P. 737-741. 173. Sánchez-Blázquez P., Rodríguez-Muñoz M., Garzón J. The cannabinoid receptor 1 associates with NMDA receptors to produce glutamatergic hypofunction: implications in psychosis and schizophrenia // Front Pharmacol. 2014. Vol.4. Is. 169. doi: 10.3389/fphar.2013.00169. 174. Sapirstein A. and Bonventre J. V. Phospholipases A2 in ischemic and toxic brain injury // Neurochem. Res. 2000. Vol. 25. P. 745-753. 175. Sasamura T, Kuraishi Y. Peripheral and central actions of capsaicin and VR1 receptor // Jpn. J. Pharmacol. 1999. Vol. 80. Is.4. P.275-80. 176. Schäbitz W.R., Giuffrida A., Berger C., Aschoff A., Schwaninger M., Schwab S., Piomelli D. Release of fatty acid amides in a patient with hemispheric stroke: a microdialysis study // Stroke. 2002. Vol. 33. P. 2112-2114. 177. Schmid P.C., Reddy P.V., Natarajan V., Schmid H.H. Metabolism of Nacylethanolamine phospholipids by a mammalian phosphodiesterase of the phospholipase D type // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 9302–9306. 178. Schomacher M., Müller H. D., Sommer C. et al. Endocannabinoids mediate neuroprotection after transient focal cerebral ischemia // Brain Research. 2008. Vol. 1240. P. 213–220. 179. Shen, M., Thayer, S.A. Cannabinoid receptor agonists protect cultured rat hippocampal neurons from excitotoxicity // Mol. Pharmacol. 1998. Vol. 54. P. 459–462. 180. Shouman B, Fontaine RH, et al. Endocannabinoids potently protect the newborn brain against AMPAkainate receptor-mediated excitotoxic damage // Br. J. Pharmacol. 2006. Vol. 148, №4. Р.442–451. 143 181. Silva A.J., Ciese K.p., Fedorov N.B., Frankland P.W., Kogan J.H. Molecular, cellular, and neuroanatomical substrates of place learning // Neurobiol. Learn. 1998. № 70. Р. 44-61. 182. Sinor A.D., Irvin, S.M., Greenberg, D.A. Endocannabinoids protect cerebral cortical neurons from in vitro ischemia in rats // Neurosci. Lett. 2000. Vol. 278. P. 157-160. 183. Stelmashook E.V., Lozier E.R., Goryacheva E.S., Mergenthaler P., Novikova S.V., Zorov D.B. and Isaev N.K. Glutamine-mediated protection from neuronal cell death depends on mitochondrial activity // Neurosci. Lett. 2010. Vol. 482 (2). Р. 151-155. 184. Sugiura T. Biosynthesis of Anandamide and 2-Arachidonoylglycerol /Cannabinoides and the brain. 2008. Р.15-30. 185. Sugiura T, Kondo S, Sukagawa A, Nakane S, Shinoda A, Itoh K, Yamashita A, Waku K. 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain // Biochem Biophys Res Commun. 1995. Vol. 215(1). P. 89-97. 186. Sugiura T., Kobayashi Y., Oka S., Waku K. Biosynthesis and degradation of anandamide and 2-arachidonoylglycerol and their possible physiological significance // Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2002. Vol.66. P. 173– 192. 187. Sun Y.X., Tsuboi K., Zhao L.Y. et al. Involvement of N-acylethanolaminehydrolyzing acid amidase in the degradation of anandamide and other Nacylethanolamines in macrophages // Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1736. P. 211–220. 188. Szabo B. Pharmacology of cannabinoid receptors // Biotrend reviews. 2008.№2. P. 1-13. 189. Szabo B., Dörner L., Pfreundtner C., Nörenberg W., Starke K. Inhibition of GABAergic inhibitory postsynaptic currents by cannabinoids in rat corpus striatum // Neuroscience. 1998. Vol. 85, № 2. P. 395-403. 144 190. Szabo B., Schlicker E. Effects of Cannabinoids on Neurotransmission // In: Cannabinoids. Handbook of Experimental Pharmacology. 2005. Vol. 168. P. 327– 365. 191. Szabo B., Wallmichrath I., Mathonia P., Pfreundtner C. Cannabinoids inhibit excitatory neurotransmission in the substantia nigra pars reticulate // Neuroscience. 2000. Vol. 97, №1. P. 89-97. 192. Szallasi A., Cortright D.N., Blum C.A., Eid S.R. The vanilloid receptor TRPV1:10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept // Nat. Rev. Drug Discov. 2007. Vol.6. Р. 357-372. 193. Takahashi N., Sasaki T., Usami A., Matsuki N., Ikegaya Y. Watching neuronal circuit dynamics through functional multineuron calcium imaging (fMCI). // Neuroscience research. 2007. Vol. 58, № 3. P. 219–225. 194. Tan H, Ahmad T, Loureiro M, Zunder J, Laviolette SR. The role of cannabinoid transmission in emotional memory formation: implications for addiction and schizophrenia // Front Psychiatry. 2014. Vol. 5. Is. 73. doi: 10.3389/fpsyt.2014.00073 195. Tanaka K. et al. Chronic cerebral hypoperfusion disrupts discriminative behavior in acquired-learning rats // J. Neurosci. Methods. 1998. Vol. 84, № 1-2. P. 63-68. 196. Ternianov A., Pérez-Ortiz J.M., Solesio M.E., García-Gutiérrez M.S., Ortega-Álvaro A., Navarrete F., Leiva C., Galindo M.F., Manzanares J. Overexpression of CB2 cannabinoid receptors results in neuroprotection against behavioral and neurochemical alterations induced by intracaudate administration of 6-hydroxydopamine // Neurobiol Aging. 2012. Vol. 33, № 2. P.421-425. 197. Thurman, D.J., Alverson, C., Dunn, K.A., Guerrero, J., Sniezek, J.E., // Traumatic brain injury in the United States: a public health perspective. J. Head Trauma Rehabil. 1999. Vol.14. Р. 602-615. 198. Twitchell W., Brown S., Mackie K. Cannabinoids inhibit N- and P/Q-type calcium channels in cultured rat hippocampal neurons // J. Neurophysiol. 1997. Vol. 78. Is.1. P.43-50. 145 199. Van Der Stelt M., Di Marzo V. Endovanilloids. Putative endogenous ligands of transient receptor potential vanilloid 1 channels // Eur J Biochem. 2004. Vol. 27. P.1827-1834. 200. Van der Stelt M., van Kuik J.A., Bari M. et al. Oxygenated metabolites of anandamide and 2-arachidonoylglycerol: conformational analysis and interaction with cannabinoid receptors, membrane transporter, and fatty acid amide hydrolase // J. Med. Chem. 2002. Vol. 45. P. 3709–3720. 201. Van der Stelt M., Veldhuis W.B. et al. Neuroprotection by Delta9tetrahydrocannabinol, the main active compound in marijuana, against ouabaininduced in vivo excitotoxicity // J. Neurosci. 2001. Vol 21, №17. Р. 6475–6479. 202. Virley D. et al. Primary CA1 and conditionally immortal MHP36 cell grafts restore conditional discrimination learning and recall in marmosets after excitotoxic lesions of the hippocampal CA1 field // Brain. 1999. Vol. 122, №. 12. P. 2321-2335. 203. Wagenaar D.A., Pine J., Potter S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures // BMC Neurosci. 2006. Feb 7. Art. no. 11. 204. Walker J.M., Krey J.F., Chen J.S., Vefring E., Jahnsen J.A., Bradshaw H., Huang S.M. Targeted lipidomics: fatty acid amides and pain modulation // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2005. Vol. 77. Is. 1-4. P.35-45. 205. Wang K. K. Calpain and caspase: can you tell the difference? // Trends. Neurosci. 2000. Vol. 23. P. 20-26. 206. Westlake T.M., Howlett A.C., Bonner T.I., Matsuda L.A., Herkenham M. Cannabinoid receptor binding and messenger RNA expression in human brain: an in vitro receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry study of normal aged and Alzheimer's brains // Neuroscience. 1994. Vol. 63. P. 637–652. 207. Won S.J., Kim D.Y., Gwag B.J. Cellular and molecular pathways of ischemic neuronal death // J Biochem Mol Biol. 2002. Vol. 35. Is. 1. P. 67-86. 208. Won H., Lee H.R., Gee H.Y., Mah W., Kim J.I., Lee J., Ha S., Chung C., Jung E.S., Cho Y.S., Park S.G., Lee J.S., Lee K., Kim D., Bae Y.C., Kaang B.K., 146 Lee M.G., Kim E. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function // Nature. 2012. Vol. 486. Is. 7402. P. 261265. 209. Xiang G., Pan L., Huang L., Yu Z., Cheng J., Xing W., ZhouY. Microelectrode array-based system for neuropharmacological applications with cortical neurons cultured in vitro // Biosens Bioelectron. 2007. V. 22(11). P. 2478– 2484. 210. Xiong Y., Mahmood A., Chopp M. Emerging treatments for traumatic brain injury // Expert Opin Emerg Drugs. 2009. Vol.14, №1ю Р.67-84. 211. Yamamoto M., Takahashi K., Ohyama M., Yamaguchi T., Saitoh S., Yatsugi S., Kogure K. Behavioral and histological changes after repeated brief cerebral ischemia by carotid artery occlusion in gerbils // Brain Res. 1993. Vol. 608, № 1. P. 16-20. 212. Younts TJ, Castillo PE. Endogenous cannabinoid signaling at inhibitory interneurons // Curr Opin Neurobiol. 2014. Vol. 26. P. 42-50. 213. Zakharov Y.N., Mitroshina E.V., Shirokova O.М., Mukhina I.V. Calcium transient imaging as tool for neuronal and glial network interaction study // Springer Proceedings in Mathematics and Statistics (Models, Algorithms, and Technologies for Network Analysis). 2013. Р. 225-232. 214. Zhang M, Martin BR, Adler MW, Razdan RK, Jallo JI, Tuma RF. Cannabinoid CB(2) receptor activation decreases cerebral infarction in a mouse focal ischemia/reperfusion model //J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 2007. Vol.27. Р.1387–1396. 215. Zhang M., Martin B.R. et al. Modulation of The Balance Between Cannabinoid CB1 and CB2 Receptor Activation During Cerebral Ischemic/Reperfusion Injury // Neuroscience. 2008. Vol. 152, №3. 753–760. 216. Zhang M., Martin B.R. et al., Modulation of cannabinoid receptor activation as a neuroprotective strategy for EAE and stroke // J. Neuroimmune Pharmacol. 2009. Vol. 4, 32. Р. 249-259. 147 217. Zimmer A. et al. Increased mortality, hypoactivity and hypoalgesia in cannabinoid CB1 receptor knockout mice // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. Vol. 7. P. 5780-5785.
